ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΧΡΗΣΤΟΥ ΝΙΤΣΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΔΡΟΘΕΡΜΙΚΗ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΧΡΗΣΤΟΥ ΝΙΤΣΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΔΡΟΘΕΡΜΙΚΗ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής και Ανόργανης Χημικής Τεχνολογίας του Τομέα Χημικής Τεχνολογίας και Βιομηχανικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: 05-07-2013 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Μάτης Κωνσταντίνος - Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγήτρια Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα - Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Επ. Καθηγητής Τριανταφυλλίδης Κωνσταντίνος - Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Καθηγήτρια Καθηγήτρια Ζουμπούλης Αναστάσιος Κούκουρα Ζωή Λεμονίδου Αγγελική Αν. Καθηγητής Λαζαρίδης Νικόλαος i

Η επταμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της Διδακτορικής Διατριβής του Νίτσου Χρήστου, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 05-07-2013, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής με τίτλο «Υδροθερμική Προκατεργασία και Ενζυμική Υδρόλυση Λιγνοκυτταρινούχας Βιομάζας». Η επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της Επιστήμης. ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Καθηγήτρια Επ. Καθηγητής Καθηγητής Καθηγήτρια Καθηγήτρια Αν. Καθηγητής Μάτης Κωνσταντίνος Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα Τριανταφυλλίδης Κωνσταντίνος Ζουμπούλης Αναστάσιος Κούκουρα Ζωή Λεμονίδου Αγγελική Λαζαρίδης Νικόλαος ii

Νίτσος Χρήστος Α.Π.Θ. Υδροθερμική προκατεργασία και ενζυμική υδρόλυση λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας ISBN «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν.5343/1932, άρθρο 202., παρ.2)» iii

Στους γονείς μου iv

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής και Ανόργανης Χημικής Τεχνολογίας του Τμήματος Χημείας του ΑΠΘ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Κ. Μάτη για την επίβλεψη της διδακτορικής μου διατριβής, και για την άψογη συνεργασία σε όλο το διάστημα της εκπόνησης της. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής, Καθηγήτρια κ. Θ. Χολή-Παπαδοπούλου, για την άψογη συνεργασία και την εκπαίδευση στις τεχνικές Μοριακής Βιολογίας. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω το μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής Επίκουρο καθηγητή κ. Κ. Τριανταφυλλίδη, για την βοήθεια του στην οργάνωση και διεξαγωγή των πειραμάτων, για την καθοδήγηση και τη στήριξη του σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής για τη συμμετοχή τους στην επιστημονική αξιολόγηση της διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Διευθυντή του Εργαστηρίου Γενικής και Ανόργανης Χημικής Τεχνολογίας Καθηγητή κ. Α. Ζουμπούλη, καθώς και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ν. Λαζαρίδη, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Δ. Ζαμπούλη και την Επίκουρη καθηγήτρια κ. Ε. Δεληγιάννη, για την παραχώρηση συσκευών και χώρων του Εργαστηρίου και για τη γενικότερη συνεργασία και τις συμβουλές τους. Από το Εργαστήριο Γενικής και Ανόργανης Χημικής Τεχνολογίας θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους υπόλοιπους καθηγητές, το προσωπικό, τους υποψήφιους διδάκτορες, και μεταπτυχιακούς φοιτητές, για τη συνεργασία τους. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Διδάκτορες Α. Φωτόπουλο και Π. Ξυδά, τους υποψήφιους διδάκτορες Δ. Γκιλιόπουλο, K. Szymanska, Κ. Αβραμίδου, Ι. Χαριστείδη Σ. Στυλιανού, τους μεταπτυχιακούς φοιτητές Ε. Καρανδρέα και Π. Λαζαρίδη, και τις προπτυχιακές φοιτήτριες, Ε. Παπαδοπούλου και Κ. Παντελή, και την MSc. Χημείας Δ. Μεραχτσάκη για τη βοήθεια, τη συνεργασία και τη φιλία τους. Ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τον κύριο Στέφανο Χατζηνικολάου για τη βοήθεια και τις συμβουλές του σε τεχνικά θέματα. Από το Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια κ. Μ. Τσιμίδου και τη Λέκτορα κ. Φ. Μαντζουρίδου για την παραχώρηση συσκευών του Εργαστηρίου και την βοήθεια και συνεργασία τους. v

Από το Εργαστήριο Οργανικής Χημικής Τεχνολογίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή καθηγητή κ. Δ. Μπικιάρη για την παραχώρηση συσκευών καθώς και όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου για τη συνεργασία τους. Από το ΙΤΧΗΔ/ΕΚΕΤΑ θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Διδάκτορες Χ. Μιχαήλωφ και Σ. Καρακούλια, το προσωπικό του Αναλυτικού Τμήματος του Εργαστηρίου Περιβαλλοντικών Καυσίμων και Υδρογονανθράκων, καθώς και το προσωπικό του Εργαστηρίου Ανάλυσης και Χαρακτηρισμού Στερεών. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το προσωπικό από το Ερευνητικό Τμήμα Βιοτεχνολογίας και Μικροβιολογίας, του Ινστιτούτου Χημικής Μηχανικής, του Τεχνολογικού Πανεπιστημίου της Βιέννης και κυρίως την Dr. Astrid R. Mach-Aigner για την καθοδήγηση της στις καλλιέργειες του T. reesei, για την ευγενική παραχώρηση των στελεχών QM9414 και RUTC30, και για τη φιλοξενία της. Επίσης θερμές ευχαριστίες στο COST ACTION CM0903, που κατέστησε δυνατή την παραγματοποίηση αυτής της μελέτης μέσω δίμηνης εκπαίδευσης μου στο Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο της Βιέννης. Θερμές ευχαριστίες επίσης στην εταιρία GENENCOR και ιδίαιτερα στον Dr. Bart Koops, για την ευγενική παραχώρηση των ενζύμων ACCELLERASE 1500, ACCELLERASE XΥ, ACCELLERASE XC, ACCELLERASE BG. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη φίλη μου Βιολόγο MSc Νικητίδου Άννα, για την πολύτιμη βοήθεια της και τη στήριξη της σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής. vi

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα, που περιλαμβάνει κάθε είδους αγροτικά και δασικά υπολείμματα και παραπροϊόντα, αποτελεί μια υποσχόμενη ανανεώσιμη πηγή για την παραγωγή ενέργειας, βιοκαυσίμων και χημικών ενώσεων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Αποτελείται από τρία βασικά δομικά συστατικά, τους υδατάνθρακες κυτταρίνη και ημικυτταρίνη και το φαινολικό πολυμερές λιγνίνη, οργανωμένα σε δομές μικροϊνιδίων. Μια από τις βασικές διεργασίες για την αξιοποίηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας είναι η βιοχημική οδός που μέσω των σταδίων της προκατεργασίας της βιομάζας, της ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης που περιέχει προς γλυκόζη, και της αλκοολικής ζύμωσης της παραγόμενης γλυκόζης, οδηγεί στην παραγωγή βιοαιθανόλης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν ως λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα ξύλο οξυάς και κλαδέματα λεύκας και αμπελιού, που ανήκουν στα αγγειόσπερμα, καθώς και ξύλο πεύκου που ανήκει στα γυμνόσπερμα. Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα υποβλήθηκε σε υδροθερμική προκατεργασία, που είχε ως στόχο την καταστροφή της δομής των μικροινιδίων και την υδρόλυση και διαλυτοποίηση της ημικυτταρίνης, καθώς και σε ενζυμική υδρόλυση για την σακχαροποίηση της κυτταρίνης. Επιπλέον μελετήθηκε η επίδραση ήπιων διεργασιών, όπως η εκχύλιση της λιγνίνης με οργανικούς διαλύτες και η εφαρμογή ήπιας υγρής άλεσης ταυτόχρονα με την ενζυμική υδρόλυση κατά την ενζυμική σακχαροποίηση της κυτταρίνης. Η υδροθερμική προκατεργασία είχε ως βασικό αποτέλεσμα την εκλεκτική απομάκρυνση της ημικυτταρίνης μέσω όξινης υδρόλυσης με καταλύτη τις οξικές ομάδες που εμπεριέχονται ήδη στην ημικυτταρίνη. Η ημικυτταρίνη ανακτάται στα υγρά προϊόντα της υδροθερμικής προκατεργασίας ως μίγμα διαλυτών ολιγομερών/μονομερών ξυλόζης, ενώ ο λόγος της συγκέντρωσης τους καθορίζεται από την ένταση των πειραμαντικών συνθηκών (θερμοκρασίας και χρόνου) η οποία εκφράζεται με τον συντελεστή δριμύτητας logro. Η μέγιστη ανάκτηση ημικυτταρίνης κυμαίνεται στο 60% και για τα τέσσερα είδη βιομάζας και επιτυγχάνεται σε μέτριες τιμές logro 3,8-4,14 (που αντιστοιχούν είτε σε μέτρια θερμοκρασία των 170 ο C και παρατεταμένους χρόνους αντίδρασης 60-120 λεπτών, είτε σε υψηλότερες θερμοκρασίες των 190-200 o C και μικρούς χρόνους των 15 λεπτών), με ταυτόχρονη απομάκρυνση της ημικυτταρίνης από τη βιομάζα της τάξης vii

