ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΟΥΚΚΑΛΗ Ε. ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΟΥΚΚΑΛΗ Ε. ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ ΙΔΡΥΜΑΤΟΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ Σ. ΩΝΑΣΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΟΥ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ-ΣΕΡΙΝΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΒΟΥΚΚΑΛΗ Ε. ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ ΙΔΡΥΜΑΤΟΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ Σ. ΩΝΑΣΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΟΥ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ-ΣΕΡΙΝΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, του Τομέα Οργανικής Χημείας και Βιοχημείας, του Τμήματος Χημείας, του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: 06/07/2009 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αν. Καθηγητής Θ. Γιαννακούρος Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Δ. Κυριακίδης Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Επ. Καθηγήτρια Ε. Νικολακάκη Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Ζ. Σκούρας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Καθηγήτρια Μ. Χατζοπούλου Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Αν. Καθηγήτρια Θ. Χολή-Παπαδοπούλου Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Αν. Καθηγητής Τ. Γιουψάνης Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

Η επταμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της Διδακτορικής Διατριβής του κ. Βουκκαλή Νικόλαου, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 6-07-2009, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής με τίτλο : Μελέτη του βιολογικού ρολού πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αργινίνης-σερίνης. Η επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της Επιστήμης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Αν.Καθηγητής Γιαννακούρος Θωμάς Καθηγητής Κυριακίδης Δημήτριος Επ. Καθηγήτρια Νικολακάκη Ελένη Καθηγήτρια Χατζοπούλου Μαργαρίτα Καθηγητής Σκούρας Ζαχαρίας Αν. Καθηγητής Γιουψάνης Τραϊανός Αν. Καθηγήτρια Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα

Νικόλαος Ε. Βουκκαλής Α.Π.Θ. Μελέτη του βιολογικού ρόλου πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αργινίνης-σερίνης ISBN «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2)

στους γονείς μου Βαγγέλη και Δήμητρα στα αδέρφια μου Πέτρο, Στέλλα και Ειρήνη

στους απανταχού διδασκάλους μου με σεβασμό και ευγνωμοσύνη

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...6 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ...9 Α.ΕΙΣΑΓΩΓΗ...14 A.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs)...14 A.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών - χαρακτηριστικά της δομής τους....14 A.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης...21 A.1.3. Εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς...22 Α.1.4. Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης...23 Α.1.5. Υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης...26 Α.1.5.1. Παράγοντες ματίσματος του RNA (SR splicing factors)...26 Α.1.5.2.Πυρηνικός φάκελος - Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR - Lamin B Receptor)29 A.1.5.3. Δημιουργία συμπυκνωμένης χρωματίνης σπερματοζωαρίων -...32 Πρωταμίνες...32 Α.1.6. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/ αργινίνης....37 Α.1.7. SRPKs και παθογένεια...38 Α.2. Πυρηνική μήτρα...39 Α.2.1. Συστατικά της πυρηνικής μήτρας....40 Α.2.1.1. Πυρηνική λάμινα...40 Α.2.1.2. Κεντρικά νημάτια...43 Α.2.1.3. Διάχυτος σκελετός....43 Α.2.1.4. Πυρηνικά σωμάτια...45 Α.2.1.5. Πυρηνίσκος...46 Α.2.2. S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS)....47 Α.2.3. Πυρηνική μήτρα και αντιγραφή...49 Α.2.4. Πυρηνική μήτρα και μεταγραφή...51 Α.2.5. Πυρηνική μήτρα και μάτισμα....52 1

Α.2.6. Σήμα εντόπισης στην πυρηνική μήτρα (NMTS, Nuclear Matrix Targeting Signal)....53 A.3. Scaffold Attachement Factor B (SAFB) (Παράγοντας πρόσδεσης... ικριώματος)....54 A.3.1. Δομή των SAFB...54 A.3.2. Εντόπιση των SAFB1 και SAFB2....55 A.3.3. Αλληλεπιδράσεις των SAFB1 και SAFB2....57 A.3.4. Δραστικότητα των SAFB1 και SAFB2....58 A.4. Ετεροχρωματίνη...60 A.4.1. Σύσταση ετεροχρωματίνης....61 A.4.2. Ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1)...63 A.5. Απόπτωση....64 A.5.1. Η διαδικασία της απόπτωσης...65 A.5.2. Μοριακοί μηχανισμοί απόπτωσης....67 A.5.2.1. Προ-αποπτωτικοί παράγοντες...67 A.5.2.2. Αντιαποπτωτικοί παράγοντες....69 A.5.3. Μονοπάτια της απόπτωσης...70 A.6. Πρωτεΐνη p53....72 A.6.1. Δομή της πρωτεϊνης p53....74 A.6.2. Είσοδος της πρωτεΐνης p53 στον πυρήνα....76 A.6.3. Ομοιοπολική τροποποίηση της p53 πρωτεΐνης...78 A.6.4. Ενεργοποίηση της μεταγραφής μέσω της πρωτεΐνης p53....79 A.6.5. Εντόπιση της πρωτεΐνης p53 στην πυρηνική μήτρα...79 A.6.6. Ο ρόλος της πρωτεΐνης p53 στην απόπτωση και οι συνέπειες της έλλειψης ή της μετάλλαξής του στην καρκινογένεση...81 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...83 B.1. Υλικά...83 Β.1.1. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας...83 Β.1.2. Βιολογικά υλικά....85 Β.1.3. Χημικά αντιδραστήρια - Υλικά χρωματογραφίας....86 B.2. Μέθοδοι...86 2

Β.2.1. Καλλιέργειες κυττάρων θηλαστικών και υποκυτταρική κλασμάτωση εκχυλισμάτων...86 Β.2.2. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. 88 Β.2.3. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με ηλεκτροδιάχυση...90 Β.2.4. Ηλεκτροφόρηση και απομόνωση DNA από πηκτή αγαρόζης....91 Β.2.5. Φωτομετρικός ποσοτικός προσδιορισμός νουκλεϊνικών οξέων....93 Β.2.6. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)...93 Β.2.7. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς...96 Β.2.8. Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων....99 Β.2.9. Δημιουργία βακτηριακών κυττάρων επιδεκτικών σε μετασχηματισμό (competent cells)...99 Β.2.10. Μετασχηματισμός κυττάρων Ε. coli...100 Β.2.11. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση...101 Β.2.12. Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το Kit Qiagen-Tip 500....102 Β.2.13. Σημειακή in vitro ολιγονουκλεοτιδίου-κατευθυνόμενη μετάλλαξη....103 Β.2.14. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST)...106 Β.2.15. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με 6 ιστιδίνες...108 Β.2.16. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE)...109 Β.2.17. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπο μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE)...111 Β.2.18. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250....112 Β.2.19. Αυτοραδιογραφία...113 Β.2.20. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western Blot)...113 Β.2.21. Ανοσοανίχνευση...114 Β.2.22. Ανοσοκατακρήμνιση...115 Β.2.23. Πειράματα συγκατακρήμνισης (Pulldown assays)....116 Β.2.24. In vitro φωσφορυλίωση υποστρωμάτων από την SRPK1....118 Β.2.25. Έμμεσος ανοσοφθορισμός Φθορισμός με GFP....118 Β.2.26. Μέτρηση μεταγραφικής ενεργότητας της πρωτεΐνης p53....119 Β.2.27. Σύστημα δυο υβριδίων....121 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...123 3

Γ.1. H πρωτεϊνική κινάση SRPK1a βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Καταστολή της μεταγραφικής ικανότητας της πρωτεΐνης p53 μετά από αλληλεπίδραση της με την πρωτεΐνη SAFB1...123 Γ.1.1. Αλληλεπίδραση του επιπλέον τμήματος της SRPK1a με τις πρωτεΐνες SAFB1 και p53 στο σύστημα των δυο υβριδίων στη ζύμη....123 Γ.1.2. Κλωνοποίηση και υπερέκφραση της πρωτεΐνης p53 σε βακτήρια...125 Γ.1.3. In vitro αλληλεπίδραση SRPK1a και p53....126 Γ.1.4. In vivo αλληλεπίδραση SRPK1a και p53...127 Γ.1.5. Υποκυτταρική κατανομή των p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα...128 Γ.1.6. Υποκυτταρική κατανομή των p53 και SAF-B1 σε HepG2 κύτταρα μετά από επίδραση μιθραμυκίνης και 5-φθοροουρακίλης....130 Γ.1.7. In vivo αλληλεπίδραση μεταξύ p53 και SAFB1....131 Γ.1.8. Εύρεση του τμήματος της πρωτεΐνης SAFB1 που αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53...133 Γ.1.9. Υποκυτταρική εντόπιση των ενδογενών SAFB1 και p53 στα HepG2 κύτταρα με δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού....135 Γ.1.10. Η υπερέκφραση του SAFB1 προκαλεί στα Κ562 κύτταρα αναστολή στη μεταγραφική ικανότητα της πρωτεΐνης p53...136 Γ.2. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας στη δομή του αμινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) και στην αλληλεπίδρασή του με την ιστόνη Η3 και την πρωτεΐνη HP1...139 Γ.2.1. Έλεγχος της ύπαρξης νουκλεϊνικών οξέων στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-LBRNt και πιθανή επίδραση τους στη διαλυτότητά της...139 Γ.2.2. Σύνθεση και έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών... GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205)...141 Γ.2.3. Έλεγχος της ικανότητας δέσμευσης RNA των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών του αμινοτελικού τμήματος του LBR και της διαλυτότητας τους μετά από επώαση με RNAse....143 Γ.2.4. Έλεγχος του ρόλου της φωσφορυλίωσης των RS ακολουθιών στη δέσμευση RNA και στη διαλυτότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBRNt. 144 Γ.2.5. Η μη φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει διαμόρφωση α-έλικας ενώ η φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει μια πληθώρα από αποδιαταγμένες τυχαίες διαμορφώσεις....145 4

Γ.2.6. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινοτελικού τμήματος του LBR με την ιστόνη Η3....147 Γ.2.7. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης GST-LBRNt από την SRPK1 «μιμείται» το RNA και αυξάνει τα επίπεδα δέσμευσης της ιστόνης Η3...149 Γ.2.8. Αλληλεπίδραση της HP1 με τα αμινοτελικά άκρα του ανθρώ-πινου LBR και του LBR από γαλοπούλα....150 Γ.2.9. Eσωτερική τάξη και αταξία του ανθρώπινου LBR και του LBR από γαλοπούλα...153 Γ.2.10. Μελέτη της αλληλεπίδρασης της HP1 με τα φυσιολογικά και μεταλλαγμένα αμινοτελικά άκρα του ανθρώπινου LBR και του LBR από γαλοπούλα...155 Γ.3. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της πρωταμίνης 1 από την SRPK1 στην αλληλεπίδρασή της με το άμινοτελικό άκρο του LBR και την είσοδό της στον πυρήνα...158 Γ.3.1. Φωσφορυλίωση της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 από την κινάση SRPK1...158 Γ.3.2. Αλληλεπίδραση της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με την RS ακολουθία του LBR....159 Γ.3.3. Υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και πρωταμίνης 1 σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρων σωληνίσκων ποντικού...161 Γ.3.4. Δημιουργία μεταλλάξεων στο μόριο της πρωταμίνης 1 και έκφρασή των μεταλλαγμάτων ως πρωτεϊνες σύντηξης με την GFP....162 Γ.3.5. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεϊνών σύντηξης με την GFP με το αμινο-τελικό άκρο του LBR (GST- LBRNt)...164 Γ.3.6. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων της πρωταμίνης 1 σε HeLa κύτταρα....165 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...167 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...180 SUMMARY...182 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...Σφάλμα! Δεν έχει οριστεί σελιδοδείκτης. 5

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Όταν φτάνεις επιτέλους στο τέλος ενός μεγάλου στόχου και κοιτάς πίσω, μόνο τότε συνειδητοποιείς την συνολική σου πορεία και τους ανθρώπους που την επηρέασαν. Σε αυτούς θέλω να αναφερθώ σε αυτές τις λίγες αράδες και να τους ευχαριστήσω θερμά για την σημαντική βοήθεια που μου προσέφεραν. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κάτω από την άμεση καθοδήγηση και επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κ. Θ. Γιαννακούρου, τον οποίο ευχαριστώ από τα βάθη της καρδιάς μου για την υπόδειξη του θέματος, την οργάνωση των πειραμάτων και την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εργασίας αλλά και κατά τη διόρθωση της διατριβής. Τόσο ο ίδιος, όσο και ο τρόπος με τον οποίο προσεγγίζει την επιστήμη της Βιοχημείας αποτελούν λαμπερά πρότυπα για μένα. Τον ευγνωμονώ για τον χρόνο που μου αφιέρωσε όλα αυτά τα χρόνια, για τις συζητήσεις εκείνες στο γραφείο 525 του τετάρτου ορόφου, όπου αισθανόμουν προνομιούχος κοινωνός της ψυχικής γενναιοδωρίας, της ακαδημαϊκής ευγένειας και της άπλετης γνώσης του. Η συνεργασία μαζί του αποτέλεσε μία πηγή γνώσεων και σωστού τρόπου σκέψης και θεώρησης της επιστήμης της Βιοχημείας. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την επίκουρο καθηγήτρια κ. Ε. Νικολακάκη, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συμπαράσταση εντός και εκτός εργαστηρίου. Υπήρξε για μένα πολύτιμος και ουσιαστικός αρωγός όλα αυτά τα χρόνια. Της οφείλω, ανάμεσα σε άλλα, τη γνώση της πλειονότητας των τεχνικών που αποκόμισα κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής μου και ιδιαίτερα σε θέματα μοριακής βιολογίας που αποτέλεσαν σημαντικά εχέγγυα για την διεκπεραίωση της εργασίας. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή κ. Δ. Κυριακίδη, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για το ενδιαφέρον του, την άψογη συνεργασία, καθώς και τις πολύτιμες υποδείξεις του κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τους καθηγητές κ. Ζ. Σκούρα και κα. Μ. Χατζοπούλου, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Τ. Γιουψάνη και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα. Δ. Χολή-Παπαδοπούλου, μέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις 6

χρήσιμες παρατηρήσεις τους και το χρόνο που διέθεσαν διορθώνοντας τα κείμενά μου. Την κα. Δ. Χολή-Παπαδοπούλου θα ήθελα να την ευχαριστήσω ιδιαίτερα για το ενδιαφέρον της προς το πρόσωπο μου και την υποστήριξη της. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Σ. Τσιφτσόγλου για την άδεια χρήσης του χώρου των κυτταροκαλλιεργιών στον οποίο διεξήχθη ένα μεγάλο μέρος των πειραμάτων, καθώς και το υπόλοιπο εργαστήριο Φαρμακολογίας για τις διευκολύνσεις που μου παρείχαν και το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον διδάκτορα Γιάννη Σανίδα για την βοήθεια του στην εκτέλεση των πειραμάτων έμμεσου ανοσοφθορισμού και για την άψογη συνεργασία μας. Ευχαριστίες επίσης οφείλω στο Εργαστήριο Ανατομίας και Ιστολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ, όπου πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα αυτά. Ευχαριστώ τους διδάκτορες Ηλία Μυλωνή και Φίλιππο Πεΐδη για την πολύτιμη βοήθεια τους, ιδιαίτερα κατά την έναρξη της εργασίας. Θέλω να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την Έλενα Αγγελίδου και το εργαστήριο της κας Μαργαρίτας Χατζοπούλου στο τμήμα Βιολογίας, για τις δοκιμασίες μεταγραφικής ενεργότητας της πρωτεΐνης p53. Ευχαριστώ τους Δρ. Μ. Βλάσση και Δ. Βλαχάκη (Ινστιτούτο Βιολογίας, Κέντρο Ερευνών Δημόκριτος) για τη μελέτη της δομής της RS ακολουθίας του LBR με προσομοίωση μοριακής δυναμικής και την Dr. L. Iakoucheva (Laboratory of Statistical Genetics, The Rockefeller University, NY, USA) για τους υπολογισμούς τάξης-αταξίας στο αμινοτελικό άκρο του LBR. Ευχαριστίες οφείλω και σ όλο το προσωπικό και συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχημείας για τη συνεργασία τους και τη δημιουργία του ευχάριστου συναδελφικού κλίματος μέσα στο εργαστήριο. Ιδιαίτερα όμως θα ήθελα να ευχαριστήσω τους διδάκτορες με τους οποίους μοιράστηκα τον ίδιο εργαστηριακό χώρο, τον Φίλιππο Κωττάκη, την Κατερίνα Τσαγκάλια, την Λένα Παπαχρήστου και την υποψήφια διδακτόρισσα Μακρίνα Δανιηλίδου για την στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συμπαράσταση και το ενδιαφέρον τους. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στο Κοινωφελές Ίδρυμα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης για την υποτροφία την οποία μου προσέφερε, και η οποία με βοήθησε ουσιαστικά για την εκπόνηση της διατριβής. 7

Τις περισσότερες ευχαριστίες τις οφείλω στην αδερφή μου Ειρήνη για τη συνεχή βοήθεια και συμπαράσταση της, αλλά ιδιαίτερα στους γονείς μου, Βαγγέλη και Δήμητρα γιατί πραγματικά χωρίς τις δικές τους προσωπικές θυσίες, την στήριξη και την αγάπη τους, η διδακτορική αυτή διατριβή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Είμαι ιδιαίτερα ευγνώμων για όσα μου έχουν προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια, την ενθάρρυνση, την αμέριστη υλική και ηθική τους συμπαράσταση και κυρίως την υπομονή τους και σίγουρα σε αυτούς χρωστάω τα πάντα. Θα ήθελα να τους ευχαριστήσω για όλες τις θυσίες που έχουν κάνει, ώστε να μου δώσουν την δυνατότητα να ασχοληθώ απερίσπαστος με κάτι τόσο συναρπαστικό όσο είναι η αναζήτηση της γνώσης και να ολοκληρώσω έτσι ένα κύκλο της ζωής μου. 8

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ACS: American Cancer Society AD: Activation Domain AML: Acute Myeloid Leukemia APS: Ammonium Persulphate ATL: Adult T-cell Leukemia ATP: Adenosine 5'-triphosphate BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate bp: base pairs CARM1: Co-Activator Arginine Methyltransferase CAT: Chloramphenicol Acetyl Transferase CB: Cajal Bodies CBP: CREB Binding Protein transcriptional coactivator CDKs: Cyclin Dependent Kinases cdna: complementary Deoxyribonucleic acid CHD1: ChromoDomain protein 1 Chk2: Checkpoint kinase 2 CML: Chronic Myelogenous Leukemia CMV: cytomegalovirus CPKC: calcium-dependent Protein Κinase C CREB: camp Response Element Binding protein CTD: Carboxyl Terminal Domain DAPI: 4-6-Diamidino-2-phenylindole DBD: DNA Binding Domain DEPC: Diethyl-pyrocarbonate DFC: Dense Fibrillar Component DISC : Death inclucing signaling complex DMEM: Dulbecco s Μodified Εagle s Μedium DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid DNAse : Deoxyribonuclease dntp: deoxynucleotide triphosphate 9

DTT: EDTA: EGFR: ER: ERE: ERK: FACS: FBS: FC: FCS: FISH: FLV: GFP: GR: GST: GTP: HAT: HBD: HDAC: HeLa: HEPES: HIPK2: HMBA: HMG: hnrna: hnrnp: Dithiothreitol Ethylenediaminotetracetic acid Epidermal Growth Factor Receptor Estrogen Receptor Estrogen Response Element Extracellular Signal Regulated Kinase Fluorescence activated cell sorting Fetal Bovine Serum Fibrillar Center Fetal Calf Serum Fluorescence in situ hybridization Friend Leukemia Virus Green Fluorescent Protein Glycocorticoid Receptor Glutathione-S-Transferase Guanosine-5'-triphosphate Histone Acetyl-Transferase Hormone Binding Domain Histone deacetylase Human cervical adenocarcinoma cells Ν-2-hydroxyethyl-piperazine-Ν -2-ethylsulphonic acid Homeodomain Interacting Protein Kinase-2 Hexamethylene bisacetamide High Mobility Group non-histone chromatin protein heterogeneous nuclear RNA heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein HP1: Heterochromatin Protein 1 HRE: Hormone Response element Hsp: heat-shock protein IFN-a: Interferon-a IGCs: Interchromatin Granule Clusters IgG: Immunoglobin G IL: Interleukin 10

IPTG: Ιsopropyl-1-thio-β-D-lactopyranoside IRES: Internal ribosome entry site K562: Human Caucasian chronic myelogenous leukaemia cells LAP: Lamina Associated Polypeptide 1 LBR: Lamin B Receptor MAGUK: Membrane Associated Guanylate Kinase Homologue MAPK: Mitogen -Activated Protein Kinase MCS: Multiple cloning sites MEF2: Myocyte Enhancer Factor 2 MEK/ERK: mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated kinase MOPS: 2-(Ν-morpholine)propanesulphonic acid mrna: messenger Ribonucleic acid MTP: Microsomal triglyceride Transfer Protein NBT: Nitro Blue Tetrazolium NES: Nuclear Export Signal NLS: Nuclear Localization Signal NMP: Nuclear Matrix Protein NMR: Nuclear Magnetic Resonance NMTS: Nuclear Matrix Targeting Signal NuMA: Nuclear Mitotic Apparatus protein NURD: ONPG: ORC: ORI: PACT: PAGE: Parc: PBS: PCNA: PCR: PDGF-R: PFs: PI: Nucleosome RemoDelling Complex Ο-Nitrophenyl-β-D-GalactoPyranoside Origin Recognition Complex ORIgins of replication p53 Associated Cellular protein-testis derived Polyacrylamide Gel Electrophoresis p53 associated, Parkin-like cytoplasmic protein Phosphate buffered saline Proliferating Cell Nuclear Antigen Polymerase Chain Reaction Platelet Derived Growth Factor-Receptor Perichromatin Fibrils Propidium iodide 11

PI3K: Phosphatidyl Inositol 3 Kinase PIPES: Piperazine-1,4-bis(2-ethane-sulfonic acid) PK: Protein Kinase PMA: Phorbol 12-Myristate 13-Acetate PMEA: Para-Methoxy-Ethylamphetamine PML: Promyelotic Leukemia Bodies PMSF: Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride prb: Retinoblastoma protein PRMT: PRotein MethylTransferase RA: Retinoic Acid RAR: Retinoic Acid Receptor RPMI-1640: Rooswell Park Memorial Institute-1640 RRM: RNA Recognition Motif RS: Arginine/Serine motifs RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction S/MARS: Scaffold/Matrix Attachment RegionS SAF-A: Scaffold Attachment Factor A SAF-B: Scaffold Attachment Factor B SAFB1: Scaffold Attachment Factor B1 SAP: Shrimp Alkaline Phosphatase SDS: Sodium Dodecyl Sulphate SF-1: Steroidogenic factor SF2/ASF: Splicing Factor 2/Alternative Splicing factor SHP: Small Heterodimer Partner SIDD: Stress-Induced DNA Duplex Destabilization sirna: small interference RNA SnRNP: small nuclear RiboNucleoProtein Sp1: Specificity protein 1 SRC-1: Steroid Receptor Coactivator 1 SRPKs: TBP: TEMED: TFIIB: Serine/Arginine Protein Kinases TATA Binding Protein N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylene-diamine Transcription Factor ΙΙΒ 12

TGF: Transforming Growth Factor TGFb: Transforming Growth Factor beta TLC: Thin Layer Chromatography TNF: Tumor Necrosis Factor Tris: Τris-hydroxymethyl-aminomethane TRN: Transportin YY1: Ying-Yang 1 ΑSC: Activating Signal Cointegrator β-gal: β-galactosidase β-msh: β-mercaptoethanol 5-FU: 5-Fluoruracil 13

Α.ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs) A.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών χαρακτηριστικά της δομής τους Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν μια σχετικά νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώματά τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες που αποτελούν μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθμιση του ματίσματος του mrna, η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταμίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης, η μεταφορά πολυαμινών μέσα στα κύτταρα και η ομοιόσταση ιόντων (Nikolakaki et al., 2001). Το πρώτο μέλος της οικογένειας το οποίο κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ήταν η ανθρώπινη μορφή της SRPK1, με βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τους παράγοντες ματίσματος που περιέχουν στο μόριο τους ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριμένων ακολουθιών παίζει καθοριστικό ρόλο στη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος του RNA (Gui et al., 1994a; Gui et al., 1994b). Μέχρι σήμερα τουλάχιστον δέκα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισμούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες μορφές των SRPK1 (accession No: U09564), SRPK1a (accession No: AJ318054) και SRPK2 (accession No: U88666A) και στο ποντίκι οι μορφές των SRPK1 (accession No: AJ224115), SRPK2 (accession No: AB006036) και SRPK3 (accession No: ΝΜ_019684). Στη ζύμη οι Sky1 (accession No: S55098) (S. cerevisiae) και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το ομόλογο της SRPK1 (accession No: AF01149), στο νηματοειδές C. elegans η SPK-1 (accession No: AF241656) και στα φυτά το αντίστοιχο ομόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana) (NCBI, Entrez Nucleotide). 14

Σχήμα Α.1. Σχηματική αναπαράσταση των SRPK ποντικού. Τα τρία μέλη της οικογένειας εμφανίζουν μεγάλη ομολογία στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), αλλά διαφέρουν στο Ν-τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή (hinge region). Το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Τα ποσοστά δηλώνουν την ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία, ενώ δίνονται και οι αριθμοί των αμινοξέων (Nakagawa et al., 2005). Οι SRPKs των θηλαστικών έχουν το χαρακτηριστικό ότι παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομολογία στην πρωτοταγή τους δομή, στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), καθώς επίσης και στην εξειδίκευση τους ως προς τα διάφορα υποστρώματα. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των κινασών αυτών αποτελεί το γεγονός ότι οι περιοχές του μορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από μία ασυνήθιστα μεγάλη αλληλουχία αμινοξέων (Σχήμα Α.1), χαρακτηριστικό πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισμένο σε κινάσες τυροσίνης (Wang et al., 1998). Η μεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αμινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, όσο και στην υποκυτταρική τους κατανομή (Ding et al., 2006). Ακόμη ένα κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι περιέχουν στο μόριο τους δύο πιθανά σήματα για την εντόπιση στον πυρήνα (NLS nuclear localization signal), ένα στην αμινοτελική περιοχή ( 11 R-K-K-R-T-K-A-K-K-D-K 21 ) και ένα στο κέντρο του μορίου ( 267 Κ-Κ-Κ-Κ-L-K-K-K-Q-K-R 277 ) (Gui et al., 1994a). 15

Σχήμα Α.2. Σχηματική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος της SRPK1a. (Α) Αναπαράσταση της δομής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τμήμα των 513 bp το οποίο δεν περιλαμβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a με την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τμήμα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος που βρίσκονται στα όρια μεταξύ των εξονίων 1a και 1b και του τμήματος των 513 bp (Nikolakaki et al., 2001). Οι διαφορές ανάμεσα στα μέλη της οικογένειας που απαντώνται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε μορίου στην πρωτοταγή του δομή. Στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού ματίσματος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η μόνη διαφορά 16

έγκειται στην ύπαρξη μιας εμβόλιμης ακολουθίας από 171 αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο του μορίου αμέσως μετά τα τέσσερα πρώτα αμινοξέα, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.2 (Nikolakaki et al., 2001). Η εμβόλιμη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σημαντικό αριθμό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες με το μοτίβο L-X-X-L-L ( 148 L-A- P-L-L 152 και 158 L-G-R-L-L 162 ), το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών με πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης με διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσμευσης της με την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγματος SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1) (Nikolakaki et al., 2001). Στην περίπτωση του μορίου της SRPK2, η οποία αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε μικρές αλλαγές στην αμινοξική ακολουθία στη κεντρική και καρβοξυτελική τους περιοχή. Οι διαφορές αυτές δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα και την εξειδίκευση των δύο ενζύμων (πάνω από 90% ομολογία στις περιοχές κινάσης). Επιπλέον, το αμινοτελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες και περιέχει την αμινοξική αλληλουχία P-P-L-P, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με SH 3 - και WW-περιοχές άλλων πρωτεϊνών (Wang et al., 1998). Κατ αναλογία με την πρόσθετη αλληλουχία της SRPK1a, η διαφορετική αυτή περιοχή της SRPK2 μπορεί να παίζει το ρόλο ενός σήματος για την αλληλεπίδραση της με διαφορετικά υποστρώματα ή άλλα ρυθμιστικά μόρια, σε σύγκριση με την SRPK1. Πρόσφατες κρυσταλλογραφικές μελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Sky1p της ζύμης S.cerevisiae υπέδειξαν τρία δομικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητα που παρουσιάζουν τα μέλη της οικογένειας των SRPKs. Για λόγους που ευνοούσαν την κρυστάλλωση του μορίου της Sky1p, δημιουργήθηκε μια μεταλλαγμένη της μορφή από την οποία είχαν αφαιρεθεί μία μη διατηρημένη αλληλουχία 137 αμινοξέων στο αμινοτελικό της άκρο, καθώς και η περιοχή που παρεμβάλλεται μεταξύ των δραστικών περιοχών της κινάσης. Η μεταλλαγμένη αυτή μορφή παραμένει ενεργή, παρουσιάζοντας παρόμοια δραστικότητα με τη φυσιολογική μορφή της κινάσης (Nolen et al., 2001). Η συνολική δομή του μορίου της Sky1p, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.3, είναι παρόμοια με αυτή που παρουσιάζουν και άλλες κινάσες πρωτεϊνών, έχοντας έναν 17

μικρό λοβό ο οποίος αποτελείται κυρίως από β-ελάσματα και έναν μεγάλο λοβό αποτελούμενο κυρίως από α-έλικες. Στη φυσιολογική της μορφή η αλληλουχία που παρεμβάλλεται μεταξύ των περιοχών της κινάσης τοποθετείται μεταξύ των ελασμάτων β7 και β8. Τα χαρακτηριστικά που διαφοροποιούν την Sky1p και γενικά όλες τις κινάσες της οικογένειας των SRPK από άλλες κινάσες πρωτεϊνών και είναι πιθανά υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητά που εμφανίζουν είναι τα εξής: i. Η έλικα αc, η οποία σε ορισμένες κινάσες πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για τον έλεγχο της δράσης τους, στην περίπτωση της Sky1p περιλαμβάνει μία επιπλέον αλληλουχία αμινοξέων (αc ) η οποία επεκτείνει τη δομή της αc κατά μία περιστροφή. Η επιπλέον αυτή περιοχή σταθεροποιεί την αc, φέρνοντας την σε επαφή με την έλικα αε του μεγάλου λοβού. Η Tyr283 της αε έλικας παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομής αλληλεπιδρώντας μέσω δεσμών υδρογόνου με τα αμινοξέα Asn210 και Asp213 της έλικας αc. ii. Οι SRPKs δεν απαιτούν τη φωσφορυλίωση του βρόχου ενεργοποίησης προκειμένου να καταστούν δραστικές. Στη θέση ενός χαρακτηριστικού αμινοξέος Arg που προηγείται του καταλυτικού Asp διαθέτουν μία Thr. Προκειμένου τα μόρια των SRPKs να καταστούν ενεργά, αντί της φωσφορυλίωσης του βρόχου ενεργοποίησης, ευνοείται η αλληλεπίδρασή του με περιοχές του μορίου εκτός της δραστικής περιοχής, οι οποίες σταθεροποιούν το βρόχο σε μία κατάσταση συνεχούς ενεργότητας. iii. Οι SRPKs διαθέτουν μία δομή στην περιοχή δέσμευσης του υποστρώματος, η οποία αναγνωρίζει φωσφοσερίνες που βρίσκονται σε P-2 θέση από τη σερίνη που πρόκειται να φωσφορυλιωθεί. Έτσι η μετατόπιση της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην περιοχή αυτή και δέσμευση της γειτονικής σερίνης στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου, προκαλεί τη διαδοχική φωσφορυλίωση των σερινών του υποστρώματος (Nolen et al., 2001). 18

Σχήμα Α.3. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της Sky1p. Παρουσιάζεται επίσης η δομική αναπαράσταση του μορίου της Sky1p ανεστραμμένη κατά 40 μοίρες όπου φαίνονται οι μη καταλυτικές περιοχές της κινάσης (Nolen et al., 2001). Σχήμα Α.4. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της SRPK1ΔNS1 (Ngo et al., 2005). Τα παραπάνω δομικά στοιχεία επιβεβαιώθηκαν μετά από την κρυσταλλογραφική μελέτη και της SRPK1, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.4. Για την καλύτερη κρυστάλλωση του μορίου της SRPK1, αφαιρέθηκαν από το μόριό της μία 19

περιοχή 40 αμινοξέων από το Ν-τελικό άκρο και 217 αμινοξέα από τη συνδετική αλληλουχία (aa 256 473). Το μόριο που δημιουργήθηκε αναφέρεται ως SRPK1ΔNS1 (Ngo et al., 2005). Η SRPK1 παρουσιάζει υψηλή δομική ομολογία με την Sky1p. Παρόλα αυτά διαθέτει και δύο αξιοσημείωτες διαφορές. Το C-τελικό άκρο της Sky1p περιλαμβάνει μία αλληλουχία 40 αμινοξέων που περιελίσσεται γύρω από την καταλυτική περιοχή (kinase domain) του καρβοξυτελικού άκρου του μορίου, κάτι που δεν υπάρχει στην SRPK1ΔNS1. Επιπλέον, η συνδετική περιοχή της SRPK1ΔNS1 δημιουργεί δύο δομές α-έλικας, που συμβάλλουν (σχηματίζουν ένα ασυνεχές τοίχος πλευρικά του ενζύμου, στο οποίο οφείλεται) στη συνεχή ενεργή διαμόρφωση της κινάσης (Ngo et al., 2005). Το μοντέλο ότι οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωμάτων τους, δεν εξηγεί τη φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώματος. Είναι πιθανό in vivo το υπόστρωμα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από μία άλλη κινάση πρωτεϊνών και ακολούθως οι SRPKs να το αναγνωρίζουν και να φωσφορυλιώνουν τις υπόλοιπες σερίνες, ακολουθώντας μία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPKs, αλλά με πολύ μικρότερη αποτελεσματικότητα. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η SRPK1 συνδέεται αρχικά με τα υποστρώματά της μέσω μίας αύλακας του μορίου της (docking groove), η οποία αναγνωρίζει το μοτίβο R-X-R/K-X-X-X-R (Ngo et al., 2005). Όταν η αρχική φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιτευχθεί, η SRPK1 συνεχίζει τη φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιδεικνύοντας υψηλότερη δραστικότητα (Nolen et al., 2001). Σε πειράματα φωσφορυλίωσης του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 από την SRPK1 βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση των σερινών της RS ακολουθίας γίνεται διαδοχικά. Όσο διαρκεί η διαδικασία αυτή, το υπόστρωμα παραμένει δεσμευμένο πάνω στο μόριο της κινάσης. Αποδείχτηκε ακόμη ότι από τις 20 σερίνες της RS ακολουθίας, μόνο οι μισές φωσφορυλιώνονται in vitro. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης μάλιστα είναι ανεξάρτητες της ποσότητας του ATP ή της ποσότητας της κινάσης (Aubol et al., 2003). 20

A.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Η εξειδίκευση των SRPKs εντοπίζεται στην ύπαρξη μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα μόρια των υποστρωμάτων τους. Η μεταφορά της γ-φωσφορικής ομάδας του ΑΤΡ γίνεται στις σερίνες των ακολουθιών αυτών. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι SRPKs είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (-R-S-R-S-R-S-). Σε πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης χρησιμοποιώντας ως κινάση την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και υποστρώματα που περιείχαν μόνο δύο επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόμη έχει δειχτεί ότι η αντικατάσταση της σερίνης από θρεονίνη ή της αργινίνης από λυσίνη στις RS ακολουθίες, έχει ως αποτέλεσμα τη μη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων από την SRPK1 (Wang et al., 1998). Το Ν-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR Lamin B Receptor) περιέχει κατάλληλη περιοχή διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την SRPK1. Μεταλλάγματα της περιοχής αυτής, στα οποία είχαν εισαχθεί με σημειακές μεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών, έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν την δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίμηση από την πλευρά της κινάσης (Nikolakaki et al., 1996; Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόμη σε in vitro πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 με διάφορους παράγοντες ματίσματος του mrna που προέρχονται από διαφορετικούς οργανισμούς, έδειξαν ότι οι κινάσες αυτές προτιμούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που είναι τοποθετημένες ανάμεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αμινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al., 1998). Όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των SRPKs, οι μελέτες που έγιναν χρησιμοποιώντας ως πηγή δράσης την SRPK1 και ως υπόστρωμα τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 έδωσαν μια τιμή Κm 10 μμ για το ΑΤΡ, και μία πολύ μικρή τιμή Κm 0,07 μμ για το υπόστρωμα. Το γεγονός αυτό δείχνει την πολύ μεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώματά τους (Gui et al., 1994b). 21

A.1.3.Εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς Φθορισμομετρικός in situ υβριδισμός (FISH) σε ανθρώπινα σωματικά κύτταρα έδειξε ότι το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται τοποθετημένο στο χρωμόσωμα 6 (θέση 6p21.2-p21.3), ενώ αντίστοιχα το γονίδιο της SRPK2 στο χρωμόσωμα 7 (θέση 7q22-q31.1). Στο ποντίκι, η χαρτογράφηση των χρωμοσωμάτων έδειξε ότι τα γονίδια των SRPK1 και SRPK2 βρίσκονται στα χρωμοσώματα 17 (θέση 17 A3.3) και 5 (θέση 5 9.0 cm) αντίστοιχα (NCBI, Entrez Gene; Wang et al., 1999). Στο ποντίκι ακόμη, όπου δεν εκφράζεται η ανθρώπινη ισομορφή SRPK1a, εκφράζεται η Stk23/SRPK3 (Nakagawa et al., 2005), το γονίδιο της οποίας βρίσκεται στο χρωμόσωμα Χ (θέση X A7.3). Ομόλογη της συγκεκριμένης χρωμοσωμικής περιοχής έχει βρεθεί και στον άνθρωπο, στο χρωμόσωμα Χ (θέση Xq28) (NCBI, Entrez Gene), δεν έχει όμως βρεθεί ακόμη η αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η κατανομή των μελών της οικογένειας των SRPKs πρωτεϊνικών κινασών στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σημαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασής τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των SRPKs, χρησιμοποιώντας υβριδισμό κατά Northern με ιχνηλάτες ραδιενεργά επισημασμένα τμήματα των γονιδίων τους, έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στους όρχεις, έχοντας μικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύμος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός μυς (Papoutsopoulou et al., 1999b). Παρόμοια εικόνα έδειξε και η μελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όμως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασής της στους διάφορους ιστούς ήταν σημαντικά μικρότερα (Nikolakaki et al., 2001). Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα, αφού εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, μέτρια στην καρδιά και το σκελετικό μυ, ενώ παρουσιάζει χαμηλά επίπεδα έκφρασης στον πνεύμονα, το ήπαρ και το νεφρό (Wang et al., 1998). Τέλος, η SRPK3 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό μυ του ποντικού (Nakagawa et al., 2005). Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών στους ιστούς των οργανισμών, συμβάλουν στη ρύθμιση των λειτουργιών τους κατά ένα εξειδικευμένο τρόπο στο επίπεδο του κάθε ιστού ξεχωριστά (tissue specific regulation). 22

Α.1.4.Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνηςαργινίνης Η υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης παρουσιάζει μια αινιγματική συμπεριφορά. Αν και όλα τα, μέχρι τώρα, γνωστά υποστρώματα τους είναι πυρηνικές πρωτεΐνες, πειράματα ανοσοφθορισμού σε καθηλωμένα κύτταρα έδειξαν ότι οι SRPKs παρουσιάζουν μία κυρίαρχη κυτταροπλασματική εντόπιση, έχοντας ταυτόχρονα ένα πολύ αδύνατο πυρηνικό σήμα (Nikolakaki et al., 2001; Wang et al., 1998). Σε αντίστοιχους φθορισμούς που έγιναν χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP, το αποτέλεσμα ήταν ανάλογο, αλλά αυτή τη φορά το πυρηνικό σήμα ήταν ξεκάθαρα ορατό (Wang et al., 1998). Μελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Dsk1 της ζύμης S. pompe αποκάλυψαν ότι σε κύτταρα συγχρονισμένα στη μεσόφαση η κυτταροπλασματική εντόπιση της κινάσης είναι κυρίαρχη. Αντίθετα σε κύτταρα λίγο πριν την είσοδο τους στη μίτωση, το σήμα ανοσοφθορισμού της κινάσης εμφανίζεται έντονα στον πυρήνα, υπονοώντας ότι η διαφορετική κυτταρική εντόπιση των κινασών αυτών κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων του κυτταρικού κύκλου είναι σημαντική για τις λειτουργίες του κυττάρου (Takeuchi and Yanagida, 1993). Στην περίπτωση της κινάσης πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Sky1p της ζύμης S. cerevisiae, βρέθηκε ότι η μεγάλη ενδιάμεση ακολουθία που χωρίζει τις δραστικές περιοχές της κινάσης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της υποκυτταρικής της εντόπισης. Χρησιμοποιώντας τόσο τη φυσιολογική, όσο και τη μορφή της κινάσης από την οποία είχε αφαιρεθεί η εν λόγω ακολουθία, βρέθηκε ότι στα κύτταρα που έφεραν τη φυσιολογική μορφή, το κυτταροπλασματικό σήμα είναι έντονο, σε αντίθεση με τη μεταλλαγμένη της μορφή η οποία εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρήνα. Μία αρχική υπόθεση για το ρόλο αυτού του εμβόλιμου τμήματος είναι ότι περιέχει κάποιο σήμα εξόδου από τον πυρήνα (NES-Nuclear Export Signal) (Siebel et al., 1999). Άλλωστε η αντίστοιχη ενδιάμεση ακολουθία της Dsk1 περιέχει ένα αντίστοιχο σήμα που μπορεί να δράσει ως NES και το οποίο εξαρτάται από τον αναστολέα της εξόδου από τον πυρήνα, λεπτομυκίνη Β (Fukuda et al., 1997). 23

Σχήμα Α.5. Υποκυτταρική εντόπιση των ενδογενών (Α) SRPK1 και (Β) SC35 σε μεσοφασικά HeLa κύτταρα, (C) Μίξη των δύο εικόνων (merge). Ο ανοσοφθορισμός έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος για την SRPK1 από ποντίκι και πολυκλωνικού αντισώματος για τον παράγοντα ματίσματος SC35 από κουνέλι (Ding et al., 2006). Σχήμα Α.6. Ο ρόλος της συνδετικής αλληλουχίας και της ενεργής διαμόρφωσης στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1. (Α) SRPK1, (D) ανενεργή SRPK1(K109M), (G) SRPK1-ΔS, που δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία, (J) SRPK1-ΔS(K109M), που είναι και ανενεργή και δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία (Β, E, H, K) παράγοντας ματίσματος SC35 και (C, F, I, L) μίξη των αντίστοιχων εικόνων (merge) (Ding et al., 2006). 24

Πρόσφατες έρευνες από την ερευνητική ομάδα του Dr. Fu X.D. έδειξαν αντίστοιχη συμπεριφορά για τις πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/αργινίνης των θηλαστικών. Η ενδογενής SRPK1, σε κύτταρα HeLa, εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, με ένα κλάσμα της να έχει μία ξεκάθαρη πυρηνική εντόπιση. Το σήμα στον πυρήνα, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.5, συνεντοπίζεται μερικά με τον παράγοντα ματίσματος SC35. Ακόμη δείχτηκε ότι η SRPK1, σε κύτταρα HeLa, αποκρίνεται στα μονοπάτια μεταφοράς σήματος κατά τον κυτταρικό κύκλο και εισέρχεται στον πυρήνα, λίγο πριν αυτά εισέλθουν στη φάση Μ (Ding et al., 2006). Η αφαίρεση της συνδετικής αλληλουχίας έχει ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό της SRPK1 εξ ολοκλήρου στον πυρήνα. Ακριβώς το ίδιο αποτέλεσμα έχουμε και στην περίπτωση της SRPK2. Σε αντίθεση με την υπόθεση ότι η περιοχή αυτή περιέχει κάποιο σήμα εξόδου από τον πυρήνα, μελέτες από την ίδια ερευνητική ομάδα έδειξαν ότι η υποκυτταρική εντόπιση εξαρτάται από τη δραστικότητα της κινάσης. Ανενεργή SRPK1, που φέρει τη σημειακή μετάλλαξη Κ109Μ στην περιοχή δέσμευσης του ΑΤΡ, διατηρεί την κυτταροπλασματική της εντόπιση, ενώ η ίδια μετάλλαξη, σε SRPK1 που της έχει αφαιρεθεί η συνδετική αλληλουχία, επηρεάζει την κατανομή και οδηγεί την κινάση τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα (σχήμα Α.6). Επιπλέον αποδείχτηκε ότι η υποκυτταρική κατανομή της SRPK1 είναι ανεξάρτητη της δράσης της λεπτομυκίνης Β (Ding et al., 2006). Τα παραπάνω δεδομένα ενισχύουν την άποψη ότι στις SRPKs η συνδετική αλληλουχία λειτουργεί περισσότερο ως «κυτταροπλασματική άγκυρα» και η έκθεσή της ανάλογα με τη διαμόρφωση (ενεργή ή ανενεργή) του ενζύμου, είναι αυτή που επηρεάζει την είσοδο στον πυρήνα. Η διαφορετική συμπεριφορά της Dsk1, όπου φαίνεται ότι η αντίστοιχη συνδετική αλληλουχία περιέχει σήμα εξόδου από τον πυρήνα, ίσως οφείλεται στο γεγονός ότι η συγκεκριμένη περιοχή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης δεν είναι αρκετά συντηρημένη κατά την εξέλιξη (Ding et al., 2006). Οι SRPKs διαθέτουν μια περιοχή ομόλογη της MAPK, όπου δεσμεύονται ορισμένα από τα υποστρώματά τους, όπως ο ASF/SF2 παράγοντας ματίσματος (Ngo et al., 2005). Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αλληλεπίδραση των φωσφορυλιωμένων παραγόντων ματίσματος με υποδοχείς εισόδου στον πυρήνα, όπως οι TRN-SR1 και 2 (transportin-sr1 και 2) (Lai et al., 2000; Yun et al., 2003), οδήγησε στην υπόθεση ότι η είσοδος των SRPKs στον πυρήνα γίνεται μέσω ενός 25

