Histology FISH Accessory Kit

Histology FISH Accessory Kit Κωδικός K5799 6η έκδοση Για in situ υβριδισµό µε φθορισµό (FISH) σε τοµές ιστού µονιµοποιηµένες µε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 20 εξετάσεις. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 1/31

Πίνακας περιεχοµένων Χρήση για την οποία προορίζεται... 3 Εισαγωγή... 3 Αντιδραστήρια... 3 Παρεχόµενα υλικά... 3 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται... 4 Προφυλάξεις... 5 Αποθήκευση... 8 Παρασκευή δειγµάτων... 8 Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη... 8 Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ... 9 A. Προετοιµασία αντιδραστηρίων... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Σειρά διαλυµάτων αιθανόλης... 9 A.5 Pepsin solution... 9 B. ιαδικασία χρώσης... 11 B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία... 11 B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση... 11 B.3 Πρωτόκολλο χρώσης... 12 B.3.α. Πρωτόκολλο χρώσης για ιχνηθέτες FISH που είναι αραιωµένοι σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το ανθρακικό αιθυλένιο... 12 B.3.β. Πρωτόκολλο χρώσης για ιχνηθέτες FISH που είναι αραιωµένοι σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το φορµαµίδιο... 16 Ποιοτικός έλεγχος... 20 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων... 20 Επίλυση προβληµάτων... 22 Παράρτηµα 1... 28 Παράρτηµα 2... 29 Βιβλιογραφία... 30 Επεξήγηση συµβόλων... 31 (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 2/31

ΕΛΛΗΝΙΚΑ Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το Histology FISH Accessory Kit προορίζεται για χρήση στην τεχνική in situ υβριδισµού µε φθορισµό (FISH) σε δείγµατα τοµών ιστών µονιµοποιηµένων µε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη. Τα αντιδραστήρια που παρέχονται σε αυτό το Histology FISH Accessory Kit µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν µε το HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (κωδικός K5731, φιαλίδιο 3). Εάν χρησιµοποιηθούν αντιδραστήρια από το Dako Histology FISH Accessory Kit, κωδικός K5799, µαζί µε αντιδραστήρια από τον κωδικό K5731, πρέπει να τηρηθεί η διαδικασία που περιγράφεται στο ένθετο της συσκευασίας για τον κωδικό K5731. Εισαγωγή Το Histology FISH Accessory Kit περιέχει όλα τα βασικά αντιδραστήρια τα οποία απαιτούνται για την ολοκληρωµένη διαδικασία FISH σε δείγµατα τοµών ιστών µονιµοποιηµένων µε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη, εκτός του ιχνηθέτη. Μετά την αποπαραφίνωση και την επανενυδάτωση, τα δείγµατα θερµαίνονται σε διάλυµα προκατεργασίας και ακολουθεί πρωτεολυτική χώνευση µε χρήση Pepsin. Μετά τα βήµατα της θέρµανσης και της πρωτεολυτικής προκατεργασίας, ο χρήστης εφαρµόζει τους δικούς του ιχνηθέτες FISH στα δείγµατα, τα οποία στη συνέχεια στεγανοποιούνται µε Coverslip Sealant και υποβάλλονται σε µετουσίωση και υβριδισµό. Μετά τον υβριδισµό, εκτελείται ισχυρή πλύση που διασφαλίζει την αποµάκρυνση των αδέσµευτων και µη ειδικά προσδεδεµένων ιχνηθετών FISH πριν από την επανυδάτωση µε αιθανόλη. Τελικά, τα δείγµατα καλύπτονται µε το Fluorescence Mounting Medium που περιέχει µια µπλε φθορίζουσα αντίχρωση. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε µικροσκόπιο φθορισµού εξοπλισµένο µε τα κατάλληλα φίλτρα (βλ. Παράρτηµα 1). Αντιδραστήρια Παρεχόµενα υλικά Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω επαρκούν για 20 εξετάσεις (µια εξέταση ορίζεται ως µία περιοχή στόχος, διαστάσεων 22 mm x 22 mm). Το κιτ παρέχει υλικά που επαρκούν για έως 10 µεµονωµένους κύκλους χρώσης (4 ξεχωριστοί κύκλοι, όταν χρησιµοποιείται η µέθοδος εµβάπτισης σε πεψίνη). Το Histology FISH Accessory Kit αποστέλλεται µέσα σε ξηρό πάγο. Για να διασφαλιστεί ότι τα συστατικά του κιτ δεν έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της µεταφοράς, κατά την παραλαβή πρέπει να υπάρχει ακόµα ξηρός πάγος. Σηµειώστε ότι ορισµένα συστατικά του κιτ επιτρέπεται να παραµένουν µη κατεψυγµένα, γεγονός το οποίο δεν επηρεάζει την απόδοση του Histology FISH Accessory Kit. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 3/31

Φιαλίδιο 1 Φιαλίδιο 2A Φιαλίδιο 2B Φιαλίδιο 4 Φιαλίδιο 5 Φιαλίδιο 6 Υλικό 7 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, συµπυκνωµένο 20x Ρυθµιστικό διάλυµα MES (2-[N-µορφολινο]αιθανοσουλφονικό οξύ). Pepsin 4 x 6,0 ml, έτοιµο προς χρήση ιάλυµα πεψίνης, ph 2,0, περιέχει σταθεροποιητή και αντιµικροβιακό παράγοντα. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, συµπυκνωµένο 10x Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης, ph 2,0. Περιέχει αντιµικροβιακό παράγοντα. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, συµπυκνωµένο 20x ρυθµιστικό διάλυµα SSC (αλατούχο διάλυµα-κιτρικό νάτριο) µε απορρυπαντικό Tween-20. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Έτοιµο προς χρήση µέσο επικάλυψης φθορισµού µε 500 µg/l DAPI (4,6-διαµιδίνη-2-φαινυλινδόλη). Wash Buffer (20x) 500 ml, συµπυκνωµένο 20x ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl. Coverslip Sealant 1 σωλήνας ιάλυµα για αφαιρούµενη στεγανοποίηση των καλυπτρίδων, έτοιµο προς χρήση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια µπορούν να αντικατασταθούν µε τα αντίστοιχα αντιδραστήρια του Dako HER2 IQFISH pharmdx (Κωδικός K5731). Εάν χρησιµοποιηθούν αντιδραστήρια από το Dako Histology FISH Accessory Kit, κωδικός K5799, µαζί µε αντιδραστήρια από τον κωδικό K5731, πρέπει να τηρηθεί η διαδικασία που περιγράφεται στο ένθετο της συσκευασίας για τον κωδικό K5731. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Εργαστηριακά αντιδραστήρια Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό Αιθανόλη, 96% Ξυλένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Εργαστηριακός εξοπλισµός Απορροφητικά µαντηλάκια Ρυθµιζόµενες πιπέτες Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο µερικής εµβάπτισης (εύρος 37 100 C) Καλυπτρίδες (18 mm x 18 mm ή 22 mm x22 mm και 24 mm x 50 mm ή 24 mm x 60 mm) Λαβίδα (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 4/31

Απαγωγός αναθυµιάσεων Dako Hybridizer (Κωδικός S2450/S2451)* Θερµαντική πλάκα ή κλίβανος υβριδισµού* Υγρός θάλαµος υβριδισµού* Μικροφυγόκεντρος Αντικειµενοφόρες πλάκες, Dako Silanized Slides, κωδικός S3003 ή αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή αντικειµενοφόρες πλάκες Superfrost Plus οχεία ή λουτρά χρώσης Μεταλλικές ή πλαστικές βάσεις Χρονόµετρο (µε ικανότητα χρονοµέτρησης διαστηµάτων 0-60 λεπτών) Υδατόλουτρο µε καπάκι (ικανό να διατηρεί θερµοκρασία 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C και από 95 C έως 99 C Φούρνος µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης εάν η προκατεργασία διεξάγεται µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων** (βλ. Βήµα 1 στην Ενότητα Β3α ή Β3β. Πρωτόκολλο χρώσης, Μέθοδος B). οχείο αδιαπέρατο από µικροκύµατα.το καπάκι πρέπει να διαθέτει τρύπες µε διάµετρο π.χ. ένα εκατοστό * Μπορούν να χρησιµοποιηθούν θερµαντική πλάκα για τη χώνευση (37 (±2) C), θερµαντική πλάκα ή φούρνος υβριδισµού για τη µετουσίωση (66 (±2) C (B.3.α.) ή 82 (±2) C) (B.3.β.) και υγρός θάλαµος υβριδισµού για υβριδισµό (45 (±2) C), αλλά συνιστούµε το Dako Hybridizer, Κωδικός S2450/S2451. ** Υδατόλουτρο µε καπάκι (ικανό να διατηρεί θερµοκρασία 95-99 C) ή θάλαµος πίεσης ελεγχόµενος από µικροεπεξεργαστή όπως το Dako Pascal, Κωδικός S2800 µπορεί να χρησιµοποιηθεί αντί για φούρνο µικροκυµάτων. Εξοπλισµός και παρελκόµενα µικροσκοπίου Φίλτρα για µικροσκόπιο φθορισµού: Φίλτρο για DAPI και φίλτρα κατάλληλα για τα χρησιµοποιούµενα φθοριοχρώµατα, π.χ. διπλό φίλτρο για FITC/Texas Red, µονά φίλτρα για FITC και Texas Red για ιχνηθέτες FISH της Dako - για λεπτοµέρειες βλ. Παράρτηµα 1. Πρέπει να χρησιµοποιηθεί µικροσκόπιο φθορισµού µε λαµπτήρα υδραργύρου 100 Watt ως πηγή φωτός για ιχνηθέτες FISH της Dako. εν συνιστώνται άλλες πηγές φωτός µε τα φίλτρα αυτά. Θήκη αντικειµενοφόρων πλακών µικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειµενοφόρες πλάκες µε αρθρωτό κάλυµµα ή παρόµοιος δίσκος). Προφυλάξεις 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. εν απαιτείται σήµανση κινδύνου για το φιαλίδιο 1, Pre-Treatment Solution (20x). Το Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. 4. Φιαλίδιο 2Α, Pepsin, περιέχει 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, και 0.011-<0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one και 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Φιαλίδιο 2 είναι σηµασµένο: Κίνδυνος H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 Προκαλεί σοβαρά δερµατικά εγκαύµατα και οφθαλµικές βλάβες. Μπορεί να προκαλέσει αλλεργική δερµατική αντίδραση. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 5/31

