Άσκηση 1, πολυφαινολοξειδάση Εκχύλιση Πρέπει να γίνει γρήγορα και εν ψυχρώ ώστε να περιοριστούν οι ενεργότητες πρωτεασών, η θερμική μετουσίωση της δομής των πρωτεϊνών, να αποφευχθεί η ανάπτυξη μικροοργανισμών. Για τον τελευταίο λόγο (μικροοργανισμοί), προστίθεται το βιοκτόνο NaN 3 σε πολλά πρωτεϊνικά παρασκευάσματα (πχ αντισώματα). Προσοχή όμως, το NaN 3 είναι καρκινογόνο. NaF Αυξάνει την ιοντική ισχύ του διαλύματος βελτιώνοντας τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Είναι επίσης αναστολέας πρωτεασών. TCA Ισχυρό οξύ που προκαλεί σε πολλές περιπτώσεις κατακρήμνιση πρωτεϊνών. Η κατακρήμνιση ενός ενζύμου από το TCA μπορεί να είναι αναστρεπτή αν το ένζυμο ανακτήσει ενεργότητα μετά την επαναδιαλυτοποίηση. Αν δεν κάνουμε το πείραμα αυτό δεν μπορούμε να ξέρουμε αν η κατακρήμνιση του συγκεκριμένου ενζύμου ήταν αναστρεπτή ή όχι. Ένα οξύ θα μπορούσε να αναστέλλει τη δράση ενός ενζύμου πρωτονιόνοντας ομάδες του ενεργόυ κέντρου που δρουν κανονικά σε μη πρωτονιομένη μορφή (πχ θειόλες). Μπορούμε επίσης να έχουμε αλλαγή δομής και ενεργότητας με αλλαγές ph (αντιστρεπτές ή μη) χωρίς κατακρήμνιση Πολυφαινολοξειδάση Περιέχει Cu 2+ ο οποίος αντιδρά με φαινυλθειουρία εξ ου και η αναστολή του ενζύμου παρουσία φαινυλθειουρίας. Κανονικά ο χαλκός του ενζύμου παίρνει μέρος στον καταλυτικό μηχανισμό. 1
Άσκηση 2, ηλεκτροφόρηση SDS Δεσμεύεται μη ομοιπολικά στον ανθρακικό κοσρμό των πρωτεϊνών με το υδρόφοβό του τμήμα (υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις). Το πολικό του τμήμα (S 2- ) προεξέχει στο διάλυμα. Η ακόλουθες εικόνες δείχνουν τις επιδράσεις του SDS σε μια ηλεκτροφόρηση κάτω από αναγωγικές συνθήκες (παρουσία β μερκαπτοεθανόλης ή διθειοθρεϊτόλης): Το ξεδίπλωμα: 2
Παρουσία SDS οι πρωτεΐνες ξεδιπλώνονται και αποκτούν ίση πυκνότητα αρνητικού φορτίου (προερχόμενη από το SDS) ανά μήκος πρωτεΐνης. Η προσθήκη αρνητικών φορτίων από το SDS είναι τόσο μεγάλη ώστε η συνεισφορά των ενδογενών φορτίων των πρωτεϊνών να καθίσταται αμελητέα. Έτσι, η προσθήκη SDS μετατρέπει τις πρωτεΐνες σε πολυανιόντα με μόνη διαφορετική ιδιότητα το μήκος του καθενός. Σε ένα πήκτωμα ακρυλαμίδης (πλέγμα διαχωρισμού) τα πολυανιόντα αυτά μεταναστεύουν σε ένα ηλεκτρικό πεδίο με βάση το μήκος τους: όσο πιο μεγάλα τόσο πιο αργά θα μεταναστεύσουν. Γλυκερόλη Αυξάνει το ιξώδες και ειδικό βάρος του δείγματος ώστε αυτό να μην ανακατεύεται με το ρυθμιστικό διάλυμα και να βυθίζεται εύκολα στο πηγαδάκι του στο πήκτωμα Μεθανόλη Διαλύει τη χρωστική και ξεβάφει το βαμμένο πήκτωμα Οξικό οξύ Κατακρημνίζει τις πρωτεΐνες πάνω στο πήκτωμα και παρεμποδίζει τη διάχυσή τους. Ζυμογόνο Πρόδρομος ανενεργός πρωτεάση με επιπλέον αλληλουχία. Triton X-100 Μη ιοντικό απορρυπαντικό. Εμβάπτυση πηκτώματος μετά από ηλεκτροφόρηση SDS- PAGE σε διάλυμα με Triton X-100, μπορεί να οδηγήσει σε αντικατάσταση του SDS 3
