Άσκηση 4: Πλασμόλυση φυτικού κυττάρου Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι η μελέτη της διαπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών και του φαινομένου της πλασμόλυσης του φυτικού κυττάρου, δηλαδή της εξόδου νερού από το εσωτερικού του κυττάρου που παρατηρείται για την εξισορρόπηση της ωσμωτικής πίεσης, όταν αυτό τοποθετείται σε υπέρτονα διαλύματα. Αρχικώς, γίνεται αναφορά στους μηχανισμούς παθητικής μεταφοράς διαμέσου της κυτταρικής (πλασματικής) μεμβράνης των μικρομοριακών ουσιών (απλή διάχυση, διευκολυνόμενη διάχυση, ώσμωση). Στη συνέχεια, περιγράφεται το φαινόμενο της πλασμόλυσης με τη βοήθεια εικόνων και κινουμένων σχεδίων που εξομοιώνουν και εξηγούν τη λειτουργία του φαινομένου. Τέλος, στο πρακτικό μέρος της άσκησης περιγράφεται η πειραματική διαδικασία που ακολουθείται για τον προσδιορισμό του χρόνου πλασμόλυσης στο φυτικό κύτταρο και για την παρατήρηση-μελέτη των διαφόρων μορφών πλασμόλυσης (κοίλη, κυρτή, σκυφιακή κ.α). Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N.A., & Reece, J. B. (2010), Βιολογία (τόμος Ι), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: 978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 7: Δομή και λειτουργία των μεμβρανών. 1. Εισαγωγικό μέρος 1.1. Διαπερατότητα μεμβρανών Η πλασματική μεμβράνη του κυττάρου αποτελεί ένα εξαιρετικό παράδειγμα μιας υπερμοριακής δομής με ενδογενείς ιδιότητες πέρα εκείνων που χαρακτηρίζουν τα μεμονωμένα μόρια. Μία από τις σπουδαιότερες λειτουργίες της πλασματικής μεμβράνης είναι να ρυθμίζει τη μεταφορά ουσιών μέσα και έξω από το κύτταρο. Αν η πλασματική μεμβράνη του κυττάρου ήταν ένα τελείως αδιαπέραστο περίβλημα, το κύτταρο θα ήταν ανίκανο να προσλάβει τις απαραίτητες θρεπτικές ουσίες, να αποβάλλει τα άχρηστα προϊόντα του μεταβολισμού του, αλλά και να εξάγει ουσίες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν αλλού. Αν πάλι η μεμβράνη ήταν τελείως διαπερατή από κάθε χημική ουσία, τότε η χημική σύσταση του κυττάρου δεν θα μπορούσε να διατηρηθεί. Θα γινόταν εντελώς όμοια με τη χημική σύσταση του περιβάλλοντός του. Έτσι, θα έχανε την υψηλή συγκέντρωση εκείνων των θρεπτικών συστατικών που είναι απαραίτητα για την εκδήλωση του φαινομένου της ζωής. Είναι λοιπόν φανερό ότι η δομή της πλασματικής μεμβράνης πρέπει να καθορίζει ποιες ουσίες θα τη διαπερνούν εύκολα, δύσκολα ή καθόλου. Με άλλα λόγια, η μεμβράνη πρέπει να είναι εκλεκτικά διαπερατή. Το μοντέλο του ρευστού μωσαϊκού που χαρακτηρίζει τη δομή των βιολογικών μεμβρανών βοηθάει στην κατανόηση της εκλεκτικής διαπερατότητας μορίων διαμέσου μιας μεμβράνης. Τρεις είναι οι κύριοι τύποι μεταφοράς ουσιών διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης: η παθητική μεταφορά, η ενεργός μεταφορά και η ενδοκυττάρωση και εξωκυττάρωση. 