ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ Γ. ΚΟΝΤΟΠΙΔΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής ΚΑΡΔΙΤΣΑ 2014 2015 1

ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Έγκαιρη προσέλευση στο εργαστήριο. Προετοιμασία της εργαστηριακής άσκησης πριν την εκτέλεσή της (προετοιμασία στο σπίτι). Θα γίνεται εξέταση του βαθμού κατανόησης της ασκήσεως από τους διδάσκοντες με ερωτήσεις. Παράδοση (γραπτώς) της προηγούμενης άσκησης που πραγματοποιήθηκε, πριν από την εκτέλεση της νέας άσκησης (μη παράδοση θα βαθμολογείται αρνητικά). Στο χώρο του εργαστηρίου απαγορεύεται αυστηρά η λήψη τροφής. Μετά το τέλος της εργασίας ακολουθεί καθαρισμός των εργαστηριακών πάγκων. Τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν καθαρίζονται και τοποθετούνται στις θέσεις τους. Φοιτητές χωρίς ποδιά, δεν μπορούν να μετέχουν σε πειραματικές εργασίες. 2

ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Η εργαστηριακή ποδιά είναι απαραίτητη, ενώ χρησιμοποιούνται προστατευτικά γυαλιά, γάντια ή μάσκα όπου απαιτείται. Απαγορεύεται αυστηρά το κάπνισμα μέσα στον εργαστηριακό χώρο. Αποφεύγεται η οποιαδήποτε επαφή χημικών αντιδραστηρίων με το δέρμα (χέρια, πρόσωπο) Κατά τη μεταφορά χημικών αντιδραστηρίων μέσα στην αίθουσα του Εργαστηρίου απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή. Κατά την αραίωση των πυκνών οξέων, ιδιαίτερα του θειϊκού οξέος, ποτέ δεν προστίθεται το νερό στο οξύ, αλλά το οξύ προστίθεται σιγά-σιγά στο νερό. Οι οργανικοί διαλύτες (αιθέρας, αλκοόλες, βενζίνη, ακετόνη κλπ) πρέπει: - να μην είναι κοντά σε γυμνή φλόγα ή εστίες θέρμανσης - να μην θερμαίνονται σε γυμνή φλόγα παρά μόνο σε υδατόλουτρο Κατά τη θέρμανση υγρού σε λύχνο ή γκαζάκι, το δοχείο ζέσεως να τοποθετείται πάνω σε πλέγμα Οι φιάλες των αντιδραστηρίων δεν απομακρύνονται από τη θέση τους. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ποσότητες αντιδραστηρίων μεγαλύτερες από αυτές που αναφέρει η οδηγία της άσκησης. Δεν εισπνέονται άμεσα από τα δοχεία αντιδραστηρίων ατμοί ή αέρια αντιδραστήρια. Όταν αυτό χρειασθεί μετακινείστε το χέρι σας από το στόμιο προς τη μύτη, μεταφέροντας έτσι μικρή ποσότητα ατμών ή αερίου. Τυχόν προβλήματα ή ατυχήματα γνωστοποιούνται έγκαιρα στον υπεύθυνο. Κατά την διεξαγωγή πειραμάτων όπου παράγονται αναθυμιάσεις και όταν χρησιμοποιούνται πτητικά αντιδραστήρια να χρησιμοποιείτε την απαγωγό εστία 3

Κανονισμός εργαστηρίου Ασφάλεια Εργαστηρίου 1 η Άσκηση ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 2 3 Βασικοί κανόνες δειγματοληψίας. Ομογενοποίηση και άλεση ζωοτροφών 6 2 η Άσκηση Προσδιορισμός υγρασίας και ξηρής ουσίας δείγματος ζωοτροφής 3 η Άσκηση Προσδιορισμός τέφρας δείγματος ζωοτροφής 4 η Άσκηση Προσδιορισμός λιπαρών ουσιών με τη μέθοδο Soxhlet 5 η Άσκηση 11 12 14 Προσδιορισμός ακατέργαστων ινών (κυτταρίνης ημικυτταρίνης και λιγνίνης) 16 6 η Άσκηση Ρυθμιστική ικανότητα ζωοτροφών (Buffering capacity) 7 η - 8 η Άσκηση 21 Προσδιορισμός Αζωτούχων Ουσιών κατά Kjeldahl με χρήση της Vapodest 30 23 4

Άσκηση 1. Βασικοί κανόνες δειγματοληψίας. Ομογενοποίηση και άλεση ζωοτροφών Η σωστή ανάλυση των δειγμάτων των ζωοτροφών έχει ως προϋπόθεση την αντιπροσωπευτικότητα του αρχικού συνολικού δείγματος από το οποίο πάρθηκε το προς εξέταση δείγμα. Ιδιαίτερη βαρύτητα πρέπει να δοθεί στον τρόπο δειγματοληψίας και κατόπιν στη διαδικασίες μεταχείρισης του δείγματος μέχρι αυτό να υποστεί χημική ανάλυση προκειμένου να μην υπάρξει απώλεια θρεπτικών συστατικών, διότι τότε η ανάλυση δεν θα δώσει ακριβή αποτελέσματα. Χρήσιμα στοιχεία που αφορούν στις βασικές αρχές και τις μεθόδους δειγματοληψίας αναφέρονται στον κανονισμό που ακολουθεί: ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΚ) αριθ. 152/2009 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 27ης Ιανουαρίου 2009 για τον καθορισμό μεθόδων δειγματοληψίας και ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ Σκοπός της αντιπροσωπευτικής δειγματοληψίας είναι η λήψη μικρού κλάσματος παρτίδας, έτσι ώστε ο προσδιορισμός οποιουδήποτε ιδιαίτερου χαρακτηριστικού αυτού του κλάσματος να αντιστοιχεί στη μέση τιμή του χαρακτηριστικού της παρτίδας. Η παρτίδα δειγματίζεται με την επαναληπτική λήψη μερικών ποσοτήτων δείγματος σε διάφορες μεμονωμένες θέσεις της. Οι εν λόγω μερικές ποσότητες δείγματος συνδυάζονται με ανάμειξη για να σχηματιστεί ένα συνολικό δείγμα, από το οποίο παρασκευάζονται αντιπροσωπευτικά τελικά δείγματα με αντιπροσωπευτική διαίρεση. Εάν διαπιστωθεί με οπτική εξέταση ότι τα προς δειγματοληψία τμήματα της ζωοτροφής διαφέρουν ως προς την ποιότητα από την υπόλοιπη ζωοτροφή της ίδιας παρτίδας, τα εν λόγω τμήματα διαχωρίζονται από την υπόλοιπη ζωοτροφή και αντιμετωπίζονται ως χωριστή υποπαρτίδα. Εάν η διαίρεση της ζωοτροφής σε χωριστές υποπαρτίδες είναι αδύνατη, η ζωοτροφή δειγματίζεται ως μία παρτίδα και το γεγονός αυτό αναφέρεται στο πρωτόκολλο δειγματοληψίας. 5