τριαδικού συμπλόκου, που περιλαμβάνει την κινάση, τους παράγοντες ματίσματος και τους πυρηνικούς υποδοχείς. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι η υπερέκφραση του ASF/SF2 αυξάνει την πυρηνική εντόπιση της SRPK1 (Ngo et al., 2005). Αντίστοιχα η έξοδος των SRPKs από τον πυρήνα θεωρείται πως γίνεται μέσω των υπο-φωσφορυλιωμένων παραγόντων ματίσματος, οι οποίοι συνδέονται με το mrna (Huang et al., 2004). Η δραστικότητα των SRPKs είναι απαραίτητη κατά την είσοδό τους στον πυρήνα, αλλά όχι και κατά την έξοδο, όπου ίσως αποτελούν συστατικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων, τα οποία εξάγονται στο κυτταρόπλασμα (Ding et al., 2006). Α.1.5. Υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης Α.1.5.1. Παράγοντες ματίσματος του RNA (SR splicing factors) Τα πιο καλά μελετημένα υποστρώματα της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης αποτελούν οι παράγοντες ματίσματος, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (SR splicing factors), με πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα τον ASF/SF2. Άλλα μέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ο SC35, ο 9G8 και τέσσερα ακόμα πολυπεπτίδια με μοριακές μάζες 20, 30, 40, 55 και 75 kda, όπως φαίνονται στο σχήμα Α.7. Άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη διαδικασία ματίσματος του RNA και περιέχουν το χαρακτηριστικό μοτίβο των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιμοποιείται για τις έξι προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται με τις μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεϊνες (snrnps small nuclear RiboNucleoProteins) όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο αμινοτελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης και δέσμευσης του RNA, RBDs (RNA Binding Domains), ενώ το καρβοξυτελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (Manley and Tacke, 1996). Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με άλλους παράγοντες ματίσματος και εκτός από την συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος, 26

θεωρούνται σημαντικές και στην περίπτωση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος των mrnas ρυθμίζοντας την επιλογή της θέσης όπου θα γίνει το μάτισμα (Manley and Tacke, 1996; alcarcel and Green, 1996). Σχήμα Α.7. Σχηματική αναπαράσταση των δομικών περιοχών των SR παραγόντων ματίσματος. Διακρίνονται στο αμινοτελικό άκρο τους μία ή δύο περιοχές δέσμευσης με το RNA (RBD - κόκκινο ή μπλε) και στο καρβοξυτελικό τους άκρο οι περιοχές των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS - πράσινο). Μία συνδετική αλληλουχία πλούσια σε γλυκίνη και σε ορισμένους παράγοντες εκτός της γλυκίνης πλούσια και σε προλίνη ή αργινίνη, φαίνεται με πορτοκαλί. Ακόμη ο παράγοντας 9G8 με μοριακή μάζα 35 kda περιέχει μία θέση δέσμευσης ψευδαργύρου (γκρι) (Manley and Tacke, 1996). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης των παραγόντων ματίσματος είναι η αποσύνδεσή τους από τις θέσεις αποθήκευσης στον πυρήνα (IGCs - Interchromatin Granule Clusters), όπου βρίσκονται συγκεντρωμένοι σε μεγάλα ανενεργά σύμπλοκα. Έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική μορφή τους, είναι δυνατή η μεταφορά τους σε ενεργές περιοχές μεταγραφής στο νουκλεόπλασμα (PFs - Perichromatin 27

Fibrils), όπου και συμμετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριμου mrna (Gui et al., 1994a; Kuroyanagi et al., 1998; Yeakley et al., 1999). Επίσης, η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από την οικογένεια των SR πρωτεϊνικών κινασών, επάγει τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύμπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας ματίσματος του mrna (Gui et al., 1994a; Yue et al., 2000). Στην ικανότητα των SR πρωτεϊνικών κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συμπλόκου, συνηγορούν και δεδομένα τα οποία δείχνουν ότι με μη φωσφορυλιωμένους παράγοντες ματίσματος ή με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύμπλοκο δεν συγκροτείται και το μάτισμα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (Cao et al., 1997). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιμη με προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος. Αφού όμως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συμπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος ώστε το σωματίδιο ματίσματος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία. Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι η παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, μετά την συγκρότηση του συμπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του ματίσματος του mrna (Cao et al., 1997). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει την λειτουργικότητα του συμπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι ένα ακόμη σημείο που καταδεικνύει την σημασία της ρυθμιζόμενης δραστικότητας των SR πρωτεϊνικών κινασών. Η δράση τους είναι απαραίτητη μόνο κατά τα αρχικά της στάδια του ματίσματος, αφού παρατεταμένη φωσφορυλίωση οδηγεί σε αναστολή της καταλυτικής διαδικασίας (Cao et al., 1997; Valcarcel et al., 1996; Wang et al., 1998; Xiao and Manley, 1997). Άλλο ένα αποτέλεσμα που συνηγορεί την παραπάνω θεώρηση, είναι η ανώμαλη φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος και η ανικανότητα δημιουργίας λειτουργικού συμπλόκου ματίσματος κατά την αλληλεπίδραση της SRPK1 με την πρωτεΐνη ICP27 του HSV-1 (Herpes Simplex Virus) (Sciabica et al., 2003). Τέλος, η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από το κυτταροπλασματικό κλάσμα των SR πρωτεϊνικών κινασών επάγει τη μεταφορά τους από το κυτταρόπλασμα, όπου συντίθενται, στον πυρήνα. Ταυτόχρονα ρυθμίζεται και η ενδοπυρηνική τους εντόπιση στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές 28

του πυρήνα (Yeakley et al., 1999). Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειωθεί ότι στη ζύμη S. cerevisiae, η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εμπλέκεται στη δέσμευση και μεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθμίζεται η είσοδος της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p με τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (Gilbert et al., 2001). Α.1.5.2. Πυρηνικός φάκελος Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR Lamin B Receptor) Κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής ενός ευκαρυωτικού κυττάρου, εκτός της μίτωσης, ο πυρήνας καλύπτεται από ένα μεμβρανικό περίβλημα, τον πυρηνικό φάκελο (nuclear envelope), ο οποίος διαμερισματοποιεί τον πυρήνα από το υπόλοιπο του κυττάρου. Ο πυρηνικός φάκελος αποτελείται από δύο διακριτές μεμβράνες, την εξωτερική και εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, οι οποίες διαχωρίζονται από τον περιπυρηνικό χώρο (perinuclear cisternal space). Οι δύο μεμβράνες σε ορισμένα σημεία τους συντήκονται και σχηματίζουν πόρους με λειτουργική διάμετρο 9 nm. Μέσω των πυρηνικών πόρων είναι δυνατή η πυρηνο-κυτταροπλασματική κυκλοφορία. Οι πυρηνικοί πόροι επιτρέπουν την ελεύθερη διάχυση ιόντων και μικρών μορίων, ενώ είναι υπεύθυνοι για την ενεργή μεταφορά πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων από και προς τον πυρήνα. Μελέτες τα τελευταία χρόνια έδειξαν ότι οι πόροι επενδύονται από μακρομοριακά συγκροτήματα που ονομάζονται συμπλέγματα των πυρηνικών πόρων (NPC, nuclear pore complexes). Τα παραπάνω αποτελούνται από περίπου 100 διαφορετικές πρωτεΐνες, τις νουκλεοπορίνες, που σχηματίζουν γιγαντιαίου μεγέθους μοριακές μηχανές (125 MDa) (Pante and Aebi, 1996). Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη έχει την ίδια βιοχημική και λειτουργική σύσταση με αυτή του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου ώστε να θεωρείται ουσιαστικά η συνέχεια του, αποτελώντας ένα εξειδικευμένο υποσύνολο του. Στο μεγαλύτερο μέρος στην επιφάνεια της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, βρίσκονται προσκολλημένα ριβοσώματα όπου και μπορεί να γίνει πρωτεϊνική σύνθεση. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη έχει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και περιέχει εξειδικευμένες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που δημιουργούν θέσεις δέσμευσης πάνω στη μεμβράνη για την ετεροχρωματίνη και την πυρηνική λάμινα. 29

Τέτοιες πρωτεΐνες είναι ο Υποδοχέας της Λαμίνης Β (LBR, Lamin B Receptor) (Worman et al., 1988), μία οικογένεια πρωτεϊνών που αναφέρονται ως LAP (Lamina Associated Polypeptides) και διαχωρίζεται σε δύο ομάδες τις LAP1 και LAP2 (Foisner and Gerace, 1993), η εμερίνη και το ΜΑΝ1 αντιγόνο (Worman and Courvalin, 2000). Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης συντίθενται στους αγωγούς του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου και με πλευρική διάχυση μεταφέρονται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, αφού πρώτα περάσουν από τα πλευρικά κανάλια του συμπλέγματος των πυρηνικών πόρων. Σχήμα Α.8α. Σχηματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Κάτω από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη βρίσκεται ένα πλέγμα, το πυρηνικό έλασμα ή αλλιώς λάμινα που προκύπτει από τον πολυμερισμό των πυρηνικών λαμινών. Τόσο η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη όσο και η πυρηνική λάμινα βρίσκονται σε στενή επαφή με την περιφερική ετεροχρωματίνη και μπορεί να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην οργάνωση του γονιδιώματος (Georgatos, 1994). Στην αλληλεπίδραση αυτή συνηγορούν βιοχημικά πειράματα, που δείχνουν ότι τόσο 30

οι πυρηνικές λαμίνες, όσο και ορισμένες πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης (LBR, LAP2B), έχουν την ικανότητα δέσμευσης με χρωμοσώματα ή νουκλεοσώματα in vitro (Burke, 1990; Glass and Gerace, 1990; Yuan et al., 1991; Pyrpasopoulou et al., 1996). Ωστόσο, ενώ η ανοσοαφαίρεση του LBR μειώνει δραματικά την ικανότητα σύνδεσης του πυρηνικού φακέλου στη χρωματίνη, η αφαίρεση της LAP2B ή των λαμινών, την επηρεάζει ελάχιστα, με συνέπεια να θεωρείται ο LBR ο κυριότερος παράγοντας για την αλληλεπίδραση μεταξύ της χρωματίνης και του πυρηνικού φακέλου (Pyrpasopoulou et al.,1996; Collas et al., 1996). Aνάλυση της πρωτοταγούς δομής του LBR έδειξε ότι αποτελείται από 8 υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές που διαπερνούν την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, καθώς και δύο υδρόφιλες περιοχές στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό του άκρο αντίστοιχα, τα οποία εκτείνονται προς το πυρηνόπλασμα (Worman et al., 1990, Ye and Worman, 1994). Αν και δεν έχει γίνει συστηματική μελέτη των διαμεμβρανικών τμημάτων και του καρβοξυτελικού άκρου της πρωτεΐνης, οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά του αμινοτελικού της άκρου έχουν μελετηθεί διεξοδικά. Σχήμα Α.8β. Σχηματική αναπαράσταση του υποδοχέα της λαμίνης Β ( LBR). Το αμινοτελικό του LBR αποτελείται από μία ακολουθία 208 αμινοξέων και έχει σφαιρικό (globular) σχήμα. Στο τμήμα αυτό περιέχονται το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της πρωτεΐνης (NLS), ακολουθίες αμινοξέων οι οποίες είναι ικανές να 31

φωσφορυλιωθούν από την πρωτεϊνική κινάση Α και την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, μία περιοχή επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS domain), καθώς και πιθανές περιοχές δέσμευσης του DNA (Appelbaum et al., 1990; Nikolakaki et al., 1997; Nikolakaki et al., 1996; Simos and Georgatos, 1992; Soullam and Worman, 1993). Ακόμη το αμινοτελικό άκρο του LBR είναι ικανό να δεσμεύσει την λαμίνη τύπου Β, γεγονός που εξηγεί και την ονομασία της πρωτεΐνης (Simos and Georgatos, 1992; Worman et al., 1988; Ye and Worman, 1994), καθώς και την ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (HP1) (Ye and Worman, 1996). Η RS ακολουθία του αμινοτελικού άκρου του LBR περιλαμβάνει πέντε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης ( 75 RSRSRSRSRS 84 ) και όλες οι σερίνες της φωσφορυλιώνονται από την SRPK1 (Mylonis et al., 2004; Nikolakaki et al., 1996). Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση του LBR με άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα όπως η πρωτεΐνη p32/p34, οι ιστόνες Η3 και Η4 (Polioudaki et al., 2001) και η πρωταμίνη 1 (Mylonis et al., 2004). Ακόμη έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του LBR από την SRPK1 επάγει τη δέσμευση χρωματίνης στον LBR (Takano et al., 2004). A.1.5.3. Δημιουργία συμπυκνωμένης χρωματίνης σπερματοζωαρίων Πρωταμίνες Η χρωματίνη των σπερματοζωαρίων είναι εξαιρετικά συμπυκνωμένη και μεταγραφικά ανενεργή. Η συμπύκνωση της χρωματίνης επιτυγχάνεται εξαιτίας της απομάκρυνσης των ιστονών και της σύνδεσης του DΝΑ με μικρά βασικά πεπτίδια, τις πρωταμίνες. Στα ψάρια και τα πουλιά φαίνεται ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες γίνεται άμεσα. Ωστόσο, στα θηλαστικά οι ιστόνες πρώτα αντικαθίστανται από τις μεταβατικές πρωτεΐνες TP1 και TP2 (transition proteins) και στην συνέχεια αυτές από τις πρωταμίνες (Oliva et al., 1991). Ο μοριακός μηχανισμός απομάκρυνσης των ιστονών δεν είναι γνωστός, αλλά ίσως παίζουν ρόλο μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, όπως η ακετυλίωση. 32

Σχήμα Α.9. Αναπαράσταση της δομής της χρωματίνης σε σωματικά και σπερματικά κύτταρα. Στα σπερματικά κύτταρα δεν παρατηρείται νουκλεοσωμική οργάνωση της χρωματίνης αλλά αυτή αντίθετα εμφανίζει μία δομή doughnut. Έχει παρατηρηθεί ότι οι ιστόνες Η3 και Η4 είναι υποακετυλιωμένες κατά τη διάρκεια της μείωσης και στις κυκλικές σπερματίδες, ενώ με την έναρξη της σπερμιογένεσης παρατηρείται έντονη υπερακετυλίωση. Αυτή η ιδιαίτερη υπερακετυλίωση έχει προταθεί ότι λειτουργεί ως σήμα, ώστε να στρατολογηθούν παράγοντες, οι οποίοι θα μεσολαβήσουν για την απομάκρυνση των ιστονών (Meistrich et al., 1992). 33

Η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες δεν είναι πλήρης. Στα ώριμα σπερματοζωάρια το 10-15% του DNA εξακολουθεί να βρίσκεται συνδεδεμένο με ιστόνες, ενώ το υπόλοιπο με πρωταμίνες. Πιστεύεται ότι οι ιστόνες συνδέονται εκλεκτικά με γονίδια τα οποία θα εκφραστούν γρήγορα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ζυγωτού. Πράγματι, σε μελέτες όπου εξετάστηκε η οργάνωση της χρωματίνης των γονιδίων της σφαιρίνης σε σπερματοζωάρια, βρέθηκε ότι κάποια τμήματα των γονιδίων της ε και γ σφαιρίνης τα οποία εκφράζονται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη συνδέονταν με ιστόνες. Αντίθετα, τα γονίδια που κωδικοποιούν την β και δ-σφαιρίνη συνδέονται μόνο με πρωταμίνες και είναι ανενεργά κατά την ανάπτυξη του εμβρύου (Gariner et al., 1998). Οι πρωταμίνες είναι μια ποικιλόμορφη οικογένεια μικρών, πλουσίων σε αργινίνες πρωτεϊνών, η σύνθεση των οποίων γίνεται στo τέλoς της φάσης των σπερματίδων πολλών ζώων και φυτών. Δεσμεύονται στο DNA, συμπυκνώνοντας το σπερματιδικό γονιδίωμα σε μία γενετικά ανενεργή κατάσταση. Τα σπονδυλωτά έχουν από ένα έως δεκαπέντε γονίδια πρωταμίνης στο γονιδίωμα τους, που είναι συγκεντρωμένα μαζί στο ίδιο χρωμόσωμα. Σύγκριση των γονιδίων των πρωταμινών αλλά και των αμινοξικών ακολουθιών τους δείχνει ότι η οικογένεια εξελίχθηκε από εξειδικευμένες ιστόνες, μέσω πρωτεϊνών ανάλογων των πρωταμινών. Τα κύρια δομικά στοιχεία που υπάρχουν σε όλες τις πρωταμίνες είναι μια σειρά περιοχών πλούσιων σε αργινίνες, οι οποίες έχουν την ιδιότητα να αγκυροβολούν στο DNA (συχνά πρωταμίνες μη θηλαστικών περιέχουν ένα μίγμα αργινίνης και καταλοίπων λυσίνης) καθώς και πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης. Στα θηλαστικά απαντώνται δύο τύποι πρωταμινών, οι τύπου 1 και 2, οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια που έχουν χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 16p13.3. Οι πρωταμίνες τύπου 1 (P1) απαντώνται σε όλα τα θηλαστικά, ενώ οι τύπου 2 (P2) περιορίζονται μόνο σε ορισμένα είδη, όπως ο άνθρωπος, το ποντίκι και το άλογο. Οι πρωταμίνες τύπου 1 συντίθενται με την ώριμή τους μορφή και αποτελούν μικρά βασικά πεπτίδια πλούσια σε αργινίνες. Οι αργινίνες αποτελούν περίπου το 50% του μορίου και διατάσσονται σε τρεις ή τέσσερις ομάδες. Οι πρωταμίνες τύπου 1 διαιρούνται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τον αν περιέχουν ή όχι κυστεΐνες στο μόριό τους. Συγκεκριμένα, αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα μαρσιποφόρα, ενώ αυτές των θηλαστικών με πλακούντα περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ενδομοριακούς δισουλφιδικούς 34

δεσμούς που σταθεροποιούν τη δομή τους (Retief et al., 1993). Η πρωταμίνη 2 συντίθεται ως πρόδρομο μόριο και η ώριμη μορφή της προκύπτει με σταδιακή πρωτεόλυση της πρόδρομης μορφής (Chauviere et al., 2002). Έχει βρεθεί ότι δεσμεύει επίσης ένα άτομο ψευδαργύρου, η λειτουργικότητα του οποίου δεν είναι γνωστή. Σχήμα A.10. Δομή των πρωταμινών P1 και P2 ποντικού. Οι αριθμοί δηλώνουν θέσεις αμινοξέων. Τα δύο εξόνια που κωδικοποιούν τις πρωταμίνες P1 και P2 αντίστοιχα, παριστάνονται με ράβδους κάτω από τις αντίστοιχες πρωτεϊνικές ακολουθίες. Οι πρωταμίνες φωσφορυλιώνονται αμέσως μετά τη σύνθεσή τους, αλλά μετά την δέσμευσή τους στο DNA οι περισσότερες από τις φωσφορικές ομάδες απομακρύνονται (Chirat et al., 1993; Oliva and Dixon, 1991), ενώ παράλληλα κάποιες κυστεΐνες οξειδώνονται, δημιουργώντας δισουλφιδικές γέφυρες που συνδέουν τις πρωταμίνες μεταξύ τους. Οι πρωταμίνες τύπου 1 περιέχουν συντηρημένα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια RS στο μόριό τους, τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την SRPK1 (Papoutsopoulou et al., 1999b). Επίσης, έχει βρεθεί ότι η πρωταμίνη τύπου 2 υπόκειται σε φωσφορυλίωση από την κινάση Camk4 (Calmodulin-dependent protein kinase). Μάλιστα απενεργοποίηση του γονιδίου της 35

κινάσης, παρεμποδίζει την αντικατάσταση της TP2 από την πρωταμίνη 2 και οδηγεί σε στειρότητα. (Ribal et al., 2000). Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση επιτρέπει στο μόριο των πρωταμινών να αποκτήσει σφαιρική δομή και έτσι διευκολύνεται η σύνδεση με το DNA (Raukas et al., 1998). Αφού συνδεθούν με το DNA, οι πρωταμίνες αποφωσφορυλιώνονται, διατηρώντας όμως την σφαιρική διαμόρφωση τους, εξαιτίας της γειτνίασης τους με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA. Η αποφωσφορυλίωσή τους πιστεύεται ότι οδηγεί πιθανότατα σε μία περαιτέρω συμπύκνωση της χρωματίνης (Chirat et al., 1993). Έχει προταθεί ότι στην συμπυκνωμένη χρωματίνη των σπερματοζωαρίων ένα μόριο πρωταμίνης συνδέεται με τρία μόρια DNA, ενώ δεν είναι γνωστό αν οι πρωταμίνες συνδέονται στην μικρή ή την μεγάλη αύλακα του DNA, αφού υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα που υποστηρίζουν και τις δύο πιθανότητες (Raukas et al., 1998). MOUSE HUMAN MARYRCCRSKSRSRCCRRRRRRCRRRRRRCCRRRRRRCCRRRRSYTIRCKKY MARYRCCRSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRRSCQTRRRAMRCCRPRYRPRCRRH Σχήμα Α.11. Θέσεις φωσφορυλίωσης ανθρώπινης πρωταμίνης 1, καθώς και πρωταμίνης 1 ποντικού. Οι σερίνες 9, 11 και 13 της RS ακολουθίας (έντονα γράμματα, υπογραμμισμένες) έχουν βρεθεί να είναι φωσφορυλιωμένες in vivo (Chirat et al., 1993, Pirhonen et al., 1994a), αλλά και in vitro από την SRPK1 (Papoutsopoulou et al., 1999b). Στην ανθρώπινη P1 oι σερίνες 13 (τελευταία σερίνη της RS ακολουθίας) και 22 (S, με κόκκινο και υπογραμμισμένη) έχουν βρεθεί να είναι φωσφορυλιωμένες in vitro από την PKC (Pirhonen et al., 1994b). Επίσης στην ανθρώπινη P1 η σερίνη 30 (S, με μπλε και υπογραμμισμένη) έχει βρεθεί να είναι φωσφορυλιωμένη τόσο in vivo όσο και in vitro από την PKA (Pirhonen et al., 1994a, 199b). Διατυπώθηκε ακόμα η άποψη ότι επειδή υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση πρωταμινών και άλλων βασικών πρωτεϊνών γύρω από το DNA, η φωσφορυλίωση σε συγκεκριμένες θέσεις στο μόριο των P1 πρωταμινών μειώνει τις δυνάμεις απώθησης μεταξύ γειτονικών θετικών φορτίων (Papoutsopoulou et al., 1999b). Πρόσφατα όμως αποτελέσματα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της με τον πυρηνικό φάκελο (Mylonis et al., 2004). Ο τρόπος με τον οποίο οι πρωταμίνες αντικαθιστούν τις μεταβατικές πρωτεΐνες και στην συνέχεια εναποτίθενται στο DNA δεν έχει διευκρινιστεί. Αυτό που είναι γνωστό, με δομικές μελέτες, είναι ότι η εμφάνιση των 36

πρωταμινών και η συμπύκνωση της χρωματίνης ξεκινά από την περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου κάτω από το ακροσωμικό κυστίδιο και στην συνέχεια προχωρά προς το πίσω μέρος του πυρήνα (Biggiogera et al., 1992). Δεδομένου ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης οδηγεί στην εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, μέσω της αλληλεπίδρασης της με τον LBR (Mylonis et al., 2004), μάλλον συνεισφέρει στην διαδικασία αντικατάστασης. Α.1.6. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης αργινίνης Η ομόλογη της SRPK1 στη ζύμη S. cerevisiae, η Sky1p, εμπλέκεται στη ρύθμιση της μεταφοράς πολυαμινών στο κύτταρο καθώς και στην ομοιόσταση ιόντων (Erez and Kahana, 2001). Μεταλλαγμένα κύτταρα ζύμης, όπου έγινε ανενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν μεγάλη ανθεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερμίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο που κωδικοποιεί την Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο με επιμόλυνσή τους με ένα μεταλλαγμένο γονίδιο που εκφράζει μια μη λειτουργική μορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξημένη ευαισθησία στην σπερμίνη. Η ανενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύμης προκάλεσε ακόμη μειωμένη πρόσληψη σπερμιδίνης και πουτρεσκίνης. Η ίδια μεταλλαγμένη μορφή των κυττάρων έδειξε και μία μεγάλη ανεκτικότητα στα ιόντα λιθίου και νατρίου (Erez and Kahana, 2001). Ένα άλλο μέλος της οικογένειας αυτής των κινασών, η SPK-1 στο νηματοειδές C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων. Η SPK-1 δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνη CeSF2 in vitro. Η κινάση αυτή και το υπόστρωμα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηματοειδούς και παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την διάρκεια του εμβρυϊκού σταδίου του C. elegans (Kuroyanagi et al., 2000). Τέλος, η SRPK1 έχει απομονωθεί ως σύμπλοκο με την τοποϊσομεράση ΙΙa, δύο ATPάσες/ελικάσες (RNA helicase A και RHII/Gu), δύο παράγοντες ματίσματος του RNA (PRP8 και hnrnp C) και μια HMG πρωτεΐνη (SSRP1) (Lee et al., 2004). Το σύμπλοκο αυτό, το οποίο ονομάστηκε τοποσωμάτιο (toposome), φαίνεται να 37

συγκροτείται κυρίως κατά τη G2/M φάση ενώ κατά τη G1/S φάση, οι συστατικές του πρωτεΐνες εμφανίζουν πολύ χαμηλή αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Το τοποσωμάτιο θεωρείται μερικώς υπεύθυνο για το διαχωρισμό των αδελφών χρωματίδων. Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι το συγκεκριμένο σύμπλοκο είναι δυναμικό και ότι ο σχηματισμός ή/και η ενεργοποίησή του εξαρτώνται άμεσα από τον κυτταρικό κύκλο (Lee et al., 2004). Α.1.7. SRPKs και παθογένεια Αύξηση των επιπέδων της SRPK1 έχει δειχτεί σε διάφορες λευχαιμίες, όπως η οξεία ATL (Adult T-cell leukemia) (Hishizawa et al., 2005) και η χρόνια CML (Salesse et al., 2004) αλλά και σε καρκίνους του στήθους, του εντέρου και του παγκρέατος (Hayes et al., 2006; Hayes et al., 2007). Μείωση της έκφρασης της SRPK1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του στήθους και του εντέρου, με χρήση sirna (small interference RNA), προκάλεσε αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που οδηγούνται σε απόπτωση και αύξηση του κυτταρικού θανάτου μετά από έκθεση σε χημειοθεραπευτικά αντιδραστήρια. Ενδελεχής μελέτη της επίδρασης της SRPK1 στην ενεργοποίηση των μονοπατιών μεταφοράς σήματος των κινασών MAPK και Akt, έδειξε ότι μετά από μείωση των επιπέδων της SRPK1, δεν παρατηρούνται αλλαγές σε επίπεδο πρωτεΐνης στις MAPK3, MAPK2 και Akt κινάσες. Εντούτοις υπάρχει μείωση στη φωσφορυλίωσή τους και αλλαγή στην αναλογία έκφρασης των ισομορφών της MAPK2, ίσως λόγω επίδρασης στο μηχανισμό ματίσματος του RNA (Hayes et al., 2007). Η επίδραση της SRPK1 στη δραστικότητα διαφόρων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, αποτελεί πεδίο αντιπαράθεσης, αφού η αύξηση των επιπέδων του συγκεκριμένου ενζύμου έχει συνδυαστεί τόσο με την αντίσταση, όσο και με την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων απέναντι σε παράγωγα πλατίνης. Σε καρκίνους των όρχεων και των ωοθηκών, η ελάττωση της έκφρασης της SRPK1 προκαλεί αντίσταση των καρκινικών κυττάρων απέναντι στη cis-πλατίνη (Schenk et al., 2001; Schenk et al., 2004). Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση της SRPK1 προκαλεί αντίσταση των ΗΤ29 (Human colon adenocarcinoma grade II cell line) κυττάρων στην οξαλιπλατίνη (Plasencia et al., 2006), ενώ η μείωση της έκφρασής της αυξάνει την ευαισθησία καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος στην cis-πλατίνη και τη 38

γεμσιταμπίνη (Hayes et al., 2006). Οι αντίθετες αυτές δράσεις της SRPK1 απέναντι στα διάφορα κυτταροτοξικά αντιδραστήρια έχουν αποδοθεί ότι οφείλονται στην έκφραση διαφορετικών πρωτεϊνών σε κάθε κυτταρική σειρά (Hayes et al., 2007). Αύξηση της έκφρασης της SRPK1 παρατηρείται και κατά τη χρωμοσωμική μετατόπιση t(6;17)(p21.31;q11.2), η οποία είναι υπεύθυνη για μια πληθώρα ανωμαλιών (Mansouri et al., 2006). Ακόμα, η εγκεφαλική ισχαιμία σε ποντίκι έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της SRPK1 στα βασικά γάγγλια και μετατόπισή της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Erdo et al., 2004). Η διαφοροποίηση των λευχαιμικών κυττάρων HL-60 από το ρετινοϊκό οξύ, τη βρωμοδεοξυουριδίνη και το μεσαίο Τ αντιγόνο του μεταλλαγμένου ιού του πολυόματος (Delta 205 mutant polyoma middle T antigen), προκαλούν αύξηση των επιπέδων έκφρασης της SRPK2 (Yen et al., 2004). Ακόμα, τόσο η SRPK2 όσο και η SRPK1 έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν την κεντρική πρωτεΐνη του ιού της ηπατίτιδας Β και να αναστέλλουν την αντιγραφή του ιού, μέσω μιας οδού η οποία φαίνεται να είναι ανεξάρτητη της φωσφορυλίωσης (Zheng et al., 2005). Η SRPK3 βρίσκεται υπό τον έλεγχο του μεταγραφικού παράγοντα MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), ο οποίος παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη των μυών. Ποντίκια, από τα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της SRPK3, παρουσιάζουν μία καινούργια μορφή μυοπάθειας, ενώ τρανσγενετικά ποντίκια που την υπερεκφράζουν, εμφανίζουν σοβαρό εκφυλισμό των μυϊκών ινών και πεθαίνουν στην F0 ή F1 γενιά. Α.2. Πυρηνική μήτρα Έχει περάσει πάνω από μισός αιώνας από τη στιγμή που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά η πυρηνική μήτρα, ως υπολειμματική δομή ύστερα από εκχύλιση κυττάρων με διαλύματα αλάτων (Zbarskii & Depov, 1948). Ως πυρηνική μήτρα ή πυρηνικό ικρίωμα ή πυρηνικό σκελετό (nuclear matrix or nuclear scaffold or nucleoskeleton) ονομάζουμε το δίκτυο πρωτεϊνών (NMP snuclear matrix proteins) και RNA που παραμένει αδιάλυτο έπειτα από την κατεργασία πυρήνων με μη ιονικά απορρυπαντικά, διαλύματα αλάτων υψηλής ιοντικής ισχύος και DNAse I. Η κατεργασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση της πυρηνικής μεμβράνης, της μεγαλύτερης ποσότητας DNA, των 39

ιστονών καθώς και των διαλυτών συστατικών του νουκλεοπλάσματος και την παραμονή μιας δομής που είναι ορατή με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Α.2.1. Συστατικά της πυρηνικής μήτρας Η πυρηνική μήτρα αποτελείται από την πυρηνική λάμινα και την εσωτερική πυρηνική μήτρα (internal nuclear matrix), που με τη σειρά της αποτελείται από τα κεντρικά νημάτια (core filaments), το διάχυτο σκελετό (diffuse skeleton), τον πυρηνίσκο (nucleolus) και τα λοιπά πυρηνικά σωμάτια (nuclear bodies). Η σύσταση της μήτρας έχει υπολογιστεί σε 85-95% πρωτεΐνες και 15-5% νουκλεϊκά οξέα. Έως τώρα έχουν βρεθεί 398 πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μήτρας (βλ. ηλεκτρονική διεύθυνση: http://www.rostlab.org/db/nmpdb/) Σχήμα A.12. Ηλεκτρονική φωτογραφία πυρηνικής μήτρας CaSki καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων μήτρας. Με Nu συμβολίζεται ο πυρηνίσκος, με L η λάμινα ενώ είναι ορατό και ένα δίκτυο. Α.2.1.1. Πυρηνική λάμινα Η πυρηνική λάμινα αποτελείται από τις λαμίνες τύπου Α και Β. Όλοι οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί, εκτός από τους μονοκύτταρους, εκφράζουν λαμίνες. Οι λαμίνες τύπου Β εκφράζονται καθ όλη την ανάπτυξη ενώ η έκφραση των λαμινών τύπου Α έχει άμεση σχέση με τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Οι λαμίνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους δίνοντας διμερή τα οποία στη συνέχεια πολυμερίζονται 40

για να μας δώσουν τα ενδιάμεσα ινίδια (intermediate filaments) πάχους 10 nm. Τα ινίδια αυτά δημιουργούν ένα δίκτυο στη εσωτερική πλευρά της πυρηνικής μεμβράνης που ως στόχο έχει τη συντήρηση της δομικής ακεραιότητας και του σχήματος του πυρήνα. Σχήμα A.13. Υπόλειμμα πυρηνικού φακέλου από ωοκύτταρα Xenopus μετά από εκχύλιση με Triton X-100 σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Στην εικόνα διακρίνεται το σχεδόν τετραγωνικό δίκτυο των λαμινών και τα κενά που αφήνουν οι πυρηνικοί πόροι. Πειράματα απαλοιφής γονιδίου (κnock-out) της λαμίνης Α είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία εύθραυστων πυρήνων οι οποίοι ήταν πιο επιμήκεις από τους φυσιολογικούς (Sullivan et al., 1999). Οι λαμίνες τύπου Α έχουν ουδέτερο ισοηλεκτρικό σημείο και συνδέονται με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη μέσω των πρωτεϊνών LAP1 (Lamina Associated Polypeptide 1) και emerin ενώ οι τύπου Β είναι όξινες και συνδέονται με την μεμβράνη μέσω των πρωτεϊνών LBR και LAP2. Κατά τη διάρκεια της μίτωσης που ο πυρηνικός φάκελος καταστρέφεται, οι λαμίνες τύπου Α και κάποιες από τις πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές φωσφορυλιώνονται, με αποτέλεσμα να διαλυτοποιούνται ενώ οι τύπου Β παραμένουν προσκολλημένες σε μεμβρανώδη σωματίδια (Georgatos et al., 1994). 41

Σχήμα A.14. Σχηματική αναπαράσταση του διμερισμού και της δημιουργίας ανωτέρων δομών από τις λαμίνες. Με τους γκρίζους κύκλους συμβολίζονται τα C-τελικά άκρα ενώ με τους κίτρινους τα Ν-τελικά. Έως τώρα έχουν αναφερθεί διάφορες αλληλεπιδράσεις των λαμινών με συστατικά της χρωματίνης. Συγκεκριμένα, οι λαμίνες στην πολυμερισμένη τους μορφή δεσμεύονται στις περιοχές S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS) του DNA (Luderus et al., 1992) καθώς και σε ιστόνες (Taniura et al., 1995). Σχήμα A.15. Σχηματική αναπαράσταση της περιοχής του πυρήνα γύρω από την πυρηνική λάμινα καθώς και των αλληλεπιδράσεων των λαμινών με άλλα μόρια. Με κόκκινες γραμμές συμβολίζονται οι λαμίνες ενώ με μπλε μόρια mrna. Με μωβ κύκλους συμβολίζεται η G-ακτίνη, με καφέ η profilin, με πορτοκαλί οι παράγοντες μεταγραφής και με πράσινο οι Arps. Η χρωματίνη φαίνεται σαν μπλε ή γκρι σκιά. Arp: Actin related protein, PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen, RFC: Replication Factor C, pol: polymerase. 42

Η πυρηνική λάμινα εμπλέκεται επίσης στη διαδικασία αντιγραφής του γενετικού υλικού αλλά και στη διαδικασία της σύνθεσης RNA. Διάσπαση της πυρηνικής λάμινας έχει ως αποτέλεσμα τη διακοπή της σύνθεσης του DNA στη φάση της επιμήκυνσης (Spann et al., 1997). Επιπλέον, ορισμένα κομμάτια της πρωτεΐνης LAP2 μπορούν να αναστείλουν ή να ενισχύσουν την αντιγραφή (Gant et al., 1999). Aλληλεπίδραση των λαμινών τύπου Α με την φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης Rb (Retinoblastoma) αναστέλλει την μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων του κυτταρικού κύκλου (Mancini et al., 1994). Απομένει να διαλευκανθεί αν τα μόρια αυτά της λαμίνης βρίσκονται στην πυρηνική περιφέρεια ή αποτελούν μέρος του εσωτερικού πυρηνικού ικριώματος. Προς την δεύτερη άποψη συνηγορεί και ο συνεντοπισμός μέρους των λαμινών με παράγοντες ματίσματος στο εσωτερικό του πυρήνα (Kumaran et al., 2002). Τέλος, μεταλλάξεις στις λαμίνες τύπου Α οδηγεί σε ασθένειες όπως η EDMD (Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy), καρδιομυοπάθεια, λιποδυστροφία και άλλες. Α.2.1.2. Κεντρικά νημάτια Τα κεντρικά νημάτια αποτελούν μέλος της οικογένειας των ενδιάμεσων ινιδίων (intermediate filaments) με πάχος 10 nm. Σημαίνονται με αντισώματα απέναντι στις συντηρημένες ακολουθίες των ενδιάμεσων ινιδίων όπως αυτών της λαμίνης Α (Hozak et al., 1995) και των κυτoκερατινών (Ocampo et al., 2005). Α.2.1.3. Διάχυτος σκελετός Χρησιμοποιούμε τον όρο διάχυτος σκελετός για την πολύπλοκη δομή που βρίσκεται προσκολλημένη στα κεντρικά νημάτια. Η δομή αυτή αποτελείται από σύμπλοκα νουκλεϊκών οξέων με πρωτεΐνες. Στις πρωτεΐνες συμπεριλαμβάνονται οι ετερογενείς πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες C1/2 και A (He et al., 1991) καθώς και η λαμίνη Α (Hozak et al., 1995). Ένα σημαντικό συστατικό αυτού του σκελετού αποτελεί και η πρωτεΐνη NuMA (NUclear Mitotic Apparatus protein), μια μεγάλη σε μέγεθος πρωτεΐνη (>250 KDa), με διαμόρφωση coiled-coil που εμπλέκεται στο μηχανισμό της μίτωσης (He et al., 1995) και δεσμεύεται στις περιοχές S/MARS του DNA (Harborth et al., 1999). 43

Πειράματα διδιάστατης ηλεκτροφόρησης αποκάλυψαν την ύπαρξη τουλάχιστον 12 πρωτεϊνών στο διάχυτο πυρηνικό σκελετό, που ονομάστηκαν matrins (Nakayasu and Berezney, 1991). Από τις πρωτεΐνες αυτές έχει μελετηθεί μόνο μία, η p250. Η p250 ταυτίζεται με μια μορφή της RNA πολυμεράσης II και ανοσοκατακρημνίζεται με σύμπλοκα ματίσματος του RNA (Mortillaro et al., 1996). Το κύριο νουκλεΐνικό οξύ του διάχυτου σκελετού είναι ετερογενές RNA (hnrna), το οποίο κατά ένα μεγάλο ποσοστό δεν αποτελεί πρώιμο mrna που οδηγείται στη συνέχεια εκτός πυρήνα, αλλά στοιχείο που συνεισφέρει στη δομική ακεραιότητα της χρωματίνης. Ως επιβεβαίωση τούτου ήρθε η παρατήρηση ότι κατεργασία κυττάρων με ριβονουκλεάσες ή αναστολείς της RNA πολυμεράσης ΙΙ έχει ως αποτέλεσμα την «κατάρρευση» της χρωματίνης σε πυκνές δομές που προσομοιάζουν την ετεροχρωματίνη (Derenzini et al., 1981). Ένα τέτοιο RNA, που διαθέτει την ικανότητα να δεσμεύεται στην πυρηνική μήτρα και δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, με δεδομένο ρόλο στη συντήρηση της χρωματινικής δομής και στον επιγενετικό έλεγχο, αποτελεί το XIST, ένα πολυαδενυλιωμένο RNA με την ικανότητα να απενεργοποιεί χρωμοσώματα (Clemson et al., 1996). Σχήμα A.16. Ηλεκτρονική φωτογραφία πυρηνικού σκελετού HeLa καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων μήτρας. Με L συμβολίζεται η πυρηνική λάμινα, ενώ είναι ορατά τα κεντρικά νημάτια αλλά και ο διάχυτος σκελετός (βέλος). 44

Α.2.1.4. Πυρηνικά σωμάτια Τα πυρηνικά σωμάτια αποτελούν έναν ετερογενή πληθυσμό δομών συνδεδεμένων στο διάχυτο σκελετό. Σ αυτά συμπεριλαμβάνονται τα σωμάτια Cajal (CB s) (Cajal Bodies ή Coiled Bodies) (Gedge et al., 2005), τα σωμάτια PML (Promyelotic Leukemia Bodies) (Stuurman et al., 1992), τα εργοστάσια αντιγραφής (replication factories) (Hozak et al., 1993), τα διαχρωματινικά κοκκιώδη συμπλέγματα (Ιnterchromatin Granule Clusters) (IGC s) (Fey et al., 1986) και τα περιχρωματινικά νημάτια (Perichromatin Fibrils) (PF s) (Van Driel et al., 1995). Τα σωμάτια Cajal ανακαλύφθηκαν από τον Santiago Ramon y Cajal το 1903. Εντοπίζονται στην περιφέρεια των πυρηνίσκων ή στο εσωτερικό τους. Καταστρέφονται στη μίτωση και επαναδημιουργούνται στην G 1 φάση. Αποτελούν σημεία βιογένεσης των snrnps (Gall et al., 1999), επεξεργασίας των πρώιμων mrna των ιστονών (Wu et al., 1993) και συναρμολόγησης των συμπλόκων μεταγραφής (Murphy et al., 2002). Τα σωμάτια PML (ή σωμάτια Kremer ή σωμάτια ND10 ή POD s (PML Oncogenic Domains)) έχουν διάμετρο 0,5 μm και αποτελούνται από έναν κεντρικό πυρήνα που περιβάλλεται από έναν πυκνό δακτύλιο, ο οποίος περιέχει κυρίως την πρωτεΐνη PML. Μια άλλη ενδιαφέρουσα πρωτεΐνη που εντοπίζεται σε αυτά τα σωμάτια είναι η Rb (Retinoblastoma). Πιστεύεται πως διαδραματίζουν κάποιο ρόλο στον έλεγχο της μεταγραφής (Hodges et al., 1998), στην επιδιόρθωση του DNA (Bischof et al., 2001) και αποτελούν στόχους ιικής μόλυνσης (Maul et al., 1998). Τα σωμάτια αυτά κέρδισαν την προσοχή του επιστημονικού κόσμου όταν ανακαλύφθηκε ότι διασπώνται σε ασθενείς που εμφανίζουν μία μετατόπιση (t15;17:q22;q21) που οδηγεί σε μία μορφή λευχαιμίας (Acute Promyelocytic Leukemia) (Daniel et al., 1993). Η πρωτεΐνη PML λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της ανάπτυξης (Hodges et al., 1998) και ως ογκοκατασταλτικός παράγοντας (Grimwade and Solomon, 1997). Αύξηση των επιπέδων της μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση (Wang et al., 1998), ενώ μια ισομορφή της έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53 (Fogal et al., 2000). Στα «εργοστάσια» αντιγραφής εκτός από DNA ανιχνεύονται η κινάση cdk2 (cyclin-dependent kinase), διάφορες κυκλίνες, το PCNA, και η DNA μεθυλοτρανσφεράση, συστατικά όλα του μηχανισμού αντιγραφής (Wansink et al., 1994). Τα 45

διαχρωματινικά κοκκιώδη συμπλέγματα (IGC s) αποτελούν χώρους όπου αποθηκεύονται υπό μορφή συμπλόκων οι παράγοντες ματίσματος του RNA και βρίσκονται σε γειτονία με τα περιχρωματινικά νημάτια (PF s), όπου λαμβάνει χώρα η μεταγραφή και η ωρίμανση του RNA με παράγοντες που προέρχονται από τα IGC s (Spector, 1996). Στα IGC s εντοπίζεται και η πρωτεΐνη NuMA, η οποία συνδέεται με τα σύμπλοκα των παραγόντων ματίσματος (van Driel et al., 1995). Στα PF s εντοπίζονται ετερογενή ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα (hnrnp s) (Fakan et al., 1976), η RNA πολυμεράση ΙΙ, διάφοροι παράγοντες μεταγραφής καθώς και παράγοντες ματίσματος (Fakan et al., 1984). Α.2.1.5. Πυρηνίσκος Οι πυρηνίσκοι είναι οι περιοχές σύνθεσης του rrna και συγκρότησης των ριβοσωμικών υπομονάδων. Αποτελούν τις πιο διακριτές μορφές μέσα στον πυρήνα καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εκτός της μίτωσης οπότε και αποσυγκροτούνται, ενώ επανασυγκροτούνται στην G 1 φάση. Δεν καλύπτονται από μεμβράνη. Σχήμα A.17. Οργάνωση του πυρηνίσκου σε Hep-2 καρκινικά κύτταρα λάρυγγα. F=ινώδες συστατικό, FC=ινώδες κέντρο, DFC=πυκνό ινώδες κέντρο, G ή GC=κοκκιώδες συστατικό, Ch=συμπυκνωμένη χρωματίνη, Ni=ενδιάμεσος χώρος. 46

Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εμφανίζονται ως φωτεινές ζώνες (ινώδη κέντρα - Fibrillar Centers (FC s)) που περιβάλλονται από ένα πυκνό ινώδες σώμα (Dense Fibrillar Components (DFC s) το οποίο είναι καθηλωμένο σε ένα κοκκιώδες σώμα (Granular Component (GC)). Τα ινώδη κέντρα αποτελούν χώρους εντόπισης του rdna, της RNA πολυμεράσης Ι, της τοποισομεράσης Ι και άλλων πρωτεϊνών απαραίτητων για τη μεταγραφή του ριβοσωμικού RNA. Στα ινώδη κέντρα γίνεται η σύνθεση του rrna, το οποίο στη συνέχεια μετατοπίζεται στα πυκνά ινώδη σώματα όπου και αρχίζει η ωρίμανσή του. Στα κοκκιώδη σώματα ολοκληρώνεται η ωρίμανση του και δημιουργούνται τα πρώιμα ριβοσώματα. Α.2.2. S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS) Στην πυρηνική μήτρα έχουν βρεθεί να παραμένουν προσκολλημένες αλληλουχίες DNA ύστερα από κατεργασία με DNAse I, που ονομάζονται S/MARS (Berezney & Jeon, 1995). Επίσης ως S/MARS χαρακτηρίζονται οι περιοχές του DNA που δεσμεύονται σε παρασκευές πυρηνικής μήτρας παρουσία DNA συναγωνιστή. Σχεδόν όλα τα S/MARS είναι πλούσια σε ΑΤ (πάνω από 65% της σύστασης τους) και σχηματίζουν μονόκλωνες ή περιοχές μη σύζευξης βάσεων (BUR s-base Unpairing Regions). Ταυτίζονται με τις περιοχές SIDD (Stress-Induced DNA Duplex Destabilization). Αρκετά S/MARS είναι συντηρημένα στην εξέλιξη όχι τόσο όσον αφορά την αλληλουχία τους όσο τη σχετική τους θέση ως προς αντίστοιχα γονίδια. Τα S/MARS μοιράζονται κάποια από τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: εμπεριέχουν ή γειτονεύουν με περιοχές έναρξης της αντιγραφής (ORIgins of replication - ORI), εμπεριέχουν περιοχές δέσμευσης ομοιωτικών πρωτεϊνών δηλαδή τις αλληλουχίες ΑΤΤΑ, ΑΤΤΤΑ ή ΑΤΤΤΤΑ, εμπεριέχουν αλληλουχίες δέσμευσης ή κοπής από τις τοποισομεράσες Ι ή ΙΙ ή/και εμπεριέχουν περιοχές δέσμευσης παραγόντων μεταγραφής. Οι ιδιότητες τους οφείλονται όχι σ αυτήν καθ αυτήν την αλληλουχία τους αλλά στη δευτερογενή δομή που αποκτούν εξαιτίας της αλληλουχίας τους. Χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: στις δομικές ακολουθίες (structural-constitutive) που περιλαμβάνουν αυτές που είναι μόνιμα προσκολλημένες στην μήτρα και σκοπός τους είναι διατηρούν την χρωματινική δομή και τις λειτουργικές (functional-facultative) 47

που εμπεριέχουν ιστοειδικές περιοχές δέσμευσης παραγόντων μεταγραφής και μπορούν να αποκολληθούν από αυτήν. Σύνδεση Μεταγραφή Τερματισμός ΜΗΤΡΑ ΜΗΤΡΑ ΜΗΤΡΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ Αποσύνδεση Σχήμα A.18. Δομικά και λειτουργικά S/MARS και μεταγραφή. Ένα ρεπλικόνιο (τμήμα DNA που αντιγράφεται από μία κοινή αρχή) με τα δομικά του S/MARS καθηλωμένα στη μήτρα αρχίζει να μεταγράφεται. Για την έναρξη της μεταγραφής το λειτουργικό S/MAR συνδέεται και αυτό με τη μήτρα για να φέρει το γονίδιο σε επαφή με τον μηχανισμό της μεταγραφής. Το μεταγραφικό σύμπλοκο παραμένει καθηλωμένο ενώ το DNA είναι αυτό που κινείται. Μετά το πέρας της διαδικασίας το λειτουργικό S/MAR απομακρύνεται από τη μήτρα. Με μια υπολογιστική προσέγγιση βρέθηκε ότι περίπου το 11% των περιοχών DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες τόσο στο ανθρώπινο, όσο και στο γονιδίωμα του ποντικού αποτελούν S/MARS. Επιπλέον βρέθηκε πως η πλειονότητα των S/MARS εμφανίζεται πριν την 5 περιοχή των γονιδίων (Glazko et al., 2003). Τα S/MARS απέχουν μεταξύ τους 5-200 Kb ανάλογα με το κύτταρο στο οποίο περιέχονται. Στο μεταφασικό χρωμόσωμα βρέθηκε πως η κατανομή των S/MARS είναι εκπληκτικά ομοιογενής, υποδηλώνοντας πως η χρωματίδα δημιουργείται από την ιεραρχική αναδίπλωση της χρωματίνης (Strukov et al., 2003). Τα S/MARS που έχουν μήκος πάνω από 1 Kb θεωρούνται ως «φράγματα» της χρωματινικής δομής και παίζουν ουσιώδη ρόλο στην πυρηνική δομή και λειτουργία. Πιστεύεται ότι στον πυρήνα ενός κυττάρου θηλαστικού οργανώνονται τα 25x10 6 νουκλεοσώματα σε 60000 χρωματινικές θηλιές των 70 Kb κατά μέσο όρο, μέσω των S/MARS ακολουθιών (Bode et al., 2000). Θεωρείται λοιπόν ότι οι θηλιές αυτές 48

αποτελούν τοπολογικά απομονωμένες μονάδες στις οποίες διαδικασίες όπως η αντιγραφή ή η συμπύκνωση της χρωματίνης μπορεί να ρυθμίζεται ανεξάρτητα. Κάποιες απ αυτές παραμένουν συμπυκνωμένες και επομένως ανενεργές ακόμα και σε ευχρωματινικές περιοχές ενώ άλλες ανοιχτές και ενεργές. Α.2.3. Πυρηνική μήτρα και αντιγραφή Μία από τις πρώτες in vivo ενδείξεις ότι η πυρηνική μήτρα διαδραματίζει βασικό ρόλο στην αντιγραφή ήρθε όταν οι Pardoll et al., (1980) έδειξαν πως το νεοσυντιθέμενο DNA κινείται από τη βάση των θηλιών προς την περιφέρεια τους. Άλλο ένα στοιχείο προς την κατεύθυνση αυτή ήρθε όταν οι Croft et al., (1999) έδειξαν ότι στο μεσοφασικό πυρήνα το ανθρώπινο χρωμόσωμα 19 καταλαμβάνει μια πιο εσωτερική θέση από το χρωμόσωμα 18 και συνδέεται εκτενέστερα με την πυρηνική μήτρα, ενώ είχε προηγουμένως δειχθεί από τους Dutrillaux et al., (1976) ότι το χρωμόσωμα 19 αντιγράφεται πριν το 18. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα το DNA είναι οργανωμένο σε 10 4 ρεπλικόνια τα οποία αντιγράφονται μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο στην S φάση. Για να επιτευχθεί αυτό το DNA παίρνει την μορφή θηλιών που προσκολλούνται στην πυρηνική μήτρα (Hozak et al., 1993,1994). Κάθε θηλιά αντιπροσωπεύει ένα ξεχωριστό ρεπλικόνιο με τα ORI του μέσα στη θηλιά και το τέλος του προσκολλημένο στο πυρηνικό ικρίωμα στο τέλος της θηλιάς. Στο τέλος της G 1 φάσης τα ORI συνδέονται με την πυρηνική μήτρα (Djeliova et al., 2001) μάλλον μέσω των ORC (Origin Recognition Complexes) (Ohta et al., 2003) και αποσυνδέονται μετά την έναρξη της αντιγραφής στην S φάση. Οι αλληλουχίες S/MARS έχουν απομονωθεί μαζί με το ORI. (Pemov et al., 1998). Συστάδες από αρκετά ρεπλικόνια αντιγράφονται μαζί στα «εργοστάσια» αντιγραφής (replication factories) που εντοπίζονται πάνω στον πυρηνικό σκελετό (Berezney et al., 2000). Τα «εργοστάσια» αντιγραφής προσκολλημένα στην μήτρα διατηρούν τη δραστικότητα τους μετά από πέψη με DNAse και εκχύλιση με ήπιες συνθήκες και δεν διαφέρουν μικροσκοπικά από αυτά των άθικτων κυττάρων (Radichev et al., 2005). Kαταλαμβάνουν συγκεκριμένα σημεία στον πυρήνα τα οποία είναι τα ίδια για συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA, για την ίδια περίοδο της S φάσης και συντηρούνται και στις μελλοντικές γενεές (Ma et al., 1998). Κατά τη διάρκεια αυτής 49

της διαδικασίας, το DNA από κάθε ρεπλικόνιο περνάει μέσα από αυτά τα «εργοστάσια» (Hozak et al., 1993,1994), τα οποία μετά τη λήξη της σύνθεσης DNA της συστάδας αποσυγκροτούνται και επανασυγκροτύνται κάπου αλλού για να αντιγραφεί η επόμενη συστάδα (Sadoni et al., 2004). Σχήμα A.19. Σχηματική αναπαράσταση της συγκρότησης του ORC ολοσυμπλόκου και της καθήλωσης του στην πυρηνική μήτρα. Το ORC 2-5 σύμπλοκο είναι δεσμευμένο στα ORI του DNA (πορτοκαλί κύκλος) καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Στο τέλος της G 1 φάσης δημιουργείται το ολοσύμπλοκο ORC 1-5 το οποίο προσκολλάται στην πυρηνική μήτρα (γκρι). Η αποσύνδεση του ORC 1 έπειτα από την έναρξη της αντιγραφής προκαλεί την επιστροφή του ORC 2-5 στην αρχική του κατάσταση. Δεν είναι ξεκάθαρο σε ποιο ORI παραμένει δεσμευμένο το ORC 2-5. Η νεοσυντιθέμενη χρωματίνη παραμένει για κάποια ώρα (10-20 min) προσκολλημένη στην μήτρα (Pospelov et al., 1982) ενώ οι μπερδεμένες θηλιές του DNA χωρίζονται 50

από τοποϊσομεράσες που βρίσκονται στην πυρηνική μήτρα στη βάση των θηλιών (Iarovaia et al., 2004). Η τοποϊσομεράση ΙΙ συνδέεται με τα S/MARS (Berrios et al., 1985) και θεωρείται συστατικό του πυρηνικού ικριώματος (Earnshaw and Heck, 1985). Επομένως το πυρηνικό ικρίωμα παίζει ένα διπλό ρόλο στη διαδικασία της αντιγραφής: από τη μία προσφέρει τη δομική στήριξη για τον μηχανισμό της αντιγραφής και από την άλλη φέρνει σε κατάλληλη θέση τους παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμό της. Α.2.4. Πυρηνική μήτρα και μεταγραφή Μετά από εκχύλιση με άλατα τα μεταγραφικά ενεργά γονίδια παραμένουν συνδεδεμένα με τον πυρηνικό σκελετό (Gerdes et al., 1994). Στην πυρηνική μήτρα έχει αναφερθεί ότι προσδένεται η υπερφωσφορυλιωμένη μορφή της μεγαλύτερης υπομονάδας της RNA πολυμεράσης II μαζί με μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι ER (Estrogen receptor), NMP-2 (Nuclear Matrix protein-2), YY1 (Ying-Yang 1), AML-1 (Acute Myeloid Leukemia protein-1), Sp1 (Specificity protein 1), GATA-1, NF-1, RFP (van Wijnen et al., 1993, Merriman et al., 1995, Sun et al., 1994, Dworetzky et al., 1992, Isomura et al., 1992, Vassetzky et al., 1993), με παράγοντες αναδιοργάνωσης της χρωματίνης όπως η HAT A (Histone Acetyl-Transferase A) (Hendzel et al., 1994) και η ΗDAC 1 (Histone DeACetylase 1) (Li et al., 1996) και με παράγοντες ματίσματος (Mortillaro et al., 1996). Μάλιστα παρασκευές πυρηνικών σκελετών από ανώριμα ερυθροκύτταρα όρνιθας, διατηρούν το 80% της δραστικότητας ακετυλοτρανσφεράσης και απακετυλάσης και τα ένζυμα αυτά καταλύουν την αντιστρεπτή ακετυλίωση της χρωματίνης που συνδέεται με την μήτρα (Hendzel et al., 1994). Επιπλέον, έχουν αποδοθεί ρόλοι στα S/MARS ως ενισχυτές (enhancers) ή μονωτές (insulators) της μεταγραφής. Μελετώντας την μεταγραφή του γονιδίου της ανοσοσφαιρίνης μ, οι Fernandez et al., (2001), έδειξαν πως ο συνδυασμός ενός κλασσικού ενισχυτή και των ακολουθιών S/MARS συνιστά ένα LCR (Locus Control Region), δηλαδή μία περιοχή που είναι ικανή per se να καθορίζει αν η χρωματίνη είναι ανοιχτή (ενεργή, υπερακετυλιωμένη) ή κλειστή (ανενεργή, ετεροχρωματινική, με την ιστόνη Η3 μεθυλιωμένη). Ακόμα, διαγονιδιακά 51

ποντίκια στα οποία έχει προστεθεί το γονίδιο της Ιgk, χωρίς όμως τις S/MARS ακολουθίες, εμφανίζουν χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης (Blasquez et al., 1989). Σχήμα A.20. Σχηματική αναπαράσταση μιας μεταγραφικά ενεργής θηλιάς. Tα δομικά S/MARS επιτρέπουν την δέσμευση της βάσης της θηλιάς στο πυρηνικό ικρίωμα. Σε γονίδιο της θηλιάς λαμβάνει χώρα αναδιάταξη της χρωματίνης ώστε να επιτευχθεί η αλληλεπίδραση DNA-πρωτεϊνών που έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη της μεταγραφής. Τελος, πειράματα προκειμένου να καθοριστούν οι ελάχιστες συνθήκες που απαιτούνται για να μπορέσει ένας πλασμιδιακός φορέας να πολλαπλασιαστεί εξωχρωμοσωμικά σε κύτταρα θηλαστικών, έδειξαν πως τοποθέτηση αλληλουχιών S/MARS, σε γειτονία με μία ενεργά μεταγραφική μονάδα, οδηγούν σε πολλαπλά αντίγραφα του φορέα, που συνδέονται μάλιστα με το πυρηνικό ικρίωμα μέσω αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη SAF-A (Jenke et al., 2004). Α.2.5. Πυρηνική μήτρα και μάτισμα Σε παρασκευές πυρηνικής μήτρας έχουν βρεθεί πρώιμα και ώριμα mrna (Mariman et al., 1982) καθώς και παράγοντες ματίσματος (Blencowe et al., 1994). Τα παρασκευάσματα αυτά πυρηνικής μήτρας έχουν την ικανότητα να αποκόπτουν ιντρόνια in situ εάν τους προστεθεί ΑΤΡ (Blencowe et al., 1998). 52

Σχήμα A.21. Μοντέλο που φανερώνει τη λειτουργική και χωρική σχέση μεταξύ των υποπυρηνικών εστιών με τελικό αποτέλεσμα τη σύνθεση ώριμων μορίων RNA. H χρωματίνη περνάει από την κλειστή στην ανοιχτή της μορφή μέσω των SWI/SNF συμπλόκων. Αυτό το άνοιγμα ευνοεί τη σύνδεση στο DNA παραγόντων μεταγραφής TF s και των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών (SHR, Steroid Hormone Receptor), οι οποίοι στρατολογούν τις ακετυλο-τρανσφεράσες (HAT) για παραπέρα αναδιάταξη της χρωματίνης. Στη συνέχεια επιστρατεύεται και η RNA πολυμεράση II με αποτέλεσμα τη σύνθεση πρώιμου RNA. H δημιουργία ώριμου RNA λαμβάνει χώρα σε εστίες πλούσιες στην πρωτεΐνη SC35. Α.2.6. Σήμα εντόπισης στην πυρηνική μήτρα (NMTS, Nuclear Matrix Targeting Signal) Aλληλουχίες υπεύθυνες για την πρόσδεση στην πυρηνική μήτρα έχουν εντοπιστεί σε διάφορες πρωτεΐνες όπως υποδοχείς στεροειδών (Eggert et al., 1997, Oesterreich et al., 2000a), παράγοντες μεταγραφής, ιικές πρωτεΐνες και ορισμένες κινάσες. Δεν έχει εντοπιστεί συγκεκριμένη αμινοξική ακολουθία που να καθηλώνει μία πρωτεΐνη στον πυρηνικό σκελετό. Διαφορετικά NMTS συνδέονται σε 53

διαφορετικές πρωτεΐνες-υποδοχείς καθώς και σε διαφορετικές περιοχές του πυρηνικού σκελετού. Τα μεγέθη των NMTS διαφέρουν από 28 αμινοξέα (Lhx3) μέχρι σχεδόν ολόκληρη την πρωτεΐνη (ZNF74). Επιπλέον, έχει βρεθεί πως τα NMTS άλλοτε συμπίπτουν με τα NLS (Nuclear Localization Signals) (κινάση DYRK1), άλλοτε με την περιοχή δέσμευσης στο DNA (υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών) και άλλοτε είναι εντελώς διαφορετικά (πρωτεΐνη AML1). Η δέσμευση στον πυρηνικό σκελετό μπορεί να είναι ρυθμιζόμενη και αντιστρεπτή. Έτσι, οι υποδοχείς των στεροειδών απαιτούν την παρουσία της αντίστοιχης ορμόνης (Barrack & Coffey, 1980) ενώ η ισχύς της δέσμευσης του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών εξαρτάται από την απουσία ή την παρουσία ΑΤΡ (Tang & DeFranco, 1996). Η κινάση CKII δεσμεύεται στη τoποισομεράση ΙΙ και στις RNA πολυμεράσες του πυρηνικού ικριώματος ισχυρότερα παρουσία ανδρογόνων καθώς και παραγόντων ανάπτυξης (Guo et al., 1999). Τέλος, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη Rb δεσμεύεται στην πυρηνική μήτρα στην G 1 φάση όπου βρίσκεται στην υποφωσφορυλιωμένη της μορφή και όχι στην S φάση (Mancini et al., 1994). Σε ασθένειες όπως η οξεία μυελογενής λευχαιμία όπου το NMTS της πρωτεΐνης AML1 έχει μεταλλαχθεί, η κατανομή της πάνω στην πυρηνική μήτρα μεταβάλλεται σημαντικά (McNeil et al., 1999). A.3. Scaffold Attachement Factor B (SAFB) (Παράγοντας πρόσδεσης ικριώματος) A.3.1. Δομή των SAFB H πρωτεΐνη SAFB1 αποτελείται από δύο βασικές περιοχές τις οποίες ενώνει μία όξινη περιοχή. Το τελικό ισοηλεκτρικό της σημείο είναι 8,8. Έχει μορφή κυρίως α-έλικας αλλά περιέχει και κάποια β-ελάσματα ενώ το C-τελικό άκρο έχει μία ευέλικτη δομή. Επίσης περιέχει δύο σήματα πυρηνικής εντόπισης (NLS). Ξεκινώντας από το Ν-τελικό άκρο η πρωτεΐνη περιέχει μια περιοχή δέσμευσης DNA (SAF-Box, αμινοξέα 35-67, μια περιοχή δέσμευσης RNA (RNA Recognition Motif, αμινοξέα 406-484), μία περιοχή πλούσια σε αργινίνες και γλουταμιvικό οξύ (RE περιοχή, 54

αμινοξέα 625-705) και μία περιοχή πλούσια σε γλυκίνες κοντά στο C-τελικό άκρο (αμινοξέα 785-899). Το τμήμα μεταξύ των αμινοξέων 599-614 περιλαμβάνει το σήμα πυρηνικής εντόπισης της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη SAFB2 παρουσιάζει 74% αμινοξική ομοιότητα με την SAFB1 και περιέχει τις ίδιες λειτουργικές περιοχές με την SAFB1 εκτός από ένα σήμα εξόδου από τον πυρήνα που υπάρχει στο μόριο της. Κουτί SAF RRM NLS RE G % Ομοιότητα Λειτουργική περιοχή με μεγάλη αμινοξική ομοιότητα Περιοχή με μεγάλη αμινοξική ομοιότητα (με άγνωστη λειτουργία) Σχήμα A.22. Σχηματική αναπαράσταση της δομής των πρωτεϊνών SAF-B1 και SAF-B2. Οι δύο πρωτεΐνες μοιράζονται τις ίδιες περιοχές (ένα SAF-Box, ένα RRΜ και τις περιοχές πλούσιες σε RE και G). Οι περιοχές με γνωστή λειτουργικότητα παρουσιάζονται με ανοιχτό γκρι χρώμα ενώ αυτές με άγνωστη λειτουργικότητα με σκούρο γκρι. Οι αριθμοί μεταξύ των αναπαραστάσεων των δύο πρωτεϊνών συμβολίζουν την ομοιότητα σε επίπεδο αμινοξέων των αντίστοιχων περιοχών, ενώ οι αριθμοί κάτω από τον SAF-B2 φανερώνουν την θέση των συγκεκριμένων περιοχών στο μόριο του. A.3.2. Εντόπιση των SAFB1 και SAFB2 Τα γονίδια των SAFB1 και 2 βρίσκονται στο χρωμόσωμα 19p13 με αντίθετη κατεύθυνση, υπό τον έλεγχο ενός κοινού προαγωγού, πλούσιου σε περιοχές δέσμευσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Γονίδια των SAFB1 και 2 βρέθηκαν και σε άλλους οργανισμούς όπως στο ποντίκι, στο γουρούνι και στο ταύρο, ενώ παρόμοια γονίδια έχουν βρεθεί στη Drosophila και στο νηματοσκώληκα C. Elegans. Δεν έχουν βρεθεί στη ζύμη, στα φυτά, στα πρωτόζωα ή στα βακτήρια. Οι πρωτεΐνες SAFB1 και 2 απαντιούνται σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές σειρές και κυρίως σε αυτές του μαστού. Σε κανονικούς ιστούς έχουν ανιχνευθεί κυρίως στην καρδιά, τον εγκέφαλο, τους πνεύμονες, τον πλακούντα, το συκώτι, το σκελετικό μύ, τα νεφρά και 55

το πάγκρεας. Γενικά υπάρχει συνεντοπισμός των δύο πρωτεϊνών που ίσως να οφείλεται στην ύπαρξη κοινού προαγωγού. Χρωμόσωμα 19p13 Εξώνιο 1 Εξώνιο 2 Κεντρομερές Τελομερές Εξώνιο 2 Εξώνιο 1 Σχήμα A.23. Χρωμοσωμική διάταξη των SAFB1 και SAFB2 στο 19p13. Τα πρώτα εξόνια των SAFB1 και SAFB2 χωρίζονται από μία περιοχή 490 bp που λειτουργεί ως δικατευθυντήριος προαγωγός. Η μεταγραφή του SAF-B1 λαμβάνει χώρα με κατεύθυνση από το τελομερές προς το κεντομερές ενώ του SAF-B2 κατά την άλλη κατεύθυνση. Η πρωτεΐνη SAFB1 όπως υποδηλώνει και το όνομα της βρίσκεται άφθονη σε παρασκευές πυρηνικής μήτρας. Την βρίσκουμε κυρίως σε περιχρωματινικά νημάτια (PF s, Chiodi et al., 2000) όπου συνυπάρχει με τον παράγοντα ματίσματος SC35, SR πρωτεΐνες, την RNA πολυμεράση ΙΙ, καθώς και με διάφορες ισομορφές της πρωτεΐνης hnrnp D, με τις οποίες και αλληλεπιδρά (Nayler et al., 1998, Arao et al., 2000). Μετά από heat shock συσσωρεύεται σε σωμάτια τα οποία ονομάζονται σωμάτια HAP και τα οποία περιέχουν κάποιο RNA (όχι όμως polya + RNA), την πρωτεΐνη hnrnp M (Chiodi et al., 2000), τον παράγοντα ματίσματος Sam68 (Hatrmann et al., 1999) και τον παράγοντα HSF1 (Heat Shock Factor 1) (Weighardt et al., 1999). Ενδιαφέρον είναι ότι στα σωμάτια αυτά δεν έχει βρεθεί καμιά από τις πρωτεΐνες με τις οποίες συνεντοπιζόταν η πρωτεΐνη SAFB1 προηγουμένως στα PF s. Σε ένα ενδιάμεσο στάδιο εντοπίζεται στον πυρηνικό φάκελο. Αυτό ενδέχεται να συμβαίνει γιατί o SAFB1 συνοδεύει τα mrna μέχρι τους πυρηνικούς πόρους, οι οποίοι κλείνουν έπειτα από heat shock με συνέπεια να συγκεντρώνεται εκεί πριν αποθηκευτεί στα σωμάτια HAP (Weighardt et al., 1999). Η εμφάνιση των σωματίων αυτών έχει συσχετιστεί και με τον καρκινικό μετασχηματισμό των κυττάρων. H συνολική ποσότητα του SAFB1 μετά το heat shock παραμένει σταθερή (Weighardt et al., 1999). 56

Ο SAFB2 συνεντοπίζεται με τον SAFB1 στον πυρήνα, ενώ στο κυτταρόπλασμα συνεντοπίζεται μερικώς με την πρωτεΐνη vinexin β σε προσφυτικές εστίες ή σε κάποια σημεία της περιφέρειας του κυττάρου (Townson et al., 2003). A.3.3. Αλληλεπιδράσεις των SAFB1 και SAFB2 Η πρωτεΐνη SAFB1 κλωνοποιήθηκε από HeLa κύτταρα, με βάση την ικανότητα της να δεσμεύεται στα S/MARS (Renz & Fackelmayer, 1996). Αργότερα, κλωνοποιήθηκε και από ένα δεύτερο εργαστήριο από MCF-7 καρκινικά κύτταρα μαστού με βάση την ικανότητα της να δεσμεύεται στον προαγωγό της πρωτεΐνης hsp27 (heat shock protein 27), o οποίος ίσως να συνιστά και αυτός ένα S/MAR (Οesterreich et al., 1997). Μέσω των RE διπεπτιδίων και της C-τελικής περιοχής της αλληλεπιδρά με τα RS διπεπτίδια των παραγόντων ματίσματος ASF/SF-2, SRp30c, U2AF35 και SRp55 (Nayler et al., 1998), SRrp86 (Li et al., 2003) και Sam68 (Townson et al., 2004). Παράλληλα αλληλεπιδρά και με άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με το RNA όπως οι hnrnp A1, U, K, I, C1/C2 και Α2 κυρίως μέσω των RE διπεπτιδίων που διαθέτει (Weighardt et al., 1999), καθώς και με κάποιες ισομορφές της hnrnp D (Arao et al., 2000). Με την μέθοδο των δύο υβριδίων βρέθηκε ότι η C-τελική περιοχή της αλληλεπιδρά, σε πυρήνες LLC-PK1 καρκινικών κυττάρων μαστού, με την πρωτεΐνη ΖΟ-2, μία πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια MAGUK (Membrane Associated Guanylate Kinase Homologue) (Traweger et al., 2002). Το περίεργο είναι ότι η πρωτεΐνη ΖΟ-2 συμμετέχει στη δημιουργία ενδοθηλιακών και επιθηλιακών διακυτταρικών συνάψεων, και είναι παντελώς άγνωστος ο ρόλος της στον πυρήνα. Η πρωτεΐνη SAFB1 έχει ακόμα την ικανότητα να δεσμεύεται σε παράγοντες του γενικού μεταγραφικού συμπλόκου όπως οι htra2-beta1 και TAF II 68 καθώς και στο C-τελικό άκρο της RNA πολυμεράσης ΙΙ (Nayler et al., 1998), Σε ορισμένα είδη κυττάρων συγκατακρημνίζεται με την τοποισομεράση ΙΙ (Adachi et al., 1989), την ιστόνη H1 (Izaurralde et al., 1989) και τον παράγοντα SAFA (Fackelmayer et al., 1994). Πρόσφατα βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά και με την DBD (DNA Binding Domain) και την hinge περιοχή του πυρηνικού υποδοχέα ER (Estrogen Receptor) μέσω της κεντρικής περιοχής της (αμινοξέα 426-600) και η δέσμευση αυτή ενισχύεται in vivo παρουσία του αντιοιστρογόνου Tamoxifen (Townson et al., 2004). 57

Η πρωτεΐνη SAFB2 δημιουργεί σύμπλοκο με την SΑF-B1 μέσω των C- τελικών τους περιοχών, ενώ αλληλεπιδρά επιλεκτικά με τις πρωτεΐνες vinexin α και β οι οποίες εμπλέκονται στην οργάνωση του κυτταροσκελετού (Townson et al., 2003). A.3.4. Δραστικότητα των SAFB1 και SAFB2 Έκφραση μικρών ποσοτήτων SAFB1 έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας του υποδοχέα των οιστρογόνων (ER) παρουσία Tamoxifen (Oesterreich et al., 2000a). Υπερέκφραση όμως του SAFB1 μειώνει την δραστικότητα του ER, τόσο όταν έχει δεσμευμένo τον φυσιολογικό του συνδέτη, την οιστραδιόλη, αλλά κυρίως όταν είναι δεσμευμένος με έναν ανταγωνιστή όπως το Tamoxifen (Oesterreich et al., 2000a). Αν και αλληλεπιδρά και με την DBD (DNA Binding Domain) περιοχή του ER, η ανασταλτική της δράση δεν έγκειται σε παρεμπόδιση δέσμευσης του ΕR στα ERE (Estrogen Response element) (Oesterreich et al., 2000a). Βρέθηκε πως ο αναστολέας των απακετυλασών (HDAC) Trichostatin, μειώνει την αναστολή της μεταγραφής που επάγει ο SAFB1 (Oesterreich et al., 2000b). Στη συνέχεια, πειράματα με διαφορετικούς υποδοχείς και αναστολείς της δράσης των HDAC έδειξαν πως ο SAFB1 στρατολογεί διαφορετικούς συγκαταστολείς της μεταγραφής, ανάλογα με το κυτταρικό περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται (Debril et al., 2005). Στους συγκαταστολείς αυτούς συγκαταλέγονται η CHD1 (ChromoDomain protein 1), μια πρωτεΐνη που δεσμεύεται σε S/MARS και συνανοσοκατακρημνίζεται μαζί με δραστικότητα απακετυλάσης, (Tai et al., 2003) και η πρωτεΐνη N-CoR (Nuclear receptor-corepressor, Jiang et al., 2005). H αναστολή οφείλεται κατά ένα μεγάλο μέρος και στην αλληλεπίδραση της SAFB1 με τον γενικό μεταγραφικό παράγοντα TAF II 68 (Townson et al., 2004) και λαμβάνει χώρα μόνο παρουσία S/MARS (Nayler et al., 1998). Η ανασταλτική ικανότητα της πρωτεΐνης SAFB1 εντοπίζεται μάλλον στο C-τελικό άκρο της δεδομένου ότι απαλοιφή αυτού του τμήματος οδηγεί σε αύξηση της μεταγραφικής ικανότητας του ΕR (Townson et al., 2004). Εκτός από τον ER, αναστέλλει την μεταγραφή που επάγεται από ένα μεγάλο αριθμό πυρηνικών υποδοχέων, όπως οι PR (Progesterone Receptor) (Αrao et al., 2000), PPARα, PPARβ και PPARγ (Peroxisome Proliferetor Activated Receptor), FXR α (Farsenoid X Receptor), ROR α1 (Retinoic acid receptor-related Orphan 58

Receptor), VDR (Vitamin D Receptor), SF-1 (Steroidogenic factor), LHR-1 (Luteinizing Hormone Receptor) ανεξάρτητα από την παρουσία συνδέτη (Debril et al., 2005). Αναστέλλει ακόμα την μεταγραφή του ογκογονιδίου c-jun (Debril et al., 2005), καθώς και του γονιδίου της πρωτεΐνης hsp27 (Oesterreich et al., 1997). γεγονός που υποδηλώνει πως δρα ως γενικός συγκαταστολέας της μεταγραφής. Μία άλλη ενδιαφέρουσα αλληλεπίδραση είναι αυτή με την πρωτεΐνη ΒΙCP22 του ιού BHV-1 (Bovine HerpesVirus-1), όπου και σ αυτήν την περίπτωση δρα ως αναστολέας της μεταγραφής, σε ιικούς προαγωγούς όμως στη συγκεκριμένη περίπτωση (Saydam et al., 2005). H κινάση CLK2 φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη SAF-B1 ρυθμίζοντας πιθανά έτσι τη δραστικότητά της (Nayler et al., 1998). Σχήμα A.24. Περίληψη των διαδικασιών στις οποίες εμπλέκονται οι πρωτεΐνες SAFB1 και SAFB2 και οι πιθανές αλληλεπιδράσεις τους. Οι διαδικασίες και οι αλληλεπιδράσεις που δείχνονται σχηματικά επεξηγούνται αναλυτικά στο κείμενο. 59

Η πρωτεΐνη SAFB2 αναστέλλει και αυτή τη μεταγραφή μέσω του ER και οι δύο πρωτεΐνες μαζί εμφανίζουν συνεργιστική ικανότητα αναστολής. Τέλος η υπερέκφραση των SAFB1 και SAFB2 επηρεάζει την επιλογή της θέσης ματίσματος (Nayler et al., 1998). Πειράματα απαλοιφής του γονιδίου του SAFB1 σε ποντίκια είχαν ως αποτέλεσμα αυξημένους θανάτους πριν και μετά τη γέννηση, νανισμό και ελάττωση των σεξουαλικών και αναπαραγωγικών λειτουργιών των πειραματόζωων. Αυτές οι ανωμαλίες ίσως να οφείλονται σε αλλαγές που παρατηρούνται στα επίπεδα των φυλετικών ορμονών και του IGF1 (Insulin Growth Factor 1) ή/και στη διαφορετική αντίδραση στις ορμόνες που προκύπτει από την απώλεια αναστολής της μεταγραφής των υποδοχέων των ορμονών (Ivanova et al., 2005). A.4. Ετεροχρωματίνη Ο όρος ετεροχρωματίνη χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1928 από τον βοτανολόγο Heitz προκειμένου να περιγράψει τις χρωμοσωμικές εκείνες περιοχές που διατηρούνται συμπυκνωμένες κατά τη μετάβαση του κυττάρου από την μίτωση στην μεσόφαση, σε αντίθεση με το υπόλοιπο χρωμοσωμικό υλικό το οποίο αποσυμπυκνώνεται και χαρακτηρίζεται ως ευχρωματινικό (Heitz et al.,1928). Η ετεροχρωματίνη διακρίνεται σε δύο κατηγορίες, την συστατική και περιστασιακή ετεροχρωματίνη. Η περιστασιακή ετεροχρωματίνη αναφέρεται σε γονίδια ή χρωμοσωμικές περιοχές που σε κάποια φάση της ζωής του κυττάρου είναι μεταγραφικά ενεργά και στην συνέχεια απενεργοποιούνται. Αντίθετα, ο όρος συστατική ετεροχρωματίνη αφορά τις χρωμοσωμικές περιοχές που σε όλους τους κυτταρικούς τύπους ενός οργανισμού είναι μεταγραφικά ανενεργές (Elgin and Grewal, 2003). Παράδειγμα περιστασιακής ετεροχρωματίνης αποτελεί στα θηλαστικά το ανενεργό Χ χρωμόσωμα των θηλυκών ατόμων, το οποίο απενεργοποιείται στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης, ώστε να υπάρχει η ίδια δόση γενετικού υλικού ανάμεσα στα δύο φύλα. Από την άλλη πλευρά, η συστατική ετεροχρωματίνη απαντάται κυρίως στα κεντρομερή και τα τελομερή και αποτελείται από επαναλαμβανόμενες ακολουθίες DNA τοποθετημένες στη σειρά (Elgin and Grewal, 2003). Πολλές φορές μεταξύ των επαναλήψεων βρίσκονται διάσπαρτα τοποθετημένα 60

μεταθετά στοιχεία. Η περικεντρομερική ετεροχρωματίνη ποικίλλει σε μέγεθος ανάμεσα στους διάφορους οργανισμούς και κυμαίνεται από λίγα kb στην ζύμη μέχρι 100-400 αλληλοδιάδοχες επαναλήψεις νουκλεοτιδίων στα θηλαστικά, φυτά και την Drosophila, οι οποίες φτάνουν σε μέγεθος τα αρκετά Mb (Choo, 2001, Pidoux et al., 2004). Η συστατική ετεροχρωματίνη καταλαμβάνει ένα μεγάλο ποσοστό της χρωματίνης και τα κύρια χαρακτηριστικά της είναι τα μειωμένα επίπεδα μειωτικού ανασυνδυασμού, η μικρή πυκνότητα σε γονίδια, ο εμπλουτισμός σε επαναλαμβανόμενο DNA και η αργή αντιγραφή στην S φάση. Επίσης, η συστατική ετεροχρωματίνη είναι μεταγραφικά ανενεργή σε όλη τη διάρκεια της ζωής του κυττάρου και καταστέλλει την μεταγραφή ευχρωματινικού γονιδίου που τοποθετείται κοντά της, ένα φαινόμενο που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στην Drosophila και ονομάστηκε αποτέλεσμα θέσης (Position Effect Variegation-PEV). Χαρακτηριστικό είναι ότι οι επαναλήψεις του DNA της συστατικής ετεροχρωματίνης δεν είναι εξελικτικά συντηρημένες και παρουσιάζουν μικρές ομοιότητες ανάμεσα στα διάφορα είδη (Richards et al., 2002). A.4.1. Σύσταση ετεροχρωματίνης Η βασική δομική μονάδα της ετεροχρωματίνης, όπως και γενικότερα της χρωματίνης, είναι τα νουκλεοσώματα τα οποία σε φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μοιάζουν με χάντρες σε κομπολόι. Τα νουκλεοσώματα αποτελούνται από ένα ιστονικό πυρήνα γύρω από τον οποίο περιελίσσεται περίπου 2 φορές DNA, μήκους 145-147 bp. Ο ιστονικός πυρήνας δομείται από τις ιστόνες Η3, Η4, Η2Α και Η2Β, όπου η κάθε μία αντιπροσωπεύεται από δύο αντίγραφα. Το κάθε νουκλεόσωμα διαχωρίζεται από το επόμενο με το συνδετικό DNA στο οποίο βρίσκεται προσκολλημένη η ιστόνη Η1. Το μήκος του συνδετικού DNA διαφέρει μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών τύπων και κυμαίνεται από 10 έως 90 bp (Luger et al., 1997). Οι ιστόνες αποτελούνται από ένα σφαιρικό καρβοξυτελικό τμήμα το οποίο συμμετέχει στον σχηματισμό του πυρήνα του νουκλεοσώματος και από ένα εύκαμπτο αμινοτελικό άκρο το οποίο αποτελεί περίπου το 25-30% του μορίου της ιστόνης και προβάλει έξω από το νουκλεόσωμα. Το αμινοτελικό άκρο υφίσταται διάφορες 61

μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, ουβικιτινιλίωση και ADP-ριβοσυλίωση (Peterson et al., 2003). Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι ο συνδυασμός των μεταμεταφραστικών αυτών τροποποιήσεων των ιστονικών ουρών διαμορφώνει έναν κώδικα (histone code) ο οποίος ρυθμίζει την μεταγραφική κατάσταση της χρωματίνης. Η δημιουργία του κώδικα στηρίζεται σε εξειδικευμένα ένζυμα που τροποποιούν τις ιστόνες, ενώ στη συνέχεια πυρηνικοί μη ιστονικοί παράγοντες αναγνωρίζουν τις συγκεκριμένες τροποποιήσεις, συνδέονται στις τροποποιημένες ιστόνες και προκαλούν κατάλληλη κάθε φορά αναδιάταξη της χρωματίνης (Cruz et al., 2005). Σχήμα Α.25. Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις ιστονών. Το αμινο-τελικό τμήμα των ιστονών υφίσταται διάφορες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως ακετυλίωση, μεθυλίωση, φωσφορυλίωση, ουβικιτινιλίωση. Ενώ οι σερίνες και οι θρεονίνες μπορούν να δεχτούν μόνο φωσφορικές ομάδες (κίτρινο χρώμα), οι λυσίνες και οι αργινίνες έχουν πολλαπλές επιλογές μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων. Για παράδειγμα, οι λυσίνες μπορούν να ακετυλιωθούν (κόκκινο χρώμα), να μονοουβικιτινιλιωθούν (μπλε χρώμα), να μονο-, δι- και τριμεθυλιωθούν (πράσινο χρώμα). Επίσης, οι αργινίνες μπορούν να μονο- ή διμεθυλιωθούν (πράσινο χρώμα). Έχει βρεθεί ότι η συστατική ετεροχρωματίνη και ιδιαίτερα η ετεροχρωματίνη γύρω από την περιοχή των κεντρομερών, αποτελείται από νουκλεοσώματα τα οποία διακρίνονται από μεγάλο ποσοστό μεθυλίωσης του DNA, μεγάλο ποσοστό 62

μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 στην λυσίνη 9 (Κ9), μικρό ποσοστό ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4 και μικρό ποσοστό μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 στην λυσίνη 4 (Κ4) (Grewal et al., 2003). Σε γενετικές μελέτες στην Drosophila προκειμένου να βρεθούν γονίδια τα οποία καταστέλλουν το φαινόμενο μεταγραφικής καταστολής λόγω γειτνίασης με την συστατική ετεροχρωματίνη (Position Effect Variegation- PEV), βρέθηκε ότι για το σχηματισμό ετεροχρωματινικών περιοχών είναι απαραίτητα τα γονίδια τα οποία κωδικοποιούν την ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) και την μεθυλτρανσφεράση Su(var)3-9, η οποία μεθυλιώνει την λυσίνη 9 στην ιστόνη Η3 (Reuter and Spierer, 1992). Επίσης, πρόσφατα διαπιστώθηκε ο απροσδόκητος ρόλος μικρών μορίων RNA που προκύπτουν μέσω του μηχανισμού της RNA παρεμβολής (RNA interference, RNAi) στην δημιουργία ετεροχρωματινικών περιοχών (Stevenson et al., 2003). A.4.2. Ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) Η ΗΡ1 είναι ένα μη ιστονικό συστατικό της χρωματίνης, που βρίσκεται κατά προτίμηση σε ετεροχρωματινικές περιοχές και σχετίζεται με την μεταγραφική καταστολή. Είναι μια σχετικά μικρή πρωτεΐνη, 200 περίπου αμινοξέων και έχει μοριακό μέγεθος περίπου 25 kda. Αποτελείται από μια χρωμοπεριοχή (chromodomain, CD) στο αμινοτελικό άκρο και περιοχή χρωμοσκιάς (chromoshadow, CSD) στο καρβοξυτελικό της άκρο. Οι δύο αυτές περιοχές διαχωρίζονται από ένα συνδετικό τμήμα το οποίο είναι εύκαμπτο και εκτεθειμένο. Οι CD και CDS περιοχές είναι εξαιρετικά συντηρημένες, ενώ η συνδετική περιοχή είναι το λιγότερο συντηρημένο τμήμα (Singh and Georgatos, 2003). Οι CD και CDS περιοχές έχουν κοινή δομή και έχει βρεθεί ότι έχουν σφαιρικό σχήμα με μέση διάμετρο 30 Α. Αποτελούνται από 3 β-ελάσματα τα οποία έρχονται κοντά σε μία α- έλικα (α2) στην περίπτωση της CD περιοχής ή δύο α-έλικες (α1, α2) στην περίπτωση της CDS περιοχής. Η CDS περιοχή έχει την ικανότητα να σχηματίζει διμερή σε αντίθεση με την CD. Υπεύθυνη για τον διμερισμό είναι η α2 έλικα της CDS περιοχής η οποία αλληλεπιδρά με την α2 έλικα μιας γειτονικής CDS περιοχής σχηματίζοντας γωνία 45º (Cowieson et al., 2002, Ball et al., 1997). Ομόλογες πρωτεΐνες της HP1 εμφανίζονται από την ζύμη έως τον άνθρωπο. Στα θηλαστικά έχουν αναγνωριστεί τρεις HP1 πρωτεΐνες, οι οποίες κωδικοποιούνται 63

από διαφορετικά γονίδια και στον άνθρωπο είναι οι HP1α, HP1β και HP1γ (Jones et al., 2000). Οι HP1 πρωτεΐνες δείχνουν κυρίως περικεντρομερική υποκυτταρική εντόπιση, αν και η HP1β και κυρίως η HP1γ εντοπίζονται και σε ευχρωματινικές περιοχές (Minc et al., 2000). Η ΗΡ1 έχει βρεθεί ότι μπορεί να καταστέλλει παροδικά την μεταγραφή ευχρωματινικών ενδογενών γονιδίων και ίσως έτσι δικαιολογείται η εντόπιση της ΗΡ1 σε περιοχές της ευχρωματίνης (Nielsen et al., 2001). Επίσης, μια πρόσφατη έρευνα αναφέρει μια απροσδόκητη εντόπιση των ΗΡ1 πρωτεϊνών σε γονίδια τα οποία ενεργοποιούνται μεταγραφικά στα πολυτενικά χρωμοσώματα της Drosophila (Piacentini et al., 2003). Σχήμα Α.26. Κρυσταλλική δομή της CD περιοχής της HP1β. Η CD περιοχή αποτελείται από τρία β-ελάσματα τα οποία έρχονται κοντά με μία α2 έλικα. Παρόμοια δομή εμφανίζει και η CDS περιοχή στο καρβοξυ-τελικό άκρο της HP1 με την διαφορά ότι η CDS περιοχή περιλαμβάνει δύο έλικες (α1 και α2) (Cowieson et al., 2000). A.5. Απόπτωση Ως απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ή ενεργός κυτταρικός θάνατος θεωρείται η βασική βιολογική διεργασία, που είναι απαραίτητη για την απομάκρυνση των πλεοναζόντων κυττάρων κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, για τη διατήρηση της ομοιόστασης στον ώριμο οργανισμό, την ωρίμανση των κυτταρικών πληθυσμών του αιμοποιητικού και του ανοσοποιητικού συστήματος και 64

την καταβολή της κακοήθους εξαλλαγής. Λειτουργεί ως προέχουσα δύναμη για τη διαμόρφωση του αναπτυσσόμενου αριθμού κυττάρων και ως αμυντικός μηχανισμός για την απομάκρυνση ανεπιθύμητων και δυνητικά επικίνδυνων κυττάρων όπως τα αυτοαντιδρώντα λεμφοκύτταρα, κύτταρα τα οποία έχουν μολυνθεί από ιούς. Η απόπτωση εμπλέκεται σε διάφορες καταστάσεις οι οποίες απεικονίζονται συνοπτικά στο σχήμα Α.27. Σχήμα A.27. Καταστάσεις που σχετίζονται με την απόπτωση A.5.1. Η διαδικασία της απόπτωσης Πολλά διαφορετικά μηνύματα, που μπορεί να προέρχονται είτε από μέσα είτε από έξω από το κύτταρο, φαίνεται να επηρεάζουν την απόφαση μεταξύ ζωής και θανάτου. Αυτά περιλαμβάνουν κυτταρική βλάβη προκαλούμενη από ιονίζουσα ακτινοβολία ή ιογενή μόλυνση, εξωκυττάριους παράγοντες επιβίωσης, κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και ορμόνες. Αυτά τα διαφορετικά μηνύματα μπορεί να λειτουργούν είτε καταστέλλοντας είτε προάγοντας την ενεργοποίηση του προγράμματος θανάτου, ενώ το ίδιο μήνυμα μπορεί να έχει αντίθετα αποτελέσματα σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους (Newell et al., 1990). Εκτός από τα ευεργετικά αποτελέσματα του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, η ακατάλληλη ενεργοποίηση της απόπτωσης μπορεί να προκαλέσει ή να συμβάλλει σε ποικιλία ασθενειών, περιλαμβανομένων του AIDS, νευροεκφυλιστικών νοσημάτων και ισχαιμικού επεισοδίου (Uyama et al., 1992). Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος μπορεί να διακριθεί από τον νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος είναι ένας παθολογικός τύπος κυτταρικού θανάτου που προκύπτει από οξεία κυτταρική βλάβη η οποία 65

