ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΟΛΥ-ΥΔΡΟΞΥΑΛΚΑΝΕΣΤΕΡΩΝ (PHAs) ΑΠΟ ΚΑΘΑΡΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΤΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ Κ. Κουρμέντζα*, Μ. Κορνάρος Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, ΤΚ 265, Ρίο, Πάτρα *email: kkourmentz@chemeng.upatras.gr ; ckourmentza@gmail.com ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία αναπτύχτηκε μικτή καλλιέργεια μικροοργανισμών ικανών για παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας δραστική λάσπη. H διεργασία εμπλουτισμού σε ΡΗΑ παραγωγούς πραγματοποιήθηκε σε αντιδραστήρα περιοδικής πλήρωσης και απορροής (draw n fill reactor) μέσω εναλλαγής περιοριστικών υποστρωμάτων άνθρακα και αζώτου στο θρεπτικό μέσο. Η εμπλουτισμένη καλλιέργεια χαρακτηρίστηκε, όσον αφορά τα κυρίαρχα στελέχη που την απαρτίζουν μέσω της τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Έξι διαφορετικά στελέχη απομονώθηκαν τα οποία βρέθηκαν να ανήκουν στο γένος Pseudomonas. Κάθε ένα από αυτά μαζί με την μικτή καλλιέργεια μελετήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να παράγουν PHAs τόσο σε αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου όσο και σε συνθήκες απουσίας αζώτου με επιπρόσθετο περιορισμό σε οξυγόνο. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε συνθετικό μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων καθώς επίσης και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου (ΟΑΕ) πλούσιο σε πτητικά λιπαρά οξέα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η μικτή καλλιέργεια επέδειξε τα υψηλότερα ποσοστά συσσώρευσης και συντελεστές απόδοσης σε PHAs οπότε και προτιμήθηκε για περαιτέρω μελέτη. Για την διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας συνθετικά υποστρώματα. Συγκεκριμένα μελετήθηκε: (α) η επίδραση του αρχικού ph, (β) η επίδραση της πηγής άνθρακα στην κατανομή των μεταβολικών προϊόντων και (γ) η επίδραση του λόγου C/N στο θρεπτικό μέσο. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη της ανάπτυξης της κυτταρικής βιομάζας μέσω της κατανάλωσης των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs παρουσία εξωκυτταρικής πηγής αζώτου απουσία πηγής άνθρακα καθώς και η ενδοκυτταρική βιοαποδόμηση των PHAs για λόγους συντήρησης της βιομάζας. Επίσης, κάνοντας χρήση του λογισμικού πακέτου MATLAB επιχειρήθηκε η πρόβλεψη τόσο της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα όσο και της κατανομής των παραγόμενων PHAs βάσει των δεδομένων των πειραμάτων που αφορούν την παραγωγή των PHAs από διαφορετικές πηγές άνθρακα. Τέλος, σε μια προσπάθεια μείωσης του κόστους του υποστρώματος η οποία συνεπάγεται μείωση του κόστους των παραγόμενων PHAs, διερευνήθηκε η αξιοποίηση ΟΑΕ σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας τύπου SBR. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την διάρκεια των τελευταίων χρόνων η εκτεταμένη χρήση των πλαστικών υλικών σε συνδυασμό με το γεγονός πως ακόμη και μετά την διάθεση τους τα υλικά αυτά παραμένουν στο περιβάλλον για πολλά χρόνια, έχει προκαλέσει ένα από τα σημαντικότερα περιβαλλοντικά προβλήματα σε παγκόσμια κλίμακα. Για τον λόγο αυτό ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην ανάπτυξη υλικών τα οποία έχουν την ικανότητα να αποδομούνται από το περιβάλλον στο οποίο διατίθενται και ονομάζονται βιοδιασπώμενα πολυμερή. Μεταξύ αυτών το μεγαλύτερο ενδιαφέρον έχει προκαλέσει η ομάδα των πολύ-υδροξυαλκανεστέρων (Polyhydroxyalkanoates: PHAs).
