ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ 2 ΗΣ ΓΕΝΙΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ PHALARIS AQUATICA L. A. Kαραπατσιά 1,2, Γ. Πενλόγλου 1, I.A. Παππάς 1, Κ. Κυπαρισσίδης 1,2 1 Ινστιτούτο Χημικών Διεργασιών και Ενεργειακών Πόρων, ΙΔΕΠ/EKETA 2 Τμήμα Χημικών Μηχανικών, ΑΠΘ, Τ.Θ. 472, 54124, Θεσσαλονίκη, Ελλάδα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ολοκληρωμένη βιοχημική παραγωγή βιοαιθανόλης από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα του λιβαδικού φυτού Phalaris aquatica L. (φαλαρίδα) περιλαμβάνει τρία βασικά στάδια, τα οποία, στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν ξεχωριστά. Η προεπεξεργασία της βιομάζας μελετήθηκε σύμφωνα με στατιστικό πειραματικό σχεδιασμό (Taguchi), με σκοπό τη βελτιστοποίηση της διαλυτοποίησης των ημικυτταρινών. Προέκυψε ότι ο συνδυασμός παραγόντων με ήπιες συνθήκες αποδίδει τη μέγιστη ποσότητα πεντοζών, ενισχύοντας παράλληλα την υδρόλυση της κυτταρίνης. Η ενζυμική υδρόλυση του στερεού υπολείμματος της προεπεξεργασίας βελτιστοποιήθηκε επίσης με στατιστικό σχεδιασμό (Box Denken) και προσθήκη επιφανειοδραστικών ουσιών, συνθέτοντας διάλυμα σακχάρων με συνολική συγκέντρωση 13,91 g/l. Η ζύμωση (καλλιέργεια του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae) της περιεχόμενης γλυκόζης στο υδρόλυμα του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης, μετά από συμπύκνωση, πραγματοποιήθηκε σε κλίμακα κωνικών φιαλών σε ασυνεχείς συνθήκες, ώστε να προκύψουν οι βέλτιστες συνθήκες αερισμού, ταχύτητας ανάδευσης, ph, μεγέθους ενοφθαλμίσματος, η βέλτιστη σύσταση του θρεπτικού μέσου, όσον αφορά τη συγκέντρωση γλυκόζης και πηγών αζώτου, καθώς και το κατάλληλο στέλεχος του σακχαρομύκητα. Ο βέλτιστος συνδυασμός μεταφέρθηκε έπειτα σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα, όπου μελετήθηκε κάτω από ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας επιτυγχάνοντας παραγωγικότητα ίση με τιμή 1,97 g/(l h) και συγκέντρωση αιθανόλης ίση με 19,12 g/l. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σύγχρονη απαίτηση για εναλλακτικές πηγές ενέργειας λόγω του περιορισμού των ορυκτών καυσίμων έχει οδηγήσει το ενδιαφέρον της έρευνας και γενικότερα της κοινωνίας σε ενεργειακά φυτά, από τη βιοχημική επεξεργασία των οποίων παράγονται βιοκαύσιμα και υλικά υψηλής προστιθέμενης αξίας [1]. Τέτοια ενεργειακά φυτά μπορούν να αποτελέσουν τα πολυετή λιβαδικά φυτά, τα οποία παράγουν άφθονη λιγνοκυτταρινική βιομάζα στους φυτικούς ιστούς και μπορούν να αποτελέσουν πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοενέργειας [2]. Ένα τέτοιο λιβαδικό φυτό αποτελεί το είδος της φαλαρίδας (Phalaris aquatica L.), ένα ενδημικό πολυετές αγρωστώδες της Παραμεσογειακής περιοχής, το οποίο μπορεί να καλλιεργηθεί σε οριακές γεωργικές εκτάσεις, χωρίς ανταγωνισμό προς την παραγωγή τροφίμων. Το συγκεκριμένο είδος αποτελεί μια εναλλακτική ενεργειακή καλλιέργεια, καθώς εμφανίζει υψηλό και σταθερό παραγωγικό δυναμικό, υψηλή συγκέντρωση δομικών πολυσακχαριτών (>650 g/kg Ξ.Μ.) και χαμηλή συγκέντρωση λιγνίνης (< g/kg Ξ.Μ.) [3]. Η υψηλή συγκέντρωση σε δομικούς πολυσακχαρίτες (κυτταρίνη και ημικυτταρίνες) της βιομάζας της φαλαρίδας, σε συνδυασμό με την υψηλή μετατρεψιμότητα τους, μέσω θερμοχημικών (αραιή όξινη προεπεξεργασία) και βιοχημικών διεργασιών (ενζυμική υδρόλυση κυτταρίνης), σε μονομερή ζυμώσιμα σάκχαρα, καθιστά το συγκεκριμένο είδος ως υποσχόμενη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς [3,4].