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ - Παρτίδα: προσδιορισμένη ποσότητα ζωοτροφών που έχουν κοινά χαρακτηριστικά, όπως καταγωγή, ποικιλία, είδος συσκευασίας, συσκευαστή, αποστολέα ή επισήμανση και, όταν πρόκειται για διεργασία παραγωγής, μια μονάδα παραγωγής προερχόμενη από μία μόνο εγκατάσταση παραγωγής, στην οποία χρησιμοποιούνται ενιαίες παράμετροι παραγωγής, ή ένας ορισμένος αριθμός τέτοιων μονάδων, όταν παράγονται σε συνεχή σειρά και αποθηκεύονται μαζί. - Δειγματιζόμενο τμήμα: παρτίδα ή προσδιορισμένο μέρος της παρτίδας ή υποπαρτίδα. - Σφραγισμένο δείγμα: δείγμα το οποίο σφραγίζεται κατά τρόπο που εμποδίζει την πρόσβαση στο δείγμα χωρίς θραύση ή αφαίρεση της σφραγίδας. - Μερική ποσότητα δείγματος: ποσότητα λαμβανόμενη από ένα σημείο του δειγματιζόμενου τμήματος. - Συνολικό δείγμα: άθροισμα των μερικών ποσοτήτων δείγματος που έχουν ληφθεί από το ίδιο δειγματιζόμενο τμήμα. - Μειωμένο δείγμα: μέρος του συνολικού δείγματος, το οποίο προκύπτει από αυτό με διαδικασία αντιπροσωπευτικής μείωσης. - Τελικό δείγμα: μέρος του μειωμένου δείγματος ή του ομογενοποιημένου συνολικού δείγματος. - Εργαστηριακό δείγμα: δείγμα που προορίζεται για το εργαστήριο (όπως παραλαμβάνεται από το εργαστήριο) και μπορεί να είναι τελικό, μειωμένο ή συνολικό δείγμα. ΓΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ - Δειγματοληπτικό προσωπικό: τα δείγματα λαμβάνονται από πρόσωπα εξουσιοδοτημένα για τον σκοπό αυτό από την αρμόδια αρχή. - Τα δείγματα πρέπει να σφραγίζονται κατά τρόπο που εμποδίζει την πρόσβαση στο δείγμα χωρίς θραύση ή αφαίρεση της σφραγίδας. Το σήμα της σφραγίδας θα πρέπει να είναι αναγνωρίσιμο με βεβαιότητα και ευδιάκριτο. Εναλλακτικά, επιτρέπεται η τοποθέτηση του δείγματος σε περιέκτη που να μπορεί να πωματιστεί κατά τρόπο ώστε να μην είναι δυνατόν να ανοιχθεί χωρίς ανεπανόρθωτη βλάβη του περιέκτη, ο οποίος δεν πρέπει να επαναχρησιμοποιείται. - Ταυτοποίηση του δείγματος: το δείγμα πρέπει να φέρει ανεξίτηλη σήμανση και να ταυτοποιείται κατά τρόπο που να το συνδέει σαφώς με το πρωτόκολλο δειγματοληψίας. 6

- Από κάθε συνολικό δείγμα λαμβάνονται τουλάχιστον δύο τελικά δείγματα: τουλάχιστον ένα για τον έλεγχο (επιβολή της νομοθεσίας) και ένα για την επιχείρηση ζωοτροφών (μέσο άμυνας). Είναι δυνατόν να ληφθεί ένα τελικό δείγμα ως δείγμα αναφοράς. Σε περίπτωση ομογενοποίησης του πλήρους συνολικού δείγματος, τα τελικά δείγματα λαμβάνονται από το ομογενοποιημένο συνολικό δείγμα, εκτός εάν η διαδικασία αυτή αντίκειται στους κανόνες των κρατών μελών για τα δικαιώματα των επιχειρήσεων ζωοτροφών. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Ο εξοπλισμός δειγματοληψίας πρέπει να είναι κατασκευασμένος από υλικά που δεν είναι δυνατόν να μολύνουν τα προς δειγματοληψία προϊόντα. Ο εξοπλισμός πολλαπλών χρήσεων πρέπει να μπορεί να καθαρίζεται εύκολα ώστε να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση. Συνιστώμενος εξοπλισμός για τη δειγματοληψία στερεών ζωοτροφών Μη μηχανική δειγματοληψία - Φτυάρι με επίπεδο πυθμένα και κατακόρυφες πλευρές - Δειγματολήπτης τύπου λόγχης με επιμήκη σχισμή ή με διαμερίσματα. Οι διαστάσεις του δειγματολήπτη τύπου λόγχης πρέπει να είναι κατάλληλες για τα χαρακτηριστικά του δειγματιζόμενου τμήματος (βάθος περιέκτη, διαστάσεις σάκου κ.λπ.) και το μέγεθος σωματιδίων της ζωοτροφής. Εάν ο δειγματολήπτης τύπου λόγχης διαθέτει πολλά ανοίγματα, αυτά θα πρέπει να χωρίζονται μεταξύ τους με διαμερίσματα ή να είναι διαγωνίως στοιχισμένα (ζιγκ ζαγκ), ώστε να εξασφαλίζεται η λήψη των δειγμάτων στις διάφορες θέσεις κατά μήκος του δειγματολήπτη. Μηχανική δειγματοληψία Για τη δειγματοληψία ρεουσών ζωοτροφών επιτρέπεται να χρησιμοποιείται κατάλληλος μηχανικός εξοπλισμός. Ο όρος «κατάλληλος» σημαίνει ότι λαμβάνονται δείγματα τουλάχιστον από ολόκληρη τη διατομή που καταλαμβάνει η ροή. Η δειγματοληψία ρεουσών ζωοτροφών (με υψηλές ταχύτητες ροής) μπορεί να διενεργηθεί με αυτόματους δειγματολήπτες. Διαιρέτης Για την παρασκευή μειωμένων δειγμάτων με αντιπροσωπευτικό τρόπο θα πρέπει να χρησιμοποιούνται, κατά το δυνατόν και εφόσον κρίνεται σκόπιμο, συσκευές που προορίζονται για τη διαίρεση του δείγματος σε ίσα περίπου μέρη. 7

ΤΕΧΝΙΚΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΕΤΑΡΤΩΝ Αρχικά γίνεται συλλογή τυχαίων αντιπροσωπευτικών στοιχειωδών δειγμάτων. Τα επί μέρους στοιχειώδη δείγματα ενώνονται και σχηματίζεται το ολικό δείγμα. Στη συνέχεια το ολικό δείγμα αναμιγνύεται για να γίνει ομοιογενές. Με τη μέθοδο των τετάρτων που ακολουθεί, η ζωοτροφή απλώνεται σε σχήμα τετραγώνου ή κύκλου. Επιλέγοντας κάθε φορά 2 διαγώνια τμήματα από το σχήμα που επιλέχθηκε (απορρίπτοντας παράλληλα τα άλλα δύο) καταλήγουμε στην επιθυμητή ποσότητα που πρόκειται να αναλυθεί. Κάθε τελικό δείγμα συσκευάζεται και σημαίνεται σε κατάλληλο περιέκτη για αποφυγή αλλοίωσης του περιεχομένου. ΑΛΕΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Για να γίνει η ανάλυση των ζωοτροφών είναι απαραίτητο να προηγηθεί η άλεσή τους. Τα πλεονεκτήματα εφαρμογής της άλεσης των ζωοτροφών, με τη βοήθεια ειδικών μύλων κοπής, είναι τα ακόλουθα: 1. Ομογενοποίηση του προς εξέταση δείγματος της ζωοτροφής 2. Μείωση του μεγέθους των μορίων του δείγματος με αποτέλεσμα την έκθεση πολύ μεγαλύτερης επιφάνειας της ζωοτροφής στη δράση των αντιδραστηρίων. Το εργαστήριο διαθέτει μύλο κοπής και άλεσης ζωοτροφών, μοντέλο KINEMATICA POLYMIX PX-MFC 90 D. 8

ΜΥΛΟΣ ΚΟΠΗΣ KINEMATICA POLYMIX PX-MFC 90 D Ο μύλος KINEMATICA POLYMIX PX-MFC 90D βρίσκει εφαρμογή στην ομογενοποίηση χονδροειδών ή συμπυκνωμένων ζωοτροφών. Χαρακτηριστικά μύλου κοπής Ταχύτητα περιστροφής της κεφαλής έως 6000 rpm (στροφές / λεπτό). Κοσκίνηση δείγματος έως 1mm (ειδικά κόσκινα διαμέτρων από 5mm 1mm) POLYMIX PX MFC 90 D Χερούλι μεταφοράς Ένδειξη στροφών και συναγερμός Ένδειξη λειτουργίας οργάνου Ρυθμιστής ταχύτητας στροφών Εικόνα 1. Μύλος άλεσης κοπής ζωοτροφών Η τροφή τοποθετείται στον ειδικό υποδοχέα στο άνω μέρος της συσκευής όπου υπάρχει ειδικό κομβίο ελέγχου της ποσότητας που εισέρχεται στον κυρίως χώρο άλεσης. Στο κάτω μέρος της συσκευής προσαρμόζονται ειδικά πλαστικά φιαλίδια για τη συλλογή του δείγματος που αλέστηκε, αποφεύγοντας έτσι τη δημιουργία σκόνης αλλά και την απώλεια ποσότητας δείγματος. 9

Άσκηση 2 η Προσδιορισμός υγρασίας και ξηρής ουσίας δείγματος ζωοτροφής Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας ενός τροφίμου σε νερό βρίσκεται με προσδιορισμό - της υγρασίας του όταν αυτό είναι σε στερεή ή ημίρρευστη κατάσταση - του ξηρού υπολείμματος εκχυλίσματος όταν αυτό είναι υγρό Αρχή μεθόδου - Γνωστή ποσότητα δείγματος αποξηραίνεται σε σταθερή θερμοκρασία μέχρι σταθερού βάρους. - Το βάρος που απομένει μετά την ξήρανση αποτελεί την ξηρή ουσία του δείγματος. - Η απώλεια βάρους εκφράζει την περιεχόμενη σε αυτό υγρασία. Η εκατοστιαία περιεκτικότητα του δείγματος σε ξηρή ουσία προσδιορίζεται με αφαίρεση του ποσοστού της υγρασίας από το 100. Επισήμανση: η παραπάνω μέθοδος δεν εφαρμόζεται σε δείγματα τροφών που περιέχουν πτητικές ενώσεις οι οποίες στη θερμοκρασία των 103 βαθμών κελσίου διασπώνται με αποτέλεσμα να υπολογίζονται στο συνολικό ποσοστό της υγρασίας (έτσι προγραμματίζουμε τη θερμοκρασία ξήρανσης κοντά στους 90 βαθμούς κελσίου για περισσότερο χρόνο). Διαδικασία - Ζυγίζεται αρχική ποσότητα 5 γραμμαρίων τροφής σε κάψα. - Μεταφέρεται η κάψα με το δείγμα στον κλίβανο σε θερμοκρασία 100 περίπου βαθμούς Κελσίου. - Το δείγμα παραμένει εκεί για 3 ώρες περίπου. - Μετά το τέλος της ξήρανσης μεταφέρουμε την κάψα από τον κλίβανο στον ξηραντήρα, όπου την αφήνουμε να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν τη ζυγίζουμε - Η ξήρανση ενδέχεται να επαναληφθεί, μέχρι η διαφορά μεταξύ 2 διαδοχικών ζυγίσεων να μην είναι μεγαλύτερη από 0,5 mg. Υπολογισμοί Η υγρασία υπολογίζεται από τη σχέση Υ% = (Μ1 Μ2) * 100 / (Μ1 Β) Ξ % = 100 Υ % Όπου Μ1 : μικτό βάρος πριν την ξήρανση Μ2 : μικτό βάρος μετά την ξήρανση Β : βάρος κάψας 10

Άσκηση 3 η. Προσδιορισμός τέφρας δείγματος ζωοτροφής Τέφρα είναι το ανόργανο υπόλειμμα που προκύπτει μετά την αποτέφρωση ενός δείγματος. Με τη διαδικασία αυτή μπορούμε και προσδιορίζουμε - τα ανόργανα συστατικά (συνολικά, υδατοδιαλυτά και τα αδιάλυτα σε HCl) - τα μεταλλικά στοιχεία (με τη βοήθεια άλλων μεθόδων) Αρχή μεθόδου - Γνωστή ποσότητα δείγματος αποξηραίνεται σε σταθερή θερμοκρασία μέχρι σταθερού βάρους. - Το βάρος που απομένει μετά την ξήρανση αποτελεί την ξηρή ουσία του δείγματος. - Στη συνέχεια το ξηρό δείγμα αποτεφρώνεται σε κλίβανο αποτέφρωσης στους 500 περίπου βαθμούς Κελσίου. - Το βάρος του δείγματος που απομένει μετά την αποτέφρωση αποτελεί την τέφρα του δείγματος ενώ η απώλεια βάρους εκφράζει την οργανική ουσία του μείγματος Η εκατοστιαία περιεκτικότητα του δείγματος σε οργανική ουσία προσδιορίζεται με αφαίρεση του ποσοστού της τέφρας από το 100. Διαδικασία - Ζυγίζεται αρχική ποσότητα 3 γραμμαρίων τροφής σε κάψα. - Μεταφέρεται η κάψα με το δείγμα στον κλίβανο σε θερμοκρασία 100 περίπου βαθμούς Κελσίου. - Το δείγμα παραμένει εκεί για 3 ώρες περίπου. - Μετά το τέλος της ξήρανσης μεταφέρουμε την κάψα από τον κλίβανο στον ξηραντήρα, όπου την αφήνουμε να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν τη ζυγίζουμε. - Η ξήρανση ενδέχεται να επαναληφθεί, μέχρι η διαφορά μεταξύ 2 διαδοχικών ζυγίσεων να μην είναι μεγαλύτερη από 0,5 mg. - Στη συνέχεια η κάψα με το ξηρό δείγμα μεταφέρεται στον κλίβανο αποτέφρωσης σε θερμοκρασία 500 περίπου βαθμούς Κελσίου. - Μετά το τέλος της αποτέφωσης (3 ώρες περίπου) μεταφέρουμε την κάψα από τον κλίβανο στον ξηραντήρα, όπου την αφήνουμε να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν τη ζυγίζουμε. 11

