ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΟΠΤΙΚΩΝ ΛΑΒΙΔΩΝ ΚΑΙ ΜΟΝΟΜΟΡΙΑΚΟΥ FRET

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΠΜΣ ΝΑΝΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ & ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΚΑΤΡΑΝΙΔΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΟΠΤΙΚΩΝ ΛΑΒΙΔΩΝ ΚΑΙ ΜΟΝΟΜΟΡΙΑΚΟΥ FRET ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

Στους γονείς μου Χωρίς αυτούς δεν θα είχα φτάσει ως εδώ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σα βγεις στον πηγαιμό για την Ιθάκη, να εύχεσαι να ναι μακρύς ο δρόμος, γεμάτος περιπέτειες, γεμάτος γνώσεις. Καλύτερα χρόνια πολλά να διαρκέσει και γέρος πια ν αράξεις στο νησί, πλούσιος με όσα κέρδισες στον δρόμο. Κ. Καβάφης Σκεφτόμενος τώρα πια το διδακτορικό και όλη την πορεία προς την ολοκλήρωσή του στροβιλίζουν συνεχώς στο μυαλό μου οι παραπάνω στίχοι του Καβάφη. Διότι ήταν όντως μακρύς ο δρόμος και όχι πάντοτε βατός, όμως η αντιμετώπιση των κάθε είδους δυσκολιών ήταν που με ωρίμασαν ως επιστήμονα και ως άνθρωπο. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδρομής είχα την ευκαιρία να γνωριστώ και να συνεργαστώ με πάρα πολλούς ανθρώπους, των οποίων οι γνώσεις και η εμπειρία μόνο κέρδη μου απέφεραν και συνέβαλαν καθοριστικά στην σφυρηλάτηση της επιστημονικής μου κρίσης. Η περιπέτεια αυτή ξεκίνησε στο Εργαστήριο Βιοχημείας, του Τμήματος Χημείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Θεοδώρας Χολή-Παπαδοπούλου, την οποία θέλω να ευχαριστήσω θερμά για τις συμβουλές της, τη συμπαράστασή της και την εμπιστοσύνη που έδειξε προς το πρόσωπό μου σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής αλλά και τα χρόνια που προηγήθηκαν αυτής. Οφείλω να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Δρ. Γεώργιο Παπαδόπουλο, καθώς το θέμα της διατριβής στηρίχτηκε αρχικά πάνω σε μία δική του ιδέα, η οποία ξεκίνησε ως επιστημονική περιέργεια και με το χρόνο πήρε σάρκα και οστά, αλλά και για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις του καθόλη τη διάρκεια της διατριβής. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω όλα τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής για τις εύστοχες παρατηρήσεις και τις όποιες διορθώσεις τους επί της

ΠΡΟΛΟΓΟΣ διατριβής. Πιο συγκεκριμένα, τον Καθηγητή κ. Στέργιο Λογοθετίδη, για την ευκαιρία που μου έδωσε μέσω του Διατμηματικού Προγράμματος Νανοεπιστημών και Νανοτεχνολογιών να ξεκινήσω αυτή την περιπέτεια, τους καθηγητές κ. Δημήτριο Κυριακίδη και κ. Μηνά Αρσενάκη, καθώς και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Νικόλαο Φράγκη, οι οποίοι υπήρξαν διδάσκοντές μου κατά την διάρκεια του μεταπτυχιακού μου και με βοήθησαν, ο καθένας στον τομέα του, να αποκτήσω τις βάσεις για την περαιτέρω πορεία μου ως υποψήφιος διδάκτορας, τον Καθηγητή κ. Δημήτριο Καλπαξή, για τις ουσιαστικές υποδείξεις του πάνω στα ριβοσώματα, οι οποίες συνέβαλαν στην ορθή παρουσίασή τους κατά τη συγγραφή της συγκεκριμένης διατριβής και τέλος τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Χρήστο Παναγιωτίδη, για την ταχεία ανταπόκρισή του στην ανάγνωση και αξιολόγηση της διατριβής. Ευχαριστώ όλα τα μέλη του εργαστηρίου Βιοχημείας για την ευχάριστη συνεργασία και ιδιαίτερα τον Δρ. Φίλιππο Κωττάκη, για την βοήθειά του στα πρώτα στάδια της διατριβής και την υποψήφια διδάκτορα Κατερίνα Τσαγκάλια, για τις άπειρες συζητήσεις επί θεμάτων επιστημονικού περιεχομένου αλλά και γενικότερου ενδιαφέροντος. Πολλές ευχαριστίες οφείλω στον Prof. Georg Büldt, διευθυντή του Ινστιτούτου Δομικής Βιολογίας και Βιοφυσικής (ΙSΒ-2) του ερευνητικού κέντρου του Jülich (Forschungszentrum Jülich) στη Γερμανία, όπου εκπονήθηκε το μεγαλύτερο μέρος της διατριβής, για την ευκαιρία που μου έδωσε να εργαστώ σε ένα άρτια οργανωμένο εργαστήριο, για την καθοδήγηση και για την οικονομική στήριξη που μου προσέφερε. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω τον Dr. Jörg Fitter και την Dr. Ramona Schlesinger, για την καθημερινή καθοδήγησή τους και τις πολύωρες συζητήσεις σε θέματα που άπτονται του αντικειμένου τους, για τις έξυπνες παρατηρήσεις τους και για την υπομονή που έδειχναν στις αμέτρητες και ενοχλητικές ερωτήσεις μου. Ευχαριστώ πολύ τον Dr. Ingo Gregor, καθώς και τον υποψήφιο διδάκτορα Diaa Atta, για την πολύτιμη βοήθειά τους στην χρήση του μικροσκοπίου ευρέως πεδίου και των προγραμμάτων ανάλυσης των δεδομένων. Ευχαριστώ, επίσης, όλα τα μέλη του Ινστιτούτου ΙSΒ-2 για την ευχάριστη συνεργασία και ιδιαίτερα την Jana Kriegsmann, την Renu Batra-Safferling, την Ekaterina Moiseeva και τον Tobias Rosenkranz, για την παρέα και τα αστεία που κάναμε. Θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον Prof. Knud Nierhaus του Ινστιτούτου Μοριακής Γενετικής Max-Planck του Βερολίνου, που μοιράστηκε μαζί μου τις γνώσεις και την τεράστια εμπειρία του στα ριβοσώματα και μου επέτρεψε να

ΠΡΟΛΟΓΟΣ εργαστώ για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα υπό την επίβλεψή του, σε ένα από τα πιο κρίσιμα κομμάτια της διατριβής μου. Ευχαριστώ, επίσης, τα μέλη του εργαστηρίου του για την πολύτιμη βοήθειά τους και ιδιαίτερα τις τρεις κυρίες του εργαστηρίου, την Daniela Wittek, την Romi Gupta και την Zhala Karim για το ευχάριστο κλίμα. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Prof. Martin Hegner, για την ευκαιρία που μου έδωσε να χρησιμοποιήσω την τεχνική των Οπτικών Λαβίδων στα πειράματά μου, αρχικά στο τμήμα Φυσικής του Πανεπιστημίου της Βασιλείας στην Ελβετία και στη συνέχεια στο Ινστιτούτο CRANN του Trinity College του Δουβλίνου στην Ιρλανδία, και για τις εύστοχες παρατηρήσεις του. Επίσης, ευχαριστώ τον Dr. Wilfried Grange, για όλες τις προσπάθειες που κατέβαλε ώστε να γίνουν αυτές οι μετρήσεις. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τους λίγους πραγματικούς μου φίλους, οι οποίοι μου συμπαραστάθηκαν όλα αυτά τα χρόνια και ήταν εκεί όταν πραγματικά τους χρειάστηκα. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, για την αμέριστη συμπαράσταση και κατανόηση, για την συνεχή ενθάρρυνση και για την αγάπη τους, που με βοήθησαν να φτάσω ως εδώ. Αλέξανδρος Κατρανίδης

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 Α.1. ΡΙΒΟΣΩΜΑ... 1 Α.1.1. Γενικά... 1 Α.1.2. Ριβοσωμικά συστατικά... 3 Α.1.2.1. Ριβοσωμικές πρωτεΐνες... 3 Α.1.2.2. Ριβοσωμικό RNA (rrna)... 4 Α.1.3. Συγκρότηση ριβοσώματος... 6 Α.1.4. Δομή ριβοσώματος... 9 Α.1.4.1. Δομή ριβοσωμικών υπομονάδων... 9 Α.1.4.2. Σταθεροποίηση της δομής του ριβοσώματος... 11 Α.1.5. Λειτουργία ριβοσώματος... 11 Α.1.5.1. Έναρξη... 12 Α.1.5.2. Επιμήκυνση... 13 Α.1.5.3. Τερματισμός και ανακύκλωση του ριβοσώματος... 15 Α.1.5.4. Τερματισμός απουσία σήματος τερματισμού... 18 Α.1.6. Δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού... 19 Α.1.6.1. Εντοπισμός του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης... 19 Α.1.6.2. Καταλυτικός μηχανισμός της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού... 20 Α.1.7. Έξοδος της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης από την 50S υπομονάδα... 23 Α.1.8. Σωστή αναδίπλωση πρωτεϊνών... 25 Α.2. ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ... 27 Α.2.1. Εισαγωγή... 27 Α.2.2. Αρχές οπτικής παγίδευσης... 27 Α.2.3. Βελτιστοποίηση της παγίδευσης... 29 Α.2.4. Μέτρηση δυνάμεων... 30 Α.2.5. Οπτικές λαβίδες διπλής δέσμης... 32 Α.2.6. Πειραματική διάταξη... 33 Α.2.6.1. Εισαγωγή και ανίχνευση των δεσμών laser... 33 Α.2.6.2. Θάλαμος δείγματος... 34 Α.2.6.3. Σύστημα ανταλλαγής διαλυμάτων στον θάλαμο... 35 Α.2.6.4. Απεικόνιση πειράματος... 36 Α.3. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΛΟΓΩ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΚΑΤΑ FÖRSTER (FRET)... 37 Α.3.1. Εισαγωγή... 37 Α.3.2. Αρχές FRET... 37 Α.3.3. Θεωρία Förster... 40 i

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α.3.4. Εναλλασσόμενη διέγερση δείγματος (ALEX)... 42 Α.3.5. Πειραματική διάταξη... 43 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ....45 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 46 Β.1. ΥΛΙΚΑ... 46 Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια... 46 Β.1.2. Υλικά χρωματογραφίας... 46 Β.1.3. Βιολογικό υλικό... 47 Β.1.4. Υλικά μοριακής βιολογίας... 47 Β.2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ... 48 Β.2.1. Καλλιέργεια κυττάρων Ε.coli... 48 Β.2.2. Μέθοδοι προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών... 48 Β.2.2.1. Φασματοφωτομετρική μέθοδος... 48 Β.2.2.2. Χρωματομετρική μέθοδος Bradford, τροποποιημένη απο τον Bearden... 49 Β.2.2.3. Χρωματομετρική μέθοδος BCA... 49 Β.2.3. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS PAGE)... 50 Β.2.4. Στερέωση και χρώση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου... 53 Β.2.4.1. Χρώση με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250... 53 Β.2.5. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου-sds σε μεμβράνη... 53 Β.2.6. Χρώση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη... 54 Β.2.6.1. Χρώση με διάλυμα Ponceau S... 54 Β.2.7. Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη (Western Blot)... 55 Β.2.7.1. Μέθοδος ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL)... 56 Β.2.7.2. Χρωματομετρική μέθοδος... 57 Β.2.8. Απομόνωση 70S ριβοσωμάτων από E.coli... 59 Β.2.9. Διαχωρισμός 50S και 30S ριβοσωμικών υπομονάδων... 60 Β.2.10. Απομόνωση ριβοσωμικών πρωτεϊνών από την 50S υπομονάδα... 61 Β.2.11. Απομόνωση 23S + 5S rrna από την 50S υπομονάδα... 62 Β.2.12. Ολική ανασυγκρότηση 50S υπομονάδας... 63 Β.2.13. Επανασύνδεση ριβοσωμικών υπομονάδων... 65 Β.2.14. Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης... 66 Β.2.15. Σήμανση μορίων με φθορισμοφόρο... 68 Β.2.15.1. Σήμανση πρωτεϊνών... 68 Β.2.15.2. Σήμανση ριβοσωμάτων... 68 B.2.16. Πρόσδεση λαβών DNA σε χάντρες... 69 ii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Β.2.17. Επεξεργασία επιφανειών για ειδική πρόσδεση μορίων... 71 Β.2.18. Συζευγμένη μεταγραφή-μετάφραση σε σύστημα ελεύθερο κυττάρων... 73 Β.2.19. Τεχνική του κατασταλτικού trna... 75 Β.3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ... 76 Β.3.1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 76 Β.3.2. Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR... 78 Β.3.3. Ηλεκτροφόρηση DNA και RNA σε πηκτή αγαρόζης... 79 Β.3.4. Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης... 80 Β.3.5. Προσδιορισμός συγκέντρωσης DNA και RNA... 81 Β.3.5.1. Φασματοφωτομετρική μέθοδος... 81 Β.3.6. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς... 81 Β.3.6.1. Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού... 82 Β.3.6.2. Αποφωσφορυλίωση πλασμιδίου... 82 Β.3.6.3. Αντίδραση λιγάσης... 83 Β.3.7. Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό κυττάρων (competent cells)... 84 Β.3.7.1. Μέθοδος ψυχρών διαλυμάτων CaCl 2 για άμεση χρήση των κυττάρων... 84 B.3.7.2. Μέθοδος CaCl 2 για διατήρηση των κυττάρων... 84 Β.3.8. Εισαγωγή πλασμιδίου στα επιδεκτικά κύτταρα (μετασχηματισμός)... 86 Β.3.9. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (mini prep)... 87 Β.3.10. Εύρεση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας DNA (DNA sequencing)... 87 Β.3.11. Υπερέκφραση γονιδίων στο σύστημα pet... 90 B.3.12. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών με ουρά 6 ιστιδινών (His-tag)... 91 Β.3.13. Βιοτινυλίωση πρωτεϊνών in vivo... 93 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 96 Γ.1. ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ... 96 Γ.1.1. Βιοτινυλίωση της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης in vivo... 96 Γ.1.1.1. Απομόνωση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης... 96 Γ.1.1.2. Κλωνοποίηση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης στο πλασμίδιο pan5... 98 Γ.1.1.3. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων AVB101 από E. coli με το ανασυνδυασμένο 9λασμίδιο pan5 + L4 για την υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης.99 Γ.1.1.4. Έλεγχος βιοτινυλίωσης της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης... 100 Γ.1.2. Απομόνωση ριβοσωμάτων με ενσωματωμένη την βιοτινυλιωμένη L4... 102 Γ.1.2.1. Απομόνωση ριβοσωμάτων από κύτταρα AVB101 μετασχηματισμένα με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4... 102 Γ.1.2.2. Έλεγχος ενσωμάτωσης της βιοτινυλιωμένης L4 στα ριβοσώματα... 102 Γ.1.3 Μη ειδική σήμανση ριβοσωμάτων με φθορισμοφόρο... 103 Γ.1.4. Τροποποίηση γονιδιακής αλληλουχίας πρωτεϊνών για πειράματα οπτικών λαβίδων... 105 Γ.1.4.1. Εισαγωγή 30 αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο της GFPem... 106 iii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γ.1.4.2. Κλωνοποίηση του GFPem + 30 aa στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας... 107 Γ.1.4.3. Εισαγωγή κωδικονίου amber και His-tag στο αμινοτελικό άκρο της GFPem... 108 Γ.1.4.4. Κλωνοποίηση του amber-31aa-his στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας... 110 Γ.1.4.5. Απομόνωση γονιδίου ουβικιτίνης... 111 Γ.1.4.6. Κλωνοποίηση του His-Ubi στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας... 112 Γ.1.5. Ετοιμασία συστήματος για μέτρηση με οπτικές λαβίδες... 113 Γ.1.5.1. Σύνδεση ριβοσωμάτων σε χάντρες στρεπταβιδίνης... 113 Γ.1.5.2. In vitro μεταγραφή-μετάφραση χωρίς την προσθήκη ιστιδίνης... 113 Γ.1.5.3. Εισαγωγή συστήματος στο θάλαμο των οπτικών λαβίδων και σύλληψη της νεοσυντιθέμενης πρωτεϊνικής αλυσίδας με λαβή DNA... 115 Γ.2. ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ ΜΕ FRET... 117 Γ.2.1. Βιοτινυλίωση και απομόνωση ριβοσωμάτων από μεταλλαγμένα στελέχη που τους λείπουν οι πρωτεΐνες L24 και L29... 117 Γ.2.1.1. Έλεγχος μεταλλαγμένων στελεχών... 117 Γ.2.1.2. Μεταφορά του συστήματος βιοτινυλίωσης στα μεταλλαγμένα στελέχη... 118 Γ.2.1.3. Έλεγχος βιοτινυλίωσης της L4 στα μεταλλαγμένα στελέχη... 119 Γ.2.1.4. Απομόνωση ριβοσωμάτων από μεταλλαγμένα στελέχη μετασχηματισμένα με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4... 120 Γ.2.2. Έκφραση και σήμανση ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 και L29... 120 Γ.2.2.1. Εισαγωγή μετάλλαξης στα γονίδια των πρωτεϊνών L24 και L29... 120 Γ.2.2.2. Κλωνοποίηση των γονιδίων των πρωτεϊνών L24 I58C και L29 A63C στο πλασμίδιο pet27b... 123 Γ.2.2.3. Υπερέκφραση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 I58C και L29 Α63C... 124 Γ.2.2.4. Σήμανση πάνω στη στήλη Ni-NTA και καθαρισμός των σημασμένων L24 I58C και L29 Α63C... 125 Γ.2.3. Aνασυγκρότηση ριβοσωμάτων με σημασμένη την L24 ή L29... 126 Γ.2.3.1. Ολική ανασυγκρότηση 50S υπομονάδων που τους λείπει η πρωτεΐνη L24 ή L29 με τις σημασμένες L24 I58C και L29 A63C... 126 Γ.2.3.2. Επανασύνδεση 50S ανασυγκροτημένων υπομονάδων με 30S υπομονάδες... 127 Γ.2.4. Τροποποίηση γονιδιακής αλληλουχίας της GFPem... 127 Γ.2.4.1. Εισαγωγή κωδικονίου amber και His-tag στο αμινοτελικό άκρο της GFPem χωρίς ενδιάμεση αλληλουχία... 127 Γ.2.4.2. Κλωνοποίηση του γονιδίου GFPem 3 στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας... 129 Γ.2.5. Σύνδεση ριβοσωμάτων σε επιφάνειες... 130 Γ.2.5.1. Σύνδεση μη ειδικά σημασμένων ριβοσωμάτων σε επιφάνειες και σύνθεση GFPem... 130 iv