Περισσότερα από 3 στελέχη μικροοργανισμών έχουν χαρακτηριστεί ως προς την ικανότητα τους να συσσωρεύουν PHAs. Η συσσώρευση τους πραγματοποιείται με την μορφή ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων, ως αποθήκες άνθρακα και ενέργειας, όταν ο μικροβιακός πληθυσμός καλείται να ανταπεξέλθει σε δυναμικές συνθήκες οι οποίες αφορούν την έλλειψη ενός χρήσιμου για την μικροβιακή ανάπτυξη συστατικού π.χ. περιορισμός του θρεπτικού μέσου σε άζωτο, φωσφόρο, μαγνήσιο, θείο, οξυγόνο ενώ υπάρχει υπερεπάρκεια πηγής άνθρακα. Σημαντικό μειονέκτημα για την ευρεία χρήση τους αποτελεί το υψηλό κόστος παραγωγής τους, το οποίο οφείλεται στην χρήση καθαρών καλλιεργειών, στην χρήση υποστρωμάτων υψηλής καθαρότητας καθώς και στη μεγάλη απαίτηση σε ένζυμα ή διαλύτες για την απόσπαση των PHAs από τα βακτηριακά κύτταρα. Για τον λόγο αυτό έχει δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στην χρήση μικτών καλλιεργειών και στην αξιοποίηση υγρών κλασμάτων αποβλήτων που χαρακτηρίζονται από υψηλό οργανικό φορτίο. Η διαχείριση και διάθεση των υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείου αποτελεί σημαντικό περιβαλλοντικό πρόβλημα τόσο λόγω των υψηλών όγκων παραγωγής τους, 3 εκατομμύρια ton/an στις μεσογειακές χώρες, αλλά και λόγω του υψηλού οργανικού φορτίο που φέρουν, περί 1-2 g COD/l. Η μικροβιολογική επεξεργασία και αξιοποίηση των αποβλήτων αυτών για την παραγωγή PHAs έχει προταθεί αρχικά από τους Dionisi κ.ά. [1]. Το πλούσιο οργανικό φορτίο αποτελεί πλεονέκτημα καθώς υπάρχει η δυνατότητα ζύμωσης των αποβλήτων αυτών σε υψηλούς ρυθμούς με αποτέλεσμα την παραγωγή πτητικών λιπαρών οξέων τα οποία αποτελούν τις πρόδρομες ενώσεις για τον σχηματισμό των PHAs. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υποστρώματα Συνθετικά υποστρώματα Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά υποστρώματα καθαρότητας των εταιριών Merck και SigmaAldrich. Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου (ΟΑΕ) Χρησιμοποιήθηκε επίσης ως πηγή άνθρακα το υγρό κλάσμα της απορροής μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα CSTR ο οποίος τροφοδοτούταν με απόβλητο τριφασικού ελαιοτριβείου αραιωμένο 1:4 με νερό βρύσης. Η απορροή του αντιδραστήρα ήταν πλούσια σε πτητικά λιπαρά οξέα. Αναλόγως του υδραυλικού χρόνου παραμονής του αντιδραστήρα τα χαρακτηριστικά της εκροής διέφεραν [2]. Καλλιέργειες μικροοργανισμών Μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια Για τον εμπλουτισμό της ενεργού ιλύος, η οποία λήφθηκε από την αερόβια δεξαμενή επεξεργασίας λυμάτων της μονάδας του βιολογικού καθαρισμού της Πάτρας, σε ΡΗΑ συσσωρευτικά βακτήρια ακολουθήθηκε η στρατηγική αερόβιων δυναμικών συνθηκών. Οι δυναμικές συνθήκες επετεύχθησαν μέσω της εναλλαγής περιορισμού του θρεπτικού μέσου σε πηγή άνθρακα και πηγή αζώτου. Συγκεκριμένα, το θρεπτικό μέσο αποτελούνταν από:.2 g/l MgSO4 7H 2 O,.251 g/l CaCl 2 2H 2 O, 5 g/l K 2 HPO 4, 3 g/l KH 2 PO 4 και.5 ml/l διαλύματος ιχνοστοιχείων ενώ ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκαν.1715 g/l CH 3 CH 2 COOH και.256 g/l CH 3 COOH ενώ ως πηγή αζώτου.278 g/l (NH 4 ) 2 SO 4. Η διεργασία έλαβε χώρα σε αντιδραστήρα άντλησης πλήρωσης (draw fill) συνεχούς λειτουργίας ενεργού όγκου 1 l, σε αερόβιες συνθήκες, θερμοκρασία περιβάλλοντος και ανάδευση 25 rpm. Η χρονική διάρκεια κάθε περιοριστικού κύκλου ανέρχονταν στις 24 h [3]. Απομονωμένα στελέχη μικροοργανισμών Η ταυτοποίηση των βακτηριακών στελεχών πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction- PCR).