Η ολοκληρωμένη βιοχημική παραγωγή βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα περιλαμβάνει συνήθως τρία βασικά στάδια: (α) το στάδιο της προεπεξεργασίας της ακατέργαστης βιομάζας, (β) το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης της προεπεξεργασμένης βιομάζας και (γ) τη μικροβιακή μετατροπή της γλυκόζης της κυτταρίνης σε βιοαιθανόλη μέσω διεργασιών ζύμωσης. Μετά την ολοκλήρωση του σταδίου της προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (π.χ. με αραιό θειικό οξύ), πραγματοποιείται διαχωρισμός των δύο φάσεων και προκύπτει στερεό υπόλειμμα πλούσιο σε κυτταρίνη και υγρό διάλυμα που περιλαμβάνει κυρίως τα μονομερή σάκχαρα από τις ημικυτταρίνες (κυρίως πεντόζες). Η κυτταρίνη στο στάδιο της προεπεξεργασίας παραμένει αδιάλυτη και σχεδόν ολόκληρη η διαθέσιμη ποσότητά της ακολουθεί τη στερεή φάση. Η μέθοδος της όξινης προεπεξεργασίας με αραιό θειικό οξύ θεωρείται ιδανική ανάμεσα σε μια σειρά εφαρμοζόμενων τεχνικών σε αυτό το στάδιο, λόγω συμβατότητας με την επιλεγμένη πρώτη ύλη, καθώς η φαλαρίδα αποτελείται από χαμηλά ποσοστά λιγνίνης και στόχος του σταδίου αυτού είναι κυρίως η διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών [3,5]. Η απόδοση του σταδίου κρίνεται γενικά ως προς την περιεκτικότητα του υγρού διαλύματος σε πεντόζες, που υποδεικνύει τη μετατροπή των ημικυτταρινών. Στη συνέχεια, ακολουθεί η ενζυμική υδρόλυση του στερεού υπολείμματος της προεπεξεργασίας με σκοπό τη σακχαροποίηση του κλάσματος της κυτταρίνης προς γλυκόζη, αξιοποιώντας γενικά ένα μίγμα εμπορικά διαθέσιμων ενζύμων που αποτελείται από: ενδογλυκανάσες, εξωγλυκανάσες και κελλοβιάση (β-γλυκοσιδάση). Οι κύριοι παράγοντες που έχουν αναγνωρισθεί ότι επηρεάζουν την υδρόλυση της κυτταρίνης είναι: 1) η ποσότητα του προκατεργασμένου υλικού, 2) η ποσότητα και η δραστικότητα των ενζύμων, 3) οι συνθήκες αντίδρασης (θερμοκρασία, ph διαλύματος), 4) το πορώδες (η επιφάνεια του υλικού που είναι προσιτή στα διάφορα ένζυμα), 5) ο βαθμός κρυσταλλικότητας της κυτταρίνης, και 6) η περιεκτικότητα των υλικών σε λιγνίνη και ημικυτταρίνες [3,6,7,8]. Η απόδοση του σταδίου έχει παρατηρηθεί γενικά ότι αυξάνεται με την προσθήκη επιφανειοδραστικών ουσιών, λόγω της δράσης των ουσιών αυτών στις δυνάμεις αλληλεπίδρασης της κυτταρίνης με την επιφάνεια της λιγνίνης [9]. Το στάδιο της ζύμωσης που ακολουθεί τα παραπάνω αποτελεί βασική βιολογική διεργασία των ζυμομυκήτων για την παραγωγή ενέργειας, μέσω της μετατροπής των υδατανθράκων σε αλκοόλη (αιθανόλη). Η αντίδραση παραγωγής αιθανόλης, κατά την οποία ένα μόριο γλυκόζης μετατρέπεται σε δύο μόρια αιθανόλης είναι: C 6 H 12 O 6 2C 2 H 6 O + 2CO 2. Σύμφωνα με τη βιοχημική αυτή αντίδραση η μέγιστη θεωρητική απόδοση της παραγωγής αιθανόλης από γλυκόζη είναι 0,51 g αιθανόλης / g σακχάρων. Ο μικροοργανισμός που χρησιμοποιείται ευρέως για τη μετατροπή των διαθέσιμων σακχάρων σε βιοαιθανόλη είναι ο Saccharomyces cerevisiae, εφόσον είναι ο πιο διαδεδομένος και μελετημένος για το ζητούμενο προϊόν, έχει την υψηλότερη παραγωγικότητα από όλα τα μικροβιακά συστήματα και ταυτόχρονα είναι εμπορικά διαθέσιμος σε χαμηλό κόστος, συγκρινόμενος με άλλους γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς []. Ο συγκεκριμένος μικροοργανισμός είναι ικανός να αναπτύσσεται ραγδαία μεταβολίζοντας ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας τη γλυκόζη, η οποία είναι και το πλουσιότερο σε σύσταση από τα σάκχαρα του υδρολύματος. Από τα διαθέσιμα στελέχη άγριου-τύπου (wild-type) του S. cerevisiae έχουν μελετηθεί και αξιολογηθεί ως προς το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων και την παραγωγή βιοαιθανόλης περισσότερα από ένα. Υπάρχει συνεπώς η απαίτηση της επιλογής του καταλληλότερου στελέχους του μικροοργανισμού. Σύμφωνα με τους Yu et al. [11] και Biener et al. [12], δύο συγκεκριμένα στελέχη (DSM 70449 και Sigma τύπος ΙΙ) παρουσιάζουν ικανοποιητικές έως υψηλές αποδόσεις σε παραγωγή αιθανόλης. Βασικός στόχος του σταδίου της ζύμωσης είναι η παραγωγή βιοαιθανόλης με υψηλό ρυθμό παραγωγής. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία η ωριαία παραγωγικότητα της βιοαιθανόλης κυμαίνεται για ασυνεχή (batch) λειτουργία ενός