του 70-80%. Σε υψηλότερες τιμές logro 4,7 (220 ο C, 15 λεπτά) επιτυγχάνεται σχεδόν πλήρης απομάκρυνση της ημικυτταρίνης απο τη βιομάζα αλλά το μεγαλύτερο ποσοστό της παραγόμενης ξυλόζης και των υπολοίπων πεντοζών μετατρέπεται σε προϊόντα αποικοδόμησης (φουρφουράλη, φορμικό οξύ και φουροϊκό οξύ) μέσω αντιδράσεων αφυδάτωσης και οξείδωσης. Επιπλέον, παράγονται και μικρές ποσότητες γλυκόζης μέσω περιορισμένης υδρόλυσης της κυτταρίνης ή λόγω των διαλυτών εκχυλίσιμων συστατικών που υπάρχουν σε σημαντικά ποσοστά στις βιομάζες αμπελιού, λεύκας και πεύκου, καθώς και προϊόντα αποικοδόμησης της γλυκόζης, όπως 5-υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (HMF), φορμικό οξύ και λεβουλινικό οξύ. Η λιγνίνη υφίσταται μερική διαλυτοποίηση, αναδιάταξη και επανασυμπύκνωση στην επιφάνεια των σωματιδίων της βιομάζας ενώ η δομική κυτταρίνη υφίσταται πολύ μικρές μεταβολές. Η υδροθερμική προκατεργασία εκτός από τις αλλαγές στην δομή και σύσταση της βιομάζας προκαλεί σημαντικές μεταβολές και στην υφή και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της. Συγκεκριμένα οδηγεί σε αύξηση της ειδικής επιφάνειας και του όγκου πόρων των σωματιδίων, προσφέροντας έτσι μεγαλύτερη προσβασιμότητα και διαθέσιμη επιφάνεια για τη δράση των ενζύμων. Για τη βιομάζα από ξύλο οξυάς, λεύκας, και αμπελιού, η υδροθερμική προκατεργασία επέτρεψε την σχετικά υψηλή ενζυμική σακχαροποίηση της κυτταρίνης σε ποσοστό 67%, 50% και 75% αντίστοιχα, ενώ αντίθετα μικρή ήταν η μετατροπή στην περίπτωση του πεύκου με 19% σακχαροποίηση. Η επακόλουθη απομάκρυνση της επιφανειακής λιγνίνης με τη χρήση οργανικών διαλυτών αιθανόλη και ακετόνη βελτίωσε την απόδοση της ενζυμικής μετατροπής για την οξυά και τη λεύκα, ενώ μικρότερη ήταν η επίδραση της στο πεύκο. Αντίθετα η εκχύλιση της λιγνίνης από βιομάζα οξυάς με οξικό οξύ επέτρεψε την πλήρη απολιγνινοποίηση της βιομάζας και την σχεδόν πλήρη σακχαροποίηση της με τη δράση των ενζύμων. Ο συνδυασμός της ενζυμικής υδρόλυσης με μια ήπια υγρή άλεση επέτρεψε την ακόμη σημαντικότερη βελτίωση της σακχαροποίησης για όλες τις βιομάζες, φτάνοντας και πάλι την πλήρη σακχαροποίηση για την οξυά (με τη χρήση αιθανόλης ή ακετόνης ως μέσο εκχύλισης της λιγνίνης), το 95% για το αμπέλι, το 67% για τη λεύκα και το 58% για το πεύκο. Το αποτέλεσμα αυτό είναι ιδιαιτέρως θετικό για τις πολύ ανθεκτικές στην υδροθερμική προκατεργασία βιομάζες γυμνόσπερμων φυτών, όπως είναι το πεύκο. Επίσης, η συνδυασμένη ενζυμική υδρόλυση με ήπια άλεση οδήγησε σε ορισμένες περιπτώσεις στην μείωση της viii

ποσότητας του προστιθέμενου ενζύμου χωρίς σημαντική μεταβολή στην μετατροπή της κυτταρίνης σε γλυκόζη. Τέλος τα υδροθερμικά προκατεργασμένα και απολιγνινοποιημένα δείγματα βιομάζας χρησιμοποιήθηκαν ως χαμηλού κόστους υποστρώματα για την παραγωγή κυτταρινασών από τον μύκητα T. reesei, επιτυγχάνοντας μεγαλύτερες ενεργότητες σε σχέση με την αρχική βιομάζα, ενώ η βιομάζα οξυάς που υπέστη υδροθερμική προκατεργασία και απολιγνινοποίηση με οξικό οξύ, οδήγησε σε παραγωγικότητα κυτταρινασών παρόμοια με αυτή που λαμβάνεται όταν ως θρεπτικό υπόστρωμα χρησιμοποιείται καθαρή εμπορική κυτταρίνη. Τα κυριότερα στοιχεία πρωτοτυπίας/καινοτομίας της παρούσας διατριβής συνοψίζονται παρακάτω: Η βελτιστοποίηση των συνθηκών υδροθερμικής προκατεργασίας για την βιομάζα από οξυά και λεύκα προς την παραγωγή σακχάρων ή ολιγομερών ημικυτταρίνης, ή προϊόντων αποικοδόμησης υψηλής αξίας όπως είναι η φουρφουράλη. Η μελέτη της βιομάζας από αμπέλι, ένα αγροτικό παραπροϊόν με ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τον Ελλαδικό χώρο, ως πρώτη ύλη για την παραγωγή αιθανόλης μέσω της υδροθερμικής προκατεργασίας και ενζυμικής υδρόλυσης. Η βελτίωση της απόδοσης της ενζυμικής υδρόλυσης της βιομάζας μέσω εκλεκτικής εκχύλισης της διαλυτοποιημένης και επιφανειακά επανασυμπυκνωμένης λιγνίνης με οργανικούς διαλύτες, και η πλήρης απολιγνινοποίηση της βιομάζας με τη χρήση οξικού οξέος με επακόλουθη επίτευξη πλήρους ενζυμικής σακχαροποίησης. Η εφαρμογή συνδυαστικής ήπιας υγρής άλεσης και ενζυμικής υδρόλυσης της προκατεργασμένης βιομάζας, που επιτρέπει την επίτευξη υψηλής σακχαροποίησης, με ταυτόχρονη μείωση της χρησιμοποιούμενης ποσότητας ενζύμου. Η χρησιμοποίηση της βιομάζας από οξυά που έχει υποστεί υδροθερμική προκατεργασία με ή χωρίς επακόλουθη απολιγνινοποίηση με οξικό οξύ ως ένα οικονομικό υπόστρωμα για την παραγωγή ενζύμων από καλλιέργειες του T. reesei, με αποδόσεις παρόμοιες με αυτές της εμπορικής κυτταρίνης. ix

ABSTRACT Lignocellulosic biomass which includes all kinds of agricultural and forestry residues and/or byproducts, is a promising source for the production of 2 nd generation biofuels and chemicals. It consists of three main structural components, the carbohydrates cellulose and hemicellulose and the phenolic polymer lignin, which are arranged together to form microfibrils. One of the main processes for the valorization of lignocellulosic biomass is the biochemical conversion, which proceeds via the steps of pretreatment, enzymatic hydrolysis of cellulose towards glucose and fermentation of glucose to bioethanol. Lignocellulosic biomass from beech wood, poplar and grapevine trimmings which are hardwoods, and pinewood, a softwood were used in the present study. The biomass samples were subjected to hydrothermal pretreatment, which aimed at the deconstruction of the microfibrils, and to enzymatic saccharification of cellulose towards glucose, while the effect of other mild processes, such as the surface lignin extraction with organic solvents and the effect of a simultaneous enzymatic hydrolysis and mild milling in aqueous media, on the saccharification efficiency were also evaluated. The main effect of hydrothermal pretreatment was the selective hydrolytic dissolution of hemicellulose, catalyzed by the acetyl units contained in hemicellulose. Hemicellulose was retrieved in the hydrothermal process liquids as a mixture of soluble xylo-oligomers/monomeric xylose, and their concentration and ratio is governed by the severity (combined effect of temperature and time) of the processes, which is expressed with the so called severity factor logro. Maximum hemicellulose recovery in the liquid product for all four types of biomass was close to 60%, a value achieved at relatively moderate severities of logro= 3.8-4.14 (induced either by moderate temperatures of ca. 160 o C and prolonged reaction times of 60-120 min or by relatively higher temperatures of 190-200 o C and shorter time of 15 min), with a corresponding value of 70-80% removal of hemicellulose from biomass. At more intense reaction conditions of logro 4,7 (220 o C, 15 min) almost all hemicellulose was removed from biomass but the greater part of xylose and of the various other produced pentosans was converted to degradation products, such as furfural, formic acid and furoic acid, via dehydration and oxidation reactions. In addition, small amounts of glucose were also detected in the hydrothermal process liquids, x

