Μελέτη βελτιστοποίησης της μιξοτροφικής καλλιέργειας μικροφυκών του γένους Chlorella σε στερεό υπόστρωμα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΘΑΛΑΣΣΙΑΣ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΥΚΛΟΣ: ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ, ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ & ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Μελέτη βελτιστοποίησης της μιξοτροφικής καλλιέργειας μικροφυκών του γένους Chlorella σε στερεό υπόστρωμα Τσάκωνα Δήμητρα Α.Μ. 547 ΠΑΤΡΑ, 2016 0

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Παύλος Μακρίδης Επ. Καθηγητής Πανεπιστήμιο Πατρών (επιβλέπων και μέλος τριμελούς επιτροπής) Στέφανος Νταϊλιάνης Επ. Καθηγητής Πανεπιστήμιο Πατρών (μέλος τριμελούς επιτροπής) Ευάγγελος Τζανάτος Λέκτορας Πανεπιστήμιο Πατρών (μέλος τριμελούς επιτροπής) 1

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ζωολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών με τίτλο «Οικολογία, Διαχείριση και Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος» τα έτη 2014-2016. Με την ολοκλήρωση αυτής της εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Παύλο Μακρίδη για την επίβλεψη και για καθοδήγησή του καθόλη τη διάρκεια της εργασίας αυτής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Στέφανο Νταϊλιάνη για την αξιολόγηση της εργασίας και τον κ. Ευάγγελο Τζανάτο για την αξιολόγηση της εργασίας και για τη βοήθειά του στη στατιστική επεξεργασία των δεδομένων. Ευχαριστώ το ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. Κρήτης και το κ. Ιωάννη Τζοβενή για τη συνεργασία μας και για τις καλλιέργειες των μικροφυκών που μας προμήθευσαν. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Μαργαρίτα Καγιώργη, η οποία όντας ο άνθρωπος που έχει δουλέψει το θέμα της παρούσας εργασίας πριν από εμένα, μου μετέφερε την εμπειρία της και ήταν πάντα πρόθυμη να μου λύσει σχετικές απορίες. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στον καθηγητή του εργαστηρίου της Φυσιολογίας Φυτών κ. Γεώργιο Γραμματικόπουλο για την πολύτιμη βοήθεια του στις μετρήσεις φθορισμού της χλωροφύλλης. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια κ. Γιόλα Πετροπούλου και τα παιδία του εργαστηρίου Φυσιολογίας Φυτών Χρήστο Χονδρογιάννη και Αλεξάνδρα Κυζερίδου για την προθυμία τους να με βοηθήσουν σε οτιδήποτε χρειάστηκα. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα παιδιά του εργαστήριου Ζωολογίας για το ευχάριστο και φιλικό περιβάλλον εργασίας και ιδιαιτέρως τη Νικολία για τη βοήθεια και τη στήριξή της. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω τους συμφοιτητές και πλέον καλούς μου φίλους για τις όμορφες στιγμές που περάσαμε μαζί και για το γενικότερο κλίμα συνεργασίας και αλληλοϋποστήριξης. Τέλος, οφείλω να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους δικούς μου ανθρώπους, την οικογένειά μου, που είναι δίπλα μου και με στηρίζουν με κάθε τρόπο. 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 4 ABSTRACT... 5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 6 1.1. Γενικά για τα μικροφύκη... 6 1.2. Το γένος Chlorella... 6 1.2.1. Chlorella minutissima... 8 1.2.2. Chlorella stigmatophora... 8 1.3. Εφαρμογές και χρήσεις μικροφυκών... 9 1.4. Παράγοντες που επιδρούν στις καλλιέργειες μικροφυκών... 12 1.5. Φθορισμός χλωροφύλλης μικροφυκών... 13 1.6. Κατηγορίες καλλιεργειών μικροφυκών... 15 1.7. Ερευνητικά ερωτήματα - σκοπός... 18 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 20 2.1. Υγρές καλλιέργειες μικροφυκών... 20 2.2. Πειράματα με ζελατίνη και άγαρ... 21 2.3. Μετρήσεις φθορισμού χλωροφύλλης... 26 2.4. Ανάλυση δεδομένων... 28 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 31 3.1. Αποτελέσματα πειραμάτων με ζελατίνη και άγαρ... 31 3.2. Αποτελέσματα μετρήσεων φθορισμού... 53 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 56 5. ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ... 63 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 65 3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι καλλιέργειες των μικροφυκών βρίσκονται στο επίκεντρο της προσοχής πολλών ερευνών σχετικά με τη βιοτεχνολογία και τη γενετική μηχανική. Αυτό συμβαίνει διότι τα μικροφύκη είναι μια πολυφυλετική ομάδα οργανισμών, που τα προϊόντα από την καλλιέργειά τους βρίσκουν εφαρμογές σε πολλούς τομείς. Η κεντρική ιδέα της παρούσας εργασίας ήταν η προσπάθεια βελτιστοποίησης της μιξοτροφικής παραγωγής κυττάρων του φύκους Chlorella minutissima και Chlorella stigmatophora σε υποστρώματα ζελατίνης και άγαρ σε διάφορες συγκεντρώσεις, με σκοπό την υψηλή παραγωγή κυττάρων σε μικρούς όγκους καλλιεργειών. Πιο αναλυτικά, μελετήθηκε η ανάπτυξη των δύο στελεχών σε υποστρώματα ζελατίνης (εργαστηριακής και εμπορίου) και άγαρ σε συνάρτηση με το χρόνο και τις διαφορετικές συγκεντρώσεις των υποστρωμάτων αυτών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μια συγκριτική μελέτη ανάπτυξης του Chlorella minutissima σε καλλιέργειες με αποστειρωμένη και μη εργαστηριακή ζελατίνη, καθώς επίσης έγιναν μετρήσεις φθορισμού της χλωροφύλλης για τον προσδιορισμό της κατάστασης της φωτοσυνθετικής συσκευής του μικροφύκους. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι ο αριθμός των κυττάρων των μικροφυκών εξαρτάται άμεσα από το χρόνο και από τη συγκέντρωση του θρεπτικού μέσου, με βέλτιστη συγκέντρωση τα 20 gr/l για τη ζελατίνη και τα 2 gr/l για το άγαρ. Επιπλέον, το Chlorella minutissima αναπτύσσεται καλύτερα στην εργαστηριακή ζελατίνη και μετά ακολουθούν η ζελατίνη εμπορίου και το άγαρ. Η μέγιστη συγκέντρωση κυττάρων που παρατηρήθηκε στο σύνολο των πειραμάτων, αφορούσε στο στέλεχος Chlorella stigmatophora, ωστόσο χρειάζεται περεταίρω μελέτη για τους παράγοντες που ευνόησαν την ανάπτυξή του. Η αποστείρωση του θρεπτικού υποστρώματος ζελατίνης απέτρεψε την ανάπτυξη μικροοργανισμών στις καλλιέργειες του Chlorella minutissima, όμως δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά σε σχέση με τα μη αποστειρωμένα δείγματα. Επίσης, οι μετρήσεις φθορισμού έδειξαν ότι η ζελατίνη σαν θρεπτικό μέσο δεν επηρεάζει τη φωτοσυνθετική κατάσταση του Chlorella minutissima. 4

ABSTRACT Microalgae are widely used, since their biomass products may have applications in many fields. Therefore, the benefits of the growth of microalgae make this multiracial group be in the center of biotechnology and genetic engineering research. The central idea of this work was to optimize the mixotrophic growth of the microalgae Chlorella minutissima and Chlorella stigmatophora, by achieving high cell density in small volumes using gelatin or agar as substrates at various concentrations. The growth of microalgae in substrates containing laboratory and commercial gelatin was determined. In addition, a comparative study of the development of Chlorella minutissima in cultures containing sterile and non-sterile laboratory gelatin, as well as fluorescence measurements were made to determine the status of the photosynthetic apparatus of microalgae. The results of this study showed that the number of microalgae cells directly depends on the time and the concentration of the nutrient medium with optimal concentration of 20 gr/l for gelatin and 2 gr/l for agar. Furthermore, Chlorella minutissima grows better in laboratory gelatin and then follows the commercial gelatin and agar. The maximum concentration of cells was observed in all the experiments involved in Chlorella stigmatophora strain, but further study on the factors that favored its development is required. Sterilization of gelatin substrate prevented the growth of microorganisms in cultures of Chlorella minutissima, but no significant difference was observed compared to the non-sterile samples. In addition, the fluorescence measurements showed that gelatin as a nutrient medium does not inhibit the photosynthetic apparatus of Chlorella minutissima. 5

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Γενικά για τα μικροφύκη Τα φύκη, με βάση το μέγεθός τους, μπορούν να διαχωριστούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τα μακροφύκη (macroalgae) και τα μικροφύκη (microalgae). Τα μακροφύκη έχουν μήκος μερικά εκατοστά και σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να φτάσουν έως και 50-70 m. Τα μονοκύτταρα μικροφύκη έχουν διάμετρο από 0,2-50 μm, ενώ οι πολυκύτταροι σχηματισμοί κυμαίνονται συνήθως από 100-200 μm. Επιπλέον, το μέγεθος ορισμένων μικροφυκών, όπως τα διάτομα (π.χ. Coscinodiscus sp., Ethmodiscus sp.), μπορεί να φτάσει έως 1.000-2.000 μm (Barsanti & Gualtiery 2014). Τα μικροφύκη (λατινικά alga, πλ. algae) είναι μια πολυφυλετική ομάδα μονοκύτταρων ή πολυκύτταρων οργανισμών με τεράστια ετερογένεια σε σχήματα, κυτταρική δομή, φυσιολογία και μέγεθος. Είναι πρωτογενείς παραγωγοί, οι οποίοι συντηρούν τη ζωή σε θαλάσσια και του γλυκού νερού οικοσυστήματα, γεγονός που αποδεικνύει την οικολογική τους σημασία (Αρώνη 2008). Διαβιούν οπουδήποτε συνυπάρχουν νερό και φως και έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν διοξείδιο του άνθρακα και να μετατρέπουν την ηλιακή ενέργεια σε χημική. Απαντώνται επίσης στο έδαφος, αλλά και σε ψυχρές ή θερμές ερημικές περιοχές (Αρώνη 2008). Επιπλέον, τα μικροφύκη είναι φωτοσυνθετικοί οργανισμοί με απλή κυτταρική δομή (Barsanti & Gualtiery 2014). Μια ιδιαίτερη κατηγορία μικροφυκών είναι τα συμβιωτικά μικροφύκη, τα οποία ζουν συμβιωτικά με άλλα είδη οργανισμών, όπως μύκητες (στην περίπτωση των λειχήνων), κοράλλια ή σπόγγους. Αξίζει να σημειωθεί ότι το 60% του οξυγόνου που απελευθερώνεται στη ατμόσφαιρα, παράγεται από φύκη μέσω της διαδικασίας της φωτοσύνθεσης (Τσαγκαμίλης 2009). Τέλος, υπάρχουν πάνω από 50.000 διαφορετικά είδη μικροφυκών, από τα οποία περίπου τα 30.000 έχουν μελετηθεί (Κόλλιας 2013). 1.2. Το γένος Chlorella Ορισμένα από τα πιο γνωστά και μελετημένα μικροφύκη είναι αυτά του γένους Chlorella, στελέχη του οποίου χρησιμοποιήθηκαν και στην παρούσα εργασία. Τα είδη του Chlorella sp. ανήκουν στην επικράτεια των Eukaryota και πιο 6

συγκεκριμένα στην τάξη Chrorallales και στην οικογένεια των Chlorophyceae (Μπίρκου 2011). Η ταξινόμηση των ειδών του γένους Chlorella είναι πολύπλοκη, καθότι δε μπορεί να βασιστεί αποκλειστικά σε μορφολογικά κριτήρια. Σε πολλές περιπτώσεις απαιτούνται περεταίρω μελέτες της φυσιολογίας και της βιοχημείας του εκάστοτε είδους (Tomaselli 2004). Αυτό διαπιστώνεται και από τις έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με τη συστηματική κατάταξη του γένους Chlorella (Πίνακας 1), στις οποίες μελετώνται οι ανάγκες των μικροφυκών σε θρεπτικά, τα μορφολογικά και δομικά χαρακτηριστικά τους, η χημική σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος, ορισμένα βιοχημικά και φυσιολογικά χαρακτηριστικά, τα μοριακά φυλογενετικά χαρακτηριστικά κ.α. (Bock et al. 2011, Huss et al. 1999). Πίνακας 1. Συστηματική ταξινόμηση του γένους Chlorella. Τα είδη του γένους Chlorella απαντώνται κυρίως στα γλυκά ύδατα και το έδαφος και σε μικρότερο βαθμό στα θαλάσσια περιβάλλοντα (Fabregas et al. 1986). Έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν σε ένα μεγάλο θερμοκρασιακό εύρος, το οποίο κυμαίνεται από 15 ο C - 40 o C (Masojídek et al. 2011). Επιπρόσθετα, το γένος Chlorella χαρακτηρίζεται ως κοσμοπολίτικο και απαρτίζεται από μονοκύτταρα ευκαρυωτικά μικροφύκη. Ανήκει στα πράσινα φύκη (χλωροφύκη) και όσον αφορά στην εξωτερική μορφολογία των κυττάρων, αυτά μπορεί να είναι είτε σφαιρικά, είτε ελλειψοειδή, με μέγεθος από 2-10 μm. Η μορφολογία των μικροφυκών του Chlorella sp. θεωρείται πλεονεκτική όσο αφορά στις βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Τα είδη αυτά παρουσιάζουν αντοχή στη διάτμηση, αντίσταση στην προσκόλληση στα τοιχώματα των αντιδραστήρων, καθώς και χαμηλή τάση δημιουργίας συσσωματωμάτων (Κόλλιας 2013). Τα είδη του Chlorella sp. φωτοσυνθέτουν και οι χλωροπλάστες επιδρούν στον ενεργειακό μεταβολισμό τους, καθώς στο εσωτερικό τους βρίσκεται η χλωροφύλλη και άλλα βιοσυνθετικά μόρια (Αρώνη 2008). Επιπλέον, ο πυρήνας βρίσκεται στο κέντρο του κυττάρου και είναι μονός, όπως ο χλωροπλάστης και το πυρηνοειδές (Κόλλιας 2013). Τα είδη του γένους Chlorella έχουν απλό κύκλο ζωής και 7

