ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437"

ŌἈπολλύων Τρικούπης
10 χρόνια πριν
Προβολές:

1 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437 Κ. Κόντη, Δ. Μαμμά, Δ. Κέκος Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, 1578, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η 1,3-διχλωρο-2-προπανόλη (DCP) και η 3-χλωρο-1,2-προπανεδιόλη (CPD) είναι δύο ιδιαίτερα τοξικές ενώσεις με ευρεία, ωστόσο, χρήση στη χημική βιομηχανία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ενζυμική αποικοδόμησή τους από το βακτηριακό στέλεχος Pseudomonas putida DSM437 το οποίο είχε αποδειχθεί ότι παρουσιάζει ικανότητα αποικοδόμησης των συγκεκριμένων ενώσεων [1]. Αρχικά, έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης των μεταβολιτών του μεταβολικού μονοπατιού αποικοδόμησης του DCP με χρήση GC-MS ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε η αποικοδόμηση διαφορετικών συγκεντρώσεων DCP και CPD. Αποδείχτηκε ότι το CPD είναι ενδιάμεσο προϊόν της αποικοδόμησης του DCP. Επίσης, η αποικοδόμηση του CPD είναι ταχύτερη σε σχέση με του DCP και ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten. ΕΙΣΑΓΩΓΗ H 1,3-δίχλωρο-2-προπανόλη (DCP) και η 3-χλώρο-1,2-προπανεδιόλη (CPD) χρησιμοποιούνται ευρέως ως διαλύτες και ως πρόδρομες ενώσεις στην παραγωγή ρητινών, πολυμερών, αγροχημικών και φαρμακευτικών προϊόντων. Παρά τη διαδεδομένη χρήση τους, πρόκειται για ιδιαίτερα τοξικές ενώσεις καθώς έχει διαπιστωθεί καρκινογόνος δράση σε πειραματόζωα και πρόκληση οξείας ηπατίτιδας σε ανθρώπους. Λόγω της επικινδυνότητας τους για τη δημόσια υγεία και το περιβάλλον τόσο η Ευρωπαϊκή Ένωση όσο και οι ΗΠΑ έχουν υιοθετήσει αυστηρούς κανονισμούς που διέπουν τη χρήση τους. Ενδεικτικά, το επιτρεπόμενο όριο υπολειμμάτων CPD και DCP σε ρητίνες είναι τα 1 ppm [2]. Η έρευνα για την βιοαποικοδόμηση χλωριωμένων ενώσεων εστιάζεται κυρίως σε διεργασίες ανοργανοποίησης αυτών καθώς και στα ενζυμικά συστήματα που εμπλέκονται στη διάσπαση του δεσμού άνθρακα-χλωρίου. Η αντίδραση κλειδί κατά τη μικροβιακή αποικοδόμηση χλωριωμένων ενώσεων είναι η απομάκρυνση του χλωρίου. Το χλώριο, που είναι συνήθως υπεύθυνο για τον τοξικό χαρακτήρα της ένωσης, αντικαθίσταται από υδρογόνο ή υδροξύλιο. Η απομάκρυνση του χλωρίου μειώνει τον κίνδυνο δημιουργίας τοξικών ενδιάμεσων στα μετέπειτα μεταβολικά στάδια [3, 4]. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του ενζυμικού συστήματος του βακτηρίου Pseudomonas putida DSM 437 όσον αφορά στις δύο προαναφερθείσες χλωροπροπανόλες. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μικροοργανισμός, ανάπτυξη: Χρησιμοποιήθηκε ο μικροοργανισμός Pseudomona putida DSM 437. Ο μικροοργανισμός αναπτύχθηκε σε βιοαντιδραστήρα ενεργού όγκου 16 L σύμφωνα με την DSMZ [5] με παροχή αέρα. Ως πηγές άνθρακα χρησιμοποιήθηκαν γλυκόζη, CPD και DCP. Ο προσδιορισμός της ανάπτυξης έγινε φωτομετρικά. Προσδιορισμός DCP και CPD: Σύμφωνα με τη μέθοδο των Mueller & Fischer [6] δείγματα εκχυλίστηκαν σε οξεικό αιθυλεστέρα και οι χλωροπροπανόλες ποσοτικοποιήθηκαν σε αέριο χρωματογράφο με ανιχνευτή ECD με τροποποίηση του θερμοκρασιακού προγράμματος. Για την αρχική ταυτοποίηση των μεταβολιτών με χρήση GC/MS πραγματοποιήθηκε επιπλέον παραγωγοποίηση με χρήση BSTFA. Πιο συγκεκριμένα, για την παραγωγή των σιλυλ-παραγώγων προστέθηκε στην οργανική φάση εκχυλισμένων δειγμάτων 1/1 του όγκου BSTFA και τα δείγματα επωάστηκαν στους 6 ο C για 3 min. Aποικοδόμηση από εσωκυτταρικό διάλυμα P. putida DSΜ 437: Κυτταρική μάζα του βακτηρίου P. putida DSM 437 που έχει αναπτυχθεί σε θρεπτικό μέσο με πηγές άνθρακα γλυκόζη και DCP/CPD συλλέχτηκε με φυγοκέντρηση και επαναδιαλύθηκε μετά την έκπλυσή της σε ρυθμιστικό διάλυμα σε διπλάσιο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος (αναλογία κυττάρων: ρυθμιστικού διαλύματος 1:1). Πραγματοποιήθηκε διάρρηξη κυττάρων με τη βοήθεια υπερήχων με ισχύ 6 Watt αφού προστέθηκε PMSF για την αποφυγή πρωτεόλυσης. Η διάρηξη των κυττάρων επιβεβαιώθηκε μέσω του φωτομετρικού προσδιορισμού της απελευθερούμενης πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford [7].