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γ.2.5.2. Σύνδεση ειδικά σημασμένων ριβοσωμάτων σε επιφάνειες και FRET... 134 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 139 Δ.1. ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ... 139 Δ.2. FRET... 148 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 157 SUMMARY...159 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ...161 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...165 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...171 v

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.1. Γενικά Τα ριβοσώματα είναι τα κυτταρικά σωματίδια που καταλύουν τον διαδοχικό πολυμερισμό αμινοξέων, σύμφωνα με τη γενετική πληροφορία που είναι κωδικοποιημένη σε ένα μόριο αγγελιοφόρου-rna (mrna), ώστε να βιοσυνθέσουν πρωτεΐνες. Οι βασικές τους λειτουργίες είναι η διασφάλιση της ορθής αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας που μεταφέρει το mrna και η δημιουργία πεπτιδικού δεσμού μεταξύ των αμινοξέων, αλλά είναι αρκετά πιθανή και η συμμετοχή τους στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών. Όλα τα κύτταρα περιέχουν ριβοσώματα καθώς για την ανάπτυξη και τη λειτουργία τους χρειάζεται συνεχής σύνθεση νέων πρωτεϊνών. Εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων καθώς και στους χλωροπλάστες και στα μιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών. Ο αριθμός των ριβοσωμάτων που υπάρχουν σε ένα κύτταρο είναι πολύ μεγάλος, κυμαίνεται από 10 4 στα προκαρυωτικά κύτταρα έως 10 7 στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Στα E.coli, τα ριβοσώματα αποτελούν γύρω στο 50% της συνολικής μάζας του κυττάρου. Τα ριβοσώματα είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικά (Ribo Nucleo Protein, RNP) σύμπλοκα, αποτελούμενα κατά τα 2 3 από RΝΑ και μόνο κατά το 1 3 από πρωτεΐνες (Ramakrishnan and Moore 2001; Moore and Steitz 2002). Σχηματίζονται από δύο άνισες σε μέγεθος υπομονάδες, την μικρή και την μεγάλη υπομονάδα. Οι δύο υπομονάδες έχουν διακριτές λειτουργίες. Η μικρή υπομονάδα εμπλέκεται στην αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας μεσολαβώντας στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ mrna και trnas, ενώ η μεγάλη υπομονάδα καταλύει την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού (Wilson and Noller 1998). Παρόλα αυτά για να ενεργοποιηθούν πρέπει να ενωθούν, ώστε να σχηματιστεί ένα πλήρες, λειτουργικό ριβόσωμα. Τα ριβοσώματα διαφέρουν σε μέγεθος από τα προκαρυωτικά στα ευκαρυωτικά, διατηρούν όμως την ίδια αρχιτεκτονική δομή και τον ίδιο τρόπο λειτουργίας (Dube et al. 1998; Ramakrishnan and Moore 2001). Στα προκαρυωτικά κύτταρα (βακτήρια και αρχαία), στους χλωροπλάστες και στα μιτοχόνδρια έχουν σταθερά καθίζησης 70S, (S=10-13 sec, η σταθερά Svedberg που έχει διαστάσεις χρόνου και δηλώνει την ταχύτητα καθίζησης του οργανιδίου κατά την φυγοκέντρηση) και μοριακή μάζα 1

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ περίπου 2,3 x 106 Daltons. Η μικρή υπομονάδα (30S), αποτελείται από ένα μόριο ριβοσωμικού RΝΑ (16S rrνα) και 21 ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Η μεγάλη υπομονάδα (50S) αποτελείται από δύο μόρια ριβοσωμικού RΝΑ (23S rrνα και 5S rrνα) και 34 διαφορετικές πρωτεΐνες (Εικόνα Α.1). Στο κυτταρόπλασμα των ευκαρυωτικών κυττάρων τα ριβοσώματα είναι σημαντικά μεγαλύτερα με σταθερά καθίζησης 80S και μοριακή μάζα που κυμαίνεται από 3,9 μέχρι 4,5 x 106 Daltons. Η μικρή υπομονάδα (40S) περιέχει ένα μόριο ριβοσωμικού RΝΑ (18S rrνα) και περίπου 30 ριβοσωμικές πρωτεΐνες ενώ η μεγάλη υπομονάδα (60S) περιέχει τρία μόρια ριβοσωμικού RΝΑ (28S, 5S και 5,8S rrνα) και 45-50 πρωτεΐνες (ο ακριβής αριθμός ποικίλλει μεταξύ των διαφόρων ειδών) (Εικόνα Α.1). Εικόνα Α.1. Σύσταση υπομονάδων προκαρυωτικών (www.bio.miami.edu/dana/104/ribosomes.jpg) 2 και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.2. Ριβοσωμικά συστατικά Α.1.2.1. Ριβοσωμικές πρωτεΐνες Η ονομασία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών αναφέρεται στην θέση τους στο ριβόσωμα (S και L για τις πρωτεΐνες της μικρής και της μεγάλης υπομονάδας αντίστοιχα) και στην ομολογία τους με ριβοσωμικές πρωτεΐνες άλλων οργανισμών. Στη μικρή υπομονάδα (30S) του ριβοσώματος των Ε.coli υπάρχουν 21 πρωτεΐνες και στη μεγάλη υπομονάδα (50S) 34 πρωτεΐνες. Για όλες είναι γνωστή η μοριακή τους μάζα, ο αριθμός και η αλληλουχία των αμινοξέων τους καθώς και η θέση τους στο ριβόσωμα (Wittmann, H. G. and Wittmann-Liebold 1974; Wittmann, H.G. et al. 1980). Οι πρωτεΐνες της 30S υπομονάδας αριθμούνται S1, S2,...έως S21 και της 50S υπομονάδας L1, L2,...έως L36. Η αρίθμηση γίνεται με βάση το μέγεθός τους, με τα πρώτα νούμερα να δηλώνουν τις μεγαλύτερες πρωτείνες και τα τελευταία τις μικρότερες. Οι πρωτεΐνες μπορούν να διαχωριστούν και να αναγνωριστούν αποτελεσματικά με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων (Wittmann, H. G. 1974; Geyl et al. 1981). Κάθε πρωτεΐνη βρίσκεται στο ριβόσωμα σε ένα αντίγραφο. Εξαίρεση αποτελούν οι πρωτεΐνες L7 και L12, οι οποίες σχηματίζουν σύμπλοκο και βρίσκονται σε τέσσερα αντίγραφα. Αυτές οι δύο πρωτεΐνες είναι ταυτόσημες με μόνη διαφορά την αμινοτελική σερίνη η οποία είναι ακετυλιωμένη στην L7 (Terhorst et al. 1972). Η πρωτεΐνη L8 αποδείχθηκε ότι είναι σύμπλοκο των τεσσάρων αντιγράφων της L7/L12 κι ενός αντιγράφου της L10 (Pettersson and Liljas 1979). Οι πρωτεΐνες αυτές (L7/L12) μαζί με την L10 απομονώνονται με τη μορφή πενταμερούς. Επίσης η πρωτεΐνη S20 της 30S υπομονάδας είναι όμοια με την πρωτεΐνη L26 της 50S υπομονάδας. Υπάρχει μόνο σε ένα αντίγραφο στο ριβόσωμα, είτε στη μικρή είτε στη μεγάλη υπομονάδα. Έτσι, αν αφαιρεθούν οι πρωτεΐνες L8 (πενταμερές), L7 (ίδια με την L12 αλλά Ν-ακετυλιωμένη) και L26 (προσμετράται μία φορά ως S20) υπάρχουν 54 διαφορετικές πρωτεΐνες στο 70S ριβόσωμα των Ε. coli και όχι 57 όπως φαίνεται από την αρίθμηση των πρωτεϊνών. Οι περισσότερες ριβοσωμικές πρωτεΐνες περιέχουν μεγάλο ποσοστό από λυσίνες και αργινίνες και γι αυτό είναι βασικές πρωτεΐνες με ισοηλεκτρικά σημεία μεταξύ 8,5 και 10. Οι μόνες όξινες πρωτεΐνες είναι οι S1, S6 και L7/L12 με μεγάλο ποσοστό από γλουταμινικό οξύ και ασπαραγινικό οξύ. Ένας μεγάλος αριθμός ριβοσωμικών 3

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ πρωτεϊνών παρουσιάζει παντελή έλλειψη συγκεκριμένων αμινοξέων. Τα τέσσερα αμινοξέα που λείπουν πιο συχνά είναι η κυστεΐνη, η μεθειονίνη, η τρυπτοφάνη και η τυροσίνη. Αυτά τα αμινοξέα θεωρούνται τα πιο απαραίτητα για τη διατροφή των θηλαστικών αλλά προφανώς όχι για το ριβόσωμα. Οι πρωτεΐνες συνεισφέρουν στην σταθεροποίηση της δομής του ριβοσώματος καθώς το θετικό τους φορτίο αντισταθμίζει το αρνητικό φορτίο των φωσφορικών ομάδων του ριβοσωμικού RΝΑ. Αυτό αποδείχθηκε και με βάση τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Wimberly et al. 2000). Οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια του ριβοσώματος, που συνηγορεί υπέρ της άποψης ότι προστέθηκαν σε αργότερα στάδια της εξέλιξης με σκοπό να συντονίσουν καλύτερα τη λειτουργία του. Καθώς είναι τοποθετημένες περιφερειακά του ριβοσώματος, κάποια τμήματα ή πλευρικές αλυσίδες τους είναι στραμμένα προς τα έξω και βοηθούν σημαντικά στην αποτελεσματική δέσμευση μη ριβοσωμικών συστατικών απαραίτητων για την διαδικασία της μετάφρασης. Γενικά οι πρωτοταγείς δομές των ριβοσωμικών πρωτεϊνών είναι πολύ συντηρημένες μέσα στην εξέλιξη. Στα ευκαρυωτικά ριβοσώματα οι μισές ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχουν ισοδύναμες ή ομόλογες μεταξύ των προκαρυωτικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών ενώ οι υπόλοιπες είναι μοναδικές κι εμφανίζονται μόνο στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Α.1.2.2. Ριβοσωμικό RNA (rrna) Το 70S ριβόσωμα περιέχει τρία μόρια ριβοσωμικού RΝΑ: το 16S rrνα στη μικρή υπομονάδα και τα 23S και 5S στη μεγάλη υπομονάδα. Στα 16S και 23S rrναs έχει παρατηρηθεί η ύπαρξη τροποποιημένων νουκλεοτιδίων. Οι κυριότερες τροποποιήσεις που παρατηρούνται είναι η μεθυλίωση (είτε στη 2' θέση της ριβόζης είτε στη βάση) και η ύπαρξη ψευδοουριδίνης (ψ). Η μεθυλίωση στη ριβόζη φαίνεται πως προστατεύει τον γειτονικό φωσφοδιεστερικό δεσμό από τη δράση ριβονουκλεασών, γι αυτό οι μεθυλομάδες των ριβοζών συνδέονται στα πρώτα στάδια της βιοσύνθεσης των ριβοσωμάτων όπου το rrνα είναι ακόμη εκτεθειμένο στις ριβονουκλεάσες και απαιτείται άμεση προστασία του. Αντίθετα οι τροποποιήσεις των βάσεων λαμβάνουν χώρα στα τελευταία στάδια της βιοσύνθεσης του ριβοσώματος παίζοντας ενδεχομένως ρόλο στη λειτουργία του ώριμου ριβοσώματος. Το 16S rrνα είναι το ριβονουκλεϊκό οξύ της μικρής υπομονάδας (30S) και είναι υπεύθυνο για τη συγκρότηση της δομής του κέντρου αποκωδικοποίησης, όπου το 4