1.2. Παθητική μεταφορά 1.2.1. Διάχυση Διάχυση είναι η τάση των μορίων λόγω της κινητικής τους ενέργειας να διασπείρονται από περιοχές υψηλής συγκέντρωσης προς περιοχές χαμηλής συγκέντρωσης (Εικ. 4.1). Για παράδειγμα, η διαφορά συγκέντρωσης του οξυγόνου (Ο 2 ) ανάμεσα στο εξωκυτταρικό (υψηλή) και στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον (χαμηλή, λόγω της κατανάλωσης του Ο 2 κατά τις βιολογικές οξειδώσεις) οδηγεί σε διάχυση του Ο 2 στο εσωτερικό του κυττάρου. Το αντίθετο ακριβώς ισχύει για το διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ). Η διάχυση μιας ουσίας αποτελεί περίπτωση παθητικής μεταφοράς γιατί δεν απαιτείται δαπάνη ενέργειας. Ορισμένες μικρομοριακές ουσίες (π.χ. Ο 2, CO 2 ) διαχέονται ελεύθερα διαμέσου του διμοριακού φωσφολιπιδικού στρώματος της πλασματικής μεμβράνης (απλή διάχυση). Άλλες πάλι, μεταφέρονται παθητικά - 57 -
διαμέσου πρωτεϊνικών διαύλων (καναλιών) ή με τη βοήθεια πρωτεϊνών φορέων της μεμβράνης (διευκολυνόμενη διάχυση). Η διάχυση ιόντων, για παράδειγμα, από και προς το εξωτερικό του κυττάρου γίνεται μέσω καναλιών της πλασματικής μεμβράνης. Οι μεμβράνες είναι επιλεκτικά διαπερατές και μπορούν να ρυθμίζουν την ταχύτητα διάχυσης των μορίων, π.χ. ανοίγοντας ή κλείνοντας τους διαύλους κάποιου ιόντος. 1.2.2. Ώσμωση Συγκρίνοντας δύο διαλύματα που διαφέρουν ως προς τη συγκέντρωση μιας ουσίας που είναι διαλυμένη σ αυτά, ονομάζουμε υπερτονικό (ή υπέρτονο) το διάλυμα με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση και υποτονικό εκείνο με τη μικρότερη. Οι όροι αυτοί έχουν νόημα με την έννοια της σύγκρισης και μόνον. Για παράδειγμα, το νερό της βρύσης (με μικρή συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών) είναι υπερτονικό συγκριτικά με το απεσταγμένο νερό, αλλά υποτονικό συγκριτικά με το θαλασσινό (μεγάλη συγκέντρωση αλάτων). Διαλύματα που έχουν την ίδια συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών ονομάζονται ισοτονικά. Η ώσμωση είναι μια ειδική περίπτωση παθητικής μεταφοράς (διάχυσης) μορίων νερού μέσω μιας ημιπερατής μεμβράνης. Αν, για παράδειγμα, η συγκέντρωση ουσιών ενδοκυτταρικά είναι μεγαλύτερη από εκείνη στο εξωτερικό του κυττάρου (με άλλα λόγια αν το ενδοκυττάριο υγρό είναι υπερτονικό συγκριτικά με το εξωκυττάριο υγρό), εισέρχεται νερό στο κύτταρο προκειμένου να εξισορροπηθεί η συγκέντρωση των διαλυμένων ουσιών ή αλλιώς η ωσμωτική πίεση στα δύο διαμερίσματα. Κατά μια έννοια, το νερό διαχέεται προς την αραιότερη (ως προς το νερό) περιοχή. Στην αντίθετη περίπτωση, όταν δηλαδή το ενδοκυττάριο υγρό είναι υποτονικό συγκριτικά με το εξωκυττάριο υγρό, εξέρχεται νερό από το κύτταρο (Εικ. 4.1). Η κίνηση του νερού μέσω της πλασματικής μεμβράνης και η ισορροπία του νερού ανάμεσα στο κύτταρο και το περιβάλλον είναι κρίσιμη για όλους τους οργανισμούς, αφού η πλασματική μεμβράνη επιτρέπει ελεύθερα τη διέλευση των μορίων νερού ενώ είναι εκλεκτικά διαπερατή σε πολλά μόρια. Στην Εικόνα 4-1 παρουσιάζονται το φαινόμενο της ώσμωσης και η συμπεριφορά του ζωικού και του φυτικού κυττάρου σε διαλύματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Εικόνα 4.1 Διαδραστική απεικόνιση των φαινομένων της διάχυσης, ώσμωσης και της ισορροπίας νερού σε ζωντανά κύτταρα. 