2 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σε εσωκυτταρικό διάλυμα του βακτηρίου Pseudomonas putida DSM4377 προστέθηκαν 1 ppm DCP και πραγματοποιήθηκε επώαση στους 3 ο C. Σε δείγματα που ελήφθησαν πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με οξεικό αιθυλεστέρα και παραγωγοποίηση με BSTFA γιαα την παραλαβή ανιχνεύσιμων παραγώγων. Η ανάλυση των εν λόγω δειγμάτων σε GC/MS έδειξε την τ παρουσίαα των σιλυλ-παραγώγων όχι μόνο του DCP αλλά και του CPD, γεγονός που μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το CPD αποτελεί ενδιάμεσο προιόν στοο μεταβολικό μονοπάτι αποικοδόμησης του DCP από το συγκεκριμένο οργανισμό. Στο Σχήμα 1 φαίνεται το προτεινόμενο μεταβολικό μονοπάτι. Σχήμα 1. Προτεινόμενο μεταβολικό μονοπάτι αποικοδόμησης του DCP από το βακτήριοο Pseudomonas putida DSM 437 Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με ε την προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων DCP ή CPD στο διάλυμα που προέκυψε από τη διάρρηξη των κυττάρων. Τα Σχήματα 2 καιι 3 συνοψίζουν τα αποτελέσματα για την αποικοδόμηση του DCP και του CPD, αντίστοιχα

Σε δείγματα που ελήφθησαν πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με οξεικό αιθυλεστέρα και παραγωγοποίηση με BSTFA γιαα την παραλαβή ανιχνεύσιμων παραγώγων.

3 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, Σχήμα 2. Αποικοδόμηση διαφορετικών συγκεντρώσεων DCP από εσωκυτταρικό διάλυμα του βακτηρίου Pseudomonas putida DSM 437 Σε κάθε περίπτωση, η αποικοδόμηση του DCP είναι πιο αργή από την αποικοδόμηση του CPD. Όσον αφορά στο DCP, παρατηρείται μια σιγμοειδής καμπύλη σε όλες τις μελετηθείσες συγκεντρώσεις με μία αρχική υστέρηση (lag phase). Από τα δεδομένα αυτά, δεν μπορούν να εξαχθούν κινητικές παράμετροι για την αποικοδόμηση του DCP και το ακολουθούμενο μοντέλο της αντίδρασης απαιτεί περαιτέρω μελέτη. Αντίθετα, όσον αφορά στην αποικοδόμηση του CPD παρατηρείται ένα αρχικό ευθύγραμμο τμήμα σε όλες τις μελετηθείσες συγκεντρώσεις (5-5 ppm) από το οποίο μπορεί να εξαχθεί ο αρχικός ρυθμός της αντίδρασης

Όσον αφορά στο DCP, παρατηρείται μια σιγμοειδής καμπύλη σε όλες τις μελετηθείσες συγκεντρώσεις με μία αρχική υστέρηση (lag phase).