χαρακτηρίζεται από οξεία κυτταρική διόγκωση και λύση. Σε αντίθεση, ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος χαρακτηρίζεται από ελεγχόμενη πέψη του ίδιου του κυττάρου. Τα κύτταρα φαίνεται ότι αρχίζουν τον αποπτωτικό τους θάνατο με την ενεργοποίηση ενδογενών πρωτεασών. Αυτό οδηγεί σε ρήξη του κυτταροσκελετού, κυτταρική συρρίκνωση και κυτταρική ρήξη. Η απόπτωση ακόμη περιλαμβάνει χαρακτηριστικές αλλαγές μέσα στον πυρήνα: ο πυρήνας υφίσταται πύκνωση καθώς οι ενδονουκλεάσες ενεργοποιούνται και ξεκινούν τον κατακερματισμό του πυρηνικού DNA. Σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, το DNA διασπάται σε κλάσματα DNA του μεγέθους των ολιγονουκλεοσωματίων, ενώ σε άλλους κυτταρικούς τύπους παράγονται μεγαλύτερα κλάσματα (Oppenheim, 1991, Stadelmann and Lassmann 2000, Hacker, 2000). Η απόπτωση ακόμη χαρακτηρίζεται από απώλεια της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι τα μιτοχόνδρια, μπορεί να έχουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της απόπτωσης, όμως δεδομένα που να στηρίζουν αυτή την υπόθεση δεν είναι ακόμη διαθέσιμα. Κυτταροπλασματική και Πυρηνική συμπύκνωση η Τεμαχισμός Φαγοκυττάρωση Μακροφάγο Σχήμα A.28. Σχηματική απεικόνιση των σταδίων της απόπτωσης 66

Το αποπτωτικό κύτταρο διατηρεί την ακεραιότητα της πλασματικής μεμβράνης. Όμως, μεταβολές στην πλασματική μεμβράνη των αποπτωτικών κυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση με γειτονικά φαγοκύτταρα που τα εγκολπώνουν και ολοκληρώνουν την διαδικασία κατάτμησης. Τα κύτταρα που δεν φαγοκυτταρώνονται αμέσως διασπώνται σε μικρότερα μορφώματα περιβαλλόμενα από μεμβράνη που καλούνται αποπτωτικά σώματα. Σε αντίθεση, ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος σχετίζεται με πρώιμη απώλεια της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης που οδηγεί σε διαρροή του κυτταροπλασματικού περιεχομένου (Oppenheim, 1991, Hacker, 2000). Στους περισσότερους ιστούς η κυτταρική επιβίωση φαίνεται να εξαρτάται από τη σταθερή παροχή μηνυμάτων επιβίωσης που προέρχονται από γειτονικά κύτταρα και το εξωκυττάριο στρώμα. Τα κύτταρα από τα περισσότερα όργανα θα υποστούν απόπτωση εάν καλλιεργηθούν μεμονωμένα με απουσία εξωγενών παραγόντων επιβίωσης. A.5.2. Μοριακοί μηχανισμοί απόπτωσης Τα γονίδια που ελέγχουν την απόπτωση έχουν προσδιοριστεί στο νηματοειδή σκώληκα Caenorhabditis elegans (C. elegans). Oνομάζονται γονίδια ced (cell death, γονίδια κυτταρικού θανάτου). Τα γονίδια ced3 και ced4, προάγουν τον κυτταρικό θάνατο, ενώ το γονίδιο ced9, τον αποτρέπει. Η ρύθμιση της απόπτωσης είναι εξαιρετικά πολύπλοκη και πλήθος γονιδίων συμμετέχουν σε αυτή. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται σε εκείνα που προάγουν την απόπτωση (όπως p53, c-myc, E2F, Fas, Bax, Bad, Bak, Bcl-Xs) και σε εκείνα που την αναστέλλουν (όπως Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, MCL-1, A-I, crma, p35). A.5.2.1. Προ αποπτωτικοί παράγοντες Έχει αποδειχθεί ότι ο συνδυασμός έκφρασης ced-3 και ced-4 είναι απαραίτητος και ικανός για να ενεργοποιήσει το πρόγραμμα κυτταρικού θανάτου του C. elegans (Yuan and Horvitz 1992, Chinnaiyan et al., 1997). Ήταν μεγάλου ενδιαφέροντος η ανακάλυψη ότι το ced-3 έχει σημαντική ομολογία με το γονίδιο που κωδικοποιεί το μετατρεπτικό ένζυμο της ιντερλευκίνης-1 (ICE), μία πρωτεΐνη που 67

ενεργοποιεί την κυτταροκίνη ιντερλευκίνη-1 που οδηγεί σε φλεγμονή (Yuan et al., 1993). Ενώ δεν είναι απόλυτα επιβεβαιωμένο ότι η πρωτεΐνη ICE παίζει πιλοτικό ρόλο στην απόπτωση των θηλαστικών, μία συγγενική οικογένεια πρωτεϊνών που αποκαλούνται κασπάσες παίζουν καθοριστικό ρόλο τόσο στον προγραμματισμένο όσο και στο μη προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (Riedl and Shi, 2004). Η κασπάση-1 (caspase-1) είναι το πρωτότυπο μίας οικογένειας συγγενών ενζύμων που συλλογικά αποκαλούνται κασπάσες (caspases: Cysteine-containg aspartate-clearing proteases) και περιέχουν κυστεΐνη στο ενεργό τους κέντρο. Έχουν δράση πεπτιδάσης και αναγνωρίζουν στα υποστρώματά τους μία πλευρική ομάδα ασπαραγινικού στα πλαίσια ενός τετραπεπτιδίου όπου η θέση του ασπαραγινικού ορίζεται ως P1 και η ομάδα του εγγύτερου αμινοξέος προς το Ν-άκρο ορίζεται ως P4. Η αποκοπή συμβαίνει στον πεπτιδικό δεσμό προς το C-άκρο του στοχευμένου ασπαραγινικού (Reed, 2000). Όλες οι κασπάσες παράγονται από το κάθε κύτταρο ως ανενεργά προένζυμα και ενεργοποιούνται μέσω πρωτεολυτικής δράσης κατά την απόπτωση. Οι κασπάσες διακρίνονται σε 2 λειτουργικές ομάδες, τις εναρκτήριες (initiators, κασπάσες-2, -8, -9 και -10 στα θηλαστικά) και τις δραστικές (effectors, κασπάσες-3, -6 και -7 στα θηλαστικά). Η ενεργοποίηση των δραστικών γίνεται από τις εναρκτήριες κασπάσες. Η ced-3, στα νηματώδη, είναι η μόνη κασπάση με διπλή λειτουργική ικανότητα ως εναρκτήρια και ως δραστική (Reed, 2000, Riedl and Shi 2004). Η ενεργοποίηση των δραστικών κασπασών γίνεται μέσω αποκοπής σε συγκεκριμένες εσωτερικές θέσεις που υπάρχει ασπαραγινικό, η οποία διαχωρίζει το αρχικό μόριο σε μία μικρή και μία μεγάλη υποομάδα. Οι δύο υποομάδες συνδέονται στενά για να σχηματίσουν ένα ετεροδιμερές κασπάσης το οποίο τελικά ενώνεται με ένα ακόμα για να σχηματίσουν τα ενεργά ετεροτετραμερή κασπάσης που περιέχουν 2 ενεργά καταλυτικά κέντρα. Οι εναρκτήριες, αντίθετα, κασπάσες αυτοενεργοποιούνται. Αυτή η αυτοενεργοποίηση όμως είναι αυστηρά ελεγχόμενη και συχνά απαιτεί την συγκρότηση ενός σύνθετου συμπλόκου, κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες απόπτωσης (Reed, 2000, Riedl and Shi, 2004, Alberts et al., 2002). Ο προαποπτωτικός παράγοντας Βad είναι ένα παράδειγμα μίας κατηγορίας επαγωγέων κυτταρικού θανάτου που αποτελούν μέλη της προαποπτωτικής οικογένειας του Bcl-2. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει 2 υποομάδες: την υποομάδα 68

των Bax, Bak, Bcl-xs, Bok/Mtd και Bcl-GL που περιέχουν 2 ή 3 BH περιοχές (Bcl-2 Homology domains) και την υποομάδα των Bad, Bik/Nbk, Blk, Bid, Hrk/DP5, Bim/Bod, Bmf, Noxa, Puma/Bbc-3 και Egl-1 του C. elegans που περιέχουν μόνο την BH3 περιοχή (Bcl-2 Homology domain 3). Χαρακτηριστικό παράδειγμα της πρώτης υποομάδας είναι η πρωτεΐνη Bax που εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και διεγείρει, σε συνεργασία με την Bak, την απελευθέρωση του κυτταροχρώματος-c, που τελικά καταλήγει στην ενεργοποίηση των κασπασών (Riedl and Shi, 2004). Στην περίπτωση της δεύτερης υποομάδας, η περιοχή BH3 είναι απαραίτητη για την σύνδεση αυτών των «BH3-μόνο» πρωτεϊνών (BH3-only proteins) στις αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες της οικογένειας. Η σύνδεση αυτή προκαλεί την απομόνωση ή δέσμευση των κυρίως αντιαποπτωτικών παραγόντων, όπως του Bcl-2, και έτσι επιτρέπει τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο να προχωρήσει ανεμπόδιστα (Bouillet and Strasser, 2002). A.5.2.2. Αντιαποπτωτικοί παράγοντες Ο μιτοχονδριακός ή ενδογενής δρόμος απόπτωσης ελέγχεται από τις πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν οι αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, MCL-1, A-1, Boo/Diva/Bcl-2-L10, Bcl-B και η ced- 9 του C. elegans (Bouillet and Strasser A, 2002). Οι σχετικές αναλογίες των αντι- και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών της οικογένειας της Bcl-2 υπαγορεύουν στο κάθε κύτταρο την τελική του ευαισθησία ή αντίσταση στα διάφορα αποπτωτικά ερεθίσματα. Η Bcl-2 και η σχετιζόμενη πρωτεΐνη Bcl-xL φαίνεται να είναι ανάμεσα στους πρωτογενείς παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για να εμποδίσουν τα κύτταρα από την επιλογή της διαδικασίας της απόπτωσης. Αυτή η οικογένεια μορίων βρίσκονται στη εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και το ενδοπλασματικό δίκτυο μέσω μίας διαμεμβρανικής περιοχής που τις «αγκυροβολεί» στις αντίστοιχες μεμβράνες (Reed, 2000, Budd, 2001). Τα μόρια αυτά είναι ικανά να δεσμεύουν τους προαποπτωτικούς παράγοντες όπως το Bax και με αυτόν τον τρόπο να τους αποτρέπουν από την ενεργοποίηση του αποπτωτικού προγράμματος. Η αποπτωτική διαδικασία φαίνεται να ελέγχεται σε σημαντικό βαθμό από την διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP). Η πτώση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης είναι 69

γεγονός κλειδί στην απόπτωση και φαίνεται να συμβαίνει νωρίς στην διαδικασία του κυτταρικού θανάτου (Kroemer, 2003, Zamzami et al., 1995a, 1995b, Kim et al., 2003). Η μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και η συνεπαγόμενη αύξηση της διαπερατότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης είναι πιθανόν η τελική κοινή οδός στον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο: όλες οι προαποπτωτικές πρωτεΐνες της οικογένειας της Bcl-2 μπορούν να δράσουν επί των μιτοχονδρίων και να επάγουν την MMP, οδηγώντας το κύτταρο σε απόπτωση ενώ από την άλλη, οι ενδογενείς αντιαποπτωτικοί παράγοντες με ευρύ φάσμα αντιαποπτωτικής δραστηριότητας, όπως είναι η Bcl-2 και η Bcl-xL, μπορούν να εμποδίσουν την απόπτωση ενεργώντας στο επίπεδο του μιτοχονδρίου και σταματώντας τοπικά την MMP (Kroemer, 2003) A.5.3. Μονοπάτια της απόπτωσης Στα θηλαστικά η απόπτωση εκτελείται είτε δια του ενδοκυττάριου ή δια του εξωκυττάριου δρόμου. Ο ενδοκυττάριος δρόμος εκτελείται δια των μιτοχονδρίων και συγκεκριμένα μετά από κάποιο αποπτωτικό ερέθισμα απελευθερώνονται αρκετές πρωτεΐνες από τον διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων προς το κυτταρόπλασμα (κυττόχρωμα-c, SMAC, DIABLO, AIF, EndoG, OMI/HTRA2). Από αυτές ίσως η πιο δραστική είναι το κυττόχρωμα-c, ένα ένζυμο κλειδί στην οξειδωτική φωσφορυλίωση. Το απελευθερούμενο κυττόχρωμα-c συνδέεται με την πρωτεΐνη APAF-1 και επάγει μια μεταβολή της στερεοχημικής δομής της που της επιτρέπει να συνδεθεί με το ATP και να οδηγήσει στον σχηματισμό του αποπτοσώματος. Το αποπτόσωμα στη συνέχεια ενεργοποιεί την προ-κασπάση-9 σε ενεργό κασπάση-9 και αρχίζει έτσι ο μη αναστρέψιμος καταρράκτης της απόπτωσης (Reed, 2000, Riedl and Shi, 2004). Ο εξωκυττάριος δρόμος ενεργοποιείται από την σύνδεση ενός εξωκυττάριου σήματος θανάτου (death ligand) στον αντίστοιχο υποδοχέα θανάτου (death receptor). Τα σήματα θανάτου είναι συνήθως ομοιοτριμερή οπότε η σύνδεσή τους με τους αντίστοιχους υποδοχείς τους οδηγεί στον σχηματισμό τριμερικών σχηματισμών στην κυτταροπλασματική μεμβράνη που έχουν την ικανότητα να προσελκύουν επιπλέον κυτταροπλασματικούς παράγοντες, όπως τον FADD και την προ-κασπάση-8, σχηματίζοντας έτσι το ολιγομερές σύμπλεγμα επαγωγής θανάτου (death-inducing signaling complex, DISC). Ο σχηματισμός του DISC οδηγεί στην ενεργοποίηση της προ-κασπάσης-8 σε κασπάση-8 η οποία στην συνέχεια ενεργοποιεί τη δραστική 70

κασπάση-3 και οδηγεί στον μη αναστρέψιμο καταρράκτη της απόπτωσης (Riedl and Shi, 2004). Οι δύο παραπάνω δρόμοι αποτελούν δύο διαφορετικούς τρόπους επαγωγής κυτταρικού θανάτου ως απάντηση σε διαφορετικά ερεθίσματα απόπτωσης. Ο εξωκυττάριος δρόμος μπορεί να επηρεάσει αμφίδρομα τον ενδοκυττάριο δια μέσου της κασπάσης-8 και της μερικής πρωτεόλυσης του BID που στη συνέχεια μπορεί να ενεργοποιήσει την απελευθέρωση των απαραίτητων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών για την επαγωγή του ενδοκυττάριου δρόμου της απόπτωσης (Riedl and Shi, 2004). Σχήμα A.29. Οι δύο αποπτωτικοί μηχανισμοί, ο ενδοκυττάριος και ο εξωκυττάριος που ενεργοποιούν την αποπτωτική διαδικασία. Επιπλέον, εκτός από τους δύο αυτούς κλασσικούς δρόμους απόπτωσης μέσω των κασπασών, πρόσφατα έχουν ανακαλυφθεί και νέοι δρόμοι απόπτωσης οι οποίοι φαίνεται να είναι ανεξάρτητοι από τις κασπάσες (Lockshin and Zakeri, 2002, Yuan et al., 2003). Ο ανεξάρτητος-των-κασπασών κυτταρικός θάνατος (CICD) φαίνεται πως έχει ως κεντρικό μηχανισμό τη δράση των μιτοχονδρίων τα οποία απελευθερώνουν 71

προαποπτωτικές πρωτεΐνες ύστερα από την επαγωγή της διαπερατότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP, mitochondrial membrane permeabilization) (Lorenzo and Susin, 2004). A.6. Πρωτεΐνη p53 Η πρωτεΐνη p53 έχει χαρακτηριστεί ως «φύλακας του γενώματος» λόγω της ικανότητας της να καταστέλλει διάφορες μορφές καρκίνων. Αυτό που κάνει στην πραγματικότητα είναι να ανταποκρίνεται στα διάφορα κυτταρικά στρες προκαλώντας μία σειρά από κυτταρικές αντιδράσεις, κυρίως μέσω της μεταγραφικής ενεργοποίησης ή απενεργοποίησης συγκεκριμένων γονιδίων. Ο μεταγραφικός αυτός έλεγχος είναι αποτέλεσμα είτε αλληλεπίδρασης της p53 με διάφορα μόρια (συμπεριλαμβανομένου και του εαυτού της-ολιγομερισμός), είτε μετα-μεταφραστικής τροποποίησης του μορίου της (φωσφορυλίωση, Ο-γλυκοσυλίωση, ακετυλίωση, ουβικιτινυλίωση, σουμοϋλίωση), είτε μεταβολής στην υποκυτταρική της εντόπιση είτε τέλος μεταβολής των επιπέδων της p53 στο κύτταρο. Η ποσότητα της πρωτεΐνης p53 ανά πάσα χρονική στιγμή αποτελεί προϊόν μίας δυναμικής ισορροπίας ανάμεσα στους ρυθμούς σύνθεσης (που εξαρτώνται από τα επίπεδα μεταγραφής και μετάφρασης της, καθώς και την σταθερότητα του mrna της) και αποικοδόμησης της (που εξαρτάται κυρίως από την ουβικιτινυλίωση της μέσω της πρωτεΐνης mdm2). Η μελέτη του τρόπου δράσης της p53 περιπλέκεται σημαντικά αν αναλογιστούμε ότι εμφανίζεται με 12 διαφορετικά mrna και 9 διαφορετικές ισομορφές. Ακόμα, έχουν βρεθεί και οι ομόλογες προς την p53, p63 και p73 πρωτεΐνες με τις δικές της ισομορφές της η καθεμία, οι οποίες εμφανίζουν δομικές ομοιότητες με την p53 και είτε συνεργάζονται με την p53, είτε παρουσιάζουν τελείως διαφορετικές ιδιότητες και λειτουργίες από αυτή. Η πρωτεΐνη p53 αφού εισέλθει στον πυρήνα, ενεργοποιείται (μέσω μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων και αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες), καταλήγει στην υποπυρηνική περιοχή που πρέπει, ολιγομερίζεται, δεσμεύεται πάνω σε εξειδικευμένες αλληλουχίες DNA μέσω της κεντρικής της περιοχής και στρατολογεί το βασικό μηχανισμό μεταγραφής μέσω της Ν-τελικής της περιοχής. Συνεργάτες του p53 Pin-1, YB-1, Bcl, TGFβ, SuprMam 1/2, NEDD8, 72

Κυτταρικό στρες Γενοτοξικότητα Θερμικό σοκ Υποξία Υπεροξία Κυτοκίνες Παράγοντες ανάπτυξης Μεταβολικές αλλαγές Αγκυροβόληση Κυτταρικές επαφές Ενεργοποιημένα ογκογονίδια Ιοί p53 p63/p73 Ισομορφές του p53 Τροποποιητές του p53 ATM/ATR, MAP/p38K, HIPK2, C-abl, Aip4/Itch, CHK1/CHK2, mdm22/mdm-χ, UbcH5B/C, p300/cbp PUMA,NOXA,BAX μιτοχόνδρια cdc25c p21 Άλλα Απόπτωση Διακοπή κυτταρικού κύκλου ΕπιδιόρθωσηDNA Ανασυνδυασμός DNA Γήρανση Σχήμα A.30. Mονοπάτια μεταγωγής σήματος που συμμετέχει η πρωτεΐνη p53. To διάγραμμα αυτό απαριθμεί τις κυριότερες πηγές κυτταρικού στρες (γενοτοξικότητα, θερμικό σοκ, υπεροξία, υποξία, κυτοκίνες, παράγοντες ανάπτυξης, μεταβολικές αλλαγές, ιική μόλυνση, ενεργοποιημένα ογκογονίδια, επαφές μεταξύ κυττάρων, «αγκυροβόληση» των κυττάρων) που μπορούν να οδηγήσουν σε ανάλογες κυτταρικές αποκρίσεις (απόπτωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή κάποια άλλη) μέσω μιας σειράς τροποποιήσεων της πρωτεΐνης p53 (και των ισομορφών της p63, p73). Μεταλλαγμένα μόρια p53 διαφέρουν στην υποκυτταρική και υποπυρηνική τους κατανομή, στην ανάγκη ή όχι ενεργοποίησης και ολιγομερισμού τους, στις 73

αλληλουχίες πάνω στις οποίες δεσμεύονται αλλά και στην αγχιστεία δέσμευσης στο DNA καθώς και στην αλληλεπίδραση με μόρια του μηχανισμού μεταγραφής. Ο ολιγομερισμός της p53 λαμβάνει χώρα μέσω της C-τελικής της περιοχής που σχηματίζει ένα ζεύγος διμερών το οποίο δεσμεύεται με μεγαλύτερη αγχιστεία στο DNA. Αποτυχία της πρωτεΐνης p53 να δράσει ογκοκαταστατικά οφείλεται κυρίως σε απενεργοποίηση της από ιικές πρωτεΐνες και σε μεταλλάξεις της (υπάρχουν βέβαια και οι περιπτώσεις που δεν ευθύνεται η ίδια η p53, αλλά κάποιο από τα μόρια με τα οποία αλληλεπιδρά). Επιδιόρθωση, αντιγραφή και ανασυνδυασμός DNA Ιικές πρωτεΐνες Αντιγόνο Υπομονάδα Μεταγραφή Σχήμα A.31. Σχηματική αναπαράσταση των πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά η p53. Στις πρωτείνες αυτές συμπεριλαμβάνονται ιικές πρωτεΐνες που απενεργοποιούν την p53, και κυτταρικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την p53 και εμπλέκονται στις διαδικασίες αντιγραφής, επιδιόρθωσης, ανασυνδυασμού και μεταγραφής του DNA. A.6.1. Δομή της πρωτεϊνης p53 74

Η p53 αποτελείται από μία Ν-τελική όξινη περιοχή (αμινοξέα 1-42), η οποία αλληλεπιδρά με μέλη του μηχανισμού μεταγραφής. Δίπλα της υπάρχει μία περιοχή πλούσια σε προλίνες (αμινοξέα 64-92) που περιέχει 5 επαναλήψεις PXXP (όπου Χ ένα τυχαίο αμινοξύ και Ρ προλίνη), η οποία θεωρείται απαραίτητη για την ενεργοποίηση του μηχανισμού της απόπτωσης. Ακολουθεί η κεντρική περιοχή (αμινοξέα 102-292) που δεσμεύεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA και παρουσιάζει δράση 3-5 εξωνουκλεάσης. Πλησίον του C-τελικού άκρου (αμινοξέα 311-393), βρίσκεται η περιοχή ολιγομερισμού της p53 (αμινοξέα 324-355), που είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία τετραμερών, τα οποία είναι αυτά που συνδέονται στο DNA. Επιπλέον, περιέχει και σήματα εξόδου από τον πυρήνα (NES, Nuclear Export Signal). Η C-τελική περιοχή τέλος, περιέχει εκτός από τα παραπάνω, σήματα εισόδου στον πυρήνα (NLS, Nuclear Localization Signal) και έχει την ικανότητα να δεσμεύει ΑΤΡ, καθώς και μόρια RNA και DΝΑ μη συγκεκριμένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Αυτό που αναγνωρίζει είναι μάλλον περίεργες δομές DNA. Ν-τελική περιοχή Κεντρική περιοχή C-τελική περιοχή Ενεργοποίηση της μεταγραφής Δέσμευση DNA συγκεκριμένης αλληλουχίας Δράση 5-3 εξονουκλεάσης Τετραμερισμός Μη εξειδικευμένη δέσμευση RNA/DNA Ρύθμιση δέσμευσης DNA συγκεκριμένης αλληλουχίας Δέσμευση ATP Επανουσίωση DNA Σχήμα A.32. Αναπαράσταση της δομής της πρωτεΐνης p53. Στον άνθρωπο η p53 αποτελείται από 393 αμινοξέα. Με λατινικούς αριθμούς συμβολίζονται οι συντηρημένες περιοχές στα θηλαστικά. Με 75

γραμμές παρουσιάζονται οι μεταλλάξεις (όσο μεγαλύτερες οι γραμμές τόσο συχνότερες οι μεταλλάξεις), ενώ φαίνονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης από τις κινάσες dsdna-pk, CK-I, CDK, PK-C και CK-II. Διακρίνονται τα σήματα εισόδου στον πυρήνα (NLS), η περιοχή τετραμερισμού (tetra) και η βασική περιοχή (basic). Από κάτω με μπάρες συμβολίζονται οι περιοχές ενεργοποίησης της μεταγραφής, η κεντρική περιοχή με την ικανότητα δέσμευσης DNA συγκεκριμένης αλληλουχίας και 3-5 εξονουκλεάσης και η C-τελική περιοχή με την ικανότητα δέσμευσης DNA/RNA μη συγκεκριμένης αλληλουχίας αλλά και ρύθμισης της εξειδικευμένης δέσμευσης DNA. Τέλος σημειώνονται οι περιοχές δέσμευσης ΑΤΡ και επανουσίωσης του DNA. A.6.2. Είσοδος της πρωτεΐνης p53 στον πυρήνα H πρωτεΐνη p53 εισέρχεται στον πυρήνα και εξέρχεται από αυτόν κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα στους ινοβλάστες, η p53 συγκεντρώνεται στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της G 1 φάσης και εισέρχεται στον πυρήνα κατά τη μετάβαση στην S φάση. Λίγο μετά την είσοδο στην S φάση, η p53 επιστρέφει στο κυτταρόπλασμα. Σε NIH3T3 ποντικίσια εμβρυϊκά κύτταρα ινοβλάστη εξέρχεται πάλι στο κυτταρόπλασμα μετά το πέρας της Μ φάσης. Όταν όμως το κύτταρο υπόκειται σε κάποια μορφή στρες, απαιτείται η συσσώρευση της p53 στον πυρήνα ώστε να υπάρχει εκδήλωση των ανάλογων κυτταρικών αποκρίσεων. Η είσοδος στον πυρήνα καθίσταται δυνατή από τα 3 σήματα εισόδου (NLS) που διαθέτει, στα οποία δεσμεύονται τα σύμπλοκα των importin a και β και επιτυγχάνουν την «προσάραξη» των μορίων p53 στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων. Η έξοδος επιτυγχάνεται από τα δύο σήματα εξόδου (NES), στα οποία δεσμεύεται η πρωτεΐνη exportin 1. Ολιγομερισμός της p53 έχει ως αποτέλεσμα την κάλυψη των NES και των NLS με αποτέλεσμα τη συσσώρευση της στον πυρήνα ή στο κυτταρόπλασμα αντίστοιχα (Stommel et al., 1999). H έξοδος της p53 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα υποβοηθείται από την πρωτεΐνη mdm2 (mouse double minute 2) με δύο τρόπους. Πρώτον, με δέσμευση και απευθείας μεταφορά της (Roth et al., 1998) και δεύτερον μέσω ουβικιτινυλίωσης της, που έχει ως συνέπεια την αποκάλυψη των NES και την έξοδο της στο κυτταρόπλασμα (Stommel et al., 1999). Η φωσφορυλίωση επίσης έχει δειχθεί πως καθορίζει την εντόπιση της p53 είτε ρυθμίζοντας την αλληλεπίδραση p53-mdm2 (Sakaguchi et al., 2000), είτε 76

σταθεροποιώντας την δημιουργία ολιγομερών (Sakaguchi et al., 1997), είτε τέλος επηρεάζοντας την ενεργότητα των NLS (Bischoff et al., 1990) ή NES (Appella & Anderson, 2001). Α Πυρήνας Κυτταρόπλασμα Δ Β Ε Ζ Γ Σχήμα A.33. Σχηματική αναπαράσταση των διαφόρων τρόπων εισόδου της p53 στον πυρήνα και εξόδου από αυτόν. (Α) Η πρωτεΐνη mdm2 με τη βοήθεια της CRM1 (exportin1) μεταφέρει την p53 στο κυτταρόπλασμα. (Β) Η mdm2 ουβικιτινυλιώνει την p53 με συνέπεια να αποκαλύπτεται το NES και η CRM1 να την οδηγεί στο κυτταρόπλασμα. (Γ) Η p53 μετατρέπεται σε μονομερές από τετραμερές, μετά από αποφωσφορυλίωση της σερίνης 392 και οδηγείται στο κυτταρόπλασμα από την CRM1. (Δ) Η p53 αποδεσμεύεται από πρωτεΐνες που καλύπτουν το NLS. (E) Αποφωσφορυλίωση της σερίνης 315 έχει ως συνέπεια να επιτραπεί η αλληλεπίδραση της p53 με τις importin α και β και να εισέλθει έτσι στον πυρήνα. (Ζ) Η δημιουργία του μονομερούς μπορεί να βοηθήσει και την είσοδο στον πυρήνα. Υπάρχουν πρωτεΐνες που καθηλώνουν την p53 στο κυτταρόπλασμα όπως η vimentin (Klotzsche et al., 1998), η tubulin (Giannakakou et al., 2000), η Parc (p53 associated, Parkin-like cytoplasmic protein, Nikolaev et al., 2003), η hsp70 (heatshock protein 70, Wadhwa et al., 2002) και η Bcl-2 (Beham et al., 1997). Υπάρχουν 77

επίσης πρωτεΐνες που βοηθούν έμμεσα την έξοδό της στο κυτταρόπλασμα όπως οι κινάσες PI3K (Phosphatidyl Inositol 3 Kinase) και Akt (Mayo & Donner, 2001) και οι ακετυλο-τρανσφεράσες CBP (CREB Binding Protein transcriptional coactivator) και p300 (Grossman et al., 2003). Τέλος, υπάρχουν πρωτεΐνες όπως η cpkc (calcium dependent Protein Κinase C, Scotto et al., 1999), η p14arf (Xirodimas et al., 2001) και η κινάση τυροσίνης c-abl (Goldberg et al., 2002) που συμμετέχουν στην παραμονή της p53 στον πυρήνα. A.6.3. Ομοιοπολική τροποποίηση της p53 πρωτεΐνης Όπως προαναφέραμε η p53 περιέχει πολλές θέσης φωσφορυλίωσης στα δύο άκρα του μορίου της και ακετυλίωσης κυρίως στο C-τελικό άκρο. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης είναι αποτέλεσμα δράσης πολλών κινασών ενώ η ακετυλίωση προϊόν των ακετυλοτρανσφερασών CBP/p300 και σε μικρότερο βαθμό της P/CAF (P300 and CBP Associated Factor, Appella & Anderson, 2001). Πολλές από αυτές τις τροποποιήσεις είναι αλληλοεξαρτώμενες (όπως συμβαίνει και στις ιστόνες) και επηρεάζουν τον ολιγομερισμό της p53 ή την αλληλεπίδραση της με διάφορα μόρια, με αποτέλεσμα αλλαγές στην υποκυτταρική εντόπιση, στην σταθερότητα και τέλος στη δέσμευση της στο DNA και στην ικανότητα να επάγει την μεταγραφή. Περιοχές δέσμευσης του p53 στο DNA Γονίδια-στόχοι του p53 78

Σχήμα A.34. Ενζυμικά σύμπλοκα που τροποποιούν την πρωτεΐνη p53. Σύμπλοκα κινασών/φωσφατασών καθορίζουν την φωσφορυλίωση της p53 (πράσινος και ροζ κύκλος) ενώ σύμπλοκα ακετυλο-τρανσφερασών/αποακετυλασών την ακετυλίωση της (γαλάζιος κύκλος). Επιπλέον, η αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PML3 καθορίζει τη σουμοϋλίωση της. Οι συνδυασμοί των τροποποιήσεων καθορίζουν τη δέσμευση της p53 στο DNA και την ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων-στόχων. Δεν έχει νόημα να σταθεί κανείς σε κάθε μία τροποποίηση ξεχωριστά αλλά αξίζει κανείς να αναφερθεί ότι ο συνδυασμός αυτών των ομοιοπολικών τροποποιήσεων ίσως να καθορίζει την εκλεκτικότητα της δέσμευσης της p53 στις ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων με αποτέλεσμα διαφορετική κυτταρική απόκριση. Αξίζει τέλος μνείας η παρατήρηση ότι η ακετυλίωση της p53 από τα παραπάνω ένζυμα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της δέσμευσης της p53 στο DNA in vitro (Liu et al., 1999). A.6.4. Ενεργοποίηση της μεταγραφής μέσω της πρωτεΐνης p53 Η πρωτεΐνη p53, μετά τη δέσμευση της στο DNA, ενεργοποιεί την μεταγραφή γονιδίων με δύο τρόπους: με απευθείας αλληλεπίδραση με παράγοντες του βασικού μεταγραφικού συμπλόκου όπως είναι οι TBP (TATA Binding Protein, Seto et al., 1992), TAF II 31 (TBP Associated Factor, Lu & Levine, 1995) και TFIIB (Transcription Factor ΙΙΒ, Liu et al., 1993) ή αλληλεπιδρώντας με ένζυμα τροποποίησης της χρωματινικής δομής όπως η ακετυλο-τρανσφεράση CBP/p300 (Gu et al., 1997) και οι μεθυλο-τρανσφεράσες CARM1 (Co-Activator Arginine Methyltransferase 1) και PRMT1 (PRotein MethylTransferase, An et al., 2004). Αντίθετα, με τον ρόλο της ως ενεργοποιητής της μεταγραφής, έχει βρεθεί πως έχει την ικανότητα να καταστέλλει τη μεταγραφή γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό όπως του c-fos ή του PCNA, κυρίως μέσω αλληλεπίδρασης της με παράγοντες μεταγραφής όπως οι TAF II 40, TAF II 60 και ίσως ο ΤΒΡ (Cox & Lane, 1995). A.6.5. Εντόπιση της πρωτεΐνης p53 στην πυρηνική μήτρα 79

Διάφορες ερευνητικές ομάδες έχουν αναφέρει εντόπιση της πρωτεΐνης p53 στην πυρηνική μήτρα. Πρώτη η ομάδα του Wolfgang Deppert είχε ανιχνεύσει σε κύτταρα ποντικού 3Τ3, τα οποία είχαν μετασχηματιστεί από τον ιό SV40, p53 στην πυρηνική μήτρα, ένα μέρος της οποίας ήταν συμπλοκοποιημένη με το μεγάλο Τ αντιγόνο του SV40 (Staufenbiel & Deppert, 1983, Deppert & Haug, 1986). Πέντε χρόνια μετά μία άλλη ερευνητική ομάδα έδειξε πως σε εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ποντικού, τα οποία είχαν επιμολυνθεί με τον παραπάνω ιό, το Τ αντιγόνο συνεντοπίζεται με την πρωτεΐνη p53 στον σκελετό του πυρηνικού ικριώματος αλλά και στα PF s και IGC s (Puvion et al., 1988). Τα τελευταία χρόνια μία πληθώρα εργασιών ανέφεραν την παρουσία της p53 σε πυρηνικά σωμάτια (κυρίως στα PML και στον πυρηνίσκο). Στα σωμάτια PML η πρωτεΐνη εναποτίθεται ύστερα από ακτινοβόληση των κυττάρων με υπεριώδες φως (Fogal et al., 2000), έκθεση σε γ-ακτινοβολία (Carbone et al., 2002) ή έκφραση ογκογονικού c-ras (Ferbeyre et al., 2000). Τα σωμάτια αυτά λειτουργούν ως μία «πλατφόρμα» μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων της p53 από μια σειρά ενζύμων, όπως ακετυλίωση από την CBP (Rodriguez et al., 1999), απακετυλίωση από την SIRT1 (Silent Information RegulaTor 1, Vaziri et al., 2001), φωσφορυλίωση από τις κινάσες HIPK2 (Homeodomain Interacting Protein Kinase-2, (Hofmann et al., 2002), ΑΤΜ (Ataxia Telagiectasia Mutated gene product) και Chk2 (Checkpoint kinase 2, Yang et al., 2002) και σουμοϋλίωση (Rodriguez et al., 1999). Επίσης εκεί αλληλεπιδρά και με τις πρωτεΐνες PML και mdm2 δημιουργώντας έτσι ένα τριμερές σύμπλοκο (p53-pml-mdm2) που εμποδίζει την ουβικιτινυλίωση της p53 (Kurki et al., 2003). Oι τροποποιήσεις αυτές έχουν ως αποτέλεσμα την σταθεροποίηση της p53 και την ενίσχυση της δραστικότητας της ως ενεργοποιητή της μεταγραφής. Ανάλογα με τον συνδυασμό των τροποποιήσεων, ο οποίος εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων και το είδος του στρες στο οποίο υποβάλλονται τα κύτταρα, το τελικό αποτέλεσμα της μεταφοράς της p53 στα σωμάτια PML είναι είτε η απόπτωση (Fogal et al., 2000) είτε η γήρανση των κυττάρων (senescence, Bischof et al., 2002). Εναπόθεση της p53 λαμβάνει χώρα και στον πυρηνίσκο (Klibanov et al., 2001), την πυρηνική λάμινα (Yin et al., 1997) και τον διάχυτο σκελετό, με τον οποίο η p53 συνδέεται είτε μέσω της περιοχής της που είναι πλούσια σε προλίνες και η δέσμευση αυτή φαίνεται να αυξάνει μετά από βλάβη του DNA (Jiang et al., 2001), είτε μέσω της C-τελικής περιοχής της στην F-ακτίνη (Okorokov et al., 2002). Από τα 80

παραπάνω γίνεται φανερό ότι υπάρχει άμεση σχέση τροποποιήσεων, υποπυρηνικής εντόπισης και λειτουργικότητας όσον αφορά την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53. A.6.6. Ο ρόλος της πρωτεΐνης p53 στην απόπτωση και οι συνέπειες της έλλειψης ή της μετάλλαξής του στην καρκινογένεση Το γονίδιο p53 έχει ογκοκατασταλτική δράση, κατέχοντας ιδιαίτερο ρόλο στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου. Η τελευταία δράση του προκαλείται κυρίως διαμέσου της πρωτεΐνης p21 (η οποία ανήκει σε μία οικογένεια κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών που δεσμεύουν τη διφωσφορική και την τριφωσφορική γουανοσίνη). Εξάλλου, είναι απαραίτητο στο σημείο ελέγχου μεταξύ G1/S φάσης του κυτταρικού κύκλου και είναι κύριο συστατικό του σημείου ελέγχου μεταξύ G2/M φάσης. Το γονίδιο p53 διαδραματίζει, επίσης, σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης. Αν και ο μηχανισμός δια μέσου του οποίου συμβαίνει αυτό δεν είναι πλήρως κατανοητός έχει πρόσφατα διαπιστωθεί ότι το p53 συντελεί στην ενεργοποίηση της προαποπτωτικής πρωτεΐνης Bax. Σε μετάλλαξη του p53 παρατηρείται μείωση της μεταγραφής του Bax και ελάττωση της απόπτωσης. Ακόμη, σε μελέτες σε ποντίκια έχει δειχτεί ότι το προαποπτωτικό μέλος της οικογένειας του Bcl-2, Bid, επίσης ρυθμίζεται από το p53 και ενδεχομένως να συντελεί στην αύξηση του κυτταρικού θανάτου των καρκινικών κυττάρων κατά την χημειοθεραπεία. 81

Σχήμα A.35. Ο ρόλος του p53 στην απόπτωση και στην καρκινογένεση. Στο σχήμα A.35 παρουσιάζεται συνοπτικά ο ρόλος του p53 στην απόπτωση και οι συνέπειες της έλλειψης ή της μετάλλαξής του στην καρκινογένεση. Συγκεκριμένα, όπως έχει ήδη αναφερθεί, στα κύτταρα με φυσιολογικό p53, ύστερα από επίδραση καρκινογόνου, μεταλλαξιογόνου ή ιονίζουσας ακτινοβολίας η προκληθείσα βλάβη του DNA ακολουθείται από την ενεργοποίηση του p53, με επακόλουθο την ενεργοποίηση του Bax και τελικό αποτέλεσμα τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Αντίθετα σε έλλειψη ή μετάλλαξη του p53, δεν ενεργοποιούνται τα εξαρτώμενα από αυτό γονίδια (κυρίως το p21) με αποτέλεσμα την έλλειψη αναστολής του κυτταρικού κύκλου. 82

Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Υλικά Β.1.1. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Tα ένζυμα μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας New England BioLabs Inc. (Beverly, MA, USA) και της Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). H δεοξυριβονουκλεάση 200 U/μl ήταν της εταιρίας Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA), ενώ η ριβονουκλεάση Α 1000 U/ml ήταν της εταιρίας Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, USA). Η πολυμεράση που χρησιμοποιήθηκε στις διάφορες αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης (PCR) ήταν της εταιρίας Finnzymes OY (Espoo, Finland). Η μη φωσφορυλιωμένη ανθρώπινη πρωταμίνη 1, καθαρισμένη με στήλη χρωματογραφίας υψηλής πίεσης μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. P. Chevaillier (Laboratoire de Biologie Cellulaire, Université Paris-Val de Marne, France). Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Για την ανάπτυξη των ευκαρυωτικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν τα θρεπτικά υγρά DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium), και RPMI-1640 (Rooswell Park Memorial Institute-1640), ορός από μοσχάρι, (FBS) και αντιβιοτικό πενικιλίνης-στρεπτομυκίνης, όλα από την εταιρεία GIBCO Life Technologies Inc. (Scotland). Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) σε βακτήρια χρησιμοποιήθηκαν ο πλασμιδιακός φορέας pgex- 2T της εταιρίας Amersham-Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση της πρωτεΐνης p53, του αμινοτελικού άκρου του LBR (LBRNt), των επιμέρους τμημάτων του LBRNt, LBRNt (62-205) και LBRNt (92-205), καθώς επίσης και για τα 83

μεταλλάγματα hlbrnt(f E) και chlbrnt(e F). Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης με 6xHis χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pet16b. Για την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων στα μόρια της πρωταμίνης 1 και του LBR χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας palter-1 της εταιρείας Promega (Madison, WI, USA). Για την έκφραση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν οι φορείς κλωνοποίησης pflag-cmv-2 (Sigma-Aldrich) για την έκφραση των SRPK1 και SRPK1a (το επίτοπο FLAG στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης σύντηξης), pgfp3 (Invitrogen Life Technologies) για την έκφραση της πρωτεΐνης SAFB1 (η Green Fluorescent Protein (GFP) στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης σύντηξης) και pegfp-n1 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) για την έκφραση της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της (η πρωτεΐνη GFP στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης σύντηξης). Tα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ακόλουθα: monoclonal anti- SAFB1 (Αbcam Inc., Cambridge, MA, USA), monoclonal anti-flag (M5, Sigma- Aldrich), monoclonal anti-p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), polyclonal anti-p53 (FL-393, Santa Cruz Biotechnology) και monoclonal anti- GFP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν rabbit anti-mouse της εταιρείας Chemicon International Inc. (Temecula, CA USA), συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση. Ως δεύτερα αντισώματα στις δοκιμασίες ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκαν FITC-conjugated goat antimouse (που δίνει πράσινο χρώμα) και RRX-conjugated goat anti-rabbit (που δίνει κόκκινο χρώμα). Η κλωνοποίηση των SRPK1/SRPK1a στoυς πλασμιδιακούς φορείς pflag- CMV-2 και pgex-2t καθώς και της πρωταμίνης 1 στον πλασμιδιακό φορέα pegfp- N1 είχε γίνει παλιότερα από την Επίκουρο Καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη (Nikolakaki et al., 1996, Papoutsopoulou et al., 1999) και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Βικτωρία Δρόσου (Β. Δρόσου, Διδακτορική Διατριβή, 2005, Θεσσαλονίκη) αντίστοιχα. Το γονίδιο της πρωτεΐνης p53 κλωνοποιημένο στον φορέα pcdna3/ha, καθώς και το πλασμίδιο αναφοράς (-2325/+8) p21-cat, μας δόθηκαν από τον Αναπληρωτή Καθηγητή Δ. Καρδάση (Ιατρικό Τμήμα, Πανεπιστήμιο Κρήτης). To γονίδιο της πρωτεΐνης HP1b κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pet16b μας δόθηκε από τον Dr. M. Lechner (The Wistar 84

Institute, Philadelphia, USA). Το γονίδιο της πρωτεΐνης SAFB1 κλωνοποιημένο στον φορέα pgfp3 μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. D.J. Elliott (Institute of Human Genetics, University of Newcastle, Newcastle, UK.). Τα τμήματα του γονιδίου του SAFB1 που περιέχονται μεταξύ των αμινοξέων 1-240 [SAFB1(1-240)] και 240-600 [SAFB1(240-600)] κλωνοποιημένα στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t μας δόθηκαν από την Dr. S. Oesterreich (Breast Cancer Department of Medicine Baylor, Houston, USA). Το τμήμα SAFB1(709-915) μας δόθηκε κλωνοποιημένο στον φορέα pgex-2t από την Επίκουρο Καθηγήτρια Ε. Γεωργάτσου (Ιατρικό Τμήμα, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας). Το πλασμίδιο CMV β-gal μας δόθηκε από την καθηγήτρια Μ. Χατζοπούλου (Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.). Β.1.2. Βιολογικά υλικά Για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές καρκινικές σειρές 293T, HeLa, HepG2 και K562. Τα 293Τ (επιθηλιακά κύτταρα νεφρού ανθρώπινου εμβρύου, στα οποία έχει εισαχθεί το θερμοευαίσθητο γονίδιο που κωδικοποιεί το SV40 T αντιγόνο) και HeLa (αδενοκαρκίνωμα σε επιθήλιο μήτρας) κύτταρα δημιουργούν μία μονοστοιβάδα στην επιφάνεια του τριβλίου, ενώ τα HepG2 (ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα) κύτταρα, αποικίες στις οποίες έχουμε ανάπτυξη των κυττάρων κάθετα προς την επιφάνεια του τριβλίου. Τα κύτταρα Κ-562 αναπτύχθηκαν σε εν αιωρήσει κυτταροκαλλιέργειες (suspension cultures). Ο πολλαπλασιασμός του πλασμιδιακού DNA έγινε με τη χρήση των στελεχών E. coli TOP-10, TOP-10F (Invitrogen Life Technologies). Το στέλεχος JM109 (Promega) χρησιμοποιήθηκε για τον πολλαπλασιασμό του DNA ύστερα από TA κλωνοποίηση, καθώς και των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων της πρωταμίνης 1 και του LBRNt που είχαν υποστεί σημειακή μετάλλαξη. Για την υπερέκφραση βακτηριακών πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν τα E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies). 85