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ κωδικόνιο του mrna ενώνεται με το αντικωδικόνιο του trna. Η πρωτοταγής δομή του 16S rrνα από E.coli προσδιορίστηκε από την ομάδα του Noller (Brosius et al. 1978). Aποτελείται από 1542 νουκλεοτίδια, από τα οποία περίπου 10 είναι μεθυλιωμένα. Τα 8 από αυτά εντοπίζονται στην περιοχή του κέντρου αποκωδικοποίησης. Κανένα από τα τροποποιημένα νουκλεοτίδια δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη μετάφραση, παρόλα αυτά αν η τροποποίηση λείπει τότε η μετάφραση είναι λιγότερο ακριβής. Το 23S rrνα είναι το μεγαλύτερο δομικό στοιχείο της μεγάλης υπομονάδας (50S). Είναι υπεύθυνο για την κατασκευή του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και παρέχει θέσεις σύνδεσης για τους παράγοντες επιμήκυνσης. Η πρωτοταγής δομή του 23S rrνα από E.coli προσδιορίστηκε επίσης από την ομάδα του Noller λίγο αργότερα (Brosius et al. 1980) και αποτελείται από 2904 νουκλεοτίδια, πολλά από τα οποία είναι τροποποιημένα. Το 5S rrνα είναι επίσης συστατικό της 50S υπομονάδας. Η ακριβής λειτουργία του δεν είναι ακόμα σαφής, αν και πιστεύεται ότι σταθεροποιεί ακόμα περισσότερο τη δομή του ριβοσώματος. Αποτελείται από 120 νουκλεοτίδια χωρίς καμία τροποποίηση (Barciszewska et al. 2001). Η δευτεροταγής δομή των ριβοσωμικών RNAs αποτελείται από μία πολύπλοκη διευθέτηση ελίκων Α-μορφής και μη ελικοειδών περιοχών (Ramakrishnan and Moore 2001) (Εικόνα Α.2). Η τριτοταγής δομή των ριβοσωμικών RNAs έχει πρόσφατα αναλυθεί σε μεγάλο βαθμό μετά από τη δημοσίευση της δομής της 30S υπομονάδας από τον οργανισμό Τ.thermophilus (Schluenzen et al. 2000; Wimberly et al. 2000) και της 50S υπομονάδας από τον οργανισμό Η.marismortui (Ban et al. 2000). Στο 16S rrνα κάθε μία από τις τέσσερις περιοχές της δευτεροταγούς δομής σχηματίζει ένα μορφολογικά διακριτό τμήμα της 30S υπομονάδας. Αντίθετα στο 23S rrνα οι έξι περιοχές της δευτεροταγούς δομής περιπλέκονται μεταξύ τους και σχηματίζουν μία συμπαγή δομή (Ramakrishnan and Moore 2001) (Εικόνα Α.2). Ο χώρος μεταξύ των δύο υπομονάδων του ριβοσώματος και ειδικά οι περιοχές δέσμευσης trna και mrna στην διεπιφάνεια αποτελούνται αποκλειστικά από rrna. Επίσης αποδείχθηκε ότι η περιοχή όπου λαμβάνει χώρα η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού συγκροτείται αποκλειστικά από rrνα, με αποτέλεσμα να αποδίδεται η δράση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης αποκλειστικά σε αυτό. Έτσι τελευταίως έχει επικρατήσει η άποψη ότι το ριβόσωμα είναι ένα ριβόζυμο. (Nissen et al. 2000). 5

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Εικόνα Α.2. Δευτεροταγείς και τριτοταγείς δομές rrna από (a) 30S και (b) 50S υπομονάδες. Κάθε περιοχή έχει ίδιο χρώμα στην δευτεροταγή και στην τριτοταγή δομή (Ramakrishnan and Moore 2001). Α.1.3. Συγκρότηση ριβοσώματος Δεδομένου του μεγάλου αριθμού των ριβοσωμικών συστατικών, η σύνθεσή τους και η συγκρότηση του ριβοσώματος πρέπει να γίνουν απόλυτα συντονισμένα. Κάποιες από τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες δεσμεύονται στο rrna χωρίς καμία συνέργεια και είναι απαραίτητες για το σχηματισμό μιας πλήρως ενεργούς υπομονάδας. Αυτές οι πρωτεΐνες ξεκινούν την ορθή συγκρότηση των ριβοσωμικών υπομονάδων, που θα δώσουν στη συνέχεια ένα λειτουργικό ριβόσωμα. Βρέθηκε ότι μόνο δύο πρωτεΐνες για κάθε υπομονάδα επιτελούν αυτή τη λειτουργία. Για την 50S υπομονάδα αυτές οι πρωτεΐνες είναι οι L3 και L24 (Nowotny and Nierhaus 1982), αν και βρέθηκε ότι σε μεταλλαγμένα στελέχη, όπου η L24 λείπει τελείως από τα ριβοσώματα, η L20 μπορεί να την αντικαταστήσει (Franceschi and Nierhaus 1988). Για την 30S υπομονάδα οι δύο πρωτεΐνες είναι οι S4 και S7 (Nowotny and Nierhaus 1988). 6

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Στην 50S υπομονάδα εκτός από τις L3 και L24, που ξεκινούν τη συγκρότηση, υπάρχουν άλλες τέσσερις πρωτεΐνες που συνδέονται στο πρώιμο στάδιο της συγκρότησης. Αυτές είναι οι L4, L13, L20 και L22, οι οποίες μαζί με την L24 συνδέονται στο 5 -άκρο του 23S rrna, ενώ η L3 είναι η μοναδική που συνδέεται στο 3 -άκρο. Οι πρωτεΐνες αυτές συνδέονται στο 5 -άκρο του rrna αμέσως μετά τη μεταγραφή και πριν ολοκληρωθεί η σύνθεση ολόκληρου του μορίου. Γίνεται δηλαδή μία σύζευξη μεταξύ της σύνθεσης του rrna και της συγκρότησης του ριβοσώματος. Κατ αυτόν τον τρόπο η εντροπία της in vivo συγκρότησης είναι πολύ χαμηλότερη από την αντίστοιχη, κατά την ολική ανασυγκρότηση του ριβοσώματος από τα συστατικά του in vitro. Αυτό συμβαίνει γιατί in vivo η έναρξη της συγκρότησης έχει να κάνει με ένα περιορισμένο αριθμό συστατικών, ενώ in vitro, όπου ολόκληρο το μόριο του rrna είναι παρόν, όλες οι πρωτεΐνες συναγωνίζονται για τη σύνδεσή τους, γεγονός που αυξάνει την αταξία του συστήματος. Έτσι εξηγείται εν μέρει γιατί in vivo χρειάζονται λίγα λεπτά στους 37 ο C, ενώ in vitro 90 λεπτά στους 50 ο C. Όλες οι υπόλοιπες πρωτεΐνες, καθώς και το 5S rrna, μπορούν να θεωρηθούν ότι συνδέονται στο τελικό στάδιο της συγκρότησης της 50S υπομονάδας. Παρόλα αυτά δύο είναι οι πρωτεΐνες, οι οποίες παίζουν ενεργό ρόλο στην οργάνωση του τελικού βήματος της συγκρότησης, οι L15 και L16 (Franceschi and Nierhaus 1990). Δεν μπορούν, επίσης, να υπάρξουν πλήρως ενεργά ριβοσώματα χωρίς το 5S rrna. (Εικόνα Α.3a). Στο πρώιμο στάδιο της συγκρότησης της 30S υπομονάδας, εκτός από τις S4 και S7, συνδέονται επίσης οι πρωτεΐνες S8, S16 και S19 (Traub and Nomura 1969). Αν και η σύνδεσή τους δεν γίνεται με τόσο ξεκάθαρη προτίμηση προς το 5 -άκρο, όπως στη μεγάλη υπομονάδα, εντούτοις κινητικές μελέτες έδειξαν επίσης διαδοχική συγκρότηση από το 5 -άκρο προς το 3 -άκρο κατά μήκος του 16S rrna (Powers et al. 1993). Οι πρωτεΐνες που συνδέονται στο δεύτερο στάδιο εξαρτώνται από τις πρωτεΐνες του πρώιμου σταδίου. Αυτό δεν σημαίνει απαραίτητα ότι αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Είναι πολύ πιθανό μία πρωτεΐνη καθώς συνδέεται να επάγει μία δομική αλλαγή του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού σωματιδίου, η οποία να δημιουργεί νέες θέσεις δέσμευσης για άλλα συστατικά. Τέλος, οι πρωτεΐνες που συνδέονται στο τρίτο στάδιο χρειάζονται τουλάχιστον μία πρωτεΐνη από το πρώτο στάδιο και μία από το δεύτερο στάδιο ώστε να συνδεθούν σωστά (Εικόνα Α.3b). Καθώς η συγκρότηση ακολουθεί τη σύνθεση του 16S rrna από το 5 -άκρο προς το 3 -άκρο, πρώτα συγκροτείται με τη βοήθεια της S4 η 5 -περιοχή και η κεντρική 7

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ περιοχή και ακολουθεί με τη βοήθεια της S7 η 3 -περιοχή, που περιλαμβάνει το κέντρο αποκωδικοποίησης και την αντι-shine-dalgarno ακολουθία. Εικόνα Α.3. Χάρτες συγκρότησης ριβοσώματος από E.coli. (a) 50S υπομονάδα (Herold and Nierhaus 1987). Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις και τα μαύρα ασθενείς (b) 30S υπομονάδα (Recht and Williamson 2001). Τα έντονα βέλη υποδεικνύουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις και τα λιγότερο έντονα ασθενείς. 8

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.4. Δομή ριβοσώματος Α.1.4.1. Δομή ριβοσωμικών υπομονάδων Η 50S υπομονάδα είναι αρκετά σφαιρική και συμμετρική με μια γραμμική διάμετρο 200Å έως 250Å σε κάθε κατεύθυνση. Περιλαμβάνει τρεις προεξοχές στο επάνω τμήμα της, αυτό που έρχεται σε επαφή με την 30S υπομονάδα κατά τη συγκρότηση του 70S ριβοσώματος. Οι προεξοχές αυτές διαφέρουν σε σχήμα και μέγεθος. Η κεντρική προεξοχή (Central Proturberance, CP) αποτελεί την κεφαλή της μεγάλης υπομονάδας, ενώ από τις πλευρικές η μία είναι επιμήκης, ονομάζεται "L7/L12 μίσχος" (L7/L12 Stalk) επειδή εκεί εντοπίζεται η πρωτεΐνη L7/L12 ενώ η άλλη ονομάζεται "L1 μίσχος" (L1 Stalk) και περιέχει την πρωτεΐνη L1 (Harms et al. 2001) (Εικόνα Α.4). Εικόνα Α.4. Δομή 50S υπομονάδας. Το rrna φαίνεται γκρίζο και οι πρωτεΐνες με διάφορα χρώματα. Ο L7/L12 μίσχος φαίνεται στα δεξιά, ο L1 μίσχος στα αριστερά και η κεντρική προεξοχή συμπεριλαμβανομένου του 5S rrna στο κέντρο (Harms et al. 2001). Η 30S υπομονάδα είναι ένα ασύμμετρο σωματίδιο διαμέτρου 230Å που αποτελείται από δύο κύριες περιοχές: την "κεφαλή" (Head), που καταλαμβάνει περίπου το ένα τρίτο και η οποία συνδέεται μέσω του "λαιμού" (Neck) με το "σώμα" (Body), που καταλαμβάνει τα υπόλοιπα δύο τρίτα της υπομονάδας. Στο σώμα περιλαμβάνονται επιπλέον δομικά στοιχεία, όπως μία πλευρική προεξοχή που ονομάζεται "πλατφόρμα" (Platform), ο "ώμος" (Shoulder) και η "βάση ή σπιρούνι" (Bottom ή Spur). (Schluenzen et al. 2000) (Εικόνα Α.5). 9

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Εικόνα Α.5. Δομή 30S υπομονάδας. Φαίνονται τα διάφορα δομικά στοιχεία της υπομονάδας, καθώς και το κέντρο αποκωδικοποίησης (Schluenzen et al. 2000). 10

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.4.2. Σταθεροποίηση της δομής του ριβοσώματος Όπως προαναφέρθηκε τα 2 3 του ριβοσώματος αποτελούνται από rrna, πράγμα που σημαίνει ότι το ριβόσωμα είναι ένα μεγάλο πολυανιόν. Υπάρχουν τριών ειδών αλληλεπιδράσεις, οι οποίες σταθεροποιούν τη τριτοταγή δομή του rrna: οι γέφυρες Mg 2+, αλληλεπιδράσεις RNA-RNA και αλληλεπιδράσεις RNA-πρωτεϊνών. Τα ιόντα μαγνησίου δημιουργούν ουδέτερες γέφυρες μεταξύ φωσφορικών ομάδων από διαφορετικές δευτεροταγείς δομές που έρχονται κοντά μεταξύ τους. Απομάκρυνση των ιόντων μαγνησίου οδηγεί σε διαχωρισμό του ριβοσώματος στις υπομονάδες του. Αλληλεπιδράσεις RNA-RNA σημαίνει είτε δημιουργία ζευγών βάσεων μεταξύ διαφορετικών δευτεροταγών δομών είτε δημιουργία A-ελάσσονων μοτίβων (A-minor motifs), όπου μία αδενίνη σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με μία ή δύο υδροξυλομάδες ενός ζεύγους γουανίνης-κυτοσίνης (Nissen et al. 2001). Στις αλληλεπιδράσεις RNA-πρωτεϊνών, οι πρωτεΐνες συνδέονται κυρίως με τα σάκχαρα και τις φωσφορικές ομάδες του rrna. Αυτό σημαίνει ότι οι πρωτεΐνες αναγνωρίζουν τη μορφή του rrna και όχι συγκεκριμένες βάσεις, οπότε οι αλληλεπιδράσεις είναι μη ειδικές ως προς την νουκλεοτιδική ακολουθία του rrna. Αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.1.2.1. ότι οι περισσότερες ριβοσωμικές πρωτεΐνες βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια του ριβοσώματος. Πολλές από αυτές έχουν μη σφαιρικές προεκτάσεις, οι οποίες εισχωρούν μέσα στο ριβόσωμα και γεμίζουν τα κενά μεταξύ των ελίκων του rrna. Σε απομονωμένες ριβοσωμικές πρωτεΐνες αυτές οι προεκτάσεις, που περιέχουν περίπου 26% αργινίνη και λυσίνη, μοιάζουν με τυχαίες έλικες, οι οποίες αποκτούν την δομή που έχουν στο ριβόσωμα μόλις συνδεθούν σε αυτό. Α.1.5. Λειτουργία ριβοσώματος Όπως προαναφέρθηκε η βασική λειτουργία του ριβοσώματος είναι η σύνθεση πρωτεϊνών, μία διαδικασία που ονομάζεται μετάφραση. Το ριβόσωμα διαβάζει τριπλέτες νουκλεοτιδίων από το mrna και τις μετατρέπει στα αντίστοιχα αμινοξέα που συνθέτουν την πρωτεΐνη, με απαραίτητα για την μετατροπή ενδιάμεσα μόρια τα μεταφορικά RNAs (trnas). Αρχικά είχαν προταθεί δύο θέσεις δέσμευσης στο ριβόσωμα για τα trnas, η Α-θέση (Aminoacyl), όπου δεσμεύεται το εισερχόμενο αμινοάκυλο-trna και η Ρ-θέση (Peptidyl), όπου δεσμεύεται το πεπτίδυλο-trna με την νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Αργότερα προτάθηκε μία τρίτη θέση 11