1.3. Πλασμόλυση αποπλασμόλυση φυτικού κυττάρου Στο φυτικό κύτταρο παρατηρείται εκλεκτική μεταφορά ουσιών από το περιβάλλον προς το εσωτερικό του κυττάρου και αντιστρόφως, η οποία ελέγχεται κυρίως από δύο βιομεμβράνες, την πλασματική μεμβράνη και τον τονοπλάστη (η μεμβράνη του χυμοτοπίου). Αν τοποθετήσουμε ζωντανά κύτταρα σε ένα υπέρτονο διάλυμα (π.χ. διάλυμα 0,7Μ KNO 3 ή KSCN, ή διάλυμα 1Μ σακχαρόζης) τότε αφαιρείται νερό από το περιεχόμενο των χυμοτοπίων (κυτταρικός χυμός) για την εξισορρόπηση της ωσμωτικής πίεσης. Το χυμοτόπιο του κυττάρου μικραίνει και το κυτόπλασμα το ακολουθεί και ξεκολλάει μερικώς ή ολικώς από το κυτταρικό τοίχωμα (Εικ. 4.2). Το φαινόμενο αυτό καλείται πλασμόλυση και είναι αντιστρεπτό. Αν, δηλαδή, τοποθετήσουμε μέσα σε καθαρό νερό το κύτταρο που έχει - 58 -
πλασμολυθεί, τότε το χυμοτόπιο διογκώνεται και το κυτόπλασμα εκτείνεται και πάλι ώσπου να καταλάβει ολόκληρο τον κυτταρικό χώρο. Το φαινόμενο αυτό χαρακτηρίζεται ως αποπλασμόλυση. Και τα δύο αυτά φαινόμενα χαρακτηρίζουν τα ζωντανά κύτταρα. Εικόνα 4.2 Πλασμόλυση φυτικού κυττάρου. Σε ισοτονικό διάλυμα το εισερχόμενο νερό ισούται με το εξερχόμενο και τα κύτταρα διατηρούν τη φυσιολογική τους εμφάνιση. Στο υπερτονικό διάλυμα παρατηρείται καθαρή μετακίνηση νερού έξω από το κύτταρο, με αποτέλεσμα τα κύτταρα να συρρικνώνονται (πλασμόλυση). Στο υποτονικό διάλυμα παρατηρείται καθαρή μετακίνηση νερού προς το εσωτερικό του κυττάρου. Το φυτικό βρίσκεται σε πλήρη σπαργή και προστατεύεται από τη διάρρηξη λόγω της παρουσίας του κυτταρικού τοιχώματος. Κατά την πλασμόλυση κυττάρων που βρίσκονται σε σπαργή (Εικ. 4.3Α) στην αρχή παρατηρείται μικρή ελάττωση του όγκου τους. Στη συνέχεια αρχίζει η αποκόλληση του κυτοπλάσματος από τις θέσεις όπου οι δυνάμεις συνάφειας ανάμεσα στο κυτόπλασμα και το κυτταρικό τοίχωμα είναι ασθενέστερες, κυρίως από τις γωνίες. Η κατάσταση κατά την οποία το κυτόπλασμα μόλις αρχίζει να ξεκολλάει από το κυτταρικό τοίχωμα χαρακτηρίζεται ως οριακή πλασμόλυση (Εικ. 4.3Β). Αν συνεχιστεί η πλασμόλυση, το κυτόπλασμα μπορεί να πάρει διάφορες μορφές ανάλογα με το ιξώδες του κυτοπλάσματος. Όταν το ιξώδες έχει μικρή τιμή, η πλασμόλυση εξελίσσεται προς μία κυρτή μορφή (Εικ. 4.3Γ). Όταν το κυτόπλασμα έχει μια μέση τιμή ιξώδους, τότε η πλασμόλυση παρουσιάζει κοίλη μορφή (Εικ. 4.3Δ). Μια προχωρημένη κοίλη μορφή πλασμόλυσης χαρακτηρίζεται ως σπασμωδική (Εικ. 4.3Ε). Μερικές φορές, κατά την πλασμόλυση επιμηκών κυττάρων, το