διευκολύνει την αναπνοή. Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P301 + P310 + P331 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. P303 + P361 + P353 + ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): P310 Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P305 + P310 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 5. Φιαλίδιο 2B, Pepsin Diluent (10x), περιέχει 50-<75% propan-2-ol, και 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 2 είναι σηµασµένο: Danger H225 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. H336 Μπορεί να προκαλέσει υπνηλία ή ζάλη. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. P210 Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. P241 Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. P304 + P340 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ: Μεταφέρετε τον παθόντα στον καθαρό αέρα και αφήστε τον να ξεκουραστεί σε στάση που διευκολύνει την αναπνοή. P303 + P361 + P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. P235 Να διατηρείται δροσερό. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 6. Φιαλίδιο 4, Stringent Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride, και 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 4 είναι σηµασµένο: Προσοχή H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 6/31

7. Φιαλίδιο 6, Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride και 10-<20% trometamol. Φιαλίδιο 5 είναι σηµασµένο: H319 H315 P280 Προσοχή P264 P305 + P351 + P338 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 8. Υλικό 7. Coverslip Sealant, περιέχει 100% ελαφρά υδρογονοκατεργασµένη νάφθα (πετρέλαιο), µε τη σήµανση: Κίνδυνος H225 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. H304 Μπορεί να προκαλέσει θάνατο σε περίπτωση κατάποσης και διείσδυσης στις αναπνευστικές οδούς. H411 Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισµούς, µε µακροχρόνιες επιπτώσεις. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. P210 Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. P241 Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. P273 Avoid release to the environment. P301 + P310 + P331 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. P303 + P361 + P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. P235 Να διατηρείται δροσερό. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 9. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (SDS) για επιπλέον πληροφορίες. 10. Μέθοδοι µονιµοποίησης ιστών και πάχη δειγµάτων διαφορετικά από εκείνα που καθορίζονται ενδέχεται να επηρεάσουν τη µορφολογία των ιστών ή/και την ένταση του σήµατος. 11. Όταν ακολουθείτε χρόνους επώασης, θερµοκρασίες ή µεθόδους, διαφορετικές από αυτές που καθορίζονται ενδέχεται να σηµειωθούν υποδεέστερα αποτελέσµατα. 12. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα ανεπαρκή απόδοση. 13. Μόνο καθαρά δοχεία χρώσης πρέπει να χρησιµοποιούνται για τη µέθοδο εµβάπτισης σε πεψίνη (Βήµα 2. Μέθοδος Γ). (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 7/31

Αποθήκευση Αποθηκεύστε στο σκοτάδι σε θερµοκρασία 2-8 C. Εναλλακτικά όλα τα αντιδραστήρια µπορούν να αποθηκευτούν κατεψυγµένα. To Pepsin (Φιαλίδιο 2Α) µπορεί να επηρεαστεί δυσµενώς αν εκτεθεί σε υψηλή θερµοκρασία. Μην αφήνετε το συστατικό αυτό σε θερµοκρασία δωµατίου. Το Fluorescence Mounting Medium (Φιαλίδιο 5) ενδέχεται να επηρεαστεί δυσµενώς αν εκτεθεί σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην αποθηκεύετε το συστατικό αυτό σε φως. Μην χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που είναι τυπωµένη στο κουτί του κιτ. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (1). εν υπάρχουν ορατά σηµάδια που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Για το λόγο αυτό είναι σηµαντικό στην αξιολόγηση να χρησιµοποιείτε ως µάρτυρα στον κύκλο του προσδιορισµού ιστό φυσιολογικό που σε προηγούµενη FISH συµπεριφέρθηκε ως "καλώς". Αν παρατηρηθεί µη αναµενόµενο πρότυπο φθορισµού το οποίο δεν µπορεί να εξηγηθεί από τις διακυµάνσεις των εργαστηριακών διαδικασιών και αν υπάρχουν υποψίες για πρόβληµα µε το Histology FISH Accessory Kit, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Παρασκευή δειγµάτων Ο χειρισµός δειγµάτων από βιοψίες, εκτοµές ή εξαιρέσεις πρέπει να γίνεται µε τρόπο ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανάλυση FISH. Ακολουθήστε τη συνιστώµενη µέθοδο επεξεργασίας ιστού για την ανοσοϊστοχηµική χρώση που περιγράφεται παρακάτω. Για περαιτέρω πληροφορίες, ανατρέξτε στην παραποµπή (2). Η χρήση ιστών που έχουν εκτεθεί σε απασβέστωση µε οξύ για FISH δεν συνιστάται (3 6). Έχει αναφερθεί ότι το EDTA ως απασβεστωτικό για διατήρηση του DNA είναι καλύτερο (6) για τεχνικές (F)ISH (3, 4, 7). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η απόδοση του Dako Histology FISH Accessory Kit σε απασβεστωµένους ιστούς δεν έχει επικυρωθεί. Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι µόνον ιστοί που διατηρoύνται σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης και εγκλεισµένοι σε παραφίνη. Τα δείγµατα πρέπει π.χ. να τεµαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm και να µονιµοποιούνται επί 18 24 ώρες σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης. Οι ιστοί κατόπιν αφυδατώνονται σε διαβαθµισµένη σειρά αιθανόλης και ξυλενίου και ακολουθεί διήθηση από τηγµένη παραφίνη που διατηρείται σε θερµοκρασία όχι µεγαλύτερη των 60 C. Κατάλληλα µονιµοποιηµένοι και εγκλεισµένοι ιστοί διατηρούνται επ αόριστον πριν από την εκτέλεση τοµών και τη στερέωση σε αντικειµενοφόρο πλάκα, εφόσον φυλάσσονται µε σωστό τρόπο (15-25 C) (2, 8). Άλλα µονιµοποιητικά δεν είναι κατάλληλα. Οι παρατεταµένοι χρόνοι µονιµοποίησης µπορεί να αυξήσουν τον απαιτούµενο χρόνο επώασης στο στάδιο χώνευσης µε Pepsin. Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους 2 6 µm, να συλλέγονται σε αντικειµενοφόρους πλάκες από υδατόλουτρο και κατόπιν να στεγνώνουν στον αέρα. Το βέλτιστο πάχος για τις τοµές ιστών είναι 2 3 µm για τους ιχνηθέτες FISH διαχωρισµένου σήµατος της Dako. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν τοµές των 4 6 µm για άλλες εφαρµογές FISH. Η παραφίνη πρέπει να τήκεται σε θερµοκρασία 60 C για 30-60 λεπτά. Οι τοµές πρέπει κατόπιν να ψύχονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) και να αποθηκεύονται στους 2-8 C. Συνιστάται η στερέωση των τοµών ιστού σε Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 ή σε αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή σε αντικειµενοφόρες πλάκες Superfrost Plus. Γενικά, τα δείγµατα πρέπει να αναλύονται εντός 6 µηνών από την εκτέλεση της τοµής, όταν φυλάσσονται στους 2-8 C. Αν οι τοµές του ιστού φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει τις συνθήκες. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 8/31

Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ A. Προετοιµασία αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: A.1 Pre-Treatment Solution Στο Φιαλίδιο 1 ενδέχεται να σχηµατιστούν κρύσταλλοι, αλλά θα διαλυθούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχουν κρύσταλλοι πριν από την παρασκευή του αντιδραστηρίου. Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 1 (Pre-Treatment Solution 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.2 Stringent Wash Buffer Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 4 (Stringent Wash Buffer 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.3 Wash Buffer Αραιώστε επαρκή ποσότητα του Φιαλιδίου 6 (Wash Buffer 20x) µε αραίωση του συµπυκνώµατος 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.4 Σειρά διαλυµάτων αιθανόλης Από διάλυµα αιθανόλης 96%, προετοιµάστε 3 δοχεία που περιέχουν αιθανόλη 70%, 85% και 96%. Φυλάσσετε τα καλυµµένα δοχεία σε θερµοκρασία δωµατίου ή στους 2 8 C και χρησιµοποιήστε για 200 αντικειµενοφόρες πλάκες κατά µέγιστο. Απορρίψτε τα διαλύµατα εάν έχουν νεφελώδη εµφάνιση. A.5 Pepsin solution ιάλυµα Pepsin χρειάζεται µόνο όταν χρησιµοποιείται η µέθοδος εµβάπτισης σε Pepsin (B.3.α. και B.3.β Βήµα 2 Μέθοδος Γ). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης ως εξής: Για δοχείο χωρητικότητας έξι αντικειµενοφόρων, παρασκευάστε διάλυµα πεψίνης 60 ml: Προσθέστε 48 ml απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύο (2-8 C) Pepsin Diluent (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 6 ml κρύο (2-8 C) Pepsin (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. Τοποθετήστε το καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Για δοχείο χωρητικότητας 24 αντικειµενοφόρων, παρασκευάστε διάλυµα πεψίνης 240 ml: Προσθέστε 192 ml απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύο (2-8 C) Pepsin Diluent (10x) (Φιαλίδιο 2B) στο δοχείο. Προσθέστε 24 ml κρύο (2-8 C) Pepsin (Φιαλίδιο 2A) στο δοχείο. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 9/31

Τοποθετήστε το καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. ιάλυµα πεψίνης που έχει ισορροπήσει πρέπει να χρησιµοποιείται εντός 5 ωρών. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 10/31