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ δέσμευσης, η Ε-θέση (Exit), από όπου το απακυλιωμένο πλέον trna απελευθερώνεται από το ριβόσωμα (Rheinberger et al. 1981; Grajevskaja et al. 1982; Yusupov et al. 2001). Κατά την μετάφραση διακρίνονται τρία βασικά στάδια: η έναρξη, η επιμήκυνση και ο τερματισμός. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η σύνθεση των πρωτεϊνών είναι πιο πολύπλοκη, παρόλα αυτά ακολουθεί τις ίδιες αρχές. Παρακάτω περιγράφεται η διαδικασία για τα προκαρυωτικά κύτταρα (Εικόνα Α.6). Α.1.5.1. Έναρξη Η σύνθεση των πρωτεϊνών ξεκινάει με το κωδικόνιο ΑUG (κωδικόνιο έναρξης), το οποίο αντιστοιχεί στο αμινοξύ μεθειονίνη. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, η πλειονότητα των mrnas περιέχει ανοδικά (~10 νουκλεοτίδια) του κωδικονίου έναρξης μια περιοχή πλούσια σε πουρίνες, μεγέθους 7-15 νουκλεοτιδίων, η οποία ονομάζεται ακολουθία Shine-Dalgarno (SD). Η περιοχή αυτή είναι συμπληρωματική μιας περιοχής στο 3' άκρο του 16S rrνα, πλούσιας σε πυριμιδίνες, (αντι-shine- Dalgarno) και βοηθά στην επιλογή του εναρκτήριου ΑUG (Shine and Dalgarno 1974). met Το trna f (εναρκτήριο trna), που αναγνωρίζει το κωδικόνιο έναρξης, διαφέρει από τα trna met (trnas επιμήκυνσης), που αλληλεπιδρούν με τα κωδικόνια εσωτερικών μορίων μεθειονίνης, παρ' όλο που και τα δύο αναγνωρίζουν το κωδικόνιο AUG. Το εναρκτήριο trna περιέχει δομικά χαρακτηριστικά, τα οποία αναγνωρίζονται από τους παράγοντες έναρξης και επιπλέον εμποδίζουν την αναγνώριση από τους παράγοντες επιμήκυνσης (Varshney et al. 1993). Επίσης είναι το μοναδικό trna που δεσμεύεται απ' ευθείας στην P-θέση του ριβοσώματος. Και το trna met f και το trna met αμινοακυλιώνονται με μεθειονίνη από το ίδιο ένζυμο, την μεθειόνυλο-trna συνθετάση. Στη συνέχεια, όμως, το Met-tRNA met f φορμυλιώνεται από ένα ειδικό ένζυμο, την μεθειόνυλο-trna τρανσφορμυλάση και προκύπτει το fmet-trna met f. Η τρανσφορμυλάση αυτή δεν αναγνωρίζει το Met-tRNA met. Στα προκαρυωτικά υπάρχουν τρεις πρωτεϊνικοί παράγοντες, οι οποίοι βοηθούν στο σχηματισμό του εναρκτήριου συμπλόκου και ονομάζονται παράγοντες έναρξης (Initiation Factors, IF). Οι παράγοντες αυτοί είναι οι IF1, IF2 και IF3 (Laursen et al. 2005). Ο IF1 δεσμεύεται ειδικά στη βάση της Α-θέσης στην 30S υπομονάδα και με αυτό τον τρόπο εμποδίζει οποιαδήποτε δέσμευση σε αυτή τη θέση (Dahlquist and Puglisi 2000; Carter et al. 2001). Επίσης επάγει την δέσμευση του IF3 στη βάση της 12

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Ε-θέσης στην 30S υπομονάδα. Ο IF3 παρεμποδίζει την σύνδεση των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων σε αυτό το στάδιο (Grunberg-Manago et al. 1975). Στη συνέχεια ακολουθεί η δέσμευση του mrna μέσω της αλληλεπίδρασης της ακολουθίας SD με την αντι-sd ακολουθία του 16S rrna και η σωστή τοποθέτηση του εναρκτήριου κωδικονίου AUG στην Ρ-θέση, που υποβοηθείται από τον IF3. Κατόπιν ο IF2, που είναι μία G-πρωτεΐνη, αφού αναγνωρίσει το εναρκτήριο fmettrna met f λόγω της φορμυλίωσης, το μεταφέρει στην Ρ-θέση καθώς οι θέσεις Α και Ε παρεμποδίζονται από τους IF1 και IF3, αντίστοιχα. Σε αυτό το στάδιο, ο IF3 ελέγχει τη συμβατότητα κωδικονίου-αντικωδικονίου και σταθεροποιεί τη δέσμευση του met fmet-trna f στην Ρ-θέση ή αποσταθεροποιεί αντίστοιχα τυχόν λανθασμένη σύνδεση (Gualerzi et al. 1977)}(Εικόνα Α.6, βήμα 1). Με τη σταθεροποίηση της δέσμευσης του fmet-trna met f στην Ρ-θέση, οι IF1 και IF3 αποδεσμεύονται από την 30S υπομονάδα ελευθερώνοντας αντίστοιχα και τις θέσεις Α και Ε. Ο ΙF2 επάγει τη σύνδεση της 50S υπομονάδας, η οποία είναι πλέον εφικτή, καθώς ο IF3 που την παρεμπόδιζε έχει ήδη αποδεσμευτεί. Ο ΙF2 επίσης met βοηθάει το fmet-trna f να τοποθετηθεί σωστά στην Ρ-θέση του 70S πλέον και κατόπιν αποδεσμεύεται από το ριβόσωμα. Για την αποδέσμευση απαιτείται μια εξαρτώμενη από τον IF2 υδρόλυση του GTP σε GDP και Pi (Tomsic et al. 2000). Με το σχηματισμό του εναρκτήριου 70S συμπλόκου η φάση της έναρξης ολοκληρώνεται και το ριβόσωμα είναι έτοιμο να εισέλθει στη φάση της επιμήκυνσης (Εικόνα Α.6, βήμα 2). Α.1.5.2. Επιμήκυνση Η φάση της επιμήκυνσης είναι η καρδιά της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Είναι μία κυκλική διαδικασία, κάθε κύκλος της οποίας επιμηκύνει την νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα κατά ένα αμινοξύ (Εικόνα Α.6, βήμα 3-9). Μπορεί να χωριστεί σε τρια βασικά στάδια. Στα προκαρυωτικά υπάρχουν δύο πρωτεϊνικοί παράγοντες, οι οποίοι καταλύουν συγκεκριμένες αντιδράσεις αυτών των σταδίων και ονομάζονται παράγοντες επιμήκυνσης (Elongation Factors, EF). Οι παράγοντες αυτοί είναι οι EF- Tu και EF-G. Το πρώτο στάδιο ξεκινάει με την είσοδο ενός αμινοάκυλο-trna (aa-trna) στην Α-θέση του ριβοσώματος. Για να επιτευχθεί αυτό, αρχικά ο EF-Tu σχηματίζει ένα τριμερές σύμπλοκο με το aa-trna και με ένα μόριο GTP. Το τριμερές σύμπλοκο είναι που αναγνωρίζει και εισέρχεται στην Α-θέση του ριβοσώματος (Εικόνα Α.6, 13

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ βήμα 4 και 9). Εκεί λαμβάνουν χώρα δύο ξεχωριστά γεγονότα. Στην αρχή η Α-θέση έχει χαμηλή αγχιστεία για το τριμερές σύμπλοκο και απλά ελέγχονται οι αλληλεπιδράσεις κωδικονίου-αντικωδικονίου (Ogle et al. 2001; Steitz 2008). Μόλις επιβεβαιωθεί η δέσμευση του σωστού aa-trna, η αγχιστεία αυξάνεται και ενεργοποιείται η δράση GTPάσης του EF-Tu (Rodnina et al. 1996). Ο προκύπτων EF- Tu GDP απελευθερώνεται από το aa-trna και το ριβόσωμα (Εικόνα Α.6, βήμα 5). Το GDP ανταλάσσεται με GTP από τον παράγοντα EF-Ts, ώστε ο EF-Tu να μπορεί να ξανασχηματίσει τριμερές σύμπλοκο με ένα καινούριο aa-trna. Στο τέλος του πρώτου σταδίου, λοιπόν, υπάρχει το fmet-trna met f δεσμευμένο στην Ρ-θέση και ένα aa-trna στην Α-θέση. Αυτή η κατάσταση του ριβοσώματος με τις θέσεις Ρ και Α δεσμευμένες και την Ε-θέση κενή ονομάζεται προ-κατάσταση (PRE-state). Στο δεύτερο στάδιο λαμβάνει χώρα η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Peptidyl Transferase Center, PTC) της 50S υπομονάδας. Η αμινομάδα του αμινοξέος του aa-trna της Α-θέσης αντιδρά με την καρβονυλομάδα του πεπτιδίου που είναι δεσμευμένο στο πεπτίδυλο-trna της Ρ- θέσης δημιουργώντας έναν πεπτιδικό δεσμό (Εικόνα Α.6, ένθετο). Έτσι το aa-trna μετατρέπεται σε πεπτίδυλο-trna μεγαλύτερο κατά ένα αμινοξύ και το πρώην πεπτίδυλο-trna απακυλιώνεται. Στο τέλος του δεύτερου σταδίου, δηλαδή, υπάρχει ένα απακυλιωμένο trna στην Ρ-θέση και ένα πεπτίδυλο-trna στην Α-θέση. Με την δημιουργία του πρώτου πεπτιδικού δεσμού η αλληλεπίδραση της ακολουθίας SD με την αντι-sd ακολουθία αποσταθεροποιείται, γεγονός που εξασθενεί τη δύναμη με την οποία το ριβόσωμα κρατάει το mrna. Αυτό ίσως είναι σημαντική προϋπόθεση, ώστε να μπορεί να ακολουθήσει η μετακίνηση του mrna και των δύο trnas στο ριβόσωμα (Uemura et al. 2007). Στο τρίτο στάδιο το ριβόσωμα μεταφέρει το απακυλιωμένο trna από την Ρ- θέση στην Ε-θέση και το πεπτίδυλο-trna από την Α-θέση στην Ρ-θέση. Η διαδικασία αυτή πρέπει να είναι εξαιρετικά ακριβής. Τα trnas πρέπει να μετακινηθούν ακριβώς 10Å (το μήκος ενός κωδικονίου), αλλιώς κινδυνεύει να αλλάξει το αναγνωστικό πλαίσιο. Η διαδικασία αυτή καταλύεται από τον EF-G, ο οποίος είναι επίσης μία G-πρωτεΐνη. Ο EF-G δεσμεύεται στην Α-θέση και μετακινεί το mrna με τα δύο trnas κατά τρία νουκλεοτίδια (Beyer et al. 1994). Έπειτα ενεργοποιείται η δράση GTPάσης του EF-G και απελευθερώνεται από το ριβόσωμα (Εικόνα Α.6, βήμα 6-8). Η κατάσταση του ριβοσώματος μετά την μετακίνηση, με το απακυλιωμένο trna στην Ε-θέση, το πεπτίδυλο-trna στην Ρ-θέση και την Α-θέση 14

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ κενή και έτοιμη να δεχτεί ένα καινούριο τριμερές σύμπλοκο ονομάζεται μετάκατάσταση (POST-state). Ο EF-G χαμηλώνει την ενέργεια ενεργοποίησης μεταξύ της PRE- και POST-κατάστασης του ριβοσώματος κατά 120 kj/mol (Schilling- Bartetzko et al. 1992), αν και παρατηρήθηκε ότι το ριβόσωμα μπορεί απουσία του EF-G να εκτελέσει την μετακίνηση 1000 φορές πιο αργά (Bergemann and Nierhaus 1983). Τελευταίες μελέτες υποδεικνύουν την συντηρημένη πρωτεΐνη LepA ως έναν επιπλέον παράγοντα επιμήκυνσης. Η LepA πρωτεΐνη παρουσιάζει τη μοναδική ιδιότητα της πίσω μετακίνησης των ριβοσωμάτων από την POST- στην PREκατάσταση. Αναγνωρίζει ριβοσώματα έπειτα από λανθασμένη μετακίνηση των trnas και επάγει μία πίσω μετακίνηση δίνοντας στον παράγοντα EF-G μία δεύτερη ευκαιρία να μετακινήσει τα trnas σωστά (Qin et al. 2006). Έχουν προταθεί διάφορα μοντέλα για να εξηγήσουν τη φάση της επιμήκυνσης. Τα πιο δημοφιλή είναι το μοντέλο των υβριδικών θέσεων (hybrid-site model) (Moazed and Noller 1989; Wilson and Noller 1998) και το αλλοστερικό μοντέλο τριών θέσεων (allosteric three-site model) (Nierhaus, K. H. 1990), το οποίο επεκτάθηκε στο μοντέλο α-ε (α-ε model) (Nierhaus, K.H. et al. 1995). Το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό αυτών των μοντέλων είναι ότι οι θέσεις Α και Ε αλληλοεπηρεάζονται αλλοστερικά μέσω αρνητικής συνέργειας. Δηλαδή η δέσμευση της Α-θέσης ελαττώνει την αγχιστεία της Ε-θέσης για το αποακυλιωμένο-trna και η δέσμευση της Ε-θέσης ελαττώνει την αγχιστεία της Α-θέσης για το aa-trna (Burkhardt et al. 1998). Για αυτό στην αρχή, όπως αναφέρθηκε η Α-θέση έχει χαμηλή αγχιστεία για το τριμερές σύμπλοκο, επειδή η Ε-θέση είναι κατειλημμένη. Μόλις όμως επιβεβαιωθεί η δέσμευση του σωστού aa-trna, η αγχιστεία της Α-θέσης αυξάνεται με αποτέλεσμα να μειώνεται της Ε-θέσης και να απελευθερώνεται το απακυλιωμένο-trna (Geigenmuller and Nierhaus 1990). Α.1.5.3. Τερματισμός και ανακύκλωση του ριβοσώματος Η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας συνεχίζεται μέχρι να εμφανιστεί στην Α-θέση ένα κωδικόνιο τερματισμού (UAG, UAA, ή UGA). Τα κωδικόνια αυτά δεν αναγνωρίζονται από κάποιο trna αλλά από πρωτεΐνες, που ονομάζονται παράγοντες απελευθέρωσης (Release Factors, RF). Υπάρχουν δύο κατηγορίες παραγόντων απελευθέρωσης. 15