αναπαράγονται αγενώς με μίτωση και κυτταρική διαίρεση, όπου από το μητρικό κύτταρο παράγονται από δύο έως οκτώ θυγατρικά κύτταρα (Αρώνη 2008). 1.2.1. Chlorella minutissima Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας, χρησιμοποιήθηκε πιο εκτεταμένα το μη κινητό μικροφύκος Chlorella minutissima Fott & Nováková (Εικόνα 1), το οποίο απομονώθηκε από το λιμάνι του Ηράκλειου Κρήτης (Kotzabasis et al. 1999). Εικόνα 1. Απεικόνιση των κυττάρων του Chlorella minutissima. Το είδος αυτό παρουσιάζει μεγάλη ανθεκτικότητα καθώς μπορεί να επιβιώνει σε ανοξικά περιβάλλοντα, όπου το εύρος τιμών του ph είναι από 4 έως 12 (Bhatnagar et al. 2010). Επίσης, εξασφαλίζει την επιβίωσή του σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες με μικρές απαιτήσεις σε θρεπτικά (Shukla et al. 2011). Το στέλεχος Chlorella minutissima αναπτύσσεται κάτω από ένα μεγάλο εύρος συγκέντρωσης CO 2, το οποίο κυμαίνεται από 0,036 έως 100% (Papazi et al. 2008) και επιπλέον είναι ανθεκτικό στα παθογόνα βακτήρια (Kokou et al. 2012, Makridis et al. 2012). Συνυπολογίζοντας παράγοντες όπως ο ταχύς ρυθμός ανάπτυξης και η υψηλή περιεκτικότητα σε αμινοξέα και λιπίδια, μπορούμε να κατανοήσουμε την τόσο διαδεδομένη χρήση του μικροφύκους για ερευνητικούς σκοπούς. 1.2.2. Chlorella stigmatophora Το γένος Chlorella περιλαμβάνει είδη, τα οποία συγκαταλέγονται κυρίως στα μικροφύκη του γλυκού νερού. Ωστόσο, υπάρχουν και ορισμένα θαλάσσια είδη, τα 8

οποία είναι πολύ λιγότερα σε σχέση με αυτά του γλυκού νερού (Fabregas et al. 1986). Ένα τέτοιο μικροφύκος είναι και το Chlorella stigmatophora Butcher, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια των πειραμάτων αυτής της εργασίας. Το μικροφύκος Chlorella stigmatophora έχει σχετικά υψηλό ρυθμό αύξησης και το μέγεθος των κυττάρων του κυμαίνεται από 2 έως 5 μm (Shams et al. 2014). Το χρώμα του είναι ανοιχτό πράσινο και τα κύτταρά του περιβάλλονται από λεπτό κυτταρικό τοίχωμα. Όσο αφορά στην αναπαραγωγή του Chlorella stigmatophora, το μητρικό κύτταρο διαιρείται σε δύο νέα θυγατρικά και σπανίως σε τέσσερα (Butcher 1952). Είναι ένα ιδιαίτερα ανθεκτικό είδος καθώς έχει βρεθεί ότι έχει την ικανότητα να προσαρμόζεται σε ένα μεγάλο εύρος αλατότητας, που κυμαίνεται από γλυκό νερό (0 ) έως θαλασσινό νερό (35 ) (Fabregas et al. 1987). Μια χαρακτηριστική ιδιότητά του είναι η αυξημένη παραγωγή προλίνης, ενός α-αμινοξέος, όταν υπάρχουν ευνοϊκές συνθήκες φωτοαναπνοής, δηλαδή μειωμένη συγκέντρωση CO 2 στον διαλυόμενο αέρα μέσα στην καλλιέργεια (Kalinkina & Yasyukova 2001). 1.3. Εφαρμογές και χρήσεις μικροφυκών Από τις καλλιέργειες των μικροφυκών παράγονται προϊόντα τα οποία βρίσκουν εφαρμογή σε διάφορους τομείς. Μια από τις βασικότερες χρήσεις των μικροφυκών είναι στις υδατοκαλλιέργειες, όπου χρησιμοποιούνται σαν ζωντανή τροφή. Επιπρόσθετα, παράγονται προϊόντα τα οποία βρίσκουν εφαρμογές σε κλάδους όπως η κοσμετολογία και η φαρμακευτική (Τσαγκαμίλης 2009). Αυτό συμβαίνει λόγω της περιεκτικότητας των διαφόρων ειδών μικροφυκών σε πρωτεΐνες, λιπαρά οξέα, αντιοξειδωτικά, βιταμίνες κ.α. Τέλος, τα μικροφύκη μπορούν να καλλιεργηθούν ώστε να παραχθούν προϊόντα για διάφορες βιομηχανικές χρήσεις. Ορισμένα τέτοια παραδείγματα αφορούν στις χρωστικές ουσίες και στη χρήση των μικροφυκών σαν μέσο λίπανσης και βελτίωσης του εδάφους (Harun et al. 2010, Pulz & Gross 2008). Ιδιαίτερη αναφορά αξίζει να γίνει στην παραγωγή βιοκαυσίμων με τη χρήση μικροφυκών, ένας τομέας που έχει βρεθεί στο επίκεντρο της προσοχής πλήθους ερευνητών τα τελευταία χρόνια (Rashid et al. 2014). Αυτό συμβαίνει διότι ορισμένα είδη μικροφυκών, σε σύγκριση με άλλες παραδοσιακές πρώτες ύλες, έχουν αυξημένη περιεκτικότητα σε λιπίδια (Πίνακας 2 & 3), ο ρυθμός ανάπτυξής τους είναι 9

αυξημένος και επιπλέον δεσμεύουν το CO 2 προκειμένου να αναπτυχθούν (Deng et al. 2009). Πίνακας 2. Σύγκριση παραγωγής βιοκαυσίμων από διάφορες πηγές λιπιδίων (Πηγή: Chisti, 2007). Καλλιέργεια Απόδοση βιοκαυσίμου (L/ha) Απαιτούμενη έκταση Ποσοστό υπάρχουσας καλλιεργήσιμης (M ha) α έκτασης (US) α Καλαμπόκι 172 1540 846 Σόγια 446 594 326 Ελαιοκράμβη 1190 223 122 Γιάτροφα 1892 140 77 Καρύδα 2689 99 54 Φοινικέλαιο 5950 45 24 Μικροφύκη β 136.900 2 1,1 Μικροφύκη γ 58.700 4,5 2,5 α Για την κάλυψη του 50%των αναγκών για βιοκαύσιμα μετακίνησης των Ηνωμένων Εθνών β 70% βιοκαυσίμων (κατά βάρος) σε βιομάζα γ 30% βιοκαυσίμων (κατά βάρος) σε βιομάζα Πίνακας 3. Περιεκτικότητα σε λιπίδια σε ορισμένα είδη μικροφυκών (Πηγή: Chisti, 2007). Μικροφύκος Περιεκτικότητα σε λιπίδια (% ξηρό βάρος) Botryococcus braunii 25 75 Chlorella sp. 28 32 Crypthecodinium cohnii 20 Cylindrotheca sp. 16 37 Dunaliella primolecta 23 Isochrysis sp. 25 33 Monallanthus salina > 20 Nannochloris sp. 20 35 Nannochloropsis sp. 31 68 Neochloris oleoabundans 35 54 Nitzschia sp. 45 47 Phaeodactylum tricornutum 20 30 Schizochytrium sp. 50 77 Tetraselmis sueica 15 23 Η παραγωγή βιοκαυσίμων από καλλιέργειες μικροφυκών έχει πλεονεκτήματα σε σχέση με τα ανώτερα φυτά. Τα μικροφύκη αξιοποιούν σε μεγάλο βαθμό την ηλιακή 10

ενέργεια, έχουν μεγάλες στρεμματικές αποδόσεις και είναι οργανισμοί των οποίων η βιομάζα μπορεί να αξιοποιηθεί πλήρως, καθότι δεν υπάρχουν παραπροϊόντα. Επιπλέον, τα μικροφύκη δεν απαιτούν τη χρήση γόνιμων εδαφών, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παράγωγη τροφίμων (Singh et al. 2011, Κόλλιας 2013, Τσαγκαμίλης 2009). Ωστόσο, ένα από τα βασικότερα μειονεκτήματα της παραγωγής τους είναι το κόστος των καλλιεργητικών εγκαταστάσεων και η συντήρησή τους (Deng et al. 2009, Chisti 2007). Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι η παραγωγή βιοντίζελ βασίζεται στην εξαγωγή των ελαίων που περιέχουν, με τη μορφή λιπιδίων και εν συνεχεία στη μετατροπή τους σε βιοκαύσιμο μέσω της διαδικασίας της μετεστερεοποίησης (Κόλλιας 2013). Ένας κλάδος στον οποίο χρησιμοποιούνται επίσης τα μικροφύκη είναι αυτός της επεξεργασίας και της διαχείρισης των λυμάτων. Μέσω της καλλιέργειας των μικροφυκών σε απόβλητα επιτυγχάνεται η απορρύπανσή τους λόγω της δέσμευσης οργανικού και ανόργανου φορτίου από τα μικροφύκη και παράλληλα η παραγωγή βιομάζας, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε άλλους τομείς (Pittman et al. 2011). Επιπλέον, έχει διαπιστωθεί η αποτελεσματικότητα της χρήσης των μικροφυκών ως βιοφίλτρων για τη δέσμευση των θρεπτικών σε βιολογικούς καθαρισμούς και κατ επέκταση την αντιμετώπιση φαινομένων ευτροφισμού στα υδάτινα οικοσυστήματα (Τσαγκαμίλης 2009). Γενικότερα, έχει πραγματοποιηθεί πλήθος ερευνών οι οποίες έχουν παράσχει ενθαρρυντικές ενδείξεις όσο αφορά στην καλλιέργεια μικροφυκών σε απόβλητα που προέρχονται από δραστηριότητες όπως οι κτηνοτροφικές, γεωργικές, πτηνοτροφικές, καθώς επίσης και απόβλητα από χοιροστάσια, ελαιοτριβεία και τυροκομεία (Posten & Schaub 2009, Lincoln et al. 1996, Hodaifa et al. 2008, Blier et al. 1995, Mata et al. 2010). Όσο αφορά στα μικροφύκη του γένους Chlorella sp. που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εργασία, αξίζει να αναφερθεί ότι βρίσκουν εφαρμογή σε διάφορους τομείς από αυτούς που αναφέρθηκαν παραπάνω. Μία σειρά από μελέτες καταλήγουν στο ότι το Chlorella minutissima είναι ένα μικροφύκος το οποίο ενδείκνυται για διαχείριση αποβλήτων, παραγωγή βιοκαυσίμων (Bhatnagar et al. 2010, Mata et al. 2010, Gautam et al. 2013), υψηλή παραγωγή βιομάζας (Malla et al. 2015), καθώς και ως συμπληρωματικός τρόπος απορρύπανσης της ατμόσφαιρας σε τοπικό επίπεδο σε περιοχές με βιομηχανική δραστηριότητα, λόγω της ικανότητάς του να δεσμεύει υψηλές συγκεντρώσεις CO 2 σε συνθήκες μεγάλης φωτεινότητας (Papazi et al. 2008). Τέλος, χρησιμοποιείται σε φωτο-βιοαντιδραστήρες διότι έχει ισχυρό κυτταρικό 11