βιοαντιδραστήρα ανάμεσα στα όρια 0,3-1,1 g/(l h) [13], ενώ για ημι-συνεχή (fed-batch) λειτουργία 0,9-1,6 g/(l h) [14,15,16]. Για τις ανάγκες της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκαν πειράματα που καλύπτουν το στάδιο της προεπεξεργασίας και της ενζυμικής υδρόλυσης μέσω στατιστικών σχεδιασμών για την επιλογή των βέλτιστων συνθηκών των δύο σταδίων ανάμεσα σε ένα εύρος τιμών, που επιλέχθηκαν με βάση προηγούμενη έρευνα για το συγκεκριμένο είδος της φαλαρίδας [3]. Στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης έγινε ανάλυση της σημαντικότητας των παραγόντων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων και επιπλέον μελέτη της επίδρασης των επιφανειοδραστικών ουσιών στην απόδοση του σταδίου. Η αύξηση της απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης σε γλυκόζη μελετήθηκε μέσω της αύξησης του περιεχόμενου της βιομάζας. Στη συνέχεια, έλαβαν χώρα πειράματα αρχικά για την επιλογή του μέσου διατήρησης και του μέσου προετοιμασίας του μικροοργανισμού κατά το στάδιο της ζύμωσης, καθώς και μελέτη της κυτταρικής ανάπτυξης στα μέσα αυτά. Ακολούθησαν πειράματα για την επιλογή του βέλτιστου μέσου για τη ζύμωση, καθώς και για διάφορες συνθήκες αερισμού και ανάδευσης. Η διεργασία της ζύμωσης μελετήθηκε σε συνθήκες ασυνεχούς και ημισυνεχούς λειτουργίας, τόσο στο επίπεδο καλλιέργειας των κωνικών φιαλών, όσο και σε αυτό του βιοαντιδραστήρα. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η πειραματική μελέτη της προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, του αλεσμένου φυτού Phalaris aquatica L. με μέγεθος σωματιδίων <1 mm, με τη μέθοδο της αραιής όξινης υδρόλυσης των ημικυτταρινών πραγματοποιήθηκε με βάση τον πειραματικό σχεδιασμό Taguchi. Οι τρείς κυριότερες μεταβλητές που μελετήθηκαν είναι η θερμοκρασία, η περιεκτικότητα θειικού οξέος και ο χρόνος υδρόλυσης. Οι παράγοντες ελέγχου ορίστηκαν σε 3 επίπεδα (υψηλό, χαμηλό και ενδιάμεσο). Συγκεκριμένα 1, 1 και 130 o C θερμοκρασία, 1, 1,5 και 2% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος και 30, 45, 60 min χρόνος αντίδρασης. Με βάση το στατιστικό σχεδιασμό πραγματοποιήθηκαν συνολικά 9 πειράματα με 2 επαναλήψεις. Η περιεκτικότητα της αλεσμένης βιομάζας ήταν σταθερή και ίση με % w/v. Στη συνέχεια, έγινε διαχωρισμός της υγρής φάσης (μονομερή σάκχαρα) από τη στερεή (κυτταρίνη και λιγνίνη) με διήθηση. Στο παραγόμενο υγρό διάλυμα μετά την προεπεξεργασία πραγματοποιήθηκε εξουδετέρωση του οξέος με την προσθήκη μικρής ποσότητας βάσης (ΝaΟΗ) ώστε το ph του να ρυθμιστεί στην τιμή 6. Έπειτα, εφαρμόστηκε φυγοκέντρηση στα.000 g για min και φιλτράρισμα με φίλτρα 0,2 μm πριν τη μεταφορά των δειγμάτων στον υγρό χρωματογράφο. Η ένταση των συνθηκών της επεξεργασίας μετρήθηκε μέσω ενός συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF), ο οποίος προσδιορίζεται με βάση την εξίσωση: CSF = log R o ph, όπου R o = log[t exp((t r T b )/ω)], Τ r είναι η θερμοκρασία της αντίδρασης, Τ b είναι η θερμοκρασία αναφοράς (Τ b =0 o C) και ω είναι ένας εμπειρικός συντελεστής ο οποίος, για την ήπια όξινη προκατεργασία, ισούται με 14,75 [16]. Για την πειραματική μελέτη της σακχαροποίησης της κυτταρίνης με τη μέθοδο της ενζυμικής υδρόλυσης χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις κύριες μεταβλητές (περιεκτικότητα βιομάζας, ποσότητα ενζύμων, χρόνος υδρόλυσης και συγκέντρωση επιφανειοδραστικού PEG 4000) σε τρία επίπεδα η κάθε μια (χαμηλό, υψηλό και ενδιάμεσο). Ο πειραματικός σχεδιασμός που εφαρμόστηκε έγινε σύμφωνα με το στατιστικό σχεδιασμό Box Denken ο οποίος αποτελεί κλασματικό παραγοντικό σχεδιασμό (1/2 3 4 ). Μια σειρά 27 πειραμάτων πραγματοποιήθηκε με τα εξής επίπεδα για κάθε παράγοντα: 2, 3, 4% περιεχόμενο στερεού, 24, 48, 72 h χρόνος αντίδρασης,, 15, FPU/g στερεού ποσότητα ενζύμου και 0,02, 0,04, 0,06 g/g στερεού συγκέντρωση επιφανειοδραστικού. Χρησιμοποιήθηκε μίγμα ενζύμων της κυτταρινάσης (Celluclast 1.5L) και της β-γλυκοσιδάσης (Novozyme 188) των μυκήτων Τrichoderma reseei