Β.1.3. Χημικά αντιδραστήρια Υλικά χρωματογραφίας Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, MI, USA), Serva (Heidelberg, Germany) και Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Τα ισότοπα γ- 32 Ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol και 14 C- χλωραμφαινικόλη 4 mci/mmol ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Τα ακτινογραφικά φιλμ που χρησιμοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες ήταν του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ ήταν αντίστοιχα: X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρείας. Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST), χρησιμοποιήθηκε υλικό χρωματογραφίας αγχιστείας (σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης), της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd. (Buckinghamshire, UK), ενώ για τις ανοσοκατακρημνίσεις protein A σεφαρόζη της ίδιας εταιρίας. B.2. Μέθοδοι Β.2.1. Καλλιέργειες κυττάρων θηλαστικών και υποκυτταρική κλασμάτωση εκχυλισμάτων Τα κύτταρα μεγαλώνουν σε επωαστήρες σε θερμοκρασία 37 ο C και σε ατμόσφαιρα 5% σε CO 2 και κορεσμένη σε υγρασία (95%), μέσα σε τριβλία που περιέχουν 10 ml θρεπτικό υγρό, 10% v/v FCS (Fetal Calf Serum-Εμβρυϊκός ορός βοδιού) και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Για την ανάπτυξη των 293T, HeLa και HepG2 κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το θρεπτικό υγρό DMEM. Τα κύτταρα Κ562 αναπτύχθηκαν σε εν 86

αιωρήσει κυτταροκαλλιέργειες (suspension cultures) σε θρεπτικό υγρό (RPMI-1640). Τα κύτταρα διατηρούνται σε συγκεντρώσεις 5x10 4-1x10 7 κύτταρα/ml προκειμένου να βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη μέθοδο του αιματοκυτταρόμετρου (Neübauer) κάτω από μικροσκόπιο (100x) (American Optical Corp., USA) και έτσι προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. Στα κύτταρα HepG2 προστέθηκαν τα φάρμακα 5-FU και μιθραμυκίνη για 36 h σε τελικές συγκεντρώσεις 50 μg/ml και 200 nm αντίστοιχα (μας παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Δ. Καρδάση). Η υποκυτταρική κλασμάτωση έλαβε χώρα σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφεται από τους Spector et al., (1998) και Jiang et al., (2001). Αφού αφαιρέθηκε επιμελώς το θρεπτικό υγρό από τα τριβλία, στη συνέχεια τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 1 ml ισότονου διαλύματος PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), με τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter). Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και στη συνέχεια αιωρήθηκαν σε 100 μl διαλύματος Α (20 mm Hepes-KOH ph 7,5, 100 mm KCl, 5% σουκρόζη, 1 mm DTT). Μετά την αιώρηση προστέθηκε σε αυτά ίσος όγκος διαλύματος Α στο οποίο όμως είχε προστεθεί 0,8% (v/v) από το μη ιονικό απορρυπαντικό NP-40 (τελική περιεκτικότητα σε ΝΡ-40 0,4%) και τα κύτταρα παρέμειναν για 10 min στους 4 ο C. Η προσθήκη του απορρυπαντικού έγινε προκειμένου να σπάσουν οι κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων χωρίς να σπάσουν όμως οι πυρηνικές. Στη συνέχεια το αιώρημα φυγοκεντρήθηκε για 10 min στα 5000 g και το υπερκείμενο αποτέλεσε το κλάσμα του κυτταροπλάσματος ενώ το ίζημα επιστοιβάχθηκε σε μαξιλάρι σουκρόζης (διάλυμα A αλλά με 0,8 Μ σουκρόζη αντί για 5%) και φυγοκεντρήθηκε για 10 min στα 5000 g για να πάρουμε καθαρούς πυρήνες. Οι πυρήνες πλύθηκαν με PBS και εκχυλίστηκαν για 5 min στους 4 ο C με 100 μl διαλύματος EB (10mM PIPES ph 6,8, 250 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2 και 1 mm αναστολέα πρωτεασών PMSF). Η εκχύλιση αυτή είχε ως αποτέλεσμα το σπάσιμο της πυρηνικής μεμβράνης και την απομάκρυνση των διαλυτών στοιχείων του πυρήνα. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 5 min στα 5000 g. Το υπερκείμενο αποτέλεσε το κλάσμα του διαλυτού νουκλεοπλάσματος ενώ το ίζημα αιωρήθηκε σε 100 μl διαλύματος DB (10 mm PIPES ph 6,8, 50 mm NaCl, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2, 0,5% μη ιονικού απορρυπαντικού Triton X-100 και 1 mm αναστολέα πρωτεασών PMSF). Στο αιώρημα αυτό προστέθηκαν 0,5 μl DNAse και 87

επωάστηκε για 1 h στους 32 ο C, για την απομάκρυνση των πρωτεϊνών που βρίσκονται συνδεδεμένες με την χρωματίνη. Το υπερκείμενο που προέκυψε μετά από φυγοκέντρηση για 5 min στα 5000 g αποτέλεσε το κλάσμα της DNAse (που περιέχει και τις ιστόνες) ενώ το ίζημα πλύθηκε μια φορά με το διάλυμα DB και αιωρήθηκε σε 100 μl του ίδιου διαλύματος για να αποτελέσει το κλάσμα της πυρηνικής μήτρας. Β.2.2. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων ως πρωτεΐνες σύντηξης με χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιμες. Βασίζεται στην αργή μίξη του πλασμιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυμα CaCl 2 με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσμα της ανάμιξης είναι η δημιουργία κατακρημνισμάτων DNA με φωσφορικό ασβέστιο. Το κατακρημνίσματα αυτά διαπερνούν την κυτταροπλασματική μεμβράνη πιθανώς με ενδοκύττωση. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις μεταβολές του ph (βέλτιστο ph 6.9-7.2) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εμπορικά kit καθαρισμού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρμογή της μεθόδου). Τα χαρακτηριστικά της μεθόδου είναι η εντόπιση του κλωνοποιημένου πλασμιδιακού φορέα εκτός του γενώματος των κυττάρων, καθώς και η ανίχνευση και παραμονή του προϊόντος του κλωνοποιημένου γονιδίου για χρονικό διάστημα 1-4 ημερών. Επίσης σε κάθε κυτταρική διαίρεση μόνο τα μισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασμιδιακού DNA με το οποίο είχαν επιμολυνθεί. 88

Σχήμα Β.2. Σχηματική αναπαράσταση της παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα ανθρώπινα 293Τ για υπερέκφραση πρωτεϊνών. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιμόλυνση πρέπει να καταλαμβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλίου. Το διάλυμα του DNA με το CaCl 2 (250 mm CaCl 2, 20 μg/ml πλασμιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 μg/ml περιλαμβάνουν το δραστικό κλάσμα του DNA που φέρει το κλωνοποιημένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος HEPES-φωσφορικών (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na 2 HPO 4 ph 7.1), το μίγμα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για 20-30 min, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως απομακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1 ml του αιωρήματος DNAφωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τριβλίο της καλλιέργειας. Τα τριβλία αφήνονται για 20 min με παροδική ανακίνηση κάθε 10 min. Στο τριβλίο προστίθενται 4 ml DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)/10% v/v FCS (Fetal Calf Serum- Εμβρυϊκός ορός βοδιού) με 5 μl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυμα που διασπούν το DNA, καθώς και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Τα τριβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία CO 2. Μετά το πέρας 4 h τα 5 ml του υγρού όπου έγινε η επιμόλυνση αφαιρούνται και προστίθενται εκ νέου 10 ml από το θρεπτικό υγρό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί με επώαση στους 37 C σε ατμόσφαιρα CO 2 για 24 h και ακολουθεί 89

ακόμη ένας κύκλος αφαίρεσης-προσθήκης θρεπτικού μέσου και επώασης για άλλες 24 h. Με τη συμπλήρωση συνολικά 48 h από τη στιγμή της επιμόλυνσης τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης. Ακολούθως προσθέτουμε 200 μl στο τριβλίο των 100 mm από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 μg/ml απροτινίνη και 1 mm PMSF) και τα κύτταρα αφαιρούνται από την επιφάνεια του τριβλίου με τη βοήθεια σπάτουλας. Τα κύτταρα αφήνονται σε αιώρηση για 30 min στους 4 C στο διάλυμα λύσης και κατόπιν διαβιβάζονται συνεχόμενα μέσα από σύριγγα πολύ στενής διαμέτρου, ώστε να διαρρηχθούν εντελώς οι κυτταρικές μεμβράνες αλλά και το χρωμοσωμκό DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 12000 g για 15 min στους 4 C και συλλογή του υπερκειμένου κυτταρικού εκχυλίσματος. Β.2.3. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με ηλεκτροδιάχυση Ηλεκτροδιάχυση είναι η διαδικασία κατά την οποία αυξάνει η διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου με την εφαρμογή εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στα K562 κύτταρα για την συνεπιμόλυνση τους με τους πλασμιδιακούς φορείς pcdna3/ha-p53, pgfp3-safb1, (-2325/+8) p21-cat και CMV β-gal, προκειμένου να γίνουν οι μετρήσεις μεταγραφικής ενεργότητας της πρωτεΐνης p53, με το σύστημα της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραμφαινικόλης (βλ. και Β.2.26.). Η συσκευή ηλεκτροδιάχυσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Gene Pulser Xcell TM Electroporation System της εταιρίας BIO-RAD (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA USA). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Δύο ημέρες πριν την ηλεκτροδιάχυση τα κύτταρα μεταφέρονται σε φλάσκα των 75 cm 2 με θρεπτικό μέσο RPMI έτσι ώστε να βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης (0.5-4 x 10 6 κύτταρα/ml) την ημέρα της ηλεκτροδιάχυσης. Τότε τα κύτταρα φυγοκεντρούνται σε 400 x g για 5-7 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και αφαιρείται το θρεπτικό υγρό. Τα κύτταρα επαναιωρούνται σε διάλυμα ηλεκτροδιάχυσης (Opti-MEM), έτσι ώστε η συγκέντρωσή τους να είναι περίπου 10 6 κύτταρα/200 μl. Στη συνέχεια, 200 μl αιωρήματος κυττάρων μαζί με το DNA μεταφέρoνται σε κυψελίδα ηλεκτροδιάχυσης. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροδιάχυσης για τα Κ562 κύτταρα είναι 155 V και 1050 μf. Αμέσως μετά την 90

ηλεκτροδιάχυση τα κύτταρα μεταφέρονται σε οπή πιάτου 6 οπών που περιέχει 2 ml RPMI με 10% FBS. Τα κύτταρα μαζεύονται μετά από 48 ώρες. Β.2.4. Ηλεκτροφόρηση και απομόνωση DNA από πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση συγκεκριμένων τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης και η απομόνωσή τους απ αυτές αποτελεί έναν απλό και αποδοτικό τρόπο διαχωρισμού και καθαρισμού τους. Η μέθοδος βασίζεται στην παρασκευή πηκτών αγαρόζης με τήξη της αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα έως ότου σχηματιστεί ένα διαυγές διάλυμα. Με τη ψύξη του διαλύματος σχηματίζεται ένα πλέγμα που η πυκνότητα του εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τα τμήματα του DNA, που είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο ph, μετακινούνται προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από ορισμένους παράγοντες. (1) Το μέγεθος των τμημάτων του DNA. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. (2) Η συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA μετακινείται με διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές με διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. (3) Η διαμόρφωση των τμημάτων DNA. Υπερελικωμένα, κυκλικά και γραμμικά τμήματα DNA ίδιου μοριακού βάρους κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της πηκτής. (4) Το δυναμικό που εφαρμόζεται στα άκρα της πηκτής. (5) Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται πηκτές με συγκέντρωση 1% αγαρόζης, σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA ph 8.0), παρουσία και βρωμιούχου αιθιδίου σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο 91

παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA. Η ιδιότητα του να απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία και να την επανεκπέμπει στο κόκκινο ορατό φάσμα χρησιμοποιείται για να ανιχνευθούν τα τμήματα του DNA πάνω στην πηκτή. Το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων αποτελείται από 5% γλυκερόλη, 0.42% μπλε της βρωμοφαινόλης, 0.42% κυανούν του ξυλενίου ενώ η χρησιμοποιούμενη συσκευή ηλεκτροφόρησης είναι της εταιρείας International Biotechnologies, Inc. Για την απομόνωση των διαχωρισθέντων τμημάτων του DNA από την αγαρόζη χρησιμοποιούνται τα αντιδραστήρια και το πρωτόκολλο που παρέχονται από το Qiaex Gel Extraction Kit της εταιρίας Qiagen. Η απομόνωση τμημάτων DNA σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή βασίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται από ειδικά σφαιρίδια στήλης, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων, ενώ οι προσμίξεις διέρχονται από τη στήλη. Το τμήμα του DNA που μας ενδιαφέρει αποκόπτεται από την πηκτή αγαρόζης και τοποθετείται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης (eppendorff). Εκεί προστίθεται το διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης (3 Μ NaI, 4 M NaClO 4, 19 mm Tris-ΗCl, 0.1% Na 2 SO 3 ph 7.0) σε αναλογία 300 μl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση για 10 min στους 50 C με περιοδική ανάδευση ώστε να διαλυτοποιηθεί η πηκτή. Η παραλαβή του DNA γίνεται με προσθήκη κατάλληλου όγκου σφαιριδίων στήλης Qiaex και θέρμανση στους 50 C για 10 min, αναδεύοντας περιοδικά ώστε τα σφαιρίδια να καλύπτουν όλο τον όγκο του διαλύματος. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του διαλύματος για 30 sec στα 12000xg και απόχυση του υπερκείμενου. Tα σφαιρίδια ξεπλένονται δύο φορές με διάλυμα πλύσης QX2 (8 M NaClO 4, 10 mm Tris-ΗCl ph 7.0) και δύο φορές με αιθανολικό διάλυμα QX3 (100 mm NaCl, 10 mm Tris-ΗCl, 1 mm EDTA ph 7.5), ώστε να απομακρυνθούν οι τυχόν προσμίξεις. Στη συνέχεια αφήνονται να στεγνώσουν για 2 min και το DNA εκλούεται με προσθήκη 20 μl Η 2 Ο ή ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 1 mm EDTA ph 8.0). Μικρή ποσότητα από το έκλουσμα (2-4 μl) ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης για να διαπιστωθεί κατ εκτίμηση η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε. 92

Β.2.5. Φωτομετρικός ποσοτικός προσδιορισμός νουκλεϊνικών οξέων Η αρχή του φωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος, έτσι, τα διαλύματα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm.η διαδικασία που ακολουθείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό των δειγμάτων του DNA είναι η εξής: Μια μικρή ποσότητα του προς ανάλυση δείγματος, (1-10 μl), αραιώνεται με αποστειρωμένο νερό, (600-1000 μl). Κατόπιν, μετράται η απορρόφηση στα 260 και 280 nm. Είναι γνωστό (Sambrook et al., 1989), ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας, (OD), στα 260 nm, αντιστοιχεί σε 50 μg/ml διαλύματος DNA και 40 μg/ml διαλύματος RNA. Με βάση τις δυο αυτές σχέσεις, προσδιορίζεται η ποσότητα του DNA στο άγνωστο δείγμα. Επίσης, από το λόγο των οπτικών πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm, (OD 260 /OD 280 ), μπορεί να εκτιμηθεί ο βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων DNA και RNA, αφού είναι διεθνώς παραδεκτό ότι δείγματα υψηλής καθαρότητας, έχουν λόγο OD 260 /OD 280, περίπου 2. Β.2.6. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης, η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία και καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας που επιθυμούμε να πολλαπλασιάσουμε. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: 93

Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση σε 90 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Στάδιο 2 ο :Υβριδισμός Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους 50-75 ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 ο : Πολυμερισμός Στο στάδιο αυτό η DNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DNA. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων. Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται 20-30 φορές και παράγονται 2n μόρια DNA, όπου n είναι ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 C για 5 min, ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός (Innis et al., 1990). Το τέλος της αντίδρασης πραγματοποιείται με την παραμονή του μίγματος της PCR στους 4 C. Τα συστατικά του μίγματος συνολικού όγκου 50 μl της αντίδρασης PCR φαίνονται στον πίνακα B1. Το 10x ρυθμιστικό διάλυμα της Taq DNA πολυμεράσης αποτελείται από 20 mm Tris-Cl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 2 mm MgSO 4 και 0.1% Triton-X-100. 94

DNA εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (sense) (0,13 μg/ μl) Εκκινητής αντινοηματικός (antisense) (0,13 μg/ μl) Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 1.25 mm Ρυθμιστικό διάλυμα Taq πολυμεράσης 10 x Taq DNA Πολυμεράση (5 U/μl) ddh 2 0 0.1 μg 3 μl 3 μl 8 μl 5 μl 1 μl Έως 50 μl Πίνακας Β1. Τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης PCR, συνολικού όγκου 50 μl. Στην παρούσα εργασία με την τεχνική της PCR πολλαπλασιάστηκαν τα τμήματα του γονιδίου του LBR που κωδικοποιούν τις ακολουθίες μεταξύ των αμινοξέων 62 έως 205 και 92 έως 205, καθώς επίσης και το τμήμα του γονιδίου του SAFB1 που κωδικοποιεί την ακολουθία μεταξύ των αμινοξέων 566 έως 706. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην κάθε περίπτωση φαίνονται στον πίνακα Β.2. Γονίδιο Εκκινητής Ενδονουκλεάση περιορισμού Τμήμα 62-205 του LBR (s) 5-cgcggatcccagaggaaaagccagtct-3 (a) 5- gcgaattctcatcttccaccaaattctag-3 BamHI EcoRI Τμήμα 92-205 του LBR (s) 5-gcgggatccagacgtcgctcttcttcccatag-3 (a) 5-gcgaattctcatcttccaccaaattctag-3 BamHI EcoRI Τμήμα 566-706 του SAFB1 (s) 5-cgcggatccatggataaatccaaaggggtgcc-3 (a) 5-cgggaattcccgctcctgctcatagcgcag-3 BamHI EcoRI Πίνακας Β.2. Ακολουθία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό των τμημάτων DNA της πρώτης στήλης. Με έντονα γράμματα είναι η θέση για πέψη από ενδονουκλεάση περιορισμού που περιείχε ο κάθε εκκινητής. Ως (s) αναφέρεται ο νοηματικός και ως (a) ο αντινοηματικός εκκινητής. 95

Β.2.7. Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Η κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακούς φορείς βασίζεται στην ικανότητα του πλασμιδιακού DNA να διασπάται σε συγκεκριμένες θέσεις μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού και να συνδέεται με το ξένο τμήμα DNA που έχει υποστεί την ίδια κατεργασία. Τα πλασμίδια είναι μικρά, κυκλικά, δίκλωνα μόρια DNA που μπορούν να αναπτύσσονται ημι-αυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε αντιβιοτικά. Το πλασμιδιακό DNA καθώς και το ξένο τμήμα DNA που έχουν κατεργαστεί με τα ίδια ένζυμα περιορισμού μπορούν να επανακυκλοποιηθούν συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού που καταλύει μία λιγάση. Το ανασυνδιασμένο πλασμίδιο μπορεί να μεταφερθεί σε κύτταρα και να αναπτυχθεί παρουσία αντιβιοτικών επιτρέποντας την επιλογή τους σε σχέση με τα κύτταρα που δεν περιέχουν το πλασμίδιο (Sambrook et al., 1989). Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι pgex-2t, palter-1 και pegfp-n1. Ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρίας Amersham-Pharmacia Biotech έχει μέγεθος γύρω στα 4900 bp και περιέχει στο μόριο του έναν tac προαγωγό για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου, το γονίδιο laq I q που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST). Η περιοχή κλωνοποίησης του πλασμιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει θέσεις για τη διάσπαση του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού BamHI και EcoRI που χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή των γονιδίων των p53, SAFB1(566-706), LBRNt(62-205) και LBRNT(92-205). Ο πλασμιδιακός φορέας palter-1 της εταιρίας Promega χρησιμοποιήθηκε για την εισαγωγή επιθυμητών σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της πρωταμίνης 1 και του LBRNt Είναι κατάλληλος για την εύκολη παρασκευή και επιλογή μεταλλαγμάτων σύμφωνα με την ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Προσφέρει αντίσταση στην τετρακυκλίνη και αμπικιλλίνη (στην περίπτωση της αμπικιλλίνης η ανθεκτικότητα επανέρχεται με τη χρήση κατάλληλου ολιγονουκλεοτιδίου) για την επιλογή των μεταλλαγμένων κλώνων. Διαθέτει δύο προαγωγείς για την Τ7 και SP6 96

RNA πολυμεράση προκειμένου να γίνει η σύνθεση του μεταλλαγμένου κλώνου. Περιέχει χαρακτηριστικές περιοχές (phage f1 region) που βοηθούν την παρασκευή μονόκλωνου DNA με τη βοήθεια φάγων. Επιτρέπει την κλωνοποίηση τμημάτων DNA με μέγεθος έως 6 kb, καθώς και επιλογή των κυττάρων που φέρουν το κλωνοποιημένο τμήμα DNA με τη δράση β-γαλακτοσιδάσης, δεδομένου ότι ο πλασμιδιακός φορέας περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί το lacz α-πεπτίδιο. Η περιοχή κλωνοποίησης περιέχει θέσεις για την πέψη του πλασμιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoR I και BamH I όπου και κλωνοποιήθηκε το γονίδιο της prm1 προκειμένου να γίνει οι σημειακές μεταλλάξεις στην RS αλληλουχία. Στις ίδιες θέσεις κλωνοποιήθηκε και το ανθρώπινο αμινοτελικό τμήμα του LBR (hlbrnt) καθώς και το αντίστοιχο από γαλοπούλα (chlbrnt) προκειμένου η φαινυλανανίνη (F) που βρίσκεται στη θέση 125 του hlbrnt να αντικατασταθεί με γλουταμινικό (Ε) και το γλουταμινικό (Ε) που βρίσκεται στη θέση 112 του chlbrnt να αντικατασταθεί με φαινυλανανίνη (F). Ο πλασμιδιακός φορέας pegfp-n1 της εταιρίας Clontech επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο με την Green Fluorescent Protein (GFP). Η μεταγραφή των τμημάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθμιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus. Περιέχει γονίδιο που του προσδίδει ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη και θέσεις για πέψη από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού Hind III και BamH I όπου και κλωνοποιήθηκαν το γονίδιο της πρωταμίνης 1 και οι μεταλλαγμένες μορφές του. Όταν γίνεται πέψη πλασμιδιακών φορέων με δύο ενδονουκλεάσες περιορισμού τότε γίνεται ταυτόχρονη επώαση όταν τα ένζυμα είναι συμβατά από πλευράς ρυθμιστικού διαλύματος επώασης, ενώ σε αντίθετη περίπτωση πραγματοποιείται διαδοχική επώαση. Στην περίπτωση αυτή πραγματοποιείται επώαση πρώτα με το ένα ένζυμο, ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή αγαρόζης και μετά επώαση με το δεύτερο ένζυμο. Ένα πλεονέκτημα της διαδοχικής πέψης είναι η επιβεβαίωση ότι μετά την πέψη με το πρώτο ένζυμο, το πλασμίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραμμικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο μορφές του πλασμιδίου. Οι πληροφορίες για το 97

κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα κάθε ενδονουκλεάσης περιορισμού δίνονται αναλυτικά στον κατάλογο της εταιρείας NEBioLabs ή της Takara, στο αντίστοιχο κεφάλαιο. Η ποσότητα των ενζύμων που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης κυμαίνεται από 15 min έως 2 h. Για τμήματα DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται μεγάλος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ κοντά στα άκρα, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η πέψη. Η αντίδραση λιγάσης πραγματοποιείται με την προσθήκη στο μίγμα αντίδρασης του τμήματος DNA και του φορέα σε αναλογία 7:1, 1.5 μl Τ4 DNA λιγάσης (400000 U/ml, BioLabs), 2 μl 10x ρυθμιστικού διαλύματος Τ4 DNA λιγάσης (500 mm Tris-Cl, 100 mm MgCl 2, 100 mm DTT, 10 mm ATP, 25 μg/ml BSA ph 7.5) και απιονισμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 20 μl. Το μίγμα επωάζεται για 12-16 h σε θερμοκρασία 15 C και ακολουθεί μετασχηματισμός των κατάλληλων σε κάθε περίπτωση κυττάρων E. coli. Η πιο πάνω αντίδραση της λιγάσης πραγματοποιείται και απουσία του τμήματος DNA που πρόκειται να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο, προκειμένου να ελεγχθεί το ποσοστό επανακυκλοποίησης του πλασμιδιακού φορέα, χωρίς την παρεμβολή του ξένου DNA. Αν παρατηρηθεί μεγάλο τέτοιο ποσοστό, κρίνεται σκόπιμο να γίνει αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου πριν αυτό χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Στη συγκεκριμένη εργασία, η φωσφατάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν της εταιρείας Roche. Η αντίδραση αποφωσφορυλίωσης γίνεται για 30 min στους 37 ο C ως εξής: DNA πλασμιδιακού φορέα (100 ng) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφατάσης 10x ( 2 ή 3 μl) SAP (1 μl) H 2 O (μέχρι τα 20 ή 30 μl). Μετά το τέλος της επώασης, ακολουθεί απενεργοποίηση του ενζύμου στους 65 ο C για 15 min. Τελικά, το πλασμίδιο καθαρίζεται και μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. 98

Β.2.8. Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Τα στελέχη E. coli BL21(DE3), JM109, TOP-10 και TOP-10F αναπτύσσονται σε θρεπτικό υπόστρωμα L.B., (Luria- Bertani) (Sambrook J. et al., 1989), του οποίου η σύσταση περιγράφεται στον παρακάτω πίνακα. Η ρύθμιση της οξύτητας γίνεται με τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση μιας Atm, για 30 min. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων TOP-10 και TOP-10F γίνεται σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση φαίνεται επίσης στον πίνακα που ακολουθεί. Θρεπτικό υλικό LB Θρεπτικό υλικό TYM Εκχύλισμα ζύμης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 1.0 % w/v NaCl 1.0 % w/v Εκχύλισμα ζύμης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 2.0 % w/v NaCl 0.1 M MgSO 4 10 mm Πίνακας Β.3. Σύσταση των θρεπτικών υλικών LB και TYM. Β.2.9. Δημιουργία βακτηριακών κυττάρων επιδεκτικών σε μετασχηματισμό (competent cells) Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασμένα με διαλύματα CaCl 2 στους 4 ο C και με ακόλουθη θέρμανση λίγων min μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές. Πολλές 99

παραλλαγές της βασικής τεχνικής έχουν περιγραφεί και μία από αυτές χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Σύμφωνα μ αυτή 2 ml θρεπτικού υλικού L.B. (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1%) εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (15 μg/ml τετρακυκλίνη ή 20 μg/ml στρεπτομυκίνη). Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για 12-16 h στους 37 C υπό ανακίνηση. Με 1 ml από την καλλιέργεια αυτή εμβολιάζουμε 50 ml θρεπτικού υγρού L.B. το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό ανάλογα με το είδος των κυττάρων που χρησιμοποιούμε. Ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C μέχρις ότου αυτή παρουσιάσει απορρόφηση Α 260 = 0.5-0.6. Η καλλιέργεια ψύχεται στον πάγο για 10 min και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση για 20 min στα 3000xg, στους 4 C. Τα κύτταρα αιωρούνται σε 16 ml (που αντιστοιχούν στο 1/3 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος που αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaCl 2, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικού καλίου ph 7.5 και το αιώρημα αφήνεται στον πάγο για 10 min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 20 min στα 3000xg και τα κύτταρα αιωρούνται σε 4 ml του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος (1/12.5 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρημα που προκύπτει μοιράζεται σε κλάσματα των 200 μl και εμβαπτίζεται σε λουτρό που αποτελείται από ξηρό πάγο/αιθανόλη για μικρό χρονικό διάστημα. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα. Β.2.10. Μετασχηματισμός κυττάρων Ε. coli Ο μετασχηματισμός κυττάρων E. coli με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο γίνεται με τη χρήση 2 διαφορετικών τεχνικών ανάλογα με το αν χρησιμοποιούνται κύτταρα BL21(DE3), TOP-10, TOP-10F ή JM109. Στην περίπτωση χρήσης βακτηριακών κυττάρων TOP-10F και BL21 (DE3) το αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων (200 μl) στο οποίο έχουν προστεθεί λίγα μl από το DNA που θέλουμε να εισάγουμε, αφήνεται στον πάγο για 60 min και ακολουθεί επώαση για 2 min στους 37 C. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τριβλίου με θρεπτικό υλικό L.B.-άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται κύτταρα 100

TOP-10 ή JM109 μετά την προσθήκη του DNA αφήνονται στον πάγο για 30 min και υπόκεινται σε θερμικό σοκ για 2 min στους 42 C. Ακολουθεί η προσθήκη 500 μl υγρού θρεπτικού υλικού L.B. και επώαση στους 37 C για 20 min. Μετά από φυγοκέντρηση για 1 min στα 5000xg αφαιρείται το μεγαλύτερο μέρος του υπερκειμένου και γίνεται αιώρηση του ιζήματος των κυττάρων με το υπερκείμενο που εναπομένει. Το αιώρημα απλώνεται με τον ίδιο τρόπο στα τριβλία. Τα τριβλία επωάζονται στους 37 C για 12-16 h ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα που περιέχουν τους ανασυνδιασμένους, με το ξένο DNA, πλασμιδιακούς φορείς. Η επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων γίνεται παρουσία της αμπικιλλίνης διότι οι ανασυνδυασμένοι πλασμιδιακοί φορείς περιέχουν το γονίδιο αντίστασης στο αντιβιοτικό αυτό. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τριβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και αναπτύσσονται εκ νέου σε υγρό θρεπτικό μέσο L.B./αμπικιλλίνης ώστε είτε να απομονώσουμε το πλασμιδιακό DNA, είτε να προχωρήσουμε σε έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Β.2.11. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση Η απομόνωση και ο καθαρισμός του πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα περιλαμβάνει τρία στάδια: την ανάπτυξη της μεταμορφωμένης βακτηριακής καλλιέργειας, τη συλλογή και λύση των κυττάρων και το καθαρισμό του πλασμιδιακού DNA. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας γίνεται με επώαση των βακτηρίων στους 37 C για 16 h σε υγρό θρεπτικό μέσο L.B., παρουσία του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη (100 μg/ml). Η συλλογή των βακτηριακών κυττάρων γίνεται με φυγοκέντρηση στα 4000xg για 10 min και ακολουθεί η αλκαλική λύση τους σύμφωνα με τα εξής: Το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 200 μl διαλύματος GTE (50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) και στο αιώρημα προστίθεται ο διπλάσιος όγκος (400 μl) διαλύματος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 300 μl ψυχρού διαλύματος 3 Μ οξικού καλίου και φυγοκέντρηση στα 12000xg για 5 min. Στο υπερκείμενο που παραλαμβάνεται γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 0.7 όγκου 101

ισοπροπανόλης και παραμονή στους -20 C για 30 min. Το ίζημα που προκύπτει, αιωρείται σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) παρουσία RNase A (20 μg/ml) και το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 20 min. Το DNA εκχυλίζεται με την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης σε αναλογία 25:24:1. Στην υδατική στοιβάδα που απομονώνεται μετά από φυγοκέντρηση στα 12000xg για 5 min, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 2.5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αμμωνίου. Το DNA διαλύεται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου ddh 2 O και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του. Β.2.12. Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας το Kit Qiagen Tip 500 Για την απομόνωση και καθαρισμό πλασμιδιακού DNA με το kit Qiagen-tip 500 ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο: Βακτηριακή καλλιέργεια 500 ml L.B. που περιέχει αμπικιλλίνη (100 μg/ml) αφήνεται να αναπτυχθεί για 16 h στους 37 C και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 5000xg για 10 min. Το ίζημα που απομένει μετά από την απόχυση του υπερκειμένου αιωρείται σε 10 ml διαλύματος Ρ1 (50 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) στο οποίο έχουμε προσθέσει 100 μg/ml RNase A και στη συνέχεια προστίθεται 10 ml διαλύματος Ρ2 (200 mm NaOH, 1% SDS) με απαλή ανάδευση ώστε να καταστεί ομογενές. Μετά από παραμονή 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος προστίθενται 10 ml ψυχρού διαλύματος P3 (3 M οξικό κάλιο ph 5.5) και μετά από απαλή ανακίνηση αφήνεται για 20 min στους 4 C. Η φυγοκέντρηση που ακολουθεί διαρκεί 30 min στα 10000xg ενώ συγχρόνως γίνεται και η εξισορρόπηση της στήλης tip 500 με 10 ml διαλύματος QBT (750 mm NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, 0.15% Triton X-100, ph 7.0). Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης αφού απομακρυνθεί με προσοχή από το σωλήνα φυγοκέντρησης ώστε να μην παραληφθεί συγχρόνως και το κολλώδες ίζημα, διαβιβάζεται από τη στήλη tip 500. Μετά τη διέλευση του υπερκειμένου από τη στήλη, γίνεται πλύση της στήλης, δύο φορές, με 30 ml διαλύματος QC (1.0 M NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, ph 7.0), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν προσμίξεις από την προηγούμενη κατεργασία. Η έκλουση του DNA γίνεται με τη διέλευση διαλύματος QF (1.25 Μ NaCl, 50 mm Tris-ΗCl, 15% αιθανόλη, ph 8.5). Αφού συλλεχθεί το σύνολο του 102

παραπάνω διαλύματος γίνεται κατακρήμνιση του DNA προσθέτοντας 0.7 όγκους ισοπροπανόλης και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 10000xg για 30 min. Μετά από προσεκτική απόχυση του υπερκειμένου γίνεται μια σύντομη πλύση με 5 ml 70% αιθανόλη και το ίζημα που παραλαμβάνεται μετά από νέα φυγοκέντρηση στα 10000xg διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0). Η περιεκτικότητα του διαλύματος σε DNA προσδιορίζεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm και το παρασκεύασμα φυλάσσεται στους -20 C. Β.2.13. Σημειακή in vitro ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη Η μέθοδος στηρίζεται στον υβριδισμό ενός συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου συμπληρωματικού ως προς το μονόκλωνο εκμαγείο στο οποίο γίνεται η σημειακή μετάλλαξη. Το ολιγονουκλεοτίδιο φέρει τη μετάλλαξη στο κέντρο του μορίου, ενώ τα άκρα του παραμένουν συμπληρωματικά ως προς το εκμαγείο. Οι συνθήκες πραγματοποίησης της αντίδρασης είναι τέτοιες, ώστε να ευνοούν τον εξειδικευμένο υβριδισμό του ολιγονουκλεοτιδίου στην επιθυμητή περιοχή του γονιδίου. Η επιμήκυνση της αλυσίδας του DNA γίνεται με εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο από μία DNA πολυμεράση, ενώ η δημιουργία του φωσφοδιεστερικού δεσμού στο χάσμα μεταξύ εκκινητή και κλώνου γίνεται από μία λιγάση. Η επιλογή των μεταλλαγμάτων γίνεται με τη χρήση αντιβιοτικού, στο οποίο ο πλασμιδιακός φορέας προσδίδει ανθεκτικότητα. Για να παραχθούν δίκλωνα μεταλλαγμένα μόρια DNA στα βακτηριακά κύτταρα, τα οποία μεταμορφώνονται με το DNA που φέρει τη μετάλλαξη μόνο στον ένα κλώνο, πρέπει να λείπουν τα γονιδιακά στοιχεία που προκαλούν την in vivo επιδιόρθωση των μεταλλάξεων (κύτταρα ES 1301 muts). Οι δίκλωνοι μεταλλαγμένοι κλώνοι που παραλαμβάνονται από αυτά, μεταμορφώνουν βακτηριακά κύτταρα JM 109 τα οποία επιτρέπουν τη δημιουργία πολλών αντιγράφων πλασμιδιακού DNA. Ο έλεγχος για την ύπαρξη της μετάλλαξης στο γονίδιο έγινε με εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στο Εργαστήριο Μικροχημείας, στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας και Έρευνας (Ι.Τ.Ε., Ηράκλειο, Κρήτη). Συγκεκριμένα στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το Altered Sites R II, in vitro mutagenesis system της εταιρίας Promega. Με βάση το σύστημα αυτό, το 103

κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα p-alter1 γονίδιο της πρωταμίνης 1 (prm1), καθώς και τα cdnas που κωδικοποιούν τα hlbrnt και chlbrnt, αφού έγιναν μονόκλωνα με τη βοήθεια φάγων, υφίστανται τη διαδικασία υβριδισμού με τα αντίστοιχα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (βλ. Πίνακα B.4.). Μετάλλαξη prm1 Ακολουθία μεταλλαγμένου ολιγονουκλεοτιδίου Ser 11 Ala 11 Ser 9 Ala 9 Ser 13 Ala 13 5 P-CTCCTGCTTTTGGCGCGGCAGCATCG-3 5 P-CATCTGCTCCTGGCTTTGCTGCGGCA-3 5 P-CGGCGGCATCTGGCCCTGCTTTTGCT-3 Μετάλλαξη LBRNt Ακολουθία μεταλλαγμένου ολιγονουκλεοτιδίου Phe 125 Glu 125 (human) Glu 112 Phe 112 (chicken) 5 P-GCTGATGCTATTTCCTTCTGGCTTCAGAATCAG-3 5 P-TGGAGCTAAGCTGGTAAACTGAATAATTTTCTT-3 Πίνακας Β.4. Ακολουθία των συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν για την μετάλλαξη των Ser της RS ακολουθίας της πρωταμίνης 1 σε Ala, καθώς και της Phe 125 σε Glu 125 στο hlbrnt και του Glu 125 σε Phe 125 στο chlbrnt. Η αντίδραση υβριδισμού εκτελείται με την προσθήκη 2 μl ssdna (0.1 μg) ως εκμαγείο, 1 μl ολιγονουκλεοτιδίου μετάλλαξης (30 ng/μl), 1 μl Ampicillin Repair Oligo (2.2 ng/μl) το οποίο επαναφέρει την ανθεκτικότητα του πλασμιδίου στην αμπικιλλίνη, και 2 μl 10x διαλύματος υβριδισμού (200 mm Tris-Cl, 100 mm MgCl 2, 500 mm NaCl ph 7.5) σε 14 μl ddh 2 O. Το μίγμα της αντίδρασης αφήνεται για 5 min στους 75 C σε υδατόλουτρο και με απομάκρυνση του σκεύους της επώασης από την πηγή θερμότητας γίνεται αργή ψύξη του μίγματος σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο τρόπος αυτός επιτρέπει τον εξειδικευμένο υβριδισμό του ολιγονουκλεοτιδίου στο εκμαγείο. 104

Σχήμα Β.2. Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας εισαγωγής σημειακών μεταλλάξεων με το in vitro σύστημα Altered Sites II της εταιρίας Promega. Ακολουθεί η σύνθεση του μεταλλαγμένου κλώνου, προσθέτοντας στο μίγμα της αντίδρασης υβριδισμού 3 μl 10x διαλύματος σύνθεσης (100 mm Tris-Cl, 5 mm dntps, 10 mm ATP, 20 mm DTT ph 7.5), 1.2 μl T4 DNA polymerase (BioLabs), 1 μl T4 DNA ligase (BioLabs) και 4.8 μl ddh 2 O. Το διάλυμα επωάζεται για 90 min στους 37 C. Από το διάλυμα σύνθεσης του μεταλλαγμένου κλώνου αφαιρούνται 15 μl με τα οποία μεταμορφώνονται βακτηριακά κύτταρα ES 1301 muts. Αυτά αναπτύσσονται σε τρυβλία LB/άγαρ με 100 μg/ml αμπικιλλίνη και μετά από επιλογή 105

και ανάπτυξη των αποικιών σε υγρό θρεπτικό υλικό LB με αμπικιλλίνη (100 μg/ml), γίνεται απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση. Χρησιμοποιώντας 1 μl του DNA αυτού, μεταμορφώνονται κύτταρα JM 109 και αφού αναπτυχθούν σε τρυβλία LB/άγαρ (100 μg/ml αμπικιλλίνη) γίνεται επιλογή μερικών αποικιών και απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Με εύρεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων διαπιστώνεται η ύπαρξη θετικού μεταλλαγμένου κλώνου σε κάποια αποικία. Οι μεταλλαγμένοι κλώνοι της πρωταμίνης 1 κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-n1 για την παροδική επιμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων, ενώ οι μεταλλαγμένοι κλώνοι των hlbrnt και chlbrnt κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t για την έκφραση στα βακτήρια αντιστοίχων πρωτεϊνών σύντηξης με GST. Β.2.14. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα με υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους κατάλληλους προαγωγούς που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης μ αυτήν. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με στήλη αγχιστείας που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το εκχύλισμα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST με τη γλουταθειόνη, με αποτέλεσμα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται με την προσθήκη διαλύματος γλουταθειόνης σε περίσσεια. Η διαδικασία αυτή έκλουσης εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτημα να γίνεται σε πολύ ήπιες συνθήκες χωρίς να υπάρχει κίνδυνος αλλαγών στη δομή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν με τον τρόπο αυτό είναι οι GSΤ-p53, GST-LBRNt, GST-LBRNt(62-205), GST-LBRNt(92-205), hgst- 106

LBRNt(F E) και chgst-lbrnt(e F). Εκφράστηκαν επίσης η SRPK1 (GST- SRPK1), καθώς και τα τμήματα της πρωτεΐνης SAFB1, GST-SAFB1(1-240), GST- SAFB1(240-600), GST-SAFB1(566-706) και GST-SAFB1(709-915). Σε όλες τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-2t. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα BL21(DE3) που έχουν μεταμορφωθεί με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τριβλία με θρεπτικό υλικό L.B./άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 h στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τριβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού L.B. (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 h στους 37 C. Από την καλλιέργεια που προκύπτει αφαιρούνται 10 ml με τα οποία εμβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού L.B. που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων γίνει ίση με Α 590 =0.6-0.7. Τη δεδομένη χρονική στιγμή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG που ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες, καθώς και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις πρωτεολυτικών ενζύμων. Η επώαση συνεχίζεται για 2-3 h και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 4000xg για 15 min. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 8 ml διαλύματος PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, 1% Triton X-100, 0.1% β-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρημα σε υπέρηχους (UP5OH sonicator) για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά, μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 min στα 8500xg και λαμβάνεται το υπερκείμενο πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Το εκχύλισμα αυτό αναμιγνύεται με το αιώρημα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 min σε θερμοκρασία 4 C, ώστε να δεσμευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 min στα 3000xg και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 min στους 4 C υπό ανάδευση. Στους κόκκους της στήλης που λαμβάνονται μετά από φυγοκέντρηση στα 3000xg για 2 min, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 min η κάθε μία με διάλυμα που περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris-Cl ph 8.0. Τα εκλούσματα που 107

περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης λαμβάνονται με φυγο-κέντρηση στα 3000xg για 2 min και στη συνέχεια φυλάσσονται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης μετά από κάθε χρήση αναγεννάται με τρείς διαδοχικές πλύσεις (30 min η κάθε πλύση) σε όξινο (0.1 M CH 3 COONa, 0.5 M NaCl, ph 4.5) και βασικό (0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-Cl, ph 8.5) διάλυμα, στους 4 C. Στη συνέχεια η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυμα PBST. Β.2.15. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με 6 ιστιδίνες Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται εναλλακτικά για την έκφραση πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα και τον εύκολο καθαρισμό τους. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, την έκφραση της οποίας επιθυμούμε, κλωνοποιείται σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα ο οποίος φέρει εκτός των χαρακτηριστικών εκείνων που εξυπηρετούν την παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγάλες ποσότητες και μια αλληλουχία η οποία κωδικοποιεί έξι συνεχόμενες ιστιδίνες. Έτσι η πρωτεΐνη θα εκφραστεί με μια «ουρά» έξι ιστιδινών στο ένα της άκρο. Η μικρή αυτή αλληλουχία εξυπηρετεί τον εύκολο καθαρισμό της πρωτεΐνης με μια στήλη Ni +2 - αγαρόζης. Η ακολουθία των 6 ιστιδινών έχει τη δυνατότητα να δεσμεύεται στη στήλη δημιουργώντας, μέσω των ιμιδαζολίων, δεσμούς συναρμογής με το δισθενές κατιόν του νικελίου. Παράλληλα στο ρυθμιστικό διάλυμα συνυπάρχει και μια μικρή συγκέντρωση ιμιδαζολίου, ώστε να αποφεύγονται μη εξειδικευμένες άλληλεπιδράσεις με τα συστατικά του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται με την προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου το οποίο συναγωνίζεται με τις έξι ιστιδίνες για τις θέσεις δέσμευσης στο Ni +2. Η πρωτεΐνη που παρασκευάστηκε με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι η HP1b, το γονίδιο της οποίας ήταν κλωνοποιημένο στο φορέα κλωνοποίησης pet-16b. Κύτταρα BL21 μεταμορφωμένα με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τριβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τριβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Με 10 ml από την παραπάνω καλλιέργεια εμβολιάζονται 500 ml LB (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και 108