κυτόπλασμα χωρίζεται σε τμήματα κυρτής επιφάνειας που συνδέονται μεταξύ τους με πλασματικά νημάτια. Πολύ λεπτά νημάτια (νημάτια Hecht) συνδέουν επίσης το κυτόπλασμα με τα κυτταρικά τοιχώματα (Εικ. 4.3Ε). Εικόνα 4.3 Μορφές πλασμόλυσης σε σχηματική απεικόνιση. Α: κύτταρο σε σπαργή, Β: κύτταρο σε κατάσταση οριακής πλασμόλυσης, Γ: κυρτή πλασμόλυση, Δ: κοίλη πλασμόλυση, Ε: σπασμωδική πλασμόλυση. Οι μορφές της πλασμόλυσης δεν είναι σταθερές. Μπορούμε, δηλαδή, κατά την πορεία μιας πλασμόλυσης να παρατηρήσουμε ότι η πλασμολυτική αποκόλληση αρχικά είναι κοίλη, ενώ αργότερα αρχίζει - 59 -
να κυρτώνεται. Τον τρόπο που μεταβάλλεται η μορφή της πλασμόλυσης παρακολουθούμε κατά τη μέτρηση του χρόνου πλασμόλυσης. Ως χρόνος πλασμόλυσης ορίζεται εκείνο το διάστημα από τη στιγμή που εμβαπτίζεται το κύτταρο στο πλασμολυτικό διάλυμα μέχρις ότου επιτευχθεί ή πλήρης κυρτή μορφή. 1.4. Σκυφιακή πλασμόλυση Η διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης και του τονοπλάστη είναι διαφορετική έναντι ορισμένων ουσιών, όπως δείχνει η πλασμόλυση φυτικών κυττάρων σε υπέρτονα διαλύματα διαφόρων αλάτων. Αν, για παράδειγμα, πλασμολύσουμε κύτταρα σε υπέρτονο διάλυμα 0,7 Μ KSCN, παρατηρούμε ότι αρχικά γίνεται κανονική πλασμόλυση, στη συνέχεια όμως, ενώ το χυμοτόπιο παραμένει σε πλασμόλυση, το κυτόπλασμα αρχίζει και διογκώνεται σιγά-σιγά και εμφανίζεται με τη μορφή δύο σκυφίων (σκουφάκια) πάνω και κάτω από το χυμοτόπιο. Η κατάσταση αυτή ονομάζεται σκυφιακή πλασμόλυση (Εικ. 4.4Α) και έχει το ιδιαίτερο γνώρισμα ότι τόσο η πλασματική μεμβράνη όσο και ο τονοπλάστης γίνονται μικροσκοπικά εμφανείς, ενώ όταν το κύτταρο βρίσκεται σε κανονική κατάσταση οι δύο αυτές μεμβράνες δεν διακρίνονται οπτικά. Όταν συνεχώς εισέρχεται KSCN στο κυτόπλασμα, αυτό συνεχώς διογκώνεται μέχρι να φτάσει ξανά στα κυτταρικά τοιχώματα (πλασμόλυση τονοπλάστη) (Εικ. 4.4Β). Εικόνα 4.4 Σκυφιακή πλασμόλυση (Α) και πλασμόλυση τονοπλάστη (Β) Το παραπάνω φαινόμενο οφείλεται στη διαφορετική διαπερατότητα των δύο μεμβρανών, δηλαδή της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και του τονοπλάστη, στο KSCN (εκλεκτική διαπερατότητα των μεμβρανών). Συγκεκριμένα, ο τονοπλάστης δεν είναι διαπερατός στα μόρια του KSCN, γι αυτό και το χυμοτόπιο παραμένει συνεχώς σε κατάσταση πλασμόλυσης. Αντιθέτως, τα μόρια του KSCN διαπερνούν ενεργητικά την κυτταροπλασματική μεμβράνη και εισέρχονται στο κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα το κυτταρόπλασμα να διογκώνεται σταδιακά καθώς εισέρχεται νερό σ αυτό για ωσμωτικούς λόγους, κι έτσι εμφανίζεται υπό μορφή σκυφίων στις άκρες του χυμοτοπίου έως ότου φτάσει ξανά στα κυτταρικά τοιχώματα. 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων 2.1.1. Συσκευές φωτονικό μικροσκόπιο. 2.1.2. Υλικά βολβοί κρεμμυδιού, - 60 -