originating either from a limited hydrolysis of cellulose or from soluble extractives present in the biomass of poplar, grapevine and pinewood in relatively high content, which however were also converted to degradation products, such as 5- hydroxymethylfurfural (HMF), formic acid and levulinic acid. Lignin is partially dissolved, relocated and recondensed on the surface of the biomass particles, while structural cellulose remains almost intact. Besides changes in the structure and chemical composition, hydrothermal pretreatment also effects the texture and morphology of biomass, leading to an increase of the specific surface area and pore volume of the biomass particles, thus increasing the accessibility of enzymes and providing a larger available area for the enzymatic reaction. In the case of beech wood, poplar, and grapevine biomass, hydrothermal pretreatment allowed for the relatively high saccharification of cellulose at conversion rates of 67%, 50% and 75%, respectively, whereas it was only 19% for pine wood. When a mild extraction of the surface lignin with the organic solvents ethanol and acetone was applied, the enzymatic conversion for beech wood and grapevine trimmings was improved, while the effect was smaller with pine wood. Extraction of lignin with acetic acid enabled the almost complete delignification of beech wood and its almost complete enzymatic saccharification. In an effort to further optimize the process, the enzymatic hydrolysis was combined with mild milling leading to additional improvement of saccharification for all types of biomass, reaching again almost complete conversion for beech wood, 95% for grapevine trimmings, 67% for poplar trimmings and 58% for pine wood. This last result is promising for the application of the hydrothermal pretreatment to the very resistant to such methods softwoods, such as pine wood. Furthermore, the use of the combined enzymatic hydrolysis - milling process resulted in some cases in considerable reduction of the necessary amount of enzyme without affecting the overall hydrolysis conversion activity. Finally the pretreated and the delignified biomass samples were used as a low cost substrate for the production of cellulose from the microorganism T. reesei, achieving greater productivities compared to untreated biomass, while the beech wood hydrothermally pretreated and delignified by acetic acid gave cellulose yields similar to those obtained when a commercial crystalline cellulose was used as substrate. The major elements of novelty of the current thesis are summarized below: xi

The optimization of hydrothermal pretreatment conditions of beech wood biomass for the production of oligomeric or monomeric sugars or the production of degradation products, such as furfural, of high added value. The evaluation of grapevine biomass, of particular interest for Greece, as a substrate for the production of biofuels via the hydrothermal pretreatment and enzymatic cellulose hydrolysis processes. The improvement of enzymatic hydrolysis of biomass via selective extraction of surface recondensed lignin, with organic solvents such as ethanol and acetone, and its complete enzymatic saccharidication via complete delignification of biomass with the use of acetic acid. The further improvement of enzymatic saccharification via the application of a combined mild milling and enzymatic hydrolysis process, with the simultaneous reduction of the enzymatic dosage. The utilization of the hydrothermally pretreated beech wood biomass, with or without subsequent delignification with the use of acetic acid, as a cheap substrate for the production of cellulases in T. reesei cultures, with similar productivities with those of commercial cellulose. xii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 4 4 1.1. Βιοκαυσιμα 4 1.1.1. Ιστορική αναδρομή 7 1.1.2. Βιοκαύσιμα 1ης γενιάς 7 1.1.2.1. Βιοντήζελ 9 1.1.2.2. Βιοαιθανόλη 9 1.1.3. Βιοκαύσιμα 2ης γενιάς 13 1.1.3.1. Αεριοποίηση της βιομάζας Διεργασία BTL 18 1.1.3.2. Πυρόλυση της βιομάζας- Βιοέλαιο 22 1.1.3.3. Βιοαιθανόλη 2ης γενιάς 23 1.2. Λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα 27 1.2.1. Σύσταση και δομή της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας 27 1.3. Προκατεργασια λιγνοκυτταρινουχου βιομαζας 39 1.3.1. Εισαγωγή 39 1.3.2. Όξινη προκατεργασία 42 1.3.2.1. Προκατεργασία με ανόργανα οξέα 42 1.3.2.2. Προκατεργασία με οργανικά οξέα 49 1.3.3. Προκατεργασία με βάσεις (Αλκαλική προκατεργασία) 52 1.3.3.1. Προκατεργασία με ανόργανες βάσεις 52 1.3.3.2. Προκατεργασία με οργανικές βάσεις 54 1.3.4. Υδροθερμική μέθοδος 57 1.3.5. Συνδυασμένες χημικές και φυσικές μέθοδοι 63 1.3.6. Οξειδωτικές μέθοδοι 71 1.3.7. Οργανική Διαλυτοποίηση (Organosolv) 78 1.4. Ενζυμική υδρόλυση 80 1.4.1. Κατηγορίες κυτταρινασών και καταλυτική τους δράση 80 1.4.2. Προσδιορισμός της ενζυμική δραστικότητας των κυτταρινασών 84 1.4.3. Βακτηριακά συστήματα κυτταρινασών 86 1.4.4. Συστήματα κυτταρινασών από μύκητες 88 1.4.5. Επαγωγή, καταστολή και παραγωγή κυτταρινασών 94 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 98 2.1 Είδη Λιγνοκυτταρινούχας Βιομάζας 98 2.2 Πειράματα υδροθερμικής προκατεργασίας 100 2.3 Πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης 104 2.3.1 Εμπορικά και εργαστηριακά ένζυμα 104 2.3.2 Προσδιορισμός μέγιστης ενζυμικής σακχαροποίησης λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας 107 2.3.3 Πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας 108 2.3.4 Καλλιέργειες παραγωγής ενζύμων 109 2.3.5 Προσδιορισμός ενεργοτήτων κυτταρινολυτικών ενζύμων 110 2.4 Αναλυτικές τεχνικές 113 2.4.1 Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC). 113 2.4.2 Σταθμικές αναλύσεις 115 xiii

2.4.3 Φασματοσκοπία Ατομικής Εκπομπής- Επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (Inductive Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy, ICP-AES). 115 2.4.4 Αέριος Χρωματογραφία- Φασματομετρία Μαζών (GC-MS). 116 2.4.5 Στοιχιακή Ανάλυση (Elemental Analysis). 116 2.4.6 Περίθλαση Ακτίνων Χ Σκόνης (XRD). 116 2.4.7 Ποροσιμετρία Αζώτου (Προσδιορισμός Ειδικής Επιφάνειας και Όγκου των Πόρων). 118 2.4.8 Θερμοσταθμική ανάλυση (Thermogravimetric analysis, TGA)/Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC). 118 2.4.9 Φασματοσκοπία υπερύθρου (Fourier transform infrared spectroscopy FT-IR). 119 2.4.10 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Scannining Electron Microscopy, SEM). 119 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΥΔΡΟΘΕΡΜΙΚΗ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΞΥΛΟΥ ΟΞΥΑΣ 121 3.1 Σύσταση της αρχικής βιομάζας 121 3.2 Επίδραση της δριμύτητας (logro) στη διαλυτοποίηση της βιομάζας 124 3.3 Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της υδροθερμικά προκατεργασμένης βιομάζας 126 3.4 Χημική σύσταση της υδροθερμικά προκατεργασμένης βιομάζας 133 3.5 Επίδραση της υδροθερμικής προκατεργασίας στη χημική σύσταση των υγρών προϊόντων 136 3.6 Βελτιστοποίηση συνθηκών/δριμύτητας υδροθερμικής επεξεργασίας. 143 3.7 Ενζυμική υδρόλυση 148 3.8 Συμπεράσματα 150 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΥΔΡΟΘΕΡΜΙΚΗ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΛΑΔΕΜΑΤΩΝ ΛΕΥΚΑΣ ΚΑΙ ΑΜΠΕΛΙΟΥ ΚΑΙ ΞΥΛΟΥ ΠΕΥΚΟΥ 152 4.1 Σύσταση της αρχικής βιομάζας 152 4.2 Επίδραση της δριμύτητας (logro) στη διαλυτοποίηση της βιομάζας 153 4.3 Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της υδροθερμικά προκατεργασμένης βιομάζας 158 4.4 Σύσταση των υγρών προϊόντων της υδροθερμικής προκατεργασίας 163 4.5 Βελτιστοποίηση συνθηκών/δριμύτητας υδροθερμικής επεξεργασίας. 174 4.6 Ενζυμική υδρόλυση υδροθερμικά προκατεργασμένης βιομάζας 178 4.7 Συμπεράσματα 181 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΥΔΡΟΛΥΣΗΣ ΥΔΡΟΘΕΡΜΙΚΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΜΕΝΗΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ 184 5.1 Ενζυμική υδρόλυση υδροθερμικά προκατεργασμένης βιομάζας σε χαμηλές συγκεντρώσεις βιομάζας (2% κ.β.) 184 5.2 Ενζυμική υδρόλυση υδροθερμικά προκατεργασμένης βιομάζας σε υψηλότερες συγκεντρώσεις βιομάζας (7% κ.β.). 192 5.3 Επίδραση της απομάκρυνσης λιγνίνης από την επιφάνεια της βιομάζας στην ενζυμική υδρόλυση 203 xiv