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Στην κατηγορία Ι ανήκουν οι RF1 και RF2. Είναι ειδικοί παράγοντες αποκωδικοποίησης, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και του πεπτίδυλο-trna χωρίς την κατανάλωση ενέργειας. Ο RF1 αναγνωρίζει τα κωδικόνια τερματισμού UAA και UAG, ενώ ο RF2 τα κωδικόνια τερματισμού UAA και UGA (Εικόνα Α.6, βήμα 10). Στην κατηγορία ΙΙ ανήκει ο RF3. Η κύρια λειτουργία του RF3 είναι να αποδεσμεύει τους RF1 και RF2 υδρολύοντας GTP (Freistroffer et al. 1997). Μετά την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας από τους RF1 και RF2 και την αποδέσμευσή τους, το ριβόσωμα είναι ακόμα συνδεδεμένο με το mrna, έχοντας ένα απακυλιωμένο trna στην Ρ-θέση. Με τη βοήθεια του EF-G, ο παράγοντας ανακύκλωσης RRF (Ribosome Recycling Factor) καταλύει την ανακύκλωση του ριβοσώματος (Εικόνα Α.6, βήμα 11) (Hirashima and Kaji 1970, 1972). Μία υπόθεση που προτάθηκε για το ρόλο του RRF στηρίζεται στην ομοιότητα των κρυστάλλων του RRF και ενός trna (Selmer et al. 1999). Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή, ο RRF δεσμεύεται στην Α-θέση του ριβοσώματος και ο EF-G ακριβώς όπως δρα κατά τη φάση της επιμήκυνσης μετακινεί τον RRF και το απακυλιωμένο trna από τις θέσεις Α και Ρ στις θέσεις Ρ και Ε, αντίστοιχα. Έτσι φαίνεται ότι ο ρόλος των RRF και EF-G είναι η απελευθέρωση του απακυλιωμένου trna και κατά συνέπεια και του mrna από το ριβόσωμα (Hirokawa et al. 2002; Kiel et al. 2003), αλλά όχι ο διαχωρισμός του 70S ριβοσώματος στις υπομονάδες του. Στο βήμα αυτό καθοριστικό ρόλο παίζει ο IF3, που διαχωρίζει τις υπομονάδες και δεν τις επιτρέπει να επανασυνδεθούν, όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο Α.1.5.1. 16

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Εικόνα Α.6. Ο κύκλος της μετάφρασης: (1) 30S εναρκτήριο σύμπλοκο, (2) 70S εναρκτήριο σύμπλοκο, (3) Τομή 70S εναρκτήριου συμπλόκου, (4) Εισαγωγή τριμερούς συμπλόκου στην Α-θέση, (5) Δημιουργία πεπτιδικού δεσμού μεταξύ των trnas των θέσεων Α και Ρ. Λεπτομερής αντίδραση στο ένθετο, (6) Δέσμευση EF-G GTP, (7) Μετακίνηση trnas και mrna κατά ένα κωδικόνιο, (8) Υδρόλυση GTP και απελευθέρωση EF-G, (9) Εισαγωγή νέου τριμερούς συμπλόκου στην Α-θέση, (10) Δέσμευση RF1 και RF3, (11) Ανακύκλωση με δέσμευση των RRF και EF-G GTP. 17

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.5.4. Τερματισμός απουσία σήματος τερματισμού Υπάρχουν περιπτώσεις όπου το mrna δεν διαθέτει κωδικόνιο τερματισμού, είτε λόγω λύσης είτε λόγω ατελούς μεταγραφής. Το ριβόσωμα δεν μπορεί να συνεχίσει τη μετάφραση, καθώς δεν υπάρχει κάποιο κωδικόνιο στην Α-θέση και παραμένει ως σύμπλοκο, αφού είναι δύσκολο να απελευθερώσει από μόνο του το mrna με το δεσμευμένο πεπτίδυλο trna. Σε αυτή την περίπτωση, η βοήθεια έρχεται από ένα μόριο, που ονομάζεται tmrna (παλιότερα 10Sa ή SsrA). Το μόριο αυτό λειτουργεί αρχικά ως trna και έπειτα ως mrna, εκεί αποδίδεται και η ονομασία tmrna. Όπως και το trna Ala, το tmrna αναγνωρίζεται από την Αλάνυλο-tRNA-συνθετάση και σχηματίζεται το Ala-tmRNA. Το Ala-tmRNA καταλαμβάνει την Α-θέση του ριβοσώματος που συνδέεται ήδη με ένα μόριο mrna με το πεπτίδυλο-trna στο τελευταίο του κωδικόνιο. Με την εισαγωγή του AlatmRNA το ριβόσωμα καταφέρνει να δημιουργήσει πεπτιδικό δεσμό μεταξύ της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και της αλανίνης που κουβαλάει το tmrna. Το tmrna μετακινείται στην Ρ-θέση και το απακυλιωμένο trna απελευθερώνεται από την Ε- θέση, καθώς επίσης και το mrna. Σε αυτή τη φάση το tmrna αρχίζει να λειτουργεί ως mrna. Περιέχει ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο (Open Reading Frame, ORF) που κωδικοποιεί μία ακολουθία 10 επιπλέον αμινοξέων και ενός κωδικονίου τερματισμού (Himeno, Nameki et al. 1997; Himeno, Sato et al. 1997). Έτσι η μετάφραση συνεχίζεται καθώς τα κωδικόνια της ακολουθίας ταιριάζουν απόλυτα στην Α-θέση και μπορούν να αναγνωριστούν από τα aa-trnas. Η πρωτεΐνη, λοιπόν, που είχε συντεθεί από το κατεστραμμένο RNA, έχει επιμηκυνθεί κατά μία αλανίνη και μία ακολουθία 10 αμινοξέων (AANDENYALAA) (Keiler et al. 1996; Roche and Sauer 1999; Dulebohn et al. 2007) (Εικόνα Α.7). Λόγω του κωδικονίου τερματισμού, η περαιτέρω μετάφραση τερματίζει χωρίς προβλήματα. Με αυτή τη διαδικασία, από τη μια, τα ριβοσώματα απελευθερώνονται από μία κατάσταση απραξίας και μπορούν να ανακυκλωθούν ξεκινώντας ένα νέο κύκλο μετάφρασης. Από την άλλη, η ακολουθία αυτή των 10 αμινοξέων είναι ένα σήμα για γρήγορη αποικοδόμηση του ημιτελούς μορίου. Πρωτεΐνες με την ακολουθία αυτή αναγνωρίζονται από ειδικές πρωτεάσες που αρχίζουν την πρωτεόλυση από το καρβοξυτελικό άκρο (Gottesman et al. 1998; Karzai et al. 2000; Mehta et al. 2006). 18

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Εικόνα Α.7. Τρόπος δράσης του tmrna, αρχικά ως trna και έπειτα ως mrna, αντικαθιστώντας το κατεστραμμένο mrna και εισάγωντας μία ακολουθία 10 αμινοξέων (AANDENYALAA) που αναγνωρίζεται από πρωτεάσες (ένθετο) (Keiler et al. 1996). Α.1.6. Δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού Α.1.6.1. Εντοπισμός του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Όπως έγινε φανερό σε προηγούμενο κεφάλαιο, ένα από τα βασικότερα βήματα κατά την πρωτεϊνική σύνθεση είναι η προσθήκη ενός αμινοξέος στη νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα. Η καταλυτική αυτή δράση ονομάστηκε πεπτιδυλοτρανσφεράση και αποτελεί αποκλειστική ιδιότητα της 50S υπομονάδας του ριβοσώματος. Ο εντοπισμός του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης καθορίστηκε κρυσταλλογραφικά με την εύρεση της δομής της 50S υπομονάδας σε σύμπλοκο με ένα ανάλογο του υποστρώματος της Α-θέσης του ριβοσώματος και με ένα ανάλογο της ενδιάμεσης κατάστασης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Nissen et al. 2000). Και τα δύο ανάλογα εντοπίζονται σε μία περιοχή που αποτελείται αποκλειστικά από το 23S rrna, γεγονός που αποδεικνύει ότι το ριβόσωμα είναι ένα ριβόζυμο (Ban et al. 2000; Nissen et al. 2000). Η περιοχή αυτή βρίσκεται στη βάση της μεγάλης και βαθιάς σχισμής της 50S υπομονάδας, στην είσοδο ενός καναλιού που διασχίζει την 19

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ υπομονάδα. Η περιοχή περιβάλλεται από νουκλεοτίδια που ανήκουν στην περιοχή V του 23S rrna. Αν και υπάρχουν 15 πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την περιοχή V του 23S rrna, δεν υπάρχουν σφαιρικές περιοχές των πρωτεϊνών κοντά στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Τα πλησιέστερα πολυπεπτίδια είναι οι μη-σφαιρικές προεκτάσεις των πρωτεϊνών L2, L3, L4 και L10e (ομόλογο της L16 των βακτηρίων) οι οποίες διεισδύουν μέσα στην περιοχή V και προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο. Αυτές οι προεκτάσεις γεμίζουν πολλούς από τους κενούς χώρους μεταξύ των ελικοειδών τμημάτων του τομέα V, εξουδετερώνοντας το αρνητικό φορτίο των φωσφορικών ομάδων και σταθεροποιώντας τη δομή του τομέα αυτού και την αλληλεπίδρασή του με τις υπόλοιπες περιοχές του 23S rrνα. Παρόλα αυτά καμία από τις πλευρικές αλυσίδες των πρωτεϊνών αυτών δεν βρίσκεται σε απόσταση μικρότερη των 18Å από το σημείο όπου λαμβάνει χώρα η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού (Εικόνα Α.8). Έτσι η καταλυτική δράση μπορεί να αποδοθεί αποκλειστικά στο rrna και όχι σε πρωτεΐνες (Jenni and Ban 2003). Εικόνα Α.8. Αποστάσεις των τεσσάρων πλησιέστερων πρωτεϊνών από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Nissen et al. 2000). Α.1.6.2. Καταλυτικός μηχανισμός της δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού Η αντίδραση που καταλύεται από το κέντρο της πεπτίδυλοτρανσφεράσης του ριβοσώματος είναι η αμινόλυση ενός εστερικού δεσμού, με πυρηνόφιλη προσβολή της α-αμινομάδας του aa-trna της Α-θέσης στον άνθρακα του καρβονυλίου του εστερικού δεσμού, που συνδέει την πολυπεπτιδική αλυσίδα με το πεπτίδυλο-trna της Ρ-θέσης (Εικόνα Α.9). 20

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Εικόνα Α.9. Η α-αμινομάδα του aa-trna στην Α-θέση (κόκκινο) προσβάλει τον άνθρακα του καρβονυλίου του πεπτίδυλο-trna στην Ρ-θέση (μπλε), ώστε να δημιουργηθεί ένα νέο πεπτίδυλοtrna μεγαλύτερο κατά ένα αμινοξύ στην Α-θέση και ένα αποακυλιωμένο trna στην Ρ-θέση. Η 50S υπομονάδα, στην οποία βρίσκεται το κέντρο της πεπτίδυλοτρανσφεράσης φαίνεται με ανοιχτό γκρι και η 30S υπομονάδα με σκούρο γκρι. Επίσης σημειώνονται οι Α-, Ρ- και Ε-θέσεις του ριβοσώματος. Προτού λάβει χώρα η αντίδραση της πεπτίδυλοτρανσφεράσης, τα trnas πρέπει να τοποθετηθούν σωστά στην Ρ-θέση και Α-θέση. Τα συντηρημένα άκρα CCA των trnas προσανατολίζονται και σταθεροποιούνται μέσω αλληλεπιδράσεων με βάσεις του 23S rrna που βρίσκονται γύρω από το ενεργό κέντρο. Στην Ρ-θέση, τα C74 και C75 του πεπτίδυλο-trna σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τα G2251 και G2252 του 23S rrna, αντίστοιχα (Samaha et al. 1995; Nissen et al. 2000). Στην Α-θέση, το άκρο CCA του aa-trνα σταθεροποιείται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ του C75 με το G2553 του 23S rrna (Kim and Green 1999; Nissen et al. 2000). Τα Α76 των 3 - άκρων του πεπτίδυλο-trna και του aatrνα σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τα G2583 και A2450, αντίστοιχα. Οι συντηρημένες βάσεις A2451, U2506, U2585, C2452 και A2602 του 23S rrna βρίσκονται στον πυρήνα του κέντρου της πεπτίδυλοτρανσφεράσης (Nissen et al. 2000; Bashan et al. 2003). Η αντίδραση της πεπτίδυλοτρανσφεράσης προχωράει μέσω μιας τετραεδρικής ενδιάμεσης κατάστασης. Το οξυανιόν της ενδιάμεσης αυτής κατάστασης σταθεροποιείται από ένα μόριο νερού που τοποθετείται από τα νουκλεοτίδια A2602 και U2584. Το μόνο άτομο σε απόσταση σχηματισμού δεσμού υδρογόνου από την α-αμινομάδα του aa-trνα είναι το 2 -OH του A76 του πεπτίδυλο-trna (Schmeing 21

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ et al. 2005). Το N3 του A2451, το οποίο βρίσκεται επίσης σε απόσταση σχηματισμού δεσμού υδρογόνου πριν την αντίδραση σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, φαίνεται να χάνει αυτήν την αλληλεπίδραση με την α-αμινομάδα του aa-trνα κατά την διάρκεια της αντίδρασης. Αρχικά πιστευόταν ότι το N3 της συντηρημένης βάσης Α2451 είναι αυτό που απομακρύνει ένα πρωτόνιο από την α-αμινομάδα του aa-trνα. Παρόλα αυτά πρόσφατες δημοσιεύσεις έδειξαν ότι το νουκλεοτίδιο αυτό μάλλον δεν παίζει καταλυτικό ρόλο στη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού διότι μεταλλάξεις αυτού δεν καταργούν το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού τόσο in vivo όσο και in vitro (Thompson et al. 2001). Ένας ρόλος του 2 -OH του A76 του πεπτίδυλο-trna είναι να γεφυρώνει την πυρηνόφιλη προσβολή της α-αμινομάδας του aa-trna και το 3 -οξυγόνο του πεπτίδυλο-trna που αποχωρεί. Το 2 -OH του A76 προσφέρει το πρωτόνιό του στο γειτονικό 3 -οξυγόνο ενώ παράλληλα αποσπά ένα από τα πρωτόνια της α-αμινομάδας του aa-trna, διευκολύνοντας την πυρηνόφιλη προσβολή αυτής της αμινομάδας στον άνθρακα του καρβονυλίου του πεπτίδυλο-trνa (Weinger et al. 2004; Rodnina et al. 2006; Beringer and Rodnina 2007) (Εικόνα Α.10). Εικόνα Α.10. (a) Το 2 -ΟΗ του Α76 του πεπτίδυλο-trna βρίσκεται πολύ κοντά κατά τη διάρκεια της πυρηνόφιλης προσβολής της α-αμινομάδας στον άνθρακα του καρβονυλίου και μπορεί να τοποθετηθεί με τέτοιο τρόπο ώστε να παίζει καταλυτικό ρόλο (Weinger et al. 2004). (b) Το πεπτίδυλο-trna (P-θέση) και το aa-trna (A-θέση) είναι μπλε και κόκκινο, αντίστοιχα. Οι βάσεις του 23S rrna είναι απαλό πράσινο και τα μόρια του νερού γκρίζα. Το 2 -OH του Α76 του πεπτίδυλο-trna προσφέρει το πρωτόνιό του στο γειτονικό 3 -οξυγόνο ενώ παράλληλα αποσπά ένα από τα πρωτόνια της α-αμινομάδας του aatrna, διευκολύνοντας την πυρηνόφιλη προσβολή αυτής της αμινομάδας στον άνθρακα του καρβονυλίου του πεπτίδυλο-trνa (Beringer and Rodnina 2007). 22