4 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, Σχήμα 3. Αποικοδόμηση διαφορετικών συγκεντρώσεων CPD από εσωκυτταρικό διάλυμα του βακτηρίου Pseudomonas putida DSM 437 Συνδυάζοντας τον αρχικό ρυθμό της αντίδρασης με την αντίστοιχη συγκέντρωση υποστρώματος, κατασκευάζουμε το διάγραμμα Lineweaver-Burk (Σχήμα 4). Από το διάγραμμα αυτό προκύπτει ότι η αποικοδόμηση του CPD ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με u max =17,27 mg CPD/L/h και K m = 132,16 mg CPD/L. Παρατηρούμε ότι το υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του CPD ένζυμο, πιθανόν μία λυάση της αλοϋδρίνης βάσει του προτεινόμενου μηχανισμού, παρουσιάζει χαμηλή συγγένεια με το υπόστρωμα. 1/v 1,4 1,2 1,,8,6,4,2 y = 59,762x +,579 R² =,9821,,1,1,2,3 1/s Σχήμα 4. Διάγραμμα Lineweaver-Burk για την αποικοδόμηση του CPD ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα βασικά συμπεράσματα που μπορούν να εξαχθούν από την παρούσα εργασία είναι τα ακόλουθα: Επιβεβαιώθηκε το μεταβολικό μονοπάτι που ακολουθεί η αποικοδόμηση του DCP Το CPD αποτελεί ένα από τα ενδιάμεσα του μονοπατιού αυτού Η αποικοδόμηση του CPD είναι ταχύτερη από την αποικοδόμηση του DCP Η αποικοδόμηση του CPD ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με u max =17,27 mg CPD/L/h και K m = 132,16 mg CPD/L ενώ για το DCP δεν μπορεί να εξαχθεί ένα κινητικό μοντέλο και απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού αποικοδόμησης ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τις κ.κ. Θ. Λυμπεροπούλου και Κ. Μπάλτα του Κέντρου Περιβάλλοντος και Ποιότητας Ζωής της Σχολής Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ για την βοήθειά τους στην ανάλυση δειγμάτων με χρήση GC/MS. Η Κ.Κ. θα ήθελε, επίσης, να ευχαριστήσει το Ι.Κ.Υ. για τη χορήγηση υποτροφίας για την εκπόνηση διδακτορικής διατριβής.

κατασκευάζουμε το διάγραμμα Lineweaver-Burk (Σχήμα 4).

5 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Κ. Κόντη, Λ. Μάτσακας, Δ. Μαμμά, Δ. Κέκος, 9o ΠΕΣΧΜ, Αθήνα,23-25 Μαΐου 213 [2]. [3]. Janssen, D.B., Oppentocht, J.E. and Poelarends, G.J., Current Opin. Biotechnol., 12: 254 (21). [4]. Smejkal,C.W., Vallaeys, T., Burton, S. K.and Lappin-Scott, H. M., Lett. in Appl. Microbiol. 32 (4): (21) [5]. [6]. Μueller, T.W. and Fischer, S.A. Tappi J. 75:159 (1992) [7]. Bradford, M. Anal. Biochem. 72 (1-2): (1976)

and Poelarends, G.J., Current Opin. Biotechnol., 12: 254 (21). [4]. Smejkal,C.W., Vallaeys, T., Burton, S. K.and Lappin-Scott, H. M., Lett. in Appl.

Σχετικά έγγραφα

ΤΕΧΝΙΚΗ ΧΗΜΙΚΩΝ & ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ Ασκήσεις επί χάρτου (Πολλές από τις ασκήσεις ήταν θέματα σε παλιά διαγωνίσματα...)

Καλογεράκης ΤΧΒΔ 1/5 ΤΕΧΝΙΚΗ ΧΗΜΙΚΩΝ & ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ Ασκήσεις επί χάρτου (Πολλές από τις ασκήσεις ήταν θέματα σε παλιά διαγωνίσματα...) Πρόβλημα Νο.1:. Πολύπλοκες ενζυματικές αντιδράσεις Αριθμός