B. ιαδικασία χρώσης B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Αν τα συστατικά του κιτ φυλάσσονται παγωµένα, συστήνουµε µια ηµέρα προτού πραγµατοποιήσετε την ανάλυση να µεταφέρετε τα αντιδραστήρια στους 2 8 C ώστε να ισορροπήσουν στη σωστή θερµοκρασία. Όλα τα αντιδραστήρια, πριν τη χρήση, πρέπει να επιστρέφουν στη σχετική θερµοκρασία. Φιαλίδιο 1: Το αραιωµένο Pre-Treatment Solution πρέπει να εξισορροπείται στους 95-99 C αν χρησιµοποιείται υδατόλουτρο (Ενότητα B3.α ή B.3.β Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 1: Προεπεξεργασία, Μέθοδος A). Αν χρησιµοποιείται φούρνος µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης για την προεπεξεργασία (Ενότητα B3.α ή B.3.β. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 1: Προεπεξεργασία, Μέθοδος B), το αραιωµένο Pre- Treatment Solution πρέπει να εξισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου στους 20-25 C. Φιαλίδιο 2A: Το Pepsin πρέπει να εφαρµόζεται στους 2-8 C (Ενότητα B.3.α. ή B.3.β. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 2: Μέθοδος A και B) και να διατηρείται ψυχρό συνεχώς. Φιαλίδιο 2B: Το Pepsin Diluent (10x) πρέπει να εφαρµόζεται στους 2-8 C (Ενότητα B.3.α. ή B.3.β. Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 2: Μέθοδος Γ) Φιαλίδιο 4: Ένα δοχείο αραιωµένου Stringent Wash Buffer πρέπει να εξισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου και ένα άλλο δοχείο πρέπει να εξισορροπείται στους 63 (±2) C (Ενότητα B.3.α.) ή 65 (±2) C (Ενότητα B.3.β), πριν από τη χρήση. Φιαλίδιο 5: Το Fluorescence Mounting Medium µπορεί να εφαρµοστεί σε οποιαδήποτε θερµοκρασία από 2-25 C. Φιαλίδιο 6: Το αραιωµένο Wash Buffer πρέπει να εξισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Υλικό 7: Το Coverslip Sealant µπορεί να εφαρµοστεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Όλα τα βήµατα πρέπει να εκτελούνται στη θερµοκρασία που καθορίζεται. Η διαδικασία προ χρώσης περιλαµβάνει αφυδατώσεις ακολουθούµενες από ξήρανση των δειγµάτων. Προτού προχωρήσετε στο επόµενο βήµα, βεβαιωθείτε ότι τα δείγµατα έχουν στεγνώσει τελείως. Κατά τη διάρκεια της υπόλοιπης διαδικασίας, µην αφήνετε τα δείγµατα να στεγνώσουν. Αν η διαδικασία χρώσης πρέπει να διακοπεί, οι αντικειµενοφόρες πλάκες µετά το στάδιο αποπαραφίνωσης µπορούν να διατηρηθούν σε Wash Buffer έως 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). B.2 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση: Πριν από την πραγµατοποίηση της διαδικασίας, οι αντικειµενοφόροι των ιστών πρέπει να αποπαραφινώνονται για να αφαιρεθεί η παραφίνη και να επανυδατώνονται. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Η υπολειµµατική παραφίνη θα έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε το λουτρό και επαναλάβετε άλλη µία φορά. 2. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 96% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε το λουτρό και επαναλάβετε άλλη µία φορά. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 11/31

3. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αιθανόλη 70% επί 2 (±1) λεπτά. Αλλάξτε το λουτρό και επαναλάβετε άλλη µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες σε αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2) επί 2 λεπτά τουλάχιστον. Αρχίστε τη διαδικασία χρώσης όπως παρουσιάζεται στην ενότητα B.3.α ή B.3.β, Βήµα 1, Προεπεξεργασία. Μετά από κάθε 200 αντικειµενοφόρους πλάκες πρέπει να παρασκευάζονται φρέσκα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα ξυλενίου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία των ιστών και τις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να ακυρώσουν τα αποτελέσµατα της δοκιµασίας. Προαιρετική ωρίµανση των δειγµάτων: Πριν από την αποπαραφίνωση και την επανυδάτωση, επωάστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στους 60 C επί π.χ. 1 ώρα σε θερµαντική πλάκα, σε πλάκα στο φούρνο υβριδισµού ή στο Dako Hybridizer. Εναλλακτικά, επωάζετε τις αντικειµενοφόρους σε θερµοκρασία 37 C επί 1-2 ηµέρες και κατόπιν επί 1 ώρα στους 60 C. Συνεχίζετε µε την αποπαραφίνωση και την επανυδάτωση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το βήµα αυτό είναι προαιρετικό. Τα ώριµα δείγµατα ενδέχεται να µειώσουν τον πιθανό θόρυβο του υπόβαθρου. B.3 Πρωτόκολλο χρώσης Ακολουθήστε µία από τις δύο παραλλαγές του πρωτοκόλλου χρώσης, B.3.α ή B3.β. Μην εναλλάσσετε βήµατα µεταξύ των δύο διαδικασιών: Στο Πρωτόκολλο χρώσης B.3.α περιγράφεται η διαδικασία διάρκειας µισής ηµέρας, η οποία πρέπει να ακολουθείται για ιχνηθέτες FISH που είναι αραιωµένοι σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το ανθρακικό αιθυλένιο. Στο Πρωτόκολλο χρώσης B.3.β περιγράφεται η διαδικασία διάρκειας 2 ηµερών η οποία πρέπει να ακολουθείται για ιχνηθέτες FISH που είναι αραιωµένοι σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το φορµαµίδιο. B.3.α. Πρωτόκολλο χρώσης για ιχνηθέτες FISH που είναι αραιωµένοι σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το ανθρακικό αιθυλένιο Βήµα 1: Προεπεξεργασία (φούρνος µικροκυµάτων, υδατόλουτρο, Pascal) Η προεπεξεργασία µπορεί να διεξαχθεί είτε µε χρήση υδατόλουτρου όπως περιγράφεται στη µέθοδο Α), είτε µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης όπως περιγράφεται στη µέθοδο Β), είτε µε χρήση συσκευής πίεσης Pascal όπως περιγράφεται στη µέθοδο Γ). Μέθοδος A: Προεπεξεργασία µε χρήση υδατόλουτρου Γεµίστε δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο Pre-Treatment Solution (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο Pre- Treatment Solution σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το Pre-Treatment Solution στους 95-99 C. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Καλύψτε τα δοχεία µε καπάκια προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφευχθεί τυχόν εξάτµιση. Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές σε θερµοκρασία δωµατίου στο προθερµασµένο Pre- Treatment Solution στα δοχεία χρώσης. Ελέγξτε ξανά τη θερµοκρασία και επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους 95-99 C. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 12/31

Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να ψυχθούν στο Pre-Treatment Solution επί 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε ένα δοχείο µε αραιωµένο Wash Buffer (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Pre-Treatment Solution έχει σχεδιαστεί για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Μέθοδος B: Προεπεξεργασία µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης (Συνιστάται) Γεµίστε ένα πλαστικό δοχείο µε αραιωµένο Pre-Treatment Solution σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο διάλυµα προκατεργασίας, καλύψτε το δοχείο µε τρυπηµένο καπάκι και τοποθετήστε το στο φούρνο µικροκυµάτων. Επιλέξτε τη λειτουργία αισθητήρα βρασµού και ένα πρόγραµµα που λειτουργεί επί 10 λεπτά µετά την επίτευξη της θερµοκρασίας βρασµού*. Ύστερα από τα 10 λεπτά επώασης, βγάλτε το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρους από το φούρνο, αφαιρέστε το καπάκι και αφήστε να κρυώσει επί 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρους σε δοχείο µε αραιωµένο Wash Buffer και εµβαπτίστε επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. * Η χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης σηµαίνει ότι ο φούρνος πρέπει να διαθέτει αισθητήρα και προγράµµατα τα οποία αρχικά θερµαίνουν το Pre-Treatment Solution ως το σηµείο βρασµού και εν συνεχεία διατηρούν την απαιτούµενη θερµοκρασία προεπεξεργασίας (άνω των 95 ºC) ενώ κάνουν αντίστροφη µέτρηση του προκαθορισµένου χρόνου (10 (±1) λεπτά). Ορισµένα µοντέλα φούρνων µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης ενδέχεται να µην διαθέτουν δυνατότητα ελεύθερης ρύθµισης χρόνου αντίστροφης µέτρησης. Αν το µοντέλο διαθέτει µόνο προκαθορισµένα προγράµµατα, βεβαιωθείτε ότι επιλέξατε πρόγραµµα που διατηρεί την απαιτούµενη θερµοκρασία προεπεξεργασίας (άνω των 95 ºC) επί τουλάχιστον 10 (±1) λεπτά και σταµατήστε δια χειρός το πρόγραµµα µετά από 10 (±1) λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Pre-Treatment Solution έχει σχεδιαστεί για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Μέθοδος Γ: Προεπεξεργασία µε χρήση συσκευής πίεσης Pascal Τοποθετήστε 500 ml απιονισµένου νερού µέσα στη λεκάνη Pascal. Γεµίστε ένα πλαστικό δοχείο µε 250 ml Pre-Treatment Solution. Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο Pre-Treatment Solution και τοποθετήστε το δοχείο µέσα στη λεκάνη Pascal. Επωάστε σε θερµοκρασία 121 C επί 1 λεπτό. Εκτονώστε την πίεση µετά την ψύξη στους 90 C. ιαβάστε προσεκτικά το Εγχειρίδιο Pascal για πληροφορίες σχετικά µε το σωστό χειρισµό του θαλάµου πίεσης Pascal. Αφαιρέστε το δοχείο µετά την απελευθέρωση της πίεσης. Αφαιρέστε τα καπάκια και αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να ψυχθούν στο Pre-Treatment Solution επί 15 λεπτά ακόµα σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες σε δοχείο που περιέχει αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε το Βήµα 2. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Pre-Treatment Solution έχει σχεδιαστεί για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Μην χρησιµοποιείτε σφραγισµένο αεροστεγές δοχείο κατά την εκτέλεση προεπεξεργασίας σε φούρνο µικροκυµάτων, καθώς η πίεση στο εσωτερικό του δοχείου θα αυξηθεί και ενδέχεται να εκραγεί ή να προκαλέσει τραυµατισµό κατά το άνοιγµα. Μπορείτε να χρησιµοποιήσετε µεταλλική βάση στήριξης αντικειµενοφόρων στο φούρνο µικροκυµάτων εφόσον η µεταλλική βάση στήριξης είναι βυθισµένη στο διάλυµα προεπεξεργασίας καθ' όλη τη διάρκεια της επεξεργασίας σε φούρνο µικροκυµάτων. ιαφορετικά, µην τοποθετείτε µεταλλικά αντικείµενα σε φούρνο µικροκυµάτων. Ακολουθείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή του φούρνου µικροκυµάτων. Αποφύγετε το συνεχή βρασµό του Pre-Treatment Solution καθ' όλο το διάστηµα των 10 λεπτών της επώασης. Να πραγµατοποιείτε τακτικούς ελέγχους της θερµοκρασίας µε χρήση ενός βαθµονοµηµένου θερµόµετρου, ώστε να επαληθεύετε ότι οι συνθήκες θερµοκρασίας είναι σωστές. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 13/31

