ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Διάμετρος 3, 5, 1 μm Λογισμικό επεξεργασίας Δυνατότητα βαθμιδωτής έκλουσης Στενές σωληνώσεις 4 psi 1 ml/min Καθορισμένου όγκου 1-2 μl Στατική Φάση Προσδιοριζόμενη Ουσία Κινητή Φάση Ανοξείδωτο χάλυβα Ποικιλία υλικών πλήρωσης Μήκος 1 έως 3 cm Εσωτερική διάμετρος 4 έως 1 mm Διάμετρος σωματιδίων πλήρωσης 1 έως 1 μm 3
Αλληλεπίδραση προσδιοριζόμενων ουσιών με τις επιφάνειες των υλικών πλήρωσης 4 Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις Κανονικής φάσης Αντίστροφης φάσης 5
Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις
Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις Προηγμένη εκτίμηση στατικών φάσεων αντίστροφης φάσης ΟΧΙ Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις
Είδη χρωματογραφίας Βάση πολικότητας κινητής στατικής φάσης φάσης Στατική Φάση Είδος χρωματογραφίας Κινητή Φάση Πολική Κανονικής φάσης Μη πολική Εξάνιο, διχλωρομεθάνιο, ισοπροπανόλη, μεθανόλη Μη πολική Αντίστροφης φάσης Πολική Νερό, ακετονιτρίλιο μεθανόλη, THF Εκλουστική ισχύ διαλυτών κινητής φάσης Ουσίες που προσδιορίζονται με HPLC αντιστρόφου φάσης % ιονισμός, άρα δεν παρατηρούνται μεταβολές στους χρόνους κατακράτησης με την μεταβολή του ph Ιονίζονται σε αλκαλικό περιβάλλον, Ka σε A ποσοστό ανάλογο της τιμής pka A καιh K a εκλούονται σε μικρότερους χρόνους HA AH H Ιονίζονται σε όξινο περιβάλλον, σε ποσοστό ανάλογο της τιμής pka και εκλούονται σε μικρότερους χρόνους Ανάλογα με το περιβάλλον (όξινο ή αλκαλικό) και με τις pka τιμές ιονίζονται είτε οι όξινες είτε οι βασικές ομάδες αντίστοιχα CH 3 OCOCH 3 COOH NH 2 HO NH 2 NO 2 toluene acetylsalicylic acid o-nitroaniline OH D,L-octopamine
Εξίσωση Henderson -Hasselbach ph-pka Οξύ: %ιοντισμός 1 x1 ph-pka (1) 1 1 Τα οξέα ιονίζονται σε βασικό περιβάλλον σε τιμές ph pka (ph=pka 5%ionization) Όσο μικρότερη η τιμή ρκα ενός οξέος τόσο ισχυρότερο είναι Βάση: %ιοντισμός 1 1 1 pka-ph pka-ph x1 (2) Οι βάσεις ιονίζονται σε όξινο περιβάλλον σε τιμές ph pka (ph=pka 5%ionization) Όσο μεγαλύτερη έναι η τιμή ρκα μίας βάσεως τόσο ισχυρότερη είναι Εξίσωση Henderson -Hasselbach ph-pka 1 Οξύ: %ιοντισμός x1 ph-pka (1) 1 1 Βάση: %ιοντισμός 1 1 1 pka-ph pka-ph x1 (2) ΟΞΕΑ ΒΑΣΕΙΣ ph=pk a (5% ionization) ph=pk a (5% ionization) PΗ>pK a +1 (9% ionization) PΗ<pK a -1 (9% ionization) PΗ>pK a +3 (99.9% ionization) PΗ<pK a -3 (99.9% ionization)
Retention times of neutral molecules 125 1 75 254nm4nm (1. ) 7.171 min ph 2.3 anisole/7.171 OCH 3 C4 Στήλη 75 5 254nm4nm (1. ) ph 6.2 6.971 min anisole/6.971 5 25 /2.11 anisole. 5. 1. 15. min 25 /2.15. 2.5 5. 7.5 min Phenyl Στήλη 254nm4nm (1. ) ph 2.3 ph 6.2 254nm4nm (1. ) 1 75 5 25 NO 2 nitrobenzene nitrobenzene/8.799 8.799 min 8.753 min 1 5 /2.6 nitrobenzene/8.753 13. 2.5 5. 7.5 1. min. 2.5 5. 7.5 1. min Λιποφιλικότητα/Υδροφιλικότητα προσδιοριζόμενων ουσιών Στατική Φάση Προσδιοριζόμενη Ουσία Λιποφιλικότητα Κινητή Φάση Ουδέτερα Μόρια Ιονισμένα Μόρια P app ή Συντελεστής μερισμού Φαινομενικός συντελεστής μερισμού Οξέα : Βάσεις : 14