5.4 Συνδυασμός ενζυμικής υδρόλυσης και ήπιας υγρής άλεσης. 217 5.5 Συμπεράσματα 245 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΩΝ ΑΠΟ ΤΟΝ ΜΥΚΗΤΑ Τ. REESEI 252 6.1 Εισαγωγή 252 6.2 Παραγωγή ξυλανασών, ενδογλυκανασών, κυτταρινασών με πρότυπους υδρατάνθρακες 253 6.3 Παραγωγή κυτταρινασών από λιγνοκυτταρινούχο βιομάζα 264 6.4 Υδρόλυση λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας με τα εργαστηριακά παραγόμενα ένζυμα 267 6.5 Συμπεράσματα 269 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ 271 7.1 Γενικά Συμπεράσματα 271 7.2 Προτάσεις για μελλοντική έρευνα 274 Βιβλιογραφία 278 xv

ΕΙΣΑΓΩΓΉ Η παραγωγή και η χρήση της ενέργειας είναι το θεμέλιο του σύγχρονου πολιτισμού. Τα ορυκτά καύσιμα (άνθρακας και παράγωγα του πετρελαίου όπως το ντίζελ, η βενζίνη και η κηροζίνη) υπήρξαν η βασική πηγή ενέργειας είτε για την παραγωγή ηλεκτρισμού και θερμότητας, είτε ως καύσιμα μεταφορών σε όλη τη διάρκεια του εικοστού αιώνα. Ωστόσο, η ασταθής αγορά του πετρελαίου, καθώς και η αβεβαιότητα για την μελλοντική επάρκεια των ορυκτών καυσίμων, ώθησε την έρευνα για την εύρεση εναλλακτικών πηγών ενέργειας που είτε υπάρχουν σε πλεόνασμα στη φύση, είτε μπορούν να παραχθούν τοπικά έτσι ώστε να μειωθεί η εξάρτηση των εθνικών οικονομιών από το εισαγόμενο πετρέλαιο. Επιπρόσθετα, η αξιοποίηση ανανεώσιμων και πιο φιλικών προς το περιβάλλον πηγών ενέργειας είναι συνυφασμένη και με την ανάγκη μείωσης των εκπομπών διοξειδίου του άνθρακα που παράγονται από την καύση των ορυκτών καυσίμων, αφού το ανθρωπογενώς παραγόμενο CO2 θεωρείται ο μεγαλύτερος παράγοντας συνεισφοράς στο φαινόμενο του θερμοκηπίου και της αύξησης της μέσης θερμοκρασίας του πλανήτη. Η πρώτη γενιά βιοκαυσίμων, το βιοντήζελ και η βιοαιθανόλη, προέρχονται από βρώσιμες πρώτες ύλες, (για παράδειγμα ηλιέλαιο και καλαμπόκι, αντίστοιχα), και για το λόγο αυτό έχει θεωρηθεί ότι οδηγούν σε αύξηση της τιμής των τροφίμων, καθώς επίσης και σε άλλες αρνητικές επιδράσεις, όπως εντατική χρήση γης και μείωση της βιοποικιλότητας. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκαν τα τελευταία χρόνια τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς τα οποία παράγονται κυρίως από λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα. Ειδικότερα, όταν η βιομάζα προέρχεται από υπολείμματα ή παραπροϊόντα δασικών και αγροτικών δραστηριοτήτων και συναφών βιομηχανιών, αντιπροσωπεύει την περισσότερο υποσχόμενη ανανεώσιμη πηγή για την παραγωγή των βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς[1]. Η στροφή σε λιγνοκυτταρινούχα υλικά ως πηγές βιομάζας για την παραγωγή καυσίμων και χημικών, στηρίχτηκε στο γεγονός ότι αποτελούνται σε μεγάλο ποσοστό (έως και 70%) από σάκχαρα στη δομή της κυτταρινής και της ημικυτταρίνης και επομένως είναι κατάλληλες πρώτες ύλες για αλκοολική ζύμωση προς παραγωγή βιοαιθανόλης. Το υπόλοιπο περίπου 30%, αποτελείται από το φαινολικό πολυμερές λιγνίνη, η οποία εκτός από την χρήση της ως στερεό βιοκαύσιμο για την παραγωγή θερμότητας/ηλεκτρισμού θα μπορούσε να υποστεί επίσης χημική/βιολογική μετατροπή προς χημικές ενώσεις υψηλής αξίας. Όσον 1

αφορά σε θέματα περιβαλλοντικής ηθικής και πρόληψης, η χρήση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας ως πηγή ενέργειας και καυσίμων παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι δεσμεύει τον άνθρακα από την ατμόσφαιρα κατά τη φωτοσύνθεση και την ανάπτυξη των φυτών, και έτσι η χρήση των βιοκαυσίμων θεωρείται ότι έχει ουδέτερη συνεισφορά στον κύκλο του άνθρακα (carbon neutral) σε αντίθεση με τα ορυκτά καύσιμα. Τέλος, η χρήση ως πρώτων υλών παραπροϊόντων όπως είναι το πριονίδι από ξύλα, τα κλαδέματα οπωροφόρων δέντρων, τα άχυρα από αγροτικά υπολείμματα, κ.α., για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προτιθέμενης αξίας, θεωρήθηκε ότι θα τονώσει την αγροτική οικονομία και επιπλέον θα δοθεί λύση σε θέματα διαχείρισης τέτοιου είδους αποβλήτων. Τρεις είναι οι κύριες μέθοδοι για την αξιοποίηση της λιγνοκυτταρίνης για την παραγωγή καυσίμων και χημικών προϊόντων. Η θερμοχημική μέθοδος που περιλαμβάνει την αεριοποίηση της βιομάζας προς παραγωγή αερίου σύνθεσης και την χρήση του για παραγωγή υγρών υδρογονανθράκων (κυρίως ολεφινών) και παραφινών μεγάλου μοριακού βάρους (κηρών) μέσω της καταλυτικής σύνθεσης Fischer Tropsch, και τέλος την υδρογονοπυρόλυση τους για την παραγωγή υδρογονανθράκων στην περιοχή μοριακών βαρών της βενζίνης και του ντήζελ. Η ταχεία πυρόλυση (με ή χωρίς τη χρήση καταλυτών) που οδηγεί στην παραγωγή βιοελαίου πλούσιου σε μια πληθώρα οξυγονούχων χημικών ενώσεων και αρωματικών, που μπορεί να αναβαθμιστεί περαιτέρω με καταλυτικές διεργασίες σε καύσιμα και χημικά. Η βιοχημική μέθοδος, που περιλαμβάνει την προκατεργασία για το άνοιγμα της δομής του ινιδίου της βιομάζας, την ενζυμική υδρόλυση για τη μετατροπή της κυτταρίνης σε γλυκόζη, την ζύμωση της γλυκόζης σε αιθανόλη, και την απόσταξη για τον καθαρισμό και την παραλαβή της αιθανόλης σε καθαρότητα καυσίμου. Για την βιοχημική μετατροπή της λιγνοκυτταρίνης έχουν προταθεί και μελετώνται διάφορες μέθοδοι για την προκατεργασία, διάφορες πηγές ενζύμων για την ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης, διάφορα βακτήρια και ζύμες για τη ζύμωση των σακχάρων, καθώς και συνδυασμοί των διεργασιών αυτών τόσο στη σειρά όσο και ταυτόχρονα. Ένας από τους στόχους για την επιτυχή παραγωγή αιθανόλης (ή άλλων προϊόντων ζύμωσης) με τη βιοχημική μέθοδο είναι η μείωση του κόστους, τόσο από τη χρήση αντιδραστηρίων, όσο και από την επένδυση κεφαλαίου (εξοπλισμού), αλλά και του κόστους παραγωγής των ενζύμων που, αυτή τη στιγμή αντιπροσωπεύει ένα από τα σημαντικότερα εμπόδια για την εκτεταμένη εμπορική εφαρμογή της μεθόδου. Εκτός των παραπάνω όμως στόχων, όπως αυτοί καθορίζονται από τις οικονομικές 2