και Αspergillus niger αντίστοιχα με σταθερή αναλογία 1 FPU / 1,75 CBU. H αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε κωνική φιάλη των 250 ml με όγκο αντίδρασης 50 ml στους 50 o C, ph=4,8 και ταχύτητα ανάδευσης ίση με 150 rpm. Στο παραγόμενο υγρό διάλυμα μετά την ενζυμική υδρόλυση έγινε φυγοκέντρηση στα.000 g για min και φιλτράρισμα 0,2 μm πριν τη μεταφορά των δειγμάτων στον υγρό χρωματογράφο. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε μικρή ποσότητα ενεργού άνθρακα 2% (w/v) για τον αποχρωματισμό των δειγμάτων σε χαμηλή θερμοκρασία (40 o C, 15 min). Η μέτρηση των σακχάρων που προήλθαν από την υδρόλυση των ημικυτταρινών καθώς και από την υδρόλυση της κυτταρίνης πραγματοποιήθηκε με υψηλής απόδοσης υγρό χρωματογράφο (HPLC), βάσει προτύπων καμπύλων αναφοράς μονομερών σακχάρων (ξύλόζη, αραβινόζη, γλυκόζη, μαννόζη, γαλακτόζη, φρουκτόζη) και (γλυκόζη, κελλοβιόζη και ξυλόζη), για τα δύο στάδια αντίστοιχα. Η συγκέντρωση των παραγόμενων σακχάρων μετρήθηκε με ανιχνευτή δείκτη διάθλασης (Refractive Index) και χρησιμοποιήθηκε η στήλη Ζorbax Carbohydrate Analysis (4.6 150mm). Το βασικό στέλεχος του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae που χρησιμοποιήθηκε για τη ζύμωση της γλυκόζης προμηθεύθηκε από τη Sigma Aldrich και είναι ο τύπος II. Έγιναν συγκριτικά πειράματα με το στέλεχος DSM 70449 από τη γερμανική τράπεζα μικροοργανισμών DSMZ. Ο μικροοργανισμός διατηρείται σε τρυβλία με σταθεροποιημένο θρεπτικό μέσο YPD, το οποίο αποτελείται από εκχύλισμα μαγιάς, πεπτόνη, γλυκόζη και αγαρόζη (στερεό μέσο διατήρησης). Το θρεπτικό μέσο της ζύμωσης περιλαμβάνει: γλυκόζη g/l, εκχύλισμα μαγιάς 3 g/l, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g/l, KH 2 PO 4 3 g/l, Νa 2 HPO 4 1 g/l, MgSO 4 7H 2 O 1 g/l, CaCl 2 2H 2 O 0,1 g/l και διάλυμα ιχνοστοιχείων 1 ml/l (ZnSO 4 7H 2 O 0,9 g/l, FeSO 4 7H 2 O 0,6 g/l, H 3 BO 3 2 g/l, MnCl 2 4H 2 O 1,5 g/l, Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,8 g/l, CoCl 2 6H 2 O 0,8 g/l, CuSO 4 5H 2 O 0,5 g/l). Πραγματοποιείται καλλιέργεια του σακχαρομύκητα S. cerevisiae σε ασυνεχείς (batch) καθώς και σε ημι-συνεχείς (fed-batch) συνθήκες (τροφοδοσίας) σε κωνικές φιάλες μέσα σε επωαστήρα με θερμοκρασία 30 o C και ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm. Η ζύμωση του μικροοργανισμού λαμβάνει χώρα σε αερόβιες συνθήκες και για αυτό το λόγο οι κωνικές φιάλες καλύπτονται με υδρόφοβο βαμβάκι. Το αρχικό ενοφθάλμισμα προέρχεται από προκαλλιέργεια όπου ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται σε πλουσιότερο θρεπτικά μέσο. Η ποσότητα του ενοφθαλμίσματος υπολογίζεται ανάλογα με την οπτική πυκνότητα της προκαλλιέργειας και τον ωφέλιμο όγκο της ζύμωσης, ώστε η αρχική οπτική πυκνότητα του μέσου της ζύμωσης να είναι μεταξύ των τιμών 0,3-0,5, μετρούμενη στα 600 nm. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (θολερότητας) της καλλιέργειας χρησιμοποιείται ως η μέθοδος παρακολούθησης του ρυθμού της κυτταρικής αύξησης και πραγματοποιείται με λήψη δείγματος από την καλλιέργεια και απευθείας μέτρηση της απορρόφησης του φωτός από το κυτταρικό αιώρημα σε φασματοφωτόμετρο ορατού/υπεριώδους στα 600 nm. Επίσης, πραγματοποιούνται συγκριτικά πειράματα για διάφορες συνθήκες αερισμού (όγκος θρεπτικού μέσου προς όγκο φιάλης = 1:5-1:2,5-1:4), ταχύτητας ανάδευσης (150 και 250 rpm), ph (5.5-6 - 6.5), μεγέθους ενοφθαλμίσματος (αρχική οπτική πυκνότητα, O.D.