P naph >P benz Phenyl Column ph 2.3 4 254nm4nm (1. ) 3 2 1 benzene 7.965 min benzene/7.965 15 1 5 254nm, 4nm (1.) naphthalene 27.194 min naphthalene/27.194. 2.5 5. 7.5 min 1 2 min 254nm, 4nm (1.) 4 3 2 CH 3 13.212 min toluene/13.212 2 15 1 254nm4nm (1. ) CH 3 CH 3 22.365 min p xylene/22.365 1 toluene 5 /1.972 xylene. 5. 1. min. 5. 1. 15. 2. min P xyl >P toluen 15 Χρόνοι κατακράτησης με βάση τη δομή C4 Στήλη ph 6.2 15 254nm, 4nm (1.) 1 5 Cl chlorobenzene 11.895 min chlorobenzene/11.895 5 25 21nm, 4nm (1.) Cl Cl dichlorobenzne 19.949min 1,2 dichlorobenzene/19.949. 2.5 5. 7.5 1. 12.5 min. 5. 1. 15. 2. min 3 21nm, 4nm (1.) 2 1 Cl Cl Cl 1,2,4-trichlorobenzene 36.243 min 1,2,4 trichlorobenzene/36.243 1 2 3 min 16
254nm, 4nm (1.) 254nm4nm (1. ) 254nm4nm (1. ) H O OH OH N COCH 3 CONH 2 nicotinamide Acidic compounds with % ionization Substance pka % ionization tr phenyl 4%MeOH tr C4 4%MeOH ph 2.3 ph 6.2 (HCl) (NH 3 ) (HCl) (NH 3 ) phenol 9.92.. 4.191 4.235 3.946 3.912 ethanophenone 18.41.. 7.269 7.265 5.4 5.32 benzaldehyde 14.92.. 5.996 5.997 4.643 4.581 1 naphthol 9.92.. 12.865 12.746 9.675 9.268 2 naphthol 9.92.. 11.842 11.766 8.579 8.42 prednisolone acetate 1 14.29.. 49.211 48.595 24.328 23.944 prednisolone 1 14.27.. 24.328 23.785 13.553 13.22 testosterone 16.18.. >3 >3 23.66 222.1 progesterone 19.28.. 276.99 274.21 98.91 96.262 methyl testosterone 15.55.. 129.211 128.232 57.13 56.29 estrone 1.61.. 63.2 63.29 27.676 27.69 nicotinamide 17.8.. 2.266 2.327 2.154 2.278 isoniazid 11.88.. 2.235 2.236 2.11 2.214 paracetamol 9.65.. 2.47 2.491 2.352 2.353 phenacetine 18.83.. 6.246 6.298 4.818 4.787 metronidazole 14.84.. 3.218 3.335 2.474 2.543 salicin 14.61.. 2.547 2.623 2.327 2.331 thiocolchicoside1 12.58.. 6.534 6.56 3.218 3.251 digitoxin1 13.77.. >4 >4 315.37 315. cortisol1 16.57.. 22.952 23.571 12.894 12.414 thanophenone % Phenyl Στήλη 1 5 OH ph 2.3 ph 6.2 4.193 min phenol/4.193 3.945 min 1 5 phenol/3.945 phenol /2.7. 1. 2. 3. 4. 5.min. 2.5 5. min 254nm4nm (1. ) 5 25 /2.93 /4.648 ph 2.3 prednisolone/13.558. 5. 1. min C4 Στήλη 3 CH 3 CH HO 2 OH 13.558 min 13.159 min 2 1 O CH 3 H H H prednisolone ph 6.2 O HO prednisolone/13.159 18. 5. 1. 15. min
Έκλουση ουδέτερων ενώσεων σε C18 Χρόνοι κατακράτησης των ουσιών που ιονίζονται σε ποσοστό 51% έως 1% Ποσοστά Ιονισμού των Όξινων ομάδων Ονομασία pka % Ιονισμός tr phenyl 4%MeOH tr C4 4%MeOH ph 2.3 ph 6.2 (HCl) (NH 3 ) (HCl) (NH 3 ) benzoic acid 4.2 1.24 99.1 5.785 2.315 5.18 1.998 naproxene 4.6 1.71 99.28 35.93 4.69 21.453 3.772 nicotinic acid 2.2 55.73 99.99 2.418 1.731 2.28 1.867 aspirin 3.83 2.87 99.58 5.189 1.77 4.248 1.722 ethamsylate 1 9.16..11 1.888 1.447 1.943 1.472 ethamsylate 2 1.92.. ethamsylate 3-2.4 1 1 ibuprofen 4.8 1.63 99.25 85.625 8.258 76.334 7.733 halazone 4.12 1.49 99.18 6.21 1.689 4.287 1.55 sulfisoxazole 6.17.1 51.73 4.62 3.67 3.139 1.952 sulfabenzamide 5.1.19 93.94 5.467 1.987 3.477 1.818 glibenclamide1 4.99.2 94.19 >3 96.82 99.478 32.5 glibenclamide2 7.6. 