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.7. Έξοδος της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης από την 50S υπομονάδα Καθώς η πολυπεπτιδική αλυσίδα μεγαλώνει με κάθε νέο κύκλο επιμήκυνσης, πρέπει να βρει ένα μονοπάτι για να εξέλθει από το ριβόσωμα. Για αυτό το λόγο, υπάρχει ένα κανάλι στην 50S υπομονάδα, που ξεκινάει από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, διαπερνάει όλη την υπομονάδα και καταλήγει στην πίσω πλευρά της (Yonath et al. 1987; Jenni and Ban 2003). Με τη δημιουργία κάθε νέου πεπτιδικού δεσμού, η πολυπεπτιδική αλυσίδα ωθείται μέσα στο κανάλι κατά ένα αμινοξύ (Εικόνα Α.11). Εικόνα Α.11. Κανάλι εξόδου των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών. Οι διαφορετικές περιοχές του 23S rrna απεικονίζονται με διαφορετικό χρώμα: Περιοχή I (κίτρινο), ΙΙ (γαλάζιο), ΙΙΙ (πορτοκαλί), IV (πράσινο), V (κόκκινο) και 5S rrna (μωβ). Οι πρωτεΐνες είναι χρωματισμένες μπλε. PT: κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Nissen et al. 2000). 23

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Το μήκος του καναλιού από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης μέχρι την έξοδό του είναι 100-120Å. Είναι ευθύ με εξαίρεση μια καμπή, που εμφανίζει σε απόσταση 20-35Å από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η διάμετρος του καναλιού κυμαίνεται από 10Å στην είσοδο του μέχρι τα 25Å κοντά στην έξοδο του. Η μέση διάμετρος είναι περίπου 15Å. Έχει βρεθεί ότι πρωτεολυτικά ένζυμα μπορούν να δράσουν στην νεοσυντιθέμενη αλυσίδα μόνο έπειτα από την ενσωμάτωση 30-40 αμινοξέων, οπότε η αλυσίδα αρχίζει να εμφανίζεται στην έξοδο του καναλιού (Berkovitch-Yellin et al. 1992). Το κανάλι, δηλαδή, προσφέρει προστασία στην νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη στα πρώτα στάδια της σύνθεσης. Η καμπή που εμφανίζεται στο κανάλι είναι το στενότερο τμήμα του και οφείλεται στην παρουσία των μη σφαιρικών προεκτάσεων των πρωτεϊνών L4 και L22, οι οποίες βρίσκονται εκατέρωθεν του καναλιού και σχηματίζουν ένα είδος πύλης. Ο ρόλος αυτής της πύλης δεν έχει διερευνηθεί πλήρως και γίνονται προσπάθειες για την κατανόηση του ρόλου των δύο αυτών πρωτεϊνών στην είσοδο του καναλιού. Κατά τα άλλα το τοίχωμα του καναλιού αποτελείται από το 23S rrνα, κυρίως από τις περιοχές V και Ι, και κατά μικρότερο ποσοστό από τις περιοχές ΙΙ, ΙΙΙ και IV. Επικρατεί η άποψη πως η νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη δεν μπορεί να αναδιπλωθεί μέσα στο κανάλι σχηματίζοντας δευτεροταγείς δομές, επειδή το κανάλι είναι πολύ στενό. Πρόσφατες μελέτες, όμως, έδειξαν ότι μεμβρανικές πρωτεΐνες αναδιπλώνονται μέσα στο κανάλι και σχηματίζουν α-έλικες. Αυτή η αναδίπλωση επάγεται και σταθεροποιείται από το ίδιο το ριβόσωμα, καθώς με την έξοδο από το κανάλι χάνεται η διαμόρφωση (Johnson 2004; Woolhead et al. 2004). Το κανάλι είναι έτσι φτιαγμένο ώστε να μην προσκολλώνται πάνω του οι νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες. Είναι κυρίως υδρόφιλο με εκτεθειμένες ομάδες που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου. Αν και αρκετές υδρόφοβες ομάδες είναι επίσης στραμμένες προς το κανάλι, δεν υπάρχουν υδρόφοβες περιοχές αρκετά μεγάλες, ώστε να σχηματίζουν σημαντικές θέσεις αλληλεπίδρασης με υδρόφοβες ακολουθίες της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης. Τέλος, στο εσωτερικό του καναλιού υπάρχουν μόρια νερού, τα οποία δημιουργούν ένα είδος στρώματος, προκειμένου να αποφευχθούν τέτοιου είδους αλληλεπιδράσεις των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών με τα τοιχώματά του (Nissen et al. 2000). 24

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Α.1.8. Σωστή αναδίπλωση πρωτεϊνών Η απόκτηση της σωστής τριδιάστατης δομής των πρωτεϊνών αποτελεί ένα από τα πιο πολύπλοκα και υπό διερεύνηση προβλήματα της μοριακής βιολογίας. Φαίνεται ότι η διαδικασία της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών λαμβάνει χώρα ταυτόχρονα με τη μετάφρασή τους. Πρόκειται δηλαδή για μια συμμεταφραστική διαδικασία, κατά την οποία η πρωτεΐνη αρχίζει να λαμβάνει την τριδιάστατη δομή της ενώ ακόμη είναι δεσμευμένη στο ριβόσωμα ως πεπτίδυλο-trna (Kudlicki et al. 1995). Το μήκος της πεπτιδικής αλυσίδας που προστατεύεται από το κανάλι κυμαίνεται από 30 έως 72 αμινοξέα, πράγμα που δείχνει ότι τα νεοσυντιθέμενα πολυπεπτίδια έχουν διαφορετικές διαμορφώσεις. Έχει διατυπωθεί, λοιπόν, η υπόθεση ότι η νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη αρχίζει να αποκτάει τη διαμόρφωσή της σε απόσταση περίπου 28Å από την έξοδο του καναλιού και συνεχίζει στην επιφάνεια της 50S υπομονάδας σε μια εσοχή κοντά στην έξοδό του (Kramer et al. 2001). Σε αυτή τη φάση, η αναδίπλωση διευκολύνεται από βοηθητικούς παράγοντες (chaperones), οι οποίοι είναι πρωτεΐνες που δεσμεύονται σε μη-αναδιπλωμένα ή μερικώς αναδιπλωμένα πολυπεπτίδια. Καθώς τα μη-αναδιπλωμένα πολυπεπτίδια έχουν εκτεθειμένα πολύ περισσότερα υδρόφοβα αμινοξέα, είναι πολύ εύκολο να δημιουργήσουν συσσωματώματα. Σε αυτές τις υδρόφοβες περιοχές δεσμεύονται οι βοηθητικοί παράγοντες εμποδίζοντας τη συσσωμάτωση. Μέσω συντονισμένων κύκλων δέσμευσης-αποδέσμευσης διευκολύνουν τις πρωτεΐνες να αποκτήσουν την σωστή τριδιάστατη δομή τους. Υπάρχει μία δεύτερη κατηγορία βοηθητικών παραγόντων, που ονομάζονται σαπερονίνες (chaperonins) και οι οποίοι δρουν αφού η πολυπεπτιδική αλυσίδα έχει απελευθερωθεί από το ριβόσωμα. Οι σαπερονίνες είναι μεγάλες κυλινδρικές πρωτεΐνες, που παρέχουν ένα συγκεκριμένο χώρο μέσα στον οποίο μπορεί η πολυπεπτιδική αλυσίδα να αποκτήσει την τριδιάστατη δομή της, απομονωμένη από το κυτταρόπλασμα (Martin and Hartl 1997; Zhang et al. 2002). Στα βακτήρια ο κυριότερος βοηθητικός παράγοντας είναι ο TF (Trigger Factor), ο οποίος δεσμεύεται απ ευθείας στο ριβόσωμα κοντά στην έξοδο του καναλιού και αλληλεπιδρά με την εξερχόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η πλειοψηφία των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών (65-80%) έχουν μικρό μέγεθος και πιστεύεται ότι αποκτούν τη σωστή τριδιάστατη δομή τους πολύ γρήγορα, χωρίς περαιτέρω βοήθεια πέραν του TF (Ullers et al. 2003; Schlunzen et al. 2005; Kaiser et al. 2006). 25

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Μεγαλύτερου μεγέθους πρωτεΐνες (10-20%) αλληλεπιδρούν εκτός του TF και με περαιτέρω βοηθητικούς παράγοντες, τους DnaK, DnaJ, και GrpE (όλοι της Hsp70 οικογένειας). Οι παράγοντες αυτοί δεν συνδέονται απ ευθείας με το ριβόσωμα, αλλά επίσης αναγνωρίζουν αναπτυσσόμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες και βοηθούν στην αναδίπλωση τους. Τέλος κάποιες πρωτεΐνες (10-15%), που αναδιπλώνονται πολύ αργά και είναι πολύ εύκολο να δημιουργήσουν συσσωματώματα, οδηγούνται από τους προηγούμενους παράγοντες της οικογένειας Hsp70 στο σύστημα μοριακών συνοδών (σαπερονινών) GroEL και GroES, αφού πρώτα έχουν απελευθερωθεί από το ριβόσωμα (Hartl and Hayer-Hartl 2002) (Εικόνα Α.12). Εικόνα Α.12. Υποβοηθούμενη αναδίπλωση νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών στα βακτήρια από βοηθητικούς παράγοντες. Η πρωτεΐνη αναδιπλωμένη στη σωστή τριδιάστατη δομή της παρίσταται ως Ν (Native protein). Μικρές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τον TF, μεγαλύτερες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν επιπλέον με τους DnaK και DnaJ, ενώ κάποιες χρειάζεται να μεταφερθούν στο σύστημα σαπερονινών GroEL και GroES αφού πρώτα έχουν απελευθερωθεί από το ριβόσωμα (Hartl and Hayer-Hartl 2002). 26

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Α.2. ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Α.2.1. Εισαγωγή Το 1970 ο Arthur Ashkin έδειξε, για πρώτη φορά, ότι μικρές διηλεκτρικές χάντρες μεγέθους μικρομέτρων, μπορούν να επιταχυνθούν ή να παγιδευτούν χρησιμοποιώντας δύο εστιασμένες, αντίθετα διαδιδόμενες, ακτίνες laser (Ashkin 1970). Η ιδέα των οπτικών λαβίδων ξεκίνησε, όταν αργότερα πρότεινε, ότι μία έντονα εστιασμένη, απλή ακτίνα laser θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να παγιδέψει ένα σωματίδιο (Ashkin 1978; Ashkin et al. 1986). Στην εστία της ακτίνας, εκτός από διηλεκτρικές χάντρες, μπορούν επίσης να παγιδευτούν βιολογικοί οργανισμοί, όπως κύτταρα, ιοί και βακτήρια (Ashkin and Dziedzic 1987; Ashkin et al. 1987). Από τότε έγιναν σημαντικές πρόοδοι στο χειρισμό μεμονωμένων βιολογικών μορίων. Για πρώτη φορά παρατηρήθηκε το βήμα μεμονωμένων μορίων κινεσίνης (Svoboda et al. 1993) και αργότερα παρουσιάστηκαν οι πρώτες καμπύλες δύναμης σε συνάρτηση με την έκταση δίκλωνων μορίων DNA (dsdna) (Smith, S. B. et al. 1996). Τα αποτελέσματα αυτά απέδειξαν ότι οι οπτικές λαβίδες έχουν μεγάλες δυνατότητες στη βιολογία και ιδιαίτερα στο χειρισμό μεμονωμένων βιομορίων (Yin et al. 1995; Oddershede et al. 2002; Cecconi et al. 2005). Οι οπτικές λαβίδες, είναι τριδιάστατες παγίδες, που χρησιμοποιούν μία εστιασμένη ακτίνα laser, για να παγιδέψουν και να χειριστούν μικροσκοπικά, ουδέτερα αντικείμενα (Ashkin 1997). Στις βιολογικές επιστήμες, η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για για καταμέτρηση δυνάμεων στην κλίμακα των pn, πράγμα αδύνατο με τη χρήση συμβατικών τεχνικών, όπως η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (Atomic Force Microscopy, AFM) καθώς και μετατοπίσεις στην κλίμακα των nm (Mehta, A. D. et al. 1999). Α.2.2. Αρχές οπτικής παγίδευσης Το φως μπορεί να περιγραφεί ως ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που εκφράζεται από τη σχέση: c = λ ν (1) όπου, c η ταχύτητα του φωτός, λ το μήκος κύματος και ν η συχνότητα. Το φως, όμως, έχει και σωματιδιακή φύση. Κάθε φωτόνιο έχει ενέργεια, που δίνεται από τη σχέση: Ε = h ν (2) 27

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ όπου, Ε η ενέργεια των φωτονίων και h η σταθερά του Planck. Ως σωματίδια, τα φωτόνια φέρουν επίσης ορμή, που δίνεται από τη σχέση: p = E = (3) όπου p η ορμή. Η δύναμη που ασκείται σε ένα αντικείμενο και οφείλεται αποκλειστικά στην αλλαγή της ορμής του φωτός που προσπίπτει πάνω του, ονομάζεται πίεση ακτινοβολίας (radiation pressure). Σε μακροσκοπικά αντικείμενα και με συμβατικές πηγές φωτός, η δύναμη αυτή είναι εξαιρετικά μικρή για να προκαλέσει κάποιο μετρήσιμο αποτέλεσμα. Σε μικροσκοπικά σωματίδια, όμως, με μία ισχυρά εστιασμένη δέσμη laser, η δύναμη αυτή μπορεί να έχει αξιοσημείωτα αποτελέσματα (Brown and Brown 2001). Οποιαδήποτε αλλαγή στη διεύθυνση διάδοσης του φωτός, από ανάκλαση ή διάθλαση, οδηγεί σε αλλαγή στην ορμή του φωτός. Εάν ένα αντικείμενο κάμπτει το φως, μεταβάλλοντας την ορμή του, η διατήρηση της ορμής απαιτεί το αντικείμενο να υποβληθεί σε μια ίση και αντίθετη αλλαγή ορμής. Αυτό συνεπάγεται άσκηση μιας δύναμης στο αντικείμενο. Το εισερχόμενο φως είναι μία ακτίνα laser, με προφίλ έντασης που περιγράφεται από μία καμπύλη Gauss. Δηλαδή, η ένταση του φωτός στο κέντρο της ακτίνας είναι μεγαλύτερη από την ένταση στις άκρες. Όταν αυτό το φως αλληλεπιδρά με μια χάντρα, οι ακτίνες φωτός κάμπτονται σύμφωνα με τους νόμους της ανάκλασης και της διάθλασης, οπότε στη χάντρα ασκούνται δύο δυνάμεις, κάθετες μεταξύ τους. Η χάντρα έχει υψηλότερο δείκτη διάθλασης από αυτόν του περιβάλλοντος μέσου (συνήθως νερό), με τυπικές αναλογίες n particle : n surrounding (n p : n s ) μεταξύ 1.1 και 1.2. Η μία δύναμη, που ονομάζεται δύναμη σκέδασης (scattering force), δημιουργείται λόγω της απώλειας ορμής από την ανάκλαση της δέσμης laser προς τα πίσω και τείνει να κινήσει τη χάντρα κατά τη διεύθυνση διάδοσης του φωτός (άξονας z), για να αντισταθμήσει την απώλεια αυτή. Η άλλη δύναμη, που ονομάζεται δύναμη βαθμίδωσης (gradient force), δημιουργείται λόγω της διάθλασης του φωτός που διέρχεται από τη χάντρα, η οποία έχει μεγαλύτερο δείκτη διάθλασης από το περιβάλλον μέσο και τείνει να τραβήξει τη χάντρα προς την αύξουσα ένταση του φωτός (κέντρο δέσμης) στο επίπεδο x-y (Εικόνα Α.13). Η συνισταμένη δύναμη οδηγεί σε σταθερή παγίδευση, όταν η επίδραση της δύναμης βαθμίδωσης είναι 28