παραμέτρους της μεθόδου, θα πρέπει να ληφθούν υπ όψη και οι περιβαλλοντικές επιπτώσεις των προτεινόμενων διεργασιών, όπως αυτές καθορίζονται από τις Αρχές της Πράσινης Χημείας και της Πράσινης Χημικής Τεχνολογίας, σχετικά με τη χρήση ασφαλέστερων αντιδραστηρίων και διαλυτών και την ανάπτυξη αποδοτικότερων μεθόδων που καταναλώνουν λιγότερη ενέργεια και αξιοποιούν στο μέγιστο πρώτες ύλες και αντιδρώντα (οικονομία ατόμου). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής και έχοντας υπόψη τα παραπάνω, προτάθηκε μια ολοκληρωμένη μέθοδος-διεργασία που θα επιτρέπει την προκατεργασία και την κλασματοποίηση των τριών κύριων συστατικών της βιομάζας (κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και λιγνίνη) με τη χρήση ως μοναδικών αντιδραστηρίων του νερού, καθώς και οργανικών διαλυτών που είναι τυπικά προϊόντα ζύμωσης από βιοτεχνολογικές διεργασίες (όπως η αιθανόλη, η ακετόνη και το οξικό οξύ) και θα μπορούσαν να εφαρμοστούν για την βιοχημική αξιοποίηση της λιγνοκυτταρίνης. Τα διάφορα στάδια της διεργασίας εφαρμόστηκαν σε τέσσερα είδη λιγνοκυτταρίνης, που ήταν εμπορική βιομάζα οξυάς (Lignocel), υπολείμματα υλοτομίας (κλαδέματα) λεύκας, αγροτικά υπολείμματα (κλαδέματα) αμπελιού, καθώς και βιομηχανικά υπολείμματα (ροκανίδια) πεύκου. Η βιομάζα που προκύπτει από τα διάφορα στάδια προκατεργασίας επιτρέπει την ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης με αποδόσεις που φτάνουν το 80%. Περαιτέρω βελτιστοποίηση οδήγησε στην ανάπτυξη μιας υβριδικής μεθόδου που συνδυάζει την ενζυμική υδρόλυση με την ταυτόχρονη ήπια υγρή άλεση της βιομάζας με σκοπό την μείωση του μεγέθους των σωματιδίων, η οποία οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση της απόδοσης της ενζυμικής υδρόλυσης έως και 100%. Τέλος η βιομάζα που προκύπτει από τις παραπάνω μεθόδους προκατεργασίας είναι κατάλληλο υπόστρωμα για την επι τόπου παραγωγή ενζύμων τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αποτελεσματική υδρόλυση της βιομάζας. 3

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1.1. Βιοκαύσιμα 1.1.1. Ιστορική αναδρομή Με τον όρο βιοκαύσιμα εννούμε συνήθως όλα τα καύσιμα που προέρχονται από οργανικά υλικά, στα οποία υλικά αναφερόμαστε με τον γενικότερο όρο βιομάζα. Με βάση την κοινοτική οδηγία 2003/30/ΕΚ ως βιομάζα ορίζεται «το βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα προϊόντων, αποβλήτων και καταλοίπων από γεωργικές (συμπεριλαμβανομένων φυτικών και ζωικών ουσιών), δασοκομικές και συναφείς βιομηχανικές δραστηριότητες, καθώς και το βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα των βιομηχανικών και αστικών αποβλήτων». Με την πιο ευρεία έννοια του όρου το πρώτο βιοκαύσιμο μπορεί να θεωρηθεί το ξύλο το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την θέρμανση και το μαγείρεμα από τον πρώτο άνθρωπο, ενώ διάφορα λίπη και έλαια (π.χ. λάδι φάλαινας ή ελαιόλαδο) έχουν χρησιμοποιηθεί στην ανθρώπινη ιστορία ως καύσιμο για τις λάμπες. Ωστόσο ο όρος βιοκαύσιμα αναφέρεται σήμερα στα καύσιμα μεταφορών και από αυτά τα πιο κοινά είναι το βιοντήζελ και η βιοαιθανόλη. Το βιοντήζελ παράγεται από την αντίδραση της μετεστεροποίησης των λιπαρών οξέων, ενώ η βιοαιθανόλη, από τη ζύμωση σακχάρων από σακχαρούχες, αμυλούχες και λιγνοκυτταρινούχες πρώτες ύλες. Παρότι τα βιοκαύσιμα έχουν έρθει, τα τελευταία χρόνια, στην επικαιρότητα τόσο λόγω της διαφαινόμενης εξάντλησης των αποθεμάτων του αργού πετρελαίου, όσο και της ανάγκης για μείωση των αέριων ρύπων (κυρίως του CO2) που παράγονται από την καύση των πετρελαϊκών καυσίμων, δεν αποτελούν μια πρόσφατη επιστημονική ανακάλυψη. Η παραγωγή βιοκαυσίμων ξεκινάει από τον 19 ο αιώνα, και η τεχνολογία που χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή τους είναι από πολλές απόψεις παρόμοια με την σημερινή. Έτσι για την παραγωγή βιοντήζελ χρησιμοποιήθηκε ως πρώτη ύλη φυτικό έλαιο προερχόμενο από διάφορες πηγές όπως καλαμποκέλαιο, φυστικέλαιο, ακόμα και έλαιο από κάνναβη. Ο Rudolph Diesel, εφευρέτης του ντιζελοκινητήρα, χρησιμοποίησε φυστικέλαιο ως καύσιμο για την πρώτη επίδειξη της εφεύρεσης του το 1898. Τα οχήματα με ντιζελοκινητήρα χρησιμοποιούσαν αρχικά φυτικά έλαια ως καύσιμα μέχρι που σταδιακά αντικαταστάθηκαν με το ντήζελ που προερχόταν από το 4

πετρέλαιο. Ωστόσο η ανησυχία για την επάρκεια του πετρελαϊκού ντίζελ ήταν από τότε υπαρκτή και ο Rudolph Diesel είχε πει «η χρήση των φυτικών ελαίων ως καύσιμα κινητήρων μπορεί να φαίνεται ασήμαντη σήμερα, αλλά τέτοια έλαια μπορεί να γίνουν, με την έλευση του χρόνου, τόσο σημαντικά όσο το πετρέλαιο». Αντίστοιχα ο Nikolaus August Otto, εφευρέτης του κινητήρα εσωτερικής καύσης, είχε οραματιστεί την αιθανόλη ως το καύσιμο για τον δικό του κινητήρα. Ο Henry Ford επίσης είχε κατασκευάσει το πρώτο του αυτοκίνητο (1903-1926 Model T) ώστε να κινείται με αιθανόλη από κάνναβη, ενώ είχε κατασκευάσει και ένα εργοστάσιο παραγωγής αιθανόλης που θα χρησίμευε ως καύσιμο ή ως πρόσθετο της βενζίνης. Η προσωρινή αφθονία της βενζίνης όμως έγειρε την πλάστιγγα υπέρ των ορυκτών καυσίμων. Ωστόσο η παραγωγή βενζίνης χαμηλής ποιότητας κατά το τέλος του Πρώτου Παγκοσμίου Πολέμου οδήγησε στην απόφαση για ανάμειξη της βενζίνης με αιθανόλη για βελτίωση της συμπεριφοράς της πρώτης ως καύσιμο. Η πλήρης αντικατάσταση της βενζίνης από αιθανόλη ωστόσο, δεν φαινόταν ακόμα δυνατή. Το πρόβλημα ήταν η διαθεσιμότητα της αιθανόλης που είχε ως κύρια πηγή το καλαμπόκι. Μια έκθεση της DuPont το 1919 έδειξε ότι θα απαιτούνταν το 50% ή και παραπάνω όλων των καλλιεργειών καρπών και σακχάρων για να αντικατασταθεί η βενζίνη από αιθανόλη. Η χρήση της αιθανόλης ως καύσιμο είχε προβλεφθεί και από πρωτοπόρους επιστήμονες με την κυτταρίνη ως πρώτη ύλη και το 1917 ο Alexander Graham Bell είχε πει: «Η αιθανόλη είναι ένα όμορφο, καθαρό και αποδοτικό καύσιμο. Μπορεί να κατασκευαστεί από στελέχη καλαμποκιού, αλλά και από οποιαδήποτε φυτική ύλη μπορεί να υποστεί ζύμωση. Δεν χρειάζεται ποτέ να φοβηθούμε την εξάντληση των τωρινών μας αποθεμάτων καυσίμων όσο μπορούμε να εξασφαλίσουμε μια ετήσια παραγωγή αιθανόλης στο βαθμό που είναι αναγκαία». Ο Harold Hibbert που μελετούσε την υδρόλυση της κυτταρίνης στο Yale είπε αναφορικά με την έκθεση για αποθέματα πετρελαίου των Η.Π.Α. το 1920: «Σε 10 με 20 χρόνια η χώρα αυτή θα εξαρτάται πλήρως από εξωτερικές πηγές για την προμήθεια σε υγρά καύσιμα και θα πληρώνει τεράστια ποσά ετησίως ώστε να εξασφαλίζει αργό πετρέλαιο από το Μεξικό, τη Ρωσία και την Περσία. Ο χημικός, ωστόσο, μπορεί να λύσει αυτό το πρόβλημα, εργαζόμενος με τα άφθονα κυτταρινούχα απόβλητα από αγροτικές καλλιέργειες, υλοτομικές δραστηριότητες και φύκια σαν μια πηγή αιθανόλης». 5