Βήµα 2: Pepsin, έτοιµη προς χρήση (RTU) ή διάλυµα πεψίνης Η επώαση πεψίνης µπορεί να διεξαχθεί µε απευθείας εφαρµογή σταγόνων πεψίνης RTU στις αντικειµενοφόρες είτε σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) (Μέθοδος A) ή στους 37 C (Μέθοδος B). Εναλλακτικά, οι αντικειµενοφόροι µπορούν να βυθιστούν σε διάλυµα πεψίνης και να επωαστούν στους 37 (±2) C (Μέθοδος Γ). Μέθοδος A και Μέθοδος B: Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος. Με χρήση απορροφητικού υφάσµατος που δεν αφήνει χνούδι (όπως απορροφητικό ταµπόν ή τεµάχιο γάζας), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για την αφαίρεση τυχόν υγρού που αποµένει και για να διατηρήσετε τα αντιδραστήρια εντός της καθορισµένης περιοχής. Εφαρµόστε 5-8 σταγόνες (250 µl) ψυχρού (2-8 C) Pepsin (Φιαλίδιο 2Α) για την κάλυψη του δείγµατος. Φυλάσσετε πάντοτε το Pepsin στους 2-8 C. Μέθοδος A: Pepsin, RTU - Επώαση στους 20-25 C Επωάστε επί 5-15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Χρόνος επώασης 5-15 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια Pepsin και εµβαπτίστε τις τοµές στο αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το αραιωµένο Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Μέθοδος B: Pepsin, RTU - Επώαση στους 37 C Τοποθετήστε δείγµα µε Pepsin σε θερµαντική πλάκα στους 37 C π.χ. Dako Hybridizer και επωάστε επί 3-5 λεπτά. Χρόνος επώασης 3-5 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια Pepsin και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Μέθοδος Γ: ιάλυµα πεψίνης - Εµβάπτιση αντικειµενοφόρων σε διάλυµα πεψίνης στους 37 C Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για τέσσερις ξεχωριστές εκτελέσεις (διάλυµα πεψίνης 60 ml, µικρό δοχείο για έξι αντικειµενοφόρους) ή για µία εκτέλεση (διάλυµα πεψίνης 240 ml, µεγάλο δοχείο για 24 αντικειµενοφόρους). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης όπως περιγράφεται στην ενότητα A.5. Τοποθετήστε το καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Μετρήστε τη θερµοκρασία µέσα στο δοχείο µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο, για να βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία είναι σωστή. Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο διάλυµα πεψίνης στους 37 (±2) C και επωάστε για 20-30 λεπτά. Χρόνος επώασης 20-30 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 14/31

Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια διαλύµατος πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε την αφυδάτωση. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Βήµα: 3 Ιχνηθέτης FISH αραιωµένος σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το ανθρακικό αιθυλένιο (παρέχεται από το χρήστη) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα µίγµατα ιχνηθετών FISH που είναι αραιωµένα σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το ανθρακικό αιθυλένιο πρέπει να αποθηκεύονται σε θερµοκρασία -18 C ανάµεσα στις χρήσεις. Η αποθήκευση στους -18 C έχει ως αποτέλεσµα το διαχωρισµό του ρυθµιστικού διαλύµατος σε δύο φάσεις. Πριν από τη χρήση, βεβαιωθείτε ότι υπάρχει µόνο µία φάση αφήνοντας το µίγµα ιχνηθετών να ισορροπήσει σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) και, στη συνέχεια, αναµιγνύοντας. Αφήστε το µίγµα ιχνηθετών FISH να ξεπαγώσει σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) για µέγιστο διάστηµα 30 λεπτών (προστατέψτε από το έντονο φως) και, στη συνέχεια, περιστρέψτε τη φιάλη επί 15 δευτερόλεπτα µε ταχύτητα 2500 rpm χρησιµοποιώντας αναδευτήρα περιδίνησης (vortex). Εφαρµόστε την κατάλληλη ποσότητα µίγµατος ιχνηθετών, π.χ. 10 µl, στο κέντρο της τοµής του ιστού. Τοποθετήστε αµέσως µια γυάλινη καλυπτρίδα 22 mm x 22 mm πάνω από το µίγµα ιχνηθετών και αφήστε το να απλωθεί οµοιόµορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε απαλά µε χρήση λαβίδας για να τις αποµακρύνετε από τον ιστό. Στεγανοποιήστε την καλυπτρίδα µε το Coverslip Sealant εξωθώντας το στεγανωτικό γύρω από την περιφέρεια της καλυπτρίδας. Αφήστε το Coverslip Sealant να επικαλύψει την καλυπτρίδα και την αντικειµενοφόρο πλάκα, σχηµατίζοντας έτσι στεγανοποίηση γύρω από την καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε ότι το Coverslip Sealant καλύπτει ολόκληρη την άκρη της καλυπτρίδας. Προετοιµάστε το Dako Hybridizer* (Κωδικός S2450 ή S2451) για εκτέλεση υβριδισµού. Βεβαιωθείτε ότι τα Humidity Control Strips (Κωδικός S2452) έχουν κορεστεί και βελτιστοποιηθεί για χρήση. Ξεκινήστε το Hybridizer και επιλέξτε πρόγραµµα για: Μετουσίωση στους 66 C επί 10 λεπτά και, στη συνέχεια, υβριδισµό στους 45 C επί 60-120 λεπτά. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους στο Hybridizer, βεβαιωθείτε ότι το καπάκι έχει κλείσει καλά και ξεκινήστε το πρόγραµµα. Για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο οδηγιών του Dako Hybridizer. * Για τη µετουσίωση και τον υβριδισµό, µπορεί να χρησιµοποιηθεί εξοπλισµός οργάνων που επιτρέπει τη δηµιουργία συνθηκών όµοιων µε εκείνων που περιγράφηκαν παραπάνω: Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε µια επίπεδη µεταλλική ή λίθινη επιφάνεια (θερµαντική πλάκα ή πλάκα φούρνου υβριδισµού) που έχετε προθερµάνει στους 66 (±1) C. Μετουσιώστε επί 10 λεπτά ακριβώς. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε προθερµασµένο υγροποιηµένο θάλαµο υβριδισµού. Καλύψτε το θάλαµο µε ένα καπάκι και επωάστε στους 45 (±2) C επί 60-120 λεπτά. Βήµα 4: Stringent Wash Γεµίστε δύο δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο Stringent Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Συνιστάται ελάχιστος όγκος 100 ml ή 15 ml ανά αντικειµενοφόρο πλάκα σε κάθε δοχείο. Τοποθετήστε ένα από τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο Stringent Wash Buffer σε θερµοκρασία δωµατίου σε απαγωγό αναθυµιάσεων και το άλλο σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το αραιωµένο Stringent Wash Buffer σε θερµοκρασία 63 (±2) C. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Καλύψτε το δοχείο µε καπάκι προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφύγετε την εξάτµιση. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου υδατόλουτρου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 15/31

Το Stringent Wash Buffer περιέχει απορρυπαντικό και ενδέχεται να καταστεί θολερό στους 63 C. Αυτό δεν θα επηρεάσει την απόδοση. Χρησιµοποιώντας λαβίδα ή γάντια, πάρτε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το θάλαµο υβριδισµού και αφαιρέστε απαλά το Coverslip Sealant, καθώς και την καλυπτρίδα, και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο δοχείο πρόπλυσης σε θερµοκρασία δωµατίου, µία κάθε φορά. Μόλις αφαιρεθούν όλες οι καλυπτρίδες, µεταφέρετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το δοχείο πρό-πλυσης που βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου στο δοχείο που βρίσκεται µέσα σε υδατόλουτρο θερµοκρασίας 63 (±2) C. Αµέσως µετά τη µεταφορά των αντικειµενοφόρων στο αραιωµένο Stringent Wash Buffer µε θερµοκρασία 63 (±2) C µέσα σε υδατόλουτρο, πρέπει να ξεκινήσει το χρονόµετρο. Πραγµατοποιήστε ισχυρή πλύση επί 10 λεπτά ακριβώς. Αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το αραιωµένο Stringent Wash Buffer και εµποτίστε τις τοµές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αλλάξτε το αραιωµένο Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96%. Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν εντελώς. Βήµα 5: Επικάλυψη Εφαρµόστε 15 µl Fluorescence Mounting Medium που περιέχει DAPI (φιαλίδιο 5) στην περιοχήστόχο της αντικειµενοφόρου και εφαρµόστε µια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν µετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ηµερών µετά την επικάλυψη. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερµοκρασίες θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε σκοτεινό χώρο σε θερµοκρασία -18-8 C. B.3.β. Πρωτόκολλο χρώσης για ιχνηθέτες FISH που είναι αραιωµένοι σε ρυθµιστικό διάλυµα υβριδισµού µε βάση το φορµαµίδιο ΗΜΕΡΑ 1 Βήµα 1: Προεπεξεργασία (φούρνος µικροκυµάτων, υδατόλουτρο, Pascal) Η προεπεξεργασία µπορεί να διεξαχθεί είτε µε χρήση υδατόλουτρου όπως περιγράφεται στη µέθοδο Α), είτε µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης όπως περιγράφεται στη µέθοδο Β), είτε µε χρήση συσκευής πίεσης Pascal όπως περιγράφεται στη µέθοδο Γ). Μέθοδος A: Προεπεξεργασία µε χρήση υδατόλουτρου Γεµίστε δοχεία χρώσης µε το αραιωµένο Pre-Treatment Solution (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο Pre-Treatment Solution σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το Pre-Treatment Solution στους 95-99 C. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Καλύψτε τα δοχεία µε καπάκια (χωρίς τρύπες) προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφευχθεί τυχόν εξάτµιση. IΕµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο προθερµασµένο Pre-Treatment Solution. Επανελέγξτε τη θερµοκρασία, κλείστε το καπάκι του υδατόλουτρου και επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους 95-99 C. Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφαιρέστε το καπάκι (µην αφαιρείτε τις αντικειµενοφόρες). Αφήστε τις αντικειµενοφόρες να ψυχθούν στο Pre- Treatment Solution επί 15 λεπτά και σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες σε ένα δοχείο µε αραιωµένο Wash Buffer (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε το Βήµα 2. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 16/31