@ 600nm = 0,5 4,5) καθώς και για την καλύτερη αναλογία θρεπτικού μέσου σε όρους συγκέντρωσης γλυκόζης (5,, g/l) και πηγής αζώτου (συνολική συγκέντρωση 4, 8, 16 g/l). Η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα μεταφέρεται από τις κωνικές φιάλες σε μεγαλύτερη κλίμακα και η ζύμωση πραγματοποιείται σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα όγκου 3 l (BioFlo 1 Bioreactor/Fermentor, New Brunswick Scientific Co. Inc.). Ο αερισμός της καλλιέργειας πραγματοποιείται με παροχή αέρα ή καθαρού Ο 2 ώστε το επίπεδο του διαλυμένου οξυγόνου (D.O.) στο μέσο καλλιέργειας να παραμένει πάντα μεγαλύτερο από το % του κορεσμού
του οξυγόνου σε αυτό. Η αρχική ροή του αέρα είναι 1 vvm, ενώ κατά την πορεία των πειραμάτων ρυθμίζεται εξωτερικά από το χρήστη μέσω κατάλληλου ροόμετρου. Η παροχή του αέρα/οξυγόνου εκτείνεται γενικά στην περιοχή 1-3 vvm. Ο τροφοδοτούμενος αέρας/οξυγόνο αποστειρώνεται μέσω φιλτραρίσματος με φίλτρα αποστείρωσης Whatman Inc. (U.S.A.) 0.2 μm. Η μέτρηση και ρύθμιση του ph γίνεται με εγκατεστημένο ηλεκτρονικό σύστημα, ενώ μέσω του επίσης εγκατεστημένου λογισμικού παρακολουθείται και ρυθμίζεται η ταχύτητα ανάδευσης. Ο αφρισμός του βιοαντιδραστήρα λόγω του μεγάλου ρυθμού ανάπτυξης, εντοπίζεται αυτόματα από το κατάλληλο μετρητικό και καταστέλλεται με την παροχή του αντι-αφριστικού Sigma Antifoam A4 (1% v/v). Ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες ημι-συνεχούς λειτουργίας που πραγματοποιήθηκαν είχαν αρχικό όγκο ίσο με 1 l. Το θρεπτικό μέσο είναι το ίδιο που αξιοποιήθηκε και στην περίπτωση των κωνικών φιαλών. Το διάλυμα της γλυκόζης που χρησιμοποιήθηκε για την τροφοδοσία είχε συγκέντρωση 300 g/l. Το διάλυμα αποστειρώνεται μέσω βιολογικών φίλτρων αποστείρωσης Whatman 0,4 μm. Η ημι-συνεχής τροφοδοσία ρυθμίστηκε σύμφωνα με τρεις διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας. Κατά την πορεία λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα λαμβάνονται δείγματα των 5 ml σε τακτά χρονικά διαστήματα για μέτρηση των υπολειπόμενων σακχάρων, της αιθανόλης και των υποπροϊόντων της ζύμωσης με υψηλής απόδοσης υγρό χρωματογράφο. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της αιθανόλης, της γλυκόζης και των υποπροϊόντων της ζύμωσης δημιουργήθηκαν πρότυπες καμπύλες αναφοράς με το μίγμα της αιθανόλης, της γλυκόζης, του μυρμηκικού οξέος, του οξικού οξέος και της γλυκερίνης. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε είναι η HiPlex H + (300 mm 7,7mm 8 μm). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Κατά το στατιστικό σχεδιασμό Taguchi μελετήθηκε η επίδραση της προεπεξεργασίας στη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών. Ο συνδυασμός της θερμοκρασίας, του χρόνου και της περιεκτικότητας του οξέος (μετρημένου ως ph) συνθέτει το συνδυαστικό συντελεστή έντασης (combined severity factor, CSF) του σταδίου. Ανάμεσα στα όρια 0,8 και 1 παρατηρούνται οι υψηλότερες τιμές μετατροπής των ημικυτταρινών, που είναι ο παράγοντας που κρίνει την απόδοση του σταδίου αυτού (Σχήμα 1). Η επιλογή των ενδιάμεσων συνθηκών αποφέρει τη μέγιστη τιμή μετατροπής των ημικυτταρινών. Οι τιμές του συντελεστή βρίσκονται σε συμφωνία με τους Lloyd et al. [18], οι οποίοι σημείωσαν τις μέγιστες αποδόσεις σε σάκχαρα για τις συνθήκες εκείνες που αντιστοιχούν σε τιμές 1 με 1,5 για τον συνδυαστικό συντελεστή έντασης. Ως βέλτιστες συνθήκες του σταδίου επιλέχθηκαν οι ενδιάμεσες: 1,5% θειικό οξύ, 1 o C, 45 min, βάσει των αποτελεσμάτων προηγούμενης έρευνας για τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας της φαλαρίδας [3,4]. Ο παραγοντικός στατιστικός σχεδιασμός Box Denken που εφαρμόστηκε στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης αναλύθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα Minitab 14.0. Οι αλληλεπιδράσεις των παραγόντων που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. Ο