HercepTest. Κωδικός K η έκδοση. Για ανοσοκυτταροχηµική χρώση. Το κιτ επαρκεί για 35 εξετάσεις (70 αντικειµενοφόροι πλάκες).

Transcript

1 HercepTest Κωδικός K η έκδοση Για ανοσοκυτταροχηµική χρώση. Το κιτ επαρκεί για 35 εξετάσεις (70 αντικειµενοφόροι πλάκες). ( ) P04085GR_01_K / σ. 1/58

2 Περιεχόµενα Σελίδα Χρήση για την οποία προορίζεται... 4 Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός... 5 Ιστορικό... 5 Χαρακτηριστικά... 5 Αρχή της διαδικασίας - Μαστός... 5 Αντιδραστήρια - Μαστός... 6 Παρεχόµενα υλικά... 6 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται... 8 Αποθήκευση - Μαστός... 8 Παρασκευή δείγµατος - Μαστός... 9 Τοµές ενσωµατωµένες σε παραφίνη... 9 Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση... 9 Προφυλάξεις - Μαστός Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Μαστός A. Προετοιµασία αντιδραστηρίων A.1 ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου A.2 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης A.3 ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) A.4 Επίχρωση A.5 Υλικό στερέωσης B. ιαδικασία χρώσης B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία B.2 Πρωτόκολλο χρώσης Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός Ερµηνεία της χρώσης - Μαστός Περιορισµοί - Μαστός Γενικοί περιορισµοί Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν Χαρακτηριστικά απόδοσης - Μαστός Ιστορικό Συγκριτικές µελέτες Σύγκριση µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής (CTA) Ακρίβεια Αναπαραγωγιµότητα Ανοσοαντιδραστικότητα Αντιµετώπιση προβληµάτων - Μαστός ( ) P04085GR_01_K / σ. 2/58

3 Περίληψη και επεξήγηση - Στόµαχος Ιστορικό Χαρακτηριστικά Αρχή της διαδικασίας - Στόµαχος Αντιδραστήρια - Στόµαχος Παρεχόµενα υλικά Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Αποθήκευση - Στόµαχος Παρασκευή δείγµατος - Στόµαχος Τοµές ενσωµατωµένες σε παραφίνη Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Προφυλάξεις - Στόµαχος Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Στόµαχος A. Προετοιµασία αντιδραστηρίων A.1 ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου A.2 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης A.3 ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) A.4 Επίχρωση A.5 Υλικό στερέωσης B. ιαδικασία χρώσης B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία B.2 Πρωτόκολλο χρώσης Έλεγχος Ποιότητας - Στόµαχος Ερµηνεία της χρώσης - Στόµαχος Περιορισµοί - Στόµαχος Γενικοί περιορισµοί Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν Χαρακτηριστικά απόδοσης - Στόµαχος Ιστορικό Αναπαραγωγιµότητα Ανοσοαντιδραστικότητα Αντιµετώπιση προβληµάτων - Στόµαχος Αναφορές Αναφορές Επεξήγηση συµβόλων ( ) P04085GR_01_K / σ. 3/58

4 Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το HercepTest είναι µια ηµι-ποσοτική ανοσοκυτταροχηµική δοκιµασία για τον καθορισµό της υπερέκθεσης της πρωτεΐνης HER2 σε καρκινικούς ιστούς του µαστού που υποβάλλονται σε επεξεργασία ρουτίνας για ιστολογική αξιολόγηση και σε ιστούς µονιµοποιηµένους µε φορµαλίνη και εγκλεισµένους σε παραφίνη από ασθενείς µε αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Το HercepTest ενδείκνυται ως επικουρικό µέσο για την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόµενο υποβολής τους σε θεραπεία µε Herceptin (trastuzumab) (βλ. ένθετο συσκευασίας του Herceptin ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ για τον καρκίνο του µαστού µόνο: Όλοι οι ασθενείς που συµµετείχαν στις κλινικές δοκιµές του Herceptin επελέγησαν µε τη βοήθεια ενός διερευνητικού ανοσοκυτταροχηµικού προσδιορισµού κλινικών δοκιµών (Clinical Trial Assay, CTA). Στις εν λόγω δοκιµές, κανείς από τους ασθενείς δεν επελέγη µε τη βοήθεια του HercepTest. Το HercepTest συγκρίθηκε µε το CTA πάνω σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δειγµάτων και διαπιστώθηκε ότι παρέχει αποτελέσµατα µε αποδεκτό βαθµό συµφωνίας. Η πραγµατική συσχέτιση των κλινικών αποτελεσµάτων του HercepTest µε εκείνα του Herceptin δεν έχει διαπιστωθεί. ΣΗΜΕΙΩΣΗ για τον καρκίνο του στοµάχου µόνο: Όλοι οι ασθενείς της µελέτης φάσης III BO18255 (ToGA) µε χορηγό τη Hoffmann-La Roche επελέγησαν µε χρήση των κιτ Dako HercepTest (IHC) και Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Η µελέτη διαπίστωσε την κλινική χρησιµότητα και των δύο εξετάσεων για την αξιολόγηση της κατάστασης του HER2 σε ασθενείς µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Το αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, αναφέρεται στο παρόν έγγραφο και ως καρκίνος του στοµάχου. Για την εφαρµογή στον καρκίνο του µαστού, ανατρέξτε στις σελίδες Για την εφαρµογή στον καρκίνο του στοµάχου, ανατρέξτε στις σελίδες Σηµαντικό: Σηµειώστε τις διαφορές ιστού καρκίνου του µαστού και ιστού καρκίνου του στοµάχου, ιδίως στις ενότητες ερµηνείας της χρώσης ( ) P04085GR_01_K / σ. 4/58

5 Καρκίνος του µαστού Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός Ιστορικό Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό και ως ERBB2 ή NEU) κωδικοποιεί µια πρωτεΐνη η οποία συχνά αναφέρεται ως πρωτεΐνη HER2 ή p185her2 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι µια τυροσινική κινάση υποδοχέα µεµβράνης µε οµολογία ως προς τον υποδοχέα παράγοντας επιδερµικής ανάπτυξης (EGFR ή HER1) (1-8). Η πρωτεΐνη HER2 είναι ένα φυσιολογικό συστατικό που εκφράζεται µε διάφορους τύπους επιθηλιακών κυττάρων (8). Σε ένα µέρος ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του µαστού, η πρωτεΐνη HER2 υπερεκφράζεται στα πλαίσια της διαδικασίας κακοήθους µεταµόρφωσης και της προόδου του όγκου (9). Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 στην επιφάνεια των κυττάρων καρκίνου του µαστού υποδεικνύει ότι θα µπορούσε να αποτελέσει στόχο ενός αντισωµατικού θεραπευτικού παράγοντα. Το Herceptin (trastuzumab) είναι ένα εξανθρωποποιηµένο µονοκλωνικό αντίσωµα (10) που συνδέεται µε υψηλή συγγένεια µε την πρωτεΐνη HER2 και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των ανθρώπινων νεοπλασµατικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 τόσο in vitro όσο και in vivo (11-13). Χαρακτηριστικά Το HercepTest αναπτύχθηκε ως εναλλακτικό του διερευνητικού CTA που εφαρµόστηκε στις κλινικές µελέτες του Herceptin. Η απόδοση του HercepTest για τον προσδιορισµό της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 αξιολογήθηκε σε ανεξάρτητη µελέτη, όπου έγινε σύγκριση των αποτελεσµάτων του HercepTest µε εκείνα του CTA πάνω σε 548 δείγµατα όγκου του µαστού, εκ των οποίων κανένα δεν ελήφθη από ασθενή που συµµετείχε στις κλινικές µελέτες του Herceptin. Τα αποτελέσµατα έδειξαν συµφωνία σε ποσοστό 79% ανάµεσα στα αποτελέσµατα των δύο προσδιορισµών πάνω σε εκείνα τα ιστικά δείγµατα. Τα δεδοµένα συµφωνίας δείχνουν επίσης ότι ένα αποτέλεσµα 3+ µε το HercepTest ήταν πολύ πιθανό να αντιστοιχεί σε θετικό αποτέλεσµα µε το CTA, γεγονός που θα πληρούσε τα κριτήρια εισαγωγής στη δοκιµή (2+ ή 3+). Τα αποτελέσµατα 2+ µε το HercepTest δεν συσχετίζονταν το ίδιο καλά µε τα αποτελέσµατα µε το CTA. Το 42% περίπου (53/126) των αποτελεσµάτων 2+ µε το HercepTest αντιστοιχούσαν σε αρνητικά αποτελέσµατα µε το CTA (0-1+), γεγονός που δεν θα επέτρεπε την εισαγωγή στις κλινικές µελέτες µε Herceptin. Το HercepTest ερµηνεύεται ως αρνητικό (ένταση χρώσης 0 και 1+), ασθενώς θετικό (ένταση χρώσης 2+) και έντονα θετικό (ένταση χρώσης 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Το HercepTest δεν προορίζεται για την παροχή προγνωστικών πληροφοριών στον ασθενή και στον ιατρό και δεν έχει επικυρωθεί για το σκοπό αυτό. Αρχή της διαδικασίας - Μαστός Το HercepTest περιέχει αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση µιας διαδικασίας δύο βηµάτων ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης για ενσωµατωµένα σε παραφίνη δείγµατα που υποβάλλονται σε αναλύσεις ρουτίνας. Μετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα κονίκλου για την ανθρώπινη πρωτεΐνη HER2, το κιτ αυτό χρησιµοποιεί ένα έτοιµο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που βασίζεται στην τεχνολογία δεξτράνης. Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται τόσο από µόρια δευτερογενούς αντιανοσοσφαιρίνης κονίκλου από αίγα όσο και από µόρια υπεροξειδάσης χρένου συνδεδεµένα µε µια κοινή κεντρική αλυσίδα πολυµερούς δεξτράνης. Με τον τρόπο αυτό, εξαλείφεται η ανάγκη αλληλοδιάδοχης εφαρµογής αντισώµατος-συνδέσµου και συζευγµένου µε υπεροξειδάση αντισώµατος. Η πιθανότητα να λάβει χώρα διασταυρούµενη αντίδραση του αντιδραστηρίου οπτικοποίησης µε τις ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες και τον ορό εµβρύου µόσχου έχει εξαλειφθεί µε απορρόφηση στερεάς φάσης. Η ενζυµατική µετατροπή της επακόλουθα προστιθέµενης χρωµογόνου ουσίας έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Στη συνέχεια, το δείγµα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί µε καλυπτρίδα. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την επικύρωση των αναλύσεων χρώσης, παρέχονται αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που περιέχουν τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Η ένταση χρώσης αυτών των κυτταρικών σειρών έχει συσχετιστεί µε τον αριθµό των υποδοχέων ανά κύτταρο. Το HercepTest, µε Κωδικό K5204, εφαρµόζεται τόσο σε µη αυτοµατοποιηµένες τεχνικές χρώσης, όσο και σε αυτοµατοποιηµένες τεχνικές χρώσης µε το όργανο Autostainer. ( ) P04085GR_01_K / σ. 5/58

6 Καρκίνος του µαστού Αντιδραστήρια - Μαστός Παρεχόµενα υλικά Τα υλικά που αναφέρονται κατωτέρω επαρκούν για 35 εξετάσεις (35 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε πρωτεύον αντίσωµα για την πρωτεΐνη HER2 και 35 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα). Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 3 σταγόνων (100 µl) από τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 1, 2, 3 και 4, καθώς και του διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) ανά τοµή ιστού. Το κιτ περιλαµβάνει υλικά που επαρκούν για 5 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης το πολύ. Αρ. φιαλιδίου Ποσότητα 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml Περιγραφή Αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης: Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, που περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ) 15 mmol/l. Αντίσωµα πρωτεΐνης HER2 ανθρώπου από κουνέλι: Έτοιµο για χρήση αντίσωµα, αποµονωµένο βάσει συγγενείας. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, µε ph 7,2, και περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Ανοσογόνο: Συνθετικό C-τελικό τµήµα (ενδοκυτταροπλασµατικό τµήµα) της πρωτεΐνης HER2, συζευγµένο σε αιµοκυανίνη πεταλίδας. Ειδικότητα: Πρωτεΐνη HER2. Μέθοδος καθαρισµού: Το αντίσωµα έχει αποµονωθεί βάσει συγγενείας µε τη βοήθεια ακινητοποιηµένου πεπτιδίου πρωτεΐνης HER2. Αντιδραστήριο οπτικοποίησης: Πολυµερές δεξτράνης συζευγµένο µε υπεροξειδάση χρένου και αποµονωµένες βάσει συγγένειας αντιανοσοσφαιρίνες κονίκλου από αίγα. Παρέχεται σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα: Τµήµα ανοσοσφαιρίνης φυσιολογικού ορού κονίκλου σε συγκέντρωση πρωτεΐνης ισοδύναµη µε εκείνη του αντισώµατος για την πρωτεΐνη HER2. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, µε ph 7,2, και περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Ρυθµισµένο υπόστρωµα DAB: Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, µε ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου < 0,1%, σταθεροποιητές, βελτιωτικά και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Χρωµογόνο DAB: Χρωµογόνο διάλυµα τετραϋδροχλωρικής 3,3'-διαµινοβενζιδίνης 5%. ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου (Containing Detergent) (10x): Ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,1 mol/l µε αντιµικροβιακό ( ) P04085GR_01_K / σ. 6/58

7 8 1 x 250 ml 5 αντικειµενοφόροι πλάκες παράγοντα. Καρκίνος του µαστού Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (10x): Ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl που περιέχει απορρυπαντικό και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα: Κάθε αντικειµενοφόρος πλάκα περιέχει τοµές τριών καθηλωµένων σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών καρκινώµατος του µαστού που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) και SK-BR-3 (3+). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα έχουν υποστεί επεξεργασία για καλύτερη πρόσφυση των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους. Τυχόν επιπρόσθετη θερµική επεξεργασία των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα µε σκοπό τη βελτίωση της πρόσφυσης των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους ενδέχεται να διακυβεύσει τα αποτελέσµατα χρώσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια, συµπεριλαµβανοµένου του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου και του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης, έχουν ειδική σύνθεση για χρήση στη συγκεκριµένη εξέταση. Για να είναι η απόδοση της εξέτασης σύµφωνη µε τις προδιαγραφές, δεν πρέπει να γίνει οποιαδήποτε αντικατάσταση, µε εξαίρεση το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης στη θέση του οποίου µπορείτε να χρησιµοποιήσετε το προϊόν µε Κωδικό S3006 της Dako. ( ) P04085GR_01_K / σ. 7/58

8 Καρκίνος του µαστού Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Απορροφητικά µαντηλάκια Υδροξείδιο του αµµωνίου, 15 mol/l αραιωµένο σε συγκέντρωση 37 mmol/l Επίχρωση: Αιµατοξυλίνη, όπως π.χ. το προϊόν υδατικής βάσης Mayer's Hematoxylin, Dako Κωδικός S3301 (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, A.4) Καλυπτρίδες Στυλό οριοθέτησης, όπως π.χ. το Dako Pen, Κωδικός S2002 Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό (νερό πλύσης) Φούρνος ξήρανσης, µε δυνατότητα διατήρησης θερµοκρασίας 60 C ή χαµηλότερη Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Θάλαµος υγρασίας (προαιρετικό) Μικροσκόπιο φωτός (µεγέθυνση 4 40x αντικειµενικού φακού) Υλικό στερέωσης, όπως π.χ. το Faramount, Κωδικός S3025 ή το Glycergel, Κωδικός C0563, της Dako Θετικοί και αρνητικοί ιστοί, για χρήση ως µάρτυρες της διαδικασίας (βλ. ενότητα περί ποιοτικού ελέγχου) Αντικειµενοφόροι πλάκες, SuperFrost Plus, πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 (βλ. ενότητα περί προετοιµασίας δειγµάτων) οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε ικανότητα χρονοµέτρησης διαστηµάτων 2 40 λεπτών) Φιάλες πλύσης Υδατόλουτρο µε καπάκι (µε δυνατότητα διατήρησης του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου στους C) Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Αποθήκευση - Μαστός Φυλάσσετε σε θερµοκρασία 2 8 C. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης, η οποία είναι σηµασµένη στο εξωτερικό της συσκευασίας. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο αυτής της συσκευασίας, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη (14a, 14b). Σηµειώνεται ότι και οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, θα πρέπει να αναλύονται υλικά θετικού και αρνητικού µάρτυρα ταυτόχρονα µε τα δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το HercepTest, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. ( ) P04085GR_01_K / σ. 8/58

9 Καρκίνος του µαστού Παρασκευή δείγµατος - Μαστός Τα δείγµατα από βιοψία πρέπει να υποβάλλονται σε κατάλληλο χειρισµό για τη συντήρηση του ιστού για ανοσοκυτταροχηµική χρώση. Για όλα τα δείγµατα, πρέπει να εφαρµόζονται οι τυπικές µέθοδοι επεξεργασίας ιστών (15). Τοµές ενσωµατωµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι ιστοί διατηρηµένοι σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη ή σε καθηλωτικό του Bouin για αναλύσεις ρουτίνας και ενσωµάτωση σε παραφίνη. Για παράδειγµα, τα δείγµατα βιοψίας πρέπει να τεµαχίζονται µέχρι πάχους 3 ή 4 mm και να καθηλώνονται επί ώρες σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη. Στη συνέχεια, οι ιστοί αφυδατώνονται σε µια σειρά αλκοολών και ξυλένιο και στη συνέχεια εµποτίζονται από τηγµένη παραφίνη θερµοκρασίας 60 C το πολύ. Οι κατάλληλα καθηλωµένοι και ενσωµατωµένοι ιστοί που εκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 διατηρούνται για απεριόριστο χρόνο πριν από την τοµή και τη στερέωση στις αντικειµενοφόρους πλάκες, όταν φυλάσσονται σε δροσερό σηµείο (15 25 C) (15, 16). Στις Η.Π.Α., σύµφωνα µε το νόµο περί βελτίωσης κλινικών εργαστηρίων του 1988, στο 42 CFR (b), προβλέπεται ότι το εργαστήριο πρέπει να φυλάσσει κεχρωσµένες αντικειµενοφόρους πλάκες επί 10 έτη τουλάχιστον, καθώς και τεµάχια δειγµάτων 2 έτη τουλάχιστον, από την ηµεροµηνία εξέτασης (16). Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους 4 5 µm, να τοποθετούνται σε αντικειµενοφόρους και να στεγνώνουν στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες (ή µέχρι να στεγνώσουν) ή στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στους 60 C για µία ώρα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η υπερβολική θέρµανση για πάνω από µία ώρα στους 60 C µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). Για τη διατήρηση της αντιγονικότητας, οι τοµές των ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine ή πυριτιωµένες), πρέπει να χρωµατίζονται εντός διαστήµατος 4 6 εβδοµάδων από τον τεµαχισµό τους όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (18). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες που απαιτούνται για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να ετοιµάζονται ταυτόχρονα. Συνιστάται ένας ελάχιστος αριθµός 5 αντικειµενοφόρων πλακών, δηλ. µία για την παρουσία όγκου, δύο για αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 (µία για επώαση µε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 2 και µία για επώαση µε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 4) και δύο εφεδρικά. Η χρήση του HercepTest σε απασβεστωµένους ιστούς δεν έχει επικυρωθεί και δεν συνιστάται. Συµβουλευθείτε το Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) (Εκπαιδευτικός οδηγός: Μέθοδοι ανοσοχηµικής χρώσης) της Dako ή τις παραποµπές 15 και 16 για περαιτέρω λεπτοµέρειες σχετικά µε την παρασκευή των δειγµάτων. Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Ειδική µέθοδος ανάκτησης επιτόπου, βρασµός σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 10 mmol/l, πρέπει να χρησιµοποιηθεί για βέλτιστη απόδοση της εξέτασης. Το ιάλυµα Ανάκτησης Επιτόπου παρέχεται στο κιτ HercepTest. Σύµφωνα µε τη µέθοδο αυτή, οι ιστικές τοµές που είναι στερεωµένες πάνω σε αντικειµενοφόρους πλάκες βυθισµένες σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 10 mmol/l (20) θερµαίνονται σε βαθµονοµηµένο υδατόλουτρο το οποίο έχει τη δυνατότητα να διατηρεί το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου στην απαιτούµενη θερµοκρασία (95 99 C). Τα εργαστήρια που βρίσκονται σε µεγαλύτερα υψόµετρα πρέπει να προσδιορίζουν την καλύτερη µέθοδο διατήρησης της απαιτούµενης θερµοκρασίας του υδατόλουτρου. Η ανάκτηση επίτοπου πρέπει να εκτελείται σε υδατόλουτρο. Έχουν δοκιµαστεί και άλλες µέθοδοι θέρµανσης, αλλά δεν δίνουν αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Αµέσως µετά από την ανάκτηση επίτοπου, αρχίστε τη διαδικασία χρώσης. Τυχόν αποκλίσεις από την περιγραφόµενη διαδικασία ενδέχεται να επηρεάσουν τα αποτελέσµατα. ( ) P04085GR_01_K / σ. 9/58