επωάζονται υπό ανακίνηση στους 37 C έως ότου παρουσιάσει απορρόφηση Α 590 =0.6-0.7. Στην καλλιέργεια προστίθενται 5 mm IPTG και η θερμοκρασία επώασης μειώνεται στους 28 C. Μετά την πάροδο 2 ωρών επώασης της καλλιέργειας υπό ανακίνηση, γίνεται φυγοκέντρηση των κυττάρων για 20 λεπτά σε 4500xg και μετά την απόχυση του υπερκειμένου, τα κύτταρα αιωρούνται σε 8 ml ρυθμιστικού διαλύματος 50 mm Na 2 HPO 4 ph 8.0, 300 mm NaCl και 5 mm ιμιδαζολίου. Το αιώρημα ψύχεται σε λουτρό ξηρού πάγου/αλκοόλης και αφήνεται να ξεπαγώσει σε θερμοκρασία 4 C ώστε να υποβοηθηθεί η ρήξη των μεμβρανών, η οποία γίνεται με τη χρήση υπερήχων για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά, μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να μην υπερθερμανθεί το δείγμα. Στη συνέχεια το αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 min σε 8500xg και παραλαμβάνεται το υπερκείμενο. Η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης στη στήλη Ni +2 -αγαρόζης γίνεται υπό ανακίνηση στους 4 C για 30 min. Ακολουθεί μία πλύση της στήλης για 10 min στους 4 C με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που έγινε η αιώρηση των κυττάρων και 2 πλύσεις των 10 min στην ίδια θερμοκρασία έχοντας αυξήσει τη συγκέντρωση του ιμιδαζολίου στα 50 mm. Η έκλουση της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με την ανακίνηση της στήλης για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 1 ml διαλύματος 50 mm Na 2 HPO 4 ph 8.0, 300 mm NaCl και 300 mm ιμιδαζολίου, δύο συνεχόμενες φορές. Από τα υπερκείμενα, προτού τα φυλάξουμε στους 20 C, παραλαμβάνονται δείγματα των 10 μl, ώστε μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250, να αποφανθούμε για την απόδοση της έκφρασης της πρωτεΐνης. Β.2.16. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός δείγματος πραγματοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύμφωνα με την εξίσωση: v = E * q / f 109

όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του Ν,Ν μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bisακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH-CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα που διαθέτει πόρους που το μέγεθος τους εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού ανάλογα και με τη συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη του υπερθειϊκού αμμωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8 για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για τη διάδοση του. Το σχήμα των πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα με τη συσκευή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στη συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, το πήκτωμα επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για τη συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωμα διαχωρισμού που είναι υπεύθυνο για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώματα είναι διαφορετικά ως προς το ph και τη σύσταση τους. Επίσης το ρυθμιστικό διάλυμα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούμενα. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου). Απουσία τέτοιων παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. 110

Β.2.17. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπο μετουσιωτικές συνθήκες (SDS PAGE) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσει τις πρωτεΐνες δεσμεύεται πάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων κατά τη διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωμα διαχωρισμού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωμα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωμα διαχωρισμού. Οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιμέρους στοιχείων του συστήματος είναι οι εξής: Διάλυμα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris 0.19 M γλυκίνη 0.1% SDS ph 8.9 Πήκτωμα επιστοίβαξης: 5% ακρυλαμίδιο 0.25% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS 0.125 Μ Tris-Cl ph 6.8 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED 111

Πήκτωμα διαχωρισμού: 12% ακρυλαμίδιο 0.62% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS 0.375 Μ Tris-Cl ph 8.9 για τον πολυμερισμό 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων το οποίο αποτελείται από: 0.0625 Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανού της βρωμοφαινόλης Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 μl του διαλύματος αυτού σε 25 μl του μίγματος επώασης. Τα δείγματα θερμαίνονται για 3 min στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDSπρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη που χρησιμοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υπομονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος 30 ma έως τη στιγμή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. Β.2.18. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue R 250 Για να βαφούν οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα που περιέχει 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% μεθανόλη, όπου και ανακινείται για διάστημα 1 h. Στο διάλυμα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται με ανακίνηση σε διάλυμα 10% οξικό οξύ, 10% μεθανόλη. 112

Β.2.19. Αυτοραδιογραφία Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεμπόμενη ακτινοβολία του ισοτόπου που χρησιμοποιείται για την επισήμανση των διάφορων μορίων. Στην περίπτωση των πηκτωμάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωμα ανακινείται για 30 min σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3MM (Whatman International Ltd. Kent, England) υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους. Μία πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger series 900 (Mini Instruments, Essex, UK). Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα. Β.2.20. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western Blot) Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, από την πηκτή προς τη μεμβράνη κατά την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού και στον εγκλωβισμό τους στο πλέγμα της μεμβράνης. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η μεμβράνη και η πηκτή μεταφέρονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) το οποίο αποτελείται από: 12.5 mm Tris-Βορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT. Η τοποθέτηση της στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε τρία χαρτιά Whatman 3MM με τη μεμβράνη προσανατολισμένη στο θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μοντέλο TE-70 113

Semi-Dry Blotter της εταιρίας Hoeffer. Η μεταφορά γίνεται για 1-1.5 h κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος (45-130 ma ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής και των πρωτεϊνών που πρόκειται να μεταφερθούν). Β.2.21. Ανοσοανίχνευση Η ανοσοανίχνευση είναι μια τεχνική που επιτρέπει τον εντοπισμό μιας καθηλωμένης σε μεμβράνη πρωτεΐνης με τη βοήθεια αντισώματος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσμευθεί με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμοδείκτη το οποίο αντιδρώντας με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου. Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρμόσθηκε για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών: SRPK1α (χρησιμοποιήθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο επίτοπο FLAG), p53 (χρησιμοποιήθηκε το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα), SAFB1 (χρησιμοποιήθηκε το a-safb1 μονοκλωνικό αντίσωμα) και πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της (χρησιμοποιήθηκε το a-gfp μονοκλωνικό αντίσωμα). Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν rabbit anti-mouse της εταιρείας Chemicon International Inc., που είναι συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση. Η διαδικασία που εφαρμόζεται, είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Αρχικά η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς εμβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 h σε διάλυμα κορεσμού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), ώστε να κορεστεί η μεμβράνη από τη ζελατίνη και να αποφύγουμε τις μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις της μεμβράνης με το αντίσωμα. Κατόπιν η μεμβράνη επωάζεται με το αντίστοιχο αντίσωμα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 h στους 4 C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 min στη μεμβράνη με διάλυμα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της μεμβράνης για 1 h υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1 : 2000) σε διάλυμα κορεσμού. Αφού η μεμβράνη υποστεί 2 πλύσεις των 10 min με 114

PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromochloroindolyl phosphate) και 30 μl NBT (Nitro Blue Tetrazolium) σε 10ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-Cl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3. Β.2.22. Ανοσοκατακρήμνιση Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης Α (Protein A) του μικροοργανισμού staphylococcus aureus να δεσμεύεται στις ανοσοσφαιρίνες. Σύμφωνα με την τεχνική, η επώαση πρωτεϊνικού εκχυλίσματος με συγκεκριμένο αντίσωμα σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα και τη συμπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του παραπάνω μίγματος σε στήλη σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, εξισορροπημένης στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει ως αποτέλεσμα τη δέσμευση του συμπλόκου αντισώματος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α και την παραλαβή του από το εκχύλισμα. Έτσι με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνουμε τον εξειδικευμένο διαχωρισμό-καθαρισμό της φυσιολογικής μορφής μιας πρωτεΐνης μέσα από ένα μίγμα πρωτεϊνών. Επίσης είναι δυνατόν κάτω από κατάλληλα διαμορφωμένες συνθήκες εφαρμογής της τεχνικής, να συγκαθαριστούν και πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται ισχυρά πάνω στην πρωτεΐνη-στόχο (υποστρώματα, ρυθμιστές, κ.α.), προσφέροντας μια γενική εικόνα των αλληλεπιδράσεων στο φυσιολογικό περιβάλλον της πρωτεΐνης. Τα σφαιρίδια εξισορροπούνται, με 3 πλύσεις των 10 min η καθεμία, σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 1% Triton X-100, 0.1 M NaCl και παραλαμβάνονται μετά από σύντομη φυγοκέντρηση, με απομάκρυνση του ρυθμιστικού διαλύματος. Παράλληλα κατάλληλος όγκος από τα κυτταρικά εκχυλίσματα (ανάλογα με το πείραμα) επωάζονται με ~2 μg αντισώματος, υπό ανακίνηση για χρονικό διάστημα 3 h στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν τα αντισώματα με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν. Μετά το πέρας της διαδικασίας μεταφέρονται σε πλαστικά σωληνάκια με την καθηλωμένη πρωτεΐνη-α 115

στα σφαιρίδια. Η δέσμευση του αντισώματος στα σφαιρίδια διαρκεί 12-16 h και ακολουθούν 3 πλύσεις των 10 min με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε να αποφευχθούν οι τυχόν ασθενείς αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες των εκχυλισμάτων. Όταν μελετήθηκαν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών της πυρηνικής μήτρας (SAFB1) τα κύτταρα λύθηκαν σε διάλυμα RIPA (1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 0,1 % SDS, 150 mm NaCl, 10 mm Na-phosphate ph 7,2, 2 mm EDTA, 50 mm NaF, 5 mm b-glycerolphosphate, 4 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 μg/ml aprotinine) και τα εκχυλίσματα αραιώθηκαν 4 φορές με το διάλυμα RIPA Rescue (10 mm Na-phosphate ph 7,2, 20 mm NaCl, 1 mm NaF, 5 mm β-glycerolphosphate, 2 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 μg/ml aprotinine), πριν έρθουν σε επαφή με τα αντισώματα. Η εξισσορόπηση των σφαιριδίων είχε γίνει επίσης με διάλυμα RIPA Rescue. Τέλος ακολουθησαν 3 πλύσεις των 10 min στους 4 ο C με το διάλυμα HNTG (50 mm HEPES ph 7,5, 150 mm NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mm EDTA, 100 mm NaF, 10% glycerol, 2 mm sodium orthovanadate, 1mM PMSF, 20 μg/ml aprotinine). Στα σφαιρίδια με τις ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες έγινε ανοσοανίχνευση για να ανιχνεύσουμε τις πρωτεΐνες που κατακρημνίστηκαν. Πριν τα δείγματα αναλυθούν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και ακολούθως θερμαίνονται στους 100 C για 3 min ώστε να διασπαστούν τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος. Β.2.23. Πειράματα συγκατακρήμνισης (Pulldown assays) Τα πειράματα συγκατακρήμνισης συνιστούν μία μέθοδο, η οποία επιτρέπει τη διερεύνηση της δυνατότητας των διαφόρων πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, Μας δίνει επίσης και μία πρώτη εκτίμηση για το πόσο ισχυρή είναι η αλληλεπίδραση αυτή. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στη δυνατότητα καθήλωσης διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης (π.χ με GST) στα σφαιρίδια των αντίστοιχης στήλης χρωματογραφίας (γλουταθειόνη-σεφαρόζη) με την οποία παρουσιάζει αγχιστεία. Η καθηλωμένη πρωτεΐνη μπορεί να δεσμεύσει άλλες πρωτεΐνες οι οποίες είτε βρίσκονται σε καθαρή μορφή, είτε περιέχονται σε συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και με τις οποίες 116

παρουσιάζει αγχιστεία. Η διαδικασία γίνεται παρουσία σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων ή/και απορρυπαντικών ώστε να αποφεύγονται τυχαίες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα εκχυλίσματα, και οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε εσφαλμένα συμπεράσματα. Στην παρούσα εργασία ως μέσο καθήλωσης χρησιμοποιήθηκε, κατά κύριο λόγο, η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης για τη δέσμευση πρωτεϊνών που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης. Στα πειράματα αναφοράς έγινε δέσμευση καθαρής GST στα σφαιρίδια. Η διαδικασία που ακολουθείται σε κάθε περίπτωση είναι σε γενικές γραμμές η ακόλουθη: Αρχικά δεσμεύεται η πρωτεΐνη σύντηξης ή η καθαρή GST στα σφαιρίδια της στήλης για 1 h, στους 4 C, σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα όπως ορίζεται σε κάθε περίπτωση. Το υπερκείμενο της στήλης απομακρύνεται μετά από φυγοκέντρηση στα 12000xg και τα σφαιρίδια της στήλης πλένονται 2 φορές με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για 10 min στους 4 C. Στη συνέχεια μία συγκεκριμένη ποσότητα από τις πρωτεΐνες των οποίων η αλληλεπίδραση πρόκειται να ελεγχθεί αραιώνεται στιο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και επωάζεται με τα σφαιρίδια της στήλης, όπου είναι καθηλωμένη η GST-πρωτεΐνη, υπό ανακίνηση για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση στα 12000xg και απομάκρυνση του υπερκειμένου, ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων των 10 min η κάθε μία, στους 4 C, πάλι στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολούθως, απομακρύνεται όλο το υγρό από τα σφαιρίδια της στήλης και επαναιωρούνται σε 25 μl νερού. Αφού προστεθούν 2 μl DTT 1 M και 6 μl από το διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων, τα δείγματα θερμαίνονται για 5 min στους 90 C και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών γίνεται με δύο τρόπους. Όταν πρόκειται για υπερεκφρασμένες πρωτεΐνες μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή βάφεται με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύονται με τη χρώση. Όταν πρόκειται για πρωτεΐνες, από εκχυλίσματα ευκαρυωτικών κυττάρων μετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση με το αντίστοιχο αντίσωμα της πρωτεΐνης στόχου. 117

Β.2.24. In vitro φωσφορυλίωση υποστρωμάτων από την SRPK1 Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα το ανασυνδυασμένο αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBRNt) και η πρωταμίνη 1. Το μίγμα επώασης περιλαμβάνει 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 25 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Περιέχονται επίσης 0.2-0.5 μg ανασυνδυασμένη GST-SRPK1 και ~2 μg υποστρώματος. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 μl και ρυθμίζεται με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη 2 Ο. Τα δείγματα επωάζονται για 30 min σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται. Ακολουθεί βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και αποχρωματισμός της. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. Στην περίπτωση που θέλουμε να επιτύχουμε όσο το δυνατόν στοιχειομετρική φωσφορυλίωση, προκειμένου να μελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις του φωσφορυλιωμένου υποστρώματος, η επώαση έγινε για 2 h στους 30 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl2 παρουσία 0.5 mm ATP. Β.2.25. Έμμεσος ανοσοφθορισμός Φθορισμός με GFP Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός έγινε σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα (Maison et al., 1993; Meier and Georgatos, 1994). Τα συγκεκριμένα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Ανατομίας και Ιστολογίας, της Κτηνιατρικής Σχολής, του Α.Π.Θ., με την βοήθεια και συμπαράσταση του Δρ. Ι. Σανίδα. Η πειραματική διαδικασία έχει ως εξής: Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με ΡΒS και τοποθετηθήκαν σε καλυπτρίδες. Ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων με 1% φορμαλδεΰδη σε PBS, για 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η εξουδετέρωση των καταλοίπων της φορμαλδεΰδης έγινε με 50 mm NH 4 Cl σε PBS. Η διαπερατότητα των κυττάρων επιτεύχθηκε με επώαση με permeabilization buffer (150 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 2 mm MgCl 2, 0.2% Triton X-100, 0.5% FSG και 0.5 mm PMSF), για 20 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η FSG (fish skin gelatin) χρησιμοποιήθηκε για να αποτραπεί η μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων. Ακολούθησε επώαση με το πρώτο αντίσωμα για 1 h σε θερμοκρασία 118

περιβάλλοντος, 4 διαδοχικές πλύσεις με blocking buffer (150 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 2 mm MgCl 2, 0.5% FSG και 0.5 mm PMSF) και επώαση με το δεύτερο αντίσωμα για 45 min, επίσης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η διαδικασία της επώασης με τα αντισώματα γίνεται εις διπλούν στην περίπτωση των διπλών ανοσοφθορισμών. Στην συνέχεια, τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη, για 10 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι καλυπτρίδες τελικά πλύθηκαν 3 φορές με PBS και τοποθετήθηκαν πάνω σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Για να προστατευθεί ο φθορισμός χρησιμοποιήθηκε ο παράγοντας Vectashield. Τέλος, η μελέτη των δειγμάτων, καθώς και η λήψη φωτογραφιών, έγινε σε συνεστιακό μικροσκόπιο Nikon. Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αραιωμένα σε blocking buffer. Τα πρώτα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν στις ακόλουθες αραιώσεις: a-safb1 monoclonal 1:150, a-p53 polyclonal (FL-393) 1:50. Ως δεύτερα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν FITC-conjugated goat anti-mouse, σε αραίωση 1:400 (πράσινο χρώμα) και RRX-conjugated goat anti-rabbit, σε αραίωση 1:350 (κόκκινο χρώμα). Στην περίπτωση απλού φθορισμού με GFP μετά την επώαση με permeabilization buffer ακολουθούν πλύσεις με PBS, επώαση με 0.2 u/μl RNAse για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου, χρώση του DNA με 1 mg/ml ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodide) και μονιμοποίηση με 4% φορμαλδεΰδη. Ο ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού είχε γίνει από τον Δρ. Η. Μυλωνή στο Εργαστήριο του Dr. Paolo Sassone- Corsi (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg, France). Β.2.26. Μέτρηση μεταγραφικής ενεργότητας της πρωτεΐνης p53 Στα πειράματα παροδικής επιμόλυνσης η δραστικότητα του ενζύμου CAT (Chloramphenicol AcetylTransferase) χρησιμοποιείται ως μέτρο ένδειξης της ενεργότητας του υποκινητή, ο οποίος είναι κλωνοποιημένος ανοδικά του γονιδίου αναφοράς CAT. Στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε τμήμα του υποκινητή του γονιδίου p21, που αποτελεί έναν από τους κεντρικούς μεταγραφικούς στόχους της πρωτεΐνης p53. Στο τμήμα αυτό του υποκινητή προσδένεται η πρωτεΐνη p53, που παράγεται μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα 119

(χρησιμοποιήθηκαν Κ562 κύτταρα τα οπόια δεν εκφράζουν καθόλου ενδογενή p53), ενεργοποιώντας έτσι τη μεταγραφή του γονιδίου αναφοράς, οπότε ο βαθμός έκφρασης του ενζύμου CAT αναλογεί στην μεταγραφική ενεργότητα του p53. Η μέθοδος στηρίζεται στο γεγονός ότι το ένζυμο CAT καταλύει τη μεταφορά ακετυλομάδων από το ακέτυλο-συνένζυμο Α (Acetyl-CoA) στη χλωραμφαινικόλη. Στα πειράματα χρησιμοποιείται ραδιενεργά επισημασμένη χλωραμφαινικόλη ( 14 C- χλωραμφαινικόλη) και η ακετυλιωμένη μορφή διαχωρίζεται από την μη ακετυλιωμένη με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Gorman et al., 1982). Η πειραματική διαδικασία έχει ως εξής: Κ562 κύτταρα συνεπιμολύνονται, με την μέθοδο της ηλεκτροδιάχυσης, με 2 μg πλασμιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς CAT [(-2325/+8) p21-cat], 3 μg pcmv β-gal που εκφράζει τη β- γαλακτοσιδάση, 0.5 μg pcdna3/ha-p53 που εκφράζει την πρωτεΐνη p53 και ανάλογα με το πείραμα αυξανόμενες ποσότητες (1, 2 και 3 μg) από το πλασμίδιο pgfp3-safb1 που εκφράζει την πρωτεΐνη SAFB1. Τα κύτταρα συλλέγονται 40 h μετά την επιμόλυνση σε ρυθμιστικό διάλυμα TEN (40 mm Tris-ΗCl ph 7,4, 1 mm EDTA ph 8, 150 mm NaCl). Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 6000xg για 2 min και επαναιώρηση του ιζήματος σε 100 μl 0,25 M Tris-ΗCl ph 7,8. Για την πλήρη λύση των κυττάρων το ίζημα ψύχεται και αποψύχεται 3 φορές (5 min στο υγρό άζωτο και 5 min στους 37 o C). Στη συνέχεια τα λυμένα κύτταρα φυγοκεντρούνται στα 12000xg για 5 min και το υπερκείμενο φυλάσσεται στους 20 o C (Manley et al., 1980). Ο προσδιορισμός της δραστικότητας της β-γαλακτοσιδάσης στα κυτταρικά εκχυλίσματα χρησιμοποιείται ως εσωτερικός μάρτυρας στα πειράματα παροδικής επιμόλυνσης, με σκοπό την εξομάλυνση των διαφορών που παρατηρούνται μεταξύ των κυττάρων ως προς την ικανότητα επιμόλυνσης. H ενζυμική αντίδραση πραγματοποιείται σε όγκο 150 μl και περιλαμβάνει: 70 μl 1 M Tris-ΗCl ph 7,8, 0,3 μci 14 C-χλωραμφαινικόλη (ICN Pharmaceuticals Ltd, UK), 20 μl 4 mm Acetyl-CoA (Amersham Pharmacia Biotech) και το υπόλοιπο του όγκου συμπληρώνεται με ένα μείγμα αποτελούμενο από το κυτταρικό εκχύλισμα και 0,25 Μ Tris-ΗCl ph 7,8, σε διαφορετικές ποσότητες ανάλογα με την απόδοση της επιμόλυνσης για κάθε δείγμα. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 1,5 h και στη συνέχεια προστίθενται 200 μl οξικού αιθυλεστέρα (ethyl acetate). Τα δείγματα αναμιγνύονται και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 13000xg για 30 sec για να διαχωριστεί η οργανική από την υδατική φάση. Η οργανική φάση περιέχει την ακετυλιωμένη χλωραμφαινικόλη και 120

μεταφέρεται σε νέους σωλήνες για λυοφίλιση για 45 min. Στη συνέχεια προστίθενται 15 μl οξικού αιθυλεστέρα και τα δείγματα επιστοιβάζονται σε T.L.C πλάκα επικαλυμμένη με πυρίτιο (Silica Gel IB2 Baker-flex). Ακολουθεί χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας η οποία πραγματοποιείται σε 200 ml διαλύματος χλωροφορμίου/μεθανόλης σε αναλογία 19:1. Στη συνέχεια, η T.L.C. πλάκα μεταφέρεται σε κασέτα αυτοραδιογραφίας, τοποθετείται φιλμ (Kodak X-OMAT S) και η ανάλυση του αποτυπώματος του φιλμ γίνεται με ηλεκτρονικό σαρωτή (phosphorimager). Στο φιλμ αποτυπώνονται 4 σήματα πάνω από το σημείο φόρτωσης των δειγμάτων (origin) που από κάτω προς τα πάνω είναι: η μη ακετυλιωμένη χλωραμφαινικόλη, ακολουθούν οι δύο μορφές της ακετυλιωμένης χλωραμφαινικόλης και τέλος όταν η μεταγραφική ενεργότητα είναι έντονη, η δι-ακετυλιωμένη μορφή της χλωραμφαινικόλης. Τα αριθμητικά δεδομένα που περιλαμβάνονται στα διαγράμματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Οι μετρήσεις μεταγραφικής ενεργότητας πραγματοποιήθηκαν από την Έλενα Αγγελίδου στο Εργαστήριο της Μ. Χατζοπούλου (Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.). Β.2.27. Σύστημα δυο υβριδίων Η τεχνική των δύο υβριδίων βασίζεται στην αρχή ότι κάθε μεταγραφικός παράγοντας περιέχει δύο περιοχές: μία περιοχή δέσμευσης στο DNA και μια περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής. Στο σύστημα της ζύμης έχει εισαχθεί ένα γονίδιο αναφοράς του οποίου η έκφραση προσδίδει κάποιο φαινότυπο στα κύτταρα της ζύμης (όπως αντίσταση σε αντιβιοτικά ή επιβίωση σε περιβάλλον έλλειψης απαραίτητων αμινοξέων) και βρίσκεται υπό τον έλεγχο του προαναφερθέντα μεταγραφικού παράγοντα. Για να διαπιστώσουμε αν δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν συνδέουμε το τμήμα του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή δέσμευσης στο DNA, στο γονίδιο που κωδικοποιεί την πρώτη πρωτεΐνη και το τμήμα του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής, στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη δεύτερη πρωτεΐνη. Με τον τρόπο αυτό και εφ όσον οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν ο μεταγραφικός παράγοντας επανασυγκροτείται και γίνεται ενεργός, οπότε έχουμε έκφραση του γονιδίου αναφοράς και εμφάνιση του φαινοτύπου. Επιπλέον, το ποσοστό της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς αποτελεί μέτρο της αγχιστείας μεταξύ των δύο 121

πρωτεϊνών. Αν τώρα στο τμήμα του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή δέσμευσης στο DNA συνδέσουμε το γονίδιο της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει και στο τμήμα του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής, ένα πλήθος από άλλα γονίδια, τα προϊόντα των οποίων θέλουμε να δούμε αν αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει, έχουμε ένα εύχρηστο εργαλείο εύρεσης αλληλεπιδράσεων που ονομάζεται σύστημα των δύο υβριδίων. Στην περίπτωση μας το Ν-τελικό τμήμα της SRPK1a μεγέθους 528 bp πολλαπλασιάστηκε με PCR (νοηματικός εκκινητής: 5 -CTGGAATTCATGGAGCGG AAAGGTGAGCGGGG-3, αντινοηματικός εκκινητής: 5 -CTAGAAGCTTCACTG CAGGAGAGAGGGATGG-3 ), κόπηκε με την ενδονουκλεάση περιορισμού BamHI, και κλωνοποιήθηκε σε BamHI και SmaI θέσεις του πλασμιδιακού φορέα pgbt9 (Clontech) σε ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο με την περιοχή δέσμευσης του DNA του μεταγραφικού παράγοντα GAL4. Στη συνέχεια τo στέλεχος pj69-4a του S. cerevisiae (MATa trp1-901 leu2-3, 112 ura3-52, his3-200 gal4δ gal80δ LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2::gal7-lacz) (James et al., 1996) συνεπιμολύνθηκε με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pgbt9-srpk1a και ένα ισομοριακό μίγμα των Ε9.5 και Ε10.5 εμβρυϊκών cdna βιβλιοθηκών από ποντίκι, ως γονίδια σύντηξης με την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής του GAL4 μεταγραφικού παράγοντα κλωνοποιημένα στον πλασμιδιακό φορέα pvp16 (Hollenberg et al., 1995). Οι θετικοί κλώνοι μεγάλωσαν σε SC (Synthetic Complete) θρεπτικό μέσο από το οποίο απουσίαζε η τρυπτοφάνη, η λευκίνη και η ιστιδίνη ενώ περιείχε 11,25 μμ Ade και 3 mm AT (3-Amino Triazole) (Rose et al., 1990). Στη συνέχεια απομονώθηκε το ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό DNA των θετικών κλώνων και έγινε εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδίων που περιείχαν. Για να ελεγχθεί και να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων οι θετικοί κλώνοι ελέγχθηκαν με ανάλογη διαδικασία για την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με την SRPK1 που επίσης είχε κλωνοποιηθεί στον πλασμιδιακό φορέα pgbt9. Οι κλωνοποιήσεις και η εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδίων των θετικών κλώνων έγιναν από την Ε. Νικολακάκη, ενώ τα πειράματα αλληλεπίδρασης με το σύστημα των δύο υβριδίων από την Ε. Γεωργάτσου (Εργαστήριο Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας). 122

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. H πρωτεϊνική κινάση SRPK1a βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Καταστολή της μεταγραφικής ικανότητας της πρωτεΐνης p53 μετά από αλληλεπίδραση της με την πρωτεΐνη SAFB1 Γ.1.1. Αλληλεπίδραση του επιπλέον τμήματος της SRPK1a με τις πρωτεΐνες SAFB1 και p53 στο σύστημα των δυο υβριδίων στη ζύμη Είναι γνωστό ότι η λειτουργικότητα και η εξειδίκευση των διαφόρων μονοπατιών μεταφοράς σήματος (signal transduction pathways) στηρίζεται στις εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις των συστατικών που τα απαρτίζουν. Προκειμένου λοιπόν να κατανοήσουμε καλύτερα το βιολογικό ρόλο της SRPK1a και να διαπιστώσουμε σε ποια μονοπάτια μεταφοράς σήματος συμμετέχει, προσπαθήσαμε να βρούμε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν εξειδικευμένα με την SRPK1a, χρησιμοποιώντας το σύστημα των δύο υβριδίων στη ζύμη. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε ως δόλωμα (bait) τo επιπλέον τμήμα των 171 αμινοξέων της SRPK1a (SRPK1a(1-175)), το οποίο και δεν υπάρχει στην SRPK1. Το τμήμα αυτό κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgbt9, σε ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο με την περιοχή δέσμευσης του DNA του μεταγραφικού παράγοντα GAL4. Στη συνέχεια τo στέλεχος pj69-4a του S. cerevisiae συνεπιμολύνθηκε με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pgbt9-srpk1a(1-175) και ένα ισομοριακό μίγμα Ε9.5 και Ε10.5 εμβρυϊκών cdna βιβλιοθηκών από ποντίκι, των οποίων τα γονίδια είχαν κλωνοποιηθεί στον πλασμιδιακό φορέα pvp16, με τέτοιο τρόπο ώστε να εκφράζουν πρωτεΐνες σύντηξης με την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής του GAL4 μεταγραφικού παράγοντα. Μετά από έλεγχο ~8 10 6 ανασυνδυασμένων κλώνων απομονώθηκαν περίπου 20 κλώνοι οι οποίοι μεγάλωσαν στο θρεπτικό μέσο επιλογής και οι οποίοι έδωσαν μετρήσιμη δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης. Οι τρεις κλώνοι που έδωσαν την ισχυρότερη αλληλεπίδραση, μετά από εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τους και έρευνα στη βάση δεδομένων BLAST, ταυτοποιήθηκαν ως διάφορα τμήματα του γονιδίου που κωδικοποιεί την 123

πρωτεΐνη SAFB1, μία πρωτεΐνη συνδεδεμένη με την πυρηνική μήτρα (EMBL data bank accession number ΑF056324). Με βάση τις αλληλουχίες του γονιδίου SAFB1 που απομονώθηκαν με το σύστημα των δύο υβριδίων, προκύπτει ότι το C-τελικό τμήμα της πρωτεΐνης, που περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 585-720, είναι αρκετό για την αλληλεπίδραση με την N-τελική περιοχή της SRPK1a. Η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται να είναι εξειδικευμένη δεδομένου ότι και οι τρεις κλώνοι που απομονώθηκαν έδειξαν μια πολύ ασθενή αλληλεπίδραση με την SRPK1 (Nikolakaki et al., 2001, Διδακτορική διατριβή Φίλιππου Πεΐδη, 2006). H αλληλεπίδραση της SRPK1a με την πρωτεΐνη SAFB1 επιβεβαιώθηκε τόσο in vitro, χρησιμοποιώντας δοκιμασίες συγκατακρήμνισης, όσο και in vivo με πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης (Nikolakaki et al., 2001, Διδακτορική διατριβή Φίλιππου Πεΐδη, 2006). Δύο από τους κλώνους που επίσης έδωσαν αλληλεπίδραση με τo επιπλέον τμήμα των 171 αμινοξέων της SRPK1a μετά από εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τους και έρευνα στη βάση δεδομένων BLAST, ταυτοποιήθηκαν ως διάφορα τμήματα του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p53 (EMBL data bank accession number AF161020.1). Και αυτή η αλληλεπίδραση φαίνεται να είναι εξειδικευμένη, δεδομένου ότι και οι δύο κλώνοι που απομονώθηκαν έδειξαν μια πολύ ασθενή αλληλεπίδραση με την SRPK1 (βλ. και σχήμα Γ.1). 50 mm AT 5 mm AT Σχήμα Γ.1. Η SRPK1a αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53 στη ζύμη. Το στέλεχος pj69-4a του S. Cerevisiae συνεπιμολύνθηκε με A) pgbt9-srpk1a(1-175) και pvp16-p53, B) pgbt9 και pvp16-124

p53, C) pgbt9-srpk1 και pvp16, D) pgbt9-srpk1 και pvp16-p53, E) pgbt9 και pvp16 και F) pgbt9-srpk1a(1-175) και pvp16. Τα στελέχη απλώθηκαν με την ίδια σειρά στα τριβλία που περιείχαν SC μείον Trp, Leu, Ade και His και 50 mm AT (αριστερά) ή SC μείον Trp, Leu, Ade και His και 5 mm AT (δεξιά). Γ.1.2. Κλωνοποίηση και υπερέκφραση της πρωτεΐνης p53 σε βακτήρια To γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p53 μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Αναπληρωτή Καθηγητή Δ. Καρδάση (Τμήμα Ιατρικης, Πανεπιστήμιο Κρήτης), κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pcdna3/ha. Για την έκφραση της πρωτεΐνης p53, ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST έγινε κοπή του γονιδίου από τον πλασμιδιακό φορέα pcdna3/ha με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoRI και BamHI και καθαρισμός του ενθέματος ύστερα από ηλεκτροφόρησή του σε πήκτωμα αγαρόζης. Ακολούθησε κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t που είχε κοπεί με τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες περιορισμού και υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε βακτήρια E. coli XL1/B. Ο μετασχηματισμός των βακτηριακών κυττάρων με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.10. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας, η έκφραση και ο καθαρισμός της Σχήμα Γ.2. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης του προϊόντος κοπής του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα pgex-2t-p53 από τις ενδονουκλεάσες περιορισμού BamHI και ΕcoRI. Η κοπή μας δίνει δύο ζώνες (διαδρομή 1), μία 4900 bp (πλασμιδιακός φορέας) και μία 1179 bp (ένθεμα). Στη διαδρομή 2 έχουν τρέξει μάρτυρες μοριακής μάζας. 125

πρωτεΐνης p53 ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST ακολούθησε το γενικό σχήμα που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.14. Η επαγωγή της έκφρασης στους 28 ο C με 0.2 mm IPTG έγινε για χρονικό διάστημα 2 ωρών γιατί επαγωγή για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα είχε ως αποτέλεσμα την εκτεταμένη πρωτεόλυση της πρωτεΐνης. Από τα εκλούσματα της στήλης σεφαρόζης-γλουταθειόνης παραλαμβάνονται 10 μl τα οποία αφού αραιωθούν σε τελικό όγκο 25 μl με H 2 O, ηλεκτροφορούνται κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η επιτυχής έκφραση της πρωτεΐνης ταυτοποιείται μετά από βαφή της πηκτής με χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250. Σχήμα Γ.3. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της πρωτεΐνης p53 ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST. Η βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με Coomassie Brilliant Blue R-250. Η πρωτεΐνη σύντηξης εμφανίζεται στην πηκτή με μοριακή μάζα ~82 kda, ενώ η ζώνη λίγο κάτω από τα 68 kda αντιπροσωπεύει προϊόν πρωτεόλυσης της GST-p53. Γ.1.3. In vitro αλληλεπίδραση SRPK1a και p53 Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι η SRPK1a αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53 χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασίες συγκατακρήμνισης. Σε στήλη γλουταθειόνηςσεφαρόζης καθηλώθηκαν ~3 μg από την πρωτεΐνη σύντηξης GST-p53 και ανάλογη ποσότητα καθαρής GST. Ο έλεγχος της αλληλεπίδρασης της SRPK1a με τις καθηλωμένες πρωτεΐνες έγινε με προσθήκη σε κάθε περίπτωση στα σφαιρίδια της στήλης 60 μl από κυτταρικό εκχύλισμα 293Τ κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η κινάση ως πρωτεΐνη σύντηξης με την FLAG ακολουθία. Η επώαση των καθηλωμένων GST-p53 και GST με τα κυτταρικά εκχυλίσματα έγινε σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος 25 mm Hepes ph 7,5, 150 mm NaCl, 1% Triton X-100. Μετά από συνεχή ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και τρεις πλύσεις με το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης οι πρωτεΐνες που δεσμεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Η δεσμευμένη SRPK1a ανιχνεύθηκε έπειτα από 126

ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιμοποιώντας το Μ5 μονοκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει το FLAG επίτοπο. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.4, η SRPK1a δεσμεύεται στην πρωτεΐνη σύντηξης GST-p53 ενώ δεν δεσμεύεται σε καθαρή GST. Σε ανάλογα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση της SRPK1 με την πρωτεΐνη p53 (αποτελέσματα που δεν δείχνονται). Σχήμα Γ.4. In vitro δέσμευση της SRPK1a στην πρωτεΐνη GST-p53. Ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην FLAG ακολουθία της FLAG-SRPK1a, υπερεκφρασμένης σε κύτταρα 293Τ που συγκατακρημνίστηκε με την πρωτεΐνη σύντηξης GST-p53 (διαδρομή 3) αλλά όχι με την καθαρή GST (διαδρομή 2). Στη πρώτη διαδρομή έτρεξαν 20 μl (1/5 του όγκου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα συγκατακρήμνισης) κυτταρικού εκχυλίσματος 293Τ κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η FLAG-SRPK1a Γ.1.4. In vivo αλληλεπίδραση SRPK1a και p53 Η αλληλεπίδραση μεταξύ SRPK1a και p53 καταδείχθηκε επίσης in vivo με πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης (σχήμα Γ.5) Για το λόγο αυτό 293Τ κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με πλασμιδιακούς φορείς που εκφράζουν FLAG-SRPK1a και HA (hemaglutinin)-p53. Το σύμπλοκο μεταξύ SRPK1a και p53 ανοσοκατακρημνίστηκε με το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στο επίτοπο FLAG και αναλύθηκe σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και η πρωτεΐνη p53 ανιχνεύθηκε με κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα (DO-1). Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.5, όταν τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με FLAG-SRPK1a και HA-p53, μία ζώνη με φαινόμενη μοριακή μάζα ~55 kda που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη p53 ανιχνεύθηκε στο ανοσοκατακρήμνισμα με αντι-flag αντίσωμα (σχήμα Γ.5, διαδρομή 3), υποδεικνύοντας μία σταθερή αλληλεπίδραση μεταξύ p53 και SRPK1a. Όταν στη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιήθηκε ένα άσχετο αντί-gfp 127

μονοκλωνικό αντίσωμα η ζώνη των ~55 kda δεν εμφανίστηκε στο ανοσοκατακρήμνισμα (σχήμα Γ.5, διαδρομή 2), αποκλείοντας έτσι την πιθανότητα της μη εξειδικευμένης ανοσοκατακρήμνισης της πρωτεΐνης p53. Σχήμα Γ.5. 293Τ κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με πλασμίδια που υπερέκφραζαν FLAG-SRPK1a και HA-p53. Τα σύμπλοκα μεταξύ p53 και SRPK1a ανοσοκατακρημνίστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στο επίτοπο FLAG και αναλύθηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και η πρωτεΐνη p53 ανιχνεύθηκε με το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα (διαδρομή 3). Δεν παρατηρήθηκε καθόλου κατακρήμνιση της πρωτεΐνης p53 όταν στη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιήθηκε ένα anti-gfp μονοκλωνικό αντίσωμα ως control (διαδρομή 2). Μία σταθερή ποσότητα κυτταρικού εκχυλίσματος, το 1/10 της οποίας φαίνεται στη διαδρομή 1, χρησιμοποιήθηκε σε κάθε δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης. Γ.1.5. Υποκυτταρική κατανομή των p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα Καμία από τις δύο πρωτεΐνες που βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με την SRPK1a (p53, SAFB1) δεν αποτελεί υπόστρωμα της κινάσης αφού και οι δύο στερούνται RS αλληλουχιών. Έτσι, σε μια πρώτη προσέγγιση αποφασίσαμε να ελέγξουμε αν υπάρχει κάποιου είδους συσχέτιση ανάμεσα στις δύο αυτές πρωτεΐνες. Η πρωτεΐνη SAFB1 έχει βρεθεί να είναι συνδεδεμένη στο μεγαλύτερο ποσοστό της με την πυρηνική μήτρα (Renz and Fackelmayer, 1996). Προκειμένου να διαπιστώσουμε αν κάτι ανάλογο συμβαίνει και με την πρωτεΐνη p53 θελήσαμε να ελέγξουμε την υποκυτταρική της εντόπιση. Για το σκοπό αυτό, HepG2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε υποκυτταρική κλασμάτωση (σχήμα Γ.6, βλ. αναλυτικά παράγραφο Β.2.1.). 128

Κύτταρα NP-40, 0.4%, 10 min, 4 o C Πυρήνες Κυτταροπλασματικές Πρωτεΐνες Θειϊκό Αμμώνιο, 250 mm, 5 min, 4 o C Εκχυλισμένοι πυρήνες Πυρηνικές Πρωτεΐνες DNAse I, 100U, 1 h, 32 o C Πυρηνικό ικρίωμα Χρωματινικές Πρωτεΐνες Σχήμα Γ.6. Πρωτόκολλο υποκυτταρικής κλασμάτωσης ευκαρυωτικών κυττάρων. Απομονώθηκαν τέσσερα κλάσματα: το κυτταρόπλασμα, το διαλυτό πυρηνόπλασμα, το κλάσμα των πρωτεϊνών που εκχυλίστηκαν από την χρωματίνη μετά από κατεργασία με DNAse I και τέλος το κλάσμα της πυρηνικής μήτρας. Ποσότητες από τα διάφορα κλάσματα, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθμό κυττάρων, ηλεκτροφορήθηκαν, υπέστησαν ανοσοαποτύπωση και ελέγχθηκαν για την ανίχνευση των πρωτεϊνών p53 και SAFB1 με τη βοήθεια των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.7 η πρωτεΐνη SAFB1 κατανέμεται κυρίως στο κλάσμα της πυρηνικής μήτρας και στο νουκλεόπλασμα. Αντίθετα το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης p53 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και ένα μικρό ποσοστό της εντοπίζεται στο νουκλεόπλασμα και στο κλάσμα της πυρηνικής μήτρας. 129

Σχήμα Γ.7. Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνών p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα. Απομονώθηκαν τέσσερα κλάσματα: το κυτταρόπλασμα, το διαλυτό πυρηνόπλασμα το κλάσμα των πρωτεϊνών που εκχυλίστηκαν από την χρωματίνη μετά από κατεργασία με DNAse I και το κλάσμα της πυρηνικής μήτρας. Ποσότητες από τα τέσσερα κλάσματα (5-20 μl), που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθμό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες p53 και SAFB1 ανιχνεύθηκαν με κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα (DO-1 και anti-safb1 αντίστοιχα). Γ.1.6. Υποκυτταρική κατανομή των p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα μετά από επίδραση μιθραμυκίνης και 5 φθοροουρακίλης Η 5-φθοροουρακίλη (5-FU) και η μιθραμυκίνη έχει βρεθεί ότι προκαλούν σημαντική απόπτωση στα HepG2 κύτταρα, επάγοντας την πρωτεΐνη p53 (Longley et al., 2003). Επαναλάβαμε λοιπόν την υποκυτταρική κατανομή των p53 και SAFB1 παρουσία των φαρμάκων 5-FU και μιθραμυκίνης. H προσθήκη των φαρμάκων είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης της p53 στον πυρήνα και συγκεκριμένα στο νουκλεόπλασμα και στο κλάσμα των πρωτεϊνών που παραμένουν συνδεδεμένες με την πυρηνική μήτρα, ενώ δεν παρατηρήθηκε ουσιαστική μεταβολή στο κυτταροπλασματικό κλάσμα της πρωτεΐνης p53 (σχήμα Γ.8.Β). Στην περίπτωση της πρωτεΐνης SAFB1 η προσθήκη των φαρμάκων δεν είχε ουσιαστική επίδραση στην υποκυτταρική της κατανομή. 130

Σχήμα Γ.8. Μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης και στην υποκυτταρική κατανομή της πρωτεΐνης p53, μετά από έκθεση HepG2 κυττάρων σε 5-φθοροουρακίλη για 36 h. Ποσότητες από τα κλάσματα του κυτταροπλάσματος, του νουκλεοπλάσματος, της DNAseI και της πυρηνικής μήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθμό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Η κατανομή των πρωτεϊνών p53 και SAFB1 μελετήθηκε στα διάφορα κλάσματα με ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιμοποιώντας τα μονοκλωνικά αντισώματα DO-1 και a-safb1 αντίστοιχα. Πάνω: control HepG2 κύτταρα. Κάτω: HepG2 κύτταρα στα οποία είχε προστεθεί 50 μg/ml 5-FU (παρόμοια εικόνα έδωσε και η προσθήκη μιθραμυκίνης). Γ.1.7. In vivo αλληλεπίδραση μεταξύ p53 και SAFB1 Δεδομένου ότι παρατηρήθηκε σημαντική συνεντόπιση των πρωτεϊνών p53 και SAFB1 ιδίως μετά από κατεργασία HepG2 κυττάρων με 5-φθοροουρακίλη και μιθραμυκίνη αποφασίσαμε να ελέγξουμε την τυχόν αλληλεπίδραση των δύο αυτών πρωτεϊνών εφαρμόζοντας δοκιμασίες συγκατακρήμνισης. HepG2 κύτταρα τα οποία είχαν κατεργαστεί με 5-FU και μιθραμυκίνη για 36 h λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (1 % NP40, 1 % sodium deoxycholate, 0,1 % SDS, 150 mm NaCl, 10 mm Na-phosphate ph 7,2, 2 mm EDTA, 50 mm NaF, 5 mm β-glycerophosphate, 4 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 μg/ml aprotinin) και τα εκχυλίσματα που προέκυψαν μετά από φυγοκέντρηση στα 10.000 x g για 15 min 131

αραιώθηκαν 4 φορές με το διάλυμα RIPA Rescue (10 mm Na-phosphate ph 7,2, 20 mm NaCl, 1 mm NaF, 5 mm β-glycerophosphate, 2 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 μg/ml aprotinine). Τα τυχόν σύμπλοκα μεταξύ των ενδογενών SAFB1 και p53 ανοσοκατακρημνίστηκαν με το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στην πρωτεΐνη SAFB1 και αναλύθηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και η δεσμευμένη πρωτεΐνη p53 ανιχνεύθηκε με το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.9.A, η πρωτεΐνη p53 συνανοσοκατακρημνίζεται με τον SAFB1. Η διαδικασία ανοσοκατακρήμνισης επαναλήφθηκε και αντίστροφα, χρησιμοποιώντας το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης p53. Και στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε συνανοσοκατακρήμνιση της πρωτεΐνης SAFB1 (η ανίχνευση της οποίας έγινε με το α-safβ1 μονοκλωνικό αντίσωμα), σε μικρότερο όμως ποσοστό (σχήμα Γ.9.Β). (A) (B) Σχήμα Γ.9. Αλληλεπίδραση μεταξύ p53 και SAFB1 in vivo σε κύτταρα θηλαστικών. Τα σύμπλοκα μεταξύ SAFB1 και p53 συνανοσοκατακρημνίστηκαν από HepG2 κύτταρα που είχαν κατεργαστεί με 50 μg/ml 5-FU για 36 h με κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στην πρωτεΐνη SAFB1 (A) είτε με το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στην πρωτεΐνη p53 (Β). Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Στο (Α) η ανίχνευση έγινε με το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στην πρωτεΐνη p53, ενώ στο (Β) η ανίχνευση έγινε με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι στην πρωτεΐνη SAFB1. 132