Υπολογισμοί Η τέφρα υπολογίζεται από τη σχέση Τ % = (Κ1 Κ2) * 100 / (Κ1 Β) Ο % = 100 Τ % Όπου Κ1 : μικτό βάρος πριν την αποτέφρωση Κ2 : μικτό βάρος μετά την αποτέφρωση Β : βάρος κάψας 12

Άσκηση 4 η Προσδιορισμός λιπαρών ουσιών με τη μέθοδο Soxhlet Τα λίπη είναι ουσίες που περιέχονται τόσο στους φυτικούς όσο και στους ζωικούς ιστούς. Διακρίνονται σε απλά λίπη, σύνθετα λίπη και σε παράγωγα λιπιδίων. Δε διαλύονται στο νερό αλλά μόνο σε οργανικούς διαλύτες (αιθέρας, χλωροφόρμιο), ενώ έχουν σημαντική πεπτικότητα και υψηλή ενεργειακή αξία. Ο προσδιορισμός τους βασίζεται στην παραλαβή τους από το δείγμα της τροφής με εκχύλιση, η οποία πραγματοποιείται με τη βοήθεια της συσκευής Soxhlet. Αρχή μεθόδου Η συσκευή Soxhlet αποτελείται από τέσσερα μέρη: 1. το θερμομανδύα 1. τη σφαιρική φιάλη, στην οποία τοποθετείται ποσότητα διαλύτη 200 ml περίπου 2. τον εκχυλιστήρα όπου γίνεται η εκχύλιση του δείγματος με συνεχείς σιφωνισμούς 3. τον ψυκτήρα όπου γίνεται η συμπύκνωση των ατμών του διαλύτη. Έξοδος νερού συμπυκνωτής Είσοδος νερού Χάρτινο φυσίγγιο πραγματοποίησης της εκχύλισης Κίτρινο χρώμα: ατμοί διαλύτη Πράσινο χρώμα: διαλύτης διαλύτης Εικόνα 2. Περιγραφή συσκευής Soxhlet 13

- Οι ατμοί του διαλύτη οδηγούνται προς συμπύκνωση στον ψυκτήρα από τον πλευρικό σωλήνα. Στην άσκηση χρησιμοποιούμε πετρελαϊκό αιθέρα ως διαλύτη. Οι σταγόνες που δημιουργούνται πέφτουν στον εκχυλιστήρα και εμποτίζουν το τρόφιμο που βρίσκεται κλεισμένο στο φυσίγγιο. - Όταν ο διαλύτης μέσα στον εκχυλιστήρα φτάσει στο ύψος του σιφωνίου τότε γίνεται αυτόματη μεταφορά του εκχυλίσματος στον υποδοχέα. Η μεταφορά αυτή ονομάζεται σιφωνισμός. - Έτσι με τους συνεχείς σιφωνισμούς (25 30 σε διάστημα 3 ωρών) γίνεται μεταφορά των λιπαρών υλών από το τρόφιμο στον υποδοχέα της συσκευής.η ποσότητα του λίπους υπολογίζεται με ζύγιση του μικτού βάρους του υποδοχέα, μετά την εξάτμιση του διαλύτη. Διαδικασία - Αρχικά γίνεται η ζύγιση του χάρτινου υποδοχέα (φυσιγγίου) της Soxhlet - Στη συνέχεια ζυγίζεται συγκεκριμένη ποσότητα δείγματος ξηρού σογιάλευρου ποσότητας 2 2,5 γραμμαρίων. Η ποσότητα αυτή του δείγματος κλείνεται μέσα σε διηθητικό χαρτί και στη συνέχεια τοποθετείται μέσα στο φυσίγγιο. - Γίνεται ζύγιση της σφαιρικής φιάλης (έχει προξηρανθεί στους 103 βαθμούς κελσίου) πριν μπει η ποσότητα του διαλύτη σε αυτή. - Bάζουμε σε λειτουργία το θερμαντικό της συσκευής Soxhlet. - Όταν ολοκληρωθεί ο απαιτούμενος αριθμός σιφωνισμών, απομακρύνεται η σφαιρική φιάλη (περιέχει μικρή ποσότητα διαλύτη) και τοποθείται στον κλίβανο ξήρανσης μέχρι την πλήρη απομάκρυνση του διαλύτη. - Γίνεται ψύξη σε ξηραντήρα και ζύγιση μέχρι σταθερού βάρους Παρατηρήσεις κατά την εκτέλεση της άσκησης 1. Χρησιμοποιούμε ως διαλύτη πετρελαϊκό αιθέρα (σ.β. 40 60 βαθμοί κελσίου) γιατί δεν αναφλέγεται εύκολα, είναι αρκετά φθηνός και δεν αναμιγνύεται καθόλου με το νερό. 2. Κάθε τρόφιμο απαιτεί διαφορετικό χρόνο εκχύλισης 3. Το δείγμα κατά την εκτέλεση του πειράματος πρέπει να είναι ήδη ξηρό. Επειδή το νερό δε διαλύεται στο διαλύτη, τον εμποδίζει να εμποτίσει τη μάζα του δείγματος ώστε να εκχυλίσει τις λιπαρές ουσίες. 4. Η θερμοκρασία κατά την ξήρανση δεν πρέπει να ξεπερνά τους 100 βαθμούς Κελσίου γιατί είναι δυνατόν να οξειδωθούν οι λιπαρές ύλες ή να σχηματίχουν με τις πρωτεΐνες και τα σάκχαρα του τροφίμου σύμπλοκα τα οποία δεν παραλαμβάνονται. 14