Πίνακας 1. Στελέχη που απομονώθηκαν από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Στέλεχος Ομοταξία/Γένος Πανομοιότυπα Στελέχη % ταυτοποίηση Pseudomonas sp. ONBA A Pseudomonas putida ATCC 1739 Pseudomonas sp. HR 13 B Pseudomonas putida ATCC 17453 C D E F Γάμμαπρωτεοβακτήρια/ Ψευδομοναδα Pseudomonas putida ATCC 17514 Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas putida ATCC 1739 Pseudomonas putida ATCC 17514 Pseudomonas putida OW-27 Pseudomonas putida RW-26 Pseudomonas putida 5Asal 98% 98% 98% Αντιδραστήρες Διαλείποντος έργου Πολλά από τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου τύπου batch. Γενικά, πρόκειται για αερόβιους αντιδραστήρες, ενεργού όγκου 1 l, θερμοκρασίας 26 ± 2 ο C με συνεχή ανάδευση 25 rpm. Κάθε φορά ως εμβόλιο χρησιμοποιούνταν 25 ml καλλιέργειας. Αντιδραστήρας τύπου SBR Ο αντιδραστήρας τύπου SBR χρησιμοποιήθηκε για την συνεχή παραγωγή PHAs από ΟΑΕ και ήταν κατασκευασμένος από πλεξιγκλάς, κυλινδρικού σχήματος και ενεργού όγκου 75 ml. Ο αντιδραστήρας λειτουργούσε σε θερμοκρασία δωματίου 26 ± 2 ο C και υπό ανάδευση στα 25 rpm. Η λειτουργία του αντιδραστήρα σύμφωνα με προκαταρκτικά πειράματα σχεδιάστηκε ως εξής: α) Φάση ανάπτυξης: διάρκειας 47 h, β) Φάση καθίζησης: διάρκειας 5 min, γ) Απορροή υπερκείμενου υγρού: διάρκειας 1min, δ) Στάσιμη φάση: διάρκειας 12h, ε) Φάση συσσώρευσης: διάρκειας 24 h, στ) Απορροή ανάμικτου υγρού: έτσι έστω να συλλεχθεί η βιομάζα και να πραγματοποιηθεί απόσπαση των PHAs από τα κύτταρα. Η διάρκεια ενός πλήρους κύκλου λειτουργίας σύμφωνα με τον παραπάνω σχεδιασμό της διεργασίας είναι 3.5 d και συμπίπτει με τον χρόνο παραμονή της βιομάζας (SRT) (για την λεπτομερή περιγραφή λειτουργίας δείτε [4]. Αναλυτικές μέθοδοι Οι συγκεντρώσεις του COD, των διαλυτών υδατανθράκων, των TSS και VSS, του NH + 4 -N και του NO - 3 -N προσδιορίστηκαν σύμφωνα με το Standard Methods for the examination of Water and Wastewaters [5]. Επίσης πραγματοποιήθηκε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των VFAs σε αέριο χρωματογράφο (Varian CP-38), εξοπλισμένο με ανιχνευτή φλόγας ιονισμού (FID) και τριχοειδή στήλη HP-FFAP (Agilent technologies INC. 3m.53mm I.D. 1. μm film) καθώς και των PHAs (ΡΗΒ και PHV) χρησιμοποιώντας τριχοειδή στήλη DB-5MS (Agilent technologies INC. 3 m.25 mm I.D..25 μm film) [6]. Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου καθώς και του νιτρικού αζώτου πραγματοποιήθηκε μέσω τεστ φιαλιδίων της εταιρείας HACH LANGE με κωδικό LCK238 και LCK339 αντίστοιχα. Η μέτρηση των υδατανθράκων έγινε σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφεται στην εργασία του Josefsson [7]. Τέλος, ο προσδιορισμός τόσο του ph όσο και του DO πραγματοποιήθηκε με εμβάπτιση κατάλληλου ηλεκτροδίου, Hanna HI 8224 και Hanna DO 9146 αντίστοιχα, στο προς ανάλυση δείγμα. 98% 98%
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ A. Διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής PHAs ανά τύπο καλλιέργειας σε συνθήκες περιορισμού Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αντιδραστήρες batch ενώ ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε συνθετικό μέσο και ΟΑΕ. Η συγκέντρωση του ΝΗ + 4 -Ν στα μέσα ήταν αμελητέα ενώ ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος συγκέντρωσης.8 g/l το καθένα. Στο ΟΑΕ έγινε προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4, τόσο για ρύθμιση του ph όσο και ως πηγή φωσφόρου, σε αντίστοιχη αναλογία και ποσότητα με αυτή του συνθετικού μέσου. Πίνακας 2. Κύρια χαρακτηριστικά παραγωγής PHAs ανά τύπο καλλιέργειας χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο και ΟΑΕ. Καλλιέργεια/ Χρονική στέλεχος διάρκεια Υ Χ/S Υ Χ/S, t r X,t Y PHAs/S r PHAs % PHAs Συνθετικό μέσο Αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου Μικτή 38 -.69 56.3.69 56.4 66.4 Α 55.214.34 14.91.9 4.4 23.77 Β 33.186.228 17.5.42 3.22 13.58 C 