Γ.1.8. Εύρεση του τμήματος της πρωτεΐνης SAFB1 που αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53 Στη συνέχεια θελήσαμε να προσδιορίσουμε ποιο τμήμα της πρωτεΐνης SAFB1 ευθύνεται για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης αυτής με την πρωτεΐνη p53. Στο σημείο αυτό πρέπει να επισημάνουμε ότι ολόκληρη η πρωτεΐνη SAFB1 δεν εκφράζεται στα βακτήρια ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST. Έτσι τμήματα του γονιδίου που κωδικοποιούν τις περιοχές μεταξύ των αμινοξέων 1 έως 240 (SAFB1(1-240)), 240 έως 600 (SAFB1(240-600)), 566 έως 706 (SAFB1(566-706)) και 709 έως 915 (SAFB1(709-915)) κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pgex-2t και εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτήρια E. coli BL21 (βλ. και παραγράφο Β.2.14.) Τα τμήματα SAF-B1(1-240) και SAF-B1(240-600) μας χορηγήθηκαν ευγενικά από την Dr. S. Oesterreich (Breast Cancer Department of Medicine Baylor, Houston, USA) ενώ το τμήμα SAFB1(709-915) από την Επίκουρο Καθηγήτρια Έλενα Γεωργάτσου (Εργαστήριο Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας). Το τμήμα SAFB1(566-706) κλωνοποιήθηκε στο εργαστήριο μας, σύμφωνα με την πειραματική διαδικασία που περιγράφεται στις παραγράφους Β.2.6. και Β.2.7. Αφού διαπιστώσαμε ότι όλα τα τμήματα της πρωτεΐνης SAFB1 εκφράζονται ικανοποιητικά σε βακτηριακά κύτταρα, σε ένα επόμενο βήμα θελήσαμε να μελετήσουμε την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη p53. Για το σκοπό αυτό έγιναν πειράματα συγκατακρήμνισης (pulldown assays) (βλ. και παράγραφο Β.2.23.). Tα διάφορα τμήματα του SAFB1, ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GSΤ, καθηλώθηκαν σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Ο έλεγχος της αλληλεπίδρασης του p53 με τις καθηλωμένες πρωτεΐνες έγινε με προσθήκη σε κάθε περίπτωση στα σφαιρίδια της στήλης 60 μl από κυτταρικό εκχύλισμα 293Τ κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η πρωτεΐνη p53 με το επίτοπο HA. Η επώαση των καθηλωμένων GST-SAFB1 τμημάτων με τα κυτταρικά εκχυλίσματα έγινε σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος 25 mm Hepes ph 7,5, 100 mm NaCl, 1% Triton X-100. Μετά από συνεχή ανάδευση για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου και τρεις πλύσεις με το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης οι πρωτεΐνες που δεσμεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιμοποιώντας το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα 133

απέναντι στο p53. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.10.C, το τμήμα που εμφανίζει αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη p53 είναι το SAFB1(709-915) που αποτελεί τη C- τελική περιοχή του SAFB1. Σχήμα Γ.10. H C-τελική περιοχή του SAFB1 (aa 709-915) αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53. (Α) Σχηματική αναπαράσταση ολόκληρης της πρωτεΐνης SAFB1 (1-915) καθώς και των μικρότερων τμημάτων SAFB1(1-240), SAFB1(240-600), SAFB1(566-706) και SAFB1(709-915). Στο σχήμα φαίνονται οι χαρακτηριστικές περιοχές της πρωτεΐνης: SAF box, η περιοχή που είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση στο DNA, RRM (RNA Recognition motif), η περιοχή που είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση 134

στο RNA, Glu/Arg rich, μια περιοχή πλούσια σε διπεπτίδια γλουταμινικού/αργινίνης, Gly rich, μια περιοχή πλούσια σε γλυκίνες. (Β) Έκφραση σε βακτήρια E. coli XL1/B των τμημάτων της πρωτεΐνης SAFB1 ως πρωτεΐνες σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης GST. Η βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με Coomassie Brilliant Blue R-250. (C) In vitro δέσμευση της p53 στα τμήματα του SAFB1. Ανοσοανίχνευση με το DO-1 μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην πρωτεΐνη p53, υπερεκφρασμένης σε κύτταρα 293Τ που συγκατακρημνίστηκε με τα τμήματα του SAFB1 εκφρασμένα ως πρωτεΐνες σύντηξης με GST (διαδρομές 2-5). Στη πρώτη διαδρομή έτρεξαν 20 μl (1/5 του όγκου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα συγκατακρήμνισης) κυτταρικού εκχυλίσματος 293Τ κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η p53. Γ.1.9. Υποκυτταρική εντόπιση των ενδογενών SAFB1 και p53 στα HepG2 κύτταρα με δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα βιοχημικά πειράματα, σχετικά με την υποκυτταρική κατανομή των SAFB1 και p53, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ένα σημαντικό κλάσμα των δύο πρωτεϊνών συνεντοπίζεται, ιδιαίτερα μετά από κατεργασία των κυττάρων με 5-φθοροουρακίλη και μιθραμυκίνη. Θελήσαμε λοιπόν στη συνέχεια να διαπιστώσουμε αν οι παρατηρήσεις αυτές επιβεβαιώνονται και από αντίστοιχα πειράματα έμμεσου ανοσοφθορισμού. Για το σκοπό αυτό, σε τομές HepG2 κυττάρων, αρχικά έγινε ανίχνευση των ενδογενών SAFB1 και p53 με τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων. Στη περίπτωση αυτή επειδή χρησιμοποιήθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην πρωτεΐνη SAFB1 (a-safb1, σε αραίωση1:150) χρησιμοποιήθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην πρωτεΐνη p53 (FL-393, σε αραίωση 1:50). Ως δεύτερα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν FITC-conjugated goat anti-mouse, σε αραίωση 1:400 (πράσινο χρώμα) και RRX-conjugated goat anti-rabbit, σε αραίωση 1:350 (κόκκινο χρώμα). Η μέθοδος που ακολουθήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.25. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.11 παρατηρήθηκε περιορισμένος συνεντοπισμός των δύο πρωτεϊνών στον πυρήνα των control HepG2 κυττάρων, ο οποίος όμως αυξάνεται σημαντικά μετά από κατεργασία των κυττάρων με 5-FU. 135

Σχήμα Γ.11. Έμμεσος ανοσοφθορισμός των ενδογενών SAFB1 και p53 σε HepG2 κύτταρα πριν και μετά από κατεργασία με 5-φθοροουρακίλη για 36 h. Στο δεξιό μέρος της φωτογραφίας φαίνονται τα αποτελέσματα του φθορισμού στο επίπεδο του ενός κυττάρου, σε μεγαλύτερη εστίαση. Παρατηρείται κάποιος συνεντοπισμός των SAFB1 και p53 στον πυρήνα σε control κύτταρα, ο οποίος αυξάνεται σημαντικά μετά από κατεργασία των κυττάρων με 5-φθοροουρακίλη. Γ.1.10. Η υπερέκφραση του SAFB1 προκαλεί στα Κ562 κύτταρα αναστολή στη μεταγραφική ικανότητα της πρωτεΐνης p53 Τα πειράματα έμμεσου ανοσοφθορισμού επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση ανάμεσα στις πρωτεΐνες SAFB1 και p53. Δεδομένου ότι μια από τις βασικές λειτουργίες της πρωτεΐνης p53 είναι η δραστικότητά της ως μεταγραφικός παράγοντας, ένα επόμενο ερώτημα που θελήσαμε να απαντήσουμε είναι εάν ο SAFB1 έχει κάποια επίδραση στην μεταγραφική ικανότητα του p53. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε Κ562 κύτταρα που δεν εκφράζουν ενδογενές p53. Επίσης καθοριστικής σημασίας είναι η παρατήρηση ότι στα κύτταρα αυτά αν υπερεκφράσουμε p53 και SAFB1 η υποκυτταρική κατανομή τους προσομοιάζει εκείνη των HepG2 κυττάρων που έχουν κατεργαστεί με 5-φθοροουρακίλη η μιθραμυκίνη (βλ. σχήμα Γ.12.Α). Έτσι Κ562 κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με 0,5 μg πλασμιδιακού φορέα pcdna3/ha-p53 που εκφράζει την πρωτεΐνη p53 με το επίτοπο HA μαζί με αυξανόμενες ποσότητες pegfp-safb1 (1, 2, 3 μg) που εκφράζει τον SAFB1. Σε όλες τις επιμολύνσεις χρησιμοποιήσαμε ως πλασμίδιο αναφοράς 2 μg από τον πλασμιδιακό φορέα (-2325/+8) p21-cat που περιέχει ένα τμήμα του προαγωγού του p21 γονιδίου, το οποίο ακολουθείται από το γονίδιο της ακέτυλοτρανσφεράσης. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β.2.26. 136

Σχήμα Γ.12. Υπερέκφραση της πρωτεΐνης SAFB1 προκαλεί αναστολή της μεταγραφής του p53 σε Κ562 κύτταρα. (A) Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνών SAFB1 και p53 που υπερεκφράστηκαν σε Κ562 κύτταρα. Ποσότητες από τα κλάσματα του κυτταροπλάσματος, του νουκλεοπλάσματος, της DNAseI και της πυρηνικής μήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθμό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE. Η κατανομή των πρωτεϊνών p53 και SAFB1 137

μελετήθηκε στα διάφορα κλάσματα με ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιμοποιώντας τα μονοκλωνικά αντισώματα DO-1 και a-safb1 αντίστοιχα. (Β) Αυτοραδιογραφία έπειτα από δοκιμασία σύνθεσης ακέτυλοχλωραμφαινικόλης (CAT assay) σε Κ562 κύτταρα που συνεπιμολύνθηκαν με 2 μg (-2325/+8) p21-cat πλασμιδίου μαζί με 0.5 μg pcdna3/ha-p53, απουσία ή παρουσία αυξανομένων ποσοτήτων pegfp-safb1 (1, 2, 3 μg). Σε κάθε δοκιμασία μεταγραφής τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν και με 3 μg του πλασμιδίου CMV β-gal για την κανονικοποίηση (normalization) των επιπέδων επιμόλυνσης. Στο κάτω διάγραμμα δίνεται μια ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της αυτοραδιογραφίας. Ως σχετική δραστικότητα CAT θεωρούμε το λόγο των κρούσεων διακετυλοχλωραμφαινικόλη + ακετυλοχλωραμφαινικόλη/χλωραμφαινικόλη Οι μετρήσεις σε κάθε περίπτωση αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.12.Β, η συνέκφραση του SAFB1 στα κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μείωση στα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου αναφοράς γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της πρωτεΐνης αυτής της πυρηνικής μήτρας στη ρύθμιση της μεταγραφικής ενεργότητας του p53. 138

Γ.2. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας στη δομή του αμινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) και στην αλληλεπίδρασή του με την ιστόνη Η3 και την πρωτεΐνη HP1 Γ.2.1. Έλεγχος της ύπαρξης νουκλεϊνικών οξέων στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST LBRNt και πιθανή επίδραση τους στη διαλυτότητά της Η κλωνοποίηση και η έκφραση του αμινοτελικού άκρου του ανθρώπινου LBR, αλλά και του αμινοτελικού άκρου του LBR από γαλοπούλα σε βακτήρια, ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST (GST-LBRNt) περιγράφεται αναλυτικά σε παλιότερες εργασίες (βλ. σχετικά Nikolakaki et al., 1996, Makatsori et al., 2004). Από την βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι το αμινοτελικό αυτό τμήμα του LBR έχει την ικανότητα να ολιγομερίζεται (Makatsori et al., 2004). Επίσης, διαπιστώθηκε ότι μετά από επαναλαμβανόμενα παγώματα και ξεπαγώματα της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης πρωτεΐνης GST-LBRNt, μειωνόταν προοδευτικά η διαλυτότητά της. Σε συνδυασμό με το γεγονός ότι και η πρωτεΐνη έδειχνε απορρόφηση στο υπεριώδες φάσμα, με το λόγο Α260/Α280 nm να κυμαίνεται μεταξύ 1.1 και 1.4, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη νουκλεικού οξέος, θελήσαμε να διαπιστώσουμε σε πρώτη φάση αν πράγματι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη συνδέεται με κάποιο νουκλεϊνικό οξύ και στη συνέχεια αν τo δεσμευμένo νουκλεϊνικό oξύ διαδραματίζει κάποιο ρόλο στην διαλυτότητα της. Για το σκοπό αυτό, η πρωτεΐνη GST-LBRNt, ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης και διαπιστώθηκε, όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.13.Β, ότι πράγματι δεσμεύει νουκλεϊνικά οξέα. Προκειμένου να διαπιστωθεί το είδος του νουκλεϊνικού οξέος, η πρωτεΐνη επωάστηκε με 5 μg RNAse A (DNAse free) ή με DNAse (~30 units) (RNAse free) για 15 λεπτά στους 30 C και έπειτα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης. Παρατηρήθηκε ότι μετά από επώαση με την DNAse, τα νουκλεϊνικά οξέα εξακολουθούσαν να παραμένουν δεσμευμένα στην πρωτεΐνη και να ανιχνεύονται μετά τη χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο, ενώ αντίθετα μετά από επώαση με την RNAse A εξαφανίστηκαν. Διαπιστώθηκε επομένως ότι το είδος του νουκλεϊνικού οξέος που 139

δεσμεύεται στην πρωτεΐνη GST-LBRNt, κατά την έκφρασή της σε βακτηριακά κύτταρα, είναι βακτηριακό RNA. Στην συνέχεια, θελήσαμε να διερευνήσουμε αν η μείωση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης οφείλεται στην υδρόλυση του βακτηριακού RNA που υπάρχει δεσμευμένο πάνω της. Για το σκοπό αυτό αρχικά η πρωτεΐνη GST-LBRNt επωάστηκε με RNAse και στην συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση και ηλεκτροφόρηση του ιζήματος και του υπερκειμένου. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.14.Γ, όταν δεν έχει προηγηθεί επώαση με RNAse, η πρωτεΐνη εντοπίζεται στο υπερκείμενο. Αντίθετα, η επώαση με RNAse έχει σαν αποτέλεσμα ένα μέρος της πρωτεΐνης να κατακρημνίζεται στο ίζημα γεγονός που υποδηλώνει ότι η σύνδεση με το RNA είναι καθοριστική για την διαλυτότητα της πρωτεΐνης. (A) (B) (Γ) Σχήμα Γ.13. Το αμινοτελικό τμήμα του LBR δεσμεύει RNA το οποίο είναι καθοριστικό για τη διαλυτότητά του. (Α) Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της πρωτεΐνης LBRNt ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST. Η βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με Coomassie Brilliant Blue R-250. Η πρωτεΐνη σύντηξης εμφανίζεται στην πηκτή με μοριακή μάζα 51 kda, ενώ οι ζώνες κάτω από τα 51 140

kda αντιπροσωπεύουν προϊόντα πρωτεόλυσης. (Β) Έλεγχος της ύπαρξης νουκλεϊνικών οξέων στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-LBRNt, η οποία είχε εκφραστεί σε βακτηριακά κύτταρα. Η πρωτεΐνη GST-LBRNt (περίπου 2 μg) επωάστηκε παρουσία ή απουσία 30 units DNAse I ή 5 μg RNAse για 15 min στους 30 C και στην συνέχεια ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης. (Γ) Έλεγχος του ρόλου του βακτηριακού RNA στην διαλυτότητα της πρωτεΐνης GST-LBRNt. Η πρωτεΐνη GST-LBRNt (περίπου 2 μg) επωάστηκε με 5 μg RNΑse για 15 min στους 30 C και στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 15 min σε 13000 g. Το υπερκείμενο και το ίζημα αναλύθηκαν σε 12% SDSπηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomassie Brilliant Blue R-250. Στο σχήμα δείχνεται η κατανομή μόνο της πλήρους μεγέθους πρωτεΐνης σύντηξης. Γ.2.2. Σύνθεση και έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST LBR(62 205) και GST LBR(92 205) Προκειμένου να βρεθεί η περιοχή του αμινοτελικού τμήματος του LBR στην οποία γίνεται η δέσμευση του βακτηριακού RNA, συντέθηκαν οι παρακάτω ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, οι οποίες περιέχουν τμήματα του αμινοτελικού άκρου του LBR ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST: (α) η πρωτεΐνη GST-LBR(62-205) από την οποία απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 61 και (β) η πρωτεΐνη GST-LBR(92-205) από την οποία απουσιάζουν τα αμινοξέα 1 έως 91, όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.14.Α. Αρχικά, σχεδιάστηκαν οι κατάλληλοι εκκινητές για την απάλειψη των περιοχών 1 έως 61 και 1 έως 91, ώστε να δημιουργηθούν οι πρωτεΐνες GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205), αντίστοιχα (βλ. παράγραφο Β.2.6.). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε να περιέχουν τις ακολουθίες αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού EcoRI και BamHI. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης όπου ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t το οποίο περιείχε το DNA που κωδικοποιεί το αμινοτελικό τμήμα του LBR. Τα προϊόντα της PCR εκχυλίστηκαν από την πηκτή αγαρόζης και επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και BamHI (βλ. παράγραφο Β.2.7.). Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pgex-2t. Ακολούθησε η αντίδραση της λιγάσης και τα προϊόντα της αντίδρασης αυτής χρησιμοποιήθηκαν για τον μετασχηματισμό «επιδεκτικών» κυττάρων BL21 με βάση την μεθοδολογία της παραγράφου Β.2.10. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας, η έκφραση και ο καθαρισμός των δύο ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ακολούθησε το γενικό σχήμα που περιγράφεται στην 141

παράγραφο Β.2.14. Από τα εκλούσματα της στήλης σεφαρόζης-γλουταθειόνης παραλαμβάνονται 10 μl τα οποία αφού αραιωθούν σε τελικό όγκο 25 μl με H 2 O, ηλεκτροφορούνται κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η επιτυχής έκφραση της πρωτεΐνης ταυτοποιείται μετά από βαφή της πηκτής με χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250. (Α) (Β) Σχήμα Γ.14. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα τμημάτων του αμινοτελικού άκρου του LBR ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST. (Α) Σχηματική αναπαράσταση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-LBRNt, GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205). Από την πρωτεΐνη GST-LBR(62-205) λείπουν τα αμινοξέα 1 έως 61, ενώ από την πρωτεΐνη GST-LBR(92-205) τα αμινοξέα 1 έως 91. Στη συνδετική περιοχή φαίνεται σχηματικά η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS). (Β) Ηλεκτροφορητική εικόνα των πρωτεϊνών GST-LBRNt, GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205) σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μετά από βαφή με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Οι πρωτεΐνες GST-LBRNt, GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205) αντιστοιχούν στις ζώνες με μοριακή μάζα ~51, ~44 και ~41 kda, αντίστοιχα ενώ οι ζώνες μικρότερης μοριακής μάζας αντιστοιχούν σε προϊόντα πρωτεόλυσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. 142

Γ.2.3. Έλεγχος της ικανότητας δέσμευσης RNA των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών του αμινοτελικού τμήματος του LBR και της διαλυτότητας τους μετά από επώαση με RNAse Προκειμένου να βρεθεί σε ποια περιοχή του αμινοτελικού άκρου του LBR γίνεται η δέσμευση του βακτηριακού RNA, οι πρωτεΐνες GST-LBRNt, GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205) ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης. Όπως διαπιστώνεται στο σχήμα Γ.15 το RNA δεσμεύεται σε ολόκληρο το αμινοτελικό άκρο του LBR (GST-LBRNt) και στην πρωτεΐνη GST-LBR(62-205) αλλά όχι στην πρωτεΐνη GST-LBR(92-205). Επομένως η πιθανή θέση δέσμευσης του RNA είναι τα αμινοξέα 62 έως 92, η περιοχή δηλαδή που περιέχει την RS αλληλουχία. Σχήμα Γ.15. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST- LBRNt, GST-(62-205) και GST-(92-205). Το RNA δεσμεύεται σε ολόκληρο το αμινοτελικό άκρο του LBR (GST-LBRNt) και στην πρωτεΐνη GST-LBR(62-205) αλλά όχι στην πρωτεΐνη GST-LBR(92-205). Στην συνέχεια, οι πρωτεΐνες GST-LBRNt, GST-LBR(62-205) και GST- LBR(92-205) επωάστηκαν παρουσία ή απουσία RNAse. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και στη συνέχεια το ίζημα και το υπερκείμενο αναλύθηκαν σε 143

πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η εικόνα της ηλεκτροφόρησης έδειξε ότι η επώαση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBR(62-205) με την RNAse είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική μείωση της διαλυτότητάς της, ενώ αντίθετα κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε στην περίπτωση της πρωτεΐνης GST-LBR(92-205). Επομένως η παρουσία του RNA στην RS περιοχή είναι απαραίτητη για να παραμένει η πρωτεΐνη σε διαλυτή μορφή. Σχήμα Γ.16. Η επώαση με RNAse επηρεάζει την διαλυτότητα της GST-(62-205) πρωτεΐνης, αλλά όχι και της GST-(92-205). Οι πρωτεΐνες GST-LBR(62-205) και GST-LBR(92-205) (περίπου 2 μg) επωάστηκαν με 5 μg RNAse για 15 min στους 30 C και στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν σε 13000 g. Το υπερκείμενο και το ίζημα ηλεκτροφορήθηκαν σε 12% SDS πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomassie Brilliant Blue R-250. Γ.2.4. Έλεγχος του ρόλου της φωσφορυλίωσης των RS ακολουθιών στη δέσμευση RNA και στη διαλυτότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST LBRNt Σε ένα επόμενο βήμα μελετήθηκε η επίδραση της φωσφορυλίωσης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBRNt από την GST-SRPK1 στην διαλυτότητα της. Για το σκοπό αυτό η πρωτεΐνη GST-LBRNt επωάστηκε με RNAse μόνο ή με RNAse και GST-SRPK1. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και το ίζημα και υπερκείμενο ηλεκτροφορήθηκαν. Μετά από βαφή με Coomassie Brilliant Blue R- 250, διαπιστώθηκε (σχήμα Γ.17) ότι η φωσφορυλίωση της GST-LBRNt αυξάνει το ποσοστό της πρωτεΐνης που ανακτάται στο διαλυτό κλάσμα. Προφανώς, η 144

φωσφορυλίωση έχει το ίδιο αποτέλεσμα στην διαλυτότητα των RS πρωτεϊνών με το αποτέλεσμα που έχει η αλληλεπίδρασή τους με μόρια RNA. Σχήμα Γ.17. Η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST- LBRNt αυξάνει την διαλυτότητά της. Περίπου 2 μg της GST-LBRNt επωάστηκαν με 5 μg RNAse μόνο ή με 5 μg RNAse και GST-SRPK1 παρουσία 0.5 mm ATP για 1 ώρα στους 30 C. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν σε 13000 g για 15 min. Το υπερκείμενο και το ίζημα ηλεκτροφορήθηκαν σε 12% SDS πηκτή πολυακρυλαμίδιίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomassie Brilliant Blue R-250. Γ.2.5. Η μη φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει διαμόρφωση α έλικας ενώ η φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει μια πληθώρα από αποδιαταγμένες τυχαίες διαμορφώσεις Στην προσπάθεια μας να κατανοήσουμε τις δομικές αλλαγές που προκαλεί η φωσφορυλίωση στην RS περιοχή του LBR προχωρήσαμε σε μελέτη προσομοίωσης Μοριακής Δυναμικής (ΜΔ) της μη-φωσφορυλιωμένης αλλά και της φωσφορυλιωμένης RS περιοχής του ανθρώπινου LBR. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση προκαλεί μια δραματική αλλαγή στη διαμόρφωση της RS περιοχής (βλ. σχήματα Γ.18 και Γ.19). Ξεκινώντας από μια αρχική μη αναδιπλωμένη (extended) διαμόρφωση της RS ακολουθίας (RSRSRSRS) του ανθρώπινου LBR έγιναν διάφορες προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής διάρκειας 200 ns. Όλες οι προσομοιώσεις κατέληξαν σε διαμόρφωση α-έλικας ή οποία μάλιστα παρέμενε και σταθερή (σχήμα Γ.18). Παρόμοια διαμόρφωση α-έλικας δείχνει και η RS ακολουθία (RSRSRSRSRS) του 145

LBR από κοτόπουλο (αποτέλεσμα που δεν δείχνεται). Η διαμόρφωση αυτή είναι γνωστό ότι συμμετέχει σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και ευνοεί τη δημιουργία διμερών αλλά και πολυμερών μεταξύ πρωτεϊνικών μορίων, γεγονός που μπορεί και να εξηγεί την τάση δημιουργίας συσσωματωμάτων μεταξύ των μη φωσφορυλιωμένων αμινοτελικών μορίων. Χρησιμοποιώντας την ίδια προσέγγιση και για τη φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία, όπου και οι τέσσερις σερίνες λαμβάνονται ως φωσφορυλιωμένες προέκυψε ότι σε αυτήν την περίπτωση δημιουργείται μία πληθώρα από αποδιαταγμένες τυχαίες διαμορφώσεις. Στο σχήμα Γ.19 φαίνεται μια τέτοια τυχαία αποδιαταγμένη διαμόρφωση. Σχήμα Γ.18. Προσομοίωση Μοριακής Δυναμικής (ΜΔ) της μη-φωσφορυλιωμένης RS περιοχής του ανθρώπινου LBR. (Α) Αρχική διαμόρφωση του πεπτιδίου. (Β) τελική διαμόρφωση του πεπτιδίου μετά από προσομοίωση ΜΔ διάρκειας 200 ns και (C) διαμόρφωση του πεπτιδίου κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ns της προσομοίωσης (οριζόντιος άξονας: Αλληλουχία του πεπτιδίου, κάθετος άξονας: χρόνος προσομοίωσης). Με κόκκινο αναπαρίσταται η διαμόρφωση α-έλικας, ενώ με γαλάζιο η εκτενής διαμόρφωση. Από την εικόνα φαίνεται ότι το μη φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο αποκτά δομή α-έλικας, η οποία διατηρείται κατά το μεγαλύτερο μέρος της προσομοίωσης ΜΔ. 146

Σχήμα Γ.19. Προσομοίωση Μοριακής Δυναμικής (ΜΔ) της φωσφορυλιωμένης RS περιοχής του ανθρώπινου LBR. (Α) Αρχική διαμόρφωση του πεπτιδίου. (Β) τελική διαμόρφωση του πεπτιδίου μετά από προσομοίωση ΜΔ διάρκειας 200 ns και (C) διαμόρφωση του πεπτιδίου κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ns της προσομοίωσης (οριζόντιος άξονας: Αλληλουχία του πεπτιδίου, κάθετος άξονας: χρόνος προσομοίωσης). Με κόκκινο αναπαρίσταται η διαμόρφωση α-έλικας, ενώ με γαλάζιο η εκτενής διαμόρφωση. Από την εικόνα φαίνεται ότι το φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο παραμένει αδιαμόρφωτο καθ όλη τη διάρκεια της προσομοίωσης. Γ.2.6. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του αμινοτελικού τμήματος του LBR με την ιστόνη Η3 Παλαιότερα είχε αναφερθεί αλληλεπίδραση του αμινοτελικού άκρου του LBR με την ιστόνη Η3. Προκειμένου να μελετήσουμε διεξοδικότερα αυτήν την αλληλεπίδραση, αρχικά οι πρωτεΐνες GST και GST-LBRNt καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και στη συνέχεια επωάστηκαν με την ιστόνη Η3 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 20 mm Hepes ph 7.5, 0.5 Μ NaCl και 1% Triton X-100. Τα σφαιρίδια της στήλης ξεπλύθηκαν τρεις φορές με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.20.Α, η ιστόνη Η3 αλληλεπιδρά με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-LBRNt ενώ δεν αλληλεπιδρά με την καθαρή GST. Σε ένα επόμενο βήμα θελήσαμε να μελετήσουμε το ρόλο του RNA στην αλληλεπίδραση αυτή. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αλληλεπίδρασης της ιστόνης Η3 με την πρωτεΐνη GST-LBRNt η οποία είχε όμως προηγουμένως επωαστεί με RNase A, ώστε να απομακρυνθεί το βακτηριακό RNA 147

που βρίσκεται δεσμευμένο πάνω της. Συγκεκριμένα, αφού η πρωτεΐνη GST-LBRNt επωάστηκε με ή χωρίς 10 μg RNase A για 30 min στους 30 C, καθηλώθηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκε με την ιστόνη Η3 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ NaCl και 1% Triton X-100. Αφού απομακρύνθηκε η περίσσεια της μη δεσμευμένης ιστόνης, τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.20.Β, ενώ η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST- LBRNt αλληλεπιδρά με την ιστόνη Η3 (διαδρομή 1), παρατηρείται απώλεια της αλληλεπίδρασης όταν η GST-LBRNt έχει προηγουμένως επωαστεί με RNase A (διαδρομή 2). Επομένως η δέσμευση της ιστόνης Η3 στην πρωτεΐνη GST-LBRNt οφείλεται στην παρουσία του RNA, αφού μετά την απομάκρυνση του δεν παρατηρείται αλληλεπίδραση. (Α) (Β) Σχήμα Γ.20. Μελέτη της αλληλεπίδρασης της ιστόνης Η3 με το αμινοτελικό τμήμα του LBR. (Α) Η ιστόνη Η3 (2 μg) επωάστηκε με ακινητοποιημένες σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GSTκαι GST-LBRNt (2 μg από κάθε πρωτεΐνη). Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDSπηκτή πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. (Β) Αλληλεπίδραση της ιστόνης Η3 με την πρωτεΐνη GST-LBRNt, η 148

οποία προηγουμένως είχε επωαστεί με RNase A. Η ιστόνη Η3 (2 μg) επωάστηκε με ακινητοποιημένη σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST-LBRNt (~2 μg πρωτεΐνης), η οποία είχε προεπωασθεί με ή χωρίς 10 μg RNase A για 30 min, στους 30 C. Γ.2.7. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης GST LBRNt από την SRPK1 «μιμείται» το RNA και αυξάνει τα επίπεδα δέσμευσης της ιστόνης Η3 Σε προηγούμενα πειράματα είδαμε ότι η φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBRNt από την SRPK1 αυξάνει σημαντικά τη διαλυτότητα της. Σε συνέχεια της παρατήρησης αυτής θελήσαμε να ελέγξουμε αν η φωσφορυλίωση της GST-LBRNt επηρεάζει τα επίπεδα δέσμευσης της ιστόνης Η3. Όπως ήδη αναφέρθηκε στην προηγούμενη παράγραφο ουσιαστικά δεν παρατηρείται δέσμευση της ιστόνης Η3 στο αμινοτελικό άκρο του LBR όταν έχει αφαιρεθεί το προσδεδεμένο RNA. Δεδομένου ότι η φωσφορυλίωση «μιμείται» από άποψη φορτίου την παρουσία μορίων RNA, υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να προάγει τη δέσμευση της Η3, κατ αναλογία με το RNA. Για το σκοπό αυτό επαναλήφθηκε το πείραμα της προηγουμένης παραγράφου με τη διαφορά ότι προηγήθηκε φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBRNt από την SRPK1 (0.2 μg) πριν τη δέσμευση της στα σφαιρίδια της στήλης γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Η φωσφορυλίωση έγινε για 2 h στους 30 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl2 και 0.5 mm ATP. Χρησιμοποιήθηκε υψηλή συγκέντρωση ψυχρού ΑΤΡ για την επίτευξη κατά το δυνατόν πιο στοιχειομετρικής φωσφορυλίωσης. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.21 (διαδρομή 5) η αλληλεπίδραση της Η3 με την GST-LBRNt αυξάνει σημαντικά όταν προηγηθεί φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης από την SRPK1 (διαδρομή 5). 149

Σχήμα Γ.21. Η φωσφορυλίωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνηςgst-lbrnt από την SRPK1 μιμείται την παρουσία μορίων RNA και προάγει τη δέσμευση της ιστόνης Η3. Έλεγχος της δέσμευσης της ιστόνης Η3 (2 μg) στο αμινοτελικό άκρο του LBR (GST-LBRNt) στο φωσφορυλιωμένο αμινοτελικό άκρο και σε καθαρή GST. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-LBRNt είχε επωαστεί με 5 μg RNase A για 30 min στους 30 C για την απομάκρυνση του δεσμευμένου RNA. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. Γ.2.8. Αλληλεπίδραση της HP1 με τα αμινοτελικά άκρα του ανθρώπινου LBR και του LBR από γαλοπούλα Υπάρχουν διάφορες αναφορές στη βιβλιογραφία σχετικά με τη δέσμευση της ετεροχρωματινικής πρωτεΐνης 1 (HP1) στο αμινοτελικό άκρο του LBR (βλ. σχετικά Ye and Worman, 1996, Lechner et al., 2005). Στο πλαίσιο της σχολαστικής μελέτης της αλληλεπίδρασης της HP1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR αρχικά πραγματοποιήσαμε πειράματα συγκατακρήμνισης. Συγκεκριμένα, σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης καθηλώθηκαν τα ανασυνδυασμένα αμινοτελικά άκρα του LBR από άνθρωπο (hlbrnt) και γαλοπούλα (chlbrnt). Η δέσμευση των GST πρωτεϊνών σύντηξης στα σφαιρίδια της στήλης έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, 1% Triton X-100). Μετά την καθήλωση των πρωτεϊνών σύντηξης στη στήλη, ακολούθησαν δύο πλύσεις της στήλης σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 100 mm NaCl, 2 mm 150

MgCl 2 και 1% Triton X-100. Στη συνέχεια έγινε δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης 6xHis-HP1 (το αντίστοιχο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Mark Lechner, The Wistar Institute, Philadelphia, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις πάλι στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και τέλος οι πρωτεΐνες αποδεσμεύτηκαν από τη στήλη μετά από αιώρηση τους σε διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και θέρμανση 5 λεπτών στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. Προς έκπληξή μας η εμφάνιση των ζωνών στην πηκτή έδειξε ότι η πρωτεΐνη HP1 δεν δεσμεύεται σε κανένα από τα δύο αμινοτελικά άκρα του LBR (σχήμα Γ.22.A). (Α) (Β) Σχήμα Γ.22. Έλεγχος της δέσμευσης της πρωτεΐνης His-HP1 στο ανθρώπινο αμινοτελικό άκρο του LBR (hlbrnt), και στο αμινοτελικό άκρο του LBR από γαλοπούλα (chlbrnt). (Α) Δεν παρατηρήθηκε καμία δέσμευση της His-HP1 στα ανασυνδυασμένα αμινοτελικά άκρα του LBR όταν αυτά δεν είχαν υποστεί καμιά κατεργασία (Β) Δέσμευση της πρωτεΐνης His-HP1 στο hlbrnt που είχε όμως προηγουμένως κατεργαστεί με 5 μg RNAse για 15 min στους 30 C. Ανάλογη εικόνα προέκυψε και με τη δέσμευση της HP1 στο chlbrnt (δεν δείχνεται εδώ, βλ. και σχήμα Γ.26). Χρησιμοποιήθηκαν ~3 μg κάθε ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Και στις δύο περιπτώσεις η εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με χρώση της πηκτής με Coomasie Brilliant Blue R-250. 151

Όπως είδαμε όμως προηγουμένως στο αμινοτελικό άκρο του LBR δεσμεύονται μόρια RNA. Για να δούμε αν η παρουσία των μορίων αυτών RNA είχε κάποια επίδραση στην αλληλεπίδραση της HP1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR έγινε κατεργασία των hlbrnt και chlbrnt με 5 μg RNAse (DNAse free) για 15 min στους 30 C. Στη συνέχεια ακολούθησε η δέσμευση της πρωτεΐνη σύντηξης 6xHis-HP1 όπως αναφέρεται και προηγουμένως. Στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε δέσμευση της HP1 τόσο στο ανθρώπινο όσο και στο αμινοτελικό άκρο του LBR από γαλοπούλα (σχήμα Γ.22.Β). Φαίνεται λοιπόν ότι η παρουσία RNA παίζει καθοριστικό ρόλο στη δέσμευση της HP1. Σε προηγούμενα πειράματα είδαμε ότι η φωσφορυλίωση της hlbrnt από την SRPK1 «μιμείται» το RNA και αυξάνει τα επίπεδα αλληλεπίδρασης της με την ιστόνη Η3. Σε ένα επόμενο στάδιο θελήσαμε επομένως να ελέγξουμε αν η φωσφορυλίωση της hlbrnt επηρεάζει και τα επίπεδα δέσμευσης της HP1, παρόμοια με την παρουσία μορίων RNA. Για το σκοπό αυτό ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση της hlbrnt με την πρωτεΐνη ΗΡ1, πριν και μετά την φωσφορυλίωση της από την SRPK1. Η φωσφορυλίωση έγινε για 2 h στους 30 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl 2 και 0.5 mm ATP. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.23 δεν παρατηρήθηκε κάποια διαφοροποίηση στα επίπεδα της αλληλεπίδρασης. Η φωσφορυλίωση δηλαδή ενώ επηρεάζει την δέσμευση της Η3, δεν έχει καμία επίδραση στην δέσμευση της HP1, αντίθετα με την παρουσία μορίων RNA. Η δέσμευση λοιπόν της HP1 φαίνεται μάλλον να επηρεάζεται στερεοχημικά από τον όγκο των μορίων RNA που βρίσκονται δεσμευμένα στην RS αλληλουχία του LBR και όχι τόσο από το φορτίο και για το λόγο αυτό η φωσφορυλίωση δεν μπορεί να μιμηθεί την παρουσία RNA. 152

Σχήμα Γ.23 Έλεγχος του ρόλου της της φωσφορυλίωσης του hlbrnt στην αλληλεπίδρασή του με την πρωτεΐνη His-HP1. Διαδρομή 1: Καθαρή His-ΗP1. Διαδρομή 2: His-HP1 που συγκατακρημνίζεται με την πρωτεΐνη hlbrnt. Διαδρομή 3: ΗP1 που συγκατακρημνίζεται με φωσφορυλιωμένη hlbrnt. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη hlbrnt είχε επωαστεί με 5 μg RNase A για 30 min στους 30 C για την απομάκρυνση του δεσμευμένου RNA. Γ.2.9. Eσωτερική τάξη και αταξία του ανθρώπινου LBR και του LBR από γαλοπούλα Πρωτεΐνες ολόκληρες, αλλά και μεγάλα τμήματα πρωτεϊνών, τα οποία στερούνται καθορισμένης διαμόρφωσης κάτω από κανονικές συνθήκες αναφέρονται ως εσωτερικά άτακτες (Intrinsically Disordered Proteins -IDPs). Πειραματικά, οι IDPs αναγνωρίζονται από ένα far-uv CD φάσμα χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών με εσωτερική αταξία. Επίσης, η απουσία τάξης σε μία κρυσταλλική δομή συχνά είναι σημάδι μιας περιοχής (domain) με εσωτερική αταξία. Το ποσοστό ορισμένων αμινοξέων είναι πιο υψηλό στις IDPs από ότι στο μέσο όρο των αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, ενώ άλλα είναι σπάνια ή απουσιάζουν. Σε γενικές γραμμές οι IDPs είναι πλούσιες σε υδρόφιλα αμινοξέα όπως Αrg, Gln, Glu, Lys και Ser, ενώ αντίθετα είναι φτωχές σε υδρόφοβα αμινοξέα Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr και Val. Η ανικανότητα των IDPs για αναδίπλωση οφείλεται κατά κύριο λόγο στην απουσία των υδρόφοβων ομάδων που εμποδίζει τον σχηματισμό υδρόφοβου πυρήνα γύρω από τον οποίο η αλυσίδα μπορεί να αναδιπλωθεί. Σύμφωνα με παλιότερες εργασίες η περιοχή του ανθρώπινου LBR όπου δεσμεύεται η HP1 περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 113-130 του αμινοτελικού του 153

άκρου (Lechner et al., 2005). Συγκεκριμένα προτάθηκε ότι η ΗP1 δεσμεύεται στην χαρακτηριστική αλληλουχία VXVXL (όπου Χ, τυχαίο αμινοξύ). Μία τέτοια αλληλουχία υπάρχει στον ανθρώπινο LBR, δεν υπάρχει όμως στον LBR από γαλοπούλα. Human LBR MPSRKFADGEVVRGRWPGSSLYYEVEILSHDSTSQLYTVKYKDGTELELKEN DIKPLTSFRQRKGGSTSSSPSRRRGSRSRSRSRSPGRPPKSARRSASASHQADIK EARREVEVKLTPLILKPFGNSISRYNGEPEHIERNDAPHKNTQEKFSLSQESS Chicken LBR MPNRKYADGEVVMGRWPGSVLYYEVQVTSYDDASHLYTVKYKDGTELAL KESDIRLQSSFKQPKSQSSSSPSRRSRSRSRSRSPGRPAKGRRRSSSHSREHKED KKKIIQETSLAPPKPSENNTRRYNGEPDSTERNDTSSKLLEQQKLKPDVEMER VL Σχήμα Γ.24. Αμινοξική ακολουθία του αμινοτελικού άκρου του ανθρώπινου LBR (hlbrnt), και του αμινοτελικού άκρου του LBR από γαλοπούλα (chlbrnt). Η κόκκινη περιοχή αντιστοιχεί στην RS περιοχή, με τη σκίαση υποδεικνύεται η αλληλουχία VXVXL στην οποία έχει προταθεί ότι δεσμεύεται η ΗP1, ενώ υπογραμμισμένα είναι τα δύο αμινοξέα (F, στον ανθρώπινο LBR και E, στον LBR από γαλοπούλα) που έχουν καθοριστική σημασία στην τάξη-αταξία της περιοχής. Επί πλέον, βλέποντας τα διαγράμματα τάξης-αταξίας του ανθρώπινου LBR και του LBR από γαλοπούλα (Σχήμα Γ.25.Α-Β) παρατηρούμε μία σημαντική διαφοροποίηση. Στον ανθρώπινο LBR η περιοχή αυτή εμφανίζει σημαντική τάξη, ενώ αντίθετα στον υποδοχέα από γαλοπούλα η περιοχή αυτή εμφανίζει αταξία. Προκειμένου να μελετήσουμε την επίδραση της δομής της συγκεκριμένης περιοχής, όσον αφορά την τάξη-αταξία που παρουσιάζει, στην ικανότητα αλληλεπίδρασης με την HP1 δημιουργήσαμε δύο μεταλλάγματα των αμινοτελικών άκρων και εκφράσαμε τις αντίστοιχες πρωτεΐνες, ως πρωτεΐνες σύντηξης με GST σε βακτήρια. Στο πρώτο μετάλλαγμα η φαινυλανανίνη (F) (βλέπε σχήμα Γ.24) που βρίσκεται στη θέση 125 του ανθρώπινου LBR αντικαταστάθηκε με γλουταμινικό (Ε). Κατ αυτόν τον τρόπο μειώθηκε σημαντικά η τάξη της περιοχής πρόσδεσης και το διάγραμμα τάξης-αταξίας του μεταλλαγμένου ανθρώπινου αμινοτελικού άκρου προσομοιάζει με το αντίστοιχο από γαλοπούλα. Στο δεύτερο μετάλλαγμα το γλουταμινικό (Ε) (βλέπε σχήμα Γ.24) που βρίσκεται στη θέση 112 του LBR από γαλοπούλα αντικαταστάθηκε με φαινυλανανίνη (F), έτσι ώστε να αυξηθεί σημαντικά η τάξη της περιοχής πρόσδεσης. 154

Στην περίπτωση αυτή το διάγραμμα τάξης-αταξίας του μεταλλαγμένου αμιτελικού άκρου από γαλοπούλα προσομοιάζει με το αντίστοιχο ανθρώπινο. Γ.2.10. Μελέτη της αλληλεπίδρασης της HP1 με τα φυσιολογικά και μεταλλαγμένα αμινοτελικά άκρα του ανθρώπινου LBR και του LBR από γαλοπούλα Προκειμένου να μελετηθεί συστηματικά η αλληλεπίδραση της HP1 με τα φυσιολογικά και μεταλλαγμένα αμινοτελικά άκρα του LBR διεξήχθησαν πειράματα συγκατακρήμνισης, παρουσία αυξανομένων συγκεντρώσεων NaCl. Συγκεκριμένα, σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης καθηλώθηκαν οι πρωτεΐνες hlbrnt, hlbrntf E, chlbrnt και chlbrnte F που είχαν προηγουμένως κατεργαστεί με RNAse για την απομάκρυνση του συνδεδεμένου βακτηριακού RNA. Στη συνέχεια έγινε δέσμευση της πρωτεΐνη σύντηξης 6xHis-HP1 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 2 mm MgCl 2, 1% Triton X-100 που περιείχε αυξανόμενες συγκεντρώσεις NaCl (100 mm NaCl, είτε 250 mm NaCl, είτε 500 mm NaCl). Ακολούθησαν τρεις πλύσεις πάλι στο αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα και η δεσμευμένη HP1 σε κάθε περίπτωση ανιχνεύθηκε μετά από χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. Η εμφάνιση των ζωνών στην πηκτή έδειξε ότι η πρωτεΐνη HP1 δεσμεύεται στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη hlbrnt παρουσία 100 και 250 mm NaCl, ενώ η αλληλεπίδραση εξασθενεί αρκετά στα 500 mm NaCl. Η αντικατάταση της φαινυλανανίνης που βρίσκεται στη θέση 125 με γλουταμινικό δεν είχε ουσιαστική επίδραση στην ικανότητα δέσμευσης της HP1 (Σχήμα Γ.26.Α). Στην περίπτωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης chlbrnt, η HP1 δεσμεύεται παρουσία 100 mm NaCl, ενώ στα 250 mm η αλληλεπίδραση εξασθενεί σημαντικά, και στα 500 mm NaCl δεν παρατηρείται καμμία αλληλεπίδραση. Και εδώ η αντικατάσταση του γλουταμινικού που βρίσκεται στη θέση 112 με φαινυλανανίνη δεν είχε ουσιαστική επίδραση στην ικανότητα δέσμευσης της HP1 (Σχήμα Γ.26.Β). 155

(Α) Human LBR WT Human mutant F125E (Β) Chicken LBR WT Chicken mutant Ε112F Σχήμα Γ.25. (Α) Διάγραμμα τάξης-αταξίας του αμινοτελικού άκρου του ανθρώπινου LBR καθώς και του μεταλλάγματος όπου η φαινυλανανίνη (F) στη θέση 125 έχει αντικατασταθεί με γλουταμινικό (E). (Β) Διάγραμμα τάξης-αταξίας του αμινο-τελικού άκρου του LBR από γαλοπούλα καθώς και του μεταλλάγματος όπου το γλουταμινικό (E) στη θέση 112 έχει αντικατασταθεί με φαινυλανανίνη (F). 156