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ αρκετά μεγάλη ώστε να υπερνικήσει την επίδραση της δύναμης σκέδασης (F gradient > F scattering ) (Ashkin 1992). Εικόνα Α.13. Αρχές οπτικής παγίδευσης διηλεκτρικής χάντρας με δέσμη laser (www.stanford.edu/group/blocklab/optical%20tweezers%20introduction.htm) Α.2.3. Βελτιστοποίηση της παγίδευσης Η κύρια σχέση μεταξύ της δύναμης παγίδευσης και της ισχύος της δέσμης laser είναι: όπου F η δύναμη που ασκείται πάνω στο παγιδευμένο αντικείμενο, Q μία αδιάστατη παράμετρος αποτελεσματικότητας, n ο δείκτης διάθλασης του περιβάλλοντος μέσου, P η ισχύς του laser και c η ταχύτητα του φωτός. Το Q περιλαμβάνει την επίδραση του laser στην σκληρότητα της παγίδας, το μέγεθος και το προφίλ της δέσμης, την πόλωση της δέσμης και τη γωνία σύγκλισης. Στο Q λαμβάνονται υπ όψη και οι οπτικές ιδιότητες του παγιδευμένου αντικειμένου, όπως το σχήμα, το μέγεθος και ο δείκτης διάθλασης (Roosen and Imbert 1976). Από τη σχέση (4) είναι φανερό ότι η παγίδευση μπορεί να γίνει πιο αποτελεσματική αυξάνοντας την ισχύ του laser, το δείκτη διάθλασης του περιβάλλοντος μέσου ή το Q. Η ισχύς του laser μπορεί να αυξηθεί μέχρι κάποιο σημείο, υπέρβαση του οποίου μπορεί να οδηγήσει σε θέρμανση ή καταστροφή των οπτικών ή του βιολογικού δείγματος. Αύξηση του δείκτη διάθλασης δεν νοείται 29

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ καθώς σχεδόν όλα τα βιολογικά δείγματα απαιτούν υδατικούς διαλύτες (n=1,33). Αυτό που μένει είναι η βελτιστοποίηση της γεωμετρικής παραμέτρου Q. Η μέγιστη γωνία πρόσπτωσης θ max ορίζεται από τον αντικειμενικό φακό που εστιάζει τη δέσμη laser. Μία βασική παράμετρος του φακού είναι το αριθμητικό του άνοιγμα (Numerical Aperture, NA). Το ΝΑ είναι ένα μέτρο της γωνίας υπό της οποίας μπορεί ο αντικειμενικός φακός να συγκεντρώσει το φως. Θα πρέπει, λοιπόν, να χρησιμοποιούνται φακοί με μεγάλο NA. Μία δεύτερη παράμετρος, που επηρεάζει το θ max κατά παρόμοιο τρόπο, είναι η διάμετρος της δέσμης laser. Μεγαλύτερη διάμετρος δίνει μεγαλύτερο θ max και επομένως μεγαλύτερη βαθμίδωση στην ένταση της δέσμης laser. Αυτό οδηγεί σε μεγαλύτερη δύναμη βαθμίδωσης F gradient, καθιστώντας την ικανή να υπερνικήσει την δύναμη σκέδασης F scattering. Για τη βελτιστοποίηση, λοιπόν, της παγίδευσης με μία δέσμη, που το προφίλ της έντασης δίνεται από καμπύλη του Gauss, η δέσμη θα πρέπει να υπερκαλύπτει το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού (Εικόνα Α.14). Εικόνα Α.14. Αύξηση της γωνίας θ max με αύξηση της διαμέτρου d της δέσμης laser που περνάει από το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού. Μέγιστη θ max όταν η δέσμη laser καλύπτει πλήρως το πίσω άνοιγμα. (a) Δέσμη laser καλύπτει μέρος του πίσω ανοίγματος του αντικειμενικού φακού (b) Δέσμη laser υπερκαλύπτει το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού. Α.2.4. Μέτρηση δυνάμεων Οι οπτικές λαβίδες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να μετρήσουν άμεσα δυνάμεις στα παγιδευμένα αντικείμενα. Αναφέρθηκε ήδη, ότι μια διηλεκτρική χάντρα, που συγκρατείται σε κάποια θέση μακριά από το κέντρο της δέσμης laser δέχεται μια ελκτική δύναμη προς το κέντρο της δέσμης. Συμπεριφέρεται, δηλαδή, ως ένα ελατήριο, όπου η δύναμη αποκατάστασης είναι ανάλογη προς την απόσταση 30

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ μεταξύ του κέντρου της χάντρας και του κέντρου της δέσμης laser. Με άλλα λόγια, η δύναμη των οπτικών λαβίδων μπορεί γενικά να περιγραφεί από τον νόμο του Hooke: F = - k x (5) όπου F η δύναμη αποκατάστασης που ασκείται στο παγιδευμένο αντικείμενο, x η μετατόπιση από το κέντρο της δέσμης και k μία σταθερά που αναφέρεται ως σκληρότητα της παγίδας (trap stiffness). Κατά συνέπεια, εάν καθοριστεί η σταθερά k, μετρώντας τη μετατόπιση της χάντρας από την παγίδα, είναι δυνατό να προσδιοριστεί η δύναμη που ασκείται πάνω της. Η μετατόπιση της χάντρας από το κέντρο της παγίδας εκτρέπει επίσης την δέσμη laser. Η εκτροπή αυτή της δέσμης μπορεί να καταγραφεί από ένα φωτοανιχνευτή, όπως μία φωτοδίοδο 4 τμημάτων. Σε αυτή την περίπτωση, ένας συγκεντρωτικός φακός τοποθετείται μετά τον αντικειμενικό φακό και μετατρέπει τις γωνιακές εκτροπές σε εγκάρσιες αποκλίσεις, οι οποίες καταγράφονται από τον ανιχνευτή (Εικόνα Α.15). Είναι εξαιρετικά σημαντικό να τονιστεί ότι οι αποκλίσεις αυτές είναι απ ευθείας ανάλογες της αλλαγής στην ορμή του φωτός και συνεπώς της δύναμης, αν και μόνο αν συλλέγονται όλες οι ακτίνες φωτός. Από τη στιγμή, όμως, που η δέσμη laser υπερκαλύπτει το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού, οποιαδήποτε εκτροπή της δέσμης δεν συλλέγεται από τον συγκεντρωτικό φακό και επομένως δεν μπορεί να μετρηθεί απ ευθείας η δύναμη. Το όργανο, σε αυτή την περίπτωση, πρέπει με κάποιο τρόπο να βαθμονομηθεί. Εικόνα Α.15. Διάταξη για την ανίχνευση της μετατόπισης της παγιδευμένης χάντρας από το κέντρο της παγίδας. Το πίσω εστιακό επίπεδο του συγκεντρωτικού φακού ανιχνεύεται από μία φωτοδίοδο 4 τμημάτων. 31

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Η πιο ακριβής μέθοδος βαθμονόμησης υπολογίζει τη σταθερά k (σε pn nm -1 ) από το φάσμα θερμικής ισχύος και συσχετίζει την μετατόπιση του παγιδευμένου αντικειμένου με Volts υπολογίζοντας την ευαισθησία του ανιχνευτή (σε V nm -1 ). Καθώς η σταθερά k και η ευαισθησία του ανιχνευτή εξαρτώνται από τοπικές παραμέτρους (ισχύς laser, δείκτης διάθλασης παγιδευμένου αντικειμένου, ιξώδες υγρού, κτλ), θα πρέπει να προσδιορίζονται για κάθε νέα μέτρηση. Αυτό αποτελεί μεγάλο μειονέκτημα της τεχνικής. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα πρέπει όλες οι ακτίνες φωτός να συλλέγονται ακόμη και μετά την εκτροπή της δέσμης, οπότε η δέσμη laser δεν πρέπει να καλύπτει πλήρως το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού αλλά μόνο μέρος αυτού (Εικόνα Α.14a). Σε αυτή την περίπτωση, όμως, η βαθμίδωση της έντασης της δέσμης laser είναι πολύ μικρή για να υπερνικήσει την δύναμη σκέδασης F scattering και η παγίδευση δεν είναι σταθερή. Α.2.5. Οπτικές λαβίδες διπλής δέσμης Για να υπάρχει σταθερή παγίδευση, χωρίς όμως να υπερκαλύπτεται το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού, μπορεί αντί για μία δέσμη laser να χρησιμοποιηθούν δύο αντίθετα διαδιδόμενες δέσμες laser, οι οποίες εστιάζουν στο ίδιο σημείο. Οι δυνάμεις σκέδασης που δημιουργούνται από τις δύο δέσμες laser αλληλοαναιρούνται, οπότε δεν υπάρχει μετατόπιση κατά το z άξονα και η παγίδευση του αντικειμένου σταθεροποιείται. Οι δυνάμεις παγίδευσης που δημιουργούνται για δεδομένη ισχύ του laser είναι ισχυρότερες από αυτές των οπτικών λαβίδων απλής δέσμης. Οι οπτικές λαβίδες διπλής δέσμης μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ανιχνευτές δύναμης μετρώντας απ ευθείας την αλλαγή στην ορμή του φωτός. Ένας ανιχνευτής μπορεί να μετρήσει τη δύναμη που ασκείται στο παγιδευμένο αντικείμενο στο x-y επίπεδο καταγράφοντας εντάσεις ρευμάτων εξόδου για τους δύο άξονες x και y (Smith, S. B. et al. 2003). F x = I R (6) F y = I R (7) όπου, F x και F y οι δυνάμεις στο επίπεδο x-y, Ι x και I y οι αντίστοιχες εντάσεις που καταγράφει ο ανιχνευτής, R η ακτίνα του ανιχνευτή, f η εστιακή απόσταση των 32

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ φακών, α ένας παράγοντας αποτελεσματικότητας του ανιχνευτή και c η ταχύτητα του φωτός. Πριν από κάθε νέα μέτρηση δεν χρειάζεται βαθμονόμηση, επειδή ο προσδιορισμός των δυνάμεων εξαρτάται μόνο από παραμέτρους του οργάνου, όπως φαίνεται από τις σχέσεις (6) και (7), οι οποίες δεν μεταβάλλονται με τις συνθήκες του πειράματος. Η χρήση των οπτικών λαβίδων διπλής δέσμης οδήγησε, τα τελευταία χρόνια, σε μεγάλη πρόοδο την μελέτη μεμονωμένων μορίων (Hegner, M. et al. 1999; Liphardt et al. 2001; Smith, D. E. et al. 2001). Α.2.6. Πειραματική διάταξη Α.2.6.1. Εισαγωγή και ανίχνευση των δεσμών laser Η διάταξη αποτελείται από δύο ίδιους φακούς (L1 και L2), που χρησιμοποιούν νερό ως υγρό βύθισης (ΝΑ=1.2, διάμετρος πίσω ανοίγματος d=7.2 mm και εστιακή απόσταση 285 μm). Ο ένας παίζει το ρόλο του αντικειμενικού και ο άλλος του συγκεντρωτικού φακού, ανάλογα σε ποια από τις δύο δέσμες laser γίνεται η αναφορά. Μία δέσμη laser (laser A, με λ=830 nm, P max =200 mw), κάθετα πολωμένη, ανακλάται από ένα διαχωριστή πολωμένης δέσμης (Polarized Beam Splitter, PBS) και αφού περάσει μέσα από δύο πλακίδια καθυστέρησης φάσης λ 4 (Quarter-Wave plates, QW) και τους δύο φακούς L1 και L2 μετατρέπεται σε οριζόντια πολωμένη. Γι αυτό το λόγο διέρχεται μέσα από τον επόμενο PBS-I (PBS-Injection) και επανακατευθύνεται μέσω του PBS-D (PBS-Detection) στον ανιχνευτή Α. Καθώς η διάταξη είναι πλήρως συμμετρική, μία δεύτερη δέσμη laser (laser B) μπορεί επίσης να εισαχθεί και να ανιχνευτεί από τον ανιχνευτή Β (Εικόνα Α.16) (Grange et al. 2002). 33

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Εικόνα Α.16. Πειραματική διάταξη για την εισαγωγή και ανίχνευση δύο αντίθετα διαδιδόμενων δεσμών laser. PBS διαχωριστής πολωμένης δέσμης, QW πλακίδιο καθυστέρησης φάσης, F φίλτρο χαμηλής συχνότητας. Επίσης φαίνονται στο σχήμα LED δίοδος εκπομπής φωτός (480nm), DM διχρωματικό κάτοπτρο και FI φίλτρο χαμηλής συχνότητας για απεικόνιση. Ο φακός L3 είναι επιπεδόκυρτος για απεικόνιση του εστιακού επιπέδου του φακού L2 σε μία CCD κάμερα. Ο κάθε ανιχνευτής είναι μία φωτοδίοδος 4 τμημάτων, η οποία μετράει απ ευθείας τις εντάσεις των ρευμάτων I x και Ι y, οι οποίες είναι απαραίτητες για τον υπολογισμό της δύναμης μέσω των σχέσεων (6) και (7). Α.2.6.2. Θάλαμος δείγματος Ο θάλαμος του δείγματος κατασκευάζεται σφραγίζοντας αεροστεγώς, με θέρμανση και πίεση, δύο στρώσεις παραφίλμ μεταξύ δύο αντικειμενοφόρων πλακών, ώστε να μην υπάρχει διαρροή. Πριν το σφράγισμα το παραφίλμ κόβεται, ώστε να σχηματιστεί ένα κανάλι (50 3.5 0.3 mm), που επιτρέπει την εισαγωγή του δείγματος. Επίσης, ένας καθετήρας από χαλαζία, εσωτερικής διαμέτρου 100 μm, τοποθετείται μεταξύ των δύο στρώσεων του παραφίλμ, που επιτρέπει την εισαγωγή ενός μικροσιφωνίου στον θάλαμο. Δύο οπές ανοίγονται στον θάλαμο για εισαγωγή και εξαγωγή υγρών και στη συνέχεια, ο θάλαμος στερεώνεται σε μία βάση αλουμινίου (Εικόνα Α.17) (Wuite et al. 2000). 34