από το Triton X-100 και επεναφορά της ενζυμικής ενεργότητος των ηλεκτροφορημένων πρωτεϊνών. Πήκτωμα επιστοίβαξης Αραιό πήκτωμα με διαφορετικό ph και ιοντική σύσταση από το κυρίως διαχωριστικό πήκτωμα όπου γίνεται η ανάλυση. Ο ρόλος του είναι να συγκεντρώνει όλες τις πρωτεΐνες του ηλεκτροφορούμενου δείγματος σε μία λεπτη ζώνη πριν από την είσοδο του δείγματος στο κυρίως διαχωριστικό πήκτωμα. Απουσία του πηκτώματος επιστοιβάξεως, η διαχωριστική ποιότητα των πηκτωμάτων ακρυλαμίδης πρωτεϊνών είναι πολύ κακή. Μηχανισμός Στο ηλεκτρικό πεδίο του πηκτώματος υπάρχουν 3 ανιόντα που μπορούν να μεταναστεύσουν στο ηλεκτρικό πεδίο: τα ιόντα χλωρίου (Cl - ), τα πολυανιόντα πρωτεϊνών και τα ανιόντα γλυκίνης (pka 2.34 για την καρβοξυλομάδα και 9.60 για την αμινομάδα). Στo ph 6,8 του πηκτώματος επιστοιβάξεως, τα ιόντα γλυκίνης είναι λιγότερο αρνητικά φορτισμένα και μεταναστεύουν πιο αργά, ενώ γρηγορότερα μεταναστεύουν τα Cl -. Ανάμεσα στις δύο αυτές ζώνες υπάρχει χαμηλή αγωγιμότης, πτώση του δυναμικού και τα πολυανιόντα των πρωτεϊνών τα οποία «συμπιέζονται» σε μια λεπτή στοιβάδα πλάτους μόλις 19 nm. Καθώς η περιεκτικότητα ακρυλαμίδης είναι χαμηλή, δεν παρατηρούνται διαφορές στη μετανάστευση των πρωτεϊνικών μορίων, οπότε όλες οι πρωτεΐνες πλησιάζουν το διαχωριστικό πήκτωμα σε μια λεπτή στοιβάδα. Με την είσοδο στο ψηλότερο ph του διαχωριστικού πηκτώματος, τα ιόντα γλυκίνης φορτίζονται ακόμα περισσότερο αρνητικά και προσπερνούν τη ζώνη των πρωτεϊνών. Το δυναμικό επανέρχεται και οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται στην υψηλότερη συγκέντρωση ακρυλαμίδης του πηκτώματος διαχωρισμού με βάση το μοριακό τους βάρος. CaCl 2 Προσθετική ομάδα πολλών ζελατινασών. 4
Άσκηση 3, αλκοολική αφυδρογονάση ζύμης Μονάδες ενεργότητος Προσοχή! Η έννοια της μονάδας (U) για κάθε ένζυμο είναι εν πολλοίς αυθαίρετη. Αν μία μονάδα ενζύμου (U) ορίζεται ως μεταβολή 0.001 ανά λεπτό σε κάποιο μήκος κύματος λ (έστω 350 nm), αυτό1 σημαίνει ότι 1U = 0.001 min Στη συγκεκριμένη περίπτωση, όταν αναφέρεστε σε μονάδα ενεργότητος, είναι λάθος να λέτε U ανά min κλπ. Η έννοια μονάδα ενζύμου (U) εμπεριέχει την έννοια του χρόνου. Μπορείτε φυσικά να χρησιμοποιείτε τον όρο U ανά ml. Υπάρχει μια περίπτωση που έχει νόημα η χρήση των μονάδων ανά μονάδα χρόνου. Αυτό γίνεται όταν έχουμε αναφορά μονάδων σε χρονική μονάδα διαφορετική από τη μονάδα χρόνου που ορίστηκε για τη μονάδα ενεργότητας. Έτσι πχ αν έχουμε συνολικές μονάδες για 10 λεπτά και ο ορισμός της ενεργότητος του ενζύμου είναι ανά λεπτό, τότε κάνουμε αναγωγή στο ένα λεπτό (διαιρώντας με το 10), ώστε να πάρουμε το κανονικό U. A 350 Υπολογισμός ειδικής δραστικότητας Υπολογίσατε την ενζυμική δραστικότητα ως μονάδες