62.99.111 6.8.12.64 4.97 D 41.362.388 3.38.26 2.7 4.7 E 4.118.154 12.25.36 2.88 11.5 F 27.166.179 26.54.13 1.96 5.1 Συνθήκες απουσίας αζώτου και περιορισμού σε οξυγόνο Μικτή 43.285.464 11.5.179 4.28 18.2 Α 27.2.83.74.81.72 5.61 Β 1.181.214 4.52.33.71 11.22 C 76.95.14 3.81.9.32 3.52 D 65.133.144 6.95.11.51 3.3 E 56.74.114 6.52.4 2.27 13.8 F 38.8.88 8.71.8.75 4.6 ΟΑΕ Αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου Μικτή 6.228.293 3.84.65 1.85 8.84 Α 54.275.314 12.91.39 1.1 6.2 Β 6.173.198 12.3.25 1.22 3.85 C 98.233.238 6.29.5.12 1.2 D 5.364.392 19.58.28 1.38 3.5 E 58.171.193 6.3.22.67 3.4 F 52.391.396 21..5.27.9 Συνθήκες απουσίας αζώτου και περιορισμού σε οξυγόνο Μικτή 7.32.345 7.5.25.71 3.25 Α 296.6.192 1.42.132 1. 11.5 Β 11.147.17 3.5.23.82 3.36 C 13.31.37 6.22.6.1 1.3 D 77.21.23 7.37.2.64 3.2 E 74.72.88 2.26.16.4 3.1 F 69.28.21 7.83.2.9.6 * Χρονική διάρκεια: h, Y X/S = Y X/S,t Y PHAs/S : g VSS/ g VFAs, YPHAs/S: g PHAs/ g VFAs, r X,t : mg VSS l -1 h -1, r PHAs : mg PHAs l -1 h -1, % PHAs: (g PHAs/ g VSS) 1. Στον πίνακα 2 παρουσιάζονται οι κύριες παράμετροι της παραγωγής των PHAs ανά τύπο καλλιέργειας. Με χρήση συνθετικού υποστρώματος απουσία αζώτου η μικτή καλλιέργεια
εμφανίζει το υψηλότερο ποσοστό ενδοκυτταρικής συσσώρευσης PHAs, 66.4 % g PHAs/ g VSS, τον υψηλότερο συντελεστή απόδοσης Υ PHAs/S =.69 g VSS/ g VFAs και τον μεγαλύτερο ρυθμό παραγωγής r PHAs = 56.4 mg l -1 h -1. Τα ποσοστά συσσώρευσης στα απομονωμένα στελέχη κυμαίνονται μεταξύ 4.7-23.77 %. Η διαφορά ανάμεσα στον συντελεστή απόδοσης βιομάζας Y X/S,t και στον συντελεστή Y PHAs/S ισούται με Y X/S. Εφόσον στο θρεπτικό μέσο δεν υπάρχει πηγή αζώτου ο συντελεστής Y X/S χαρακτηρίζει την ενδοκυτταρική συσσώρευση άλλων μεταβολικών προϊόντων πέραν των PHAs. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία έχει αναφερθεί η παραγωγή λιπιδίων από το στέλεχος Pseudomonas RRL- 28 σε ποσοστό 42.7 % g/ g ξηρού κυτταρικού βάρους [8] ενώ σύμφωνα με τους Zevenhuizen και Ebbink [9] όταν το στέλεχος Pseudomonas V-19 τροφοδοτήθηκε με οξικό νάτριο υπό περιοριστικές συνθήκες αζώτου παρήχθησαν 1.3 % γλυκογόνου, 1.3 % ΡΗΒ και 2.4 % λιπίδια g/ g ξηρού κυτταρικού βάρους ενώ όταν χρησιμοποιήθηκε υδροξυβουτυρικό νάτριο παρήχθησαν 9.45 % γλυκογόνο, 33.4 % ΡΗΒ και 24 % λιπίδια. Ο περιορισμός σε οξυγόνο φαίνεται να οδηγεί όλους τους τύπους καλλιεργειών σε μικρότερους ρυθμούς κατανάλωσης των οργανικών υποστρωμάτων και συνεπώς σε μικρότερους ρυθμούς βιοσύνθεσης PHAs. Επίσης, επηρεάζει αρνητικά τα ποσοστά PHAs από εμπλουτισμένη καλλιέργεια ενώ στα στελέχη Β,C,D,E,F δεν διαφέρουν σημαντικά. Αντίθετα, στο στέλεχος Α ο περιορισμός οξυγόνου φαίνεται να επιδρά θετικά στο ποσοστό συσσώρευσης PHAs. Όταν ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιείται ΟΑΕ τόσο τα μεγέθη των ποσοστών συσσώρευσης PHAs, των συντελεστών απόδοσης καθώς και των ρυθμών είναι μικρότερα σε σχέση με αυτά που παρατηρήθηκαν κάνοντας χρήση συνθετικού μέσου. Β. Παραγωγή PHAs μέσω της εμπλουτισμένης καλλιέργειας κάνοντας χρήση συνθετικών υποστρωμάτων Β1. Επίδραση της τιμής του αρχικού ph Η τιμή του ph στα πειράματα δεν ήταν ελεγχόμενη αλλά αντιστοιχούσε στην αρχική τιμή του ph στην καλλιέργεια. Η επιλογή αυτή έγινε με βάση τον σχεδιασμό μιας απλούστερης και οικονομικά πιο ανταγωνιστικής διεργασίας. Η ρύθμιση του αρχικού ph πραγματοποιήθηκε μέσω ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4. Οι τιμές του ph που εξετάστηκαν ήταν οι εξής: 6.4, 6.9, 7.25 και 7.5. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος σε αναλογία 1:1:1 (g/l). Όπως φαίνεται και από τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα όταν η αρχική τιμή του ph είναι ίση με 6.9 επετεύχθη το μεγαλύτερο ποσοστό συσσώρευσης, ο υψηλότερος συντελεστής απόδοσης Y P/S, ο υψηλότερος ειδικός ρυθμός παραγωγής PHAs, q P, και ο υψηλότερος ειδικός ρυθμός κατανάλωσης υποστρώματος, -q S. Επίσης, παρατηρούμε ότι παράγεται συμπολυμερές PHBV, 81 % HB-19 % HV, με το υψηλότερο μοριακό βάρος. Ο συντελεστής πολυδιασποράς των συμπολυμερών που προκύπτουν κυμαίνεται από 1.14-1.21. Στην τιμή 6.4 παρατηρείται το μέγιστό κλάσμα μονάδων HV στο παραγόμενο συμπολυμερές PHBV ενώ με αύξηση του ph φαίνεται η τάση μείωσης του κλάσματος HV μονάδων. Β2. Επίδραση της πηγής άνθρακα Τα υποστρώματα άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ καθώς και όλοι οι πιθανοί συνδυασμοί τους με συγκέντρωση 1 g/l το καθένα. Επίσης χρησιμοποιήθηκε γλυκόζη για να πιστοποιηθεί αν η εμπλουτισμένη καλλιέργεια παράγει γλυκογόνο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στην βέλτιστη αρχική τιμή ph= 6.9. Στον πίνακα 4 συνοψίζονται οι κύριες παράμετροι που χαρακτηρίζουν την παραγωγή των PHAs. Τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs είναι αρκετά υψηλά σε όλες τις περιπτώσεις. Παρατηρούμε πως οι μέγιστοι συντελεστές απόδοσης που έχουν επιτευχθεί είναι.89 και.9 Cmmol PHAs/ Cmmol S με χρήση βουτυρικού οξέος και μίγματος προπιονικού και βουτυρικού οξέος
Πίνακας 3. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικές τιμές ph. Παράμετροι ph 6.4 6.9 7.25 7.5 Χρονική διάρκεια 52. 38.5 83.5 124. S 124.1 ±.4 126.6 ±.6 122.8 ±.5 125.3 ±.6 Xi 44.9 ±.6 45.7 ±.6 36.4 ± 1.5 4.7 ± 1.2 -q S, average.553.654.385.245 q P,average.42.521.468.218 Y P/S.73 ±.2.81 ±.1.68 ±.1.44 ±.3 fphas.74 ±.2.77 ±.2.7 ±.2.58 ±.2 % PHAs 64.7 ±.5 66.4 ± 1.3 66. ± 2.8 52. ± 5.8 % mol HB-% mol HV 65-35 81-19 86-14 84-16 Mn ( 1 5 Da) 2.53 4.2 3.79 3.83 Mw ( 1 5 Da) 3.6 4.88 4.58 4.38 P.I. (Mw/Mn) 1.21 1.21 1.21 1.14 Πίνακας 4. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs χρησιμοποιώντας διάφορα υποστρώματα άνθρακα. Παράμετροι Οξικό οξύ Οξικό, Προπιονικό Βουτυρικό Οξικό και Οξικό και Προπιονικό και προπιονικό και οξύ οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξύ βουτυρικό οξύ βουτυρικό οξύ Γλυκόζη Χρονική διάρκεια 1 25 12 24 28 8 38.5 3 S 32.8 ±.2 41.3 ±.6 46.1 ±.1 7.8 ±.5 76.8 ±.7 82.3 ±.8 126.6 ±.6 47.2 ±.2 Xi 27.4 ± 1. 27.8 ± 1. 26.4 ±.9 29.3 ±.8 28.9 ±.4 26.2 ± 1. 45.73 ±.61 38.6 ± 1.7 -q S, average.118.612.1417.95.956.596.654.442 q P,average.855.437.1115.597.734.57.521.164 Y P/S.72 ±.1.73 ±.2.89 ±.2.85 ±.1.71 ±.1.9 ±.1.81 ±.1.53 ±.1 fphas.49 ±.1.57 ±.2.58 ±.2.76 ±.2.72 ±.2.82 ±.2.77 ±.2.45 ±.1 % PHAs 43.1 ±.5 47.8 ± 3.2 62.9 ± 1. 63. ± 1. 62.7 ± 1.2 65.8 ±.2 66.4 ± 1.3 38.9 ±.1 % mol HB-% mol HV 1-34-66 1-33-67 1-8-2 81-19 1- * Χρονική διάρκεια: h, S: αρχική συγκέντρωση υποστρώματος (Cmmol/l), Xi: αρχική συγκέντρωση βιομάζας (Cmmol/l), -q S : Cmmol S/Cmmol X h, q P : Cmmol PHAs/Cmmol X h, Y P/S : Cmmol PHAs/Cmmol S, fphas: Cmmol PHAs/Cmmol X, % PHAs: (g PHAs/g VSS) 1
Β3. Επίδραση του λόγου C/N Οι συνθήκες περιορισμού σε άζωτο ή σε κάποιο άλλο βασικό για την κυτταρική ανάπτυξη συστατικό μπορεί να είναι δύσκολο να επιτευχθούν όταν ως πηγές άνθρακα χρησιμοποιηθούν υγρά απόβλητα. Αυτή η κατηγορία πειραμάτων έχει ως στόχο την λεπτομερή μελέτη της επίδρασης της παρουσίας πηγής αζώτου στο θρεπτικό μέσο στην παραγωγή των PHAs. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος, από 1 g/l το καθένα ενώ οι λόγοι C/N που μελετήθηκαν αντιστοιχούν σε 11, 22 και 8 Cmmol/ Nmmol τόσο παρουσία όσο και απουσία N-allylthiourea. Στον πίνακα 5 συνοψίζονται οι κυριότερες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγή PHAs σε διαφορετικούς λόγους C/N παρουσία (+) και απουσία (-) N-allylthiourea. Η απουσία N-allylthiourea στο θρεπτικό μέσο φαίνεται να οδηγεί σε μεγαλύτερα ποσοστά συσσώρευσης PHAs, μεγαλύτερους συντελεστές απόδοσης Y P/S και μικρότερους συντελεστές απόδοσης Y X/S συγκριτικά με τα αντίστοιχα πειράματα παρουσία N-allylthiourea. Αυτό το φαινόμενο οφείλεται στο ότι ένα μέρος της συγκέντρωσης του ΝΗ 4 + -Ν οξειδώνεται προς παραγωγή νιτρικών και νιτρωδών ιόντων οπότε και δεν συμβάλει στην παραγωγή νέας βιομάζας. Φαίνεται πως ο περιορισμός αζώτου στο θρεπτικό μέσο ευνοεί τον σχηματισμό των PHAs και αυτό φαίνεται και από τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs τα οποία αυξάνονται με την μείωση της συγκέντρωσης του αζώτου. Το μέγιστο ποσοστό συσσώρευσης PHAs αφορά τον λόγο C/N = και ανέρχεται σε 66.4 % g. Η μέγιστη τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ max παρατηρείται όταν στο θρεπτικό μέσο ο λόγος C/N ισούται με 22 τόσο παρουσία όσο και απουσία N-allythiourea με τιμές.127 h -1 και.1192 h -1 αντίστοιχα. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μικτών καλλιεργειών που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή PHAs ανέρχεται σε.19 h -1 [1]. Β4. Ανάπτυξη και συντήρηση βιομάζας μέσω κατανάλωσης των ενδοκυτταρικών PHAs Μελετήθηκε η κατανάλωση του ΡΗΒ και του PHBV παρουσία αμμωνιακού αζώτου με παράλληλη παρουσία και απουσία N-allylthoiurea στο θρεπτικό μέσο. Επίσης μελετήθηκε η κατανάλωση του ΡΗΒ και του PHBV από τα μικροβιακά κύτταρα για λόγους συντήρησης, δηλαδή υπό συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου στο θρεπτικό μέσο. Παρατηρώντας τις τιμές των ειδικών ρυθμών κατανάλωσης υποστρώματος, που έχουν παρατηρηθεί σε προηγούμενα πειράματα (πίνακες 3, 4, 5), και συγκρίνοντας αυτές με τις τιμές του πίνακα 6 συμπεραίνουμε πως δεν υπάρχει ιδιαίτερη διαφορά μεταξύ της κατανάλωσης εξωκυτταρικής και ενδοκυτταρικής πηγής άνθρακα. Επίσης παρατηρούμε πως οι συντελεστές απόδοσης Y X/S είναι σχετικά υψηλοί και κυμαίνονται μεταξύ.45 -.7 Cmmol X/ Cmmol PHAs, με τις υψηλότερες τιμές να σημειώνονται στην περίπτωση παρουσίας N-allylthiourea. Οι μικροοργανισμοί που επιδεικνύουν παρόμοιους ρυθμούς κατανάλωσης και συντελεστές απόδοσης κάνοντας χρήση είτε εξωκυτταρικής είτε ενδοκυτταρικής πηγής άνθρακα, χαρακτηρίζονται από ανταγωνιστικό πλεονέκτημα έναντι των υπολοίπων και κυριαρχούν στη μικτή καλλιέργεια [11]. Ο ρυθμός κατανάλωσης των ενδοκυτταρικών PHAs είναι άμεσα συνδεδεμένος με το κλάσμα των PHAs στην βιομάζα, fphas και περιγράφεται από την dfphas εξίσωση πρώτης τάξης: kphas fphas. Οι τιμές του k που περιγράφουν την dt κατανάλωση των PHAs για λόγους ανάπτυξης, kphas, κυμαίνονται μεταξύ.14.27 h -1 ενώ οι τιμές του kphas για λόγους συντήρησης της βιομάζας διαφέρουν κατά μια τάξη μεγέθους,.16.28 h -1. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία οι τιμές των kphas των συγκεκριμένων πειραμάτων είναι χαμηλότερες από αυτές που έχουν παρατηρηθεί [12]. Όσον
Πίνακας 5. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικούς λόγους C/N. Παράμετροι C/N= 11 C/N= 22 C/N= 8 C/N= Ν-allylthiourea + - + - + - - Χρονική διάρκεια 33 36 24 32 4 42 38.5 S 126.8 ± 1.1 117.1 ±.3 12.4 ±.3 115. ±.3 12.9 ±.6 11.8 ±.3 126.6 ±.6 Xi 22.4 ± 1.2 15.5 ±.2 19.9 ±.5 16.3 ±.6 19.5 ±.4 16.3 ±.2 45.7 ±.6 + Ν-ΝΗ 4 1.9 ±.3 11. ±.2 5. ±.1 5. ±.1 1.45 ±.1 1.55 ±.1 - -q S, average.69.821.1187.1126.992.132.654 q P,average.192.414.21.359.161.466.521 μ average.475.347.552.43.348.7 - -q Ν,average.87.114.95.135.54.71 - % απομάκρυνση Ν 86.7 ±.8 94.3 ± 1.1 1 ±. 1 ±. 1 ±. 1 ±. - % SND - 94.5 ±.5-98.6 ±.7-96.7 ±.5 - Y X/S.26 ±.1.13 ±.1.15 ±.1.8 ±.1.15 ±.1.2 ±.1 - Y P/S.13 ±.1.28 ±.2.25 ±.1.36 ±.1.3 ±.1.31 ±.1.81 ±.1 % PHAs 2.2 ±.4 44.4 ±.7 37.8 ±.5 56.9 ±.3 54.8 ±.8 6.7 ±.1 66.4 ± 1.3 % mol HB-% mol HV 87.5-12.5 89-11 88.5-11.5 84-16 88.3-11.7 84.3-15.7 81-19 Πίνακας 6. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι ενδοκυτταρικής κατανάλωσης και αποδόμησης PHAs. Κατανάλωση ενδοκυτταρικού ΡΗΒ Κατανάλωση ενδοκυτταρικού PΗΒV Ανάπτυξη Συντήρηση Ανάπτυξη Συντήρηση N-allylthiourea + - - + - - Χρονική διάρκεια 23 2 3 17 3 15 S 26.2 ±.1 21. ±. 21.1 ±.1 23.3 ±.1 14.7 ±.1 15.8 ±.1 Xi 47.6 ±.1 35.8 ±.1 34.2 ±.1 48. ±.1 32.1 ±.1 37. ±.1 + Ν-ΝΗ 4 5.7 ±.2 5.6 ±.1-5.6 ±.1 5.5 ±.2 - -q PHAs,average.435.62.63.523.41.125 μ average.586.454 -.676.367 - q Ν,average.61.4 -.37.36 - Y X/S.7 ±.3.5 ±.2 -.65 ±.2.45 ±.2 % απομάκρυνση Ν 58.4 ± 1.3 43.7 ± 1.4-25.7 ±.8 2.7 ± 1.2 - % SND - 88.1 ±.4 - - 85.6 ±.6 - kphb -.246 -.271 -.165 -.979 -.718 -.131 kphv - - - -.1798 -.79 -.146 * Χρονική διάρκεια: h, S: αρχική συγκέντρωση υποστρώματος (Cmmol/l), Xi: αρχική συγκέντρωση βιομάζας (Cmmol/l), N-NH + 4 : αρχική συγκέντρωση αμμωνιακού αζώτου (Nmmol/l), -q S : Cmmol S/Cmmol X h, q P : Cmmol PHAs/Cmmol X h, q N : Nmmol/Cmmol X h, μ: h -1, Y P/S : Cmmol PHAs/Cmmol S, Y X/S : Cmmol X/Cmmol S, fphas: Cmmol PHAs/Cmmol X, kphas: h -1, % PHAs: (g PHAs/g VSS) 1.
VSS (Cmmol/ l) PHB (Cmmol/ l) PHV (Cmmol/ l) Παραγόμενο οξικό οξύ (Cmmol/ l) Οξικό οξύ (Cmmol/ l) Προπιονικό οξύ (Cmmol/ l) Βουτυρικό οξύ (Cmmol/ l) 9 ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη αφορά την περίπτωση κατανάλωσης ΡΗΒ και PHBV για λόγους συντήρησης της βιομάζας, οι τιμές των k είναι ακόμα χαμηλότερες λόγω της έλλειψης πηγής αζώτου. Θα πρέπει να επισημανθεί πως κατά την κατανάλωση PHBV για λόγους ανάπτυξης παρουσία N- allylthiourea η αποδόμηση του HV κλάσματος φαίνεται να πραγματοποιείται με γρηγορότερο ρυθμό. Παρουσία N-allylthiourea οι αντίστοιχες τιμές των k που παρατηρούνται είναι σχεδόν ίσες. Η διαφοροποίηση αυτή οφείλεται πιθανότητα στο γεγονός πως το PHV προτιμάται ως πιο αποδοτικός δότης ηλεκτρονίων για SND. Γ. Ανάπτυξη μαθηματικού μοντέλου για την πρόβλεψη της παραγωγής των PHAs Με την βοήθεια του λογισμικού πακέτου MATLAB επιχειρήθηκε η ανάπτυξη ενός μαθηματικού μοντέλου το οποίο περιγράψει τις σχέσεις που συνδέουν την κατανάλωση και τον μετασχηματισμό των ανθρακικών υποστρωμάτων με την παραγωγή των PHAs. Ως δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν τα πειράματα που αφορούν την ενότητα Β2. 6 5 4 3 2 (α) 5 4 3 2 (β) 6 5 4 3 2 (γ) 7 6 5 4 3 2 (δ) 1 1 1 1 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 (ε) 12 1 8 6 4 2 Σχήμα 1. και πρόβλεψη μοντέλου-συγκεντρώσεις (α) παραγόμενου οξικού, (β) οξικού, (γ) προπιονικού, και (δ) βουτυρικού οξέος, (ε) βιομάζας, (στ) ΡΗΒ και (ζ) PHV. Σύμφωνα με το κινητικό μοντέλο που αναπτύχθηκε περιγράφονται ιδιαίτερα ικανοποιητικά τα προφίλ κατανάλωσης του βουτυρικού οξέος, η αύξηση της βιομάζας και η παραγωγή του PHV. Η κατανάλωση του προπιονικού οξέος παρουσιάζει μικρές σχετικά αποκλίσεις. Παρόλο που προβλέπεται η τάση παραγωγής του ΡΗΒ οι πειραματικές μετρήσεις είναι μεγαλύτερες από τις συγκεντρώσεις που προβλέπει το μοντέλο. Στην περίπτωση της κατανάλωσης του οξικού οξέος παρόλο που είναι δυνατή η πρόβλεψη των αρχικών και τελικών πειραματικών σημείων, η κατανάλωση του οξικού οξέος προβλέπεται πως πραγματοποιείται μέσω ενός σταθερού ρυθμού κατανάλωσης. Δ. Παραγωγή PHAs από οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου μέσω αντιδραστήρα SBR Τα ποσοστά συσσώρευσης που επετεύχθησαν κατά την διάρκεια της λειτουργίας του SBR αντιδραστήρα κυμαίνονταν από 4.2-8.94 % g PHAs/ g VSS. Λόγω του σχηματισμού βιοφίλμ στον αντιδραστήρα εκτιμάται πως τα ποσοστά και οι αποδόσεις σε PHAs είναι μικρότερα από τα πραγματικά καθώς μέρος της βιομάζας που συμμετέχει στην συσσώρευση παραμένει προσκολλημένη στα τοιχώματα του αντιδραστήρα. Πέραν της λειτουργίας του συγκεκριμένου συστήματος για την παραγωγή PHAs παρατηρούμε μείωση του οργανικού φορτίου του αποβλήτου η οποία κατά την φάση της ανάπτυξης κυμαίνεται από 36.8-58.8 % ενώ κατά την φάση της συσσώρευσης των PHAs κυμαίνεται από 24-4 %. Πέραν των πτητικών λιπαρών οξέων, που εάν καταναλωθούν πλήρως οδηγούν στην απομάκρυνση (στ) 4 35 3 25 2 15 1 5 (ζ)