Παρότι αρχικά η ανάμιξη της βενζίνης με αιθανόλη είχε θεωρηθεί η λύση στο πρόβλημα της χαμηλής ποιότητας της βενζίνης, προκρίθηκε προσωρινά η χρήση του τετρααιθυλιούχου μολύβδου ως βελτιωτικό - παρότι ήταν ιδιαίτερα τοξικός- μέχρι η τεχνολογία της αιθανόλης να ωριμάσει. Τελικά ο τετρααιθυλιούχος μολύβδος αποδείχθηκε τόσο κερδοφόρος που η ιδέα της αιθανόλης ως βελτιωτικό βενζίνης εγκαταλείφθηκε, μαζί φυσικά με την ιδέα της πλήρους αντικατάστασης της βενζίνης από αιθανόλη στις Η.Π.Α. Εξαιρέσεις αποτέλεσαν το εργοστάσιο του Ford στις H.Π.Α. αλλά και προγράμματα ανάμιξης αιθανόλης/βενζίνης σε βιομηχανικές χώρες σε Ευρώπη ( Βρετανία, Γαλλία, Γερμανία, Ιταλία και Ανατολική Ευρώπη) και Λατινική Αμερική. Βασικοί στόχοι αυτών των προγραμμάτων ήταν: Εθνική Ασφάλεια: Χώρες χωρίς αποθέματα πετρελαίου θεωρούσαν ότι εκτός από βελτιωτικό βενζίνης, η αιθανόλη αποτελεί μια πηγή καυσίμων σε περίπτωση ανάγκης. Στήριξη Αγροτικής Οικονομίας: Χώρες με αγροτικά πλεονάσματα θεώρησαν ότι τα προγράμματα ανάμιξης αιθανόλης σταθεροποιούν την αγροτική οικονομία. Ανάπτυξη εναλλακτικών αντι-κροτικών προσθέτων βενζίνης, λόγω της μεγάλης τοξικότητας του μολύβδου. Τα βιοκαύσιμα ξαναήρθαν στην επικαιρότητα στον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο όταν η έλλειψη του πετρελαίου υποχρέωσε τις αντιμαχόμενες πλευρές να αναζητήσουν εναλλακτικές πηγές καυσίμων για να κινήσουν την πολεμική τους μηχανή. Κατά τη διάρκεια του πολέμου η Γερμανία ήταν από τις χώρες με μεγάλη έλλειψη σε πετρέλαιο, και για το λόγο αυτό χρησιμοποίησε μείγμα βενζίνης με αιθανόλη που προερχόταν από πατάτες και ονομαζόταν Reichskraftsprit. Στη Βρετανία η αιθανόλη που αναμιγνυόταν με τη βενζίνη προερχόταν από δημητριακά και ονομαζόταν Discol. Την έλειψη πετρελαίου κατά τη διάρκεια του πολέμου, ωστόσο, ακολούθησε η διάθεση φθηνού και άφθονου πετρελαίου από τις χώρες του Αραβικού Κόλπου, και το ενδιαφέρον για τα βιοκαύσιμα ελαττώθηκε. Οι πετρελαϊκές κρίσεις όμως του 1973 και 1979 διέκοψαν τη ροή του πετρελαίου και εκτόξευσαν τις τιμές του οδηγώντας και πάλι στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών καυσίμων μεταφορών και έφεραν την έρευνα για τα βιοκαύσιμα στο προσκήνιο. 6

Στους παραπάνω γεωπολιτικούς και κοινωνικοοικονομικούς λόγους, έχουν πλέον προστεθεί οι σύγχρονες προκλήσεις που σχετίζονται με την προστασία του περιβάλλοντος μέσω μείωσης των εκπομπών του CO2 που συνεισφέρει στο φαινόμενο του θερμοκηπίου και διαφόρων αερίων ρύπων (οξείδια του αζώτου και του θείου, άκαπνοι τοξικοί υδρογονάνθρακες κ.α.) που επηρεάζουν αρνητικά όχι μόνο τον άνθρωπο αλλά και το σύνολο του φυτικού και ζωϊκού οικοσυστήματος. Η «βιώσιμη» παραγωγή βιοκαυσίμων η οποία θα μπορούσε να αποτελέσει μέρος της λύσης των παραπάνω προβλημάτων, εξαρτάται κυρίως από δύο παράγοντες: (α) την διασφάλιση της πρώτης ύλης-βιομάζας που δεν ανταγωνίζεται τα τρόφιμα, δεν επηρεάζει τη βιοποικιλότητα, και στην καλύτερη περίπτωση περιλαμβάνει υπολείματα και παραπροϊόντα χαμηλής ποιότητας και αξίας, και (β) την ανάπτυξη νέων αποδοτικών και φιλικών προς το περιβάλλον διεργασιών παραγωγής βιοκαυσίμων, στοχεύοντας σε ένα θετικό ενεργειακό ισοζύγιο με το μικρότερο δυνατό περιβαλλοντκό αποτύπωμα. 1.1.2. Βιοκαύσιμα 1 ης γενιάς Με τον όρο βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς εννοούμε συνήθως τη βιοαιθανόλη και το βιοντήζελ τα οποία παράγονται από αγροτικά προϊόντα που περιλαμβάνουν ζάχαρη ή άμυλο και ελαιούχους καρπούς, αντίστοιχα, δηλαδή από εδώδιμα προϊόντα με τη χρήση συμβατικών τεχνολογιών[2]. 1.1.2.1. Βιοντήζελ Το βιοντήζελ παράγεται από φυτικά έλαια και ζωϊκά λίπη μέσω ομογενών ή ετερογενών καταλυτικών και βιοκαταλυτικών αντιδράσεων εστεροποίησης και μετεστεροποίησης. Ομογενής κατάλυση. Η κλασική διεργασία παραγωγής βιοντήζελ, είναι η αντίδραση μετεστεροποίησης των τριγλικεριδίων των ελαίων προς μεθυλεστέρες των αντίστοιχων ελεύθερων λιπαρών οξέων (Σχήμα 1.1). Οι καταλύτες της αντίδρασης μπορούν να είναι είτε βάσεις[3] (όπως καυστικό νάτριο ή κάλιο) είτε οξέα [4, 5] όπως θεϊικό, και υδροχλωρικό σε σχετικά ήπιες θερμοκρασίες (50-80 o C) Στα 7