10 Προφυλάξεις - Μαστός 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. Καρκίνος του µαστού 3. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1, Αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης, περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. ιατίθεται δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού για τους επαγγελµατίες χρήστες, µετά από σχετικό αίτηµα. 4. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6, DAB Chromogen, περιέχει 5-<10% τετραχλωριούχο διφαινυλο- 3,3,4,4 -τετραϋλ-τετρα-αµµώνιο και φέρει τη σήµανση: H350 H341 P201 P280 Κίνδυνος P308 + P313 P405 P501 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. Ύποπτο για πρόκληση γενετικών ελαττωµάτων. Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανής έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. Φυλάσσεται κλειδωµένο. ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. Ως γενικός κανόνας, άτοµα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Πρέπει να δίνονται προσεκτικές οδηγίες στους χρήστες σχετικά µε τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (SDS) για επιπλέον πληροφορίες. 5. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 8, Wash Buffer (10x), περιέχει 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)- propane-1,3-diol hydrochloride και 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. Ενδέχεται να προκαλέσει αλλεργική αντίδραση. Η επισήµανση στο Wash Buffer (10x) είναι η εξής: Προσοχή H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. P264 Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 6. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό για το σχηµατισµό ιδιαίτερα εκρηκτικών συσσωρεύσεων αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (21, 22). 7. Τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 2, 3 και 4 περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 8. Πρέπει να τα µεταχειρίζεστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες των µαρτύρων και τα δείγµατα, τόσο πριν όσο και µετά τη µονιµοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ( ) P04085GR_01_K / σ. 10/58

11 Καρκίνος του µαστού ως δυνητικά µολυσµατικά και να τα απορρίπτετε µε τις δέουσες προφυλάξεις (23). Μην αναρροφάτε µε πιπέτα τα αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε αντιδραστήρια και δείγµατα. Εάν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή µε ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε µε άφθονες ποσότητες νερού. 9. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων, για να αποτρέψετε τυχόν µη ειδική χρώση. 10. Τυχόν εφαρµογή χρόνων, θερµοκρασιών ή µεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνων που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα. Η υπερβολική ξήρανση στους 60 C για πάνω από µία ώρα µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). 11. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει µείωση της αντιγονικής χρώσης. 12. Όλα τα αντιδραστήρια, συµπεριλαµβανοµένου του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου και του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης, έχουν ειδική σύνθεση για χρήση στη συγκεκριµένη εξέταση. Για να είναι η απόδοση της εξέτασης σύµφωνη µε τις προδιαγραφές, δεν πρέπει να γίνει οποιαδήποτε αντικατάσταση, µε εξαίρεση το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης στη θέση του οποίου µπορείτε να χρησιµοποιήσετε το προϊόν µε Κωδικό S Το αντιδραστήριο οπτικοποίησης και το χρωµογόνο DAB ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς, εάν εκτεθούν σε υπερβολικό φως. Μη φυλάσσετε τα µέρη του συστήµατος και µην εκτελείτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άµεσο ηλιακό φως. 14. Φοράτε κατάλληλο ατοµικό προστατευτικό εξοπλισµό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. Για επιπλέον πληροφορίες, ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (SDS). 15. Τα υπολείµµατα παραφίνης µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσµατα. 16. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώµενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. Εάν η περικλειόµενη τοµή ιστού δεν καλυφθεί εντελώς µε τις 3 σταγόνες (100 µl) του αντιδραστηρίου, πρέπει να προστεθούν ακόµα 3 σταγόνες. ( ) P04085GR_01_K / σ. 11/58

12 Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Μαστός A. Προετοιµασία αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: Καρκίνος του µαστού A.1 ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου Αραιώστε επαρκή ποσότητα από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 7 ( ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου 10x) σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για την προγραµµατισµένη διαδικασία χρώσης. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.2 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 8 (Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης 10x) σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για τα βήµατα πλύσης. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Εάν το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Για έκπλυση µετά από την επώαση µε το αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης, το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου και αιµατοξυλίνη, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Για όλα τα άλλα στάδια έκπλυσης, απαιτείται χρήση του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. A.3 ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) Με τη διαδικασία που ακολουθεί, παρασκευάζεται 1 ml διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου. Κάθε κλάσµα του 1 ml επαρκεί για 10 ιστικές τοµές. Βήµα 1: Βήµα 2: Μεταφέρετε 1 ml ρυθµισµένου υποστρώµατος DAB από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 5 σε ένα δοκιµαστικό σωλήνα. Προσθέστε µία σταγόνα (25 30 µl) χρωµογόνου DAB από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. Αναµείξτε και εφαρµόστε στις ιστικές τοµές µε µια πιπέτα. Το παρασκευασµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) παραµένει σταθερό επί 5 ηµέρες περίπου, όταν φυλάσσεται στους 2 8 C. Το διάλυµα αυτό πρέπει να αναµειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζηµα που έχει σχηµατιστεί στο διάλυµα δεν επηρεάζει δυσµενώς την ποιότητα της χρώσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το χρωµογόνο DAB στο φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6 ενδέχεται να ποικίλλει ως προς το χρώµα από τελείως άχρωµο έως ανοικτό ιώδες-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει δυσµενώς την απόδοση του προϊόντος αυτού. Η αραίωση πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε αυτό το ένθετο συσκευασίας. Τυχόν προσθήκη περίσσειας χρωµογόνου DAB στο ρυθµισµένο υπόστρωµα DAB θα έχει ως αποτέλεσµα την αλλοίωση του θετικού σήµατος. A.4 Επίχρωση Το έγχρωµο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης DAB διαλύεται στην αλκοόλη και το νερό. Εφαρµόστε επίχρωση αιµατοξυλίνης και προσαρµόστε την ένταση χρώσης της αιµατοξυλίνης σε επίπεδο παρόµοιο µε εκείνο που απεικονίζεται στο έγγραφο HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Εγχειρίδιο ερµηνειών HercepTest Καρκίνος του µαστού) της Dako. Είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί αιµατοξυλίνη είτε αλκοολικής είτε υδατικής βάσης, όπως π.χ. το Dako Mayer's Hematoxylin, Κωδικός S3301. Αµέσως µετά την επίχρωση αιµατοξυλίνης, εκπλύντε σχολαστικά µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό και κατόπιν βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες µε τους ιστούς σε λουτρό υδατικού διαλύµατος αµµωνίας 37 mmol/l (βλ. ενότητα B.2, βήµα 6). Το υδατικό διάλυµα αµµωνίας (37 mmol/l) παρασκευάζεται µε ανάµειξη 2,5 ml (συµπυκνωµένου) διαλύµατος υδροξειδίου του αµµωνίου 15 mol/l µε 1 L απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού. Τυχόν µη χρησιµοποιηµένο υδατικό διάλυµα αµµωνίας 37 mmol/l είναι δυνατό να φυλαχθεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) σε ερµητικά πωµατισµένη φιάλη επί 12 µήνες το πολύ. ( ) P04085GR_01_K / σ. 12/58

13 Καρκίνος του µαστού A.5 Υλικό στερέωσης Συνιστάται η χρήση µη υδατικού υλικού µόνιµης στερέωσης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Για την υδατική στερέωση, συνιστάται η χρήση του Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Κωδικός S3025, ή του Glycergel Mounting Medium, Κωδικός C0563, της Dako. Υγροποιήστε το Glycergel µε θέρµανση στους 40 (±5) C περίπου, πριν από τη χρήση. B. ιαδικασία χρώσης B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπήσουν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) πριν από την ανοσοχρώση. Με παρόµοιο τρόπο, όλες οι επωάσεις πρέπει να εκτελεστούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Μην επιτρέπετε το στέγνωµα των ιστικών τοµών κατά τη διαδικασία χρώσης. Οι στεγνωµένες ιστικές τοµές ενδέχεται να εµφανίζουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Καλύπτετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες που είναι εκτεθειµένες σε ρεύµατα αέρα. Σε περίπτωση εφαρµογής παρατεταµένων επωάσεων, τοποθετείτε τους ιστούς σε υγρό περιβάλλον. Εάν χρειαστεί να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να φυλαχτούν σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος µετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα (βήµα 3) επί 1 ώρα το πολύ σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί δυσµενώς η απόδοση της χρώσης. Αποπαραφίνωση και επανενυδάτωση: Πριν από τη χρώση, πρέπει να αφαιρεθεί η παραφίνη από τις αντικειµενοφόρους πλάκες ιστών για την αποµάκρυνση του υλικού ενσωµάτωσης. Στη συνέχεια, οι πλάκες πρέπει να επανυδατωθούν. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Το υπολειµµατικό µέσο ενσωµάτωσης θα έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 2. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απόλυτη αιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε 95% αιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό επί 30 δευτερόλεπτα τουλάχιστον. Αρχίστε τη διαδικασία χρώσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα B.2, βήµα 1, Ανάκτηση επίτοπου. Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αντικαθίστανται κάθε 40 αντικειµενοφόρους πλάκες. Αντί ξυλενίου, είναι δυνατή η χρήση υποκατάστατων τολουενίου ή ξυλενίου, όπως π.χ. το Histoclear. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να καταστήσει τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού µη έγκυρα για χρήση στην επιλογή ασθενών για θεραπεία µε Herceptin. B.2 Πρωτόκολλο χρώσης Εκτέλεση σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Βήµα 1: Ανάκτηση επίτοπου ( ) P04085GR_01_K / σ. 13/58

14 Καρκίνος του µαστού Πληρώστε τα δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης µε το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου στους C. Με τη θέρµανση, το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση. Βάλτε τα καπάκια στα δοχεία, για σταθεροποίηση της θερµοκρασίας και την αποτροπή τυχόν εξάτµισης. Βυθίστε τις τοµές, από τις οποίες έχετε αφαιρέσει την παραφίνη και οι οποίες βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου, στο προθερµασµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου των δοχείων χρώσης. ΕΠΑΝΑΘΕΡΜΑΝΕΤΕ ΤΟ Υ ΑΤΟΛΟΥΤΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΙΑΛΥΜΑ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΕΠΙΤΟΠΟΥ ΣΤΟΥΣ C. Επωάστε επί 40 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία C. Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να κρυώσουν µέσα στο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου επί 20 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αποχύστε το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου και εκπλύντε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Για τη βέλτιστη απόδοση, εµποτίστε τις τοµές σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 5 20 λεπτά µετά την ανάκτηση του επίτοπου και πριν τη χρώση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου είναι σχεδιασµένο για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Βήµα 2: Αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος. Με τη βοήθεια απορροφητικού υλικού που δεν αφήνει χνούδι (όπως π.χ. Kimwipe ή ένα επίθεµα γάζας), καθαρίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για να αποµακρύνετε τυχόν αποµένον υγρό και να περιορίσετε τα αντιδραστήρια εντός της προδιαγεγραµµένης περιοχής. Κυκλώστε την ιστική τοµή µε ένα στυλό Dako Pen. Προσθέστε 3 σταγόνες (100 µl) αντιδραστηρίου αποκλεισµού της υπεροξειδάσης µε τρόπο ώστε να καλυφθεί το δείγµα. Επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Ξεπλύνατε απαλά µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης από υδροβολέα (χωρίς να κατευθύνετε τη ροή απ' ευθείας πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε τις τοµές µέσα σε λουτρό φρέσκου ρυθµιστικού διαλύµατος. Βήµα 3: Πρωτεύον αντίσωµα ή αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Καλύψτε το δείγµα µε 3 σταγόνες (100 µl) αντισώµατος πρωτεΐνης HER2 ή αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνατε απαλά µε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης από υδροβολέα (χωρίς να κατευθύνετε τη ροή απ' ευθείας πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε τις τοµές µέσα σε λουτρό φρέσκου ρυθµιστικού διαλύµατος. Εάν χρειαστεί να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να φυλαχτούν µέσα σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης µετά από το βήµα 3 επί 1 ώρα το πολύ σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί δυσµενώς η απόδοση της χρώσης. Βήµα 4: Αντιδραστήριο οπτικοποίησης Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. ( ) P04085GR_01_K / σ. 14/58

15 Καλύψτε το δείγµα µε 3 σταγόνες (100 µl) αντιδραστηρίου οπτικοποίησης. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Πλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως περιγράφεται στο βήµα 3. Βήµα 5: ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Καρκίνος του µαστού Καλύψτε το δείγµα µε 3 σταγόνες (100 µl) διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB). Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά. Ξεπλύνατε απαλά µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό από υδροβολέα (χωρίς να κατευθύνετε τη ροή απευθείας επάνω στον ιστό). Συλλέξτε το χρησιµοποιηµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) σε δοχείο επικίνδυνων υλικών προς διάθεση µε τον κατάλληλο τρόπο. Βήµα 6: Επίχρωση (οι οδηγίες αφορούν την αιµατοξυλίνη) Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό αιµατοξυλίνης. Επωάστε επί 2 5 λεπτά, ανάλογα µε την ισχύ της χρησιµοποιούµενης αιµατοξυλίνης. Ξεπλύντε απαλά σε λουτρό απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού. Βεβαιωθείτε ότι έχει αποµακρυνθεί κάθε ίχνος αποµένουσας αιµατοξυλίνης. Προαιρετικό: Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες 10 φορές σε λουτρό υδατικού διαλύµατος αµµωνίας 37 mmol/l (βλ. ενότητα A.4). Ξεπλύντε απαλά τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού επί 2 5 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανάλογα µε τη διάρκεια επώασης και τη δραστικότητα της χρησιµοποιούµενης αιµατοξυλίνης, η επίχρωση θα δώσει ένα χλωµό έως σκούρο µπλε χρωµατισµό των κυτταρικών πυρήνων. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. Βήµα 7: Στερέωση Συνιστάται η χρήση µη υδατικού υλικού µόνιµης στερέωσης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Τα δείγµατα είναι δυνατό να στερεωθούν πάνω στις αντικειµενοφόρους πλάκες και να καλυφθούν µε καλυπτρίδες µε ένα υλικό στερέωσης υδατικής βάσης όπως π.χ. το Faramount, Κωδικός S3025 ή το Glycergel, Κωδικός C0563, της Dako. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ανάγνωση των αντικειµενοφόρων πλακών είναι δυνατό να γίνει σε βολικό για σας χρόνο. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες έχουν καλυφθεί µε καλυπτρίδα µε χρήση υδατικού υλικού στερέωσης και εκτεθούν σε έντονο φως επί χρονικό διάστηµα µίας εβδοµάδας, ενδέχεται να λάβει χώρα ξεθώριασµα σε κάποιο βαθµό. Για την ελαχιστοποίηση του ξεθωριάσµατος, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). ( ) P04085GR_01_K / σ. 15/58

16 Καρκίνος του µαστού Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός Τυχόν διαφορές στην καθήλωση, την επεξεργασία και την ενσωµάτωση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να οδηγήσει σε σηµαντική διακύµανση των αποτελεσµάτων, τέτοια που να χρειάζεται η τακτική εκτέλεση εσωτερικών ελέγχων εκτός των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα που παρέχονται από την Dako. Στις Η.Π.Α., για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP), την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (24) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS) και τη βιβλιογραφική αναφορά 25. Πίνακας 1. Σκοπός του καθηµερινού ποιοτικού ελέγχου. Ιστός: καθηλωµένος και επεξεργασµένος όπως τα δείγµατα ασθενών Ειδικό αντίσωµα και δευτερεύον αντίσωµα Μη ειδικό αντίσωµα* ή ρυθµιστικό διάλυµα συν το ίδιο δευτερεύον αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε µαζί µε το ειδικό αντίσωµα Θετικός µάρτυρας: Ιστός ή κύτταρα που περιέχουν το αντιγόνο-στόχος προς ανίχνευση (είναι δυνατό να βρίσκεται στον ιστό ασθενούς). Ο ιδανικός µάρτυρας είναι ασθενώς θετικός ιστός χρώσης, επειδή αυτός είναι ο πλέον ευαίσθητος στη διάσπαση αντισώµατος ή αντιγόνου Ελέγχει όλα τα στάδια της ανάλυσης. Επικυρώνει τα χρησιµοποιούµενα αντιδραστήρια και τις διαδικασίες που εφαρµόζονται για τη χρώση πρωτεΐνης HER2 Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Αρνητικός µάρτυρας: Ιστοί ή κύτταρα που αναµένονται να είναι αρνητικοί (είναι δυνατό να βρίσκονται στον ιστό ασθενούς ή στον ιστό θετικού µάρτυρα) Ανίχνευση µη επιδιωκόµενης διασταυρούµενης αντίδρασης αντισώµατος µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Ιστός ασθενούς Ανίχνευση ειδικής χρώσης φόντου Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Αντικειµενοφόρος πλάκα που παρέχεται από την Dako Ελέγχει µόνον τη διαδικασία χρώσης * Ορός από τα ίδια είδη µε το ειδικό αντίσωµα, αλλά µη κατευθυνόµενος ενάντια του ίδιου αντιγόνου-στόχο. Για την ανίχνευση µη ειδικής σύνδεσης αντιγόνου, π.χ. δέσµευση του τµήµατος Fc του αντιγόνου από τον ιστό. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (παρέχεται): Καθεµιά από τις παρεχόµενες αντικειµενοφόρους πλάκες µάρτυρα περιέχει τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, σε µορφή ιζήµατος, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, µία αντικειµενοφόρος πλάκα πρέπει να υποβάλλεται σε χρώση. Με την αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα που παρέχεται από την Dako υποδεικνύεται η εγκυρότητα της ανάλυσης χρώσης. Ιστός θετικού µάρτυρα: Οι µάρτυρες πρέπει να είναι νωπά δείγµατα αυτοψίας, βιοψίας ή χειρουργικά, τα οποία έχουν υποβληθεί σε καθήλωση, επεξεργασία και ενσωµάτωση στον ελάχιστο δυνατό χρόνο και µε τον ίδιο τρόπο όπως και το(α) δείγµα(τα) ασθενών. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα υποδεικνύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών και των τεχνικών χρώσης. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, πρέπει να περιλαµβάνεται ένας ιστός θετικού µάρτυρα για κάθε σύνολο συνθηκών εξέτασης. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα πρέπει να δίνουν ασθενώς θετική χρώση, προκειµένου να επιτρέπουν την ανίχνευση ακόµη και ανεπαίσθητων µεταβολών της ευαισθησίας του πρωτεύοντος αντισώµατος. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που παρέχονται µαζί µε το κιτ αυτό ή τυχόν δείγµατα που υποβάλλονται σε επεξεργασία διαφορετική από το(α) δείγµα(τα) ασθενών επικυρώνουν µόνον την απόδοση των αντιδραστηρίων και δεν επαληθεύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών. Ως ιδανικό ιστό θετικού µάρτυρα, χρησιµοποιήστε ανθρώπινο ιστό διηθητικού καρκινώµατος του µαστού που παρουσιάζει υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, ο οποίος έχει υποβληθεί στο παρελθόν σε προσδιορισµό και έχει δώσει αποτέλεσµα 2+. ( ) P04085GR_01_K / σ. 16/58