στατιστικός σχεδιασμός καθόρισε ποιοι παράγοντες επιδρούν σημαντικά στην παραγωγή γλυκόζης (ποσότητα ενζύμου, χρόνος, περιεκτικότητα στερεού και περιεκτικότητα επιφανειοδραστικού) με σημαντικότερη την αλληλεπίδραση ποσότητας ενζύμου και χρόνου. Συμπεραίνεται ότι ο βέλτιστος συνδυασμός συνθηκών είναι 4% περιεκτικότητα στερεού, FPU ενζύμου, 0,04 g/g στερεού συγκέντρωση επιφανειοδραστικού και 72h χρόνος υδρόλυσης. Από τα αποτελέσματα κατασκευάστηκε εμπειρικό μοντέλο παλινδρόμησης για την πρόβλεψη της μέγιστης τιμής παραγωγής αιθανόλης στο εύρος των τιμών των μεταβλητών που χρησιμοποιήθηκαν. Η τιμή της συγκέντρωσης της γλυκόζης ήταν ίση με
12,9 g/l, με υψηλό συντελεστή προσδιορισμού (R 2 = 0,97). Η δράση των επιφανειοδραστικών δε βελτίωσε σημαντικά τις αποδόσεις σε γλυκόζη του σταδίου της υδρόλυσης, σε σχέση με προηγούμενη μελέτη της ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης της φαλαρίδας [3]. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στη χαμηλή περιεκτικότητα του συγκεκριμένου φυτικού είδους (Phalaris aquatica L.) σε λιγνίνη [3]. 80 Μετατροπή Ημικυτταρινών (g/kg DM) 70 60 50 40 30 0-0,4-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Συνδυαστικός Συντελεστής Έντασης (CSF) Σχήμα 1: Επίδραση των συνθηκών προεπεξεργασίας μέσω του συνδυαστικού συντελεστή έντασης του σταδίου στη μετατροπή των ημικυτταρινών. Πραγματοποιήθηκαν επίσης πειράματα με μεγαλύτερη τιμή περιεκτικότητας στερεού (Σχήμα 3) ώστε να αυξηθεί η τελική συγκέντρωση γλυκόζης στο υδρόλυμα για τη μετέπειτα ζύμωση του από το σακχαρομύκητα προς παραγωγή αιθανόλης. Η αύξηση του περιεχόμενου στερεού σε 6% περιεκτικότητα δε δημιούργησε προβλήματα ανάμειξης και μεταφοράς μάζας, ενώ παράλληλα η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξήθηκε στην τιμή 18,8 g/l στις 48 h. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών παραγόντων στη ζύμωση της γλυκόζης από τον σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα των πειραμάτων απεικονίζονται στον Πίνακα 1. Οι συγκριτικές αυτές καλλιέργειες οδήγησαν στο βέλτιστο μέσο, το οποίο αποτελείται από g/l αρχικής γλυκόζης όταν πρόκειται για ασυνεχείς συνθήκες και 8 g/l πηγής αζώτου προερχόμενου από εκχύλισμα μαγιάς και θειικό αμμώνιο σε συγκέντρωση 3 και 5 g/l, αντίστοιχα. Ταυτόχρονα επιλέχθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες αερισμού (όγκος θρεπτικού μέσου προς όγκο φιάλης = 1:5), ανάδευσης (150 rpm), ph (6,5) και αρχικό μέγεθος ενοφθαλμίσματος (αρχική οπτική πυκνότητα ίση με 0,5) που εφαρμόστηκαν στα πειράματα της ημι-συνεχούς τροφοδοσίας. Το στέλεχος του σακχαρομύκητα παρατηρήθηκε ότι δεν επηρεάζει σημαντικά την απόδοση της αιθανόλης και καθώς το στέλεχος που προέρχεται από την τράπεζα μικροοργανισμών DSM έχει σημαντικά μεγαλύτερη φάση υστέρησης, κατά την αλλαγή μέσου ανάπτυξης και τη μεταφορά του κυτταρικού πληθυσμού από το πλουσιότερο μέσο προκαλλιέργειας στο φτωχότερο μέσο ζύμωσης, επιλέχθηκε η περαιτέρω χρήση του στελέχους τύπου ΙΙ από τη Sigma Aldrich. Η ζύμωση του υδρολύματος της ενζυμικής υδρόλυσης πραγματοποιήθηκε σε κωνική φιάλη σε συνθήκες ημι-συνεχούς λειτουργίας. Η τροφοδοσία εφαρμόστηκε σε τρεις δόσεις από τις οποίες η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης (ίση με 18,84 g/l) επιτεύχθηκε μετά τη δεύτερη δόση ταυτόχρονα με τη μέγιστη παραγωγικότητα 0,82 g/(l h) (Σχήμα 4).
