Κεφάλαιο 28 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΑΤΙΣΜΑ ΤΟΥ RNA Η ροή της πληροφορίας για το σχηματισμό των πρωτεϊνών, προϋποθέτει τη μεταφορά της από το DNA στο RNA (ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ) Η διαδικασία της μεταγραφής απαιτεί τη δράση του ενζύμου RNA πολυμεράση Η δομή του ενζύμου στα πρκαρυωτικά και τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι πανομοιότυπη, αν και υπάρχουν διαφορές στο μήκος και τον αριθμό των υπομονάδων (άρα και στη ρύθμιση της όλης διαδικασίας)
Η τρισδιάστατη δομή αποκαλύπτει την κοινή φυλογενετική πορεία τους Προκαρυωτική RNA πολυμεράση Ευκαρυωτική RNA πολυμεράση
Λειτουργίες RNA πολυμεράσης Αναζητά στο DNA θέσεις έναρξης μεταγραφής (θέσεις προαγωγέων ή προαγωγείς) (E. coli = 2000 θέσεις σε όλοτογονιδίωμα) Ξετυλίγει το δίκλωνο μόριο DNA και παράγει μονόκλωνο εκμαγείο Επιλέγει τον κατάλληλο τριφωσφορικό ριβονουκλεοζίτη και καταλύει το σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού (επεξεργαστικό ένζυμο= όλα από την αρχή ως το τέλος) Ενώ συνθέτει την αυξανόμενη αλυσίδα, ανιχνεύει θέσεις τερματισμού Αλληλεπιδρά με ενεργοποιητικές και κατασταλτικές πρωτεϊνες
Η RNA πολυμεράση του E.coli είναι πολύ μεγάλο ένζυμο (~400Kd) που αποτελείται από επιμέρους υπομονάδες σε στοιχειομετρία α 2 ββ σ Η σ υπομονάδα είναι αυτή που ανιχνεύει τον προαγωγέα στο DNA και αφού βοηθήσει στην εκκίνηση μετά απομακρύνεται/αποσυνδέεται. Το α 2 ββ ονομάζεται πυρήνας του ενζύμου και έχει το καταλυτικό κέντρο
Η RNA πολυμεράση, σε απόλυτη αντιστοιχία με την DNA πολυμεράση, περιέχει δύο μεταλλικά ιόντα στο ενεργό κέντρο. Τρία συντηρημένα ασπαραγινικά συμμετέχουν στη δέσμευση των ιόντων
Έλεγχος της πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης με την τεχνική της αποτύπωσης Προσθήκη RNA πολυμεράσης
Προαγωγέας είναι μια αλληλουχία DNA, που κατευθύνει την RNA πολυμεράση στην κατάλληλη θέση έναρξης της μεταγραφής. Οι θέσεις των προαγωγέων εντοπίστηκαν με την τεχνική της αποτύπωσης (blotting). Προσδιορίστηκαν 2 αλληλουχίες, η ΤΑΤΑΑΤ με κέντρο τη θέση -10, και η TTGACA στη θέση -35 Ημεταγραφή αρχίζει εδώ Κάθε προαγωγέας έχει και διαφορετική ισχύ (που σημαίνει μεταγραφή κάθε sec ή κάθε 10 λεπτά)
Η μοναδική διαφορά είναι ότι το μόριο του RNA έχει ουρακίλη (U) εκεί όπου ο κωδικεύων κλώνος του DNA έχει θυμίνη (T). Στοστάδιοτηςμεταγραφήςμόνο ένας από τους δύο κλώνους μεταγράφεται προς αγγελιαφόρο RNA (mrna) (σε αντίθεση με την αντιγραφή του DNA, όπου και οι δύο κλώνοι αντιγράφονται). Ο κλώνος του αρχικού μορίου DNA που περιέχει το γονίδιο ονομάζεται κωδικεύων ή νοηματικός κλώνος (+) (coding or sense strand), ενώ ο κλώνος-εκμαγείο ονομάζεται πρότυπος ή αντινοηματικός κλώνος (-) (template or antisense strand). Επειδή ο πρότυπος και ο κωδικεύων κλώνος είναι συμπληρωματικοί (complementary), και επειδή ο πρότυπος κλώνος και το μόριο του RNA είναι επίσης συμπληρωματικοί, συνεπάγεται ότι το μόριο του RNA που σχηματίζεται κατά το στάδιο της μεταγραφής, αποτελεί αντίγραφο του κωδικεύοντος κλώνου.