προβλήματα της διεργασίας περιλαμβάνονται η μη δυνατότητα ανακύκλωσης του καταλύτη, η ανάγκη πλύσης του βιοντήζελ για καθαρισμό από σάπωνες και άλατα, η κατεργασία του υδατικού αποβλήτου που δημιουργείται από τις πλύσεις, και τέλος ο διαχωρισμός και καθαρισμός της γλυκερόλης που αποτελεί το βασικό παραπροϊόν της αντίδρασης, καθώς o κανονισμός της Ευρωπαϊκής Ένωσης (EN 14214) προβλέπει περιεχόμενο του βιοντήζελ σε γλυκερόλη μικρότερο του 0.02%[2]. Η μετεστεροποίηση των τριγλυκεριδίων με οξέα δεν έχει μελετηθεί τόσο εκτεταμένα όσο η βασικά καταλυόμενη διεργασία, λόγω των μειονεκτημάτων της που περιλαμβάνουν τους χαμηλότερους ρυθμούς αντίδρασης, την ανάγκη για πιο έντονες συνθήκες, και τον σχηματισμό ανεπιθύμητων δευτερογενών προϊόντων όπως είναι αιθέρες της γλυκερόλης. Στο Σχήμα 1.2 παρουσιάζεται ένα απλοποιημένο σχεδιάγραμμα μονάδας/διεργασίας συνεχούς ροής για τη μετεστεροποίηση ελαίων[6]. Σχήμα 1.1. Αντίδραση μετεστεροποίησης τριγλικεριδίων προς παραγωγή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων (βιοντήζελ) (από αναφορά [6]). Ετερογενής κατάλυση. Εκτός από τα ανόργανα οξέα και βάσεις (ομογενείς καταλύτες) η αντίδραση μετεστεροποίησης των τριγλικεριδίων μπορεί να πραγματοποιηθεί και με ετερογενείς καταλύτες όπως είναι στερεοί όξινοι καταλύτες, π.χ. Ζn ακινητοποιημένος σε γέλη σίλικας[7] ή μεσοπορώδες σύνθετο υλικό από άνθρακά και σίλικα με δραστικές σουλφουνομάδες[8] και βασικοί καταλύτες όπως Mg-MCM-41, υδροταλκίτη Mg-Al, ζιρκονία εμποτισμένη με K + [9] και οξείδιο του ασβεστίου (CaO), υδροξείδιο του ασβεστίου (Ca(OH)2), ή ανθρακικό ασβέστιο (CaCO3) [10]. Τα πλεονεκτήματα της ετερογενούς κατάλυσης περιλαμβάνουν την δυνατότητα της εύκολης ανακύκλωσης και της επαναχρησιμοποίησης των καταλυτών, την ελάττωση των αποβλήτων (αλάτων και σαπώνων), τις σχετικά ήπιες θερμοκρασίες που απαιτούνται για πολλούς από τους στερεούς καταλύτες αλλά και τις υψηλές τους αποδόσεις σε μεθυλ- και αιθυλεστέρες των λιπαρών οξέων[2]. 8

Σχήμα 1.2. Συνεχής διεργασία μετεστεροποίησης ελαίων (παραγωγής βιοντήζελ) (από αναφορά[6]). Βιοκατάλυση. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή του βιοντήζελ είναι κυρίως οι λιπάσες και μπορεί να είναι στην ελεύθερη του μορφή (ομογενής κατάλυση)[11] ή ακινητοποιημένες σε στερεούς φορείς όπως είναι μαγνητικά νανοσωματίδια[12] ή διάφορα μικρο/μεσοπορώδη υλικά[13]. Το βιοντήζελ παράγεται με τη δράση των λιπασών σε ήπιες συνθήκες και είναι καθαρότερο του χημικά παραγόμενου βιοντήζελ, ενώ σημαντικό μειονέκτημα της χρήσης ενζύμων είναι το υψηλό κόστος παραγωγής τους κάτι το οποίο αντισταθμίζεται ως ένα βαθμό από την επαναχρησιμοποίηση των ακινητοποιημένων ενζύμων[2]. 1.1.2.2. Βιοαιθανόλη Η βιοαιθανόλη πρώτης γενιάς παράγεται από βρώσιμες πρώτες ύλες. Αυτές μπορεί να είναι σακχαρούχες πρώτες ύλες όπως είναι το σακχαρότευτλο και το σακχαροκάλαμο ή αμυλούχες πρώτες ύλες όπως είναι (κυρίως) το καλαμπόκι αλλά και το σιτάρι ή άλλα δημητριακά. 9

Όπως αναφέρθηκε και στα εισαγωγικά, η παραγωγή βιοαιθανόλης από καλαμπόκι είναι μια παλιά, ανεπτυγμένη τεχνολογία κυρίως στις ΗΠΑ. Δύο είναι οι κύριες διεργασίες για την παραγωγή αιθανόλης από το καλαμπόκι, η ξηρή (dry grind) και η υγρή άλεση (wet milling)[14]. Στην ξηρή άλεση η βαρύτητα δίνεται στην επιστροφή κεφαλαίου ανά λίτρο αιθανόλης, δηλαδή στη μεγάλη αποδοτικότητα παραγωγής αιθανόλης. Στην υγρή άλεση, αντίθετα με την ξηρή, μεγάλη σημασία δίνεται στο διαχωρισμό και την εκμετάλευση πολύτιμων προϊόντων από τον καρπό του καλαμποκιού, πριν από το στάδιο της ζύμωσης προς αιθανόλη. Κατά την ξηρή άλεση, το καλαμπόκι καθαρίζεται, αλέθεται και αναμιγνύεται με νερό ώστε να σχηματιστεί πολτός. Ο πολτός θερμαίνεται και προστίθενται ένζυμα (αμυλάσες) που μετατρέπουν το άμυλο του καλαμποκιού σε σάκχαρα. Στη συνέχεια προστίθενται ζύμες και ακολουθεί αλκοολική ζύμωση των σακχάρων. Ακολουθεί απόσταξη για τον διαχωρισμό της αιθανόλης από το μίγμα της ζύμωσης, και αφυδάτωση για παραλαβή αιθανόλης με προδιαγραφές καυσίμου. Τα στερεά που απομένουν μετά την απόσταξη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συμπλήρωμα ζωοτροφής[14]. Η ξηρή άλεση έχει ως στόχο την ζύμωση όσο το δυνατόν μεγαλύτερου μέρους του καρπού, δεν περιλαμβάνει κάποιο στάδιο διαχωρισμού των συστατικών, ενώ αποτελείται από πέντε βασικά στάδια: την άλεση, την θέρμανση, την διαλυτοποίηση, την σακχαροποίηση και, τέλος, τη ζύμωση. Εκτός από την αιθανόλη παράγεται ζωοτροφή (distillers grains) και διοξείδιο του άνθρακα, που χρησιμοποιείται στη βιομηχανία. Κατά το πρώτο στάδιο ολόκληρος ο καρπός αλέθεται σε σφυρόμυλο ώστε να παραχθεί ένα χοντρό αλεύρι (>30 mesh), το οποίο στη συνέχεια αναμυγνίεται με νερό και σχηματίζεται ένας πολτός. Το ph του πολτού ρυθμίζεται στο 6 και προστίθεται α-αμυλάση η οποία αρχίζει και διασπά το άμυλο σε διαλυτές δεξτρίνες. Ο πολτός, στη συνέχεια θερμαίνεται στους 100 o C, και η θερμοκρασία φάση βοηθάει τη διάσπαση του αμύλου. Στη συνέχεια η θερμοκρασία πέφτει στους 80 90 C, προστίθεται εκ νέου αμυλάση και η διαδικασία της διαλυτοποίησης συνεχίζεται για μισή ώρα. Ακολουθεί το στάδιο της σακχαροποίησης, κατά το οποίο το ph ρυθμίζεται στο 4.5, και προστίθεται γλυκοαμυλάση, ένα ένζυμο που μετατρέπει τις διαλυτές δεξτρίνες σε γλυκόζη. Η διεργασία της σακχαροποίησης συνεχίζεται και κατά το στάδιο της ζύμωσης, ώστε η παραγωγή γλυκόζης να μην είναι το καθορίζον την ταχύτητα στάδιο της αντίδρασης. 10