,0 17,5 15,0 12,5,0 2 Enzyme*Biomass 3 4 70 60 50 40 30 2 TIme*Biomass 3 4 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 2 P E G 4000* Biomass 3 4 glucose (g/l) < 5,0 5,0-7,5 7,5 -,0,0-12,5 > 12,5 70 TIme*Enzyme 0,06 P EG 4000* E nzy m e 0,06 P E G 4000* TIm e 60 0,05 0,05 50 0,04 0,04 40 30 15 0,03 0,02 15 0,03 0,02 30 45 60 Σχήμα 2: Περιγράμματα (Contour Plots) της επίδρασης τεσσάρων μεταβλητών (ποσότητας ενζύμου, περιεκτικότητας σε στερεό, χρόνος και ποσότητα επιφανειοδραστικού PEG 4000) και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων στη συγκέντρωση της γλυκόζης. 22 Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) 18 16 14 12 8 6 4 2 0 Περιεχόμενο στερεού 2% Περιεχόμενο στερεού 4% Περιεχόμενο στερεού 6% 0 30 40 50 60 70 Χρόνος (h) Σχήμα 3: Δυναμική εξέλιξη της ενζυμικής υδρόλυσης σε σχέση με το χρόνο για διαφορετικό περιεχόμενο στερεού κατά την αντίδραση. Τα πειράματα στον αντιδραστήρα πραγματοποιήθηκαν βασισμένα σε 4 διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας. Η πρώτη πολιτική τροφοδοσίας ακολουθεί σταθερό ρυθμό τροφοδοσίας του συμπυκνωμένου θρεπτικού μέσου από την έναρξη της ζύμωσης. Το πλεόνασμα γλυκόζης από την αρχή της καλλιέργειας οδηγεί την αύξηση των κυττάρων του πληθυσμού του Saccharomyces cerevisiae. Συγκεκριμένα στις 15 ώρες καλλιέργειας, η οπτική πυκνότητα του μέσου της ζύμωσης είναι ίση με 88 στα 600 nm. Η συγκέντρωση της αιθανόλης είναι ίση με 19,77 g/l τιμή που σημειώθηκε και σε καλλιέργειες με χαμηλότερη
κυτταρική βιομάζα. Την ίδια χρονική στιγμή η παραγωγικότητα της αιθανόλης είναι 1,32 g/(l h). Κατά τη δεύτερη πολιτική τροφοδοσίας ο ρυθμός παροχής θρεπτικού μέσου είναι ίσος με το ρυθμό κατανάλωσης των σακχάρων. Η έναρξη της τροφοδοσίας γίνεται όταν μηδενιστεί η συγκέντρωση των αρχικών περιεχόμενων σακχάρων, όταν δηλαδή ολοκληρωθεί το πρώτο στάδιο υπό ασυνεχείς συνθήκες. Η συγκέντρωση της αιθανόλης φτάνει την τιμή 17,46 g/l και η παραγωγικότητα της είναι 1,34 g/(l h). H τρίτη πολιτική τροφοδοσίας που εφαρμόστηκε βασίστηκε σε παράγοντα ελέγχου το ρυθμό κατανάλωσης των κυττάρων. Η διαφορά με την προηγούμενη πολιτική τροφοδοσίας είναι ότι η έναρξη της τροφοδοσίας πραγματοποιήθηκε στη μέση της εκθετικής φάσης ανάπτυξης των κυττάρων, με αποτέλεσμα να μην μηδενιστεί σε κανένα σημείο η περιεχόμενη αιθανόλη στο θρεπτικό μέσο και η τιμή της συγκέντρωσης της αιθανόλης να αυξηθεί τελική στην τιμή 19,12 g/l και η παραγωγικότητα στην τιμή 1,27 g/(l h). Η μέγιστη παραγωγικότητα αιθανόλης με τιμή 1,97 g/(l h) σημειώθηκε στην πολιτική τροφοδοσίας με σταθερό ρυθμό τροφοδοσίας (Σχήμα 5). Σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές τιμές είναι από τα υψηλότερα επίπεδα ρυθμού παραγωγής αιθανόλης. Οι Laopaiboon et al. [14] αναφέρουν παραγωγικότητα 1,68 g/(l h) και οι Dehkhoda et al. [16] επίσης σημειώνουν παραγωγικότητα αιθανόλης στα ίδια επίπεδα (1,6 g/(l h)). α/α Πίνακας 1: Επίδραση διαφόρων παραγόντων κατά τη ζύμωση της γλυκόζης από τον σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae στην παραγωγή αιθανόλης. Ενοφθάλμισμα ph Αιθανόλη (gr) (v:v) (rpm) (gr) (gr) Γλυκόζη Αερισμός Ανάδευση Άζωτο Στέλεχος (A@600nm) 1 DSM 70449 1:2,5 150 3 + 5 0,5 6,5 8,2 2 Type II 1:5 150 3 + 5 0,5 6,5 9,8 3 Type II 1:4 150 3 + 5 0,5 6,5 9,84 4 Type II 1:5 250 3 + 5 0,5 6,5,8 5 Type II 5 1:2,5 150 3 + 5 0,5 6,5 1,02 6 Type II 1:2,5 150 3 + 5 0,5 6,5 1,58 7 Type II 1:2,5 150 1,5 + 2,5 0,5 6,5 7,6 8 Type II 1:2,5 150 5 + 3 0,5 6,5,25 9 Type II 1:2,5 150 + 6 0,5 6,5 8 Type II 1:2,5 150 6 + 0,5 6,5 9,15 11 Type II 1:2,5 150 3 + 5 4 6,5 9,5 13 Type II 1:2,5 150 3 + 5 0,5 5,5 8,9 14 Type II 1:2,5 150 3 + 5 0,5 6 9,98 Τα πειράματα της ζύμωσης με το σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση καθαρής γλυκόζης καθώς και γλυκόζης προερχόμενης από την ενζυμική υδρόλυση, ως πηγή άνθρακα. Η απόκλιση των πειραμάτων με γλυκόζη προερχόμενη από το υδρόλυμα σε σύγκριση με τη ζύμωση με καθαρή γλυκόζη μετρήθηκε σε τιμή ίση με 16%. Η απόκλιση αυτή μπορεί να αποδοθεί κυρίως σε παρεμποδιστικές ενώσεις που απελευθερώνονται κατά την προεπεξεργασία [19]. Η μείωση της διαφοράς μεταξύ των δύο τιμών έχει μελετηθεί με προσθήκη ενεργού άνθρακα για τον αποχρωματισμό του δείγματος και ουδετεροποίηση με άνοδο του ph με ισχυρό αλκάλιο (NaOH) και στη συνέχεια σχηματισμό ιζήματος αλάτων με τη χρήση θειικού οξέος.