ΗυπομονάδαστηςRNA πολυμεράσης Ησυπομονάδασυμβάλλειστηνειδικήέναρξητης μεταγραφής, μειώνοντας τη συγγένεια για τυχαίες θέσεις του DNA κατά 10 4 και προσδίδοντας ειδικότητα στο ένζυμο για τη θέση του προαγωγέα Συγκεκριμένα το ολοένζυμο α 2 ββ σ δεσμεύεται σε δίκλωνο DNA, και ολισθαίνει κατά μήκος του και αναγνωρίζει θέση προαγωγέα (κινείται σε μια διάσταση) Όταν η νέα αλύσίδα RNA γίνει 9 ή 10 νουκλεοτίδια μήκους η σ υπομονάδα αποδεσμεύεται και μπορεί να βοηθήσει έναν άλλο πυρήνα στην εύρεση προαγωγέα
Δομή της υπομονάδας σ, όπου διακρίνεται μια α- έλικα που δεσμέυει την αλληλουχία -10 Έλικα για αναγνώριση της -10 αλληλουχίας
Το E. coli έχει πολλούς παράγοντες σ που αναγνωρίζουν διαφορετικούς προαγωγείς Η ομόφωνη αλληλουχία αναγνωρίζεται από την σ 70, ενώ υπό άλλες συνθήκες αναλαμβάνουν δράση άλλες σ υπομονάδες Συνηθισμένος προαγωγέας Προαγωγέας γονιδίων θερμικής καταπληξίας Προαγωγέας τροφοπενίας
Επόμενο βήμα είναι να ξετυλιχθεί η διπλή έλικα Η RNA πολυμεράση δεσμεύεται σε δίκλωνο DNA αλλά η έναρξη της σύνθεσης απαιτεί ξετυλιγμένο DNA. Δίκλωνο ελικοειδές DNA Ξετυλιγμένο DNA (μήκος 17bp) RNA πολυμεράση
Το ξετύλιγμα του δίκλωνου DNA αυξάνει το βαθμό αρνητικής υπερσπείρωσης Παρεμβαίνει η τοποϊσομεράση Ι που συντονισμένα σπάει και επανενώνει Η μετάβαση από το σύμπλοκο του κλειστού προαγωγέα σε αυτό του ανοικτού είναι σημαντικό γεγονός
Η RNA πολυμεράση σε αντίθεση με την DNA πολυμεράση δεν απαιτεί εκκινητή και γι αυτό οι αυξανόμενες mrna αλυσίδες έχουν στο 5 άκρο τους μια ετικέτα pppa ή pppg Οι αλυσίδες RNA όπως και του DNA αναπτύσσονται κατά την κατεύθυνση 5-3 Πρώτο γεγονός είναι η απώλεια του παράγοντα σ (που οδηγεί πλέον σε ισχυρότερη δέσμευση το ένζυμο πάνω στο υπόστρωμα) Η φυσαλίδα μεταγραφής προχωρά 17nm το δευτερόλεπτο και έτσι προσθέτει 50 βάσεις ανά δευτερόλεπτο (πολύ φτωχό σε σύγκριση με τις 1000 που προσθέτει η DNA πολυμεράση
Το νεοσυντιθέμενο RNA υποχωρεί και η διπλή αλυσίδα DNA ξανακλείνει πίσω Το υβρίδιο RNA-DNA παραμένει σταθερό σε μήκος καθώς και το ξετυλιγμένο τμήμα της έλικας του DNA Η RNA πολυμεράση δεν έχει δραστικότητα νουκλεάσης, δηλαδή δε διορθώνει λάθη. Η πιστότητά της είναι πολύ μικρότερη, 1 λάθος ανά 10 4, στοιχείο που δεν είναι τόσο καθοριστικό καθώς η πληροφορία δε μεταφέρεται στους απογόνους.