ανά πρωτεΐνης που είναι και το σωστό. Για να το κάνετε αυτό υπολογίσατε πρώτα την συνολική πρωτεΐνη με βάση τον όγκο, κατόπιν τις συνολικές μονάδες με βάση πάλι τον όγκο και τέλος διαιρέσατε τις συνολικές μονάδες ανά συνολική πρωτεΐνη. Αυτό σας έδωσε το σωστό αποτέλεσμα αλλά αν παρατηρήσετε τι κάνατε, θα δείτε ότι από την προηγούμενη διαίρεση εξαλείφεται η έννοια του όγκου. Με άλλα λόγια, τα U ανά ένα ml και mg ανά ένα ml θα σας έδιναν πάλι το ίδιο αποτέλεσμα. Αυτός είναι και ο τρόπος σκέψης του «καλού ενζυμολόγου». Στάδια καθαρισμού Η χρήση οργανικού διαλύτη προκαλεί κατακρήμνιση των πρωτεϊνών του διαλύματος διότι απομακρύνει το νερό που είναι στοιχείο της εξωτερικής δομής των πρωτεϊνών το οποίο περιβάλλει τώρα τα μόρια του οργανικού διαλύτη. Όταν το νερό φύγει, πολικές ομάδες στις διαφορετικές πρωτεΐνες είναι πιο προσιτές για αλληλεπιδράσεις. Η αλληλεπίδραση γίνεται σχυρότερη και λόγω της ελάττωσης της διηλεκτρικής σταθεράς λόγω οργανικού διαλύτη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η δημιουργία συσσωματωμάτων. Η κατακρύμνιση γίνεται εν ψυχρώ ώστε να αποφευχθεί η μη αντιστρεπτή αποδιάταξη των κατακρημνιζόμενων πρωτεϊνών. 5
Η θέρμανση του πρωτεϊνικού διαλύματος στους 55 βαθμούς προκάλεσε εκλεκτική κατακρύμνιση (θερμική μετουσίωση) μη επιθυμητών πρωτεϊνών, ώστε το εναπομείνον ένζυμό μας να προκύψει σε υψηλότερο βαθμό καθαρότητος. Παράδειγμα πίνακα καθαρισμού και υπολογισμών Στάδιο καθαρισμού Υδατική Εκχύλιση Συγκέντρωση πρωτεΐνης (mg/ml) Συνολικός Όγκος (ml) Mονάδες ανά ml (U/mL) Συνολικές Μονάδες ενζύμου (U) Ειδική δραστικότητα (U/mg) Απόδοση (%) 3 20 50 1000 50/3 100 Θέρμανση 2 15 60 900 60/2 90 Ακετόνη 1,5 8 100 800 100/1,5 80 Μελετείστε προσεκτικά τον πίνακα για να καταλάβετε πως γίνονται οι υπολογισμοί (θέμα ΣΟΣ)! Εξειδίκευση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμα Βοηθά να σκεφθείτε τις πλευρικές ομάδες της CH 2 -OH σαν βοήθεια για προσανατολισμό της ΟΗ στο ενεργό κέντρο Η αιθανόλη για την οποία το ένζυμο που έχει τη μεγαλύτερη ενεργότητα από τις ενώσεις που χρησιμοποιήσατε έχει τον τύπο: CH 3 -CH 2 -OH Mε τη μεθανόλη CH 3 -OH δεν παρατηρήθηκε ενεργότητα. Ίσως λοιπόν η έξτρα μεθυλομάδα της αιθανόλης να χρειάζεται για να δεσμευθεί το υπόστρωμα στην ενεργό περιοχή του ενζύμου. Ενεργότητα δεν είχατε ούτε με τη βουτανόλη (CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -OH) 6