τοίχωμα που το προστατεύει από τη υψηλή υδροστατική πίεση που δημιουργείται λόγω της χρήσης αντλιών. Αντίθετα, στελέχη όπως το Isochrysis sp. δε μπορούν να καλλιεργηθούν εύκολα σε τέτοιους αντιδραστήρες γιατί τα κύτταρά τους είναι εύθραυστα και δεν αντέχουν υψηλές πιέσεις. Σχετικά με το Chlorella stigmatophora, έχει διαπιστωθεί ότι ο ρυθμός ανάπτυξής του είναι πολύ μεγαλύτερος όταν το μικροφύκος καλλιεργείται μέσα σε αστικά απόβλητα με πλήρη δέσμευση του αζώτου και φωσφόρου σε σχέση με την ανάπτυξή του μέσα σε θαλασσινό νερό εμπλουτισμένο με θρεπτικά (Arbib et al. 2012). Επίσης, το είδος αυτό έχει μεγάλη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες (Fabregas et al. 1986), γεγονός που το καθιστά τροφή υψηλής αξίας για οργανισμούς όπως τα ψάρια (Fabregas et al. 1986). Επιπλέον, θεωρείται ένας πλαγκτονικός οργανισμός κατάλληλος για μελέτες ιχνοστοιχείων και μετάλλων (Shams et al. 2014). Πιο συγκεκριμένα, το Chlorella stigmatophora ενδείκνυται για τη διερεύνηση των διεργασιών που ελέγχουν την συσσώρευση μετάλλων σε κυτταρικό επίπεδο (Quigg et al. 2006), λόγω των πολυσακχαριτών που παράγονται στο κυτταρικό τοίχωμα του μικροφύκους και επηρεάζουν τη διαδικασία αυτή (Kaplan et al. 1987). 1.4. Παράγοντες που επιδρούν στις καλλιέργειες μικροφυκών Οι καλλιέργειες των μικροφυκών εξαρτώνται από διάφορους βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες. Οι σημαντικότεροι από αυτούς είναι το φως, η θερμοκρασία, αλατότητα και τα θρεπτικά συστατικά που παρατίθενται στη συνέχεια. Επιπλέον, για την επιβίωση και τη επιτυχή ανάπτυξη των μικροφυκών, πρέπει να υπολογίζονται και παράμετροι όπως το ph του θρεπτικού μέσου, ο αερισμός της καλλιέργειας, η ανάδευση και οι επιμολύνσεις από παθογόνους μικροοργανισμούς. Το φως, τόσο σε ένταση όσο και σε ποιότητα, παίζει καθοριστικό ρόλο σε μια καλλιέργεια. Ο ελλιπής φωτισμός μιας καλλιέργειες έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της χλωροφύλλης α, ενώ αντίθετα η μεγάλη ένταση φωτός ενεργοποιεί την παραγωγή των δευτερογενών καροτενοειδών στα μικροφύκη για λόγους προστασίας (Vonshak & Torzillo 2004). Όσο αφορά στη θερμοκρασία, πολλά μικροφύκη μπορούν να αντέξουν θερμοκρασίες μέχρι και 15 C χαμηλότερα από την βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξής τους, αλλά υπάρχει πιθανότητα με μια μεταβολή της τάξης των 2-4 C πάνω από το βέλτιστο σημείο να υπάρξει πλήρης απώλεια της καλλιέργειας (Mata et al. 2010). 12

Επίσης, έχει παρατηρηθεί ότι η θερμοκρασία επιδρά στη σύνθεση και το περιεχόμενο των λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης των μικροφυκών (Hu 2004). Η αλατότητα επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τις καλλιέργειες μικροφυκών, καθότι οι μεταβολές της προκαλούν στα κύτταρά τους ωσμωτική και ιοντική καταπόνηση, όπως επίσης τροποποιούν την ικανότητα μεταφοράς της κυτταρικής μεμβράνης, με αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων στα κύτταρα (Mata et al. 2010, Bilanovic et al. 2009). Τέλος, τα θρεπτικά μιας καλλιέργειας μικροφυκών μπορούν να καθορίσουν την επιτυχή ανάπτυξη αυτής. Εκτός του διοξειδίου του άνθρακα χρειάζονται και ορισμένα ανόργανα στοιχεία τα οποία είναι αναγκαία για τις διάφορες μεταβολικές κυτταρικές διεργασίες. Τα κυριότερα θρεπτικά στοιχεία είναι τα νιτρικά (N) και τα φωσφορικά άλατα (P), καθώς επίσης και το κάλιο (K) (Hu 2004, Mata et al. 2010). 1.5. Φθορισμός χλωροφύλλης μικροφυκών Οι δυσμενείς συνθήκες σε μια καλλιέργεια μικροφυκών όπως οι ακραίες συγκεντρώσεις άνθρακα, υψηλή ή χαμηλή ένταση φωτός, τα επίπεδα αλατότητας, η διαθεσιμότητα θρεπτικών, το ph, υψηλές ή χαμηλές θερμοκρασίες έχουν σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη μηχανισμών ρύθμισης προκειμένου να ανταπεξέλθουν τα κύτταρα (Masojídek et al. 2011). Η διαδικασία αυτή αντικατοπτρίζεται άμεσα στη φωτοσυνθετική δραστηριότητα των μικροφυκών και πιο συγκεκριμένα στη λειτουργία του φωτοσυστήματος II (PSII). O φθορισμός της χλωροφύλλης είναι ένας γρήγορος και ασφαλής τρόπος εντοπισμού καταπονήσεων σε μια καλλιέργεια (Masojídek et al. 2011). Πιο διεξοδικά, φθορισμός ονομάζεται το φαινόμενο κατά το οποίο μια ουσία που απορροφά ένα φωτόνιο μετατρέπεται η ίδια σε πηγή φωτεινής ακτινοβολίας και εκπέμπει ένα φωτόνιο μικρότερης ενέργειας, εξαιτίας των απωλειών ενέργειας με τη μορφή θερμότητας (Χονδρογιάννης 2013). Οι χλωροφύλλες είναι οι μοναδικές φωτοσυνθετικές χρωστικές οι οποίες μπορούν να αποδιεγερθούν μέσω του φθορισμού (Νικηφόρου 2012). Ωστόσο, ο φθορισμός ως τρόπος αποδιέγερσης των χλωροφυλλών, είναι μια οδός που είναι αμοιβαία ανταγωνιστική με την έκλυση θερμότητας και την παραγωγή φωτοχημικού έργου (Maxwell & Johnson 2000). Η σχέση αυτή αποτυπώνεται από τον τύπο: A = P + Q + F, όπου: Α: η απορροφούμενη φωτεινή ενέργεια 13

P: το φωτοχημικό έργο Q: το ποσό της θερμικής απώλειας F: ο εκπεμπόμενος φθορισμός Συνεπώς, είναι κατανοητό ότι η μέτρηση του φθορισμού της χλωροφύλλης μπορεί να μας δώσει πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολές στη φωτοσύνθεση (Negi et al. 2016). Οι Kautsky και Hirsch (1931) κατανόησαν τη σύνδεση της φωτοσύνθεσης και του φθορισμού (Strasser et al. 2000). Πιο συγκεκριμένα, παρατήρησαν ότι με τον αιφνίδιο φωτισμό προ-σκοτεινιασμένων φωτοσυνθετικών ιστών, υπήρξε μια ραγδαία άνοδος του φθορισμού από μια αρχική τιμή (F 0 ) σε μια μέγιστη τιμή (F max ), η οποία μειώθηκε σταδιακά μέχρι να σταθεροποιηθεί (F S ). Οι τιμές του φθορισμού σχετίζονται άμεσα με τα κέντρα αντίδρασης του PSII. Αναλυτικότερα, στην κατάσταση όπου τα κέντρα αντίδρασης βρίσκονται σε συνθήκες σκοταδιού χαρακτηρίζονται ως «ανοιχτά» και επιτελούν το μέγιστο φωτοχημικό έργο, εκπέμποντας τον ελάχιστο φθορισμό. Το F 0 λοιπόν, αντιστοιχεί στην τιμή του φθορισμού ύστερα από φωτισμό υψηλής έντασης σε ιστούς που έχουν παραμείνει στο σκοτάδι, όταν όλα τα ενεργά κέντρα του PSII είναι ανοιχτά. Κατά τη διάρκεια που ο ιστός δέχεται φωτεινή ακτινοβολία, τα δραστικά κέντρα κλείνουν και ο φθορισμός φτάνει τη μέγιστη τιμή του όταν όλα τα ενεργά κέντρα είναι «κλειστά». Η τιμή αυτή αποδίδεται ως F max (Νικηφόρου 2012). Ο πιο διαδεδομένος δείκτης στις μετρήσεις φθορισμού είναι ο F v /F max, όπου F v είναι ο μεταβαλλόμενος (variable) φθορισμός, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε ευρέως στις πρωταρχικές μελέτες ανίχνευσης καταπονήσεων στα φυτά (Sharma et al. 2015). Ο λόγος αυτός αποδίδει τη μέγιστη φωτοχημική απόδοση του PSΙΙ και προκύπτει από την τιμή της διαφοράς F max -F 0 /F max, δηλαδή υπολογίζονται οι αναλογίες των μετρούμενων μεγεθών. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο δείκτης αυτός είναι συντηρητικός, συνεπώς οι μεταβολές στις τιμές του δείχνουν σημαντικά προβλήματα στη φωτοσυνθετική συσκευή των κυττάρων. Στην περίπτωση των μικροφυκών οι φυσιολογικές τιμές αυτού του δείκτη κυμαίνονται γύρω στο 0,6 (Masojidek et al. 2004). Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια έχουν προταθεί και χρησιμοποιηθεί ορισμένοι δείκτες οι οποίοι συμπεριλαμβάνουν περισσότερες παραμέτρους και είναι πολύ πιο ευαίσθητοι από τον F v /F max (Strasser et al. 2000, Dao & Beardall 2016). Ένας τέτοιος δείκτης είναι ο PI abs (performance index) ο οποίος μπορεί να αποδοθεί ως δείκτης ζωτικότητας και μας δίνει πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργικότητα των δύο 14

φωτοσυστημάτων PSI και PSII (Živčák et al. 2008). Σύμφωνα με πολλές μελέτες, ο PI abs έχει ανταποκριθεί στις περισσότερες στρεσσογόνες περιβαλλοντικές συνθήκες (Živčák et al. 2008). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο PI abs είναι ένας δείκτης ο οποίος έχει νόημα να χρησιμοποιείται συγκριτικά προκειμένου να διαπιστώνονται οι πιθανές επιπτώσεις των περιβαλλοντικών συνθηκών στη λειτουργικότητα των φωτοσυστημάτων PSI και PSII. Κατ επέκταση, δεν υπάρχει μια απόλυτη τιμή η οποία να θεωρείται καλή, σε αντίθεση με τον δείκτη F v /F max. Οι μετρήσεις του φθορισμού της χλωροφύλλης στις καλλιέργειες μικροφυκών είναι μια τεχνική ιδιαίτερα σημαντική, καθώς με τη σωστή ανάλυση των αποτελεσμάτων εξάγονται πληροφορίες σχετικά με την παραγωγή βιομάζας. Πιο αναλυτικά, υπάρχει η δυνατότητα να αποφευχθεί κάποια μείωση στη βιομάζα και απώλεια μιας καλλιέργειας, γεγονός που είναι πολύ χρήσιμο αν σκεφτούμε την τεράστια εμπορική σημασία των μικροφυκών (Masojídek et al. 2011). Επιπρόσθετα, πρέπει να συνυπολογιστεί ότι τα περισσότερα συστήματα καλλιέργειας μεγάλης κλίμακας είναι σε εξωτερικούς χώρους, με συνέπεια την έκθεση των μικροφυκών σε πολλές περιβαλλοντικές συνθήκες (Jerez et al. 2016, Malapascua et al. 2014). Ένας τομέας που μελετάται πολύ είναι ο προσδιορισμός των λιπιδίων που περιέχονται σε μια καλλιέργεια μέσω του φθορισμού (Negi et al. 2016, Rumin et al. 2015, Kiran et al. 2016). Συνοψίζοντας, ο φθορισμός είναι μια μη επεμβατική, μη καταστρεπτική, εύχρηστη και οικονομική μέθοδος για τη μελέτη των φωτοσυνθετικών οργανισμών και αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο που βρίσκει πολλές εφαρμογές στον τομέα την φυσιολογίας (Χονδρογιάννης 2013). 1.6. Κατηγορίες καλλιεργειών μικροφυκών Τα μικροφύκη έχουν την ικανότητα να ακολουθούν διάφορους τύπους μεταβολισμού και να εναλλάσσουν τον μεταβολισμό τους ως απόκριση στις αλλαγές των περιβαλλοντικών συνθηκών (Mata et al. 2010). Τέτοιες αλλαγές μπορεί να είναι η μορφή της διαθέσιμης ενέργειας και του διαθέσιμου άνθρακα. Αναλυτικά, οι μεταβολικοί τύποι με τους οποίους μπορούν να αναπτυχθούν ορισμένα μικροφύκη είναι: α) φωτοαυτότροφος: τα μικροφύκη αναπτύσσονται χρησιμοποιώντας ως πηγή ενέργειας τον ήλιο και ως πηγή άνθρακα το CO 2 ή άλλες ανόργανες μορφές, όπου 15