Η λήξη της μεταγραφής είναι καλά καθορισμένη όπως και η έναρξη. Στον τερματισμό: Σταματά η προσθήκη νουκλεοτιδίων Αποσυνδέεται το RNA από το DNA Ξανατυλίγεται το DNA Η RNA πολυμεράση αποδεσμεύει το DNA Τα μετάγραφα σταματούν μετά το σχηματισμό στο RNA της δομής φουρκέτας (περιοχή πλούσια σε G και C που μπορούν και ζευγαρώνουν σταθερά με τρεις δεσμούς υδρογόνου) Ακολουθουν 3-4 βάσεις ουρακίλης που είναι καθοριστικές για τη λήξη
Κάποιες φορές στους προκαρυωτικούς οργανισμούς συμμετέχουν και άλλοι παράγοντες για τη λήξη (πχ παράγοντας ρ) Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το νεοσυντιθέμενο RNA υφίσταται μικρή ή καμία τροποποίηση (μπορεί να αρχίσει η μετάφραση παράλληλα με τη μεταγραφή) Τα μικρά trna και τα rrna μπορεί να προκύπτουν από ψαλίδισμα μεγαλύτερων μεταγραφημάτων Επίσης παρατηρούνται μικρο-προσθήκες στα άκρα καθώς και τροποποιήσεις βάσεων και μεθυλιώσεις
Αντιβιοτικά ως αναστολείς της μεταγραφής Η ριφαμπικίνη και η ακτινομυκίνη D αναστέλλουν τη μεταγραφή με διαφορετικό ειδικό τρόπο Η ριφαμπικίνη αναστέλλει την έναρξη της σύνθεσης RNA, εμποδίζοντας τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, φράσσοντας το δίαυλο από όπου περνά το DNA-RNA σύμπλοκο ΗακτινομυκίνηD δεσμεύεται σε δίκλωνο DNA και δεν του επιτρέπει να είναι εκμαγείο για σύνθεση RNA
Μέχρι τώρα μελετήσαμε τη μεταγραφή στο προκαρυωτικό κύτταρο (αριστερά) Στο ευκαρυωτικό κύτταρο η μεταγραφή και η ακολουθούμενη μετάφραση γίνονται σε διαφορετικά διαμερίσματα Άρα απαιτείται συντονισμός και συστήματα ρύθμισης Επίσης υπάρχουν τα εσώνια που απαιτούν την τροποποίηση του πρωτογενούς μεταγραφήματος Πυρήνας Κυτοσόλιο Προκαρυωτικό Ριβόσωμα Νεοσυντιθέμενη πρωτείνη Ευκαρυωτικό Ριβόσωμα Νεοσυντιθέμενη πρωτείνη
Προκειμένου για ευκαρυωτικά κύτταρα υπάρχουν τριών ειδών RNA πολυμεράσες, με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά όσον αφορά την εξειδίκευση, τη θέση τους στον πυρήνα και την ευαισθησία τους σε αναστολείς. Οι τρεις πολυμεράσες είναι σχετικά ομόλογες και δομικά παρόμοιες, η ΙΙ ωστόσο έχει μια πρόσθετη ομάδα 220 kd, με ασυνήθiστες επαναλήψεις.
