ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ. παράδοση β. Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ παράδοση β Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

2 Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας S E P

3 Μέτρηση ενζυμικής δραστικότητας Μονάδες Ενζυμική μονάδα (enzyme unit, U) ή Διεθνής μονάδα (international unit, IU): S E P Η ποσότητα ενζύμου που μετατρέπει 1 μmol υποστρώματος ή παράγει 1 μmol προϊόντος ανά λεπτό katal (Kat): Η ποσότητα ενζύμου που μετατρέπει 1 mol υποστρώματος ή παράγει 1 mol προϊόντος ανά δευτερόλεπτο (s) Ενζυμική μονάδα (enzyme unit, U) και katal (Kat): πόσα U είναι ένα Kat; 1 Kat = 1 mol/s= μmol/s Σε 1s έχουμε μmol Σε 1 λεπτό έχουμε μmol. Άρα 1 Kat = 6x10 7 U

4 Εκφράσεις Μέτρηση ενζυμικής δραστικότητας Ειδική δραστικότητα (specific activity) Δραστικότητα ανά συνολική πρωτεΐνη δείγματος που περιέχει το ένζυμο U / mg συνολικής πρωτεΐνης. Μέτρο της καθαρότητος ενός ενζύμου. Μοριακή δραστικότητα (molecular catalytic activity) Δραστικότητα ανά μmol καθαρού ενζύμου U / μmol ενζύμου Αριθμός μορίων υποστρώματος ανά μόριο ενζύμου ανά μονάδα χρόνου Μπορεί να υπολογισθεί από την Ειδική δραστικότητα εάν γνωρίζουμε το μοριακό βάρος και την καθαρότητα του ενζύμου Αριθμός μετατροπής (turnover number) Αριθμός μορίων υποστρώματος ανά ενεργό περιοχή μορίου, ανά μονάδα χρόνου

5 Παράδειγμα: καθαρισμός γλουταρεδοξίνης από βακτηριακή καλλιέργεια

6 Τεχνικές προσδιορισμού ενζυμικής δραστικότητας Άμεσες: Έμμεσες: Συνεχείς: Ασυνεχείς: προσδιορισμός του παραγόμενου προϊόντος ή του εναπομείναντος υποστρώματος S P Η υπό μελέτη ενζυμική αντίδραση συζεύγνυται με άλλη, το προϊόν της οποίας μπορεί να μετρηθεί εφαρμόζονται όταν το S και το P διαφέρουν τουλάχιστον σε μια παράμετρο (ph, φάσμα απορρόφησης, ιξώδες, κ. α.) μετρήσεις είτε σταματώντας την αντίδραση (μεταβολή του ph, θέρμανση, κ. α.) είτε αδρανοποιώντας το ένζυμο. Το S διαχωρίζεται από το Ρ ή προστίθεται χρωμοφόρος ένωση, που αντιδρά με το S ή το Ρ και επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός από τα δύο E

7 Τεχνικές προσδιορισμού ενζυμικής δραστικότητας Σύγκριση συνεχών με ασυνεχείς μεθόδους Διαφορά στο σχήμα της καμπύλης προσδιορισμού Ανακρίβειες κατά τη διάρκεια του προσδιορισμού (λεπτομέρεια στο χρόνο τερματισμού ή της απομάκρυνσης των δειγμάτων σε συγκεκριμένους χρόνους)

8 [3H] CDP RNR [3H] dcdp Μέτρηση δραστικότητας αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίων Άμεση ασυνεχής μέθοδος

9 Μέτρηση δραστικότητας γλουταρεδοξίνης Έμεση, συνεχής μέθοδος

10 Μέθοδοι προσδιορισμού ενζυμικής δραστικότητας Φασματοφωτομετρία όταν το υπόστρωμα ή ένα από τα προϊόντα απορροφούν το φως (ορατό ή υπεριώδες), προσδιορισμός της γαλακτικής αφυδρογονάσης προσδιορισμός νουκλεασών Φασματοφθορισιομετρία: τουλ 100 φορές πιο ευαίσθητη από τη φασματοφωτομετρία Ηλεκτροχημικοί μέθοδοι με ιοντοεκλεκτικά ηλεκτρόδια όταν κατά την αντίδραση απελευθερώνονται όξινα προϊόντα είτε μετράται η πτώση της τιμής του ph με τον χρόνο είτε χρησιμοποιείται αυτόματος τιτλοδότης που προσθέτει διάλυμα αλκάλεως ώστε το ph να διατηρείται σταθερό Χημικές όταν πρέπει να γίνει ποσοτικός προσδιορισμός του εναπομένοντος υποστρώματος ή των παραγόμενων προϊόντων π. χ. νουκλεάσες, φωσφατάσες κλπ

11 Μέθοδοι προσδιορισμού ενζυμικής δραστικότητας Ραδιοχημικές όταν η ενζυμική δράση είναι πολύ ασθενής ή όταν είναι διαθέσιμοι πολύ μικροί όγκοι αντίδρασης και ταυτόχρονα δεν είναι επιθυμητή η εφαρμογή πολύπλοκων μεθόδων προσδιορισμού Πολωσιμετρικές όταν το υπόστρωμα είναι οπτικά μη ενεργό και τα προϊόντα ενεργά (ή αντίστροφα) όταν το υπόστρωμα στρέφει το πολωμένο φώς προς μια κατεύθυνση και τα προϊόντα προς την αντίθετη προσδιορίζεται η περιστροφή του πολωμένου φωτός με τον χρόνο (π.χ. Ινβερτάση) Αεριομετρικές όταν ένα από τα προϊόντα είναι αέριο (τότε η αντίδραση πραγματοποιείται σε κλειστό δοχείο) π. χ. Οξειδάσες, αποκαρβοξυλάσες κλπ Ενθαλπομετρικές όταν η ενζυμική αντίδραση συνοδεύεται με μετρίσιμη μεταβολή θερμοκρασίας

12 Υπολογισμός ενεργότητας γαλακτικής αφυδρογονάσης μέσω οξείδωσης NADH σε NAD + Πυροσταφυλικο οξύ γαλακτικό οξύ

13 Μέθοδοι προσδιορισμού ενζυμικής δραστικότητας Χρωματογραφικές και ηλεκτροφορητικές Πότε; όταν το προϊόν θα πρέπει να καθαριστεί από τα υπόλοιπα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης για να γίνει ο προσδιορισμός του Πως; σε τακτά χρονικά διαστήματα, αφαιρείται ποσότητα του μίγματος αντίδρασης και υποβάλλεται στη διαδικασία καθαρισμού Παρατήρηση Oι μέθοδοι αυτοί αποτελούν έσχατη λύση όσον αφορά τη μέτρηση ενζυμικής δραστικότητος

14 Μέθοδοι προσδιορισμού ενζυμικής δραστικότητας Χρωματογραφικές ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με τη χρήση ειδικών στηλών ιοντοανταλλαγής ανάστροφης φάσης υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων HPLC και εφαρμογή ισοκρατικής έκλουσης έκλουση διαβαθμισμένης συγκέντρωσης

15 ΤΕΛΟΣ