μέσω της διαδικασίας της φωτοσύνθεσης μετατρέπουν την ηλιακή ακτινοβολία σε χημική (Mata et al. 2010, Κόλλιας 2013), β) ετερότροφος: τα μικροφύκη χρησιμοποιούν ως πηγή ενέργειας και άνθρακα μόνο οργανικές ουσίες (Mata et al. 2010), γ) μιξότροφος: τα μικροφύκη ακολουθούν τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης ως πηγή ενέργειας, αλλά ταυτόχρονα χρησιμοποιούνται οργανικές ενώσεις και CO 2 ως πηγές άνθρακα για την ανάπτυξη τους. Επί της ουσίας, τα μικροφύκη έχουν δυνατότητα να αναπτυχθούν είτε υπό αυτότροφες, είτε υπό ετερότροφες συνθήκες ή και υπό τις δύο συνθήκες (Mata et al. 2010, Chojnacka & Marquez-Rocha 2004) και δ) φωτοετερότροφος: τα μικροφύκη χρησιμοποιούν ως πηγή ενέργειας τον ήλιο και σαν πηγή άνθρακα τις οργανικές ενώσεις (Chojnacka & Marquez-Rocha 2004). Η κύρια διαφορά της φωτοετερότροφης καλλιέργειας με τη μιξότροφη καλλιέργεια είναι ότι η πρώτη χρησιμοποιεί φωτισμό ως πηγή ενέργειας, ενώ η τελευταία χρησιμοποιεί οργανικές ενώσεις για τον ίδιο σκοπό (Κόλλιας 2013). Γενικά, οι ετεροτροφικές και μιξοτροφικές καλλιέργειες των μικροφυκών μπορούν να αποτελέσουν ιδανική καλλιεργητική τεχνική, συγκριτικά με τις φωτοαυτότροφες καλλιέργειες, καθώς αντιμετωπίζεται το πρόβλημα της αξιοποίησης του φωτός στις μεγάλες πυκνότητες του μικροφύκους, όπου περιορίζεται η διείσδυση του φωτός στο νερό. Με την ίδια λογική, σε αυτού του τύπου τις καλλιέργειες επιλύεται το πρόβλημα της αυτοσκίασης των κυττάρων και κατ επέκταση η παρεμπόδιση της φωτοσύνθεσης. Σύμφωνα με τον Gladue (1991), οι φωτοαυτότροφες καλλιέργειες σπάνια να ξεπερνούν πυκνότητες μεγαλύτερες των 0,5 gr ξηρής βιομάζας ανά λίτρο νερού. Σε ενίσχυση των παραπάνω, σύμφωνα με τους Chojnacka και Marquez-Rocha (2004) και με τον Lee (2001) ο μιξότροφος μεταβολισμός έχει μεγαλύτερους ρυθμούς ανάπτυξης και μεγαλύτερη τελική παραγωγή σε βιομάζα σε σχέση με τους άλλους τρεις μεταβολισμούς, καθώς επίσης τα μικροφύκη έχουν μεγαλύτερη περιεκτικότητα ελαίων (Κόλλιας 2013). Επιπλέον, οι μιξοτροφικές καλλιέργειες έχουν το πλεονέκτημα ότι τα κύτταρα εξοικονομούν ενέργεια που μπορούν να χρησιμοποιήσουν για μεγαλύτερη ανάπτυξη. Από την άλλη πλευρά, τα βασικότερα μειονεκτήματα που παρατηρούνται σχετικά με τις προαναφερθείσες καλλιέργειες είναι οι επιμολύνσεις και το αυξημένο κόστος εξαιτίας της προσθήκης οργανικών ενώσεων ως πηγή άνθρακα (Κόλλιας 2013). Στη διεξαγωγή των πειραμάτων της παρούσας διπλωματικής εργασίας τα στελέχη του γένους Chlorella sp. καλλιεργήθηκαν μιξοτροφικά. Η μιξοτροφική 16

καλλιέργεια του γένους Chlorella χρονολογείται από το 1964 και έπειτα, οπότε και ξεκίνησε η εμπορική της εκμετάλλευση κυρίως ως τροφή για τροχόζωα και προνύμφες ψαριών στις υδατοκαλλιέργειες (Iwamoto 2004). Στελέχη του γένους Chlorella sp. έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες σχετικά με την μιξοτροφική ανάπτυξη των μικροφυκών. Οι Kotzabasis και συν. (1999) χρησιμοποίησαν τη μεθανόλη σαν πηγή άνθρακα σε καλλιέργειες Chlorella minutissima. Αντιστοίχως, στελέχη του γένους Chlorella έχουν αναπτυχθεί με τη χρήση γλυκόζης, γλυκερόλης, μελάσας (Gautam et al. 2013), καθώς επίσης και σε απόβλητα επεξεργασίας ελιάς (Sánchez et al. 2001). Σαν πηγή οργανικού άνθρακα στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν, κατά κύριο λόγο, η ζελατίνη, καθώς επίσης και το άγαρ σε διάφορες συγκεντρώσεις. Η ζελατίνη είναι ένα παράγωγο πρωτεΐνης που παράγεται από ιστούς χοίρου. Πιο αναλυτικά, η ζελατίνη είναι ένα ετερογενές μίγμα από υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες με μεγάλο μοριακό βάρος, που υπάρχει στο κολλαγόνο. Οι πρωτεΐνες εκχυλίζονται με βρασμό ιστών όπως το δέρμα, οι τένοντες, οι σύνδεσμοι, τα οστά κλπ σε νερό. Η ζελατίνη, σαν θρεπτικό υπόστρωμα για την ανάπτυξη των στελεχών του Chlorella sp., έχει την ιδιαιτερότητα ότι η σύστασή της μεταβάλλεται ανάλογα με τη συγκέντρωσή της στις καλλιέργειες. Έτσι, στις χαμηλές συγκεντρώσεις ζελατίνης η μορφή των καλλιεργειών των μικροφυκών ήταν ρευστή, ενώ μεταβαλλόταν σε ημιστερεή και στερεή αναλογικά με τη συγκέντρωσή της. Όσο αφορά στο άγαρ, είναι μία υδρόφιλη κολλώδης ουσία που εξάγεται από τα κυτταρικά τοιχώματα των φυκών, κυρίως του Agarophyte gelidium. Πρόκειται στην ουσία για έναν πολυσακχαρίτη, ο οποίος συλλέγεται με την επεξεργασία του βρασμού και η μορφή του είναι ζελατινώδης, λευκή και ημιδιαφανής. Κατ αντιστοιχία με τη ζελατίνη, η σύσταση του άγαρ μεταβάλλεται ανάλογα με τη συγκέντρωσή του. Ένα πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης, δηλαδή της καλλιέργειας σε στερεό υπόστρωμα, είναι η δυνατότητα εύκολης συγκομιδής των κυττάρων, σε αντίθεση με τις καλλιέργειες σε υγρό υπόστρωμα. Στις υγρές καλλιέργειες, ορισμένες μέθοδοι συγκομιδής της βιομάζας των κυττάρων συχνά προκαλούν βλάβες στην κυτταρική δομή των μικροφυκών και επίσης είναι μια χρονοβόρα και υψηλού κόστους διαδικασία για της μεγάλης κλίμακας καλλιέργειες, όπου η τελική συγκομιδή μπορεί να ισοδυναμεί με 20-30% του συνολικού κόστους παραγωγής (Molina et al. 2003, Surendhiran & Vijay 2013). 17

Η μιξοτροφική καλλιέργεια του Chlorella sp. σε θρεπτικό υπόστρωμα ζελατίνης και άγαρ, είναι ένα θέμα καινοτόμο σε πρωταρχικό στάδιο έρευνας, βασισμένο στη ιδέα της ανάπτυξης μικροφυκών σε μικρούς όγκους. Το 2012 στα πλαίσια μιας εργαστηριακής άσκησης του Π.Μ.Σ. «Περιβαλλοντική βιολογία: Διαχείριση χερσαίων και θαλάσσιων βιολογικών πόρων» του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης, η κ. Μαργαρίτα Καγίωργη πραγματοποίησε μια μελέτη σχετικά με την ανάπτυξη του Chlorella minutissima σε υπόστρωμα ζελατίνης στο εργαστήριο Ζωντανής Τροφής του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υδατοκαλλιεργειών του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. Διαπιστώθηκε ότι το μικροφύκος αποκρίθηκε πολύ καλά με τη συγκέντρωσή του να φτάνει περίπου τα 300 10 6 cells/ml σε όγκους μόλις 25 ml. Τα ιδιαίτερα ενθαρρυντικά αποτελέσματα αυτής της εργασίας αποτέλεσαν εφαλτήριο για την περεταίρω έρευνα του θέματος. Ας σημειωθεί ότι στην παρούσα εργασία το Chlorella minutissima καλλιεργήθηκε σε υπόστρωμα ζελατίνης (εργαστηριακή και εμπορίου) και άγαρ, ενώ το Chlorella stigmatophora μόνο σε εργαστηριακή ζελατίνη. 1.7. Ερευνητικά ερωτήματα - σκοπός Ο σκοπός της εργασίας είναι η προσπάθεια βελτιστοποίησης της μιξοτροφικής παραγωγής κυττάρων του φύκους Chlorella minutissima και Chlorella stigmatophora σε στερεά υποστρώματα. Λόγω της περιορισμένης εμπειρίας και έρευνας σχετικά με το θέμα αυτό, τροποποιήθηκαν διάφορες παράμετροι προκειμένου να διαπιστωθεί η απόκριση των μικροφυκών. Πιο αναλυτικά, γίνεται μια προσπάθεια να απαντηθούν τα ακόλουθα ερωτήματα: 1. Πώς αναπτύσσεται το Chlorella minutissima σε υπόστρωμα ζελατίνης και άγαρ και το Chlorella stigmatophora σε ζελατίνη; Πιο αναλυτικά: α) Υπάρχουν διαφορές στην ανάπτυξη των δύο στελεχών; β) Επηρεάζεται ο ρυθμός ανάπτυξης των μικροφυκών σε συνάρτηση με το χρόνο και τη συγκέντρωση του θρεπτικού μέσου; γ) Επηρεάζει η αποστείρωση της ζελατίνης την ανάπτυξη του μικροφύκους Chlorella minutissima; δ) Υπάρχουν διαφοροποιήσεις στην ανάπτυξη του Chlorella minutissima μεταξύ διαφορετικών τύπων ζελατίνης (εργαστηρίου και εμπορίου) σαν θρεπτικό υπόστρωμα; 18

2. Ποια είναι η κατάλληλη πυκνότητα του Chlorella minutissima (cells/ml) προκειμένου να πραγματοποιούνται οι μετρήσεις του φθορισμού της χλωροφύλλης; 3. Επηρεάζει το θρεπτικό μέσο την κατάσταση της φωτοσυνθετικής συσκευής του Chlorella minutissima; 4. Πως διαμορφώνονται οι μετρήσεις φθορισμού των μικροφυκών στα διάφορα στάδια ανάπτυξης του Chlorella minutissima; 19

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Υγρές καλλιέργειες μικροφυκών Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Chlorella minutissima (Fott & Nováková), το οποίο απομονώθηκε από τις ακτές του Ηρακλείου Κρήτης, καθώς επίσης και το Chlorella stigmatophora, που μας προμήθευσε ο κ. Ιωάννης Τζοβενής (ΕΚΠΑ). Εικόνα 2. Θάλαμος σταθερής θερμοκρασίας για την καλλιέργεια μικροφυκών. Τα μικροφύκη καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες φλάσκες όγκου 500 ml, με αποστειρωμένο διάλυμα απιονισμένου νερού με αλάτι, αλατότητας 25 σε κάθε περίπτωση. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιήθηκε ήταν Cell-hi F2P σε συγκέντρωση 0,2 gr/l και στις καλλιέργειες υπήρχε σταθερή παροχή αέρα. Όλες οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας (Εικόνα 2) 25±1 ο C με λαμπτήρες Philips master TL-D 36W/840 και ένταση φωτός 18,2 W/m 2, η οποία μετρήθηκε με φωτόμετρο LI-COR LI-250A. Επιπλέον, οι καλλιέργειες ήταν μονοκαλλιέργειες με την παρουσία ενός είδους μικροφύκους (uni-algal) και μη αξενικές, δηλαδή περιείχαν μικροοργανισμούς (βακτήρια και μύκητες) σε ελεγχόμενες ωστόσο πυκνότητες, γεγονός που φαίνεται να έχει θετική επίδραση στην ανάπτυξη των μικροφυκών (Μπέλλου 2015). 20