17 Καρκίνος του µαστού ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Γνωστός ιστός θετικού µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνον για λόγους παρακολούθησης της ορθής απόδοσης των επεξεργασµένων ιστών και των αντιδραστηρίων εξέτασης και ΟΧΙ ως επικουρικό µέσο διατύπωσης ειδικής διάγνωσης δειγµάτων ασθενών. Εάν ο ιστός θετικού µάρτυρα δεν παρουσιάζει ορθή θετική χρώση, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. Ιστός αρνητικού µάρτυρα: Χρησιµοποιήστε ιστό αρνητικού µάρτυρα (γνωστού ως αρνητικού στην πρωτεΐνη HER2), καθηλωµένο, επεξεργασµένο και ενσωµατωµένο µε τρόπο πανοµοιότυπο µε το(α) δείγµα(τα) ασθενών, σε κάθε ανάλυση χρώσης για επαλήθευση της ειδικότητας του πρωτεύοντος αντισώµατος και την παροχή ένδειξης ειδικής χρώσης φόντου. Κατάλληλος για χρήση ως ιστός αρνητικού µάρτυρα είναι ιστός του κόλου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς. Η ποικιλία διαφορετικών τύπων κυττάρων, που υπάρχει στις περισσότερες ιστικές τοµές, προσφέρει εσωτερικές θέσεις αρνητικού µάρτυρα (αυτό θα πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη). Φυσιολογικοί πόροι µαστού είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ως εσωτερικοί αρνητικοί µάρτυρες. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα ή στον ιστό εσωτερικού αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών θα πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα και η εξέταση πρέπει να επανεκτελεστεί. Μη ειδικό αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα: Χρησιµοποιήστε το παρεχόµενο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα αντί του πρωτεύοντος αντισώµατος, σε µια τοµή από κάθε δείγµα ασθενούς, για την αξιολόγηση µη ειδικής χρώσης και τη διευκόλυνση της ερµηνείας της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να αντιστοιχεί σε εκείνη του πρωτεύοντος αντισώµατος. Επαλήθευση προσδιορισµού: Πριν από την αρχική χρήση ενός αντισώµατος ή συστήµατος χρώσης σε µια διαγνωστική διαδικασία, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύει την ειδικότητα του αντισώµατος υποβάλλοντάς το σε εξέταση σε µια σειρά εργαστηριακών ιστών µε γνωστά ανοσοκυτταροχηµικά χαρακτηριστικά απόδοσης που αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκαν παραπάνω στην ενότητα αυτή του ένθετου προϊόντος και στις απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP) ή/και την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (24) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS). Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαµβάνονται για κάθε νέα παρτίδα αντισώµατος ή σε κάθε περίπτωση µεταβολής των παραµέτρων του προσδιορισµού. Καρκινώµατα του µαστού µε γνωστή ένταση χρώσης πρωτεΐνης HER2 που κυµαίνεται µεταξύ 0 και 3+, καθώς και αρνητικοί ιστοί, π.χ. του κόλου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς, είναι κατάλληλοι για την επαλήθευση του προσδιορισµού. Ερµηνεία της χρώσης - Μαστός Για τον προσδιορισµό της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2, µόνον η ένταση και το σχήµα χρώσης της µεµβράνης πρέπει να αξιολογούνται µε την κλίµακα του Πίνακα 2. Η αξιολόγηση των αντικειµενοφόρων πλακών πρέπει να εκτελείται από παθολόγο µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την αξιολόγηση της ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης και βαθµολογίας, κρίνεται κατάλληλη η χρήση αντικειµενικού φακού µεγέθυνσης 10x. Η χρήση µεγέθυνσης 20 40x στον αντικειµενικό φακό είναι χρήσιµη για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος πρέπει να θεωρείται ως µη ειδική χρώση και δεν πρέπει να περιλαµβάνεται στην αξιολόγηση της έντασης χρώσης της µεµβράνης (8). Προς διευκόλυνση της διάκρισης ανάµεσα στις χρώσεις έντασης 0, 1+, 2+ και 3+, ανατρέξτε στο έγγραφο HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Εγχειρίδιο ερµηνειών HercepTest - Καρκίνος του µαστού) της Dako, όπου περιλαµβάνονται αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες διαφόρων εντάσεων χρώσης. Μόνο δείγµατα από ασθενείς που πάσχουν από διηθητικό καρκίνωµα του µαστού πρέπει να βαθµολογούνται. Σε περιπτώσεις µε καρκίνωµα in situ και διηθητικό καρκίνωµα στο ίδιο δείγµα, µόνον το διηθητικό συστατικό πρέπει να βαθµολογείται. Πίνακας 2. Κριτήρια έντασης χρώσης της κυτταρικής µεµβράνης. ( ) P04085GR_01_K / σ. 17/58

18 Καρκίνος του µαστού Σχήµα χρώσης Βαθµολογία (να αναφερθεί στο θεράποντα ιατρό) Πρωτεΐνη HER2. Υπερέκφραση Αξιολόγηση (να αναφερθεί στο θεράποντα ιατρό) εν παρατηρείται καµία χρώση ή παρατηρείται χρώση µεµβράνης σε λιγότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου 0 Αρνητικό Παρατηρείται ελαφριά, µόλις και µετά βίας αντιληπτή χρώση µεµβράνης σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου. Η χρώση των κυττάρων λαµβάνει χώρα µόνο σε ένα µέρος της µεµβράνης τους 1+ Αρνητικό Παρατηρείται ασθενής έως µέτρια πλήρης χρώση µεµβράνης σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου Παρατηρείται έντονη πλήρης χρώση µεµβράνης σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου Ασθενώς θετικό Έντονα θετικό Το HercepTest ερµηνεύεται ως αρνητικό (ένταση χρώσης 0 και 1+), ασθενώς θετικό (ένταση χρώσης 2+) και έντονα θετικό (ένταση χρώσης 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Το HercepTest δεν προορίζεται για την παροχή προγνωστικών πληροφοριών στον ασθενή και στον ιατρό και δεν έχει επικυρωθεί για το σκοπό αυτό. Για κάθε ανάλυση χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να εξετάζονται µε τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 3 για τον προσδιορισµό της εγκυρότητας της ανάλυσης χρώσης και την ηµιποσοτική αξιολόγηση της έντασης χρώσης στον ιστό του δείγµατος. ( ) P04085GR_01_K / σ. 18/58

19 Καρκίνος του µαστού Πίνακας 3. Σειρά αξιολόγησης των αντικειµενοφόρων πλακών. Σειρά αξιολόγησης των αντικειµενοφόρων πλακών Αιτιολογία 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που περιέχει τις τρεις κυτταρικές σειρές Η παρουσία καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης (περιφερειακή χρώση) 3+ στο 3+ Control Cell Line SK-BR-3, µερικώς καφέ περιφερειακή χρώση στο 1+ Control Cell Line MDA-175 και καµία χρώση στο 0 Control Cell Line MDA-231 υποδεικνύουν έναν έγκυρο προσδιορισµό. Παρουσία στικτής και ασυνεχούς χρώσης µεµβράνης σε µικρό έως µέτριο αριθµό των κυττάρων του ασθενώς θετικού 1+ Control Cell Line MDA-175. Επίσης, δυνατότητα παρατήρησης ανοσοχρώσης σε µορφή κουκκίδων στην περιοχή Golgi του κυτταροπλάσµατος σε αυτήν την κυτταρική σειρά. Παρουσία καφέ χρώσης στο 0 Control Cell Line MDA-231 (αρνητικό για χρώση πρωτεΐνης HER2) υποδεικνύει ότι έλαβε χώρα µη ειδική χρώση κατά τον προσδιορισµό. Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού ενδέχεται να µην είναι έγκυρα λόγω υπερβολικής χρώσης. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης µεµβράνης. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών δεν πρέπει να υπερβαίνει το Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα Η ΑΠΟΥΣΙΑ ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση µεµβράνης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. 4. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Αντιδραστήρια 5. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το πρωτεύον αντίσωµα Απουσία ειδικής χρώσης µεµβράνης επαληθεύει την ειδική σήµανση του αντιγόνου-στόχου από το πρωτεύον αντίσωµα. Λοιπές καστανόχρυσες ή καφέ χρώσεις που λαµβάνουν χώρα στο κυτταρόπλασµα του δείγµατος που έχει υποστεί επεξεργασία µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα, όπως π.χ. σε συνδετικό ιστό, λευκοκύτταρα, ερυθροκύτταρα ή νεκρωτικό ιστό, πρέπει να θεωρούνται ως µη ειδική χρώση φόντου και πρέπει να αναφέρονται κάτω στην ενότητα σχολίων του υπολογιστικού φύλλου δεδοµένων. Όταν ανιχνεύεται υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 στο δείγµα, αυτή εµφανίζεται ως καφέ περιφερειακή χρώση εντοπισµένη στην κυτταρική µεµβράνη των κυττάρων του όγκου που έχουν υποστεί επεξεργασία µε το πρωτεύον αντίσωµα. 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (παρέχεται): Η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που είναι κεχρωσµένη µε HercepTest, πρέπει να εξετάζεται πρώτη προς επιβεβαίωση ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν κανονικά. Η παρουσία καφέ προϊόντος αντίδρασης (3,3 -διαµινοβενζιδίνη, DAB) στην κυτταρική µεµβράνη υποδεικνύει θετική αντιδραστικότητα. Η παρουσία καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης (περιφερειακή χρώση) στο 3+ Control Cell Line SK-BR-3, µερικώς καφέ περιφερειακή χρώση στο 1+ Control Cell Line MDA-175 και καµία χρώση στο 0 Control Cell Line MDA-231 υποδεικνύουν έναν έγκυρο προσδιορισµό. Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα δεν πληρούν τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα: Αµέσως, µετά πρέπει να εξεταστεί η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό θετικού µάρτυρα. Αυτή η αντικειµενοφόρος πλάκα επαληθεύει ότι η µέθοδος καθήλωσης και η διαδικασία ανάκτησης επίτοπου είναι αποτελεσµατικές. Χρησιµοποιείτε άθικτα κύτταρα για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα συχνά παρουσιάζουν µη ειδική χρώση (26). Η χρώση πρέπει να παρατηρείται στον ιστό του όγκου µε τη µορφή καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης. Η καφέ ( ) P04085GR_01_K / σ. 19/58

20 Καρκίνος του µαστού χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών στο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει τη βαθµολογία έντασης χρώσης του Ιστός αρνητικού µάρτυρα: Η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό αρνητικού µάρτυρα πρέπει να εξεταστεί αµέσως µετά, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήµανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτεύον αντίσωµα. Η απουσία ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Εναλλακτικά, µπορείτε να χρησιµοποιήσετε αρνητικά µέρη του ιστού θετικού µάρτυρα ως ιστό αρνητικού µάρτυρα, αλλά αυτό πρέπει να επαληθευτεί από το χρήστη. Σηµειώνεται ότι είναι δυνατό να παρατηρηθεί ασθενής αντίδραση (ένταση χρώσης 0-1+) στους περισσότερους φυσιολογικούς επιθηλιακούς ιστούς. Στους πιθανούς ιστούς αρνητικού µάρτυρα περιλαµβάνονται ιστοί από τα παρακάτω σηµεία: κόλον, ήπαρ και θυρεοειδής. Η µη ειδική χρώση, εάν υπάρχει, θα έχει διάχυτη όψη. Ενδέχεται επίσης να παρατηρηθεί σποραδική χρώση συνδετικού ιστού σε τοµές από ιστούς υπερβολικά καθηλωµένους σε φορµαλίνη Ιστός ασθενή: Τελευταία εξετάζονται τα δείγµατα ασθενών, που είναι κεχρωσµένα µε HercepTest. Θα πρέπει να διαπιστωθεί θετική χρώση, ενδεχοµένως εντός µη ειδικής χρώσης φόντου του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Όπως συµβαίνει µε κάθε ανοσοκυτταροχηµική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα ή στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισµό. Για πιο συγκεκριµένες πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοδραστικότητα του HercepTest, ανατρέξτε στις ενότητες Περίληψη και επεξήγηση, Περιορισµοί και Χαρακτηριστικά απόδοσης. Πρόσθετες συστάσεις για την ερµηνεία χρώσης HercepTest Τα περισσότερα µεταστατικά καρκινώµατα του µαστού που υποβάλλονται σε εξέταση υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 βαθµολογούνται στην κλίµακα 0 έως 3+. Παρ' ότι η πλειοψηφία των περιπτώσεων αυτών είναι πέραν πάσης αµφιβολίας, ένα µικρό ποσοστό των υπόλοιπων δειγµάτων 1+ και 2+ ενδέχεται να παρουσιάζει µεγαλύτερη δυσκολία στην ερµηνεία. Για την ερµηνεία της χρώσης HercepTest στο εργαστήριό σας, εφαρµόστε τις παρακάτω κατευθυντήριες οδηγίες. Για να επαληθεύσετε την απόδοση του προσδιορισµού, αξιολογήστε τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα. Αξιολογήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες θετικού και αρνητικού µάρτυρα. Για την πρώτη αξιολόγηση, συνιστάται χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγµατος. (Ο όγκος ενδέχεται να µην είναι εµφανής όταν παρατηρείτε το κεχρωσµένο µε HercepTest δείγµα. Η κεχρωσµένη µε H&E αντικειµενοφόρος πλάκα απαιτείται για να επιτρέψει στον παθολόγο να εντοπίσει την παρουσία του όγκου.). Το HercepTest πρέπει να διεξάγεται σε τοµές κατά ζεύγη (σειριακές τοµές) από το ίδιο µπλοκ παραφίνης του δείγµατος. Αξιολογήστε πρώτα τις κεχρωσµένες για υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 τοµές χαµηλής βαθµολογίας. Η πλειοψηφία των θετικών περιπτώσεων θα είναι προφανής σε µικρή µεγέθυνση. Πρέπει να χρησιµοποιηθούν οι καλοδιατηρηµένες και καλά κεχρωσµένες περιοχές του δείγµατος, για τον εντοπισµό των επί τοις εκατό θετικών κυττάρων όγκου. Γενικά, η βαθµολογία των περιπτώσεων θα πρέπει να είναι προφανής σε µικρή µεγέθυνση. Εάν η διάκριση µεταξύ των οριακών περιπτώσεων 1+/2+ είναι δύσκολη σε µικρή µεγέθυνση, η βαθµολογία συνήθως είναι 1+. Για να επαληθεύσετε τη χρώση µεµβράνης, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 20 40x. Εάν η πλειοψηφία των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία χρώσης είναι είτε 2+ είτε 3+. Για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 20 40x. ( ) P04085GR_01_K / σ. 20/58

21 Καρκίνος του µαστού Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων 3+, ένα 80% τουλάχιστον των κυττάρων του όγκου είναι κεχρωσµένα και η χρώση µεµβράνης είναι έντονη. Εάν το δείγµα είναι κοντά στο όριο του 10% θετικών κυττάρων του όγκου, συνιστάται η καταµέτρηση 100 κυττάρων του όγκου κατ' ελάχιστον για τον προσδιορισµό του επί τοις εκατό ποσοστού των κεχρωσµένων κυττάρων. Εάν διαπιστωθεί πλήρης χρώση µεµβράνης ασθενούς έως µέτριας έντασης σε ποσοστό µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος είναι 2+. Αυτό συνοδεύεται συνήθως µε ατελή χρώση µεµβράνης για την πλειοψηφία των υπόλοιπων κυττάρων του όγκου. Εάν λιγότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη περιφερειακή χρώση µεµβράνης, παρ' ότι άλλα κύτταρα του όγκου ενδέχεται να παρουσιάζουν ατελή χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία είναι 1+. Εάν λιγότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη ή ατελή περιφερειακή χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία είναι 0. Περιορισµοί - Μαστός Γενικοί περιορισµοί 1. Η ανοσοκυτταροχηµεία είναι µια πολυβάθµια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, καθήλωση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιµασία της αντικειµενοφόρου πλάκας ανοσοκυτταροχηµείας και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης. 2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρµανση, τοµή ή µόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήµατα, παγίδευση αντισώµατος ή εσφαλµένως αρνητικά αποτελέσµατα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και ενσωµάτωσης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. 4. Η κλινική ερµηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της µορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερµηνεία οποιασδήποτε χρώσης ή η απουσία της πρέπει να συµπληρώνεται από µορφολογικές µελέτες και κατάλληλους ελέγχους, καθώς και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερµηνεία του κεχρωσµένου παρασκευάσµατος αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευµένου παθολόγου, που είναι εξοικειωµένος µε τα χρησιµοποιούµενα αντισώµατα και αντιδραστήρια και τις εφαρµοζόµενες µεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρµόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσµένων αντικειµενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών µαρτύρων. 5. Ιστοί από άτοµα µολυσµένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου (27). 6. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να προκαλέσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που δεν έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις ακόµη και σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσµατα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς (28). Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τεκµηριωµένες απροσδόκητες αντιδράσεις, απευθυνθείτε στο τµήµα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της Dako. 7. Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω µη ανοσολογικής δέσµευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώµατος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν ( ) P04085GR_01_K / σ. 21/58

22 Καρκίνος του µαστού από δραστηριότητα ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωµα C) (28). 8. Η διαδικασία χρώσης πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος C. Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν 1. Το αντιγόνο που υπάρχει στο 1+ Control Cell Line MDA-175 υπόκειται σε αποδόµηση µε την πάροδο του χρόνου. Αξιολογείτε τα αποτελέσµατα της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα σε συνδυασµό µε την ηµεροµηνία λήξης της. Τυχόν αρνητική χρώση των κυττάρων του MDA-175 υποδεικνύει µόνον ότι η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα ενδέχεται να έχει αλλοιωθεί. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. 2. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόµηση του αντιγόνου στους ιστούς µε την πάροδο του χρόνου. Τα δείγµατα πρέπει να υποβάλλονται σε χρώση εντός 4 6 εβδοµάδων από τη στερέωση των ιστών πάνω στις αντικειµενοφόρους πλάκες όταν φυλάσσονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (29). 3. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα, για την πρωτεΐνη HER2 απαιτείται θερµικά επαγόµενη ανάκτηση επίτοπου, όταν οι ιστοί καθηλώνονται (σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη ή σε καθηλωτικό του Bouin) και ενσωµατώνονται σε παραφίνη στα πλαίσια διαδικασιών ρουτίνας. Αυτή η προκατεργασία πρέπει να ολοκληρώνεται στην αρχή ολόκληρης της διαδικασίας χρώσης. Για οδηγίες, ανατρέξτε στην ενότητα Προετοιµασία δειγµάτων, υποενότητα Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση. 4. Η θερµικά επαγόµενη ανάκτηση επιτόπου της πρωτεΐνης HER2 πρέπει να εκτελείται µόνο µε βαθµονοµηµένο υδατόλουτρο. Έχουν δοκιµαστεί και άλλες µέθοδοι θέρµανσης, αλλά δεν δίνουν αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. 5. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια του κιτ µε αντιδραστήρια άλλων αριθµών παρτίδας ή άλλων κατασκευαστών. Εξαιρείται µόνον το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης, το οποίο είναι δυνατό να αντικατασταθεί µε το Dako Wash Buffer, Κωδικός S Ψευδή αποτελέσµατα είναι δυνατό να ληφθούν από την αξιολόγηση κυτοπλασµατικής χρώσης. Κατά την ερµηνεία αποτελεσµάτων, να λαµβάνετε υπόψη σας µόνον την ένταση της χρώσης στην κυτταρική µεµβράνη. 7. Οι κεχρωσµένες αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για επικύρωση της ανάλυσης χρώσης και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως οδηγός βαθµολόγησης της αντίδρασης χρώσης σε ιστικές τοµές. 8. Περιστασιακά, είναι δυνατό να παρατηρηθεί έντονη εστιασµένη χρώση (3+), τα λεγόµενα θερµά σηµεία. Αυτό ενδέχεται να είναι αποτέλεσµα ανοµοιόµορφης καθήλωσης ή/και επεξεργασίας του ιστού. Στην περίπτωση αυτή, συνιστάται η ανοσοχρώση δεύτερου τεµαχίου ιστού από το ίδιο δείγµα. 9. Η εφαρµογή του HercepTest σε δείγµατα καθηλωµένα σε καθηλωτικά διαφορετικά από την ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη ή το καθηλωτικό του Bouin δεν έχει επικυρωθεί. 10. Το φυσιολογικό επιθήλιο του ιστού του µαστού πρέπει να παρουσιάζει χρώση µεταξύ 0 και 1+. Εάν διαπιστωθεί χρώση µεγαλύτερη από 1+ στο φυσιολογικό επιθήλιο, η εξέταση πρέπει να επαναληφθεί. Σηµειώνεται ότι τα φυσιολογικά επιθήλια αµυγδαλών και οισοφάγου ενδέχεται να παρουσιάσουν χρώση έντασης µέχρι και 2+. Χαρακτηριστικά απόδοσης - Μαστός Ιστορικό Ο προσδιορισµός κλινικής δοκιµής (Clinical Trial Assay, CTA) που εφαρµόστηκε για τον εντοπισµό κατάλληλων ασθενών για τις κλινικές µελέτες Herceptin προοριζόταν για διερευνητική χρήση και δεν είναι πλέον διαθέσιµος. Το HercepTest αναπτύχθηκε µε σκοπό να αποτελέσει µια συγκρίσιµη εναλλακτική λύση του CTA. Η ασφάλεια και η αποτελεσµατικότητα του Herceptin αξιολογήθηκαν σε µια τυχαιοποιηµένη ελεγχόµενη κλινική δοκιµή και σε µια µεγάλη δοκιµή ανοικτής σήµανσης (βλ. ένθετο συσκευασίας του Herceptin ). Όλοι οι ασθενείς που επελέγησαν για τις κλινικές δοκιµές του Herceptin ( ) P04085GR_01_K / σ. 22/58

