Μεταλλαξιγένεση Παναγούλιας Ιωάννης, MSc,PhD

Transcript

1 Άσκηση «Μεταλλαξιγένεση»-Πειραματική πορεία Σκοπός Να προσδιοριστεί η επίδραση διαφόρων προϊόντων με πιθανή μεταλλαξιγόνο δράση στο ρυθμό μεταλλαξιγένεσης σε αυξότροφο στέλεχος ζύμης (Leu -, Ura -, Ade - ). Να προσδιοριστεί η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας-uv (γνωστό μεταλλαξιγόνο) στο ρυθμό μεταλλαξιγένεσης του στελέχους ζύμης (Leu-, Ura-, Ade-) και την επιβίωση των ζυμών άγριου τύπου (wild type). Υποθέσεις Μηδενική υπόθεση: Τα προϊόντα που θα χρησιμοποιήσουμε δεν έχουν σημαντική επίδραση στο ρυθμό μεταλλαξιγένεσης του στελέχους ζύμης. Εναλλακτική υπόθεση: Τα προϊόντα που θα χρησιμοποιήσουμε έχουν σημαντική επίδραση στο ρυθμό μεταλλαξιγένεσης του στελέχους ζύμης. Πορεία Δύο μέρες πριν την έναρξη της εργαστηριακής άσκησης αφήνουμε τα στελέχη της ζύμης να αναπτυχθούν σε θρεπτικό μέσο YEPD, στους 30 ο C. Την ημέρα της εργαστηριακής άσκησης φωτομετρούμε την καλλιέργειά μας σε OD660nm και με βάση την τιμή της οπτικής απορρόφησης και τον Πίνακα 1 (στο τέλος του κειμένου) υπολογίζουμε τον αριθμό των κυττάρων ανά ml καλλιέργειας. Για να επιβεβαιώσουμε τον αριθμό των κυττάρων του yeast στην καλλιέργεια μεταφέρουμε 10μl της καλλιέργειας σε αιμοκυτταρόμετρο τύπου Νewbauer και μετράμε με την βοήθεια οπτικού μικροσκοπίου (Εικόνα 1). Καθώς μετράτε παρατηρήστε την διαίρεση των κυττάρων yeast και τον σχηματισμό των εκβλαστημάτων (budding) (Εικόνα 2). Αραιώστε τα κύτταρα yeast (αν χρειάζεται) με YEPD ώστε η συγκέντρωσή τους να είναι 1.5-2x107/ml. Μεταφέρουμε 1ml της καλλιέργειας σε πλαστικό σωληνάριο τύπου Eppendorf. Φυγοκεντρούμε για 15sec στις στροφές.

2 Εικόνα 1: Μέτρηση αριθμού και βιωσιμότητας των yeast. 1. Πάρτε 10μl από την καλλιέργεια yeast θέλετε να μετρήσετε. 2. Ανακατέψτε το δείγμα πολύ καλά. Εάν ο αριθμός των κυττάρων είναι πολύ μεγάλος, θα πρέπει να τα αραιώσετε το δείγμα των yeast με νερό καθώς δεν είναι δυνατή η μέτρηση των κυττάρων αν ο αριθμός τους είναι πολύ μεγάλος στη διαφάνεια του αιμοκυτταρομέτρου. Στοχεύστε να υπάρχουν κύτταρα στα 5 τετραγωνίδια μέτρησης. 3. Στο αραιωμένο δείγμα προσθέστε μερικές σταγόνες μπλε του μεθυλενίου (1:1). 4. Τοποθετήστε 10μl του δείγματος στην πλάκα του αιμοκυτταρόμετρου χρησιμοποιώντας ακρορύγχια των 10μl. 5. Μετρήστε όλα τα κύτταρα που βρίσκονται εντός των πλαισίων που σημειώνονται στην εικόνα με μπλε χρώμα (τα 5 κουτιά 4x4 που βρίσκονται μέσα στο μεγάλο κεντρικό τετράγωνο). Σημειώστε ότι κάθε ένα από τα τετράγωνα μέτρησης είναι πλαισιωμένο από μια τριπλή γραμμή. Τα κύτταρα που βρίσκονται πάνω στην άνω και δεξιά τριπλή γραμμή δεν θα πρέπει να υπολογίζονται (θεωρούνται εκτός ορίων). Τα κύτταρα που βρίσκονται εντός της κατώτερης και αριστερής τριπλής γραμμής θα πρέπει να καταμετρούνται. 6. Πάρτε τον αριθμό των κυττάρων που μετρήσατε, πολλαπλασιάστε με 5 (επειδή υπολογίσατε μόνο 5 από τα 25 τετράγωνα της πλάκας), πολλαπλασιάστε με (επειδή ο όγκος σας μετρήθηκε ήταν 10000th ενός ml) και πολλαπλασιάστε με τον συντελεστή αραίωσης. Π.χ. εάν αραιώσατε το δείγμα σας 1:1 και απαριθμήσατε 89 κύτταρα ο συνολικός αριθμός κυττάρων ανά ml καλλιέργειας θα ισούται με: 89 x 5 x x 2 (αρχική αραίωση) x 2 (η αραίωση με μπλε του μεθυλενίου) = 1.78x10 7 /ml. Εικόνα 2: Κύτταρο yeast με εκβλάστημα στο οπτικό μικροσκόπιο. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο και διαλύουμε τα κύτταρα σε 1ml Sodium phosphate buffer, 0.1 M και αναδεύουμε ελαφρώς. Σε 4 πλαστικά σωληνάρια τύπου Eppendorf προσθέτουμε 900μl Sodium phosphate buffer και προχωράμε σε διαδοχικές αραιώσεις. Στο 1 ο σωληνάριο προσθέτουμε 100μl από το εναιώρημα των κυττάρων (10-1 ). Αναδεύουμε ελαφρώς. Στο δεύτερο σωληνάριο προσθέτουμε 100μl από το εναιώρημα 10-1 (10-2 ). Συνεχίζουμε τις αραιώσεις μέχρι να φτάσουμε στη συγκέντρωση 10-4 (Εικόνα 2). Υπολογίστε σε ποια αραίωση η συγκέντρωση των κυττάρων yeast είναι περίπου 1000 κύτταρα/ml. Η μέχρι τώρα διαδικασία θα γίνει τόσο για το αυξότροφο στέλεχος όσο και για το στέλεχος αγρίου τύπου. Τα επόμενα βήματα αναφέρονται μόνο στο αυξότροφο στέλεχος.