Άσκηση 5 η. Προσδιορισμός ακατέργαστων ινών (κυτταρίνης ημικυτταρίνης και λιγνίνης) Οι ακατέργαστες ίνες (crude fiber) είναι κυρίως φυτικές ύλες που είναι άπεπτες από τον άνθρωπο και από αρκετά ζώα. Δεν έχουν θρεπτική αξία, χρησιμεύουν στην εκτίμηση της τρυφερότητας των λαχανικών και των φρούτων, διεγείρουν τις περισταλτικές κινήσεις του εντέρου, ενώ συμβάλλουν με τον όγκο τους στην αίσθηση του κορεσμού. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ακατέργαστων ινών (πάνω από 90 %) αποτελούν η κυτταρίνη και η λιγνίνη. Η κυτταρίνη είναι ένας πολυσακχαρίτης, ενώ η λιγνίνη είναι ένα αρωματικό πολυμερές μεγάλου μοριακού βάρους. Και τα δύο αποτελούν δομικά συστατικά των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων. Οι ακατέργαστες ίνες δεν υδρολύονται από τα ένζυμα του πεπτικού συστήματος των περισσότερων ζώων με αποτέλεσμα να μην αφομοιώνονται (εξαίρεση αποτελούν τα μηρυκαστικά και τα ιπποειδή όπου η μικροχλωρίδα του στομάχου τους σχηματίζει την κυτταρινάση που υδρολύει την κυτταρίνη). Ο προσδιορισμός τους βασίζεται στη μέθοδο των Van Soest - Moore (τροποποιημένη μέθοδος). Κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και λιγνίνη Η κυτταρίνη (εικόνα 4), απαντά σε όλα τα φυτικά τρόφιμα, δεν μπορεί όμως να αφομοιωθεί από τον άνθρωπο και πολλά σαρκοβόρα ζώα, γιατί τα ένζυμα του στομαχιού τους δεν μπορούν να διασπάσουν τους β-1,4 γλυκοζιτικούς δεσμούς που ενώνουν τα μόρια της γλυκόζης στο μόριο της. Στο ξύλο, το μόριο της κυτταρίνης έχει μήκος 5000 nm και αποτελείται από 1000 μονάδες ανυδρογλυκόζης (μακρομόριο). Είναι διευθετημένη έτσι ώστε 15 40 μακρομόρια να αντιστοιχούν σε μικροινίδια. Τα μικροινίδια ενωμένα μεταξύ τους σχηματίζουν τα κυτταρικά ινίδια, τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με άμορφες ημικυτταρίνες και λιγνίνες σχηματίζοντας τα κύτταρα. Η λιγνίνη (εικόνα 4) δεν είναι πολυσακχαρίτης, είναι συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος και είναι αδιάλυτη σε αραιό θειικό οξύ. Αποτελείται από ομάδες φαινυλοπροπανίου και ο ρόλος της είναι να συγκρατεί τις ίνες της κυτταρίνης. Οι ημικυτταρίνες (εικόνα 4) είναι μίγμα πολυσακχαριτών με δομικές μονάδες κυρίως πεντόζες και εξόζες. Λόγω της ύπαρξης υδροξυλίων, ακετυλικών και καρβοξυλικών ομάδων στις μοριακές αλυσίδες, οι ημικυτταρίνες εμφανίζουν μεγάλη προσροφητικότητα (περίπου διπλάσια από την κυτταρίνη). 15

Η μέθοδος χρησιμοποιεί τη συσκευή Dosi fiber,η οποία περιλαμβάνει - Σύστημα έξι θέσεων θερμής εκχύλισης και διήθησης - Γυάλινα πορώδη χωνευτήρια ηθμούς ανθεκτικά στους 600 βαθμούς κελσίου - Πολυλαβίδα 6 θέσεων για τη συγκράτηση των χωνευτηρίων Σύστημα εκχύλισης και διήθησης 6 θέσεων Εικόνα 3. Συσκευή Dosi fiber 16

Ενδιάμεση μεμβράνη Κυτταρικό τοίχωμα πηκτίνη κυτταρίνη Πλασματική μεμβράνη ημικυτταρίνη Διαλυτή πρωτεΐνη κυτταρίνη ημικυτταρίνη πηκτίνη λιγνίνη Εικόνα 4. Δομές κυτταρίνης, ημικυτταρίνης, λιγνίνης και πηκτίνης 17

Παρατηρήσεις σχετικές με τη μέθοδο - Όσο πιο λεπτά αλεσμένο είναι ένα δείγμα τόσο πιο αντιπροσωπευτικά είναι τα αποτελέσματα. - Συνήθως το δείγμα αρχικά περνάει από κόσκινο των 5mm και μετά από κόσκινο του 1mm, επειδή αν χρησιμοποιηθεί απευθείας το δεύτερο θα κλείσουν οι οπές και θα παρεμποδιστεί η άλεση. - Πιο αποτελεσματική είναι η δράση του διαλύματος όξινης αντίδρασης ADS σε λεπτοαλεσμένα δείγματα. - Ο ρυθμός θέρμανσης πρέπει να ρυθμίζεται πριν και μετά το βρασμό. - Η χρήση του διαλύματος ADS βοηθά στη διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών των ημικυτταρινών και λιπιδίων. - Η χρήση της οκτανόλης ενδείκνυται ως αντιαφροιστικό μέσο. - Για την ψύξη της συσκευής κατά τη διάρκεια της θερμής εκχύλισης ανοίγουμε τη βάνα του νερού από τη βρύση, ενώ η παροχή του νερού πρέπει να κυμαίνεται από 1 2 λίτρα ανά λεπτό. - Για την υποβοήθηση του βρασμού του δείγματος μπορούμε να ανοίξουμε το διακόπτη της πίεσης. Στη συνέχεια γυρίζοντας τον κεντρικό διακόπτη του διακόπτη χειρισμού από τη θέση off στη θέση αντίστροφης πίεσης εισέρχεται αέρας εντός του χωνευτηρίου με κατεύθυνση από κάτω προς τα πάνω. Με αυτόν τον τρόπο γίνεται καλύτερη ανάμιξη του δείγματος με το διάλυμα όξινης αντίδρασης. Διαδικασία. Προσδιορισμός ADF (αδιάλυτα σε όξινο διάλυμα απορρυπαντικών ουσιών) 1. Γίνεται παρασκευή όξινου διαλύματος απορρυπαντικών ουσιών ADS (20 γραμμάρια δεκαεξυλο τριεθυλο αμμωνιο βρωμίδιο διαλύονται σε 1000 ml 1Ν θειϊκού οξέος) 2. Σε προζυγισμένο χωνευτήριο ηθμό ζυγίζουμε 1 γραμμάριο δείγματος σογιάλευρου (προαλεσμένου και προξηραμένου). 3. Τοποθετώ το χωνευτήριο στην κατάλληλη θέση της συσκευής Dosi fiber και κατεβάζουμε το μοχλό ακινητοποίησης. 18