(Α) (Β) Σχήμα Γ.26. (Α) Έλεγχος της δέσμευσης της πρωτεΐνης His-HP1 στα φυσιολογικά και μεταλλαγμένα ανασυνδυασμένα αμινοτελικά άκρα του LBR από άνθρωπο και γαλοπούλα. (Α) Δέσμευση της πρωτεΐνης His-HP1 στο φυσιολογικό αμινοτελικό άκρο του LBR από άνθρωπο (hlbrnt) καθώς και στο μετάλλαγμα, όπου η φαινυλανανίνη που βρίσκεται στη θέση 125 αντικαταστάθηκε με γλουταμινικό (hlbrntf E), παρουσία 100, 250 και 500 mm NaCl. (Β) Δέσμευση της πρωτεΐνης His-HP1 στο φυσιολογικό αμινοτελικό άκρο του LBR από γαλοπούλα (chlbrnt), καθώς και στο μετάλλαγμα όπου το γλουταμινικό που βρίσκεται στη θέση 112 αντικαταστάθηκε με φαινυλανανίνη (chlbrnte F), παρουσία 100, 250 και 500 mm NaCl. Σε όλες τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν ~3 μg κάθε ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Η εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με χρώση της πηκτής με Coomasie Brilliant Blue R-250. 157

Γ.3. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της πρωταμίνης 1 από την SRPK1 στην αλληλεπίδρασή της με το άμινοτελικό άκρο του LBR και την είσοδό της στον πυρήνα Γ.3.1. Φωσφορυλίωση της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 από την κινάση SRPK1 Είναι γνωστό ότι η πρωτεϊνική κινάση SRPK1 εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους όρχεις (Papoutsopoulou et al., 1999). Προκειμένου να ερμηνευτεί η κατανομή της και να διευκρινιστεί ο ρόλος της, αναζητήθηκαν υποστρώματά της στους όρχεις, δηλαδή πρωτεΐνες οι οποίες να περιέχουν στο μόριο τους RS διπεπτίδια. Στην προσπάθεια αυτή ελέγχθηκε, εάν η πρωταμίνη 1 η οποία περιέχει τρία RS διπεπτίδια στο μόριό της, φωσφορυλιώνεται από την κινάση SRPK1(βλ. και σχήμα Γ.27). Συγκεκριμένα, ανθρώπινη πρωταμίνη 1 (που μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Philippe Chevaillier (Laboratoire de Biologie Cellulaire, Université Paris-Val de Marne, France) φωσφορυλιώθηκε από 0.5 μg καθαρή ανασυνδυασμένη GST-SRPK1 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 25 μμ ψυχρό ATP και 0.6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Σχήμα Γ.27. Η πρωταμίνη 1 φωσφορυλιώνεται in vitro από την SRPK1 (Α) Ηλεκτροφορητική εικόνα της ανθρώπινης πρωταμίνης 1 σε 12% πηκτή πολυακρυλαμιδίου μετά από βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250. (Β) In vitro φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την κινάση GST-SRPK1. 158

Η αντίδραση φωσφορυλίωσης έγινε για 30 min στους 30 C και στην συνέχεια οι ραδιενεργά επισημασμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS ηλεκτροφόρηση και ακολούθησε αυτοραδιογραφία. Όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.27., η πρωταμίνη 1 αποτελεί υπόστρωμα για την κινάση SRPK1. Γ.3.2. Αλληλεπίδραση της φωσφορυλιωμένης πρωταμίνης 1 με την RS ακολουθία του LBR. Κατά την αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες στην διαδικασία της σπερμιογένεσης, οι πρωταμίνες ανιχνεύονται αρχικά στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου (Biggiogera et al., 1992). Δεδομένου ότι οι RS ακολουθίες θεωρούνται υπεύθυνες για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών, ιδίως όταν η μία RS ακολουθία είναι φωσφορυλιωμένη (Weiss et al., 1998), ελέγχθηκε αν η περιφερειακή εντόπιση της πρωταμίνης 1 οφείλεται στην αλληλεπίδρασή της με τον LBR, δια μέσου των RS ακολουθιών τους. Για το σκοπό αυτό διεξήχθησαν πειράματα συγκατακρήμνισης της πρωταμίνης 1 με τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST- LBRNt και GST-ΔRS. Αρχικά, οι πρωτεΐνες GST-LBRNt, GST-LBRNt που είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί από την GST-SRPK1 και GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία, καθηλώθηκαν σε σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης. Ακολούθησε επώαση των καθηλωμένων πρωτεϊνών με πρωταμίνη 1 και πρωταμίνη 1 η οποία προηγουμένως είχε φωσφορυλιωθεί από την κινάση GST-SRPK1. Η δοκιμασία αλληλεπίδρασης έγινε για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0.5 Μ NaCl, 20 mm Tris-Cl ph 7.5, 2 mm MgCl 2 και 1% Triton X-100. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και θέρμανση για 5 λεπτά στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με Coomasie Brilliant Blue R-250. Η φωσφορυλίωση της GST- LBRNt και της πρωταμίνης 1 από την ανασυνδυασμένη κινάση GST-SRPK1 έγινε σε ρυθμιστικό διάλυμα που αποτελείται από 15 mm Hepes-KOH ph 7.5, 10 mm MgCl 2, παρουσία 0.5 mm ΑΤΡ για 2 ώρες στους 30 C. Για να έχουμε ακριβώς τις ίδιες συνθήκες αλληλεπίδρασης και οι μη φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες επωάστηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, αλλά απουσία της GST- SRPK1. 159

Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.28, μόνο όταν η πρωταμίνη 1 είναι φωσφορυλιωμένη αλληλεπιδρά με το αμινο-τελικό άκρο του LBR (διαδρομή 5). Η αλληλεπίδραση αυτή προϋποθέτει την ύπαρξη της RS ακολουθίας του LBR, αφού η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 δεν συνδέεται με την πρωτεΐνη GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία (διαδρομή 8). Η μη αλληλεπίδραση της πρωταμίνης με το φωσφορυλιωμένο αμινοτελικό άκρο του LBR αποτελεί σαφή ένδειξη ότι οι RS ακολουθίες των δύο πρωτεϊνών δεν είναι ισοδύναμες. Σχήμα Γ.28. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR. Η πρωταμίνη 1 και η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 (~2 μg πρωτεΐνης σε κάθε περίπτωση) επωάστηκαν με ακινητοποιημένες σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης GST, GST-wtNt (~2 μg), GST-wtNt η οποία είχε προηγουμένως φωσφορυλιωθεί και GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250. H φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 αλληλεπιδρά με το αμινο-τελικό άκρο του LBR (διαδρομή 5) και αλληλεπίδραση αυτή προϋποθέτει την ύπαρξη της RS ακολουθίας του LBR, αφού η φωσφορυλιωμένη πρωταμίνη 1 δεν συνδέεται με την πρωτεΐνη GST-ΔRS από την οποία απουσιάζει η RS ακολουθία (διαδρομή 8). 160

Γ.3.3. Υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και πρωταμίνης 1 σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρων σωληνίσκων ποντικού Η υποκυτταρική εντόπιση του υποδοχέα της λαμίνης Β και της πρωταμίνης 1 έγινε με ανοσοφθορισμό σε απομονωμένα κύτταρα του σπερματοφόρου σωληνίσκου.(mylonis et al., 2004). Για την απομόνωση των κυττάρων επιλέχθηκαν τμήματα του σωληνίσκου των σταδίων VII και VIII, ώστε να περιλαμβάνονται οι σπερματίδες που βρίσκονται στην έναρξη της φάσης επιμήκυνσης. Χρησιμοποιήθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στον LBR και την πρωταμίνη 1. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι το Cy3 το οποίο κατά το φθορισμό του στο μικροσκόπιο δίνει κόκκινη χροιά. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με τη χρωστική ουσία DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) που δεσμεύεται στην χρωματίνη και κατά το φθορισμό δίνει γαλάζια χροιά στον πυρήνα των κυττάρων. Σύμφωνα με το αποτέλεσμα του ανοσοφθορισμού (σχήμα Γ.29), ο LBR εντοπίζεται στο αρχικό στάδιο της σπερμιογένεσης στην περιφέρεια του πυρήνα και καταλαμβάνει σχεδόν όλο το σύνολο της πυρηνικής μεμβράνης. Σε αυτό το στάδιο η πρωταμίνη 1 δεν έχει εμφανιστεί ακόμα, ενώ το DNA στην χρωματίνη είναι συνδεδεμένο με ιστόνες. Σε επόμενο στάδιο, εντοπίζεται και η πρωταμίνη 1 στην περιφέρεια του πυρήνα και έχει την ίδια ακριβώς κατανομή με τον LBR του σταδίου αυτού. Συγκεκριμένα, τόσο ο LBR όσο και η πρωταμίνη 1 δεν καταλαμβάνουν όλη την πυρηνική μεμβράνη, αλλά αντίθετα έχουν περιοριστεί μόνο σε ένα τμήμα της. Σχήμα Γ.29. Ανοσοφθορισμός σε απομονωμένα κύτταρα σπερματοφόρου σωληνίσκου ποντικού, χρησιμοποιώντας κατάλληλα πολυκλωνικά αντισώματα απέναντι στον LBR και την πρωταμίνη 1. 161

Γ.3.4. Δημιουργία μεταλλάξεων στο μόριο της πρωταμίνης 1 και έκφρασή των μεταλλαγμάτων ως πρωτεϊνες σύντηξης με την GFP Η ακολουθία της πρωταμίνης 1 περιλαμβάνει τρία επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης-σερίνης τα οποία πιθανότατα να αποτελούν θέσεις φωσφορυλίωσης για την κινάση SRPK1. Για να διαπιστωθεί αφ ενός αν η SRPK1 φωσφορυλιώνει κατά προτίμηση τη σερίνη κάποιου συγκεκριμένου διπεπτιδίου, και για να μελετηθεί αφ ετέρου η συνεισφορά κάθε συγκεκριμένου διπεπτιδίου στην αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR, πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις στο μόριο της πρωταμίνης 1. Συγκεκριμένα, οι σερίνες στις θέσεις 9, 11 και 13 αντικαταστάθηκαν με αλανίνες. Οι μεταλλάξεις που δημιουργήθηκαν απεικονίζονται στο σχήμα Γ.30. Σχήμα Γ.30. Αμινοξική ακολουθία της RS ακολουθίας της πρωταμίνης 1 όπου φαίνονται οι σερίνες που μεταλλάχθηκαν σε αλανίνες. Η τεχνική η οποία χρησιμοποιήθηκε για την δημιουργία των παραπάνω μεταλλάξεων ήταν η ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενη μετάλλαξη. Τα ολιγονουκλεοτίδια που σχεδιάστηκαν για το σκοπό αυτό καθώς και η διαδικασία της μετάλλαξης περιγράφονται στην παράγραφο Β.2.13. Η πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της εκφράστηκαν αρχικά ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST σε βακτηριακά κύτταρα XL1/B μετά από τον μετασχηματισμό τους με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pgex-2t. Λόγω του πολύ έντονου βασικού χαρακτήρα της πρωταμίνης χρησιμοποιήθηκε 1 Μ NaCl κατά την εκχύλιση των βακτηριακών κυττάρων, αλλά και κατά τη διάρκεια του καθαρισμού. 162

Παρατηρήθηκε όμως αδυναμία της GST-SRPK1 να φωσφορυλιώσει την ανασυνδυασμένη πρωταμίνη 1 και τα μεταλλάγματά της όταν έχουν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GST (αποτελέσματα που δεν δείχνονται). Πιθανόν αυτό να οφείλεται στο ότι η συνεκφραζόμενη GST καλύπτει τα RS διπεπτίδια με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η φωσφορυλίωση τους. Στη συνέχεια το γονίδιο της πρωταμίνης 1 καθώς και οι μεταλλαγμένοι κλώνοι, μετά από πέψη με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoRI και BamHI, κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pegfp-n1, ώστε να εκφραστούν ως πρωτεΐνες σύντηξης με την GFP πρωτεΐνη, η οποία έχει περίπου τριπλάσια μοριακή μάζα από την πρωταμίνη 1 και κατά συνέπεια μειώνει σημαντικά το πολύ θετικό φορτίο της πρωταμίνης. Η έκφραση σε ευκαρυωτικά κύτταρα επιτεύχθηκε με παροδική επιμόλυνση 293Τ. Με τη πάροδο 48 ωρών από τη στιγμή της επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν και ακολούθησε προσπάθεια ανίχνευσης των υπερεκφρασμένων πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, 10 μl από το κυτταρικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε ανοσοανίχνευση με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. Στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε σημαντική έκφραση τόσο της αγρίου τύπου πρωταμίνης 1 όσο και των μεταλλαγμάτων της (σχήμα Γ.31). Σχήμα Γ.31. Έκφραση αγρίου τύπου πρωταμίνης και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεΐνες σύντηξης με GFP σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Ανοσοανίχνευση εκχυλισμάτων από κύτταρα 293Τ που έχουν επιμολυνθεί παροδικά με GFP (σκέτος πλασμιδιακός φορέας, διαδρομή 1), Prm1-GFP (διαδρομή 2), Prm1(9SA)-GFP (διαδρομή 3), Prm1(11SA)-GFP (διαδρομή 4) και Prm1(13SA)-GFP (διαδρομή 5) με την χρήση μονοκλωνικού αντισώματος απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. 163

Γ.3.5. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της ως πρωτεϊνών σύντηξης με την GFP με το αμινοτελικό άκρο του LBR (GST LBRNt) H πρωταμίνη και τα μεταλλάγματά της κατά την υπερέκφρασή τους σε ευκαρυωτικά κύτταρα ως πρωτεΐνες σύντηξης με GFP πρέπει να είναι φωσφορυλιωμένες, αν και δεν είναι εύκολο να προσδιοριστεί με ακρίβεια ή έκταση της φωσφορυλίωσής τους. Έτσι, προκειμένου να εκτιμήσουμε το ρόλο της φωσφορυλίωσης κάθε σερίνης της RS ακολουθίας της πρωταμίνης 1 στην αλληλεπίδρασή της με τον LBR κυτταρικά εκχυλίσματα από 293Τ κύτταρα, που είχαν επιμολυνθεί με GFP (σκέτος πλασμιδιακός φορέας), Prm1-GFP, Prm1(9A)- GFP, Prm1(11A)-GFP και Prm1(13A)-GFP χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα συγκατακρήμνισης με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-LBRNt. Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη GST-LBRΝt καθηλώθηκε σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκε με 200 μl των κυτταρικών εκχυλισμάτων, για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων (1% Triton X-100, 25 mm Tris-Cl ph 7.5, 0.5 M NaCl και 1 mm PMSF). Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και θέρμανση για 5 λεπτά στους 90 C. Τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και έγινε ανοσοανίχνευση των δεσμευμένων πρωταμινών με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.32, η πρωταμίνη1-gfp και τα μεταλλάγματα Prm1(11A)-GFP και Prm1(13A)-GFP δεσμεύονται στην πρωτεΐνη GST-LBRNt με περίπου την ίδια ένταση, ενώ το μετάλλαγμα Prm1(9A)- GFP δεν αλληλεπιδρά καθόλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της σερίνης 9 πιθανά να παίζει καθοριστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR. 164

Σχήμα Γ.32. Η φωσφορυλίωση της Ser9 στην ακολουθία της πρωταμίνης 1 είναι καθοριστική για την αλληλεπίδρασή της με το αμινοτελικό άκρο του LBR. Αλληλεπίδραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-LBRNt με κυτταρικά εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων τα οποία είχαν επιμολυνθεί παροδικά με GFP (σκέτος πλασμιδιακός φορέας, διαδρομή 1), Prm1-GFP (διαδρομή 2), Prm1(9A)- GFP (διαδρομή 3), Prm1(11A)-GFP (διαδρομή 4), και Prm1(13A)-GFP (διαδρομή 5) Η ανίχνευση της δεσμευμένης πρωταμίνης σε κάθε περίπτωση έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος απέναντι στην GFP πρωτεΐνη. Γ.3.6. Υποκυτταρική εντόπιση των μεταλλαγμάτων της πρωταμίνης 1 σε HeLa κύτταρα Σε ένα τελευταίο στάδιο θελήσαμε να ελέγξουμε την υποκυτταρική κατανομή της πρωταμίνης 1 και των μεταλλαγμάτων της σε HeLa κύτταρα. Το σκεπτικό μας ήταν ότι η απουσία αλληλεπίδρασης του μεταλλάγματος Prm1(9A)-GFP με το αμινοτελικό άκρο του LBR πιθανά να επηρεάζει και την υποκυτταρική του εντόπιση. Στη σκέψη αυτή μας οδήγησε και μια παλιά παρατήρηση ότι η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 είναι απαραίτητη προκειμένου αυτή να εμφανίσει πυρηνική εντόπιση (Boogaard and Dixon, 1983). Για το σκοπό αυτό το γονίδιο της πρωταμίνης 1 και τα μεταλλάγματά της εκφράστηκαν σε HeLa κύτταρα, ως πρωτεΐνες σύντηξης με GFP, και ακολούθησε μελέτη της κατανομής τους με φθορισμό, με βάση την ικανότητα της GFP πρωτεΐνης να φθορίζει. 165

Σχήμα Γ.33. Φθορισμός GFP, Prm1-GFP και Prm1(9A)-GFP μετά από υπερέκφρασή τους σε HeLa κύτταρα. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.33 η πρωταμίνη 1 εντοπίζεται σε εστίες στον πυρήνα. Παρόμοια εικόνα δίνουν και τα μεταλλάγματα Prm1(11A)-GFP και Prm1(13A)-GFP (αποτελέσματα που δεν δείχνονται). Αντίθετα, στην περίπτωση του μεταλλάγματος Prm1(9A)-GFP παρατηρείται ότι ένα μέρος του παραμένει στο κυτταρόπλασμα. Πιθανά λοιπόν σε κάποια έκταση η αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με το αμινοτελικό άκρο του LBR να συνεισφέρει στην πυρηνική εντόπιση της πρωταμίνης. 166

Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι κινάσες πρωτεϊνών αποτελούν ένζυμα που καταλύουν την μεταφορά της γ- φωσφορικής ομάδας του ΑΤΡ στα υποστρώματά τους. To αποτέλεσμα αυτής της αντίδρασης είναι η προσθήκη δύο αρνητικών φορτίων σε μια περιοχή του μορίου, που από πλευράς φορτίου είναι ουδέτερη. Είναι εύκολο να φανταστεί κανείς τις επιπτώσεις που έχει μια τέτοια ηλεκτροστατική φόρτιση στις ανώτερες διαμορφώσεις και κατ επέκταση στη λειτουργικότητα και τις αλληλεπιδράσεις μιας πρωτεΐνης. Το πλεονέκτημα αυτού του μηχανισμού επέμβασης στην πρωτοταγή δομή ενός μορίου είναι ότι είναι ταχύτατος αλλά κυρίως ότι είναι αντιστρεπτός. Ειδικά ένζυμα που ονομάζονται φωσφατάσες πρωτεϊνών απομακρύνουν τις προστιθέμενες από τις κινάσες φωσφορικές ομάδες. Έτσι με τον συνδυασμό της δράσης των δύο αυτών κατηγοριών ενζύμων ο οργανισμός ενεργοποιεί και αδρανοποιεί ένζυμα ή τροποποιεί τη διαμόρφωση άλλων λειτουργικών πρωτεϊνών ώστε να μεταβάλλει τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλα μόρια γρήγορα και ανάλογα με τις ανάγκες του. Οι κινάσες συμμετέχουν σχεδόν σε όλες τις κυτταρικές λειτουργίες και οποιαδήποτε απόκλιση οδηγεί σε σοβαρές δυσλειτουργίες των κυττάρων και κατ επέκταση των οργανισμών. Οι SRPKs, που αποτελούν και το αντικείμενο μελέτης της ερευνητικής μας ομάδας, φωσφορυλιώνουν σερίνες σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης σερίνης (RS). Οι κινάσες αυτές έχουν το χαρακτηριστικό πως η καταλυτική τους περιοχή περιορίζεται στο Ν- και στο C- τελικό άκρο τους, χωρισμένη από μια συνδετική περιοχή, δομή ασυνήθιστη για πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης-θρεονίνης. Αν και όλες οι SRPKs περιέχουν στο μόριό τους δύο αλληλουχίες πυρηνικής εντόπισης (Nuclear Localization Signals, NLS), εντοπίζονται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα των κυττάρων. Ένα χαρακτηριστικό των υποστρωμάτων τους είναι ότι οι περιοχές που αποτελούν τους στόχους φωσφορυλίωσης αποτελούν και τις θέσεις δέσμευσης των κινασών. Απαιτείται η ύπαρξη τριών τουλάχιστον αλληλοδιάδοχων RS διπεπτιδίων προκειμένου οι κινάσες αυτής της οικογένειας να είναι ενεργές (Papoutsopoulou et al., 1999). Αν ανατρέξει κανείς στις βάσεις δεδομένων θα διαπιστώσει ότι υπάρχουν εκατοντάδες πρωτεΐνες που περιέχουν στο μόριο τους τουλάχιστον τρία 167

επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια και άρα αποτελούν εν δυνάμει υποστρώματα των SRPKs. Οι πρωτεΐνες -πιθανά υποστρώματα- εμφανίζουν τόσο πυρηνική όσο και κυτταροπλασματική εντόπιση και εμπλέκονται σε μια ποικιλία βιολογικών λειτουργιών, όπως η οργάνωση της δομής της χρωματίνης, η σύνθεση mrna από την RNA πολυμεράση II, η διαδικασία του ματίσματος, ο κυτταρικός κύκλος, η μετάφραση των mrna, η οργάνωση του κυτταροσκελετού και γενικότερα η διατήρηση της κυτταρικής δομής, η οσμωτική ρύθμιση των κυττάρων και η διαδικασία της σπερμιογένεσης στα σπερματικά κύτταρα ( Boucher et al., 2001). Η προσπάθεια για την κατανόηση του βιολογικού ρόλου των SRPKs αποτέλεσε και το θέμα αυτής της διδακτορικής διατριβής. Η μελέτη μας κινήθηκε σε τρεις άξονες: Ο πρώτος άξονας αφορούσε τις πιθανές αλληλεπιδράσεις της SRPK1a, η οποία αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του ίδιου γονιδίου με την SRPK1 και περιέχει σε σχέση με την SRPK1 μία πρόσθετη ακολουθία 171 αμινοξέων στο Ν- τελικό της άκρο (Nikolakaki et al., 2001). Χρησιμοποιώντας το σύστημα των δύο υβριδίων βρήκαμε ότι η SRPK1a βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Η πιθανή λειτουργικότητα αυτού του συμπλόκου και ο ρόλος του στη ρύθμιση της μεταγραφικής ενεργότητας της πρωτεΐνης p53 αναλύονται στο πρώτο μέρος της συζήτησης. Ο δεύτερος άξονας αφορούσε τη μελέτη της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) από την SRPK1. Ο LBR αποτελεί ένα από τα πιο καλά μελετημένα υποστρώματα των SRPKs (βλ. σχετικό κεφάλαιο Εισαγωγής) και η φωσφορυλίωση της RS αλληλουχίας του φαίνεται να ρυθμίζει την αλληλεπίδρασή του με διάφορες πρωτεΐνες. Από τη μελέτη μας προέκυψε ένα πολύ ενδιαφέρον συμπέρασμα το οποίο πιθανά να δίνει και μια σφαιρική ερμηνεία για τον πιθανό ρόλο της φωσφορυλίωσης ενός τόσο μεγάλου αριθμού ετερογενών πρωτεϊνών με διαφορετικές λειτουργικότητες και κυτταρική εντόπιση. Συγκεκριμένα προέκυψε ότι η μη φωσφορυλιωμένη RS ακολουθία εμφανίζει διαμόρφωση α-έλικας, ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας έχει ως αποτέλεσμα αυτή να λαμβάνει μια τυχαία αποδιαταγμένη διαμόρφωση. Η επίδραση της δομικής αυτής μεταβολής στην λειτουργικότητα του LBR αλλά και γενικότερα πρωτεϊνών που περιέχουν RS ακολουθίες στο μόριο τους σχολιάζονται στο δεύτερο μέρος της συζήτησης. 168

Τέλος ο τρίτος άξονας αφορούσε τη φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την SRPK1. Ο πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης αυτής στην αλληλεπίδρασή της με τον LBR αλλά και η συμβολή της αλληλεπίδρασης αυτής στην πυρηνική εντόπιση της πρωταμίνης 1 σχολιάζονται στο τρίτο μέρος της συζήτησης. H πρωτεϊνική κινάση SRPK1a βρίσκεται σε σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες p53 και SAFB1. Καταστολή της μεταγραφικής ικανότητας της πρωτεϊνης p53 μετά από αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη SAFB1 Στο εργαστήριο μας κλωνοποιήθηκε παλαιότερα μία ισομορφή της SRPK1, η SRPK1a, η οποία αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του ίδιου γονιδίου και περιέχει σε σχέση με την SRPK1 μία πρόσθετη ακολουθία 171 αμινοξέων στο Ν- τελικό της άκρο (Nikolakaki et al., 2001). Προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα το βιολογικό ρόλο της SRPK1a και να διαπιστώσουμε σε ποια μονοπάτια μεταφοράς σήματος συμμετέχει προσπαθήσαμε να βρούμε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν εξειδικευμένα με την SRPK1a. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε το σύστημα των δύο υβριδίων στη ζύμη, επιλέγοντας ως δόλωμα (bait) τo επιπλέον τμήμα των 171 αμινοξέων της SRPK1a (SRPK1a(1-175)), το οποίο και δεν υπάρχει στην SRPK1. Δύο από τους κλώνους που έδωσαν αλληλεπίδραση, μετά από εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τους και έρευνα στη βάση δεδομένων BLAST, ταυτοποιήθηκαν ως τμήματα των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες SAFB1 και p53 αντίστοιχα. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές επιβεβαιώθηκαν με in vitro πειράματα συγκατακρήμνισης και in vivo δοκιμασίες συνανοσοκατακρήμνισης. Καμία από τις δύο πρωτεΐνες που βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με την SRPK1a (p53, SAFB1) δεν αποτελεί υπόστρωμα της κινάσης αφού και οι δύο στερούνται RS αλληλουχιών. Έτσι, σε μια πρώτη προσέγγιση αποφασίσαμε να ελέγξουμε αν υπάρχει κάποιου είδους συσχέτιση ανάμεσα στις δύο αυτές πρωτεΐνες. Η πρωτεΐνη SAFB1 έχει βρεθεί να είναι συνδεδεμένη στο μεγαλύτερο ποσοστό της με την πυρηνική μήτρα (Renz and Fackelmayer, 1996). Αντίθετα ένα σχετικά μικρό ποσοστό της πρωτεΐνης p53 φαίνεται να εντοπίζεται στον πυρήνα σε control HepG2 κύτταρα. Προσθήκη όμως στα κύτταρα κυτταροστατικών φαρμάκων, όπως μιθραμυκίνη και 5 φθοροουρακίλη, έχει ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση των 169

επιπέδων του p53. Στην περίπτωση των κυττάρων που έχουν κατεργαστεί με μιθραμυκίνη ή 5-φθοροουρακίλη το μεγαλύτερο ποσοστό της πρωτεΐνης p53 εντοπίζεται στον πυρήνα και μάλιστα ένα σημαντικό μέρος από την πυρηνική p53 βρίσκεται ενωμένο με την πυρηνική μήτρα. Επεκτείνοντας αυτές τις παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης SAFB1 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη p53, ενώ με δοκιμασίες έμμεσου ανοσοφθορισμού παρατηρήθηκε σημαντική συνεντόπιση των p53 και SAFB1 σε HepG2 κύτταρα που είχαν κατεργαστεί με 5-φθοροουρακίλη ή μιθραμυκίνη. Γνωρίζοντας ότι μια από τις βασικές λειτουργίες της πρωτεΐνης p53 είναι η δραστικότητά της ως μεταγραφικός παράγοντας, ένα επόμενο ερώτημα που θελήσαμε να απαντήσουμε είναι εάν ο SAFB1 έχει κάποια επίδραση στην μεταγραφική ικανότητα του p53. Συνέκφραση p53 και SAFB1 στα Κ562 κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μείωση στα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου αναφοράς γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της πρωτεΐνης SAFB1 στη ρύθμιση της μεταγραφικής ενεργότητας του p53. Η πρωτεΐνη p53 αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, ιδίως όταν το κύτταρο βρεθεί σε διάφορες καταστάσεις στρες. Αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης αυτής δημιουργούν ανεπιθύμητα αποτελέσματα. Η αυστηρή ρύθμιση της p53 είναι επομένως καθοριστικής σημασίας για την ομαλή κυτταρική λειτουργία. Επί πλέον, είναι σημαντική για το κύτταρο η επάνοδος της δραστικότητας αλλά και των επιπέδων της πρωτεΐνης p53 σε φυσιολογικές τιμές μετά την πάροδο του στρες, στο οποίο είχε εκτεθεί το κύτταρο. Η πρωτεΐνη-κλειδί στη ρύθμιση της p53 είναι η MDM2/HDM2 (Brooks and Gu, 2006). Συγκεκριμένα, αλληλεπίδραση των MDM2 και p53 έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της μεταγραφικής ενεργότητας της p53. Επί πλέον, η πρωτεΐνη MDM2 μέσω μιας δομής RING-finger, που περιέχει στο μόριό της, εμφανίζει δράση λιγάσης ουβικιτίνης οδηγώντας στην αποικοδόμηση της πρωτεΐνης p53 στο πρωτεόσωμα (Brooks and Gu, 2006). Η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης p53 λαμβάνει χώρα κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Τα τελευταία όμως χρόνια μια σειρά από ευρήματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τόσο τα επίπεδα όσο και η λειτουργικότητα της πρωτεΐνης p53 μπορούν να ρυθμίζονται και στον πυρήνα και μάλιστα ότι πρωτεΐνες της πυρηνικής μήτρας παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτή. Η πρωτεΐνη SMAR1, μία πρωτεΐνη που βρίσκεται συνδεδεμένη με την πυρηνική μήτρα και η οποία, όπως και ο SAFB1 αλληλεπιδρά με τις αλληλουχίες 170

S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS) του DNA, έχει αναφερθεί ότι δημιουργεί σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες MDM2-p53 και αναστέλλει τη μεταγραφική ενεργότητα της p53 (Pavithra et al., 2009). Ακόμα πιο ενδιαφέρουσα είναι η παρατήρηση ότι δύο πρωτεΐνες φαίνεται να συνδέουν την ουβικιτινιλίωση της p53 με την πυρηνική μήτρα και τις SRPKs. Η πρώτη από αυτές είναι η πρωτεΐνη P2P-R (γνωστή επίσης ως PACT και Rbbp6) που κλωνοποιήθηκε περίπου πριν από μια δεκαετία με βάση την ικανότητα της να δεσμεύει τις πρωτεΐνες p53 (Simons et al., 1997) και Rb1 (Witte and Scott, 1997). Η P2P-R περιέχει στο αμινοτελικό της άκρο μια δομή RING finger και πρόσφατα δείχτηκε ότι αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη HDM2 επάγοντας την ουβικιτινιλίωση της p53. Η επαγωγή αυτή είναι αποτέλεσμα της αύξησης της αγχιστείας της αλληλεπίδρασης των p53 HDM2 (Li et al., 2007). Η πρωτεΐνη P2P-R περιέχει ακόμα στο μόριό της μια RS ακολουθία που φωσφορυλιώνεται από την SRPK1a (Scott et al., 2003). Τέλος, η P2P-R αλληλεπιδρά με τον SAFB1, καθώς και με την νουκλεολίνη που επίσης δεσμεύεται σε S/MARS αλληλουχίες (Scott et al., 2003, Βουκκαλής Ν., Πεΐδης Φ. και Γιαννακούρος Θ., αδημοσίευτα αποτελέσματα). Η δεύτερη πρωτεΐνη είναι η topors που έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά τόσο με την τοποϊσομεράση I, όσο και με την p53 (Haluska et al., 1999). H topors περιέχει επίσης στην αμινοτελική της περιοχή μια δομή RING finger και ουβικιτιλιώνει την p53 (Rajendra et al., 2004). Όπως και η P2P-R, η topors συνδέεται με την πυρηνική μήτρα (Rasheed et al., 2002) και περιέχει μια RS ακολουθία που πιθανότατα φωσφορυλιώνεται από τις SRPKs. Χρειάζεται περαιτέρω έρευνα προκειμένου να εξακριβωθεί αν ο ίδιος ο SAFB1 αναστέλλει τη μεταγραφική ικανότητα της p53, ή αυτό επιτυγχάνεται μέσω της δημιουργίας συμπλόκων που συμπεριλαμβάνουν την MDM2/HDM2 ή/και άλλες πρωτεΐνες όπως η P2P-R ή/και η topors. Η δική μας πεποίθηση είναι ότι ο SAFB1 ρυθμίζει την p53 και με τους δύο τρόπους. Ενώ ο SAFB1 αρχικά αναφέρθηκε ως καταστολέας της μεταγραφής που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων (Oesterreich et al., 2000), πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι μέλη της οικογένειας SAFB δρουν ως γενικοί μεταγραφικοί καταστολείς. (Debril et al., 2005, Chan et al., 2007). Μάλιστα η κατασταλτική δράση εστιάζεται στην C-τελική περιοχή του SAFB1 (Τownson et al., 2004), η οποία είναι υπεύθυνη και για την αλληλεπίδραση του με την p53. Από την άλλη πλευρά, ο SAFB1 αλληλεπιδρά με ένα μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών 171

που ρυθμίζουν την μεταγραφή, την διαδικασία του ματίσματος και την ουβικιτινιλίωση (Nayler et al., 1998; Oesterreich et al., 2000; Scott et al., 2003), παρέχοντας έτσι μια πλατφόρμα στην πυρηνική μήτρα που προάγει την δημιουργία διαφόρων ρυθμιστικών συμπλόκων. Ποια κυτταρική λειτουργία θα επηρεαστεί, συμπεριλαμβανομένων της μεταγραφικής ενεργότητας ή/και των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης p53 εξαρτάται από τη συγκεκριμένη σύσταση των συμπλόκων. Ένα επιπλέον θέμα αποτελεί η αποσαφήνιση του ρόλου της SRPK1a. Αν και η SRPK1a περιέχει δύο LXXLL μοτίβα (Nikolakaki et al., 2001), μέσω των οποίων διευκολύνεται η αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών με πυρηνικούς υποδοχείς, δεν υπάρχει μέχρι σήμερα σαφής απόδειξη ότι συμμετέχει ευθέως στη ρύθμιση της μεταγραφής. Στο σημείο αυτό πρέπει να τονιστεί ότι υπερέκφραση της SRPK1a στο σύστημα μας δεν είχε κάποια επίδραση στην μεταγραφική ικανότητα της p53 (αποτελέσματα που δεν δείχνονται). Η υπόθεσή μας είναι ότι η SRPK1a μπορεί να επηρεάζει την σύσταση των συμπλόκων που οργανώνονται με βάση τον SAFB1. Για παράδειγμα η φωσφορυλίωση της RS περιοχής της P2P-R μπορεί να παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση SAFB1/P2P-R. Προκειμένου όμως να ελεγχθούν τέτοιου είδους υποθέσεις απαιτείται περεταίρω έρευνα. Από αυτήν την άποψη είναι σημαντικό να γίνει μελέτη τόσο της δομής όσο και των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη σύσταση των συμπλόκων που είναι συνδεδεμένα με την πυρηνική μήτρα. Η προσέγγιση αυτή κάθε άλλο παρά είναι εύκολη, δεδομένου ότι η χρονική διάρκεια ύπαρξης αυτών των συμπλόκων είναι πολύ μικρή. Επίδραση της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας στη δομή του αμινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) και στην αλληλεπίδρασή του με την ιστόνη Η3 Στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η επίδραση της φωσφορυλίωσης της RS ακολουθίας του αμινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) τόσο στη δομή όσο και στην αλληλεπίδρασή του με την ιστόνη Η3 και την πρωτεΐνη HP1. Το αμινοτελικό τμήμα του LBR είχε βρεθεί ότι δεσμεύει RNA το οποίο είναι καθοριστικό για τη διαλυτότητά του (Nikolakaki et al., 2008). Η περιοχή δέσμευσης του RNA βρέθηκε ότι είναι τα αμινοξέα 62 έως 92, η περιοχή δηλαδή που περιέχει την RS αλληλουχία και η παρουσία του RNA είναι απαραίτητη για να παραμένει η 172

πρωτεΐνη σε διαλυτή μορφή. Η φωσφορυλίωση του LBR από την SRPK1 έχει το ίδιο αποτέλεσμα στην διαλυτότητά του με το αποτέλεσμα που έχει η δέσμευση μορίων RNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση «μιμείται» από άποψη φορτίου την παρουσία μορίων RNA. Πολλές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης σχηματίζουν μακρομοριακά σύμπλοκα, όπως ο LBR, οι LAP1 και LAP2 πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες αυτές έχει προταθεί ότι λειτουργούν ως σημεία αγκίστρωσης της χρωματίνης στο πυρηνικό φάκελο ή ως σημεία αναδιοργάνωσης της χρωματίνης (Georgatos, 2001). Ωστόσο, δεν είναι ακόμα γνωστό εάν αυτές οι πρωτεΐνες ασκούν τον ρόλο τους ως μονομερή ή πολυμερή. Δεδομένα άλλων εργασιών (Makatsori et al., 2004), καθώς και δεδομένα από την παρούσα εργασία, δείχνουν ότι ο LBR πολυμερίζεται μέσω του αμινοτελικού του άκρου και σχηματίζει ολιγομερή. Επίσης, διάφορα πειράματα έδειξαν ότι ο LBR οργανώνεται σε μικροπεριοχές στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη (Makatsori et al. 2004). Η πιο αποδεκτή παρούσα άποψη είναι ότι ο LBR συνδέεται με την ετεροχρωματίνη με την μορφή ενός υψηλού μοριακού μεγέθους ολιγομερούς. Επεκτείνοντας την άποψη αυτή, προτείνουμε ότι όταν τα αμινοτελικά άκρα αρκετών κοντινών LBR μορίων είναι μη φωσφορυλιωμένα (ή όταν δεν συνδέονται με μόρια RNA) αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και σχηματίζουν ένα είδος πολυμερούς που αλληλεπιδρά με την χρωματίνη. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση αυξάνει την διαλυτότητα των RS περιοχών του LBR με αποτέλεσμα να έχουμε αποδιάταξη του πολυμερούς και τα αμινοτελικά άκρα να προεξέχουν ως «ουρές» στο νουκλεόπλασμα. Στη περίπτωση αυτή όλες οι ενδείξεις οδηγούν στην άποψη ότι δεν έχουμε σύνδεση με τη χρωματίνη (Pyrpasopoulou et al., 1996, Takano et al., 2004, Nikolakaki et al., 2008). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η φάση της μίτωσης, όπου εκεί παρατηρείται αποκόλληση της περιφερικής ετεροχρωματίνης από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Στην αρχή της μίτωσης παρατηρείται υπερφωσφορυλίωση της RS ακολουθίας του LBR από τις SRPK1 και cdc2 κινάσες, η οποία αναστέλλει τελείως την πρόσδεση των χρωμοσωμάτων (Nikolakaki et al., 1997, Takano et al., 2004). Δεδομένου ότι η φωσφορυλίωση από την SRPK1 οδηγεί σε αποπολυμερισμό των αμινοτελικών άκρων με αποτέλεσμα, όπως ήδη αναφέρθηκε, αυτά να προεξέχουν στο νουκλεόπλασμα είναι πιθανόν αυτά να αποτελούν σημεία πρόσδεσης διάφορων πρωτεϊνών όπως π.χ. η ιστόνη Η3. Ο πιθανότερος λόγος της πρόσδεσης είναι 173

προκειμένου η Η3 να υποστεί τις κατάλληλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις πριν ενσωματωθεί στη χρωματίνη. Υπάρχουν πρόσφατα αποτελέσματα που συνηγορούν σε αυτή την άποψη. Είναι γνωστό ότι προσθήκη βουτυρικού νατρίου έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4. Δεν είναι ξεκάθαρο που γίνεται αυτή η ακετυλίωση. Πρόσφατα όμως αποτελέσματα από τους Rada-Iglesias et al. (2007) έδειξαν ότι οι ακετυλιωμένες Η3 και Η4 συσσωρεύονται στην περιφέρεια του πυρήνα (σχήμα Δ.1). Είναι λοιπόν πιθανόν η ακετυλίωση αυτή να γίνεται στην πυρηνική περιφέρεια μέσω της πρόσδεσης των μη χρωματινικών Η3 και Η4 στο φωσφορυλιωμένο αμινοτελικό άκρο του LBR. Πρόσφατα επίσης αποτελέσματα στοιχειοθετούν την άποψη ότι πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης λειτουργούν ως σημεία πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων όταν αυτοί δεν βρίσκονται συνδεδεμένοι με τη χρωματίνη (Heessen and Fornerod, 2007). Σχήμα Δ1. Οι ακετυλιωμένες ιστόνες Η3 και Η4 που προκύπτουν μετά από επίδραση βουτυρικού νατρίου σε κύτταρα συσσωρεύονται στην πυρηνική περιφέρεια (Rada-Iglesias et al., 2007). Ένα ακόμα σημαντικό ερώτημα που προκύπτει είναι εάν πράγματι μόρια RNA αλληλεπιδρούν με τον LBR, και αν ναι, τι είδους μόρια RNA είναι αυτά. Εναλλακτικά, μόρια DNA θα μπορούσαν να συνδέονται στον LBR, μιας και η 174

περιφερική χρωματίνη είναι εμπλουτισμένη σε DNA. Έχει βρεθεί ότι μόρια RNA συνδέονται καλύτερα στο αμινοτελικό άκρο του LBR από ότι μόρια DNA. Θα πρέπει όμως να λαμβάνει κανείς υπ όψη ότι στη περιφέρεια του πυρήνα η συγκέντρωση μορίων DNA είναι πολλή μεγαλύτερη από τη συγκέντωση μορίων RNA, λόγω της ύπαρξης της περιφερικής ετεροχρωματίνης. Ενδιαφέρον όμως παρουσιάζει και το γεγονός ότι διάφορες μελέτες δείχνουν ότι μόρια RNA συμμετέχουν στο σχηματισμό της χρωματίνης. Σε κύτταρα ωοθηκών από κινέζικο χάμστερ (Chinese Hamster Ovary (CHO) cells) μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο που πραγματοποιήθηκαν είκοσι χρόνια πριν, έδειξαν την ύπαρξη πολλών μικρών μορίων RNAs (snrnas) στην περιφέρεια του πυρήνα και ιδιαίτερα σε περιοχές μεγάλης συμπύκνωσης της χρωματίνης (Lacoste-Royal and Simard, 1983). Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι ένα RNA συστατικό είναι υπεύθυνο για την διατήρηση της δομής της περικεντρικής ετεροχρωματίνης (Maison et al., 2004, Muchardt et al., 2002). Επιπλέον, προϊόντα μεταγραφής που προέρχονται από την περιοχή, η οποία διαχωρίζει γονίδια που κωδικοποιούν ριβοσωμικά RNA (intergenic spacer, IGS), απαιτούνται για την δημιουργία και τη διατήρηση μιας συγκεκριμένης ετεροχρωματινικης περιοχής στην περιοχή του προαγωγού ενός πληθυσμού τέτοιων γονιδίων (Mayer et al., 2006). Συμπερασματικά λοιπόν, μπορεί να ειπωθεί ότι ο ολιγομερισμός των RS ακολουθιών ή η αποδιάταξη τους μέσω φωσφορυλίωσης ή πρόσδεσης RNA μπορεί να ρυθμίζει σημαντικές πυρηνικές λειτουργίες. Στο επόμενο σχήμα φαίνονται διαγραμματικά οι μορφές που μπορεί να βρεθεί ο LBR (αλλά και γενικότερα μια πρωτεΐνη που περιέχει RS ακολουθίες) με βάση τις τροποποιήσεις/αλληλεπιδράσεις της RS ακολουθίας. 175

Σχήμα Δ.2. Προτεινόμενο μοντέλο για τον πολυμερισμό/αποπολυμερισμό πρωτεϊνών που περιέχουν περιοχή με RS αλληλουχία. Όταν η RS ακολουθία των RS πρωτεϊνών δεν είναι τροποποιημένη, οι RS πρωτεΐνες βρίσκονται σε συσσωματωμένη μορφή. Η σύνδεση RNA μορίων ή η φωσφορυλίωσή της RS περιοχής έχει σαν αποτέλεσμα οι πρωτεΐνες να είναι διαλυτές. Η φωσφορυλίωση μπορεί να πραγματοποιείται αποκλειστικά από μέλη της SRPK οικογένειας ή από μέλη τόσο της SRPK, αλλά και της CLK οικογένειας που έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνουν κάποιες RS πρωτεΐνες (Nikolakaki et al., 2002). Οι διαλυτές πρωτεΐνες μπορούν να μετατραπούν από την φωσφορυλιωμένη τους μορφή, στην μορφή που είναι συνδεδεμένη με RNA ή και το αντίθετο, με αποφωσφορυλίωση ή φωσφορυλίωση, αντίστοιχα σε συνδυασμό με την σύνδεση ή απομάκρυνση RNA μορίων. Η απομάκρυνση των RNA μορίων μπορεί να επιτυγχάνεται μέσω γεγονότων φωσφορυλίωσης/αποφωσφορυλίωσης, ενώ δεν αποκλείεται και η αποικοδόμηση των RNA μορίων. Από την εργασία μας προέκυψε και ένα πολύ ενδιαφέρον συμπέρασμα το οποίο πιθανά να έχει και γενικότερη σημασία για τον πιθανό ρόλο της φωσφορυλίωσης των RS ακολουθιών από τις SRPKs. Όπως ήδη αναφέρθηκε RS ακολουθίες απαντώνται σε ένα μεγάλο αριθμό ετερογενών πρωτεϊνών με διαφορετικές λειτουργικότητες και κυτταρική εντόπιση. Με μελέτη προσομοίωσης Μοριακής Δυναμικής (ΜΔ) της μη-φωσφορυλιωμένης αλλά και της φωσφορυλιωμένης RS περιοχής του ανθρώπινου LBR, προέκυψε ότι η ότι η φωσφορυλίωση προκαλεί μια δραματική αλλαγή στη διαμόρφωση της RS περιοχής. Ξεκινώντας από μια αρχική μη αναδιπλωμένη (extended) διαμόρφωση της RS ακολουθίας (RSRSRSRS) του ανθρώπινου LBR όλες οι προσομοιώσεις κατέληξαν 176