23 Καρκίνος του µαστού παρουσίασαν υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, όταν υποβλήθηκαν σε ανοσοκυτταροχηµικές εξετάσεις οι οποίες εκτελέστηκαν µαζί µε τον CTA σε κεντρικό εργαστήριο. Οι ασθενείς κρίθηκαν κατάλληλοι για αγωγή µε Herceptin εφ' όσον ο όγκος τους παρουσίαζε υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 επιπέδου 2+ ή 3+ (µε βάση την κλίµακα 0 έως 3+, όπου το 3+ αντιπροσώπευε το υψηλότερο επίπεδο). Η ανάλυση υποοµάδων των αποτελεσµάτων των µελετών αυτών υπέδειξε ότι οι ασθενείς των οποίων οι ιστοί είναι έντονα θετικοί (3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 ενδέχεται να ωφεληθούν περισσότερο από το Herceptin απ' ό,τι οι ασθενείς µε ασθενώς θετικούς ιστούς (2+). Ο βαθµός υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 αποτελεί δυνητικώς ένα σηµαντικό παράγοντα πρόβλεψης των επιπτώσεων της αγωγής µε Herceptin. Λόγω του γεγονότος ότι κανείς από τους ασθενείς στις µελέτες Herceptin δεν επελέγη µε το HercepTest, η συσχέτιση ανάµεσα στο βαθµό θετικότητας και την πιθανότητα κλινικού οφέλους από την αγωγή µε Herceptin είναι άγνωστη. Συγκριτικές µελέτες Για το χαρακτηρισµό του HercepTest, διενεργήθηκαν δύο µελέτες. 1) Σύγκριση µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής (CTA). 2) Ακρίβεια κατά τη σύγκριση µε πέντε επιπρόσθετους προσδιορισµούς. Σύγκριση µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής (CTA) Το HercepTest συγκρίθηκε µε το CTA που εφαρµόστηκε για τον εντοπισµό κατάλληλων ασθενών για αγωγή µε Herceptin, σε 274 δείγµατα ιστού µε καρκίνο του µαστού θετικά στην πρωτεΐνη HER2 (2+ ή 3+) και ισάριθµα αρνητικά στην πρωτεΐνη HER2. Στον Πίνακα 4 παρατίθενται τα αποτελέσµατα σε διάγραµµα 2 x 2, όπου οι βαθµολογίες 0 και 1+ θεωρήθηκαν αρνητικές, ενώ οι 2+ και 3+ θεωρήθηκαν θετικές. Πίνακας 4. Συµφωνία 2 x 2 του HercepTest συγκρινόµενου µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής (πλήθος δειγµάτων). Ανάλυση κλινικών δοκιµών Θετική Αρνητική Σύνολο HercepTest Θετικό Αρνητικό Σύνολο Συµφωνία: ιάστηµα εµπιστοσύνης 95% ίσο µε 79% (76 82%). Η συνολική δυαδική συµφωνία του HercepTest συγκρινόµενου µε το CTA ήταν 79% (431/548), µε αµφίπλευρο διάστηµα εµπιστοσύνης 95% ίσο µε 76 82%. Το είκοσι ένα τοις εκατό (21%) των αποτελεσµάτων παρουσίαζε διαφωνία ανάµεσα στις δύο αυτές µεθόδους. Τα αποτελέσµατα του HercepTest αναφέρθηκαν στην κλίµακα 0 έως +3 και ερµηνεύθηκαν ως αρνητικά (ένταση χρώσης 0 και 1+), ασθενώς θετικά (ένταση χρώσης 2+) και έντονα θετικά (ένταση χρώσης 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. ( ) P04085GR_01_K / σ. 23/58

24 Πίνακας 5. Συµφωνία 3 x 3 του HercepTest συγκρινόµενου µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής. Ανάλυση κλινικών δοκιµών Καρκίνος του µαστού Σύνολο HercepTest Σύνολο Αυτή η παρουσίαση 3 x 3 της µελέτης συµφωνίας δείχνει ότι ένα αποτέλεσµα 3+ µε το HercepTest είναι πολύ πιθανό να αντιστοιχεί σε θετικό αποτέλεσµα µε το CTA, γεγονός που πληροί τα κριτήρια εισαγωγής στη δοκιµή Herceptin (2+ ή 3+). Τα αποτελέσµατα 2+ µε το HercepTest δεν συσχετίζονταν το ίδιο καλά µε τα αποτελέσµατα µε το CTA. Το 42% περίπου (53/126) των αποτελεσµάτων 2+ µε το HercepTest αντιστοιχούσαν σε αρνητικά αποτελέσµατα µε το CTA (0-1+), γεγονός που δεν θα επέτρεπε την εισαγωγή στις κλινικές µελέτες µε Herceptin. Ακρίβεια Το HercepTest ελέγχθηκε επίσης σε δύο αντικειµενοφόρους πλάκες µικροσκοπίου µε τοµές ιστού ενσωµατωµένες σε παραφίνη, από 168 όγκους του µαστού. Οι όγκοι αυτοί είχαν ήδη χαρακτηριστεί µε 5 διαφορετικές µεθόδους προσδιορισµού της ενίσχυσης των γονιδίων HER2 και της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2, τις εξής: εσωτερικό ανοσοαποτύπωµα Southern, υβριδίωση in situ µε φθορισµό (FISH) για την ενίσχυση του DNA, ανάλυση RNA ανοσοαποτυπώµατος Northern, ανοσοαποτύπωµα Western και ανοσοκυτταροχηµεία (ICC) σε κατεψυγµένους ιστούς (29). Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6. Σύγκριση του HercepTest µε συνδυασµένα αποτελέσµατα (OE) από εξετάσεις ενίσχυσης γονιδίων και υπερέκφρασης πρωτεΐνης HER2. Κατάταξη αναφοράς OE + - Σύνολο HercepTest Συµφωνία θετικών: 43/69 = 62% Συµφωνία αρνητικών: 99/99 = 100% Σύνολο Τα αποτελέσµατα έδειξαν επίπεδο συµφωνίας 85% (142/168) (µε διάστηµα εµπιστοσύνης 95% ίσο µε 78 89%) ανάµεσα στην ένταση θετικής χρώσης (2+ και 3+) και την ένταση αρνητικής χρώσης (0 και 1+) µε το HercepTest. από τα δείγµατα που καταδείχθηκαν ως αρνητικά µε τις 5 διαφορετικές µεθόδους δεν καταδείχθηκε ως θετικό µε το HercepTest, ενώ τα συνδυασµένα αποτελέσµατα από τις 5 διαφορετικές µεθόδους έδειξαν υψηλότερο αριθµό θετικών περιπτώσεων. Αναπαραγωγιµότητα Αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό: Η αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό ελέγχθηκε σε ένα εργαστήριο µε 5 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας έντασης χρώσης ICC. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις τριπλούν σε µασκαρισµένη τυχαιοποιηµένη µορφή. Το πρωτόκολλο αυτό εφαρµόστηκε στη µη αυτοµατοποιηµένη χρώση και ξανά στην αυτοµατοποιηµένη χρώση. Όλα τα δείγµατα έδωσαν 100% αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ διαφορετικών προσδιορισµών: Η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ διαφορετικών προσδιορισµών ελέγχθηκε σε τρία εργαστήρια κατά τη διάρκεια 4 ηµερών µε 5 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας έντασης χρώσης ICC, τυχαιοποιηµένα και µασκαρισµένα σύµφωνα µε την αυτοµατοποιηµένη µεθοδολογία. Επίσης, ένα εργαστήριο επανέλαβε το πρωτόκολλο αυτό µε τη µη αυτοµατοποιηµένη µεθοδολογία. ιαπιστώθηκε εξαιρετική αναπαραγωγιµότητα για τα θετικά σε σύγκριση µε τα αρνητικά αποτελέσµατα (0 και 1+ σε ( ) P04085GR_01_K / σ. 24/58

25 Καρκίνος του µαστού σύγκριση µε 2+ και 3+), µε εξαίρεση δύο δείγµατα σε ένα εργαστήριο όπου εφαρµόστηκε η αυτοµατοποιηµένη µεθοδολογία, τα οποία κυµάνθηκαν µεταξύ 1+ και 2+. ιαπιστώθηκε αναπαραγωγιµότητα 100% για τα δείγµατα 2+ και 3+. Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων: Η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων ελέγχθηκε σε τρία γεωγραφικώς αποµονωµένα εργαστήρια, µε 40 πανοµοιότυπα τυχαιοποιηµένα και µασκαρισµένα δείγµατα ποικίλης βαθµολογίας έντασης χρώσης ICC. Φρεσκοπαρασκευασµένες αντικειµενοφόροι πλάκες προωθήθηκαν σε κάθε εργαστήριο ελέγχου για µη αυτοµατοποιηµένη και αυτοµατοποιηµένη χρώση και αξιολόγηση από παθολόγο. Η επί τοις εκατό ποσοστιαία συµφωνία µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων κυµάνθηκε από 82% έως 90% για ένα διχοτοµικό προσδιορισµό θετικών/αρνητικών, όπου τα 0 και 1+ θεωρήθηκαν ως αρνητικά και τα 2+ και 3+ θεωρήθηκαν ως θετικά ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Μετά από σύγκριση µε τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν στο εργαστήριο αναφοράς που είχε εκτελέσει το CTA, ένα ποσοστό 12,5% (15/120) των συγκριτικών αποτελεσµάτων παρουσίασε διαφωνία ανάµεσα στον αρνητικό (0 ή 1+) και το θετικό (2+ ή 3+) προσδιορισµό. Ένα πρόσθετο 10% (12/120) παρουσίασε διαφωνία ανάµεσα στις βαθµολογίες 2+ και 3+. Ανοσοαντιδραστικότητα Στον Πίνακα 7 παρατίθεται περιληπτικά η ανοσοαντιδραστικότητα του HercepTest µε το συνιστώµενο σύνολο φυσιολογικών ιστών. Όλοι οι ιστοί ήταν καθηλωµένοι στη φορµαλίνη και ενσωµατωµένη σε παραφίνη και είχαν υποβληθεί σε χρώση µε HercepTest σύµφωνα µε τις οδηγίες του ένθετου συσκευασίας. Πίνακας 7. Σύνοψη της αντιδραστικότητας του HercepTest µε φυσιολογικούς ιστούς. Τύπος ιστών (πλήθος εξετασθέντων) Επινεφρίδιο (3) Μυελός των οστών (3) Εγκέφαλος/Παρεγκεφαλίδα (3) Εγκέφαλος/Κύριο τµήµα εγκεφάλου (3) Μαστός (3) Τράχηλος της µήτρας (3) Κόλον (3) Οισοφάγος (3) Καρδιά (3) Νεφρός (3) Ήπαρ (3) Πνεύµονας (3) Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) Ωοθήκη (3) Πάγκρεας (3) Παραθυρεοειδής (3) Περιφερικό νεύρο (3) Υπόφυση (3) Προστάτης (3) Σιελογόνος αδένας (3) Σκελετικός µυς (3) έρµα (3) Λεπτό έντερο (3) Σπλήνας (3) Στόµαχος (3) Όρχις (3) Θύµος αδένας (3) Θυρεοειδής (3) Αµυγδαλή (3) Μήτρα (3) Στοιχεία του ιστού µε θετική χρώση και σχήµα χρώσης Μαστικός αδένας (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+) Σωληνάρια του νεφρικού µυελού (3/3 ιστών, 1 2+ σε 5 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Προστατικός αδένας/αγωγοί (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Ιδρωτοποιοί αδένες (1/3 ιστών, 1+, 30% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Κυλινδρικό επιθήλιο, επιφάνεια (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 2+, 25% των κυττάρων) Επιθήλιο (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 25% των κυττάρων) Πλακώδες επιθήλιο (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+), 80% των κυττάρων) Η αναφερθείσα χρώση σε όλους τους ιστούς ήταν χρώση µεµβράνης, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Και τα τρία δείγµατα από κάθε τύπο ιστού είχαν την ίδια ένταση χρώσης εκτός αν σηµειώνεται διαφορετικά. ( ) P04085GR_01_K / σ. 25/58

26 Καρκίνος του µαστού Αντιµετώπιση προβληµάτων - Μαστός Ανατρέξτε στην ενότητα περί αντιµετώπισης προβληµάτων του προαναφερθέντος εγχειριδίου της Dako (19) για ενέργειες αποκατάστασης ή απευθυνθείτε στο τµήµα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της Dako για να αναφέρετε τυχόν ασυνήθιστη χρώση. Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Καµία χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών 1α. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιήθηκαν µε τη σωστή σειρά 1α. Μελετήστε τις οδηγίες εφαρµογής των αντιδραστηρίων 2. Ασθενής χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών 1β. Αζίδιο του νατρίου στο διάλυµα πλύσης 1γ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. 2α. Ανεπαρκής ανάκτηση επίτοπου 2β. Ανεπαρκείς χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια 2γ. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης 2δ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντική µείωση της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. 2ε. Εφαρµόστηκε ανεπαρκής όγκος αντιδραστηρίου 1β. Χρησιµοποιήστε φρέσκο παρασκεύασµα ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης που περιλαµβάνεται στο κιτ 1γ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας (17). 2α. Βεβαιωθείτε ότι το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου έχει φτάσει τους C επί 40 ολόκληρα λεπτά και έχει αφεθεί να κρυώσει επί άλλα 20 λεπτά 2β. Μελετήστε τις οδηγίες της διαδικασίας χρώσης 2γ. Βεβαιωθείτε ότι ο ιστός του ασθενούς δεν έχει υποβληθεί σε υπερβολική καθήλωση, καθώς και ότι δεν χρησιµοποιήθηκε εναλλακτικό καθηλωτικό 2δ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας (17). 2ε. Ελέγξτε πόσος όγκος αντιδραστηρίου εφαρµόστηκε ( ) P04085GR_01_K / σ. 26/58

27 Καρκίνος του µαστού Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 3. Εκτεταµένη χρώση φόντου των αντικειµενοφόρων πλακών 3α. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3β. Χρησιµοποιήθηκαν πρόσθετα αµύλου για τη στερέωση των τοµών στις αντικειµενοφόρους πλάκες 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν εκπλύθηκαν σχολαστικά 3δ. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διαδικασία χρώσης 3ε. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης 3α. Χρησιµοποιήστε φρέσκα διαλύµατα καθαρισµού και ακολουθήστε τις διαδικασίες, όπως αυτές περιγράφονται στην ενότητα B.1 3β. Αποφύγετε τη χρήση πρόσθετων αµύλου για την πρόσφυση των τοµών στο κρύσταλλο των αντικειµενοφόρων πλακών. Πολλά πρόσθετα είναι ανοσοαντιδραστικά 3γ. Χρησιµοποιήστε φρέσκο διάλυµα στα λουτρά ρυθµιστικού διαλύµατος και στις φιάλες πλύσης 3δ. Χρησιµοποιήστε θάλαµο υγρασίας. Σκουπίζετε µόνον τρεις έως τέσσερις αντικειµενοφόρους πλάκες κάθε φορά, προτού εφαρµόσετε το αντιδραστήριο 3ε. Βεβαιωθείτε ότι έχει χρησιµοποιηθεί εγκεκριµένο καθηλωτικό. Η τυχόν χρήση εναλλακτικού καθηλωτικού ενδέχεται να προκαλέσει εκτεταµένη χρώση φόντου 4. Ο ιστός αποκολλάται από τις αντικειµενοφόρους πλάκες 5. Υπερβολικά έντονη ειδική χρώση 3στ. Μη ειδική δέσµευση αντιδραστηρίων στον ιστό 4α. Χρήση εσφαλµένων αντικειµενοφόρων πλακών 5α. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης 5β. Εφαρµογή εσφαλµένης πηγής θερµότητας για την ανάκτηση επίτοπου, π.χ. συσκευή παραγωγής ατµού, φούρνος µικροκυµάτων ή αυτόκαυστο 5γ. Υπερβολικά µεγάλοι χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια 5δ. Χρήση εσφαλµένου διαλύµατος πλύσης 3στ. Ελέγξτε τη µέθοδο καθήλωσης του δείγµατος και τυχόν παρουσία νέκρωσης 4α. Χρησιµοποιήστε σιλανοποιηµένες αντικειµενοφόρους πλάκες, όπως π.χ. τις Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003, τις SuperFrost Plus ή τις αντικειµενοφόρους πλάκες µε επίστρωση πολυ-l-λυσίνης 5α Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείτε µόνον εγκεκριµένα καθηλωτικά και εφαρµόζετε εγκεκριµένες µεθόδους καθήλωσης 5β. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείτε µόνον υδατόλουτρο για το στάδιο ανάκτησης επίτοπου 5γ. Μελετήστε τις οδηγίες της διαδικασίας χρώσης 5δ. Χρησιµοποιήστε µόνον το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης που συνιστάται για το κιτ αυτό ( ) P04085GR_01_K / σ. 27/58

28 Καρκίνος του µαστού Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 6. Ασθενής χρώση της κυτταρικής σειράς της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα 1+ 6α. Εφαρµογή εσφαλµένου πρωτοκόλλου ανάκτησης επίτοπου 6α. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο προθερµασµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου. Επαναφέρετε τη θερµοκρασία του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου στους C και προεπεξεργαστείτε επί 40 ολόκληρα λεπτά 7. Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου έχει νεφελώδη εµφάνιση όταν θερµαίνεται 8. Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου έχει νεφελώδη εµφάνιση όταν αποθηκεύεται (πριν θερµανθεί) 6β. Καµία αντίδραση µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) 6γ. Αλλοίωση της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα 7. Όταν θερµαίνεται, το διάλυµα αποκτά νεφελώδη εµφάνιση 8. Το διάλυµα αποθηκεύτηκε σε λανθασµένες συνθήκες ή έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης του διαλύµατος 6β. Βεβαιωθείτε ότι η επώαση διαρκεί 10 ολόκληρα λεπτά. Βεβαιωθείτε ότι προσθέσατε µόνο µία σταγόνα χρωµογόνου DAB σε 1 ml ρυθµισµένου υποστρώµατος DAB 6γ. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης του κιτ και τις συνθήκες φύλαξής του, που αναγράφονται στο εξωτερικό της συσκευασίας 7. Αυτό είναι φυσιολογικό και δεν επηρεάζει τη χρώση 8. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης και τις συνθήκες αποθήκευσης του κιτ στο εξωτερικό της συσκευασίας. Απορρίψτε το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε κάποιο από τα παραπάνω αίτια ή εάν η προτεινόµενη ενέργεια δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβληµα, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την προετοιµασία δειγµάτων στο προαναφερθέν εγχειρίδιο της Dako (19) (που διατίθεται από την Dako), στο Atlas of Immunohistology (30) και στο Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04085GR_01_K / σ. 28/58