4. Ανοίγοντας το καπάκι της συσκευής, από την κορυφή της φιάλης ρίχνουμε περίπου 100 ml διαλύματος ADS και λίγες σταγόνες οκτανόλης. 5. Ρυθμίζουμε τη συσκευή ώστε να επιτύχουμε ήπιο βρασμό για 60 λεπτά περίπου. Έτσι μέχρι να ξεκινήσει ο βρασμός ο διακόπτης Heater τοποθετείται στο 90 %, ενώ μετά τη θέρμανση ρυθμίζεται στο 30 %. 6. Η θέρμανση διαρκεί περίπου 1 ώρα. 7. Απομακρύνουμε το υγρό με τα διαλυμένα συστατικά και ξεπλένουμε 3 φορές με ζεστό απεσταγμένο νερό και με κρύα ακετόνη. 8. Στη συνέχεια το χωνευτήριο τοποθετείται στον κλίβανο ξήρανσης για 8 ώρες στους 103 βαθμούς Κελσίου.η 9. Γίνεται ζύγιση και προσδιορισμός του ADF %. Υπολογισμοί ADF % = (μικτό βάρος ποτηριού μετά την ξήρανση βάρος χωνευτηρίου) * 100 ) / βάρος αρχικού δείγματος Προσδιορισμός ΝDF (αδιάλυτα σε όξινο διάλυμα απορρυπαντικών ουσιών) Γίνεται αρχικά βρασμός για περίπου μία ώρα με ένα διάλυμα ουδέτερης αντίδρασης (Neutral detergent solution), στη συνέχεια ακολουθεί διήθηση και η αρχική ξηρή ουσία του δείγματος διαχωρίζεται σε δύο φάσεις. Η μία φάση είναι η υγρή που περιλαμβάνει τα συστατικά που υδρολύονται στο διάλυμα αυτό και ονομάζεται κυτταρικό περιεχόμενο και μία στερεή φάση που περιλαμβάνει τα συστατικά των κυτταρικών τοιχωμάτων και ονομάζεται κυτταρικά τοιχώματα NDF (Neutral Detergent Fiber). Παρατηρήσεις σχετικές με τη μέθοδο - Τα μη διαλυτά συστατικά του δείγματος αποτελούνται κυρίως από κυτταρίνη, ημικυτταρίνη, λιγνίνη κυρίως, καθώς και από ελάχιστη ποσότητα πρωτεΐνης και αδιάλυτων ανόργανων συστατικών. - Το ουδέτερο διάλυμα απορρυπαντικών διαλυτοποιεί στο μεγαλύτερο ποσοστό το σύνολο των υδατανθράκων, των λιπών, των πρωτεϊνών και των ανόργανων αλάτων. 19

- Η διαφορά του NDF ADF καθορίζει την ποσότητα των ημικυτταρινών που περιέχονται στο δείγμα (έμμεσος προσδιορισμός). - Ζωοτροφές με περιεκτικότητα σε λιπαρές ουσίες μεγαλύτερες από 10 % πρέπει να υφίστανται εκχύλιση με πετρελαϊκό αιθέρα πριν τη διαδικασία προσδιορισμού των ακατέργαστων ινών. Διαδικασία. Προσδιορισμός NDF (αδιάλυτα σε ουδέτερο διάλυμα απορρυπαντικών ουσιών) 1. Γίνεται παρασκευή ουδέτερου διαλύματος απορρυπαντικών ουσιών NDS (1 λίτρο απεσταγμένο νερό + 30 γραμμάρια δωδεκυλ θειικό νάτριο+ 18,61 γραμμάρια EDTA + 6,81 γραμμάρια δεκαυδρικό βορικό νάτριο + 4,56 γραμμάρια άνυδρο μονόξινο φωσφορικό νάτριο + 10 ml καθαρή 2 αιθοξυαιθανόλη) 2. Σε προζυγισμένο χωνευτήριο ηθμό ζυγίζουμε 1 γραμμάριο δείγματος σογιάλευρου (προαλεσμένου και προξηραμένου). 3. Τοποθετώ το χωνευτήριο στην κατάλληλη θέση της συσκευής Dosi fiber και κατεβάζουμε το μοχλό ακινητοποίησης. 4. Ανοίγοντας το καπάκι της συσκευής, από την κορυφή της φιάλης ρίχνουμε περίπου 100 ml διαλύματος NDS, λίγες σταγόνες οκτανόλης και 0,5 γραμμάρια άνυδρο θειώδες νάτριο. 5. Ρυθμίζουμε τη συσκευή ώστε να επιτύχουμε ήπιο βρασμό για 60 λεπτά περίπου. Έτσι μέχρι να ξεκινήσει ο βρασμός ο διακόπτης Heater τοποθετείται στο 90 %, ενώ μετά τη θέρμανση ρυθμίζεται στο 30 %. 6. Η θέρμανση διαρκεί περίπου 1 ώρα. 7. Απομακρύνουμε το υγρό με τα διαλυμένα συστατικά και ξεπλένουμε 3 φορές με ζεστό απεσταγμένο νερό και με κρύα ακετόνη. 8. Στη συνέχεια το χωνευτήριο τοποθετείται στον κλίβανο ξήρανσης για 8 ώρες στους 103 βαθμούς Κελσίου. 9. Γίνεται ζύγιση και προσδιορισμός του NDF %. Υπολογισμοί NDF % = (μικτό βάρος ποτηριού μετά την ξήρανση βάρος χωνευτηρίου) * 100 ) / βάρος αρχικού δείγματος και NDF % ADF % = ποσοστό ημικυτταρινών που υπάρχουν στο δείγμα 20