Εικόνα 3. Αιμοκυτταρόμετρο τύπου Neubauer. Στις καλλιέργειες ελέγχονταν τακτικά η πυκνότητα των κυττάρων με τη βοήθεια αιμοκυτταρόμετρου τύπου Neubauer (Εικόνα 3). Οι μέγιστες συγκεντρώσεις των κυττάρων των μικροφυκών στις υγρές καλλιέργειες έφταναν κατά προσέγγιση τα 300 10 6 cells/ml. Ταυτόχρονα με την καταμέτρηση των κυττάρων, πραγματοποιούνταν και μια επισκόπηση της γενικής εικόνας της καλλιέργειας, όπως η δημιουργία συσσωματωμάτων των κυττάρων, παρουσία πιθανών επιμολύνσεων κλπ. 2.2. Πειράματα με ζελατίνη και άγαρ Η διερεύνηση της μέγιστης παραγωγής κυττάρων του μικροφύκους Chlorella sp. με τη χρήση ζελατίνης και άγαρ ως θρεπτικών υποστρωμάτων, πραγματοποιήθηκε με μια σειρά πειραμάτων, όπου ελέγχθηκε ο ρυθμός αύξησης των Chlorella minutissima και Chlorella stigmatophora σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των δύο μέσων. Εν συνεχεία, παρουσιάζονται διεξοδικά τα πειράματα που διεξήχθησαν. Τα μικροφύκη που χρησιμοποιήθηκαν για τα ακόλουθα πειράματα, προέρχονταν από καλλιέργειες οι οποίες είχαν εμβολιαστεί 3-5 ημέρες πριν από την έναρξη του εκάστοτε πειράματος, ώστε να είναι καλή η κατάσταση των κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι περιγράφονται ορισμένα πειράματα στα οποία παρόλο που οι συγκεντρώσεις των μικροφυκών δεν ήταν ικανοποιητικές, μας έδωσαν σημαντικές πληροφορίες για το σχεδιασμό και τους χειρισμούς που πρέπει να ακολουθούνται. Τέλος, διεξήχθησαν πειράματα που δε συμπεριλαμβάνονται στα αποτελέσματα, στα οποία το κύριο πρόβλημα ήταν η εμφάνιση μούχλας στα δείγματα με τη ζελατίνη. 21

Αυτό αποδόθηκε στο γεγονός ότι η ζελατίνη είναι ένα ιδανικό υπόστρωμα για την ανάπτυξη μικροοργανισμών, με αποτέλεσμα την καταστροφή των δειγμάτων και την χαμηλή συγκέντρωση κυττάρων του Chlorella sp. Πείραμα 1 Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ένα προκαταρκτικό πείραμα ώστε να αποκτηθεί μία πρώτη εικόνα σχετικά με την ανάπτυξη του μικροφύκους μέσα στη ζελατίνη. Όσο αφορά στην προετοιμασία των υαλικών που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος, αυτά καθαρίστηκαν με υγρό σαπούνι και το τελικό στάδιο ήταν η υγρή αποστείρωση σε κλίβανο στους 121 ο C για 20 min. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν έξι δοκιμαστικοί σωλήνες στους οποίους προστέθηκαν 25 ml διαλύματος ζελατίνης και Chlorella minutissima σε συγκέντρωση 5 10 6 cells/ml, ενώ οι τελικές συγκεντρώσεις της ζελατίνης στα δείγματα ήταν 10, 15 και 20 gr/l, σε δυο επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση. Το πρώτο στάδιο ήταν η παρασκευή του διαλύματος ζελατίνης, όπου χρησιμοποιήθηκε θαλασσινό νερό αλατότητας 25, το οποίο διηθήθηκε, αποστειρώθηκε και διαλύθηκε σε αυτό η αντίστοιχη ποσότητα ζελατίνης. Η ζελατίνη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η gelatin from porcine skin, gel strength 300, type A της Sigma-Aldrich. Τα διαλύματα αναδεύτηκαν με τη χρήση μαγνήτη και παράλληλα θερμάνθηκαν, έως ότου η ζελατίνη διαλυθεί και το διάλυμα φτάσει σε σημείο βρασμού. Στο δεύτερο μέρος του πειράματος ακολούθησε η μεταφορά της ζελατίνης σε δοκιμαστικούς σωλήνες και η προσθήκη του μικροφύκους. Πιο αναλυτικά, αφότου έγινε έλεγχος της θερμοκρασίας του διαλύματος ζελατίνης και η θερμοκρασία έφτασε τους 35 ο C, μεταφέρθηκαν σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 25 ml από το διάλυμα της ζελατίνης και στη συνέχεια η αντίστοιχη ποσότητα (μl) από την υγρή καλλιέργεια Chlorella minutissima, ώστε η συγκέντρωση του μικροφύκους σε κάθε δοκιμαστικού σωλήνα να είναι 5 10 6 cells/ml. Προκειμένου τα δείγματα να γίνουν ομοιογενή, αναδεύτηκαν ελαφρά με τη χρήση γυάλινης πιπέτας Pasteur. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες σφραγίστηκαν με πώματα από υδρόφοβο βαμβάκι και το στόμιό τους καλύφθηκε με αλουμινόχαρτο. Στο τελικό στάδιο του πειράματος, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο σταθερών συνθηκών (Εικόνα 2) με θερμοκρασία 25±1 ο C και ένταση φωτός 18,2 22

W/m 2 με λαμπτήρες Philips master TL-D 36W/840. Η πυκνότητα των κυττάρων στα δείγματα μετρούνταν κάθε 2-3 ημέρες για συνολικά περίπου 10-15 ημέρες, έως ότου να μην παρατηρούνται σημαντικές μεταβολές στον ρυθμό αύξησης των κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα δείγματα με συγκεντρώσεις ζελατίνης από 20 gr/l και άνω στερεοποιούνταν. Κατά συνέπεια, για να γίνει εφικτή η μέτρηση των κυττάρων, γινόταν λήψη ενός μικρού κομματιού από την επιφάνεια του δείγματος με τη χρήση αποστειρωμένης μικρής μεταλλικής σπάτουλας, το οποίο θερμαινόταν ελαφρώς προκειμένου να ρευστοποιηθεί. Οι μετρήσεις των κυττάρων έγιναν με οπτικό μικροσκόπιο Zeiss Axionstar plus. Πείραμα 2 Πραγματοποιήθηκε επαναληπτικό πείραμα όμοιο με το πείραμα 1, με μόνη διαφοροποίηση ότι τα δείγματα, προκειμένου να ομογενοποιηθούν, αναδεύτηκαν με Vortex. Πείραμα 3 Επαναληπτικό πείραμα όμοιο με το πείραμα 1, όπου μελετήθηκε η ανάπτυξη του μικροφύκους σε διαλύματα ζελατίνης με συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 gr/l, σε τρεις επαναλήψεις η κάθε συγκέντρωση, καθώς επίσης ο τελικός όγκος των δειγμάτων μειώθηκε από 25 ml σε 5 ml. Πείραμα 4 Δοκιμαστικό πείραμα όμοιο με το πείραμα 1, όπου μελετήθηκε η ανάπτυξη του Chlorella minutissima σε διαλύματα ζελατίνης συγκέντρωσης 10, 20, 30 και 40 gr/l, σε τέσσερεις επαναλήψεις η κάθε συγκέντρωση, με τελικό όγκο 5 ml. Η διαφοροποίηση του συγκεκριμένου πειράματος έγκειται στο γεγονός ότι για κάθε συγκέντρωση ζελατίνης, οι δύο από τους τέσσερεις δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετήθηκαν στο αυτόκαυστο στους 121 ο C για 20 min. Αφότου η θερμοκρασία των διαλυμάτων ζελατίνης μετά την υγρή αποστείρωση έφτασε τους 35 ο C, προστέθηκε η αντίστοιχη ποσότητα μικροφύκους. Τέλος, όλα τα δείγματα τοποθετήθηκαν στο θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας. 23

Σκοπός του πειράματος ήταν να ελεγχθεί το κατά πόσο η εκ των προτέρων αποστείρωση του διαλύματος ζελατίνης θα συμβάλλει στη μείωση της ανάπτυξης μικροοργανισμών μέσα στα δείγματα, καθώς και να γίνει μια σύγκριση της ανάπτυξης του μικροφύκους σε αποστειρωμένο και μη αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο. Πείραμα 5 Επαναληπτικό πείραμα όμοιο με το πείραμα 4, όπου μελετήθηκε η ανάπτυξη του μικροφύκους σε διαλύματα ζελατίνης με συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 15, 20, 30, και 40 gr/l, σε τρεις επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση. Πείραμα 6 Στο πείραμα αυτό έγινε μια συγκριτική μελέτη της ανάπτυξης του Chlorella minutissima σε υπόστρωμα ζελατίνης της Sigma-Aldrich, που χρησιμοποιήθηκε και στα προηγούμενα πειράματα, όπως επίσης και σε ζελατίνη εμπορίου για ζαχαροπλαστική χρήση, αλλά και άγαρ Agar No.1 Bacteriological, MC002 της Lab M. Οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων και για τρία μέσα ήταν 5, 10, 15, 20 και 30 gr/l με τρεις επαναλήψεις σε κάθε συγκέντρωση. Επιπλέον, στο παρόν πείραμα διπλασιάστηκε ο τελικός όγκος των δειγμάτων από 5 ml σε 10 ml και η αρχική ποσότητα του μικροφύκους που προστέθηκε ήταν τα 10 10 6 κύτταρα/ml. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρξε μια επιπλέον μετατροπή στη διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων, η οποία αφορούσε στην αναλογία μικροφύκους και διαλύματος ζελατίνης/άγαρ κατά την ανάμιξή τους. Η αναλογία αυτή ήταν 1:1, δηλαδή σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστέθηκαν 5 ml μικροφύκους και 5 ml διαλύματος ζελατίνης και άγαρ κατά περίπτωση. Εν αντιθέσει, στα πειράματα 1 έως και 5 η ποσότητα του μικροφύκους που προσθέτονταν είχε πολύ μικρότερο όγκο (μl) σε σχέση με τα διαλύματα ζελατίνης. Πείραμα 7 Επαναληπτικό πείραμα όμοιο με το πείραμα 6, όπου διαφοροποιήθηκαν οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων με το άγαρ και ο αριθμός των επαναλήψεων. Πιο 24

αναλυτικά, δοκιμάστηκαν οι συγκεντρώσεις 0, 0,5, 1, 2 και 3 gr/l σε τέσσερεις επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση. Επίσης, για τα δείγματα με τη ζελατίνη της Sigma-Aldrich και αυτή του εμπορίου, προστέθηκαν και δοκιμαστικοί σωλήνες control με συγκέντρωση ζελατίνης 0 gr/l πέραν αυτών του πειράματος 6. Πείραμα 8 Στο πείραμα αυτό διαφοροποιήθηκε το είδος του μικροφύκους, όπου χρησιμοποιήθηκε το Chlorella stigmatophora, το οποίο αναπτύχθηκε σε υπόστρωμα εργαστηριακής ζελατίνης. Οι συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν ήταν τα 0, 10 και 20 gr/l σε δύο επαναλήψεις η κάθε μία και η αναλογία του μικροφύκους και του διαλύματος ζελατίνης στους δοκιμαστικούς ήταν 1:1, ομοίως με το πείραμα 6. Πείραμα 9 Στο τελευταίο πείραμα, τα υαλικά που χρησιμοποιήθηκαν αφότου καθαρίστηκαν με υγρό σαπούνι, παρέμεναν για περίπου 6 ώρες σε διάλυμα NaOH με συγκέντρωση 15 gr/l και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε διάλυμα HCl με αραίωση 1:10, όπου παρέμειναν σε διάρκεια μίας νύχτας. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε προκειμένου να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα απορρυπαντικού και κυττάρων. Το τελικό στάδιο ήταν η υγρή αποστείρωση σε κλίβανο στους 121 ο C για 20 min. Το μικροφύκος που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Chlorella stigmatophora με αρχική συγκέντρωση 10 10 6 cells/ml, το οποίο αναπτύχθηκε σε υπόστρωμα εργαστηριακής ζελατίνης σε συγκεντρώσεις 0, 10, 20, 30 gr/l, σε 3 επαναλήψεις η κάθε συγκέντρωση. Όσο αφορά στην προετοιμασία των διαλυμάτων ζελατίνης, θερμάνθηκαν και αναδεύτηκαν έως ότου η ζελατίνη διαλυθεί και το διάλυμα αποκτήσει μια διαυγή όψη. Σε αυτό το σημείο αξίζει να σημειωθεί ότι αποφεύχθηκε να φτάσει το διάλυμα σε σημείο βρασμού, εν αντιθέσει με τα προηγούμενα πειράματα. Στο δεύτερο μέρος του πειράματος ακολούθησε η μεταφορά της ζελατίνης σε δοκιμαστικούς σωλήνες και η προσθήκη του μικροφύκους, σε αναλογία 1:1. Σε αντίθεση με όλα τα πειράματα που περιγράφηκαν παραπάνω, τα μικροφύκος προστέθηκε στο διάλυμα ζελατίνης όταν η θερμοκρασία έφτασε τους 26±1 ο C. 25