29 Καρκίνος του στοµάχου Περίληψη και επεξήγηση - Στόµαχος Ιστορικό Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό και ως ERBB2 ή NEU) κωδικοποιεί µια πρωτεΐνη που συχνά αναφέρεται ως πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι µια τυροσινική κινάση υποδοχέα µεµβράνης µε οµολογία ως προς τον υποδοχέα παράγοντα επιδερµικής ανάπτυξης (EGFR ή HER1) (1-8). Η πρωτεΐνη HER2 είναι ένα φυσιολογικό συστατικό που εκφράζεται µε διάφορους τύπους επιθηλιακών κυττάρων (8). Πολλές µελέτες έδειξαν ότι υπάρχει υπερέκθεση της πρωτεΐνης HER2 και ενίσχυση του γονιδίου HER2 στις περιπτώσεις καρκίνου του στοµάχου. Η θετικότητα σχετικά µε το HER2 µπορεί να ανιχνευθεί σε περίπου 20% των ασθενών είτε µε IHC ή FISH (32). Οι προκλινικές µελέτες in vitro και in vivo έδειξαν ότι το trastuzumab (Herceptin ) είναι αποτελεσµατικό σε διάφορους τύπους καρκίνου του στοµάχου, δίνοντας έτσι αφορµή για την έναρξη κλινικών µελετών (32-36). Σε µια µελέτη BO18255 φάσης ΙΙΙ, τη δοκιµή ToGA, οι ασθενείς που παρουσίασαν θετικό HER2 µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής τυχαιοποιήθηκαν για να λάβουν 5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη, είτε µεµονωµένα είτε σε συνδυασµό µε το trastuzumab. Ένα στατιστικά σηµαντικό κέρδος στη συνολική βιωσιµότητα (OS) εµφανίστηκε στους ασθενείς που έλαβαν συνδυασµένη θεραπεία µε trastuzumab και χηµειοθεραπεία (37, 38). Το trastuzumab είναι ένα εξανθρωποποιηµένο µονοκλωνικό αντίσωµα (10) που συνδέεται µε υψηλή συγγένεια µε την πρωτεΐνη HER2 και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των ανθρώπινων νεοπλασµατικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 τόσο in vitro όσο και in vivo (33-36). Χαρακτηριστικά 3803 ασθενείς εξετάστηκαν για κατάσταση HER2 προκειµένου να ενταχθούν στη µελέτη ToGA. Σε αυτή τη µελέτη, µετρήθηκαν τόσο η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 µε τη µέθοδο IHC (HercepTest, Dako) όσο και η ενίσχυση του γονιδίου HER2 µε τη µέθοδο FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). Έγκυρα αποτελέσµατα ελήφθησαν από 3665 δείγµατα είτε µε τη δοκιµασία IHC είτε µε τη δοκιµασία FISH, καθώς και από 3280 δείγµατα και µε τις δύο δοκιµασίες. Τα αποτελέσµατα της µελέτης ToGA κατέδειξαν ότι 22,1% των ασθενών µε προχωρηµένο καρκίνο του στοµάχου ήταν θετικοί σε HER2, όπως καθορίστηκε είτε µέσω IHC είτε µέσω FISH, σύµφωνα µε τον ορισµό των κριτηρίων επιλογής HER2 της ToGA (38). Αναφορικά µε τη χρήση του HercepTest στην αξιολόγηση των ασθενών για τους οποίους µελετάται η πιθανότητα αγωγής µε trastuzumab, ανατρέξτε στο ένθετο της συσκευασίας του Herceptin για περισσότερες πληροφορίες. Αρχή της διαδικασίας - Στόµαχος Το HercepTest περιέχει αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση µιας διαδικασίας δύο βηµάτων ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης για ενσωµατωµένα σε παραφίνη δείγµατα που υποβάλλονται σε αναλύσεις ρουτίνας. Μετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα κονίκλου για την ανθρώπινη πρωτεΐνη HER2, το κιτ αυτό χρησιµοποιεί ένα έτοιµο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που βασίζεται στην τεχνολογία δεξτράνης. Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται τόσο από µόρια δευτερογενούς αντιανοσοσφαιρίνης κονίκλου από αίγα όσο και από µόρια υπεροξειδάσης χρένου συνδεδεµένα µε µια κοινή κεντρική αλυσίδα πολυµερούς δεξτράνης. Με τον τρόπο αυτό, εξαλείφεται η ανάγκη αλληλοδιάδοχης εφαρµογής αντισώµατος-συνδέσµου και συζευγµένου µε υπεροξειδάση αντισώµατος. Η πιθανότητα να λάβει χώρα διασταυρούµενη αντίδραση του αντιδραστηρίου οπτικοποίησης µε τις ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες και τον ορό εµβρύου µόσχου έχει εξαλειφθεί µε απορρόφηση στερεάς φάσης. Η ενζυµατική µετατροπή της επακόλουθα προστιθέµενης χρωµογόνου ουσίας έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Στη συνέχεια, το δείγµα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί µε καλυπτρίδα. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την επικύρωση των αναλύσεων χρώσης, παρέχονται αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που περιέχουν τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, ( ) P04085GR_01_K / σ. 29/58

30 Καρκίνος του στοµάχου 1+ και 3+. Η ένταση χρώσης αυτών των κυτταρικών σειρών έχει συσχετιστεί µε τον αριθµό των υποδοχέων ανά κύτταρο. Το HercepTest, µε Κωδικό K5204, εφαρµόζεται τόσο σε µη αυτοµατοποιηµένες τεχνικές χρώσης, όσο και σε αυτοµατοποιηµένες τεχνικές χρώσης µε το όργανο Autostainer. Αντιδραστήρια - Στόµαχος Παρεχόµενα υλικά Τα υλικά που αναφέρονται κατωτέρω επαρκούν για 35 εξετάσεις (35 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε πρωτεύον αντίσωµα για την πρωτεΐνη HER2 και 35 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα). Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 3 σταγόνων (100 µl) από τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 1, 2, 3 και 4, καθώς και του διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) ανά τοµή ιστού. Το κιτ περιλαµβάνει υλικά που επαρκούν για 5 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης το πολύ. Αρ. φιαλιδίου Ποσότητα 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml 4 1 x 3,5 ml Περιγραφή Αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης: Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, που περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ) 15 mmol/l. Αντίσωµα πρωτεΐνης HER2 ανθρώπου από κουνέλι: Έτοιµο για χρήση αντίσωµα, αποµονωµένο βάσει συγγενείας. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, µε ph 7,2, και περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Ανοσογόνο: Συνθετικό C-τελικό τµήµα (ενδοκυτταροπλασµατικό τµήµα) της πρωτεΐνης HER2, συζευγµένο σε αιµοκυανίνη πεταλίδας. Ειδικότητα: Πρωτεΐνη HER2. Μέθοδος καθαρισµού: Το αντίσωµα έχει αποµονωθεί βάσει συγγενείας µε τη βοήθεια ακινητοποιηµένου πεπτιδίου πρωτεΐνης HER2. Αντιδραστήριο οπτικοποίησης: Πολυµερές δεξτράνης συζευγµένο µε υπεροξειδάση χρένου και αποµονωµένες βάσει συγγένειας αντιανοσοσφαιρίνες κονίκλου από αίγα. Παρέχεται σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα: Τµήµα ανοσοσφαιρίνης φυσιολογικού ορού κονίκλου σε συγκέντρωση πρωτεΐνης ισοδύναµη µε εκείνη του αντισώµατος για την πρωτεΐνη HER2. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, µε ph 7,2, και περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη. ( ) P04085GR_01_K / σ. 30/58

31 Καρκίνος του στοµάχου 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml 5 αντικειµενοφόροι πλάκες Ρυθµισµένο υπόστρωµα DAB: Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, µε ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου < 0,1%, σταθεροποιητές, βελτιωτικά και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Χρωµογόνο DAB: Χρωµογόνο διάλυµα τετραϋδροχλωρικής 3,3'-διαµινοβενζιδίνης 5%. ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου (Containing Detergent) (10x): Ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,1 mol/l µε απορρυπαντικό. Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (10x): Ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl που περιέχει απορρυπαντικό και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα: Κάθε αντικειµενοφόρος πλάκα περιέχει τοµές τριών καθηλωµένων σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών καρκινώµατος του µαστού που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) και SK-BR-3 (3+). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα έχουν υποστεί επεξεργασία για καλύτερη πρόσφυση των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους. Τυχόν επιπρόσθετη θερµική επεξεργασία των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα µε σκοπό τη βελτίωση της πρόσφυσης των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους ενδέχεται να διακυβεύσει τα αποτελέσµατα χρώσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια, συµπεριλαµβανοµένου του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου και του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης, έχουν ειδική σύνθεση για χρήση στη συγκεκριµένη εξέταση. Για να είναι η απόδοση της εξέτασης σύµφωνη µε τις προδιαγραφές, δεν πρέπει να γίνει οποιαδήποτε αντικατάσταση, µε εξαίρεση το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης στη θέση του οποίου µπορείτε να χρησιµοποιήσετε το προϊόν µε Κωδικό S3006 της Dako. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Απορροφητικά µαντηλάκια Υδροξείδιο του αµµωνίου, 15 mol/l αραιωµένο σε συγκέντρωση 37 mmol/l Επίχρωση: Αιµατοξυλίνη, όπως π.χ. το προϊόν υδατικής βάσης Mayer's Hematoxylin, Dako Κωδικός S3301 (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, A.4) Καλυπτρίδες Στυλό οριοθέτησης, όπως π.χ. το Dako Pen, Κωδικός S2002 Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό (νερό πλύσης) Φούρνος ξήρανσης, µε δυνατότητα διατήρησης θερµοκρασίας 60 C ή χαµηλότερη Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Θάλαµος υγρασίας (προαιρετικό) Μικροσκόπιο φωτός (µεγέθυνση 4 40x αντικειµενικού φακού) ( ) P04085GR_01_K / σ. 31/58

32 Υλικό στερέωσης, όπως π.χ. το Faramount, Κωδικός S3025 ή το Glycergel, Κωδικός C0563, της Dako Θετικοί και αρνητικοί ιστοί, για χρήση ως µάρτυρες της διαδικασίας (βλ. ενότητα περί ποιοτικού ελέγχου) Καρκίνος του στοµάχου Αντικειµενοφόροι πλάκες, SuperFrost Plus, πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003 (βλ. ενότητα περί προετοιµασίας δειγµάτων) οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε ικανότητα χρονοµέτρησης διαστηµάτων 2 40 λεπτών) Φιάλες πλύσης Υδατόλουτρο µε καπάκι (µε δυνατότητα διατήρησης του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου στους C) Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Αποθήκευση - Στόµαχος Φυλάσσετε σε θερµοκρασία 2 8 C. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης, η οποία είναι σηµασµένη στο εξωτερικό της συσκευασίας. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο αυτής της συσκευασίας, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη (14a, 14b). Σηµειώνεται ότι και οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, θα πρέπει να αναλύονται υλικά θετικού και αρνητικού µάρτυρα ταυτόχρονα µε τα δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το HercepTest, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Παρασκευή δείγµατος - Στόµαχος είγµατα αδενοκαρκινώµατος του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, από βιοψίες, εκτοµές ή εξαιρέσεις πρέπει να υποβάλλονται σε σωστό χειρισµό έτσι ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανοσοκυτταροχηµική χρώση. Για όλα τα δείγµατα, πρέπει να εφαρµόζονται οι τυπικές µέθοδοι επεξεργασίας ιστών (15). Για τις δοκιµές σε µικρά δείγµατα βιοψίας, βεβαιωθείτε ότι η µορφολογία του όγκου είναι άθικτη και ότι υπάρχουν αρκετά κύτταρα του όγκου για αξιολόγηση IHC. Αν γίνει ανάλυση HercepTest σε ένα δείγµα βιοψίας, πρέπει να αναλυθούν πολλαπλά δείγµατα βιοψίας (7-8) από διαφορετικές περιοχές του όγκου για να διασφαλιστεί ο αξιόπιστος προσδιορισµός της κατάστασης HER2. Τοµές ενσωµατωµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι οι ιστοί που διατηρούνται σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµόλης και ενσωµατωµένοι σε παραφίνη. Τα δείγµατα πρέπει π.χ. να κόβονται σε τεµάχια πάχους 3 ή 4 mm και να µονιµοποιούνται επί ώρες σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης. είγµατα βιοψίας µονιµοποιήθηκαν επί 6-8 ώρες στη δοκιµή ToGA (για παραποµπή στη µελέτη, ανατρέξτε στο (37)). Στη συνέχεια, οι ιστοί αφυδατώνονται σε µια σειρά αλκοολών και ξυλένιο και στη συνέχεια εµποτίζονται από τηγµένη παραφίνη θερµοκρασίας 60 C το πολύ. Οι κατάλληλα καθηλωµένοι και ενσωµατωµένοι ιστοί που εκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 διατηρούνται για απεριόριστο χρόνο πριν από την τοµή και τη στερέωση στις αντικειµενοφόρους πλάκες, όταν φυλάσσονται σε δροσερό σηµείο (15 25 C) (15, 16). Στις Η.Π.Α., σύµφωνα µε το νόµο περί βελτίωσης κλινικών εργαστηρίων του 1988, στο 42 CFR (b), προβλέπεται ότι το εργαστήριο πρέπει να φυλάσσει κεχρωσµένες αντικειµενοφόρους πλάκες επί 10 έτη τουλάχιστον, καθώς και τεµάχια δειγµάτων 2 έτη τουλάχιστον, από την ηµεροµηνία εξέτασης (16). Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους 4 5 µm, να τοποθετούνται σε αντικειµενοφόρους και να στεγνώνουν στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες (ή µέχρι να στεγνώσουν) ή στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στους 60 C για ( ) P04085GR_01_K / σ. 32/58

33 Καρκίνος του στοµάχου µία ώρα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η υπερβολική θέρµανση για πάνω από µία ώρα στους 60 C µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). Για τη διατήρηση της αντιγονικότητας, οι τοµές των ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine ή πυριτιωµένες), πρέπει να χρωµατίζονται εντός διαστήµατος 4 6 εβδοµάδων από τον τεµαχισµό τους όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (18). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες που απαιτούνται για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 και την επαλήθευση της παρουσίας όγκου πρέπει να ετοιµάζονται ταυτόχρονα. Συνιστάται ένας ελάχιστος αριθµός 5 αντικειµενοφόρων πλακών, δηλ. µία για την παρουσία όγκου, δύο για αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 (µία για επώαση µε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 2 και µία για επώαση µε το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 4) και δύο εφεδρικά. Η χρήση του HercepTest σε απασβεστωµένους ιστούς δεν έχει επικυρωθεί και δεν συνιστάται. Συµβουλευθείτε το Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) (Εκπαιδευτικός οδηγός: Μέθοδοι ανοσοχηµικής χρώσης) της Dako ή τις παραποµπές 15 και 16 για περαιτέρω λεπτοµέρειες σχετικά µε την παρασκευή των δειγµάτων. Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Ειδική µέθοδος ανάκτησης επιτόπου, βρασµός σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 10 mmol/l, πρέπει να χρησιµοποιηθεί για βέλτιστη απόδοση της εξέτασης. Το ιάλυµα Ανάκτησης Επιτόπου παρέχεται στο κιτ HercepTest. Σύµφωνα µε τη µέθοδο αυτή, οι ιστικές τοµές που είναι στερεωµένες πάνω σε αντικειµενοφόρους πλάκες βυθισµένες σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 10 mmol/l (20) θερµαίνονται σε βαθµονοµηµένο υδατόλουτρο το οποίο έχει τη δυνατότητα να διατηρεί το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου στην απαιτούµενη θερµοκρασία (95 99 C). Τα εργαστήρια που βρίσκονται σε µεγαλύτερα υψόµετρα πρέπει να προσδιορίζουν την καλύτερη µέθοδο διατήρησης της απαιτούµενης θερµοκρασίας του υδατόλουτρου. Η ανάκτηση επίτοπου πρέπει να εκτελείται σε υδατόλουτρο. Έχουν δοκιµαστεί και άλλες µέθοδοι θέρµανσης, αλλά δεν δίνουν αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Αµέσως µετά από την ανάκτηση επίτοπου, αρχίστε τη διαδικασία χρώσης. Τυχόν αποκλίσεις από την περιγραφόµενη διαδικασία ενδέχεται να επηρεάσουν τα αποτελέσµατα. Προφυλάξεις - Στόµαχος 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 1, Αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης, περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. ιατίθεται δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού για τους επαγγελµατίες χρήστες, µετά από σχετικό αίτηµα. 4. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6, DAB Chromogen, περιέχει 5-<10% τετραχλωριούχο διφαινυλο- 3,3,4,4 -τετραϋλ-τετρα-αµµώνιο και φέρει τη σήµανση: Κίνδυνος H350 H341 P201 P280 P308 + P313 P405 P501 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. Ύποπτο για πρόκληση γενετικών ελαττωµάτων. Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανής έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. Φυλάσσεται κλειδωµένο. ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. ( ) P04085GR_01_K / σ. 33/58

34 Καρκίνος του στοµάχου Ως γενικός κανόνας, άτοµα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Πρέπει να δίνονται προσεκτικές οδηγίες στους χρήστες σχετικά µε τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (MSDS) για επιπλέον πληροφορίες. 5. Το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 8, Wash Buffer (10x), περιέχει 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)- propane-1,3-diol hydrochloride και 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. Ενδέχεται να προκαλέσει αλλεργική αντίδραση. Η επισήµανση στο Wash Buffer (10x) είναι η εξής: Προσοχή H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. P264 Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. 6. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό για το σχηµατισµό ιδιαίτερα εκρηκτικών συσσωρεύσεων αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (21, 22). 7. Τα φιαλίδια υπ' αριθµ. 2, 3 και 4 περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 8. Πρέπει να τα µεταχειρίζεστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες των µαρτύρων και τα δείγµατα, τόσο πριν όσο και µετά τη µονιµοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ως δυνητικά µολυσµατικά και να τα απορρίπτετε µε τις δέουσες προφυλάξεις (23). Μην αναρροφάτε µε πιπέτα τα αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε αντιδραστήρια και δείγµατα. Εάν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή µε ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε µε άφθονες ποσότητες νερού. 9. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων, για να αποτρέψετε τυχόν µη ειδική χρώση. 10. Τυχόν εφαρµογή χρόνων, θερµοκρασιών ή µεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνων που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα. Η υπερβολική ξήρανση στους 60 C για πάνω από µία ώρα µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). 11. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει µείωση της αντιγονικής χρώσης. 12. Όλα τα αντιδραστήρια, συµπεριλαµβανοµένου του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου και του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης, έχουν ειδική σύνθεση για χρήση στη συγκεκριµένη εξέταση. Για να είναι η απόδοση της εξέτασης σύµφωνη µε τις προδιαγραφές, δεν πρέπει να γίνει οποιαδήποτε αντικατάσταση, µε εξαίρεση το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης στη θέση του οποίου µπορείτε να χρησιµοποιήσετε το προϊόν µε Κωδικό S Το αντιδραστήριο οπτικοποίησης και το χρωµογόνο DAB ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς, εάν εκτεθούν σε υπερβολικό φως. Μη φυλάσσετε τα µέρη του συστήµατος και µην εκτελείτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άµεσο ηλιακό φως. ( ) P04085GR_01_K / σ. 34/58