Άσκηση 6 η. Ρυθμιστική ικανότητα ζωοτροφών (Buffering capacity) Στην παρούσα άσκηση γίνεται η μέτρηση της ρυθμιστικής ικανότητας ορισμένων ζωοτροφών που χρησιμοποιούνται στη διατροφή των ζώων, καθώς και των πρώτων υλών που παίρνουν μέρος στη σύνθεσή τους. Ως ρυθμιστική ικανότητα των τροφών ορίζεται η ποσότητα του υδροχλωρικού οξέος (ml ή mmol HCl) που απαιτείται για να μειωθεί το αρχικό ph μιας πρώτης ύλης ζωοτροφής ή μιας σύνθετης τροφής σε τελική τιμή ph = 3 ή 4. Οι ζωοτροφές με υψηλή τιμή ρυθμιστικής ικανότητας δημιουργούν σοβαρά πεπτικά προβλήματα στα νεαρά ζώα (χοιρίδια) που έχουν περιορισμένη ικανότητα σύνθεσης υδροχλωρικού οξέος. Όταν η τροφή έχει υψηλή ρυθμιστική ικανότητα, το ph στο στομάχι παραμένει σε σχετικά υψηλή τιμή, με αποτέλεσμα να μειώνεται η πεπτικότητα των πρωτεϊνών της τροφής τους. Έτσι άπεπτες πρωτεΐνες φτάνουν στον εντερικό σωλήνα, όπου υφίστανται ζυμώσεις που οδηγούν στο σχηματισμό τοξικών, βιογενών αμινών. Επιπλέον οι τροφές με υψηλή ρυθμιστική ικανότητα, μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση του ph στον εντερικό σωλήνα και κατά συνέπεια τον υπέρμετρο πολλαπλασιασμό παθογόνων βακτηρίων. Βασικές αρχές πειραματικής διαδικασίας Η ρυθμιστική ικανότητα των τροφών και των πρώτων υλών προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό πεχάμετρο. Αρχικά ζυγίζεται συγκεκριμένη ποσότητα δείγματος ζωοτροφής και στη συνέχεια προστίθεται ποσότητα απεσταγμένου νερού. Το διάλυμα υποβάλλεται σε ανάδευση και στη συνέχεια προστίθεται ποσότητα υδροχλωρικού οξέος μέχρις ότου η τιμή του ph φτάσει στην τιμή 4. Πειραματική διαδικασία - Η τροφή περνά από κόσκινο 1 mm και 2 mm - Αναμιγνύονται 10 γραμμάρια τροφής με 90 ml νερό για 30 λεπτά - Γίνεται η μέτρηση του ph - Ακολουθεί ογκομέτρηση με 0,1 Ν HCl μέχρι το ph να φτάσει στην τιμή 4. 21

Παρατηρήσεις 1. Υψηλή τιμή δείγματος σημαίνει ότι η τροφή μπορεί να απορροφήσει πολλά Η + και ότι το ph από το στομάχι και στον πεπτικό σωλήνα θα παραμείνει υψηλό. 2. Η πεψίνη, το πρωτεολυτικό ένζυμο, υπεύθυνο για την αποσύνθεση των πρωτεϊνών, ενεργοποιείται από το πεψινογόνο σε χαμηλό ph. 3. Οι άπεπτες πρωτεΐνες μπορούν να οδηγηθούν στο λεπτό και στο παχύ έντερο οδηγώντας στο σχηματισμό βιογενών τοξινών αμινών. 4. Αποτέλεσμα των παραπάνω είναι η εμφάνιση διάρροιας 5. Χαμηλότερη τιμή ph ελέγχει και το βακτηριαδιακό πληθυσμό (E. Coli, Salmonella) 6. Η παρουσία οξέων φέρεται να έχει σημαντικά αποτελέσματα στη σύνδεση με στοιχεία, όπως Ca, P, Mn, και στη διάθεσή τους στον οργανισμό. 7. Όσο πιο υψηλή είναι τόσο μεγαλύτερη είναι η θνησιμότητα 22

Άσκηση 7 η 8 η. Προσδιορισμός Αζωτούχων Ουσιών κατά Kjeldahl με χρήση της Vapodest 30 Προσδιορισμός Αζωτούχων Ουσιών Οι αζωτούχες ουσίες της τροφής διακρίνονται σε λευκωματοειδείς και μη. Οι λευκωματοειδείς ουσίες αποτελούν συνήθως το 95 98% των αζωτούχων ουσιών της τροφής ενώ στις μη λευκωματοειδείς ανήκουν οι αμίνες, τα πεπτίδια. Είκοσι στάνταρ αμινοξέα Εικόνα 5. Διάφορα είδη αμινοξέων 23

Όλα τα αμινοξέα έχουν ένα N άζωτο (κύρια αμινομάδα) αλλά έχουν διαφορετική αναλογία στην πλάγια αλυσίδα Είδη αμινοξέων και περιεκτικότητα σε άζωτο Εργαστήριο Διατροφής Εικόνα 6. Περιεκτικότητα αμινοξέων σε άζωτο 24

Άρα ανάλογα το αμινοξέα (και την ποσότητα του στο δείγμα πρέπει να πολλαπλασιάσουμε με διαφορετικό συντελεστή για να βρούμε την αρχική ποσότητα του αμινοξέων (και τελικά της πρωτεΐνης Η Αλανίνη έχει ένα Ν σε μάζα 89.09 g mol 1 Η Αργινίνη έχει τέσσερα Ν σε μάζα 174.20 g mol 1 Μια πρωτεΐνη με 50% Αλανίνη και 50% Αργινίνη πόσο θα έχει; Σε μάζα (89+174) 263 g mol 1 θα έχει πέντε Ν Εργαστήριο Διατροφής 25

Η μέθοδος Kjeldahl είναι η πλέον διαδεδομένη για τον προσδιορισμό του οργανικού αζώτου των πρωτεϊνών στις τροφές. Σύμφωνα με τη μέθοδο Kjeldahl ο προσδιορισμός των αζωτούχων ουσιών της τροφής πραγματοποιείται από την μέτρηση του ολικού αζώτου της τροφής και κατόπιν με το πολλαπλασιασμό του με τον συντελεστή 6,25, δηλαδή: Αζωτούχες Ουσίες = (ολικό άζωτο τροφής) Χ 6,25 Ο συντελεστής 6,25 δεν είναι τυχαίος αλλά προκύπτει από το πηλίκο 100 / 16 = 6,25 ως εξής: η περιεκτικότητα σε άζωτο της συνολικής πρωτεΐνης κάθε σχεδόν φυσικού προϊόντος, χωριστά, είναι περίπου σταθερή. Έτσι του ζωικού λευκώματος (κρέας, γάλα) είναι 16 %, ενώ του φυτικού κυμαίνεται από 16,6 18,2 % ανάλογα με το προϊόν. Παραδείγματα: κρέας ψάρια: 100 / 16 = 6,25 γαλακτοκομικά: 100 / 15,67 = 6,38 σιτάρι αλεύρι: 100 / 17,54 = 5,70 Αρχή της μεθόδου Ποσότητα δείγματος ζωοτροφής θερμαίνεται επί αρκετό χρονικό διάστημα μέσα σε ειδική φιάλη (Kjeldahl) με πυκνό θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) παρουσία θειικού χαλκού (CuSO 4.5H 2 O) και θειικού καλίου (K 2 SO 4 ). Κατά τη θέρμανση το υδρογόνο και ο άνθρακας των οργανικών ουσιών της τροφής οξειδώνεται προς νερό (H 2 O) και διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ), αντίστοιχα, ενώ το άζωτο ανάγεται προς αμμωνία (NH 3 ). Η τελευταία δεσμεύεται από την περίσσεια του πυκνού θειικού οξέος και σχηματίζεται όξινο θειικό αμμώνιο NH 3 + H 2 SO 4 NH 4 HSO 4 Με την προσθήκη πυκνού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (NaOH) ακολουθεί απελευθέρωση της δεσμευμένης αμμωνίας, η οποία παραλαμβάνεται ποσοτικά με απόσταξη μέσα σε διάλυμα βορικού οξέος (H 3 BO 3 ), οπότε και σχηματίζεται δισόξινο βορικό αμμώνιο NH 4 HSO 4 + 2 NaOH NaSO 4 + NH 3 +H 2 O H 3 BO 3 + NH 3 NH 4 H 2 BO 3 26