Συγκέντρωση Αιθανόλης (g/l) Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) 15 5 0 Οπτική Πυκνότητα Γλυκόζη Αιθανόλη 0 5 15 25 30 Χρόνος (h) 1 0,1 Οπτική Πυκνότητα (O.D. @ 600nm) Σχήμα 4: Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae με συνθήκες ημισυνεχούς τροφοδοσίας σε κωνική φιάλη. 30 0 Συγκέντρωση αιθανόλης (g/l) Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) 25 15 5 0 Οπτική Πυκνότητα Γλυκόζη Αιθανόλη 1 0 5 15 25 Χρόνος (h) Οπτική Πυκνότητα (O.D. @ 600nm) Σχήμα 5: Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae με συνθήκες ημισυνεχούς τροφοδοσίας σε βιοαντιδραστήρα με συνεχή ρυθμό τροφοδοσίας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η κατεργασία με αραιό θειικό οξύ κατά το στάδιο της προεπεξεργασίας διαλυτοποίησε επιτυχώς τις ημικυτταρίνες της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας του λιβαδικού φυτού Phalaris aquatica L. Η στερεή κυτταρίνη διαλυτοποιήθηκε, με τη χρήση μίγματος ενζύμων, προς μονομερή σάκχαρα γλυκόζης σε ικανοποιητικά υψηλές συγκεντρώσεις. Η ζύμωση μελετήθηκε αρχικά σε επίπεδο καλλιέργειας κωνικών φιαλών και στη συνέχεια αναπτύχθηκε στις βέλτιστες συνθήκες με σάκχαρα αποκλειστικά προερχόμενα από την ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης της φαλαρίδας. Ακολούθησε κλιμάκωση της καλλιέργειας στο επίπεδο του βιοαντιδραστήρα, αποκλειστικά σε συνθήκες ημισυνεχούς λειτουργίας, αξιοποιώντας τις βέλτιστες συνθήκες που προέκυψαν από τα πειράματα στο επίπεδο κωνικών φιαλών.
Έπειτα από τη μελέτη και βελτιστοποίηση των τριών σταδίων της ολοκληρωμένης βιοχημικής διεργασίας, η παραγωγή της αιθανόλης πραγματοποιήθηκε με ικανοποιητικές αποδόσεις. Οι συνθήκες αυτές μπορούν να μεταφερθούν σε ακόμα μεγαλύτερη κλίμακα ώστε να βελτιστοποιηθεί η βιομηχανική παραγωγή της αιθανόλης από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα της φαλαρίδας. Επιπρόσθετα, η διεργασία αυτή θα μπορούσε να αποτελέσει μέρος μιας ολοκληρωμένης μονάδας βιοδιυλιστηρίου που θα συνδυάζει την παραγωγή βιοαιθανόλης με την παραγωγή βιοϋλικών υψηλής προστιθέμενης αξίας ώστε να αυξηθεί συνολικά η οικονομική αποδοτικότητα του εγχειρήματος. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού έργου «Αειφόρος Παραγωγή Βιοκαυσίμων και Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Βιοχημικών Προϊόντων από Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα ΛΙΓΝΟΦΟΣ», χρηματοδοτούμενου από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας, Εθνικό Στρατηγικό Πλαίσιο Αναφοράς (ΕΣΠΑ) 07-13, Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα & Επιχειρηματικότητα (ΕΠΑΝ ΙΙ). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Hamelinck N.C., Van Hooijdonk G., Faaij PC.A., Biomass and Bioenergy, 28:384-4 (05). [2] Pappas I., Koukoura Z., Goulas Ch., Kiparissides C., Tananaki Ch., Grassland Science in Europe, 14: 425-427 (09). [3] Παππάς Ι.Α., Διδακτορική διατριβή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (). [4] Pappas I., Koukoura Z., Kiparissides C., Goulas Ch., Tananaki Ch., Grassland Science in Europe, 24: 448-450 (12). [5] Alvira P., Tomas-Pejo E., Ballesteros M., Negro M.J., Bioresource Technology, 1: 4851-4861 (). [6] McMillan J.D., Himmel M.E., Baker J.O., Overend R.P., ACS Symposium Series vol. 566, ACS, Washington, DC, (1994), pp. 292 324. [7] Sun Y., Cheng J., Bioresource Technology, 83:1-11 (02). [8] Karimi K., Kheradmandinia S., Taherzadeh M.J., Biomass Bioenergy, 30:247 253 (06). [9] Kristensen J.B., Borjesson J., Bruun M.H., Tjerneld F., Jοrgensen H., Enzyme and Microbial Technology, 40:888 (07). [] Modig T., Almeida J.R.M., Gorwa-Grauslund M.F., Liden G., Biotechnology and Bioengineering, 0:423-430 (07). [11] Yu G., Yano S., Inoue H., Inoue S., Endo T., Sawayama S., Applied Biochemistry and Biotechnology, 160:539 551 (). [12] Biener R., Steinkämper A., Horn T., Journal of Biotechnology, 160:195-1 (12). [13] Kuhad R.C., Gupta R., Khasa Y. P., Singh A., Bioresource Technology, 1:8348 8354 (). [14] Laopaiboon L., Thanonkeo P., Jaisil P., Laopaiboon P., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 23:1497 1501 (07). [15] Taherzadeh M., Niklasson C., Liden G., Bioresource Technology, 69:59-66 (1999). [16] Dehkhoda A., Brandberg T., Taherzadeh M., BioResources 4, 1:309-3 (09). [17] Kühnel S., Schols H.A., Gruppen H., Biotechnology for Biofuels, 4:14 (11). [18] Lloyd Τ.Α., Wyman C.E., Bioresource Technology, 96:967 1977 (05). [19] Palmqvist E., Hahn-Hagerdal G., Bioresource Technology, 74:25-33 (00).