Τέλος, τα δείγματα τοποθετήθηκαν στο θάλαμο σταθερών συνθηκών σε μεγαλύτερη απόσταση από τους λαμπτήρες, συγκριτικά με τα προηγούμενα πειράματα και η ένταση του φωτός ήταν 5,6 W/m 2. 2.3. Μετρήσεις φθορισμού χλωροφύλλης Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας, εκτός από τα πειράματα που περιγράφηκαν παραπάνω, πραγματοποιήθηκαν και μετρήσεις φθορισμού, ώστε να εξαχθούν ορισμένα συμπεράσματα σχετικά με τη φυσιολογική κατάστασης της φωτοσυνθετικής συσκευής των κυττάρων. Οι μετρήσεις φθορισμού της χλωροφύλλης έγιναν με τη χρήση του φθορισμόμετρου Handy-PEA (Hansatech Instruments Ltd., King s Lynn, Norfolk, UK), (Εικόνα 4). Τα δείγματα πριν μετρηθούν παρέμειναν στο σκοτάδι για 15 min περίπου, βάσει βιβλιογραφίας (Papazi et al. 2008, Xiong et al. 1999). Η διάρκεια της μέτρησης ήταν 2 sec και τα δείγματα φωτίζονταν µε ένταση 3000 µmol m -2 s -1. Εικόνα 4. Φθορισμόμετρο Handy-PEA. Οι δείκτες οι οποίοι μελετήθηκαν ώστε να ελεγχθεί η κατάσταση των κυττάρων ήταν ο δείκτης μέγιστης απόδοσης του φωτοσυστήματος II F v /F m και ο δείκτης ζωτικότητας PI abs. Επιπλέον, το λογισμικό µε το οποίο έγινε η συλλογή και επεξεργασία των δεδομένων μετά το πέρας των μετρήσεων είναι το Pea Plus software. Τέλος, αξίζει να αναφερθεί ότι στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν για τις μετρήσεις φθορισμού χρησιμοποιήθηκε μόνο το είδος Chlorella minutissima. Πείραμα Α Στο παρόν πείραμα πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις φθορισμού της χλωροφύλλης σε δείγματα υγρής καλλιέργειας με αραιώσεις, στις οποίες η πυκνότητα 26

των κυττάρων κυμαινόταν από 0,1 10 6-10 10 6 cells/ml. Πιο αναλυτικά, στα φιαλίδια που τοποθετούνταν στο φθορισμόμετρο προστέθηκε 1 ml από κάθε αραιωμένο διάλυμα της μητρικής καλλιέργειας και ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε νερό αλατότητας 25. Σκοπός του πειράματος ήταν να ελεγχθεί ποια ήταν καταλληλότερη συγκέντρωση κυττάρων στα δείγματα, προκειμένου να γίνονται οι μετρήσεις φθορισμού. Πείραμα Β Στο δεύτερο πείραμα διερευνήθηκε ο βαθμός στον οποίο το θρεπτικό μέσο στο οποίο αναπτύσσεται το Chlorella minutissima επηρεάζει την κατάσταση των κυττάρων του. Στη συγκεκριμένη περίπτωση έγινε μια σύγκριση ανάμεσα στη ζελατίνη και το νερό αλατότητας 25 που καλλιεργείται το μικροφύκος υπό φυσιολογικές συνθήκες. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις σε δείγματα, στα οποία η αρχική καλλιέργεια του μικροφύκους αραιώθηκε με νερό αλατότητας 25, καθώς και με διαλύματα ζελατίνης σε συγκεντρώσεις 5, 10 και 20 gr/l. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι συντελεστές αραίωσης ήταν οι ίδιοι για το νερό αλατότητας 25 και για τα τρία διαφορετικής συγκέντρωσης διαλύματα ζελατίνης και διαμορφώθηκαν με βάση τα αποτελέσματα του πειράματος Α, ώστε να υπάρχει η κατάλληλη πυκνότητα κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, οι συντελεστές αραίωσης που εφαρμόστηκαν ήταν 1:60, 1:10 και 1:6, ώστε η συγκέντρωση των κυττάρων να είναι 1, 6 και 10 εκατομμύρια cells/ml αντίστοιχα. Πείραμα Γ Η κεντρική ιδέα του τρίτου πειράματος ήταν η διερεύνηση των πιθανών μεταβολών στις μετρήσεις του φθορισμού των κυττάρων του Chlorella minutissima στα διάφορα στάδια ανάπτυξης του μικροφύκους. Για να επιτευχθεί το παραπάνω έπρεπε να πραγματοποιηθεί αραίωση των δειγμάτων όταν η συγκέντρωση των κυττάρων τους ξεπερνούσε τα 10 10 6 cells/ml (πείραμα 1). Όμως, όπως προαναφέρθηκε, τα διαλύματα ζελατίνης με συγκέντρωση από 20 gr/l και πάνω στερεοποιούνταν. Έτσι, για να είναι εφικτές οι μετρήσεις στα στερεά δείγματα θα έπρεπε ένα μέρος από την καλλιέργεια να αναδιαλυθεί σε νερό αλατότητας 25 προκειμένου να αραιωθεί και να μεταφερθεί στα φιαλίδια ώστε να μετρηθεί ο 27

φθορισμός. Λόγω αυτής της ιδιαιτερότητας προέκυψε η ανάγκη να διερευνηθεί πρώτα ο βαθμός στον οποίο η διαδικασία της αναδιάλυσης μπορεί να επηρεάσει τις μετρήσεις του φθορισμού. Προκειμένου να διαπιστωθεί το παραπάνω, παρασκευάστηκαν δείγματα με συγκεντρώσεις ζελατίνης 20, 30 και 40 gr/l και συγκέντρωση μικροφύκους 8 10 6 cells/ml. Για να προσπελαστεί το πρόβλημα της μεταφοράς των στερεών καλλιεργειών στα γυάλινα φιαλίδια τα οποία χρησιμοποιούνται για τις μετρήσεις του φθορισμού στο φθορισμόμετρο Handy-PEA, οι καλλιέργειες παρασκευάστηκαν απευθείας μέσα στα φιαλίδια αυτά με όγκο 1 ml. Συνεπώς, όταν τα δείγματα έφτασαν σε θερμοκρασία δωματίου και στερεοποιήθηκαν, πραγματοποιήθηκε μέτρηση του φθορισμού της χλωροφύλλης. Το επόμενο στάδιο ήταν η αναδιάλυση των δειγμάτων στα φιαλίδια σε νερό αλατότητας 25 και η εκ νέου μέτρηση του φθορισμού με σκοπό να ερευνηθεί το ερώτημα που τέθηκε. Κρίθηκε σκόπιμο να πραγματοποιηθούν όσο το δυνατόν πιο ήπιοι χειρισμοί ώστε να μην αποτελέσουν αιτία για πιθανές διαφορές στα αποτελέσματα. Οι τεχνικές που δοκιμάστηκαν ήταν η φυγοκέντρηση των δειγμάτων, η χρήση φίλτρων, καθώς και μια δοκιμή διάλυσης της ζελατίνης σε νερό αλατότητας 25 με χειροκίνητο τρόπο, και τη βοήθεια μιας μεταλλικής σπάτουλας. 2.4. Ανάλυση δεδομένων Για την επεξεργασία των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα STATGRAPHICS Centurion XV (έκδοση 15.2.05). Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικοί έλεγχοι, όπου ως εξαρτημένη μεταβλητή ορίστηκε ο λογάριθμος και η απόλυτη τιμή της συγκέντρωσης (cells/ml) των κυττάρων του Chlorella sp. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν, κρίθηκε σκόπιμο να χρησιμοποιηθεί ο λογάριθμος των συγκεντρώσεων των κυττάρων. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 4 τα πειράματα 2, 3, 6 και 8 εξαιρέθηκαν της στατιστικής ανάλυσης, διότι όπως παρουσιάζεται στα αποτελέσματα παρακάτω οι συγκεντρώσεις των μικροφυκών παρέμειναν σε πολύ χαμηλά επίπεδα, γεγονός που οφείλεται σε διαφορετικούς παράγοντες σε κάθε περίπτωση. Ωστόσο, κρίθηκε σκόπιμο τα πειράματα αυτά να συμπεριληφθούν στη μεθοδολογία και να παρουσιαστούν τα αποτελέσματά τους, καθώς μας δίνουν σημαντικές πληροφορίες για τον πειραματικό σχεδιασμό. 28

Πίνακας 4. Προκαταρκτικές στατιστικές αναλύσεις των λογαριθμισμένων συγκεντρώσεων των μικροφυκών σε συνάρτηση με τις παραμέτρους που ελέγχθηκαν ανά πείραμα. Αποτελέσματα ελέγχου κανονικότητας (αποτέλεσμα στατιστικού ελέγχου και πιθανότητα που αντιστοιχεί σε αυτό) και ελέγχου ομοιογένειας της διασποράς για κάθε παράμετρο ανά πείραμα (αποτέλεσμα στατιστικού ελέγχου και πιθανότητα που αντιστοιχεί σε αυτό), καθώς και ο έλεγχος που επιλέχθηκε να πραγματοποιηθεί στα δεδομένα βάσει αυτών των αποτελεσμάτων. Αριθμός πειράματος Έλεγχος κανονικότητας Shapiro- Wilk W p Παράμετροι που ελέγχθηκαν με Levene's test Έλεγχος ομοιογένειας διασποράς Levene's test W p Πραγματοποιηθείς έλεγχος 1 0,938385 0,0966667 4 0,927701 <0,001 5 0,94147 <0,001 7a 0,912531 <0,001 7b 0,861741 <0,001 9 0,885903 <0,001 Χρονικό διάστημα από έναρξη 0,288428 0,882693 ANOVA πειράματος Συγκέντρωση ζελατίνης 0,0491783 0,952096 ANOVA Χρονικό διάστημα από έναρξη 0,152635 0,961256 ANOVA πειράματος Συγκέντρωση ζελατίνης 0,262381 0,852283 ANOVA Αποστείρωση ή μη ζελατίνης 0,402745 0,527532 ANOVA Χρονικό διάστημα από έναρξη 0,766251 0,574898 ANOVA πειράματος Συγκέντρωση ζελατίνης 4,88129 <0,001 Kruskal-Wallis Αποστείρωση ή μη ζελατίνης 0,955542 0,329258 ANOVA Χρονικό διάστημα από έναρξη 3,97559 0,00384926 Kruskal-Wallis πειράματος Συγκέντρωση ζελατίνης 4,83855 <0,001 Kruskal-Wallis Τύπος ζελατίνης 1,43072 0,232837 ANOVA Χρονικό διάστημα από έναρξη 1,42725 0,233253 ANOVA πειράματος Συγκέντρωση άγαρ 5,75996 0,00132483 Kruskal-Wallis Χρονικό διάστημα από έναρξη 4,97812 <0,001 Kruskal-Wallis πειράματος Συγκέντρωση ζελατίνης 2,87212 0,0414219 Kruskal-Wallis Οι στατιστικοί έλεγχοι που πραγματοποιήθηκαν αφορούσαν στο να διαπιστωθεί αν οι διάφορες παράμετροι κάθε πειράματος επηρέασαν τις λογαριθμισμένες τιμές των συγκεντρώσεων των κυττάρων των μικροφυκών. Αξίζει 29

να σημειωθεί ότι το πείραμα 7 αναλύθηκε σε δύο μέρη, τα 7a και 7b. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, στο πείραμα 7 πραγματοποιήθηκε μια συγκριτική μελέτη της ανάπτυξης του μικροφύκους σε υποστρώματα εργαστηριακής ζελατίνης, ζελατίνης εμπορίου και άγαρ. Τα δύο είδη ζελατινών είχαν τις ίδιες συγκεντρώσεις (gr/l), ενώ το άγαρ χρησιμοποιήθηκε σε πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις, λόγω της δυσκολίας ρευστοποίησής του, προκειμένου να μετρηθεί η συγκέντρωση των κυττάρων. Συνεπώς, όπως διαφαίνεται και από τον πίνακα 4, στο πείραμα 7a η παράμετρος τύπος ζελατίνης αναφέρεται στην εργαστηριακή και εμπορική ζελατίνη. Αντιστοίχως, στο πείραμα 7b ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση του άγαρ. Όσο αφορά στην επιλογή του κατάλληλου στατιστικού ελέγχου, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικές αναλύσεις σχετικά με την κανονικότητα της κατανοµής (Shapiro-Wilks) και την ομοιογένεια της διασποράς (Levene s test). Στην περίπτωση όπου και οι δύο αυτές προ-απαιτούμενες συνθήκες των παραμετρικών ελέγχων πληρούνταν, πραγματοποιήθηκε ο παραμετρικός έλεγχος ανάλυσης διακύμανσης προς ένα ή περισσότερους παράγοντες (analysis of variance, One- Way/Multi-factor ANOVA). Ωστόσο, επειδή η ανάλυση διακύμανσης είναι αρκετά ανθεκτική (robust) σε εκτροπές από την κανονικότητα (Zar 2010), εφαρμόστηκε και στις περιπτώσεις όπου ικανοποιούνταν μόνο το κριτήριο της ομοιογένειας της διασποράς. Αντιθέτως, όταν δεν υπήρχε παραμετρικότητα, πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος Kruskal-Wallis. 30