Και στα ευκαρυωτικά κύτταρα απαραίτητη ύπαρξη προαγωγέων, που όμως είναι διαφορετικοί για κάθε μια από τις RNA πολυμεράσες. Ωστόσο τα ευκαρυωτικά έχουν και θέσεις ενισχυτών, θέσεις που αυξάνουν την αποτελεσματικότητα των προαγωγέων. Προαγωγέας για την RNA πολυμεράση ΙΙ, ανάλογος με αυτόν της προκαρυωτικής πολυμεράσης. Τοποθετείται μεταξύ -30 και -100. Μεταλλαγή σε μια μόνο θέση του ΤΑΤΑ αλλάζει δραστικά την αποτελεσματικότητα
Πρόσθετα στοιχεία πέραν του TATA είναι παρόντα ώστε να δίνουν επιπλέον δραστικότητα. Βρίσκονται μεταξύ -40 έως -150 (π.χ. CAAT, GC). ΟΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΑΥΤΕΣ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΚΛΩΝΟ-ΕΚΜΑΓΕΙΟ (ΟΧΙ ΣΤΟΝ ΚΩΔΙΚΕΥΟΝΤΑ ΟΠΩΣ ΣΤΑ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΑ)
Εκτός από τίς παραπάνω θέσεις, υπάρχουν θέσεις δέσμευσης διαφόρων Παραγόντων μεταγραφής (TF). Καθοριστικό στοιχείο για την έναρξη, η πρόσδεση του TFIID στο ΤΑΤΑΑΑ
Όλα τα αρχικά προϊόντα μεταγραφής στους ευκαρυωτικούς υφίστανται επεξεργασία. Παράδειγμα το trna Οδηγός Επεξεργασία Πρώιμο μεταγράφημα Ώριμο trna
ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ Την πιο εκτεταμένη επεξεργασία υφίστανται τα προϊόντα της RNA πολυμεράσης ΙΙ Το προ-mrna ματίζονται ώστε να αφαιρεθούν τα εσώνια, ενώ τα 3 και 5 άκρα τους τροποποιούνται Συγκεκριμένα στο 5 άκρο τροποποιείται ο τριφωσφορικός νουκλεοζίτης (αφαίρεση μιας φωσφορικής ομάδας και δημιουργία ενός ασυνήθιστου 5-5 τριφωσφορικού συνδέσμου με γουανίνη.
Τροποποίηση 5 άκρου. Τοποθέτηση καλύματος με μεθυλίωση. Το trna και το rrna δεν καλύπτονται με αυτό τον τρόπο. Τα καλύματα δίνουν σταθερότητα και ενισχύουν τη μετάφραση.
Το mrna τροποποιείται και στο 3 άκρο. Συγκεκριμένα στα πιο πολλά υπάρχει μια polya ουρά η οποία δεν κωδικεύεται. Ειδική ενδονουκλεάση διασπά την αλληλουχία ΑΑUΑΑΑ. Στη συνέχεια προστίθεται μια ουρά περίπου 250 αδενυλικών καταλοίπων. Προσδίδει σταθερότητα στο mrna Εκμαγείο DNA Νεοσυντιθέμενο RNA Σήμα διάσπασης Διάσπαση από ενδονουκλεάση Προσθήκη ουράς από πολυα πολυμεράση Πολυαδενυλιωμένο πρόδρομο mrna
Η ύπαρξη εσωνίων και εξωνίων καθιστά επιτακτική την ανάγκη της διεργασίας του ματίσματος για το πρόδρομο mrna. Το μάτισμα είναι ευαίσθητο γιατί λάθος κατά ένα μόνο νουκλεοτίδιο θα άλλαζε το πλαίσιο ανάγνωσης. Πώς αναγνωρίζεται το εσώνιο: αρχίζει με GU και τελειώνει σε AG, ενώ υπάρχει και μια πολύ σημαντική θέση μεταξύ 20 και 50 (θέση διακλάδωσης). Τα εσώνια μπορεί να έχουν μήκος 500 έως 10000 νουκλεοτίδια
Μηχανισμός ματίσματος για τα πρόδρομα mrna