35 Καρκίνος του στοµάχου 14. Φοράτε κατάλληλο ατοµικό προστατευτικό εξοπλισµό, έτσι ώστε να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. Για επιπλέον πληροφορίες, ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (SDS). ( ) P04085GR_01_K / σ. 35/58

36 Καρκίνος του στοµάχου 15. Τα υπολείµµατα παραφίνης µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσµατα. 16. Για ακριβή ερµηνεία των αποτελεσµάτων του HercepTest σε κεχρωσµένα δείγµατα βιοψίας από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, συνιστάται µια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων όγκου. Μια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου αποτελείται από 5 συνδεόµενα κύτταρα όγκου κεχρωσµένα για HER Εξαιτίας του ετερογενούς χαρακτήρα των δειγµάτων βιοψίας καρκίνου του στοµάχου, είναι σηµαντική η εκτέλεση της εξέτασης IHC για HER2 σε πολλαπλά τεµάχια βιοψίας (7-8) από διαφορετικές περιοχές του όγκου ώστε να επιτευχθεί αξιόπιστο αποτέλεσµα. 18. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώµενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. Εάν η περικλειόµενη τοµή ιστού δεν καλυφθεί εντελώς µε τις 3 σταγόνες (100 µl) του αντιδραστηρίου, πρέπει να προστεθούν ακόµα 3 σταγόνες. 19. Συνιστάται η εξέταση περισσότερων του ενός τεµαχίων ιστού από εξαιρέσεις καρκίνου του στοµάχου όταν το δείγµα παρουσιάζει υψηλό επίπεδο ετερογένειας (41). ( ) P04085GR_01_K / σ. 36/58

37 Καρκίνος του στοµάχου Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ - Στόµαχος A. Προετοιµασία αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: A.1 ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου Αραιώστε επαρκή ποσότητα από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 7 ( ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου 10x) σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για την προγραµµατισµένη διαδικασία χρώσης. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.2 Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 8 (Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης 10x) σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για τα βήµατα πλύσης. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 8 C επί ένα µήνα. Εάν το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Για έκπλυση µετά από την επώαση µε το αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης, το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου και αιµατοξυλίνη, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Για όλα τα άλλα στάδια έκπλυσης, απαιτείται χρήση του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. A.3 ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) Με τη διαδικασία που ακολουθεί, παρασκευάζεται 1 ml διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου. Κάθε κλάσµα του 1 ml επαρκεί για 10 ιστικές τοµές. Βήµα 1: Μεταφέρετε 1 ml ρυθµισµένου υποστρώµατος DAB από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. 5 σε ένα δοκιµαστικό σωλήνα. Βήµα 2: Προσθέστε µία σταγόνα (25 30 µl) χρωµογόνου DAB από το φιαλίδιο υπ' αριθµ. Αναµείξτε και εφαρµόστε στις ιστικές τοµές µε µια πιπέτα. Το παρασκευασµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) παραµένει σταθερό επί 5 ηµέρες περίπου, όταν φυλάσσεται στους 2 8 C. Το διάλυµα αυτό πρέπει να αναµειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζηµα που έχει σχηµατιστεί στο διάλυµα δεν επηρεάζει δυσµενώς την ποιότητα της χρώσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το χρωµογόνο DAB στο φιαλίδιο υπ' αριθµ. 6 ενδέχεται να ποικίλλει ως προς το χρώµα από τελείως άχρωµο έως ανοικτό ιώδες-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει δυσµενώς την απόδοση του προϊόντος αυτού. Η αραίωση πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε αυτό το ένθετο συσκευασίας. Τυχόν προσθήκη περίσσειας χρωµογόνου DAB στο ρυθµισµένο υπόστρωµα DAB θα έχει ως αποτέλεσµα την αλλοίωση του θετικού σήµατος. A.4 Επίχρωση Το έγχρωµο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης DAB διαλύεται στην αλκοόλη και το νερό. Εφαρµόστε επίχρωση αιµατοξυλίνης και προσαρµόστε την ένταση χρώσης της αιµατοξυλίνης σε επίπεδο παρόµοιο µε εκείνο που απεικονίζεται στο έγγραφο HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Εγχειρίδιο ερµηνειών HercepTest Καρκίνος του στοµάχου) της Dako. Είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί αιµατοξυλίνη είτε αλκοολικής είτε υδατικής βάσης, όπως π.χ. το Dako Mayer's Hematoxylin, Κωδικός S3301. Αµέσως µετά την επίχρωση αιµατοξυλίνης, εκπλύντε σχολαστικά µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό και κατόπιν βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες µε τους ιστούς σε λουτρό υδατικού διαλύµατος αµµωνίας 37 mmol/l (βλ. ενότητα B.2, βήµα 6). Το υδατικό διάλυµα αµµωνίας (37 mmol/l) παρασκευάζεται µε ανάµειξη 2,5 ml (συµπυκνωµένου) διαλύµατος υδροξειδίου του αµµωνίου 15 mol/l µε 1 L απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού. Τυχόν µη χρησιµοποιηµένο υδατικό διάλυµα αµµωνίας 37 mmol/l είναι δυνατό να φυλαχθεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) σε ερµητικά πωµατισµένη φιάλη επί 12 µήνες το πολύ. ( ) P04085GR_01_K / σ. 37/58

38 Καρκίνος του στοµάχου A.5 Υλικό στερέωσης Συνιστάται η χρήση µη υδατικού υλικού µόνιµης στερέωσης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Για την υδατική στερέωση, συνιστάται η χρήση του Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Κωδικός S3025, ή του Glycergel Mounting Medium, Κωδικός C0563, της Dako. Υγροποιήστε το Glycergel µε θέρµανση στους 40 (±5) C περίπου, πριν από τη χρήση. B. ιαδικασία χρώσης B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπήσουν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) πριν από την ανοσοχρώση. Με παρόµοιο τρόπο, όλες οι επωάσεις πρέπει να εκτελεστούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Μην επιτρέπετε το στέγνωµα των ιστικών τοµών κατά τη διαδικασία χρώσης. Οι στεγνωµένες ιστικές τοµές ενδέχεται να εµφανίζουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Καλύπτετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες που είναι εκτεθειµένες σε ρεύµατα αέρα. Σε περίπτωση εφαρµογής παρατεταµένων επωάσεων, τοποθετείτε τους ιστούς σε υγρό περιβάλλον. Εάν χρειαστεί να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να φυλαχτούν σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος µετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα (βήµα 3) επί 1 ώρα το πολύ σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί δυσµενώς η απόδοση της χρώσης. Αποπαραφίνωση και επανενυδάτωση: Πριν από τη χρώση, πρέπει να αφαιρεθεί η παραφίνη από τις αντικειµενοφόρους πλάκες ιστών για την αποµάκρυνση του υλικού ενσωµάτωσης. Στη συνέχεια, οι πλάκες πρέπει να επανυδατωθούν. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Το υπολειµµατικό µέσο ενσωµάτωσης θα έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 2. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απόλυτηαιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε 95% αιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό επί 30 δευτερόλεπτα τουλάχιστον. Αρχίστε τη διαδικασία χρώσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα B.2, βήµα 1, Ανάκτηση επίτοπου. Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αντικαθίστανται κάθε 40 αντικειµενοφόρους πλάκες. Αντί ξυλενίου, είναι δυνατή η χρήση υποκατάστατων τολουενίου ή ξυλενίου, όπως π.χ. το Histoclear. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να καταστήσει τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού µη έγκυρα για χρήση στην επιλογή ασθενών για θεραπεία µε Herceptin. ( ) P04085GR_01_K / σ. 38/58

39 B.2 Πρωτόκολλο χρώσης Εκτέλεση σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Βήµα 1: Ανάκτηση επίτοπου Καρκίνος του στοµάχου Πληρώστε τα δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης µε το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου στους C. Με τη θέρµανση, το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση. Βάλτε τα καπάκια στα δοχεία, για σταθεροποίηση της θερµοκρασίας και την αποτροπή τυχόν εξάτµισης. Βυθίστε τις τοµές, από τις οποίες έχετε αφαιρέσει την παραφίνη και οι οποίες βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου, στο προθερµασµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου των δοχείων χρώσης. ΕΠΑΝΑΘΕΡΜΑΝΕΤΕ ΤΟ Υ ΑΤΟΛΟΥΤΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΙΑΛΥΜΑ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΕΠΙΤΟΠΟΥ ΣΤΟΥΣ C. Επωάστε επί 40 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία C. Αφαιρέστε ολόκληρο το δοχείο µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το υδατόλουτρο. Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να κρυώσουν µέσα στο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου επί 20 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αποχύστε το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου και εκπλύντε τις τοµές σε αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (βλ. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2). Για τη βέλτιστη απόδοση, εµποτίστε τις τοµές σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης επί 5 20 λεπτά µετά την ανάκτηση του επίτοπου και πριν τη χρώση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου είναι σχεδιασµένο για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Βήµα 2: Αντιδραστήριο αποκλεισµού της υπεροξειδάσης Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος. Με τη βοήθεια απορροφητικού υλικού που δεν αφήνει χνούδι (όπως π.χ. Kimwipe ή ένα επίθεµα γάζας), καθαρίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για να αποµακρύνετε τυχόν αποµένον υγρό και να περιορίσετε τα αντιδραστήρια εντός της προδιαγεγραµµένης περιοχής. Κυκλώστε την ιστική τοµή µε ένα στυλό Dako Pen. Προσθέστε 3 σταγόνες (100 µl) αντιδραστηρίου αποκλεισµού της υπεροξειδάσης µε τρόπο ώστε να καλυφθεί το δείγµα. Επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Ξεπλύνατε απαλά µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης από υδροβολέα (χωρίς να κατευθύνετε τη ροή απ' ευθείας πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε τις τοµές µέσα σε λουτρό φρέσκου ρυθµιστικού διαλύµατος. Βήµα 3: Πρωτεύον αντίσωµα ή αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Καλύψτε το δείγµα µε 3 σταγόνες (100 µl) αντισώµατος πρωτεΐνης HER2 ή αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνατε απαλά µε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης από υδροβολέα (χωρίς να κατευθύνετε τη ροή απ' ευθείας πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε τις τοµές µέσα σε λουτρό φρέσκου ρυθµιστικού διαλύµατος. Εάν χρειαστεί να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να φυλαχτούν µέσα σε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης µετά από το βήµα 3 επί 1 ώρα το πολύ σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί δυσµενώς η απόδοση της χρώσης. ( ) P04085GR_01_K / σ. 39/58

40 Βήµα 4: Αντιδραστήριο οπτικοποίησης Καρκίνος του στοµάχου Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Καλύψτε το δείγµα µε 3 σταγόνες (100 µl) αντιδραστηρίου οπτικοποίησης. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Πλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως περιγράφεται στο βήµα 3. Βήµα 5: ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως πριν. Καλύψτε το δείγµα µε 3 σταγόνες (100 µl) διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB). Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά. Ξεπλύνατε απαλά µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό από υδροβολέα (χωρίς να κατευθύνετε τη ροή απευθείας επάνω στον ιστό). Συλλέξτε το χρησιµοποιηµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) σε δοχείο επικίνδυνων υλικών προς διάθεση µε τον κατάλληλο τρόπο. Βήµα 6: Επίχρωση (οι οδηγίες αφορούν την αιµατοξυλίνη) Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό αιµατοξυλίνης. Επωάστε επί 2 5 λεπτά, ανάλογα µε την ισχύ της χρησιµοποιούµενης αιµατοξυλίνης. Ξεπλύντε απαλά σε λουτρό απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού. Βεβαιωθείτε ότι έχει αποµακρυνθεί κάθε ίχνος αποµένουσας αιµατοξυλίνης. Προαιρετικό: Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες 10 φορές σε λουτρό υδατικού διαλύµατος αµµωνίας 37 mmol/l (βλ. ενότητα A.4). Ξεπλύντε απαλά τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού επί 2 5 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανάλογα µε τη διάρκεια επώασης και τη δραστικότητα της χρησιµοποιούµενης αιµατοξυλίνης, η επίχρωση θα δώσει ένα χλωµό έως σκούρο µπλε χρωµατισµό των κυτταρικών πυρήνων. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. Βήµα 7: Στερέωση Συνιστάται η χρήση µη υδατικού υλικού µόνιµης στερέωσης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Τα δείγµατα είναι δυνατό να στερεωθούν πάνω στις αντικειµενοφόρους πλάκες και να καλυφθούν µε καλυπτρίδες µε ένα υλικό στερέωσης υδατικής βάσης όπως π.χ. το Faramount, Κωδικός S3025 ή το Glycergel, Κωδικός C0563, της Dako. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ανάγνωση των αντικειµενοφόρων πλακών είναι δυνατό να γίνει σε βολικό για σας χρόνο. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες έχουν καλυφθεί µε καλυπτρίδα µε χρήση υδατικού υλικού στερέωσης και εκτεθούν σε έντονο φως επί χρονικό διάστηµα µίας εβδοµάδας, ενδέχεται να λάβει χώρα ξεθώριασµα σε κάποιο βαθµό. Για την ελαχιστοποίηση του ξεθωριάσµατος, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Έλεγχος Ποιότητας - Στόµαχος Τυχόν διαφορές στην καθήλωση, την επεξεργασία και την ενσωµάτωση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να οδηγήσει σε σηµαντική διακύµανση των αποτελεσµάτων, τέτοια που να χρειάζεται η τακτική εκτέλεση εσωτερικών ελέγχων εκτός των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα που παρέχονται από την Dako. Στις Η.Π.Α., για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP), την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (24) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS) και τη βιβλιογραφική αναφορά 25. ( ) P04085GR_01_K / σ. 40/58

41 Καρκίνος του στοµάχου Πίνακας 8. Σκοπός του καθηµερινού ποιοτικού ελέγχου. Ιστός: καθηλωµένος και επεξεργασµένος όπως τα δείγµατα ασθενών Ειδικό αντίσωµα και δευτερεύον αντίσωµα Μη ειδικό αντίσωµα* ή ρυθµιστικό διάλυµα συν το ίδιο δευτερεύον αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε µαζί µε το ειδικό αντίσωµα Θετικός µάρτυρας: Ιστός ή κύτταρα που περιέχουν το αντιγόνο-στόχος προς ανίχνευση (είναι δυνατό να βρίσκεται στον ιστό ασθενούς). Ο ιδανικός µάρτυρας είναι ασθενώς θετικός ιστός χρώσης, επειδή αυτός είναι ο πλέον ευαίσθητος στη διάσπαση αντισώµατος ή αντιγόνου Ελέγχει όλα τα στάδια της ανάλυσης. Επικυρώνει τα χρησιµοποιούµενα αντιδραστήρια και τις διαδικασίες που εφαρµόζονται για τη χρώση πρωτεΐνης HER2 Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Αρνητικός µάρτυρας: Ιστοί ή κύτταρα που αναµένονται να είναι αρνητικοί (είναι δυνατό να βρίσκονται στον ιστό ασθενούς ή στον ιστό θετικού µάρτυρα) Ανίχνευση µη επιδιωκόµενης διασταυρούµενης αντίδρασης αντισώµατος µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Ιστός ασθενούς Ανίχνευση ειδικής χρώσης φόντου Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Αντικειµενοφόρος πλάκα που παρέχεται από την Dako Ελέγχει µόνον τη διαδικασία χρώσης * Ορός από τα ίδια είδη µε το ειδικό αντίσωµα, αλλά µη κατευθυνόµενος ενάντια του ίδιου αντιγόνου-στόχο. Για την ανίχνευση µη ειδικής σύνδεσης αντιγόνου, π.χ. δέσµευση του τµήµατος Fc του αντιγόνου από τον ιστό. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (παρέχεται): Καθεµιά από τις παρεχόµενες αντικειµενοφόρους πλάκες µάρτυρα περιέχει τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, σε µορφή ιζήµατος, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, µία αντικειµενοφόρος πλάκα πρέπει να υποβάλλεται σε χρώση. Με την αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα που παρέχεται από την Dako υποδεικνύεται η εγκυρότητα της ανάλυσης χρώσης. Ιστός θετικού µάρτυρα: Οι µάρτυρες πρέπει να είναι νωπά δείγµατα αυτοψίας, βιοψίας ή χειρουργικά, τα οποία έχουν υποβληθεί σε καθήλωση, επεξεργασία και ενσωµάτωση στον ελάχιστο δυνατό χρόνο και µε τον ίδιο τρόπο όπως και το(α) δείγµα(τα) ασθενών. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα υποδεικνύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών και των τεχνικών χρώσης. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, πρέπει να περιλαµβάνεται ένας ιστός θετικού µάρτυρα για κάθε σύνολο συνθηκών εξέτασης. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα πρέπει να δίνουν ασθενώς θετική χρώση, προκειµένου να επιτρέπουν την ανίχνευση ακόµη και ανεπαίσθητων µεταβολών της ευαισθησίας του πρωτεύοντος αντισώµατος. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που παρέχονται µαζί µε το κιτ αυτό ή τυχόν δείγµατα που υποβάλλονται σε επεξεργασία διαφορετική από το(α) δείγµα(τα) ασθενών επικυρώνουν µόνον την απόδοση των αντιδραστηρίων και δεν επαληθεύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών. Ως ιδανικό ιστό θετικού µάρτυρα, χρησιµοποιήστε ιστό από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής, στον οποίο έχει προηγουµένως εξακριβωθεί υπερέκφραση 2+ της πρωτεΐνης HER2. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Γνωστός ιστός θετικού µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνον για λόγους παρακολούθησης της ορθής απόδοσης των επεξεργασµένων ιστών και των αντιδραστηρίων εξέτασης και ΟΧΙ ως επικουρικό µέσο διατύπωσης ειδικής διάγνωσης δειγµάτων ασθενών. Εάν ο ιστός θετικού µάρτυρα δεν παρουσιάζει ορθή θετική χρώση, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. ( ) P04085GR_01_K / σ. 41/58

42 Καρκίνος του στοµάχου Ιστός αρνητικού µάρτυρα: Χρησιµοποιήστε ιστό αρνητικού µάρτυρα (γνωστού ως αρνητικού στην πρωτεΐνη HER2), καθηλωµένο, επεξεργασµένο και ενσωµατωµένο µε τρόπο πανοµοιότυπο µε το(α) δείγµα(τα) ασθενών, σε κάθε ανάλυση χρώσης για επαλήθευση της ειδικότητας του πρωτεύοντος αντισώµατος και την παροχή ένδειξης ειδικής χρώσης φόντου. Κατάλληλος για χρήση ως ιστός αρνητικού µάρτυρα είναι ιστός του κόλου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς. Η ποικιλία διαφορετικών τύπων κυττάρων, που υπάρχει στις περισσότερες ιστικές τοµές, προσφέρει εσωτερικές θέσεις αρνητικού µάρτυρα (αυτό θα πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη). Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα και η δοκιµή να ξαναγίνει. Μη ειδικό αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα: Χρησιµοποιήστε το παρεχόµενο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα αντί του πρωτεύοντος αντισώµατος, σε µια τοµή από κάθε δείγµα ασθενούς, για την αξιολόγηση µη ειδικής χρώσης και τη διευκόλυνση της ερµηνείας της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να αντιστοιχεί σε εκείνη του πρωτεύοντος αντισώµατος. Επαλήθευση προσδιορισµού: Πριν από την αρχική χρήση ενός αντισώµατος ή συστήµατος χρώσης σε µια διαγνωστική διαδικασία, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύει την ειδικότητα του αντισώµατος υποβάλλοντάς το σε εξέταση σε µια σειρά εργαστηριακών ιστών µε γνωστά ανοσοκυτταροχηµικά χαρακτηριστικά απόδοσης που αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκαν παραπάνω στην ενότητα αυτή του ένθετου προϊόντος και στις απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP) ή/και την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (24) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS). Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαµβάνονται για κάθε νέα παρτίδα αντισώµατος ή σε κάθε περίπτωση µεταβολής των παραµέτρων του προσδιορισµού. Αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, µε γνωστή ένταση χρώσης πρωτεΐνης HER2 που κυµαίνεται µεταξύ 0 και 3+, καθώς και αρνητικοί ιστοί, π.χ. του παχέος εντέρου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς, είναι κατάλληλοι για την επαλήθευση του προσδιορισµού. Ερµηνεία της χρώσης - Στόµαχος Για τον προσδιορισµό της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2, µόνον η ένταση και το σχήµα χρώσης της µεµβράνης πρέπει να αξιολογούνται µε την κλίµακα του Πίνακα 9. Η αξιολόγηση των αντικειµενοφόρων πλακών πρέπει να εκτελείται από παθολόγο µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την αξιολόγηση της ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης και βαθµολογίας, κρίνεται κατάλληλη η χρήση αντικειµενικού φακού µεγέθυνσης 10x. Η χρήση µεγέθυνσης 5 40x στον αντικειµενικό φακό είναι χρήσιµη για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος πρέπει να θεωρείται ως µη ειδική χρώση και δεν πρέπει να περιλαµβάνεται στην αξιολόγηση της έντασης χρώσης της µεµβράνης (8). Προς διευκόλυνση της διάκρισης ανάµεσα στις χρώσεις έντασης 0, 1+, 2+ και 3+, ανατρέξτε στο έγγραφο HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Εγχειρίδιο ερµηνειών HercepTest Καρκίνος του στοµάχου) της Dako, όπου περιλαµβάνονται αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες διαφόρων εντάσεων χρώσης. ( ) P04085GR_01_K / σ. 42/58