Άρα δύο έξτρα μεθυλομάδες ίσως παρεμποδίζουν την είσοδο στο ενεργό κέντρο. Μπορεί δηλαδή να μπαίνουν οι μεθυλομάδες, αλλά το υπόστρωμα αλκοόλη να μένει μακριά από την ενεργό περιοχή. Ενεργότητα παρατηρήθηκε με προπανόλη (CH 3 -CH 2 -CH 2 -OH). Άρα μία επιπλέον μεθυλομάδα επιτρέπει μετρήσιμη αλληλεπίδραση με το υπόστρωμα. Καμμία ενεργότητα δεν παρατηρήθηκε με ισοπροπανόλη (CH 3 ) 2 CH-OH Αν και το μόριο έχει επιπλέον μεθυλομάδες σε σχέση με τη μεθανόλη, η τοποθεσία τους στο μόριο το καθιστά πιο σφαιρικό απ ότι πχ η αιθανόλη. Είναι λοιπόν πιθανό οι δύο διακλαδωμένες μεθυλομάδες να μην επιτρέπουν στο μόριο να μπει στο ενεργό κέντρο ούτως ώστε η υδροξυλομάδα να προσεγγίσει την ενεργό περιοχή. Εξειδίκευση, εκφράσεις Λέμε, το ένζυμο παρουσιάζει (ή έχει) απόλυτη (μερική κλπ) εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα (συνένζυμο) τάδε. Επίδραση αναστολέων Γνωρίζετε από την εισαγωγή σας ότι ασχολείσθε με ένα ένζυμο που έχει κυστεΐνη στο ενεργό του κέντρο. Με βάση αυτή την παρατήρηση μπορούν να εξηγηθεί η συμπεριφορά του ενζύμου στους πιθανούς αναστολείς. 7
Ιωδοακεταμίδιο: παρατηρήθηκε ισχυρή αναστολή Η ουσία αλληλεπιδρά ισχυρά με σουλφυδρύλια (-SH). H αντίδραση λαμβάνει χώρα με το θειούχο ανιόν (-S - ) του σουλφυδυλίου ( SH S + + H ). Σχηματίζεται ομοιοπολικό σύμπλοκο Ιωδοβενζοϊκό οξύ: δεν παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή παρόλο που περιέχει αντιδρόν ιώδιο. Η παρατήρηση αυτή σε συνάρτηση με την παρατήρηση μη αντίδρασης του ενζύμου με ισοπροπανόλη συνηγορεί προς την κατεύθυνση του περιορισμένου και στερεοειδικού χώρου για το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Χλωροϋδράργυρο-βενζοϊκό οξύ: δεν παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή. Η ελαφρά αναστολή οφείλεται μάλλον στην αλληλεπίδραση υδραργύρου με την θειόλη 8
της κυστεΐνης του ενεργού κέντρου. Και πάλι, είναι πολύ πιθανό να έχουμε παρεμπόδιση της αντίδρασης λόγω παρεμβολής του ογκόδους βενζοϊκού δακτυλίου. Η ένωση είναι γνωστό ότι αντιδρά με σουλφυδρύλια. Ιωδοακεταμίδιο και γλουταθειόνη Μερικές αναφορές ανέφεραν προστασία του ενζύμου από τη γλουταθειόνη. Είναι λογικό αν σκεφτούμε ότι η (οξειδωμένη) γλουταθειόνη (περιέχει σουλφυδρύλιο!) μπορεί να αντέδρασε με τη θειόλη του ενεργού κέντρου του ενζύμου και να την προστάτευσε από το κατόπιν προστεθέν ιωδακεταμίδιο. Μπορεί επίσης το ιωδακεταμίδιο να αντέδρασε με την περίσεια γλουταθειόνης, οπότε να μην περίσεψε αρκετό να αντιδράσει με τις σουλφυδρυλομάδες του ενεργού κέντρου. Ποιές ήταν οι τελικές συγκεντρώσεις γλουταθειόνης-ιωδοακεταμιδίου; Προστασία ενεργού κέντρου από το υπόστρωμα Η προεπώαση με αιθανόλη προστάτευσε το ένζυμο από το ιωδοακεταμίδιο. Όχι όμως η προεπώαση με NAD. Τα αποτελέσματα αυτά δηλούν ότι η αιθανόλη αντιδρά με την σουλφυδρυλομάδα του ενεργού κέντρου, αλλά όχι το NAD. Μην ξεχνάτε ότι στον καταλυτικό μηχανισμό του ενζύμου (που δεν έδειξε κανείς σας), η αλκοόλη δείνει τα ηλεκτρόνιά της στο NAD, αφού πρώτα δεσμευθεί στο ένζυμο. Δηλαδή πρώτα δεσμεύετα ιη αλκοόλη και μετά το NAD. Το NAD. Δεν ανάγει την αλκοόλη, το ένζυμο το κάνει. Το NAD όμως είναι ο τελικός αποδέκτης ηλεκτρονίων. 9