αντικειμενοφόροι, καλυπτρίδες, σταγονόμετρα, διηθητικό χαρτί, λαβίδες, βελόνες ανατομίας, νυστέρι. 2.1.3. Διαλύματα διάλυμα 0,7M νιτρικού καλίου (KNO 3 ), διάλυμα 0,7M θειοκυανιούχου καλίου (KSCN). 2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1. Μορφή και χρόνος πλασμόλυσης κυττάρων κρεμμυδιού Τοποθετήστε σε μία καθαρή αντικειμενοφόρο μία σταγόνα διαλύματος 0,7Μ KNO 3. Πάρτε έναν βολβό κρεμμυδιού και αφαιρέστε ένα μικρό τμήμα επιδερμίδας από την εσωτερική επιφάνεια του χιτώνα (βλέπε Άσκηση 3). Τοποθετήστε το υμένιο στη σταγόνα του διαλύματος και σκεπάστε με καλυπτρίδα. Αρχίστε αμέσως την παρατήρηση, σημειώνοντας τη χρονική αυτή στιγμή ως «χρόνο μηδέν». Παρατηρήστε το φαινόμενο της πλασμόλυσης (Εικ. 4.5). Αρχικά η μορφή του κυτοπλάσματος που έχει αποκολληθεί είναι κοίλη. Σε ορισμένα κύτταρα το κυτόπλασμα δεν αποκολλάται πλήρως από το κυτταρικό τοίχωμα αλλά συγκρατείται με τα νημάτια Hecht. Η μορφή της πλασμόλυσης μετατρέπεται βαθμιαία σε κυρτή και μέσα σε 20-40 λεπτά το κυτόπλασμα παίρνει εντελώς κυρτή μορφή. Εικόνα 4.5 Μικροσκοπική απεικόνιση (100Χ) πλασμόλυσης κυττάρων κρεμμυδιού. Κοίλη (α) και κυρτή (β) πλασμόλυση. Για το παρασκεύασμα στην εικόνα (γ) χρησιμοποιήθηκε υμένιο από την επάνω επιφάνεια (μοβ) του κρεμμυδιού. Στις εικόνες (δ-στ) βλέπετε λεπτομέρειες των κυττάρων (400Χ), όπου διακρίνονται νημάτια Hecht. - 61 -
1. Σχεδιάστε δύο-τρία κύτταρα με αντιπροσωπευτικές μορφές πλασμόλυσης. Μορφή πλασμόλυσης. Μορφή πλασμόλυσης. Μορφή πλασμόλυσης. 2. Σχεδιάστε ένα κύτταρο σε διαδοχικά στάδια πλασμόλυσης σε συνάρτηση με τον χρόνο. Χρόνος μηδέν 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min - 62 -
2.2.2. Σκυφιακή πλασμόλυση σε κύτταρα κρεμμυδιού Τοποθετήστε σε μία καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα μία σταγόνα διαλύματος 0,7Μ KNO 3. Μεταφέρετε ένα μικρό τμήμα του εσωτερικού χιτώνα και τοποθετήστε την καλυπτρίδα. Παρατηρήστε το φαινόμενο της πλασμόλυσης. Το κοκκώδες κυτόπλασμα περιβάλλει σε λεπτό στρώμα το χυμοτόπιο. Μετά από 15 λεπτά, περίπου, η πλασμόλυση γίνεται σκυφιακή κατά την οποία το κυτόπλασμα εμφανίζεται ελαφρά διογκωμένο (Εικ. 4.6), ενώ μετά από παρέλευση περισσότερου χρόνου φθάνει μέχρι το κυτταρικό τοίχωμα (πλασμόλυση τονοπλάστη). Παράλληλα με τη διόγκωση του κυτοπλάσματος παρατηρείται διόγκωση του πυρήνα. Εικόνα 4.6 Σκυφιακή πλασμόλυση. Παρατηρήστε πως διογκώνονται τα σκυφία με την πάροδο του χρόνου και γίνονται διακριτές η πλασματική μεμβράνη και ο τονοπλάστης. Σχεδιάστε δύο αντιπροσωπευτικά κύτταρα. Σκυφιακή πλασμόλυση Πλασμόλυση τονοπλάστη - 63 -
2.3. Παρατηρήσεις Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης. ISBN: 978-960-524-305-0. 2. Καμάρη, Γ., & Τηνιακού, Α. (1993). Εργαστηριακές ασκήσεις μορφολογίας φυτών. Τμήμα Βιολογίας, Εργαστήριο Βοτανικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα. - 64 -