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Αποτελέσματα πειραμάτων με ζελατίνη και άγαρ Πείραμα 1 Στο αρχικό πείραμα μελετήθηκε ο ρυθμός αύξησης των κυττάρων του Chlorella minutissima για συγκεντρώσεις ζελατίνης 10, 15 και 20 gr/l. Όπως διαφαίνεται από τη Εικόνα 5 το μικροφύκος αποκρίθηκε καλύτερα στα 20 gr/l, συγκριτικά με τα υπόλοιπα δείγματα, με την συγκέντρωση των κυττάρων να φτάνουν περίπου τα 90 10 6 cells/ml την τελευταία ημέρα μετρήσεων, ενώ ακολούθησαν τα 15 gr/l και τέλος τα 10 gr/l. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 5 8 12 14 Ημέρες 10 gr/lt 15 gr/lt 20 gr/lt Εικόνα 5. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης, κατά τη διάρκεια δεκατεσσάρων ημερών. Επιπρόσθετα, ο ρυθμός αύξησης του Clorella minutissima για τις συγκεντρώσεις ζελατίνης 15 και 20 gr/l ήταν παρόμοιος μέχρι και την τρίτη μέτρηση των δειγμάτων (8 η ημέρα πειράματος), ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε μείωση του αριθμού των κυττάρων για τα 15 gr/l. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ημέρα 0 στον οριζόντιο άξονα του γραφήματος, είναι αυτή κατά την οποία διεξήχθη το πείραμα και η συγκέντρωση των κυττάρων 31

ήταν ίδια σε όλα τα δείγματα και για κάθε συγκέντρωση ζελατίνης. Συνεπώς, η πρώτη μέτρηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε την 2 η ημέρα, η δεύτερη την 5 η κ.ο.κ. Τα παραπάνω ισχύουν και για τα επακόλουθα πειράματα. Στατιστική ανάλυση Οι στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις συγκεντρώσεις ανά χρονικό διάστημα από την έναρξη του πειράματος (ANOVA, F- Ratio=145,7, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 6α) και ανά επίπεδο συγκέντρωσης της ζελατίνης (ANOVA, F-Ratio=128,2, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 6β). (α) (β) Εικόνα 6. Επίδραση (α) του χρονικού διαστήματος από την έναρξη του πειράματος και (β) της συγκέντρωσης της ζελατίνης στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις του μικροφύκους Chlorella minutissima. 32

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima Πείραμα 2 Σε αυτό το πείραμα δεν πραγματοποιήθηκε μέτρηση των κυττάρων του μικροφύκους στα δείγματα, καθώς για την ανάδευση των διαλυμάτων ζελατίνης και του μικροφύκους έγινε χρήση Vortex. Το γεγονός αυτό είχε σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία αφρού στην επιφάνεια των δοκιμαστικών σωλήνων, που αποδόθηκε στην καταστροφή των πρωτεϊνών που περιέχονται μέσα στη ζελατίνη λόγω της έντονης ανάδευσης, και εν τέλει το πείραμα διακόπηκε. Συνεπώς, στα επόμενα πειράματα η ανάδευση με Vortex αποφεύχθηκε. Πείραμα 3 Στο πείραμα 3 ο ρυθμός αύξησης των κυττάρων του μικροφύκους παρέμεινε σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Συγκρίνοντας την αρχική συγκέντρωση των κυττάρων της πρώτης ημέρας του πειράματος με αυτές της τελευταίας ημέρας, παρατηρήθηκε ότι αυξήθηκαν ελάχιστα για τις συγκεντρώσεις ζελατίνης 0, 5, 10 και 15 gr/l. Αντίθετα, για τις συγκεντρώσεις 20, 30, 40 και 50 gr/l η πυκνότητα των κυττάρων μειώθηκε και έπεσε κάτω από τα 5 10 6 cells/ml, που ήταν η αρχική συγκέντρωση του Chlorella minutissima. Η διεξαγωγή του πειράματος διακόπηκε την έβδομη ημέρα καθώς δε φάνηκε κάποια αξιοσημείωτη αύξηση των κυττάρων του μικροφύκους. 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 5 7 Ημέρες 0 gr/lt 5 gr/lt 10 gr/lt 15 gr/lt 20 gr/lt 30 gr/lt 40 gr/lt 50 gr/lt 33

Εικόνα 7. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης, κατά τη διάρκεια επτά ημερών. Πείραμα 4 Στο πείραμα αυτό έγινε μια συγκριτική μελέτη της ανάπτυξης του μικροφύκους Chlorella minutissima σε θρεπτικό μέσο ζελατίνης το οποίο στην μία περίπτωση είχε αποστειρωθεί σε αυτόκαυστο, ενώ στη δεύτερη όχι (Εικόνα 8). 34

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 80 70 60 50 40 30 Με αποστείρωση Χωρίς αποστείρωση 20 10 0 10 20 30 40 10 20 30 40 10 20 30 40 10 20 30 40 10 20 30 40 10 20 30 40 0 3 6 8 10 13 Ημέρες Εικόνα 8. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης (10, 20, 30, 40), εκφρασμένες σε gr/l, κατά τη διάρκεια δεκατριών ημερών, με και χωρίς αποστείρωση του θρεπτικού μέσου. 35

Η γενικότερη εικόνα, όπως φαίνεται και από την Εικόνα 8, είναι ότι το μικροφύκος αποκρίθηκε καλύτερα στα δείγματα με το αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο για όλες τις ελεγχόμενες συγκεντρώσεις ζελατίνης στο τέλος του πειράματος. Αυτό μπορεί να συσχετιστεί με το γεγονός ότι στα αποστειρωμένα δείγματα η ανάπτυξη μικροοργανισμών ήταν μικρότερη σε σχέση με τα μη αποστειρωμένα. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε ότι η προσθήκη της ζελατίνης στο αυτόκαυστο είχε σαν αποτέλεσμα να παραμένει ρευστή σε όλες τις συγκεντρώσεις, το οποίο οφείλεται στην καταστροφή των πρωτεϊνών που περιέχονται σε αυτή, λόγω της υψηλής θερμοκρασίας που αναπτύσσεται στο αυτόκαυστο. Οι συνθήκες αυτές ίσως έπαιξαν ευνοϊκό ρόλο στην ανάπτυξη του μικροφύκους. Πιο αναλυτικά, παρατηρήθηκε ότι σε όλες τις μετρήσεις πυκνότητας των κυττάρων μέχρι το τέλος του πειράματος, τα δείγματα με την συγκέντρωση ζελατίνης 20 gr/l, είτε αποστειρωμένα είτε όχι, υπερτέρησαν σε σχέση με τα αντίστοιχά τους για τις υπόλοιπες συγκεντρώσεις ζελατίνης. Συγκεκριμένα, το μικροφύκος σε αποστειρωμένο διάλυμα ζελατίνης 20 gr/l εμφάνισε την καλύτερη απόκριση, με την πυκνότητα των κυττάρων του να γίνεται σχεδόν 15 φορές μεγαλύτερη από την αρχική. Επιπλέον, κοιτάζοντας τα αποτελέσματα των μετρήσεων της τελευταίας ημέρας του πειράματος και συγκρίνοντας τα αποστειρωμένα και μη δείγματα για την κάθε συγκέντρωση ζελατίνης, προέκυψε ότι για τη συγκέντρωση 10 gr/l τα αποστειρωμένα δείγματα ήταν 5,25% καλύτερα από τα μη αποστειρωμένα, στα 20 gr/l 42,53%, στα 30 gr/l 27,22% και στα 40 gr/l 14,57% αντίστοιχα. Τέλος, φάνηκε ότι το Chlorella minutissima αναπτύχθηκε λιγότερο στα δείγματα αποστειρωμένα ή μη με συγκεντρώσεις ζελατίνης 40 gr/l. Στατιστική ανάλυση Οι στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις συγκεντρώσεις ανά χρονικό διάστημα από την έναρξη του πειράματος (ANOVA, F- Ratio=477,61, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 9α), ανά επίπεδο συγκέντρωσης της ζελατίνης (ANOVA, F-Ratio=23,1, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 9β) και ανά αποστειρωμένο ή μη θρεπτικό μέσο (ANOVA, F-Ratio=7,32, α=0,05, p=0,0085), (Εικόνα 9γ). 36

(α) (β) (γ) Εικόνα 9. Επίδραση (α) του χρονικού διαστήματος από την έναρξη του πειράματος, (β) της συγκέντρωσης της ζελατίνης και (γ) της αποστείρωσης ή μη του θρεπτικού μέσου στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις του μικροφύκους Chlorella minutissima. 37

Πείραμα 5 Το πείραμα 5 ήταν μια επανάληψη του 4 ου πειράματος με μια διαφοροποίηση στο εύρος των συγκεντρώσεων ζελατίνης. Όπως διαφαίνεται από την Εικόνα 10, μέχρι και την τρίτη μέτρηση (ημέρα 10) τα δείγματα με τα διαλύματα ζελατίνης που προηγουμένως είχαν αποστειρωθεί αναπτύχθηκαν καλύτερα σε σχέση με τα μη αποστειρωμένα, στο σύνολο των επτά ελεγχόμενων συγκεντρώσεων ζελατίνης. Ωστόσο, από την τέταρτη μέτρηση (ημέρα 12) και ως το τέλος του πειράματος ίσχυσε το αντίστροφο, καθώς τα μη αποστειρωμένα δείγματα αποκρίθηκαν καλύτερα για τις συγκεντρώσεις ζελατίνης 10, 15, 30 και 40 gr/l. Πιο αναλυτικά, στην τελευταία μέτρηση το δείγμα με τη μεγαλύτερη ανάπτυξη ήταν αυτό με το αποστειρωμένο διάλυμα ζελατίνης στα 20 gr/l, όπου η συγκέντρωση των κυττάρων του Chlorella minutissima ήταν 16,53% μεγαλύτερη σε σχέση με το αντίστοιχο μη αποστειρωμένο, γεγονός που έρχεται σε συμφωνία με το πείραμα 4. Στη συνέχεια ακολούθησαν με φθίνουσα σειρά τα μη αποστειρωμένα δείγματα με συγκεντρώσεις ζελατίνης 15 και 10 gr/l. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια σημαντική διαφορά μεταξύ στα αποστειρωμένα και μη δείγματα για τη συγκέντρωση ζελατίνης 5 gr/l, όπου τα πρώτα αναπτύχθηκαν κατά 31,89% περισσότερο από τα τελευταία. 38

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 60 50 40 30 20 Με αποστείρωση Χωρίς αποστείρωση 10 0 0 5 10 15 20 30 40 0 5 10 15 20 30 40 0 5 10 15 20 30 40 0 5 10 15 20 30 40 0 5 10 15 20 30 40 0 5 10 15 20 30 40 0 5 10 15 20 30 40 0 4 7 10 12 14 17 Ημέρες Εικόνα 10. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης, εκφρασμένες σε gr/l, κατά τη διάρκεια δεκαεπτά ημερών, με και χωρίς αποστείρωση του θρεπτικού μέσου. 39

Στατιστική ανάλυση Οι στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις συγκεντρώσεις ανά χρονικό διάστημα από την έναρξη του πειράματος (ANOVA, F- Ratio=46,44, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 11α), ανά επίπεδο συγκέντρωσης της ζελατίνης (Kruskal-Wallis, H=51,4252, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 11β) και ανά αποστειρωμένο ή μη θρεπτικό μέσο (ANOVA, F-Ratio=3,98, α=0,05, p=0,0472), (Εικόνα 11γ). (α) 40

(γ) Εικόνα 11. Επίδραση (α) του χρονικού διαστήματος από την έναρξη του πειράματος, (β) της συγκέντρωσης της ζελατίνης και (γ) της αποστείρωσης ή μη του θρεπτικού μέσου στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις του μικροφύκους Chlorella minutissima. Πείραμα 6 Το πείραμα 6 ήταν μια συγκριτική μελέτη της ανάπτυξης του μικροφύκους Chlorella minutissima με τη χρήση τριών διαφορετικών θρεπτικών μέσων: εργαστηριακής ζελατίνης, ζελατίνης εμπορίου και άγαρ (Εικόνα 12). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι μετρήσεις της πυκνότητας των κυττάρων του Chlorella minutissima σε υπόστρωμα με άγαρ δεν ήταν εφικτό να πραγματοποιηθούν σε καμία από τις ελεγχθείσες συγκεντρώσεις, διότι η ρευστοποίηση ενός τμήματος των δειγμάτων με σκοπό τη μέτρηση των κυττάρων ήταν αδύνατη. Κατά συνέπεια, στην Εικόνα 12 απεικονίζονται οι συγκεντρώσεις των κυττάρων του μικροφύκους στα άλλα δύο θρεπτικά μέσα. Η γενικότερη εικόνα που διαφαίνεται από την Εικόνα 12 είναι ότι τα δείγματα δεν αναπτύχθηκαν αρκετά, ειδικότερα αν λάβουμε υπόψη τις τιμές στις συγκεντρώσεις των κυττάρων προηγούμενων πειραμάτων. Όλα τα δείγματα, για κάθε συγκέντρωση ζελατίνης που ελέγχθηκε, παρουσίασαν μια πτωτική τάση, συγκριτικά με την αρχική συγκέντρωση (10 10 6 cells/ml). Επιπλέον, αυτό που παρατηρείται είναι ότι το μικροφύκος αποκρίθηκε καλύτερα στα δείγματα με την εργαστηριακή ζελατίνη, παρά με την εμπορική. Ωστόσο, το μικροφύκος που αναπτύχθηκε στη ζελατίνη εμπορίου με συγκέντρωση 15 gr/l, έφτασε σε μεγαλύτερη πυκνότητα συγκριτικά με το αντίστοιχό του με εργαστηριακή ζελατίνη, στις δύο τελευταίες μετρήσεις του πειράματος (ημέρα 11 και 14). Την καλύτερη απόκριση είχαν τα 41