Μέθοδος B: Προεπεξεργασία µε χρήση φούρνου µικροκυµάτων µε δυνατότητα ανίχνευσης (Συνιστάται) Γεµίστε ένα δοχείο µε αραιωµένο Pre-Treatment Solution σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο διάλυµα και κλείστε το καπάκι. Το καπάκι πρέπει να διαθέτει τρύπες ώστε να εκτονώνεται η πίεση. Τοποθετήστε το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρες στο φούρνο µικροκυµάτων και θερµάνετε. Πριν τη θέρµανση, βεβαιωθείτε ότι το εξωτερικό του δοχείου και η κοιλότητα του φούρνου µικροκυµάτων είναι στεγνά. Επωάστε έως µόλις πριν το σηµείο βρασµού (όχι λιγότερο από 95 C) επί 10 λεπτά. Μετά την επώαση, αφαιρέστε το καπάκι (µην αφαιρείτε τις αντικειµενοφόρες). Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να ψυχθούν στο Pre-Treatment Solution επί 15 λεπτά και σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Οι αντικειµενοφόρες πρέπει να καλύπτονται µε ρυθµιστικό διάλυµα καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας προκατεργασίας. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες σε ένα δοχείο µε αραιωµένο Wash Buffer (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε το Βήµα 2. Μέθοδος Γ: Προεπεξεργασία µε χρήση συσκευής πίεσης Pascal Τοποθετήστε 500 ml απιονισµένου νερού µέσα στη λεκάνη Pascal. Γεµίστε ένα πλαστικό δοχείο µε 250 ml Pre-Treatment Solution. Εµβαπτίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές στο Pre-Treatment Solution και τοποθετήστε το δοχείο µέσα στη λεκάνη Pascal. Επωάστε σε θερµοκρασία 121 C επί 1 λεπτό. Εκτονώστε την πίεση µετά την ψύξη στους 90 C. ιαβάστε προσεκτικά το Εγχειρίδιο Pascal για πληροφορίες σχετικά µε το σωστό χειρισµό του θαλάµου πίεσης Pascal. Αφαιρέστε το δοχείο µετά την απελευθέρωση της πίεσης. Αφαιρέστε τα καπάκια και αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να ψυχθούν στο Pre-Treatment Solution επί 15 λεπτά ακόµα σε θερµοκρασία δωµατίου. Μεταφέρετε τις αντικειµενοφόρες σε δοχείο που περιέχει αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε το Βήµα 2. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Pre-Treatment Solution έχει σχεδιαστεί για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Μην χρησιµοποιείτε σφραγισµένο αεροστεγές δοχείο κατά την εκτέλεση προεπεξεργασίας σε φούρνο µικροκυµάτων, καθώς η πίεση στο εσωτερικό του δοχείου θα αυξηθεί και ενδέχεται να εκραγεί ή να προκαλέσει τραυµατισµό κατά το άνοιγµα. Μπορείτε να χρησιµοποιήσετε µεταλλική βάση στήριξης αντικειµενοφόρων στο φούρνο µικροκυµάτων εφόσον η µεταλλική βάση στήριξης είναι βυθισµένη στο διάλυµα προεπεξεργασίας καθ' όλη τη διάρκεια της επεξεργασίας σε φούρνο µικροκυµάτων. ιαφορετικά, µην τοποθετείτε µεταλλικά αντικείµενα σε φούρνο µικροκυµάτων. Ακολουθείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή του φούρνου µικροκυµάτων. Αποφύγετε το συνεχή βρασµό του Pre-Treatment Solution καθ' όλο το διάστηµα των 10 λεπτών της επώασης. Να πραγµατοποιείτε τακτικούς ελέγχους της θερµοκρασίας µε χρήση ενός βαθµονοµηµένου θερµόµετρου, ώστε να επαληθεύετε ότι οι συνθήκες θερµοκρασίας είναι σωστές. Βήµα 2: Pepsin, έτοιµη προς χρήση (RTU) ή διάλυµα πεψίνης Η επώαση πεψίνης µπορεί να διεξαχθεί µε απευθείας εφαρµογή σταγόνων πεψίνης RTU στις αντικειµενοφόρες είτε σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) (Μέθοδος A) ή στους 37 C (Μέθοδος B). Εναλλακτικά, οι αντικειµενοφόροι πλάκες µπορούν να βυθιστούν σε διάλυµα πεψίνης και να επωαστούν στους 37 (±2) C (Μέθοδος Γ) Μέθοδος Α και Μέθοδος Β: Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρεθεί η περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος. Χρησιµοποιώντας ύφασµα χωρίς χνούδι (όπως µια απορροφητική χαρτοπετσέτα ή µια γάζα), σκουπίστε προσεκτικά (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 17/31

γύρω από το δείγµα για να αφαιρέσετε τυχόν υπολείµµατα υγρού και για να συγκρατήσετε τα αντιδραστήρια εντός της απαιτούµενης περιοχής. Εφαρµόστε 5-8 σταγόνες (250 µl) ψυχρού (2 8 C) Pepsin (Φιαλίδιο 2Α) για την κάλυψη του δείγµατος. Φυλάσσετε πάντοτε το Pepsin στους 2-8 C. Μέθοδος A: Pepsin, RTU Επώαση στους 20-25 C Επωάστε επί 5-50 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Μια επώαση διάρκειας 10 20 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου επαρκεί για την πλειονότητα των δειγµάτων, ο χρήστης όµως πρέπει να προσδιορίσει το βέλτιστο χρόνο επώασης. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια Pepsin και εµβαπτίστε τις τοµές στο αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το αραιωµένο Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Συνεχίστε µε το βήµα 3, ιχνηθέτης FISH ή βλ. Παράρτηµα 2 για τη βελτιστοποίηση του χρόνου χώνευσης (προαιρετικό). Μέθοδος B: Pepsin, RTU Επώαση στους 37 C Τοποθετήστε τα δείγµατα µε την πεψίνη στους 37 C στο Dako Hybridizer ή σε προθερµασµένη θερµαντική πλάκα. Επωάστε επί 2 6 λεπτά στους 37 C. Αυτό αρκεί για την πλειονότητα των δειγµάτων που έχουν παρασκευαστεί όπως περιγράφηκε στην ενότητα "Παρασκευή δειγµάτων". Ο βέλτιστος χρόνος επώασης εξαρτάται από τον τύπο του ιστού, τη µονιµοποίηση του ιστού, το πάχος του δείγµατος, την ωρίµανση του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Οι παράγοντες αυτοί µπορεί να αυξήσουν τον απαιτούµενο χρόνο χώνευσης στα 7 15 λεπτά ή ακόµα περισσότερο. Οι αρχάριοι χρήστες πρέπει να ταυτοποιήσουν το βέλτιστο χρόνο χώνευσης εξετάζοντας έναν αντιπροσωπευτικό ιστό επί 1, 3, 6, 12 και 18 λεπτά. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια Pepsin και εµβαπτίστε τις τοµές στο αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3) επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το αραιωµένο Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Συνεχίστε µε το βήµα 3, ιχνηθέτης FISH ή βλ. Παράρτηµα 2 για τη βελτιστοποίηση του χρόνου χώνευσης (προαιρετικό). Μέθοδος Γ: ιάλυµα πεψίνης - Εµβάπτιση αντικειµενοφόρων σε διάλυµα πεψίνης στους 37 C Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για τέσσερεις ξεχωριστούς κύκλους (60 ml διάλυµα πεψίνης, µικρό δοχείο για έξι αντικειµενοφόρες) ή για ένα µόνο κύκλο (240 ml διάλυµα πεψίνης, µεγάλο δοχείο για 24 αντικειµενοφόρες). Παρασκευάστε το διάλυµα πεψίνης όπως περιγράφεται στην ενότητα A.5. Τοποθετήστε το καπάκι στο δοχείο και αφήστε το διάλυµα πεψίνης να ισορροπήσει στους 37 (±2) C σε υδατόλουτρο. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Μετρήστε τη θερµοκρασία µέσα στο δοχείο µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο, για να βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία είναι σωστή. Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες στο διάλυµα πεψίνης στους 37 (±2) C και επωάστε για 20-30 λεπτά. Χρόνος επώασης 20-30 λεπτών θα είναι επαρκής για τα περισσότερα δείγµατα, αλλά ο βέλτιστος χρόνος επώασης ενδέχεται να εξαρτηθεί από τη µονιµοποίηση του ιστού ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Κτυπήστε ελαφρά για να φύγει η περίσσεια του διαλύµατος πεψίνης και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αντικαταστήστε το Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί ακόµα 3 λεπτά. Συνεχίστε µε το βήµα 3, ιχνηθέτης FISH ή βλ. Παράρτηµα 2 για τη βελτιστοποίηση του χρόνου χώνευσης (προαιρετικό). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Συνιστάται η εφαρµογή της διαδικασίας που περιγράφεται στην ενότητα "Προετοιµασία δειγµάτων". Ιστός µε ελλιπή χώνευση µπορεί να οδηγήσει σε απουσία σηµάτων ή σε θολά σήµατα, συχνά µε υψηλά επίπεδα πράσινου κυτταρολυµατικού υποβάθρου. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 18/31