12.13 diclofenac 4.46.69 98.21 227.8 14.76 55.35 5.993 ketoprofen 3.49 6.7 99.81 41.932 4.72 21.627 3.584 2 flurbiprofen 3.3 15.7 99.93 87.132 6.48 5.947 5.27 flufenamic acid 3.92 2.35 99.48 226.47 8.918 125. 7.27 mefenamic acid 3.91 2.4 99.49 187.97 12.856 14.736 7.383 niflumic acid 1.92 7.58 99.99 51.293 4.626 27.766 3.538 nalidixic acid 6.14.1 53.45 18.457 15.846 7.64 6.898 indomethacin 4.23 1.16 98.94 117.96 8.336 53.485 3.735 cromolyn1.53 98.33 1 8.72 1.817 3.936 1.555
254nm4nm (1. ) 254nm4nm (1. ) 3 2 1 21nm, 4nm (1.) OCOCH 3 acetylsalicylic acid COOH /1.758 /1.969 ph 2.3 Έκλουση όξινων ενώσεων 5.19 min Phenyl Στήλη acetylsalicilic acid/5.19 1 5 1.193 min ph 6.2 acetylsalicilic acid/1.938. 2.5 5. min. 1. 2. 3. min 25 2 15 1 5 21nm, 4nm (1.) F flurbiprofen C4 Στήλη ph 2.3 ph 6.2 87.133 min COOH CH 3 flurbiprofen/87.133. 25. 5. 75. min 5 4 3 2 1 5.98 min /1.94 flurbiprofen/5.98 21. 2.5 5. 7.5 1. min ΟΞΕΑ ΒΑΣΕΙΣ ph=pk a (5% ionization) ph=pk a (5% ionization) PΗ>pK a +1 (9% ionization) PΗ<pK a -1 (9% ionization) PΗ>pK a +3 (99.9% ionization) PΗ<pK a -3 (99.9% ionization) Βάσεις ph=8.4 ph=7.4
Επίδραση διαλύτη κινητής φάσης Εκλουστικη ισχύ Τετραυδροφουράνιο 23% Ακετονιτρίλιο 33% Μεθανόλη 4% Η 2 Ο πολικότητα CH 3 CN-H 2 (3:7) CH 3 CN-MeOH-H 2 (15:15:7) CH 3 CN-THF-H 2 (15:15:7) Λιποφιλικότητα/Υδροφιλικότητα προσδιοριζόμενων ουσιών Ουδέτερα Μόρια Ιονισμένα Μόρια P app ή Συντελεστής μερισμού k ' t R t t Συντελεστής συγκράτησης ή παράγοντας χωρητικότητας Κ o o Φαινομενικός συντελεστής μερισμού t t ' Rapp o kapp to Φαινομενικός παράγοντας χωρητικότητας Οξέα : K app K Βάσεις : K app K 23
Καμπύλες συσχέτισης ph 8 6 4 2 2%ACN: 8% Buffer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 tr % buffer %buffer ph6.3/acn Vs tr Επίδραση θερμοκρασίας 9 8 7 6 5,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 tr ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ: ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥΣ, ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ- ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ, ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥΣ ΝΑΙ ΠΡΟΗΓΜΕΝΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΣΤΑΤΙΚΩΝ ΦΑΣΕΩΝ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ ΟΧΙ Απόδοση ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων ΟΧΙ Προηγμένη εκτίμηση των στατικών φάσεων αντίστροφης φάσης ΟΧΙ
Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ανάλυση ζεύγους ιόντων (ανταλλαγή κατιόντων) αδρεναλίνη ph όξινο Οκτανοσουλφονικό νάτριο Na + Na + Na+ Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ανάλυση ζεύγους ιόντων (ανταλλαγή ανιόντων) Ασκορβικό οξύ ph=βασικό κετριμίδιο
Χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλοεπίδρασης (ZIC- HILIC Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (υαλουρονικό οξύ) UV 215nm MB>1 6 Daltons Στατική φάση: Συμβατή με το νερό Κινητή φάση: Υδατικό διάλυμα
Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ανάλυση μη-ιοντικών επιφανειοδραστικών με ELSD αλκυλομάδα CH 3 (CH 2 ) m (OCH 2 CH 2 ) n OH πολυαιθυλενογλυκόλη Ουσία:Cetomacrocol (m=15-17, n=2-24) Ανιχνευτής : IR, ELSD Στατική φάση: αμινοπροπυλ στήλη Κινητή φάση: εξανιο/χλωροφόρμιο/meoh (Βαθμιδωτή έκλουση) Ανάλυση πρωτεϊνών Στατική: φάσηc18 Κιν. Φάση : Τριφθ. Οξύ/Ακετονιτρίλιο Βαθμιδωτή έκλουση Ανίχν. UV (215nm) Ινσουλίνη Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Αντιδράσεις παραγωγοποίησης Ουσία:νεομυκίνη Αντιδραστήριο:φθοροδινιτροβενζόλιο Ανιχνευτής : UV Στατική φάση: SiO 2 Κινητή φάση: ΕtOH/χλωροφόρμιο
Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ιοντική Χρωματογραφία Ουσία: κατιόντα Ανιχνευτής : αγωγιμότητας Στατική φάση: κατιονανταλλακτική ρητίνη Κινητή φάση:μεθανοσουλφονικό οξύ Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ιοντική Χρωματογραφία Ουσία: ανιόντα Ανιχνευτής : αγωγιμότητας Στατική φάση: ανιονανταλλακτική ρητίνη Κινητή φάση:ναοη Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Μηχανισμός Α:Σχηματισμός ζεύγους ιόντων (με θειικό διμεθυλοκυκλοεξύλιο) Μηχανισμός Β: Ιονανταλλαγή Ουσία: κατεχολαμίνες σε ούρα Ανιχνευτής : ηλεκτροχημικός Στατική φάση A : C 18 στήλη B: κατιονανταλλακτική ρητίνη
ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΕΝΑΝΤΙΟΜΕΡΩΝ ΜΕ ΧΕΙΡΟΜΟΡΦΗ HPLC ΟΧΙ Εφαρμογές HPLC σε ποσοτικές αναλύσεις φαρμάκων Αναλύσεις βασισμένες σε βαθμονόμηση με εξωτερικό πρότυπο (εύρος± 2%, r>.99) Ανάλυση με βαθμονόμηση ενός σημείου Ανάλυση με βαθμονόμηση ενός σημείου και εσωτερικό πρότυπο Ανάλυση με εκχύλιση Υπολογισμός συγκέντρωσης ατροπίνης σε άγνωστο δείγμα παρουσία εσωτερικής προτύπου Ποσότητα ατροπίνης δείγμα= Παράγων απόκρισης για άγνωστο δείγμα Παράγων απόκρισης για πρότυπο χ Ποσότητα ατροπίνης στο πρότυπο Παράγων απόκρισης=εμβαδόν ατροπίνης/εμβ. εσωτερικής προτύπου Εκχύλιση Σε δισκίο (στερεού-υγρού) N NH SO 2 NH 2 sulfapyridine pk a = 5 Συνήθως η ουσία ιονίζεται στο κατάλληλο ph (όξινο) και παραλαμβάνεται με υδατικό διαλύτη Σε υδρόφιλο σιρόπι (στερεού-υγρού) Συνήθως η ουσία διατηρείται σε μη ιονιζμένη μορφή ph (αλκαλικό) και παραλαμβάνεται με οργανικό μη πολικό διαλύτη διαλύτη που δεν αναμιγνύεται με το σιρόπι Σε αλοιφή (στερεού-υγρού) Συνήθως η ουσία ιονίζεται στο κατάλληλο ph (όξινο) και παραλαμβάνεται με πολικό οργανικό ή υδατικό διαλύτη
Χρωματογραφία Υπευψηλής Απόδοσης (UPLC) Χρωματογραφία Υπευψηλής Απόδοσης (UPLC)