43 Καρκίνος του στοµάχου Μόνο δείγµατα από ασθενείς που πάσχουν από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, πρέπει να βαθµολογούνται. Σε περιπτώσεις εντερικής µεταπλασίας και γαστρικού αδενοκαρκινώµατος στο ίδιο δείγµα, µόνον το συστατικό του γαστρικού αδενοκαρκινώµατος πρέπει να βαθµολογείται. Για ερµηνεία των κεχρωσµένων µε HercepTest βιοψιών, συνιστάται συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. Μια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου αποτελείται από 5 συνδεόµενα κύτταρα όγκου κεχρωσµένα για HER2. Πίνακας 9. Ερµηνεία και βαθµολόγηση της ανοσοκυτταρικής χρώσης του HER2 Βαθµολογία Χειρουργικό δείγµα - Σχήµα χρώσης είγµα βιοψίας - Σχήµα χρώσης Αξιολόγηση υπερέκφρασης HER2 0 Καµία αντιδραστικότητα ή καµία µεµβρανική αντιδραστικότητα σε < 10% των κυττάρων του όγκου Καµία αντιδραστικότητα ή καµία µεµβρανική αντιδραστικότητα σε κανένα κύτταρο του όγκου (ή συστάδα < 5 κυττάρων) Αρνητικό 1+ Αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη αντιδραστικότητα σε 10% των κυττάρων του όγκου, τα κύτταρα αντιδρούν µόνο σε µέρος της µεµβράνης Συστάδα κυττάρων όγκου ( 5 κύτταρα) µε αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη µεµβρανική αντιδραστικότητα, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου Αρνητικό 2+ Ασθενής ως µέτρια πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα σε 10% των κυττάρων του όγκου Συστάδα κυττάρων όγκου ( 5 κύτταρα) µε ασθενή ως µέτρια πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου ιφορούµενη 3+ Ισχυρή πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα σε 10% των κυττάρων του όγκου Συστάδα κυττάρων όγκου ( 5 κύτταρα) µε ισχυρή πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου Θετική Οδηγίες βάσει των Hofmann et al. (40). Το HercepTest ερµηνεύεται ως αρνητικό (βαθµολόγηση 0 και 1+), διφορούµενο (βαθµολόγηση 2+) και θετικό (βαθµολόγηση 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Το HercepTest δεν προορίζεται για την παροχή προγνωστικών πληροφοριών στον ασθενή και στον ιατρό και δεν έχει επικυρωθεί για το σκοπό αυτό. Για κάθε ανάλυση χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να εξετάζονται µε τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 10 για τον προσδιορισµό της εγκυρότητας της ανάλυσης χρώσης και την ηµιποσοτική αξιολόγηση της έντασης χρώσης στον ιστό του δείγµατος. ( ) P04085GR_01_K / σ. 43/58

44 Καρκίνος του στοµάχου Πίνακας 10. Σειρά αξιολόγησης των αντικειµενοφόρων πλακών. Σειρά αξιολόγησης των αντικειµενοφόρων πλακών Αιτιολογία 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που περιέχει τις τρεις κυτταρικές σειρές Η παρουσία καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης (περιφερειακή χρώση) 3+ στο 3+ Control Cell Line SK-BR-3, µερικώς καφέ περιφερειακή χρώση στο 1+ Control Cell Line MDA-175 και καµία χρώση στο 0 Control Cell Line MDA-231 υποδεικνύουν έναν έγκυρο προσδιορισµό. Παρουσία στικτής και ασυνεχούς χρώσης µεµβράνης σε µικρό έως µέτριο αριθµό των κυττάρων του ασθενώς θετικού 1+ Control Cell Line MDA-175. Επίσης, δυνατότητα παρατήρησης ανοσοχρώσης σε µορφή κουκκίδων στην περιοχή Golgi του κυτταροπλάσµατος σε αυτήν την κυτταρική σειρά. Παρουσία καφέ χρώσης στο 0 Control Cell Line MDA-231 (αρνητικό για χρώση πρωτεΐνης HER2) υποδεικνύει ότι έλαβε χώρα µη ειδική χρώση κατά τον προσδιορισµό. Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού ενδέχεται να µην είναι έγκυρα λόγω υπερβολικής χρώσης. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης µεµβράνης. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών δεν πρέπει να υπερβαίνει το Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα Η ΑΠΟΥΣΙΑ ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση µεµβράνης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. 4. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Αντιδραστήρια 5. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το πρωτεύον αντίσωµα Απουσία ειδικής χρώσης µεµβράνης επαληθεύει την ειδική σήµανση του αντιγόνου-στόχου από το πρωτεύον αντίσωµα. Λοιπές καστανόχρυσες ή καφέ χρώσεις που λαµβάνουν χώρα στο κυτταρόπλασµα του δείγµατος που έχει υποστεί επεξεργασία µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα, όπως π.χ. σε συνδετικό ιστό, λευκοκύτταρα, ερυθροκύτταρα ή νεκρωτικό ιστό, πρέπει να θεωρούνται ως µη ειδική χρώση φόντου και πρέπει να αναφέρονται κάτω στην ενότητα σχολίων του υπολογιστικού φύλλου δεδοµένων. Όταν ανιχνεύεται υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 στο δείγµα, αυτή εµφανίζεται ως καφέ περιφερειακή χρώση εντοπισµένη στην κυτταρική µεµβράνη των κυττάρων του όγκου που έχουν υποστεί επεξεργασία µε το πρωτεύον αντίσωµα. 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (παρέχεται): Η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που είναι κεχρωσµένη µε HercepTest, πρέπει να εξετάζεται πρώτη προς επιβεβαίωση ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν κανονικά. Η παρουσία καφέ προϊόντος αντίδρασης (3,3 -διαµινοβενζιδίνη, DAB) στην κυτταρική µεµβράνη υποδεικνύει θετική αντιδραστικότητα. Η παρουσία καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης (περιφερειακή χρώση) στο 3+ Control Cell Line SK-BR-3, µερικώς καφέ περιφερειακή χρώση στο 1+ Control Cell Line MDA-175 και καµία χρώση στο 0 Control Cell Line MDA-231 υποδεικνύουν έναν έγκυρο προσδιορισµό. Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα δεν πληρούν τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα: Αµέσως, µετά πρέπει να εξεταστεί η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό θετικού µάρτυρα. Αυτή η αντικειµενοφόρος πλάκα επαληθεύει ότι η µέθοδος καθήλωσης και η διαδικασία ανάκτησης επίτοπου είναι αποτελεσµατικές. Χρησιµοποιείτε άθικτα κύτταρα για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα συχνά παρουσιάζουν µη ειδική χρώση (26). Η χρώση πρέπει να παρατηρείται στον ιστό του όγκου µε τη µορφή καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης. Η καφέ χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών στο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει τη βαθµολογία έντασης χρώσης του 1+. ( ) P04085GR_01_K / σ. 44/58

45 Καρκίνος του στοµάχου 3. Ιστός αρνητικού µάρτυρα: Η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό αρνητικού µάρτυρα πρέπει να εξεταστεί αµέσως µετά, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήµανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτεύον αντίσωµα. Η απουσία ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Εναλλακτικά, µπορείτε να χρησιµοποιήσετε αρνητικά µέρη του ιστού θετικού µάρτυρα ως ιστό αρνητικού µάρτυρα, αλλά αυτό πρέπει να επαληθευτεί από το χρήστη. Σηµειώνεται ότι είναι δυνατό να παρατηρηθεί ασθενής αντίδραση (ένταση χρώσης 0-1+) στους περισσότερους φυσιολογικούς επιθηλιακούς ιστούς. Στους πιθανούς ιστούς αρνητικού µάρτυρα περιλαµβάνονται ιστοί από τα παρακάτω σηµεία: κόλον, ήπαρ και θυρεοειδής. Η µη ειδική χρώση, εάν υπάρχει, θα έχει διάχυτη όψη. Ενδέχεται επίσης να παρατηρηθεί σποραδική χρώση συνδετικού ιστού σε τοµές από ιστούς υπερβολικά καθηλωµένους σε φορµαλίνη Ιστός ασθενή: Τελευταία εξετάζονται τα δείγµατα ασθενών, που είναι κεχρωσµένα µε HercepTest. Θα πρέπει να διαπιστωθεί θετική χρώση, ενδεχοµένως εντός µη ειδικής χρώσης φόντου του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Όπως συµβαίνει µε κάθε ανοσοκυτταροχηµική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα ή στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισµό. Για πιο συγκεκριµένες πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοδραστικότητα του HercepTest, ανατρέξτε στις ενότητες Περίληψη και επεξήγηση, Περιορισµοί και Χαρακτηριστικά απόδοσης. Πρόσθετες συστάσεις για την ερµηνεία χρώσης HercepTest Στο αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, που εξετάζεται για υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, δίνεται βαθµολογία 0 έως 3+. Παρ' ότι οι περιπτώσεις 0 και 3+ είναι πέραν πάσης αµφιβολίας, ένα µικρό ποσοστό των υπόλοιπων δειγµάτων 1+ και 2+ ενδέχεται να παρουσιάζει µεγαλύτερη δυσκολία στην ερµηνεία. Για την ερµηνεία της χρώσης HercepTest στο εργαστήριό σας, εφαρµόστε τις παρακάτω κατευθυντήριες οδηγίες. Για να επαληθεύσετε την απόδοση του προσδιορισµού, αξιολογήστε τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα. Αξιολογήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες θετικού και αρνητικού µάρτυρα. Για την πρώτη αξιολόγηση, συνιστάται χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγµατος. (Ο όγκος ενδέχεται να µην είναι εµφανής όταν παρατηρείτε το κεχρωσµένο µε HercepTest δείγµα. Η κεχρωσµένη µε H&E αντικειµενοφόρος πλάκα απαιτείται για να επιτρέψει στον παθολόγο να εντοπίσει την παρουσία του όγκου.). Το HercepTest πρέπει να διεξάγεται σε τοµές κατά ζεύγη (σειριακές τοµές) από το ίδιο µπλοκ παραφίνης του δείγµατος. Αξιολογήστε πρώτα τις κεχρωσµένες για υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 τοµές χαµηλής βαθµολογίας. Η πλειοψηφία των θετικών περιπτώσεων θα είναι προφανής σε µικρή µεγέθυνση. Για τις περιπτώσεις 1+, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 40x για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Για τις περιπτώσεις 2+, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 10x 20x για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Χειρουργικά δείγµατα Πρέπει να χρησιµοποιηθούν οι καλοδιατηρηµένες και καλά κεχρωσµένες περιοχές του δείγµατος, για τον εντοπισµό των επί τοις εκατό θετικών κυττάρων όγκου. Εάν η πλειοψηφία των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία χρώσης είναι είτε 2+ είτε 3+. Εάν διαπιστωθεί πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική χρώση µεµβράνης ισχυρής έντασης σε ποσοστό ίσο ή µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος είναι 3+. Εάν διαπιστωθεί πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική χρώση µεµβράνης ασθενούς ως µέτριας έντασης σε ποσοστό ίσο ή µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος είναι 2+. ( ) P04085GR_01_K / σ. 45/58

46 Καρκίνος του στοµάχου Αν ένα ποσοστό ίσο ή µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου στα χειρουργικά δείγµατα, τα κεχρωσµένα µόνο σε µέρος της µεµβράνης, έχουν αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη ένταση, η βαθµολογία του δείγµατος είναι 1+. Εάν λιγότερο από το 10% των κυττάρων του όγκου στα χειρουργικά δείγµατα παρουσιάζουν χρώση, ανεξάρτητα από το πρότυπο χρώσης (π.χ. πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική ή χρώση µέρους της µεµβράνης), η βαθµολογία είναι 0. Αν δεν παρατηρηθεί χρώση, η βαθµολογία του χειρουργικού δείγµατος είναι 0. είγµατα βιοψίας Μια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου αποτελείται από 5 συνδεόµενα κύτταρα όγκου κεχρωσµένα για HER2. Αν υπάρχει συστάδα κυττάρων όγκου µε τουλάχιστον 5 κεχρωσµένα κύτταρα όγκου µε ισχυρή πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική χρώση, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 3+, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. Αν υπάρχει συστάδα κυττάρων όγκου µε τουλάχιστον 5 κεχρωσµένα κύτταρα όγκου µε ασθενή ως µέτρια πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική χρώση, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 3+, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. Αν υπάρχει συστάδα κυττάρων όγκου µε τουλάχιστον 5 κεχρωσµένα κύτταρα όγκου µε αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική χρώση και τα κύτταρα είναι κεχρωσµένα µόνο σε µέρος της µεµβράνης τους, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 1+, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. Αν δεν παρατηρηθεί χρώση ή µεµβρανική χρώση σε λιγότερα από 5 κύτταρα του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 0. Περιορισµοί - Στόµαχος Γενικοί περιορισµοί 1. Η ανοσοκυτταροχηµεία είναι µια πολυβάθµια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, καθήλωση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιµασία της αντικειµενοφόρου πλάκας ανοσοκυτταροχηµείας και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης. 2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρµανση, τοµή ή µόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήµατα, παγίδευση αντισώµατος ή εσφαλµένως αρνητικά αποτελέσµατα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και ενσωµάτωσης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. 4. Η κλινική ερµηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της µορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερµηνεία οποιασδήποτε χρώσης ή η απουσία της πρέπει να συµπληρώνεται από µορφολογικές µελέτες και κατάλληλους ελέγχους, καθώς και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερµηνεία του κεχρωσµένου παρασκευάσµατος αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευµένου παθολόγου, που είναι εξοικειωµένος µε τα χρησιµοποιούµενα αντισώµατα και αντιδραστήρια και τις εφαρµοζόµενες µεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρµόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσµένων αντικειµενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών µαρτύρων. 5. Ιστοί από άτοµα µολυσµένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου (27). ( ) P04085GR_01_K / σ. 46/58

47 Καρκίνος του στοµάχου 6. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να προκαλέσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που δεν έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις ακόµη και σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσµατα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς (28). Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τεκµηριωµένες απροσδόκητες αντιδράσεις, απευθυνθείτε στο τµήµα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της Dako. 7. Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω µη ανοσολογικής δέσµευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώµατος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν από δραστηριότητα ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωµα C) (28). 8. Η διαδικασία χρώσης πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος C. Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν 1. Το αντιγόνο που υπάρχει στο 1+ Control Cell Line MDA-175 υπόκειται σε αποδόµηση µε την πάροδο του χρόνου. Αξιολογείτε τα αποτελέσµατα της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα σε συνδυασµό µε την ηµεροµηνία λήξης της. Τυχόν αρνητική χρώση των κυττάρων του MDA-175 υποδεικνύει µόνον ότι η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα ενδέχεται να έχει αλλοιωθεί. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. 2. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόµηση του αντιγόνου στους ιστούς µε την πάροδο του χρόνου. Η χρώση των δειγµάτων πρέπει να γίνεται εντός 4 6 εβδοµάδων µετά την τοποθέτηση των δειγµάτων σε πλάκες, όταν αποθηκεύονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (29). 3. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα, για την πρωτεΐνη HER2 απαιτείται θερµικά επαγόµενη ανάκτηση επίτοπου, όταν οι ιστοί καθηλώνονται (σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη) και ενσωµατώνονται σε παραφίνη στα πλαίσια διαδικασιών ρουτίνας. Αυτή η προκατεργασία πρέπει να ολοκληρώνεται στην αρχή ολόκληρης της διαδικασίας χρώσης. Για οδηγίες, ανατρέξτε στην ενότητα Προετοιµασία δειγµάτων, υποενότητα Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση. 4. Η θερµικά επαγόµενη ανάκτηση επιτόπου της πρωτεΐνης HER2 πρέπει να εκτελείται µόνο µε βαθµονοµηµένο υδατόλουτρο. Έχουν δοκιµαστεί και άλλες µέθοδοι θέρµανσης, αλλά δεν δίνουν αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. 5. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια του κιτ µε αντιδραστήρια άλλων αριθµών παρτίδας ή άλλων κατασκευαστών. Εξαιρείται µόνον το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης, το οποίο είναι δυνατό να αντικατασταθεί µε το Dako Wash Buffer, Κωδικός S Ψευδή αποτελέσµατα είναι δυνατό να ληφθούν από την αξιολόγηση κυτοπλασµατικής χρώσης. Κατά την ερµηνεία αποτελεσµάτων, να λαµβάνετε υπόψη σας µόνον την ένταση της χρώσης στην κυτταρική µεµβράνη. 7. Οι κεχρωσµένες αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για επικύρωση της ανάλυσης χρώσης και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως οδηγός βαθµολόγησης της αντίδρασης χρώσης σε ιστικές τοµές. 8. Περιστασιακά, είναι δυνατό να παρατηρηθεί έντονη εστιασµένη χρώση (3+), τα λεγόµενα θερµά σηµεία. Αυτό ενδέχεται να είναι αποτέλεσµα ανοµοιόµορφης καθήλωσης ή/και επεξεργασίας του ιστού. Στην περίπτωση αυτή, συνιστάται η ανοσοχρώση δεύτερου τεµαχίου ιστού από το ίδιο δείγµα. 9. Η εφαρµογή του HercepTest σε δείγµατα καθηλωµένα σε καθηλωτικά διαφορετικά από την ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη ή το καθηλωτικό του Bouin δεν έχει επικυρωθεί. 10. Σηµειώνεται ότι τα φυσιολογικά επιθήλια αµυγδαλών και οισοφάγου ενδέχεται να παρουσιάσουν χρώση έντασης µέχρι και Η χρήση συνθλιµµένων δειγµάτων καρκίνου του στοµάχου και η ερµηνεία τεχνηµάτων γύρω από τα άκρα της βιοψίας πρέπει να αποφεύγονται. ( ) P04085GR_01_K / σ. 47/58