δείγματα με την εργαστηριακή ζελατίνη στα 10 και 30 gr/l, τα οποία όμως εξακολούθησαν να έχουν χαμηλότερες συγκεντρώσεις κυττάρων από την αρχική. 42

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 12 10 8 6 Ζελατίνη εργαστηριακή 4 Ζελατίνη εμπορίου 2 0 5 10 15 20 30 5 10 15 20 30 5 10 15 20 30 5 10 15 20 30 5 10 15 20 30 0 4 7 11 14 Ημέρες Εικόνα 12. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις εργαστηριακής και ζελατίνης εμπορίου, εκφρασμένες σε gr/l, κατά τη διάρκεια δεκατεσσάρων ημερών. 43

Πείραμα 7 Το πείραμα 7 ήταν μια επανάληψη του 6 ου πειράματος αφότου έγινε μια αναπροσαρμογή των συγκεντρώσεων του άγαρ, με σκοπό να μπορεί να μετρηθεί η πυκνότητα των κυττάρων του μικροφύκους και επιπλέον προστέθηκαν δείγματα control με συγκέντρωση ζελατίνης 0 gr/l. Ωστόσο, το θέμα της ρευστοποίησης ενός τμήματος των δειγμάτων, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η μέτρηση τους, εξακολούθησε να υφίσταται για τη συγκέντρωση 3 gr/l και κατά συνέπεια εξαιρέθηκε. Γενικότερα, όπως φαίνεται και από την Εικόνα 13 το Chlorella minutissima αναπτύχθηκε καλύτερα σε θρεπτικό μέσο εργαστηριακής ζελατίνης, ενώ ακολούθησε η ζελατίνη εμπορίου και τέλος το άγαρ. Στην Εικόνα 14 είναι εμφανές ότι η πυκνότητα των κυττάρων του Chlorella minutissima παρέμεινε μεγαλύτερη για τη συγκέντρωση εργαστηριακής ζελατίνης 30 gr/l καθόλη τη διάρκεια διεξαγωγής του πειράματος, γεγονός που δεν είχε παρατηρηθεί ξανά σε προηγούμενο πείραμα. Οι αμέσως επόμενες μεγαλύτερες συγκεντρώσεις του μικροφύκους βρέθηκαν στα 15, 20, 5, 10 και 0 gr/l. Το ίδιο μοτίβο ανάπτυξης του μικροφύκους παρατηρήθηκε και για τα δείγματα με τη ζελατίνη εμπορίου, με λίγο χαμηλότερες τιμές στην πυκνότητα των κυττάρων συγκριτικά με τα δείγματα με εργαστηριακή ζελατίνη. Πιο αναλυτικά, όπως είναι εμφανές στην Εικόνα 15 η διαβάθμιση των πυκνοτήτων των κυττάρων του μικροφύκους με ζελατίνη εμπορίου κατά φθίνουσα σειρά είναι ομοίως στα 30, 15, 20, 5, 10 και 0 gr/l. Επιπρόσθετα, όσο αφορά στο άγαρ, το Chlorella minutissima αναπτύχθηκε στο βέλτιστο βαθμό στα δείγματα με συγκεντρώσεις 2 gr/l και στην συνέχεια ακολούθησαν τα 1, 0,5 και 0 gr/l (Εικόνα 16). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 16, παρατηρήθηκε μια αξιοσημείωτη αύξηση της συγκέντρωσης των κυττάρων στο άγαρ με συγκέντρωση 1 gr/l την ημέρα 9 του πειράματος, όπου η πυκνότητα των κυττάρων σχεδόν τριπλασιάστηκε σε σχέση με αρχική. 44

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 60 Πείραμα 7 50 40 30 Ζελατίνη εργαστηριακή Ζελατίνη εμπορίου 20 Άγαρ 10 0 0 0,5 1 2 5 10 15 20 30 0 0,5 1 2 5 10 15 20 30 0 0,5 1 2 5 10 15 20 30 0 0,5 1 2 5 10 15 20 30 0 0,5 1 2 5 10 15 20 30 0 0,5 1 2 5 10 15 20 30 0 3 6 9 11 13 Ημέρες Εικόνα 13. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις εργαστηριακής ζελατίνης, ζελατίνης εμπορίου και άγαρ, εκφρασμένες σε gr/l, κατά τη διάρκεια δεκατριών ημερών. 45

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 60 Εργαστηριακή Ζελατίνη 50 40 30 20 10 0 0 3 6 9 11 13 Ημέρες 0 gr/lt 5 gr/lt 10 gr/lt 15 gr/lt 20 gr/lt 30 gr/lt Εικόνα 14. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις εργαστηριακής ζελατίνης, κατά τη διάρκεια δεκατριών ημερών. 45 40 Ζελατίνη Εμπορίου 35 30 25 20 15 10 5 0 gr/lt 5 gr/lt 10 gr/lt 15 gr/lt 20 gr/lt 30 gr/lt 0 0 3 6 9 11 13 Ημέρες Εικόνα 15. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης εμπορίου, κατά τη διάρκεια δεκατριών ημερών. 46

C (x10 6 cells/ml) Chlorella minutissima 40 35 Άγαρ 30 25 20 15 10 0 gr/lt 0,5 gr/lt 1 gr/lt 2 gr/lt 5 0 0 3 6 9 11 13 Ημέρες Εικόνα 16. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella minutissima για τις διάφορες συγκεντρώσεις άγαρ, κατά τη διάρκεια δεκατριών ημερών. Στατιστική ανάλυση 7a (ζελατίνη εργαστηριακή και εμπορίου) Οι στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις ανά χρονικό διάστημα από την έναρξη του πειράματος (Kruskal-Wallis, H=139,063, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 17α) και ανά επίπεδο συγκέντρωσης της ζελατίνης (Kruskal-Wallis, H=63,5288, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 17β). Αντιθέτως, δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά ανά τύπο ζελατίνης (εργαστηριακή και εμπορίου) (ANOVA, F-Ratio=0,27, α=0,05, p=0,6027). (α) 47

(β) Εικόνα 17. Επίδραση (α) του χρονικού διαστήματος από την έναρξη του πειράματος και (β) της συγκέντρωσης της ζελατίνης, στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις του μικροφύκους Chlorella minutissima. Στατιστική ανάλυση 7b (άγαρ) Οι στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις ανά χρονικό διάστημα από την έναρξη του πειράματος (ANOVA, F-Ratio=17,74, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 18α) και ανά επίπεδο συγκέντρωσης του άγαρ (Kruskal-Wallis, H=22,3055, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 18β). (α) 48

(β) Εικόνα 18. Επίδραση (α) του χρονικού διαστήματος από την έναρξη του πειράματος και (β) της συγκέντρωσης του άγαρ, στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις του μικροφύκους Chlorella minutissima. Πείραμα 8 Στο όγδοο πείραμα χρησιμοποιήθηκε το είδος Chlorella stigmatophora προκειμένου να μελετηθεί η ανάπτυξή του. Πραγματοποιήθηκε μια αρχική μέτρηση της πυκνότητας των κυττάρων, όπου διαπιστώθηκε αύξηση των κυττάρων συγκριτικά με την αρχική συγκέντρωση του μικροφύκους. Πιο αναλυτικά, όπως φαίνεται στην Εικόνα 19, μετά το πέρας τριών ημερών η πυκνότητα των κυττάρων του μικροφύκους είναι σχεδόν ίδια για τις συγκεντρώσεις 0 και 20 gr/l ζελατίνης, με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση κυττάρων να εμφανίζεται στα 10 gr/l ζελατίνης. 49

C (x10 6 cells/ml) Chlorella stigmatophora 40 35 30 25 20 15 10 0 gr/lt 10 gr/lt 20 gr/lt 5 0 0 3 Ημέρες Εικόνα 19. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella stigmatophora για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης, κατά τη διάρκεια τριών ημερών. Στη συνέχεια το πείραμα διακόπηκε λόγω της παρουσίας πρωτοζώων μέσα στα δείγματα, τα οποία προέρχονταν από την μητρική υγρή καλλιέργεια και σταδιακά μείωσαν σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων του μικροφύκους, καθώς τα δέσμευσαν σαν τροφή. Στην πρώτη μέτρηση των δειγμάτων, τα πρωτόζωα δεν έγιναν αντιληπτά εξαιτίας του πολύ μικρού τους αριθμού, ωστόσο στη δεύτερη κατά σειρά μέτρηση παρατηρήθηκε μια ραγδαία αύξηση του αριθμού τους στα δείγματα. Πείραμα 9 Στο τελευταίο πείραμα χρησιμοποιήθηκε το μικροφύκος Chlorella stigmatophora και μελετήθηκε η ανάπτυξή του σε υπόστρωμα ζελατίνης. Παρατηρήθηκε μια ομαδοποίηση στις τιμές των συγκεντρώσεων των κυττάρων του Chlorella stigmatophora, για τις συγκεντρώσεις ζελατίνης 0 και 10 gr/l, όπως επίσης και για τις 20 και 30 gr/l. Πιο αναλυτικά, στην Εικόνα 20 φαίνεται ότι στην πρώτη μέτρηση των κυττάρων παρατηρήθηκε γενικότερα μια ελαφριά μείωση της συγκέντρωσης των κυττάρων σε σχέση με την αρχική, με μια εξαίρεση στη συγκέντρωση ζελατίνης 20 gr/l, όπου εμφανίστηκε μια μικρή αύξηση και στα 30 gr/l, που η πυκνότητα παρέμεινε σχεδόν σταθερή με την αρχική. Μπορούμε να πούμε ότι μέχρι και τη δεύτερη ημέρα του πειράματος το μικροφύκος βρισκόταν σε 50

C (x10 6 cells/ml) Chlorella stigmatophora λανθάνουσα φάση (lag phase) για όλες τις συγκεντρώσεις της ζελατίνης, που επί της ουσίας είναι το διάστημα προσαρμογής στις νέες συνθήκες καλλιέργειας. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 7 9 11 14 17 Ημέρες 0 gr/lt 10 gr/lt 20 gr/lt 30 gr/lt Εικόνα 20. Μεταβολή της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella stigmatophora για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης, κατά τη διάρκεια δεκαεπτά ημερών. Εν συνεχεία, κατά τη δεύτερη μέτρηση των δειγμάτων (ημέρα 4) φάνηκε ένας έντονος διαχωρισμός στην πυκνότητα των κυττάρων του μικροφύκους μεταξύ των διαφόρων συγκεντρώσεων ζελατίνης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως όπου διατηρήθηκε μέχρι το τέλος του πειράματος. Πιο συγκεκριμένα, τα δείγματα με τη ζελατίνη στα 0 και 10 gr/l παρέμειναν σε χαμηλά επίπεδα, συγκρινόμενα με αυτά στις συγκεντρώσεις ζελατίνης 20 και 30 gr/l. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι στο τέλος του πειράματος η συγκέντρωση των κυττάρων του μικροφύκους για την συγκέντρωση ζελατίνης 0 gr/l παρέμεινε σχεδόν σταθερή και για τα 10 gr/l σχεδόν τετραπλασιάστηκε. Όσο αφορά στα δείγματα με τις συγκεντρώσεις ζελατίνης 20 και 30 gr/l, παρατηρήθηκε ότι η πυκνότητα των κυττάρων είχε αυξητική τάση καθόλη τη διάρκεια του πειράματος με εξαίρεση μια μικρή πτώση στην τελευταία μέτρηση της συγκέντρωσης των κυττάρων του Chlorella stigmatophora για τα 30 gr/l ζελατίνης. Επίσης, εμφανίστηκε μια σχετική σταθεροποίηση των συγκεντρώσεων του μικροφύκους από την 11 η ημέρα του πειράματος και έπειτα για τη συγκέντρωση ζελατίνης 30 gr/l και από τη 14 η για τα 20 gr/l. Επιπλέον, το μικροφύκος σε διάλυμα ζελατίνης 20 gr/l εμφάνισε την καλύτερη απόκριση, τόσο σε σχέση με τα υπόλοιπα δείγματα για τις διάφορες συγκεντρώσεις ζελατίνης του πειράματος, όσο και συνολικά για όλα τα προηγούμενα 51

πειράματα που διεξήχθησαν, με την πυκνότητα των κυττάρων του να γίνεται σχεδόν 17 φορές μεγαλύτερη από την αρχική. Τέλος, ακολούθησαν τα δείγματα σε διάλυμα ζελατίνης 30 gr/l, όπου η συγκέντρωση των κυττάρων του Chlorella stigmatophora έγινε σχεδόν 16 φορές μεγαλύτερη, γεγονός που είναι επίσης ενθαρρυντικό. Στατιστική ανάλυση Οι στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις λογαριθμισμένες συγκεντρώσεις ανά χρονικό διάστημα από την έναρξη του πειράματος (Kruskal-Wallis, H=30,354, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 21α) και ανά επίπεδο συγκέντρωσης της ζελατίνης (Kruskal-Wallis, H=46,436, α=0,05, p<0,001), (Εικόνα 21β). (α) 52