3 Εικόνα 2: Διαδοχικές αραιώσεις της αρχικής καλλιέργειας των κυττάρων yeast. Πιο πριν έχουμε αποστειρώσει την ουσία με τη πιθανή μεταλλαξιγόνο δράση σε αυτόκαυστο ή με φίλτρο. Διατηρούμε δύο συγκεντρώσεις της ουσίας αυτής, 100% και 10% (αραίωση με dh 2 O). Σε 4 πλαστικά σωληνάρια τύπου Eppendorf προσθέτουμε με μικροπιπέτα τα συστατικά που αναφέρονται στον Πίνακα 2 που ακολουθεί. Πίνακας 2: Όγκος συστατικών που θα προσθέσουμε σε κάθε Eppendorf Αφήνουμε το διάλυμα με τα κύτταρα yeast και το πιθανό μεταλαξιγόνο για 20min στους 30 0 C. Απλώνουμε 100μl από το κάθε διάλυμα του Πίνακα 2 σε Drop-out θρεπτικό μέσο με άγαρ (χωρίς το αμινοξύ που μας ενδιαφέρει) και άλλα 100μl σε YEPD πιάτα (όλα τα αμινοξέα). Μεταφέρουμε τα πιάτα στον επωαστικό θάλαμο στους 32 0 C για 2-3 μέρες. Μετά το πέρας των 2-3 ημερών καταγράφουμε τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν και εξετάζουμε αν η υπόθεσή μας ήταν μηδενική ή εναλλακτική.

4 Πορεία για τη μελέτη της δράσης της UV ακτινοβολίας Απλώνουμε 100μl του διαλύματος του αυξότροφου στελέχους ζύμης (αραίωση 10-4 από την προηγούμενη πειραματική πορεία) σε 5 πιάτα με Drop-out θρεπτικό μέσο με άγαρ (χωρίς το αμινοξύ που μας ενδιαφέρει). Απλώνουμε 100μl του διαλύματος του αγρίου τύπου στελέχους ζύμης (αραίωση 10-4 από την προηγούμενη πειραματική πορεία) σε 5 πιάτα σε θρεπτικό μέσο ΥEPD με άγαρ (όλα τα αμινοξέα). 2 πιάτα (1 με το αυξότροφο στέλεχος και 1 με το αγρίου τύπου στέλεχος) θα υποβληθούν σε UV ακτινοβολία για 15sec και αμέσως θα καλυφθούν με αλουμινόχαρτο μαζί με ένα επιπλέον πιάτο από το κάθε στέλεχος, το οποίο δεν θα υποβληθεί σε UV ακτινοβολία. 2 πιάτα (1 με το αυξότροφο στέλεχος και 1 με το αγρίου τύπου στέλεχος) θα υποβληθούν σε UV ακτινοβολία για 15sec και θα μεταφερθούν, μαζί με ένα επιπλέον πιάτο από το κάθε στέλεχος, το οποίο δεν θα υποβληθεί σε UV ακτινοβολία, για 1h σε μέρος που η ηλιακή ακτινοβολία είναι ελεύθερη. Η πάνω διαδικασία θα επαναληφθεί και για έκθεση σε UV ακτινοβολία για 30sec. Μετά την έκθεση των στελεχών στην UV και ηλιακή ακτινοβολία τα πιάτα θα μεταφερθούν στον επωαστικό θάλαμο στους 32 0 C για 2-3 μέρες. Μετά το πέρας των 2-3 ημερών καταγράφουμε τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν και εξετάζουμε την δράση της UV και ηλιακής ακτινοβολίας στον ρυθμό μεταλλαξιγένεσης των αυξότροφων στελεχών yeast και τη βιωσιμότητα του στελέχους αγρίου τύπου.

5 Πίνακας 1: Αντιστοίχιση τιμής οπτικής πυκνότητας με αριθμό κυττάρων yeast OD660 Cellsx10 7 OD660 Cellsx10 7 OD660 Cellsx10 7 OD660 Cellsx