Βήµα 3: Ιχνηθέτης FISH (παρέχεται από το χρήστη) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν χρησιµοποιηθούν αντιδραστήρια από το Dako Histology FISH Accessory Kit, κωδικός K5799, µαζί µε αντιδραστήρια από τον κωδικό K5731, πρέπει να τηρηθεί η διαδικασία που περιγράφεται στο ένθετο της συσκευασίας για τον κωδικό K5731. Το ακόλουθο βήµα πρέπει να εκτελείται σε απαγωγό αναθυµιάσεων. Οι σηµασµένοι µε φθοριοχρώµατα ιχνηθέτες ενδέχεται να επηρεάζονται δυσµενώς όταν εκτίθενται σε υπερβολικά υψηλά επίπεδα φωτός. Μην πραγµατοποιείτε την υπόλοιπη διαδικασία σε δυνατό φως, όπως είναι η άµεση ηλιακή ακτινοβολία. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96% (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.4). Αφήστε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Απλώστε στο µέσον της τοµής του ιστού την κατάλληλη ποσότητα σηµασµένου µε φθοριόχρωµα ιχνηθέτη, π.χ. 10 µl ιχνηθέτη FISH της Dako. Τοποθετήστε αµέσως πάνω από τον ιχνηθέτη µια γυάλινη καλυπτρίδα 18 mm x 18 mm (ή 22 mm x 22 mm) και αφήστε τον να απλωθεί οµοιόµορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Αν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε ελαφρά µε µια λαβίδα ώστε να αποµακρυνθούν. Στεγανοποιήστε την καλυπτρίδα απλώνοντας Coverslip Sealant στην περιφέρεια της καλυπτρίδας. Αφήστε το Coverslip Sealant να επικαλύψει την καλυπτρίδα και την αντικειµενοφόρο πλάκα, σχηµατίζοντας έτσι στεγανοποίηση γύρω από την καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε ότι το Coverslip Sealant στεγανοποιεί όλο το περίγραµµα της καλυπτρίδας. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο Dako Hybridizer (Κωδικός S2450/S2451) και ρυθµίστε τη µετουσίωση στους 82 C επί 5 λεπτά και τον υβριδισµό στους 45 C καθ' όλη τη διάρκεια της νύχτας (14 20 ώρες) όταν χρησιµοποιείτε ιχνηθέτες FISH της Dako. Συνεχίστε µε τη διαδικασία για την Ηµέρα 2, Βήµα 4, Stringent Wash. είτε το Εγχειρίδιο του Hybridizer για περαιτέρω οδηγίες. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μπορούν να χρησιµοποιηθούν εναλλακτικά θερµαντική πλάκα, φούρνος υβριδισµού και θάλαµος υβριδισµού. Βλέπε παρακάτω. Τοποθετήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα πάνω σε επίπεδη µεταλλική ή λίθινη επιφάνεια (θερµαντική πλάκα ή σε πλάκα φούρνου υβριδισµού) προθερµασµένη στους 82 (±2) C. Μετουσιώστε επί 5 λεπτά διασφαλίζοντας ότι η θερµοκρασία της πλάκας δεν µειώνεται κάτω από τους 80 C. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε προθερµασµένο υγροποιηµένο θάλαµο υβριδισµού. Καλύψτε το θάλαµο µε ένα καπάκι και επωάστε για όλη τη νύκτα (14 20 ώρες) στους 45 (±2) C όταν χρησιµοποιείτε τους ιχνηθέτες Dako FISH. ΗΜΕΡΑ 2 Βήµα 4: Stringent Wash Γεµίστε δύο δοχεία χρώσης µε αραιωµένο ισχυρό Stringent Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Για την τοποθέτηση 1 6 αντικειµενοφόρων στο δοχείο, ο ελάχιστος όγκος αραιωµένου Stringent Wash Buffer που απαιτείται είναι 100 ml. Για περισσότερες από 6 αντικειµενοφόρους πλάκες χρησιµοποιήστε τουλάχιστον 15 ml ρυθµιστικού διαλύµατος ανά αντικειµενοφόρο πλάκα, Τοποθετήστε ένα από τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο Stringent Wash Buffer σε θερµοκρασία δωµατίου σε απαγωγό αναθυµιάσεων και το άλλο σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το αραιωµένο Stringent Wash Buffer σε θερµοκρασία 65 (±2) C. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Καλύψτε το δοχείο µε καπάκι προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφύγετε την εξάτµιση. Μετρήστε τη θερµοκρασία µέσα στο δοχείο µε βαθµονοµηµένο θερµόµετρο και βεβαιωθείτε ότι είναι η σωστή θερµοκρασία. Βγάλτε τις αντικειµενοφόρες από το θάλαµο υβριδισµού. Με τη χρήση λαβίδων, αφαιρέστε προσεκτικά το Coverslip Sealant και την καλυπτρίδα και µεταφέρετε την αντικειµενοφόρο σε δοχείο πρόπλυσης σε θερµοκρασία δωµατίου. Μόλις αφαιρεθούν όλες οι καλυπτρίδες, µεταφέρετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το δοχείο πρόπλυσης που βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου στο δοχείο που βρίσκεται µέσα σε (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 19/31

υδατόλουτρο θερµοκρασίας 65 (±2) C. Κλείστε το καπάκι του δοχείου και µετά το καπάκι του υδατόλουτρου. Πραγµατοποιήστε ισχυρή πλύση επί 10 ακριβώς λεπτά στους 65 (±2) C. Αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρες πλάκες από το αραιωµένο Stringent Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Αλλάξτε το αραιωµένο Wash Buffer και εµβαπτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Αφυδατώστε τις τοµές ιστών µέσω διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96% (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.4). Αφήστε τις αντικειµενοφόρες να στεγνώσουν πλήρως στον αέρα. Βήµα 5: Επικάλυψη Εφαρµόστε 15 µl Fluorescence Mounting Medium (Φιαλίδιο 5), το οποίο περιέχει µπλε φθορίζουσα αντίχρωση στην περιοχή-στόχο της αντικειµενοφόρου και τοποθετήστε µια γυάλινη καλυπτρίδα (π.χ. 24 mm x 50 mm ή 24 mm x 60 mm). Αφήστε το µέσο να απλωθεί οµοιόµορφα πάνω από το δείγµα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν µετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ηµερών µετά την επικάλυψη. Αν οι αντικειµενοφόρες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερµοκρασίες, παρατηρείται αποχρωµατισµός των αντικειµενοφόρων. Οι αντικειµενοφόρες πρέπει να αποθηκεύονται σε σκοτεινό µέρος, σε θερµοκρασία -18 8 C. Ποιοτικός έλεγχος 1. Τα σήµατα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Ως µάρτυρες στον κύκλο του προσδιορισµού πρέπει να χρησιµοποιούνται φυσιολογικοί ιστοί που σε προηγούµενη FISH είχαν αξιολογηθεί ως "καλώς". 3. Τα σήµατα φθορισµού στα κύτταρα των φυσιολογικών ιστών πρέπει είναι σαφώς ορατά, δείχνοντας µε αυτόν τον τρόπο ότι οι ιχνηθέτες FISH υβριδοποιήθηκαν επιτυχώς στις περιοχές-στόχους. 4. Αδυναµία εντοπισµού σήµατος σε κύτταρα φυσιολογικού ιστού αποτελεί ένδειξη αποτυχίας της δοκιµασίας και τα αποτελέσµατά της πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 5. Λόγω του τεµαχισµού του ιστού, ορισµένα φυσιολογικά κύτταρα µπορεί να παρουσιάζουν µικρότερο αριθµό σηµάτων από τον αναµενόµενο. 6. Κατά την αξιολόγηση µε χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική µορφολογία πρέπει να είναι άθικτη και οµοιόµορφα κεχρωσµένη. Τα πολυάριθµα ίχνη κυττάρων, κύτταρα σχήµατος κουλούρας και γενικά µια πενιχρή µορφολογία του πυρήνα αποτελούν ενδείξεις υπερβολικής χώνευσης ή υπερβολικής µετουσίωσης του δείγµατος, γεγονός που µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια ή τον κατακερµατισµό του σήµατος. Περιφερειακή χρώση, τρύπες στα κύτταρα (φίλτρο DAPI) ή/και ισχυρή πράσινη χρώση κυτταρολυµατικού υποβάθρου κατά την παρατήρηση µε διπλό φίλτρο Texas Red/FITC µπορεί να υποδεικνύει ελλιπή χώνευση, που µπορεί να οδηγήσει σε απώλεια σήµατος. Τέτοια δείγµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 7. Τυχόν διαφορές στη µονιµοποίηση, την επεξεργασία και την έγκλειση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντική µεταβλητότητα στα αποτελέσµατα, καθιστώντας αναγκαία την τακτική αξιολόγηση των εσωτερικών µαρτύρων. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Σαρώστε αρκετές περιοχές των κυττάρων ώστε να λάβετε υπόψη σας τυχόν ανοµοιογένεια. Επιλέξτε µια περιοχή που έχει καλή κατανοµή των πυρήνων. Αρχίστε την ανάλυση από το πάνω αριστερό τεταρτηµόριο της περιοχής που επιλέξατε και αρχίστε να σαρώνετε από αριστερά προς τα δεξιά, καταµετρώντας τον αριθµό των σηµάτων που βρίσκονται εντός των ορίων κάθε πυρήνα που αξιολογείται σύµφωνα µε τις παρακάτω οδηγίες. Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήµατα στο µεµονωµένο πυρήνα. Μην βαθµολογείτε πυρήνες χωρίς κανένα σήµα. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 20/31

Μην συµπεριλαµβάνετε πυρήνες που απαιτούν υποκειµενική κρίση. Παραβλέψτε πυρήνες µε ασθενή ένταση σήµατος και µη ειδικό ή υψηλό υπόβαθρο. Ο χρήστης πρέπει να προσδιορίζει τον αριθµό των πυρήνων που πρέπει να καταµετρούνται για κάθε ιχνηθέτη. Αποφεύγετε περιοχές όπου τα πυρηνικά όρια είναι ασαφή. Περιορισµοί 1. Ο ιδανικός χρόνος επώασης για τη χώνευση µε πεψίνη ενδέχεται να εξαρτάται από τη µονιµοποίηση ιστών ή/και το πάχος του δείγµατος και πρέπει να καθορίζεται και να επαληθεύεται από το χρήστη. 2. Για την προβλεπόµενη χρήση του ιχνηθέτη FISH, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του µεµονωµένου ιχνηθέτη FISH για τις σχετικές πληροφορίες προϊόντος. 3. Η µέθοδος FISH είναι µια διεργασία πολλαπλών βηµάτων, η οποία απαιτεί ειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, καθώς και στην επιλογή, µονιµοποίηση και επεξεργασία ιστού, παρασκευή της αντικειµενοφόρου πλάκας FISH και ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης. 4. Τα αποτελέσµατα της µεθόδου FISH εξαρτώνται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη µονιµοποίηση, πλύση, στέγνωµα, θέρµανση, σχηµατισµός τοµών ή µόλυνση µε άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να επηρεάσει τον υβριδισµό των ιχνηθετών. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και ενσωµάτωσης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 5. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα, οι αντικειµενοφόροι πλάκες µε τον ιστό πρέπει να αποπαραφινώνονται εντελώς. Η αφαίρεση της παραφίνης χρειάζεται να ολοκληρωθεί κατά την έναρξη της διαδικασίας χρώσης. ( είτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα B.2). 6. Πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο υδατόλουτρο βαθµονοµηµένης θερµοκρασίας, θερµαντική πλάκα και κλίβανος υβριδοποίησης. Η χρήση άλλων τύπων εξοπλισµού ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την εξάτµιση του µίγµατος ιχνηθετών κατά τη διάρκεια του υβριδισµού και πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 21/31