48 Καρκίνος του στοµάχου Χαρακτηριστικά απόδοσης - Στόµαχος Ιστορικό Η ασφάλεια και η αποτελεσµατικότητα του (Herceptin ) αποδείχθηκε σε κλινική µελέτη (τη δοκιµή ToGA) (38, 39). Η µελέτη σχεδιάστηκε ως µελέτη ανοιχτής επισήµανσης, φάσης III, τυχαιοποιηµένη, πολυκεντρική, σε ασθενείς που ανιχνεύθηκαν µε θετικό HER2 και µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Στη δοκιµή ToGA, η θετικότητα σε HER2 ορίστηκε ως θετική µε IHC (3+) (HercepTest, Dako) ή/και θετική µε HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako).. Αφού συµπεριελήφθησαν στη µελέτη, οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν για να υποβληθούν σε χηµειοθεραπεία (5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη) ή χηµειοθεραπεία σε συνδυασµό µε trastuzumab. Το βασικό τελικό σηµείο στη µελέτη ήταν η συνολική βιωσιµότητα (OS). Στη µελέτη, τυχαιοποιήθηκε ένα σύνολο 594 ασθενών και 584 ασθενείς έλαβαν τη φαρµακευτική αγωγή της µελέτης και συµπεριλήφθηκαν στο σύνολο των αναλύσεων (FAS). Για το βασικό τελικό σηµείο, ο συνδυασµός χηµειοθεραπείας και trastuzumab απεδείχθη στατιστικά ανώτερος από µόνη τη χηµειοθεραπεία. Η µέση συνολική βιωσιµότητα OS αυξήθηκε από 11,1 σε 13,8 µήνες (p=0,0046) µε αναλογία κινδύνου 0,74 (95% CI: 0,60 0,91). Οι καµπύλες Kaplan-Meier για την OS φαίνονται στο Σχήµα 1. Πιθανότητα επιβίωσης 1,0 0,9 0,8 0,7 Έλεγχος ηµερολογίου κατάταξης P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Χρόνος (µήνες) Αριθ. υπολοίπου Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Οµάδα θεραπείας Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Σχήµα 1. Καµπύλη Kaplan-Meier για την OS (n=584). ( ) P04085GR_01_K / σ. 48/58

49 Καρκίνος του στοµάχου Προκαθορισµένες διερευνητικές αναλύσεις υποοµάδων ως προς την κατάσταση HER2 διενεργήθηκαν µόλις τα δεδοµένα κατέστησαν διαθέσιµα. ύο νέες υποοµάδες HER2 καθορίστηκαν post hoc µε βάση τη βαθµολογία IHC: Οµάδα 1 ( οµάδα χαµηλής έκφρασης HER2 ): Οµάδα 2 ( οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 ): IHC 0/FISH+ και IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ και IHC 3+ (FISH+ ή FISH- ή FISH κανένα αποτέλεσµα (n=446) Όταν έγινε επανάληψη post hoc της βασικής ανάλυσης της OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 (n=446), το όφελος υπέρ της συνδυασµένης θεραπείας ήταν ακόµα µεγαλύτερο. Η µέση OS για την οµάδα των ασθενών που είχαν υποβληθεί σε χηµειοθεραπεία σε συνδυασµό µε το trastuzumab παρουσίασε αύξηση 16,0 µηνών σε σύγκριση µε τους 11,8 µήνες που ίσχυε για τους ασθενείς που υποβλήθηκαν µόνο σε χηµειοθεραπεία. Η αναλογία κινδύνου για αυτήν την ανάλυση µειώθηκε στο 0,65 (95% CI: 0,51 0,83). Οι καµπύλες Kaplan-Meier για την OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 φαίνονται στο Σχήµα 2. Πιθανότητα επιβίωσης 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Χρόνος (µήνες) Αριθ. υπολοίπου Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Οµάδα θεραπείας Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Σχήµα 2. Καµπύλη Kaplan-Meier για την OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 (n=446). Η δοκιµή ToGA έδειξε ότι ο συνδυασµός των µεθόδων IHC και FISH είναι προβλεπτικός για το αποτέλεσµα της συνδυασµένης θεραπείας µε χηµειοθεραπεία και trastuzumab, ωστόσο οι διερευνητικές post hoc αναλύσεις φαίνεται να δείχνουν ότι ασθενείς µε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης HER2 (IHC2+/FISH+ και IHC3+) αποκοµίζουν το µεγαλύτερο όφελος. Αυτό µπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι η πρωτεΐνη αποτελεί το στόχο για το trastuzumab. Για περισσότερες πληροφορίες για τη δοκιµή ToGA, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του Herceptin. ( ) P04085GR_01_K / σ. 49/58

50 Καρκίνος του στοµάχου Αναπαραγωγιµότητα Αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό: Η αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό ελέγχθηκε σε ένα εργαστήριο µε 11 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας χρώσης IΗC. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις τριπλούν. Το πρωτόκολλο αυτό εφαρµόστηκε στη µη αυτοµατοποιηµένη χρώση. Όλα τα δείγµατα έδωσαν 100% αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Η αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό ελέγχθηκε σε ένα εργαστήριο µε 3 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας χρώσης IΗC. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις τριπλούν. Το πρωτόκολλο αυτό εφαρµόστηκε σε αυτοµατοποιηµένη χρώση. Όλα τα δείγµατα έδωσαν 100% αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Επαναληψιµότητα µεταξύ κύκλων και µεταξύ εργαστηρίων: Έγινε ανάλυση HercepTest σε 60 διαφορετικά δείγµατα καρκίνου του στοµάχου, που ελήφθησαν από περιοχές του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής και προήλθαν από χειρουργικές εξαιρέσεις και βιοψίες, επί πέντε µη διαδοχικές ηµέρες σε τρία κέντρα µελέτης. Τα 60 δείγµατα της µελέτης διανεµήθηκαν ισοµερώς στις τρεις κατηγορίες κατάστασης HER2. ιεξήχθησαν συνολικά 2040 βαθµολογήσεις HER2 από έξι παθολογοανατόµους. Η µεταξύ ηµερών συµφωνία (αρνητική, διφορούµενη, θετική) κυµάνθηκε από 83,1% έως 98,3%. Σε 47 από τις 60 πιθανές συγκρίσεις, η συµφωνία ήταν 90,0% ή παραπάνω. Στον Πίνακα 11, παρουσιάζονται συγκεκριµένα παραδείγµατα των συγκρίσεων µεταξύ ηµερών µε τη µέση συµφωνία να είναι 91,2%, 92,5% και 92,5% για τα τρία κέντρα. Η συµφωνία µεταξύ κέντρων ήταν 82,7%, 75,0% και 88,0%, αντίστοιχα, για σύγκριση κέντρων κατά ζεύγη (βλ. Πίνακα 12). Σύµφωνα µε τον έλεγχο Fisher s exact test, τα αποτελέσµατα δεν διέφεραν µεταξύ κέντρων. Η συµφωνία µεταξύ των παρατηρητών παθολογοανατόµων σε κάθε κέντρο ήταν 88,0%, 83,6% και 81,0% για τα τρία κέντρα µελέτης, αντίστοιχα (Πίνακας 13). Συµπερασµατικά, η ανάλυση HercepTest των δειγµάτων καρκίνου του στοµάχου σε τρία κέντρα µελέτης κατέδειξε καλή συµφωνία παρατηρήσεων µεταξύ ηµερών, κέντρων και παρατηρητών. Πίνακας 11. Συνολικά ποσοστά συµφωνίας µεταξύ ηµερών - Υποσύνολο 12 εκ των 60 συγκρίσεων Κέντρο 1 Κέντρο 2 Κέντρο 3 Παρατηρητής 1 Παρατηρητής 2 Μέσος όρος Συµφωνία CI95 LL 1 Συµφωνία CI95 LL 1 Συµφωνία Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 2 85,0 74,4 93,3 84,9 91,2 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 2 95,0 87,3 83,1 72,0 92,5 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 2 90,0 80,5 91,7 82,7 92,5 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95% διάστηµα εµπιστοσύνης κατώτατου ορίου. ( ) P04085GR_01_K / σ. 50/58

51 Καρκίνος του στοµάχου Πίνακας 12. Συνολικά ποσοστά συµφωνίας µεταξύ κέντρων Συµφωνία CI95 LL 1 Μέσος όρος συµφωνίας Κέντρο 1 έναντι Κέντρου 2 Κέντρο 1 έναντι Κέντρου 3 Κέντρο 2 έναντι Κέντρου 3 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 1 83,3 72,4 Ηµέρα 2 έναντι Ηµέρας 2 85,0 74,4 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 3 85,0 74,4 Ηµέρα 4 έναντι Ηµέρας 4 81,7 70,5 Ηµέρα 5 έναντι Ηµέρας 5 78,3 66,7 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 1 80,0 68,6 Ηµέρα 2 έναντι Ηµέρας 2 73,3 61,2 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 3 78,3 66,7 Ηµέρα 4 έναντι Ηµέρας 4 68,3 55,9 Ηµέρα 5 έναντι Ηµέρας 5 75,0 63,0 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 1 88,3 78,5 Ηµέρα 2 έναντι Ηµέρας 2 86,7 76,4 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 3 90,0 80,5 Ηµέρα 4 έναντι Ηµέρας 4 86,7 76,4 Ηµέρα 5 έναντι Ηµέρας 5 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 1 CI95 LL: 95% διάστηµα εµπιστοσύνης κατώτατου ορίου. Πίνακας 13. Ποσοστά συµφωνίας µεταξύ παρατηρητών Συµφωνία CI 95 LL 1 Μέσος όρος συµφωνίας Κέντρο 1 Ηµέρα 1 91,7 82,7 Ηµέρα 2 91,7 82,7 Ηµέρα 3 93,3 84,9 88,0 Κέντρο 2 Κέντρο 3 Ηµέρα 4 83,3 72,4 Ηµέρα 5 80,0 68,6 Ηµέρα 1 86,4 76,0 Ηµέρα 2 83,3 72,4 Ηµέρα 3 83,3 72,4 Ηµέρα 4 83,3 72,4 Ηµέρα 5 81,7 70,5 Ηµέρα 1 80,0 68,6 Ηµέρα 2 78,3 66,7 Ηµέρα 3 80,0 68,6 Ηµέρα 4 78,3 66,7 Ηµέρα 5 90,0 80,5 83,6 81,0 1 CI95 LL: 95% διάστηµα εµπιστοσύνης κατώτατου ορίου. ( ) P04085GR_01_K / σ. 51/58

52 Καρκίνος του στοµάχου Ανοσοαντιδραστικότητα Στον Πίνακα 14 παρατίθεται περιληπτικά η ανοσοαντιδραστικότητα του HercepTest µε το συνιστώµενο σύνολο φυσιολογικών ιστών. Όλοι οι ιστοί ήταν καθηλωµένοι στη φορµαλίνη και ενσωµατωµένη σε παραφίνη και είχαν υποβληθεί σε χρώση µε HercepTest σύµφωνα µε τις οδηγίες του ένθετου συσκευασίας. Πίνακας 14. Σύνοψη της αντιδραστικότητας του HercepTest µε φυσιολογικούς ιστούς. Τύπος ιστών (πλήθος εξετασθέντων) Επινεφρίδιο (3) Μυελός των οστών (3) Εγκέφαλος/Παρεγκεφαλίδα (3) Εγκέφαλος/Κύριο τµήµα εγκεφάλου (3) Μαστός (3) Τράχηλος της µήτρας (3) Κόλον (3) Οισοφάγος (3) Καρδιά (3) Νεφρός (3) Ήπαρ (3) Πνεύµονας (3) Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) Ωοθήκη (3) Πάγκρεας (3) Παραθυρεοειδής (3) Περιφερικό νεύρο (3) Υπόφυση (3) Προστάτης (3) Σιελογόνος αδένας (3) Σκελετικός µυς (3) έρµα (3) Λεπτό έντερο (3) Σπλήνας (3) Στόµαχος (3) Όρχις (3) Θύµος αδένας (3) Θυρεοειδής (3) Αµυγδαλή (3) Μήτρα (3) Στοιχεία του ιστού µε θετική χρώση και σχήµα χρώσης Μαστικός αδένας (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+) Σωληνάρια του νεφρικού µυελού (3/3 ιστών, 1 2+ σε 5 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Προστατικός αδένας/αγωγοί (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Ιδρωτοποιοί αδένες (1/3 ιστών, 1+, 30% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Κυλινδρικό επιθήλιο, επιφάνεια (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 2+, 25% των κυττάρων) Επιθήλιο (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 25% των κυττάρων) Πλακώδες επιθήλιο (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+), 80% των κυττάρων) Η αναφερθείσα χρώση σε όλους τους ιστούς ήταν χρώση µεµβράνης, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Και τα τρία δείγµατα από κάθε τύπο ιστού είχαν την ίδια ένταση χρώσης εκτός αν σηµειώνεται διαφορετικά. ( ) P04085GR_01_K / σ. 52/58

53 Καρκίνος του στοµάχου Αντιµετώπιση προβληµάτων - Στόµαχος Ανατρέξτε στην ενότητα περί αντιµετώπισης προβληµάτων του προαναφερθέντος εγχειριδίου της Dako (19) για ενέργειες αποκατάστασης ή απευθυνθείτε στο τµήµα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της Dako για να αναφέρετε τυχόν ασυνήθιστη χρώση. Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Καµία χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών 1α. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιήθηκαν µε τη σωστή ειρά 1α. Μελετήστε τις οδηγίες εφαρµογής των αντιδραστηρίων 2. Ασθενής χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών 1β. Αζίδιο του νατρίου στο διάλυµα πλύσης 1γ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. 2α. Ανεπαρκής ανάκτηση επίτοπου 2β. Ανεπαρκείς χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια 2γ. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης 2δ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντική µείωση της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. 2ε. Εφαρµόστηκε ανεπαρκής όγκος αντιδραστηρίου 1β. Χρησιµοποιήστε φρέσκο παρασκεύασµα ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης που περιλαµβάνεται στο κιτ 1γ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας 17). 2α. Βεβαιωθείτε ότι το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου έχει φτάσει τους C επί 40 ολόκληρα λεπτά και έχει αφεθεί να κρυώσει επί άλλα 20 λεπτά 2β. Μελετήστε τις οδηγίες της διαδικασίας χρώσης 2γ. Βεβαιωθείτε ότι ο ιστός του ασθενούς δεν έχει υποβληθεί σε υπερβολική καθήλωση, καθώς και ότι δεν χρησιµοποιήθηκε εναλλακτικό καθηλωτικό 2δ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας 17). 2ε. Ελέγξτε πόσος όγκος αντιδραστηρίου εφαρµόστηκε ( ) P04085GR_01_K / σ. 53/58

54 Καρκίνος του στοµάχου Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 3. Εκτεταµένη χρώση φόντου των αντικειµενοφόρων πλακών 3α. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3α. Χρησιµοποιήστε φρέσκα διαλύµατα καθαρισµού και ακολουθήστε τις διαδικασίες, όπως αυτές περιγράφονται στην ενότητα B.1 4. Ο ιστός αποκολλάται από τις αντικειµενοφόρους πλάκες 5. Υπερβολικά έντονη ειδική χρώση 3β. Χρησιµοποιήθηκαν πρόσθετα αµύλου για τη στερέωση των τοµών στις αντικειµενοφόρους πλάκες 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν εκπλύθηκαν σχολαστικά 3δ. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διαδικασία χρώσης 3ε. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης 3στ. Μη ειδική δέσµευση αντιδραστηρίων στον ιστό 4α. Χρήση εσφαλµένων αντικειµενοφόρων πλακών 5α. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης 5β. Εφαρµογή εσφαλµένης πηγής θερµότητας για την ανάκτηση επίτοπου, π.χ. συσκευή παραγωγής ατµού, φούρνος µικροκυµάτων ή αυτόκαυστο 5γ. Υπερβολικά µεγάλοι χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια 5δ. Χρήση εσφαλµένου διαλύµατος πλύσης 3β. Αποφύγετε τη χρήση πρόσθετων αµύλου για την πρόσφυση των τοµών στο κρύσταλλο των αντικειµενοφόρων πλακών. Πολλά πρόσθετα είναι ανοσοαντιδραστικά 3γ. Χρησιµοποιήστε φρέσκο διάλυµα στα λουτρά ρυθµιστικού διαλύµατος και στις φιάλες πλύσης 3δ. Χρησιµοποιήστε θάλαµο υγρασίας. Σκουπίζετε µόνον τρεις έως τέσσερις αντικειµενοφόρους πλάκες κάθε φορά, προτού εφαρµόσετε το αντιδραστήριο 3ε. Βεβαιωθείτε ότι έχει χρησιµοποιηθεί εγκεκριµένο καθηλωτικό. Η τυχόν χρήση εναλλακτικού καθηλωτικού ενδέχεται να προκαλέσει εκτεταµένη χρώση φόντου 3στ. Ελέγξτε τη µέθοδο καθήλωσης του δείγµατος και τυχόν παρουσία νέκρωσης 4α. Χρησιµοποιήστε σιλανοποιηµένες αντικειµενοφόρους πλάκες, όπως π.χ. τις Dako Silanized Slides, Κωδικός S3003, τις SuperFrost Plus ή τις αντικειµενοφόρους πλάκες µε επίστρωση πολυ-lλυσίνης 5α Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείτε µόνον εγκεκριµένα καθηλωτικά και εφαρµόζετε εγκεκριµένες µεθόδους καθήλωσης 5β. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιείτε µόνον υδατόλουτρο για το στάδιο ανάκτησης επίτοπου 5γ. Μελετήστε τις οδηγίες της διαδικασίας χρώσης 5δ. Χρησιµοποιήστε µόνον το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης που συνιστάται για το κιτ αυτό ( ) P04085GR_01_K / σ. 54/58

55 Καρκίνος του στοµάχου Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 6. Ασθενής χρώση της κυτταρικής σειράς της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα 1+ 6α. Εφαρµογή εσφαλµένου πρωτοκόλλου ανάκτησης επίτοπου 6α. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο προθερµασµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου. Επαναφέρετε τη θερµοκρασία του διαλύµατος ανάκτησης επίτοπου στους C και προεπεξεργαστείτε επί 40 ολόκληρα λεπτά 7. Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου έχει νεφελώδη εµφάνιση όταν θερµαίνεται 8. Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου έχει νεφελώδη εµφάνιση όταν αποθηκεύεται (πριν θερµανθεί) 6β. Καµία αντίδραση µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) 6γ. Αλλοίωση της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα 7. Όταν θερµαίνεται, το διάλυµα αποκτά νεφελώδη εµφάνιση 8. Το διάλυµα αποθηκεύτηκε σε λανθασµένες συνθήκες ή έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης του διαλύµατος 6β. Βεβαιωθείτε ότι η επώαση διαρκεί 10 ολόκληρα λεπτά. Βεβαιωθείτε ότι προσθέσατε µόνο µία σταγόνα χρωµογόνου DAB σε 1 ml ρυθµισµένου υποστρώµατος DAB 6γ. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης του κιτ και τις συνθήκες φύλαξής του, που αναγράφονται στο εξωτερικό της συσκευασίας 7. Αυτό είναι φυσιολογικό και δεν επηρεάζει τη χρώση 8. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης και τις συνθήκες αποθήκευσης του κιτ στο εξωτερικό της συσκευασίας. Απορρίψτε το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε κάποιο από τα παραπάνω αίτια ή εάν η προτεινόµενη ενέργεια δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβληµα, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την προετοιµασία δειγµάτων στο προαναφερθέν εγχειρίδιο της Dako (19) (που διατίθεται από την Dako), στο Atlas of Immunohistology (30) και στο Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04085GR_01_K / σ. 55/58

56 Αναφορές 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an antip185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4: Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides, Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: ( ) P04085GR_01_K / σ. 56/58

57 26. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press). 33. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04085GR_01_K / σ. 57/58

58 Αναφορές Επεξήγηση συµβόλων Αριθµός καταλόγου Περιορισµοί θερµοκρασίας Κωδικός παρτίδας Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Εύθραυστο, να χρησιµοποιείται µε προσοχή Ηµεροµηνία λήξης Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Συµβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Περιεχόµενο επαρκές για «ν» εξετάσεις Κατασκευαστής Παρασκευάζεται από την ιανέµεται στις ΗΠΑ από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Τηλ Φαξ Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Τηλ. 805/ , ωρεάν: 800/ Πληροφορίες για παραγγελίες: Τηλ. 800/ Φαξ 805/ Τεχνική Υπηρεσία: Τηλ. 800/ Τα HercepTest και Herceptin είναι εµπορικά σήµατα της Genentech, Inc. και είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν µετά από ειδική άδεια της Dako Denmark A/S και της F. Hoffmann-La Roche Ltd. ( ) P04085GR_01_K / σ. 58/58