Το σχηματιζόμενο δισόξινο βορικό αμμώνιο, η ποσότητα του οποίου είναι ανάλογη της αμμωνίας που αποστάχθηκε και δεσμεύτηκε, ογκομετρείται μετά το τέλος της απόσταξης με πρότυπο ( συνήθως 0,1N) διάλυμα υδροχλωρικού ή θειικού οξέος : NH 4 H 2 BO 3 + HCl NH 4 Cl + H 3 BO 3 ή 2 NH 4 H 2 BO 3 + H 2 SO 4 NH 4 Cl + H 3 BO 3 Από την ποσότητα (ml) του διαλύματος υδροχλωρικού ή θειικού οξέος υπολογίζεται η επί τοις εκατό (%) περιεκτικότητα της τροφής σε ολικό άζωτο. Αντιδραστήρια 1. Θειικό κάλιο (K 2 SO4) 2. Θειικός χαλκός (CuSO 4.5H 2 O). Χρησιμοποιούμε ειδικές ταμπλέτες για τα αντιδραστήρια 1 και 2. 3. Πυκνό θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) 95-97%, ειδικό βάρος 1,84 4. Διάλυμα υδροξείδιου του νατρίου: Παρασκευάζεται με διάλυση 500 gr υδροξειδίου του νατρίου (NaOH) και 12 gr θειούχου νατρίου (Na 2 S.9H 2 O) σε 1000 ml απεσταγμένου νερού. 5. Διάλυμα βορικού οξέος: Παρασκευάζεται με διάλυση 40 gr βορικού οξέος (Η 3 ΒΟ 3 ) σε 1000 ml απεσταγμένου νερού. 6. Διάλυμα δείκτη: Παρασκευάζεται μεδιάλυση 0,2 gr ερυθρού του μεθυλίου και 0,1 gr κυανούν του μεθυλενίου σε 100 ml αιθανόλης (96 % κ.ο.). 7. Διάλυμα δεκατοκανονικό υδροχλωρικού (ή θειικού) οξέος 0,1 Ν: Μία αμπούλα Ν /10 HCl διαλύεται σε ογκομετρική φιάλη η οποία γεμίζεται με απεσταγμένο νερό μέχρι της ενδείξεως των 1000 ml. Διαδικασία 1. Σε κάθε μία από τις οκτώ γυάλινες φιάλες πέψεως βάζουμε 1,0 gr δείγματος της υπό εξέτασης ζωοτροφής μαζί με 15 20 gr θειικού καλίου και 1 gr θειικού χαλκού. 2. Στην ίδια φιάλη βάζουμε 20 25 ml πυκνού θειικού οξέος 95-97 %, (d = 1,84). 3. Τοποθετούμε τις φιάλες στη συσκευή πέψεως εντός της εστίας του απαγωγού. 4. Γίνεται θέρμανση της φιάλης πέψεως για περίπου δύο (2) ώρες. 27

Εικόνα 7. Τα δείγματα 1 και 3 (διαυγές χρώμα) έχουν υποστεί πλήρη υγρή καύση (wet oxidation ή digestion). 5. Στο τέλος της θέρμανσης γίνεται απομάκρυνση της φιάλης από τη θερμαντική εστία (αφήνεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέχρι να κρυώσει). 6. Στη συνέχεια γίνεται τοποθέτηση της φιάλης στη συσκευή απόσταξης Vapodest 30. 7. Τοποθετούμε μια κωνική φιάλη των 250 ml στη συσκευή. Η συσκευή εκτελεί αυτόματα την απόσταξη με το ανάλογο πρόγραμμα. 8. Στο τέλος γίνεται τιτλοποίηση του περιεχομένου της κωνικής φιάλης με δεκατοκανονικό (Ν/10) διάλυμα υδροχλωρικού οξέος. Στη φιάλη αρχικά προσθέτουμε 3-4 σταγόνες διαλύματος δείκτη (το δείγμα αποκτά πράσινο χρωματισμό) και ανακινούμε ελαφρώς. Στο σημείο όπου αλλάζει το χρώμα, σημειώνουμε την ένδειξη. 28

Εικόνα 8. Συσκευή απόσταξης Vapodest 30 Υπολογίζουμε την ποσότητα αζώτου της τροφής σύμφωνα με τον τύπο: Ολικό άζωτο (%) = (1,40 x κανονικότητα οξέος x ml καταναλώθηκαν) / βάρος δείγματος Παρατηρήσεις - Προκειμένου να αποφευχθεί η επικόλληση της τροφής στα τοιχώματα της φιάλης κατά τη διάρκεια της θέρμανσης, η τροφή τοποθετείται σε ειδικό διηθητικό χαρτί. - Ανά τακτά χρονικά διαστήματα ανακινούμε ελαφρά τη φιάλη, ώστε το θειικό οξύ να διαβρέχει τα τοιχώματα της φιάλης για την επίτευξη πλήρους καύσεως της ζωοτροφής. - Εάν κατά τη θέρμανση δημιουργηθεί αφρός πρέπει να χαμηλώσουμε τη θερμοκρασία. - Με την έναρξη αλλαγής χρώματος του περιεχομένου της φιάλης από καφέ σε πρασινωπό, αυξάνουμε στο μέγιστο τη θερμοκρασία και σε 10 λεπτά απομακρύνουμε τη φιάλη από τη συσκευή. - Η φιάλη πέψεως τοποθετείται με τέτοιο τρόπο στη συσκευή απόσταξης ώστε να εφάπτεται κανονικά στην υποδοχή της συσκευής 29

Βιβλιογραφία 1. AOAC Official Method of Analysis (1990). Official Methods of Analysis. 15th edition. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC. 2. AOAC Official Method of Analysis (2005). Method 920.39. Fat (crude) or ether extract in animal feed. 18th Ed. AOAC Int., Gaithersburg, MD. 3. AOAC Official Method of Analysis (2002). Method 934.01. Loss on drying (moisture) at 95 100 C for feeds. AOAC International, Arlington, VA. 4. AOAC Official Method of Analysis (1990). Method. (984.13). Protein (Crude) Determination in Animal Feed: Copper Catalyst Kjeldahl. Association of Official Analytical Chemists. 15thEdition. 5. Makkink, C., (2001) Acid binding capacity in feedstuffs. Feed International, October: 24-27 30