Επίλυση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Απουσία σηµάτων ή ασθενή σήµατα 1α. Ακατάλληλος χρόνος χώνευσης. 1α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται µόνον τοµές ιστών µονιµοποιηµένες µε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη. Παρατεταµένος χρόνος χώνευσης π.χ. επί 7 15 λεπτά στους 37 C µπορεί να βοηθήσει. Βλ. Ενότητα B.3.α ή B.3.β Βήµα 2, Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 4δ, 4ε και Παράρτηµα 2. 1β. Το κιτ έχει εκτεθεί σε υψηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια της µεταφοράς ή της φύλαξης. 1γ. Εσφαλµένες συνθήκες προκατεργασίας. 1δ. Εσφαλµένες συνθήκες µετουσίωσης. 1ε. Εσφαλµένη θερµοκρασία υβριδισµού. 1β. Ελέγξτε τις συνθήκες φύλαξης. Βεβαιωθείτε ότι υπήρχε ξηρός πάγος κατά την παραλαβή της αποστολής. Βεβαιωθείτε ότι τα φιαλίδια 2Α και 5 αποθηκεύτηκαν στους 2 8 C και ότι το φιαλίδιο 5 αποθηκεύτηκε στο σκοτάδι. 1γ. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο. Επιπλέον, ότι ο χρόνος επώασης της χώνευσης βελτιστοποιήθηκε αν αυτό απαιτείται, βλ. ενότητα Β.3.α ή Β.3.β Βήµα 2. Όσο πλησιάζει η θερµοκρασία προκατεργασίας στο σηµείο βρασµού τόσο ισχυρότερα είναι τα σήµατα. Βεβαιωθείτε ότι ο χειρισµός του Pepsin γίνεται στη σωστή θερµοκρασία. Βλ. ενότητα Β.1. 1δ. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία µετουσίωσης και τον προτεινόµενο χρόνο. 1ε. Όταν χρησιµοποιείτε τους ιχνηθέτες FISH της Dako, πραγµατοποιείτε τον υβριδισµό στους 45 (±2) C. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 22/31

2. Περιοχές χωρίς σήµα 1στ. Εξάτµιση του ρυθµιστικού διαλύµατος του ιχνηθέτη κατά τον υβριδισµό. 1ζ. Εσφαλµένες συνθήκες ισχυρής πλύσης. 1η. Το µικροσκόπιο δεν λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Ακατάλληλος λαµπτήρας - Ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Φίλτρα καύσης - Ακάθαρτοι ή/και ραγισµένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1στ. Βεβαιωθείτε ότι υπάρχει αρκετή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού. Χρησιµοποιήστε το Dako Hybridizer (Κωδικός S2450/S2451) και τα Hybridizer Humidity Control Strips (Κωδικός S2452). Χρησιµοποιήστε Coverslip Sealant. Βλέπε Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 5α και 5β. 1ζ. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείται ο συνιστώµενος όγκος, θερµοκρασία και χρόνος ισχυρής πλύσης, και ότι αφαιρέθηκαν οι καλυπτρίδες πριν από την εκτέλεση της ισχυρής πλύσης. 1η. Ελέγξτε το µικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα φίλτρα που χρησιµοποιείτε είναι τα κατάλληλα για τα φθοριοχρώµατα, ότι δεν είναι φθαρµένα και ότι η λυχνία υδραργύρου είναι κατάλληλη και δεν χρησιµοποιείται πέρα από την αναµενόµενη διάρκεια ζωής της (βλ. Παράρτηµα 1). Χρησιµοποιείτε κατάλληλο έλαιο εµβάπτισης για φθορισµό. Σε περίπτωση αµφιβολίας, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον τοπικό προµηθευτή του µικροσκοπίου σας. 1θ. Σήµατα που αποχρωµατίζονται. 1θ. Αποφύγετε την παρατεταµένη εξέταση στο µικροσκόπιο και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε πηγές ισχυρού φωτός. 2α. Ο όγκος του ιχνηθέτη είναι πολύ µικρός. 2β. Κατά την εφαρµογή του ιχνηθέτη ή την επικάλυψη, µπορεί να παγιδευτούν φυσαλίδες αέρα. 2α. Βεβαιωθείτε ότι ο όγκος του ιχνηθέτη είναι αρκετά µεγάλος για την κάλυψη της περιοχής κάτω από την καλυπτρίδα. 2β. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Αν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε τις ελαφρά µε µια λαβίδα ώστε να αποµακρυνθούν. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 23/31

2γ. Κακή αποπαραφίνωση. 2γ. Βεβαιωθείτε ότι έχει γίνει πλήρης αφαίρεση της παραφίνης από τις τοµές. Βλ. ενότητα Β.2. 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 3α. Ακατάλληλος χρόνος χώνευσης. Ισχυρή πράσινη χρώση κυτταρολυµατικού υποβάθρου ενδέχεται να υποδεικνύει ελλιπή χώνευση. 3α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται µόνον τοµές ιστών µονιµοποιηµένες µε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη. Παρατεταµένος χρόνος χώνευσης π.χ. επί 7 15 λεπτά στους 37 C µπορεί να βοηθήσει. Ενότητα B.3.α ή B.3.β. Βήµα 2, Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 4ε και Παράρτηµα 2. 3β. Οι τοµές στέγνωσαν στο B.3. 3β. Ακολουθήστε τις οδηγίες και αποφύγετε το στέγνωµα των αντικειµενοφόρων εκτός αν προσδιορίζεται συγκεκριµένα. 3γ. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3δ. Η θερµοκρασία της ισχυρής πλύσης ήταν πολύ χαµηλή. 3ε. Παρατεταµένη έκθεση της υβριδιωµένης τοµής σε ισχυρό φως. 3στ. Ληγµένες γυάλινες αντικειµενοφόρες ή µη κατάλληλες αντικειµενοφόρες ενδέχεται να προκαλέσουν υπερβολικά ερυθρά χρώση τύπου "ουρανού µε αστέρια. 3γ. Ακολουθήστε τις διαδικασίες αποπαραφίνωσης και επανενυδάτωσης που περιγράφονται στην ενότητα B.2 3δ. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείται η συνιστώµενη θερµοκρασία της ισχυρής πλύσης. 3ε. Αποφύγετε την παρατεταµένη εξέταση στο µικροσκόπιο και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε δυνατό φως. 3στ. Χρησιµοποιήστε τους συνιστώµενους τύπους αντικειµενοφόρων και βεβαιωθείτε ότι δεν είναι ληγµένες. Βλ. ενότητα "Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη". (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 24/31

4. Κακή µορφολογία των πυρήνων ή ασθενής χρώση των πυρήνων. 3ζ. Ανάµιξη ελαίου εµβάπτισης µη φθορισµού µε το Fluorescence Mounting Medium. 4α. Οι λανθασµένες συνθήκες προκατεργασίας µπορεί να έχουν ως αποτέλεσµα ασαφή ή νεφελώδη εµφάνιση. 4β. Βρασµός στη διάρκεια της προεπεξεργασίας µπορεί να οδηγήσει σε βλάβη της µορφολογίας και έλλειψη σηµάτων. 4γ. Λανθασµένη επεξεργασία µε Pepsin. 4δ. Πάρα πολύ µακρά επεξεργασία µε Pepsin διαλύει τον ιστό και έχει ως αποτέλεσµα απουσία σηµάτων. Υπερβολική χώνευση ενδέχεται να προκαλέσει την εµφάνιση ιχνών κυττάρων ή πυρήνων σχήµατος κουλούρας και πυρήνες µε γενικά πενιχρή µορφολογία του πυρήνα. 3ζ. Χρησιµοποιήστε µεγάλες γυάλινες καλυπτρίδες κατά την επικάλυψη σύµφωνα µε τις συστάσεις. Βλ. Ενότητα B.3.α ή B.3.β, Βήµα 5. Αυτό εµποδίζει την ανάµιξη του ελαίου εµβάπτισης µε το µέσο επικάλυψης, αποφεύγοντας τον αυτοφθορισµό και την τυχαία αφαίρεση των καλυπτρίδων από τον αντικειµενικό φακό του µικροσκοπίου. 4α. Βεβαιωθείτε ότι τηρήσατε την προτεινόµενη θερµοκρασία προκατεργασίας και τον προτεινόµενο χρόνο. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 4β-ε. 4β. Αποφύγετε το βρασµό. Βλ. Ενότητα B.3, Βήµα 1. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 4δ. 4γ. Τηρείτε τους συνιστώµενους χρόνους επώασης του Pepsin. Βλ. Ενότητα B.3, Βήµα 2 και Παράρτηµα 2. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 1α, 1γ 3α, 4δ και 4ε. 4δ. Μειώστε το χρόνο επώασης του Pepsin. Βλ. Ενότητα B.3.α ή B.3.β, Βήµα 2 και Παράρτηµα 2. Βεβαιωθείτε ότι το πάχος της τοµής είναι 2 6 µm. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 1α, 1γ, 4β και 4ε. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 25/31