Ακολουθεί το στάδιο της ζύμωσης, κατά το οποίο ο πολτός ψύχεται στους 32 C και μεταφέρεται σε ζυμωτήρες όπου προστίθονται οι ζύμες. Ως πηγή αζώτου, προστίθεται ουρία η θειϊκό αμμώνιο, ενώ μπορεί να προστεθούν και πρωτεάσες που διασπούν την πρωτείνη του καλαμποκιού σε ελεύθερα αμινοξέα τα οποία αποτελούν επιπλέον πηγή αζώτου για τις ζύμες. Η ζύμωση διαρκεί περίπου 48-72 ώρες και παρέχει τελική συγκέντρωση αιθανόλης 10-12%. Η παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα κατά την διάρκεια της ζύμωσης κατεβάζει το ph κάτω από το 4. Αυτή η μείωση είναι σημαντική γιατί αυξάνει την δραστικότητα της γλυκοαμυλάσης και αναστέλει την ανάπτυξη βακτηρίων που θα μπορούσαν να επιμολύνουν τη διεργασία. Η ποσότητα της γλυκοαμυλάσης που προστίθεται μπορεί να ελαττωθεί, αν πραγματοποιηθεί σακχαροποίηση του διαλυτοποιημένου αμύλου στους 65 C πριν από τη ζύμωση. Επίσης, μπορεί να πραγματοποιηθεί ταυτόχρονη σακχαροποίηση και ζύμωση (Simultaneous Saccarification and Fermantation ή SSF) -μια διεργασία που συναντάμε και στη βιοαιθανόλη 2 ης γενιάς- η οποία μειώνει τον κίνδυνο μικροβιακής μόλυνσης, μειώνει το αρχικό ωσμοτικό στρες στα κύτταρα των ζυμών καθώς η αρχική συγκέντρωση του σακχάρου είναι μικρή, και είναι πιο αποδοτική ενεργειακά. Μπορεί, τέλος, να δώσει 8% περισσότερη αιθανόλη. Για την παραγωγή αιθανόλης μπορούν να χρησιμοποιηθούν είτε συνεχή είτε ασυνεχή συστήματα ζύμωσης, με τα τελευταία να είναι τα πιο συνηθισμένα. Το διοξείδιο του άνθρακα που παράγεται κατά τη ζύμωση δεσμεύεται και χρησιμοποιείται στην παρασκευή ανθρακούχων ποτών, ξηρού πάγου κλπ. Τη ζύμωση ακολουθεί η απόσταξη που έχει ως στόχο τον διαχωρισμό της αιθανόλης από τα υγρά και στερεά της διεργασίας. Με τη χρήση συμβατικών μεθόδων απόσταξης παραλαμβάνεται 95% αιθανόλη καθώς σχηματίζει αζεοτροπικό μίγμα με το νερό και δεν μπορεί να διαχωριστεί περαιτέρω, ενώ με τη χρήση μοριακών ηθμών (molecular sieves) που προσροφούν εκλεκτικά μπορεί να ληφθεί αιθανόλη 100%. Το υγρό και στερεό κλάσμα που παραμένει μετά την απόσταξη αναφέρεται ως βινάσσες (whole stillage), και περιλαμβάνει ίνες, έλαια, και πρωτεϊνες του καρπού καθώς και το άμυλο που δεν έχει υποστεί υδρόλυση και ζύμωση, και χρησιμοποιούνται ως ζωοτροφή. Σημαντική για την αύξηση της παραγωγής σε αιθανόλη είναι η ικανότητα ζύμωσης των ινών που περιέχονται στον καρπό του καλαμποκιού. Οι ίνες έχουν μεγάλη περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες και η ζύμωση τους μπορεί να αυξήσει την παραγωγή αιθανόλης κατά 10%. Επειδή ωστόσο οι ίνες αυτές εντάσσονται στην λιγνοκυτταρινούχο βιομάζα η ζύμωση τους εμπεριέχει δυσκολίες λόγω της 11

ανθεκτικότητας αυτού του τύπου βιομάζας και της σχετικής δυσκολίας μετατροπής της σε σάκχαρα. Η υπέρβαση αυτών των δυσκολιών απαιτεί ένα στάδιο προκατεργασίας και ένα στάδιο ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης για την μετατροπή σε σάκχαρα[14]. Οι διεργασίες μετατροπής της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας σε αιθανόλη (βιοαιθανόλη 2 ης γενιάς) καλύπτονται πιο εκτεταμένα παρακάτω. Η υγρή άλεση είναι διεργασία έντασης κεφαλαίου και ενέργειας, καθώς ο καρπός του καλαμποκιού πρέπει να διαχωριστεί στα συστατικά του, που περιλαμβάνουν το άμυλο, τις ίνες, τη γλουτένη (πρωτεϊνη) και το φύτρο. Το φύτρο διαχωρίζεται από τον καρπό και παραλαμβάνεται το έλαιο που περιέχει με εκχύλιση. Το εναπομένων φύτρο μαζί με τις ίνες το φλοιό και τη γλουτένη που διαχωρίστηκε από τον καρπό χρησιμοποιούνται ως ζωοτροφή με υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεϊνη. Το άμυλο χρησιμοποιείται για την παραγωγή σακχάρων και αιθανόλης. Με βάση λοιπόν την περιπλοκότητα της διεργασίας μπορούμε να πούμε ότι τα εργοστάσια υγρής άλεσης καλαμποκιού λειτουργούν ως «βιοδιυλιστήρια» που παράγουν μια ποικιλία προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας[14]. Η υγρή άλεση του καλαμποκιού πραγματοποιείται με μια πιο σύνθετη διεργασία σε σχέση με την ξηρή άλεση, ενώ παράγονται περισσότερα και διαφορετικού είδους προϊόντα. Ο βασικός στόχος της διεργασίας της υγρής άλεσης είναι ο διαχωρισμός του αμύλου που υπάρχει στον καρπό. Καθώς τα περισσότερα προϊόντα της διεργασία μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για ανθρώπινη κατανάλωση -εκτός από την παραγωγή αιθανόλης- έχει μεγάλη σημασία η ποιότητα του καλαμποκιού[15]. Αρχικά το καλαμπόκι κοσκινίζεται για να απομακρυνθούν τα διάφορα υπολείμματα, σκουπίδια και σπασμένοι καρποί, και στη συνέχεια εμβαπτίζεται σε ένα διάλυμα διοξειδίου του θείου για 40 με 48 ώρες. Ακολουθεί μια διαδικασία αλέσματος, διαφορικού διαχωρισμού, και φυγοκέντρησης, μέσω της οποίας οι σπόροι του καλαμποκιού διαχωρίζονται. Όπως είπαμε παραπάνω το βασικό επιθυμητό προϊόν αυτής της διαδικασίας είναι το άμυλο. Σε περίπτωση που το άμυλο δεν προορίζεται για την παραγωγή αιθανόλης, μπορεί να ξηρανθεί και να χρησιμοποιηθεί για μια μεγάλη ποικιλία προϊόντων, όπως αμυλοσιρόπιο και άλλα γλυκαντικά, ή να μετατραπεί σε δεξτρόζη και να χρησιμοποιηθεί ως πηγή άνθρακα σε διάφορες μικροβιακές ζυμώσεις. Όταν το άμυλο προορίζεται για την παραγωγή αιθανόλης, τότε μετατρέπεται σε γλυκόζη, με τη βοήθεια ενζύμων, και η γλυκόζη στη συνέχεια μετατρέπεται με τη βοήθεια ζυμών προς βιοαιθανόλη. Ένα παραπροϊόν της 12

διεργασίας είναι τα διαλυτά συστατικά της απόσταξης (distillers solubles), που περιέχουν τις ζύμες και τα σάκχαρα που δε ζυμώθηκαν. Αυτά μαζί με το φύτρο, τις ίνες και τη γλουτένη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ζωοτροφή[15]. Στο Σχήμα 1.3 παρουσιάζονται τα διαγράμματα ροής των διεργασιών ξηρής και υγρής άλεσης για (α) ΞΗΡΗ ΑΛΕΣΗ (β) ΥΓΡΗ ΑΛΕΣΗ Καλαμπόκι Ένζυμα Άλεση Διαλυτοποίηση Καλαμπόκι Ένζυμα Διαβροχή Απομάκρυνση φύτρου/ινών Διαχωρισμός γλουτένης Διαλυτοποίηση Γλουτένη/Ίνες Ένζυμα Ζύμες Σακχαροποίηση και Ζύμωση(SSF) Enzyme Ζύμες Σακχαροποίηση Ζύμωση Απόσταξη Αφυδάτωση ΑΙΘΑΝΟΛΗ την παραγωγή βιοαιθναόλης 1 ης γενιάς. Ξήρανση Ζωοτροφή Απόσταξη Αφυδάτωση ΑΙΘΑΝΟΛΗ Ξήρανση Ζωοτροφή Σχήμα 1.3. Διεργασίες ξηρής (α) και υγρής (β) άλεσης του καλαμποκιού για την παραγωγή αιθανόλης 1 ης γενιάς (από παραπομπή [14]. 1.1.3. Βιοκαύσιμα 2 ης γενιάς Ένα από τα μεγάλα προβλήματα των βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς είναι ότι χρησιμοποιούν ως πρώτες ύλες εδώδιμα αγροτικά ή κτηνοτροφικά προϊόντα, όπως είναι λίπη και έλαια, σάκχαρα και καρπούς (άμυλο). Αυτό μπορεί να συνεπάγεται την αλλαγή της χρήσης της καλλιεργήσιμης γης από την παραγωγή τροφίμων στην παραγωγή καυσίμων. Υπάρχουν φόβοι ότι η μετατροπή φυσικών οικοσυστημάτων όπως είναι βροχοδάση, λιβαδικές εκτάσεις ή σαββάνες σε περιοχές όπως οι ΗΠΑ, η Βραζιλία και η νοτιοανατολική Ασία, σε καλλιέργειες σακχαροκάλαμου ή καλαμποκιού για την παραγωγή βιοκαυσίμων θα φέρει ελλείψεις σε τρόφιμα και θα οδηγήσει σε αύξηση των τιμών των τροφίμων με τεράστιες οικονομικές, κοινωνικές και περιβαλλοντικές συνέπειες, ενώ η αλλαγή χρήσης γης θα οδηγήσει σε πιθανή 13