σχεδόν 4-5 % του οργανικού φορτίου, στο απόβλητό περιέχονται επίσης αλκοόλες και διαλυτοί υδατάνθρακες που δεν προτιμούνται από την καλλιέργεια. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα μας [4,13] με την εργασία των Beccari κ.ά. [14] βλέπουμε πως η τιμές τόσο του συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S όσο και της % απομάκρυνση του ΧΑΟ είναι σχεδόν διπλάσιες. Εάν στην περίπτωση μας δεν υπήρχε σχηματισμός βιοφίλμ θα αναμένονταν καλύτερα αποτελέσματα. Βέβαια, το γεγονός αυτό δεν θα αναμένεται να δημιουργήσει πρόβλημα σε αντιδραστήρα πιλοτικής κλίμακας. Πίνακας 9. Χαρακτηριστικά της διεργασίας παραγωγής PHAs στον αντιδραστήρα SBR. Φάση ανάπτυξης Φάση συσσώρευσης % απομάκρυνση διαλυτού ΧΑΟ 47.8 ± 11. 32.15 ± 8.2 % κατανάλωση οξικού οξέος 93.98 ± 13.27 48.5 ± 18.6 % κατανάλωση προπιονικού οξέος 96.76 ± 26.3 71.6 ± 28.14 % κατανάλωση βουτυρικού οξέος 98.37 ± 7.8 82.76 ± 16.86 % PHAs (g PHAs/ g VSS) - 4.2-8.94 Y PHAs/S (g ΧΑΟ/g ΧΑΟ) -.8.17 Κλάσμα HV (% mol) - 2-8 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Σύμφωνα με τα όσα παρατηρήθηκαν, φαίνεται πως η εμπλουτισμένη καλλιέργεια επιδεικνύει καλύτερα χαρακτηριστικά όσον αφορά την παραγωγή PHAs κάνοντας χρήση είτε συνθετικού μέσου είτε ΟΑΕ συγκριτικά με τα στελέχη του γένους Pseudomonas που απομονώθηκαν. Επίσης οι βέλτιστες συνθήκες παραγωγής PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια είναι αερόβιες και αντιστοιχούν σε ph=6.9 και λόγο C/N=. Κάνοντας χρήση οξικού, βουτυρικού, μίγματος οξικού και βουτυρικού οξέος καθώς και γλυκόζης επιτυγχάνεται η παραγωγή ομοπολυμερούς ΡΗΒ. Με χρήση μίγματος προπιονικού και βουτυρικού καθώς και μίγματος οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέως παράγονται συμπολυμερή PHBV-2 % HV ενώ η χρήση προπιονικού και μίγματος οξικού και προπιονικού οξέως οδηγεί στην παραγωγή συμπολυμερών PHBV-33 %HV. Τέλος, φάνηκε πως η αξιοποίηση του υγρού κλάσματος του οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου για την παραγωγή PHAs είναι υποσχόμενη και επιδέχεται βελτιστοποίησης ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Dionisi D., Caruzzi G., Petrangeli P., Papini M., Riccardi C., Wat. Resear. 39 (25). [2] Κουτρούλη Ελένη, Διδακτορική διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα (28). [3] Kourmentza C., Ntaikou I., Kornaros M., Lyberatos G., Des. 248 (29). [4] Κουρμέντζα Κων/να, Διδακτορική διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα (212). [5] APHA, AWWA, WEF, 19 th Edition, Washington, D.C. (1995). [6] Oehmen A., Keller-Lehmann B., Zeng R.J. et al., J. Chromat. A 17 (25). [7] Josefsson B., Verlag Chemie GmbH (1983). [8] Patnayak S. and Sree A., Appl. Microbiol. 4 (25). [9] Zevenhuizen L.P.T.M. and Ebbink A.G, Antonie van Leeuwenhoek 4 (1974). [1] Serafim L.S., Lemos P.C., Oliveira R., Reis M.A.M., Biotechnol. Bioeng. 87 (24). [11] Third K.A., Burnett N., Cord-Ruwisch R., Biotechnol. Bioeng. 83:6 (23). [12] Beun J.J., Dircks K., van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J, Water Res. 36 (22). [13] Ntaikou I., Kourmentza C., Koutrouli E. et al., Biores. Technol. 1 (29). [14] Beccari M., Bertin L., Dionisi D. et al., J. Chem. Technol. Biotechnol. 84 (29).