5. Η καλυπτρίδα προσκολλάται ισχυρά στη γυάλινη αντικειµενοφόρο µετά τον υβριδισµό και εποµένως είναι δύσκολη η αφαίρεση. 4ε. Υπερβολικά σύντοµη επεξεργασία µε Pepsin ενδέχεται να οδηγήσει σε απουσία σηµάτων. Ελλιπής χώνευση ιστών µπορεί να προκαλέσει περιφερειακή χρώση πυρήνων και τρύπες στους πυρήνες (φίλτρο DAPI), ισχυρό πράσινο υπόβαθρο στο κυτταρόλυµα (διπλό φίλτρο Texas Red/FITC). Σηµειώστε ότι οι πυρήνες σε ιστούς µε ελλιπή χώνευση παρουσιάζουν καλή µορφολογία σε αντίθεση µε τους ιστούς υπερβολικής χώνευσης. 4στ. Η θερµοκρασία µετουσίωσης είναι πολύ υψηλή. 4ζ. Λανθασµένες συνθήκες υβριδισµού. 5α. Η καλυπτρίδα έχει στεγανοποιηθεί µε ακατάλληλο τρόπο στη γυάλινη αντικειµενοφόρο. 4ε. Παρατείνετε το χρόνο επώασης του Pepsin π.χ. 2-3 φορές το χρόνο επώασης που χρησιµοποιήθηκε. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 1α, 1γ, 3α, 4α και 4δ. 4στ. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείται η συνιστώµενη θερµοκρασία µετουσίωσης. 4ζ. Βλ. Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 1στ και 5β. 5α. Μην ασκήσετε δύναµη για να αφαιρέσετε την καλυπτρίδα αν έχει προσκολληθεί ισχυρά στη γυάλινη αντικειµενοφόρο. Εµβαπτίστε την αντικειµενοφόρο στο δοχείο που περιέχει αραιωµένο Stringent Wash Buffer σε θερµοκρασία δωµατίου επί πέντε λεπτά και κατόπιν αφαιρέστε την καλυπτρίδα. Ακολουθήστε τις συστάσεις για στεγανοποίηση της καλυπτρίδας στην Ενότητα B.3α ή Β.3.β, Βήµα 3. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 1στ και 5β. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 26/31

6. Υψηλό επίπεδο πράσινου αυτοφθορισµού στην αντικειµενοφόρο συµπεριλαµβανο- µένων περιοχών χωρίς ιστό FFPE 5β. Λανθασµένες συνθήκες υβριδισµού. Ενδέχεται να προκληθεί µείωση ή απουσία σηµάτων, βλάβη του ιστού και χρώση υποβάθρου. 6. Χρήση ληγµένων ή µη συνιστώµενων γυάλινων αντικειµενοφόρων 5β. Βεβαιωθείτε ότι υπάρχει αρκετή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού. Χρησιµοποιήστε το Hybridizer (Κωδικός S2450/S2451) και τα Hybridizer Humidity Control Strips (Κωδικός S2452). Ακολουθήστε τις οδηγίες του ένθετου της συσκευασίας των Hybridizer Humidity Control Strips. Βλ. τις συνιστώµενες συνθήκες υβριδισµού στην Ενότητα B.3.α ή Β.3.β, Βήµα 3. Βλ. επίσης Αντιµετώπιση προβληµάτων σηµείο 1στ και 5α. 6. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης για την επιστρωµένη γυάλινη αντικειµενοφόρο (Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003, ή αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-lλυσίνη). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή εάν η προτεινόµενη διορθωτική ενέργεια δεν επιτύχει την επίλυση του προβλήµατος, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 27/31

Παράρτηµα 1 Histology FISH Accessory Kit, Κωδικός K5799 Προδιαγραφές µικροσκοπίου φθορισµού Όταν χρησιµοποιούνται οι ιχνηθέτες FISH της Dako, η Dako συνιστά τον παρακάτω εξοπλισµό για χρήση µε το Histology FISH Accessory Kit: 1. Τύπος µικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισµού. 2. Λαµπτήρας Λαµπτήρας υδραργύρου των 100 watt (συνήθως πρέπει να αντικαθίσταται κάθε 200 ώρες). 3. Αντικειµενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ξηροί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού 10x ή ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισµού 16x. Για µεγέθυνση υψηλής ισχύος και βαθµολόγηση των σηµάτων, συνιστώνται µόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού, π.χ. 63x ή 100x. 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατοµικά για ειδικά φθορισµοχρώµατα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Όταν χρησιµοποιούνται οι ιχνηθέτες FISH της Dako, η Dako συνιστά τη χρήση ενός ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασµό µε ένα υψηλής ποιότητας, διπλό φίλτρο Texas Red/FITC. Φίλτρο DAPI, π.χ. φίλτρο Omega Optical #XF06 ή φίλτρο Chroma # 31000. ιπλό φίλτρο Texas Red/FITC, π.χ. φίλτρο Omega Optical # XF53 ή φίλτρο Chroma # 51006. Για επιβεβαίωση µπορούν να χρησιµοποιηθούν µονά φίλτρα Texas Red και FITC, π.χ. φίλτρο Omega Optical # XF102-2 και XF202, αντίστοιχα. Φθορισµόχρωµα Μήκος κύµατος διέγερσης Μήκος κύµατος εκποµπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο µικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι κρίσιµης σηµασίας για την ερµηνεία. Περαιτέρω λεπτοµερείς πληροφορίες µπορούν να δοθούν από τον κατασκευαστή του µικροσκοπίου σας ή από τον αντιπρόσωπο της Dako ή τον ιστότοπο της Dako. 5. Έλαιο Έλαιο καταδυτικού φακού που δεν φθορίζει. Προφυλάξεις Συγκεκριµένα φθορισµοχρώµατα απαιτούν διαφορετικό εξοπλισµό. Για τους ιχνηθέτες FISH της Dako δεν συνιστάται η χρήση λαµπτήρα υδραργύρου των 50 Watt, ενώ δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν φίλτρα ροδαµίνης και δεν προτείνεται γενικά η χρήση τριπλών φίλτρων. Ένα µη βελτιστοποιηµένο µικροσκόπιο είναι δυνατό να προκαλέσει προβλήµατα κατά την ανάγνωση των σηµάτων φθορισµού. Είναι σηµαντικό να µην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραµµιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να τηρούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαµπτήρα υδραργύρου, ενώ το µικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται. Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγµατος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισµού. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 28/31

Προτού ξεκινήσετε τη φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση, προτείνουµε να συζητήσετε µε τον κατασκευαστή την εγκατάσταση του µικροσκοπίου σας ή να ανατρέξετε στη σχετική βιβλιογραφία. Παράρτηµα 2 Προαιρετικό βήµα για τη βελτιστοποίηση του χρόνου χώνευσης του Pepsin Το προαιρετικό αυτό βήµα χρησιµοποιείται για την αξιολόγηση της επίδρασης της χώνευσης µε πεψίνη και για να βοηθήσει στη βελτιστοποίηση του χρόνου χώνευσης που εφαρµόζεται στο βήµα 2, Pepsin. Για να ελέγξετε αν ο εφαρµοζόµενος χρόνος χώνευσης µε πεψίνη είναι αρκετός, χρωµατίστε την πλυµένη και χωνευµένη µε πεψίνη τοµή του ιστού µε 10 µl ιωδιούχου προπιδίου που παρέχει ο χρήστης (400 ng/ml). Τοποθετήστε πάνω από το ιωδιούχο προπίδιο µια γυάλινη καλυπτρίδα 22 mm x 22 mm και αφήστε το να απλωθεί οµοιόµορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Επωάστε επί 1 λεπτό. Χρησιµοποιήστε µικροσκόπιο φθορισµού µε διπλό φίλτρο Texas Red/FITC (βλ. Παράρτηµα 1) για να αξιολογήσετε την ερυθρά χρώση των πυρήνων µε το ιωδιούχο προπίδιο. Για να είναι αποδεκτή η χώνευση του ιστού πρέπει να υπάρχουν κόκκινοι πυρήνες µε καλά καθορισµένα όρια. Αφαιρέστε το ιωδιούχο προπίδιο εµβαπτίζοντας τις τοµές δύο φορές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) και συνεχίστε µε την Ενότητα B3, Πρωτόκολλο χρώσης, βήµα 3, Ιχνηθέτης FISH. Αν οι πυρήνες παραµένουν πράσινοι λόγω αυτοφθορισµού και δεν είναι χρωµατισµένοι κόκκινοι από το ιωδιούχο προπίδιο, είναι απαραίτητο να επαναλάβετε τον κύκλο της χώνευσης. Εµβαπτίστε τις τοµές δύο φορές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) για να αποµακρύνετε το ιωδιούχο προπίδιο. Εφαρµόστε 5-8 σταγόνες (250 µl) ψυχρού (2-8 C) Pepsin (Φιαλίδιο 2Α) για την κάλυψη του δείγµατος. Αποθηκεύετε πάντοτε το φιαλίδιο Pepsin στους 2 8 C. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στους 37 C πάνω σε προθερµασµένη θερµαντική πλάκα ή στο Dako Hybridizer. Επωάστε επί 10 λεπτά αν υπάρχει ελάχιστη ή καθόλου χώνευση. Τα 10 λεπτά είναι απλώς µια σύσταση και ο βέλτιστος χρόνος επαφίεται στην κρίση του χρήστη. Εµβαπτίστε πάλι δύο φορές αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) για να αποκρύνετε το Pepsin. Απλώστε άλλη µια φορά 10 µl ιωδιούχου προπιδίου (400 ng/ml) επί 1 λεπτό. Αξιολογήστε τη χρώση και εµβαπτίστε τις τοµές δύο φορές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Εάν είναι απαραίτητο, επαναλάβετε τον κύκλο ή συνεχίστε µε την Ενότητα B.3.α ή Β.3.β, Πρωτόκολλο χρώσης, Βήµα 3, Ιχνηθέτης FISH. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 20 εξετάσεις. Το προαιρετικό αυτό βήµα µε τη χρήση Wash Buffer και Pepsin µειώνει το συνολικό αριθµό των πιθανών εξετάσεων του κιτ. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 29/31

Βιβλιογραφία 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, 1992. 2. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; 1980. 3. Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem 2002 50:113-5. 4. Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem 1999 47:703-9. 5. Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol 1992 45:763-5. 6. Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol 2000 53:336. 7. Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol 2006 30: 892-6. 8. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; 1981. (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 30/31

Επεξήγηση συµβόλων Αριθµός καταλόγου/ κωδικός αριθµός Περιορισµοί θερµοκρασίας Αριθµός παρτίδας In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Συµβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης ιατηρείτε µακριά από τον ήλιο (συµβουλευτείτε το τµήµα "Αποθήκευση" ) Περιεχόµενο επαρκές για "ν" εξετάσεις Ηµεροµηνία λήξης Κατασκευαστής Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Παρασκευάζεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Τηλ. +45 44 85 95 00 DK-2600 Glostrup Φαξ +45 44 85 95 95 Denmark www.dako.com (128919-001) P04094GR_02_K579911-2/2015.10 σ. 31/31