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Εικόνα Α.17. Θάλαμος δείγματος (Wuite et al. 2000). Το μικροσιφώνιο (εσωτερικής διαμέτρου <1μm) δημιουργείται με ολκή ενός τριχοειδούς γυάλινου σωλήνα (εσωτερικής διαμέτρου 40μm), εισάγεται στον θάλαμο μέσω του καθετήρα από χαλαζία και συνδέεται στην άλλη άκρη με μία σύριγγα, που επιτρέπει την αναρρόφηση χαντρών μεγέθους μικρομέτρων στην άκρη της μικροπιπέτας. Μία χάντρα στερεωμένη στην άκρη του μικροσιφωνίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μία ευκόλως ανταλλάξιμη επιφάνεια, με καθορισμένες χημικές ιδιότητες, πάνω στην οποία μπορούν να δεσμευτούν και να μελετηθούν διάφορα μόρια Ο θάλαμος τοποθετείται μέσω της αλουμινένιας βάσης σε μία μαγνητική πιεζοηλεκτρική τράπεζα, που επιτρέπει κίνηση στις τρεις διαστάσεις, 100 μm για τους άξονες x, y και 20 μm για τον άξονα z και κάθε άξονας ελέγχεται με ένα σήμα διαφοράς δυναμικού (0-100 V). Α.2.6.3. Σύστημα ανταλλαγής διαλυμάτων στον θάλαμο Η ροή και ανταλλαγή των διαλυμάτων μέσα στο θάλαμο ελέγχονται από δοχεία πίεσης και ένα αυτόματο σύστημα βαλβίδων. Η ροή των διαφόρων διαλυμάτων από τα δοχεία πίεσης επιτυγχάνεται με υδροστατική πίεση και η εισαγωγή τους στο θάλαμο με το αυτόματο σύστημα βαλβίδων. Το διάλυμα που εξέρχεται από τον θάλαμο λόγω της εισαγωγής του νέου διαλύματος συλλέγεται σε ένα δοχείο απορριμμάτων. Με αυτόν τον τρόπο καθαρίζεται ο θάλαμος, αφαιρούνται τυχόν φυσαλλίδες αέρα και εισάγονται χάντρες αιωρημένες σε διάλυμα. 35

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Ο ρυθμός της ροής μέσα στο θάλαμο είναι απ ευθείας ανάλογος της υψομετρικής διαφοράς μεταξύ των δοχείων εισαγωγής διαλυμάτων και του δοχείου απορριμμάτων επί την εφαρμοζόμενη πίεση. Ο όγκος των διαλυμάτων μέσα στα δοχεία πίεσης είναι περίπου 4ml, πολύ μικρότερος από τον όγκο του αέρα στο σύστημα πίεσης (~80 cm 3 ) και ο μέσος ρυθμός ροής είναι μικρός (~1 μl/s). Έτσι, η αλλαγή στον όγκο του αέρα, λόγω του εκτοπιζόμενου διαλύματος, είναι μικρή και η ροή παραμένει σταθερή. Το πλεονέκτημα αυτού του συστήματος, σε σχέση με τις περισταλτικές αντλίες, είναι ότι δεν περιέχει μηχανικά εξαρτήματα, που θα επηρέαζαν τη σταθερότητα της ροής. Α.2.6.4. Απεικόνιση πειράματος Κάθε πείραμα που λαμβάνει χώρα μέσα στο θάλαμο πρέπει να απεικονιστεί και να καταγραφεί από ένα στοιχείο συζευγμένου φορτίου (Charge Coupled Device, CCD κάμερα) (Εικόνα Α.18). Εικόνα Α.18. Απεικόνιση μίας χάντρας (διαμέτρου 3.1 μm) στερεωμένης στo μικροσιφώνιο με αναρρόφηση. Στο πάνω μέρος, μία δεύτερη χάντρα (διαμέτρου 2.9 μm) είναι παγιδευμένη από τις δύο αντίθετα διαδιδόμενες δέσμες laser των οπτικών λαβίδων (Grange et al. 2002). Μία δίοδος εκπομπής φωτός (Light Emitting Diode, LED) παρέχει φως μήκους κύματος 480 nm, το οποίο ανακλάται αρχικά από ένα διχρωματικό κάτοπτρο (Dichroic Mirror, DM) και κατόπιν περνάει από τον αντικειμενικό φακό. Ένας επιπεδόκυρτος φακός L3 χρησιμοποιείται για την απεικόνιση του δείγματος πάνω στην CCD κάμερα. Ενδιάμεσα υπάρχει φίλτρο χαμηλής συχνότητας (Filter for Imaging, FI), το οποίο αφαιρεί την ανεπιθύμητη, για την κάμερα CCD, ακτινοβολία υπερύθρου (Εικόνα Α.16). 36

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET Α.3. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΛΟΓΩ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΚΑΤΑ FÖRSTER (FRET) Α.3.1. Εισαγωγή Η μεταφορά ενέργειας λόγω συντονισμού κατά Förster είναι ένα φυσικό φαινόμενο, που περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Förster (Förster 1948). Αναφέρεται συχνά και ως μεταφορά ενέργειας φθορισμού λόγω συντονισμού [Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer, FRET], αλλά η ονομασία αυτή δεν είναι απόλυτα σωστή, καθώς στην μεταφορά της ενέργειας δεν εμπλέκεται φθορισμός. Το FRET είναι μία διαδικασία, κατά την οποία λαμβάνει χώρα μεταφορά ενέργειας από ένα φθορισμοφόρο με διηγερμένη ηλεκτρονική κατάσταση (δότης) σε ένα κοντινό δεύτερο φθορισμοφόρο (δέκτης), χωρίς όμως εκπομπή ακτινοβολίας (φωτονίου). Η μεταφορά ενέργειας μπορεί να λάβει χώρα σε ένα εύρος 10-100 Å και η απόδοση της μεταφοράς είναι εξαιρετικά ευαίσθητη ως προς την απόσταση μεταξύ των φθορισμοφόρων. Γι αυτό τον λόγο το FRET είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την εξέταση αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων. Για να εξηγηθεί η μεταφορά ενέργειας, το διηγερμένο φθορισμοφόρο θεωρείται ως ένα δίπολο που ταλαντώνεται και μεταφέρει ενέργεια σε ένα δεύτερο δίπολο με παρόμοια συχνότητα συντονισμού. Το μηχανικό ανάλογο είναι δύο συζευγμένοι ταλαντωτές, που δονούνται στην ίδια συχνότητα. Η μεταφορά της ενέργειας λαμβάνει χώρα χωρίς μετατροπή σε θερμική ενέργεια και χωρίς συγκρούσεις μεταξύ μορίων. Κατά το FRET, η ένταση φθορισμού του δότη μειώνεται, καθώς και ο χρόνος παραμονής στην διεγερμένη κατάσταση και αντίστοιχα η ένταση φθορισμού του δέκτη αυξάνεται. Α.3.2. Αρχές FRET Όπως ήδη αναφέρθηκε, στο FRET η ενέργεια ενός διηγερμένου φθορισμοφόρουδότη μεταφέρεται σε ένα κοντινό φθορισμοφόρο-δέκτη. Για να συμβεί αυτό, όμως, το φάσμα εκπομπής του δότη πρέπει να επικαλύπτει το φάσμα απορρόφησης του δέκτη (Εικόνα Α.19). Δηλαδή, το φάσμα του δέκτη είναι μετατοπισμένο ως προς το φάσμα του δότη προς μεγαλύτερα μήκη κύματος (μικρότερη ενέργεια). 37

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET Εικόνα Α.19. Φάσματα απορρόφησης (κόκκινο) και φάσματα εκπομπής (μπλε) ζεύγους φθορισμοφόρων δότη-δέκτη. Η γκρι περιοχή δηλώνει την επικάλυψη του φάσματος εκπομπής του δότη με το φάσμα απορρόφησης του δέκτη. (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fret/fretintro.html). Το φαινόμενο μπορεί να γίνει αντιληπτό διεγείροντας με φως μήκους κύματος που αντιστοιχεί στο φάσμα απορρόφησης του δότη και παρατηρώντας εκπομπή φωτός μήκους κύματος που αντιστοιχεί στο φάσμα εκπομπής του δέκτη. Η όλη διαδικασία απορρόφησης και εκπομπής φωτονίων περιγράφεται αναλυτικά σε ένα διάγραμμα Jablonski (Εικόνα Α.20). Όταν ένα φθορισμοφόρο απορροφά ένα φωτόνιο, λόγω της ενέργειας που δέχεται μεταπίπτει από τη βασική κατάσταση σε μία υψηλότερης ενέργειας διεγερμένη ηλεκτρονική κατάσταση. Ένας τρόπος αποδιέγερσης και επιστροφής του μορίου στη βασική του κατάσταση είναι η εκπομπή ενός φωτονίου, φαινόμενο που ονομάζεται φθορισμός. Η εκπομπή αυτή είναι χαμηλότερης ενέργειας, οπότε λαμβάνει χώρα σε μεγαλύτερα μήκη κύματος σε σχέση με την απορρόφηση (μετατόπιση Stokes). Η διαφορά μεταξύ της ενέργειας απορρόφησης και εκπομπής μετατρέπεται σε ταλάντωση ή θερμότητα. Υπάρχουν, όμως, και άλλες ανταγωνιστικές διαδικασίες αποδιέγερσης του μορίου, πολλές από τις οποίες δεν περιλαμβάνουν εκπομπή ακτινοβολίας. Μία από αυτές είναι και το FRET. 38

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET Εικόνα Α.20. Διάγραμμα Jablonski που απεικονίζει τις συζευγμένες μεταπτώσεις μεταξύ της εκπομπής του δότη και της απορρόφησης του δέκτη κατά το φαινόμενο του FRET. Η απορρόφηση και η εκπομπή παριστάνονται με ευθέα βέλη (πράσινο και κόκκινο, αντίστοιχα), ενώ η δονητική χαλάρωση παρίσταται με κυματιστά βέλη (κίτρινα). Οι συζευγμένες μεταπτώσεις παριστάνονται με διακεκκομένα βέλη, δείχνοντας ότι δεν υπάρχει εκπομπή ακτινοβολίας και η μεταφορά της ενέργειας μεταξύ τους με το μπλε βέλος (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fret/fretintro.html). Εκτός από την επικάλυψη των φασμάτων που περιγράφηκε παραπάνω, ένα επιπλέον κριτήριο για να λάβει χώρα το φαινόμενο του FRET είναι η εγγύτητα μεταξύ δότη και δέκτη. Τα δύο φθορισμοφόρα πρέπει να βρίσκονται σε απόσταση μεταξύ 10 και 100 Å, το ένα από το άλλο. Όπως περιγράφεται παρακάτω, η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας μεταξύ δότη και δέκτη μειώνεται με την έκτη δύναμη της μεταξύ τους απόστασης. Έτσι, η δυνατότητα μεταφοράς της ενέργειας από το ένα μόριο στο άλλο μειώνεται δραματικά αυξανομένης της μεταξύ τους απόστασης, περιορίζοντας το φαινόμενο του FRET σε μία μέγιστη ακτίνα 100 Å. Σε απόσταση μικρότερη των 10 Å, επιπλέον φαινόμενα μεταφοράς ενέργειας μπορούν να λάβουν χώρα. Αυτή η εξάρτηση του FRET από την απόσταση είναι πολύ σημαντική για την μελέτη αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων (Stryer and Haugland 1967). Σε μόρια σημασμένα με φθορισμοφόρα, που μπορούν να σχηματίσουν ζεύγος δότη-δέκτη, FRET μπορεί να παρατηρηθεί μόνο αν τα μόρια βρίσκονται αρκετά κοντά μεταξύ τους, ώστε να αλληλεπιδρούν βιολογικά το ένα με το άλλο (Ha et al. 1996; Deniz et al. 1999). 39

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET Α.3.3. Θεωρία Förster Ο Förster ανέπτυξε μία θεωρία, με την οποία έδωσε ποσοτικό χαρακτήρα στο φαινόμενο του FRET. Η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας είναι ένα μέτρο του ποσοστού των φωτονίων που μεταφέρονται στον δέκτη από αυτά που συνολικά απορροφήθηκαν από τον δότη. Για να μπορέσει το FRET να δώσει χρήσιμες πληροφορίες για τη δομή των μορίων, πρέπει η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας να συσχετιστεί με την απόσταση μεταξύ των φθορισμοφόρων. Όπως αναφέρθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο, η απόδοση αυτή είναι αντιστρόφως ανάλογη της έκτης δύναμης της απόστασης μεταξύ των φθορισμοφόρων και δίνεται από τη σχέση: όπου, Ε η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας, R 0 η ακτίνα Förster και r η απόσταση μεταξύ των φθορισμοφόρων. Η ακτίνα Förster είναι η απόσταση μεταξύ των φθορισμοφόρων, όπου παρατηρείται 50% μεταφορά ενέργειας από τον δότη στον δέκτη (Εικόνα Α.21). Εικόνα Α.21. Απόδοση της μεταφοράς ενέργειας συναρτήσει της απόστασης μεταξύ ενός κατάλληλου ζεύγους φθορισμοφόρων (Schuler 2005). Η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας είναι πολύ ευαίσθητη ως προς τις αλλαγές στην απόσταση, όταν αυτή πλησιάζει την ακτίνα Förster R 0. Λόγω της ισχυρής εξάρτησης της απόδοσης από την απόσταση, οι μετρήσεις για την εύρεση της απόστασης μεταξύ δότη και δέκτη είναι αξιόπιστες μόνο στο εύρος 0.5R 0 1.5R 0. Όταν το r είναι περίπου ίσο με 0.5R 0, τότε η απόδοση μεταφοράς ενέργειας είναι σχεδόν μέγιστη και μικρότερες αποστάσεις δεν είναι δυνατό να προσδιοριστούν με 40

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET ακρίβεια. Αντίστοιχα, όταν το r είναι περίπου ίσο με 1.5R 0, τότε η απόδοση μεταφοράς ενέργειας είναι σχεδόν μηδενική και μεγαλύτερες αποστάσεις επίσης δεν είναι δυνατό να προσδιοριστούν Η ακτίνα Förster για ένα συγκεκριμένο ζεύγος φθορισμοφόρων μπορεί να υπολογιστεί από τη σχέση: R 6 0 = (8,79 10-5 ) D J (9) όπου, R 0 η ακτίνα Förster (σε Å 6 ), κ 2 ένας παράγοντας σχετικού προσανατολισμού των φθορισμοφόρων, Φ D η κβαντική απόδοση του δότη, J(λ) το ολοκλήρωμα της περιοχής επικάλυψης των φασμάτων δότη-δέκτη (σε Μ -1 cm -1 nm 4 ) και n ο δείκτης διάθλασης του διαλύματος (Lakowicz 1999). Η κβαντική απόδοση του δότη Φ D, ορίζεται ως ο λόγος του αριθμού των φωτονίων που εκπέμπονται προς αυτών που απορροφούνται. Συνήθως υπολογίζεται συγκρίνοντας τον δότη με συνηθισμένα φθορισμοφόρα, τα οποία έχουν γνωστές κβαντικές αποδόσεις. Καθώς το Φ D εμφανίζεται ως έκτη ρίζα στον υπολογισμό του R 0, μικρές παρεκκλίσεις από την πραγματική τιμή δεν έχουν σημαντική επίπτωση στην τελική τιμή του R 0. Το ολοκλήρωμα επικάλυψης J(λ) πρέπει να υπολογίζεται για κάθε ζεύγος δότηδέκτη. Όσο μεγαλύτερη η επικάλυψη μεταξύ του φάσματος εκπομπής του δότη με το φάσμα απορρόφησης του δέκτη, τόσο μεγαλύτερη και η τιμή του R 0. Επίσης η τιμή του R 0 μεγαλώνει για δέκτες με μεγαλύτερους συντελεστές εξάλειψης, καθώς η τιμή τους συνυπολογίζεται στο ολοκλήρωμα επικάλυψης. Ο δείκτης διάθλασης n είναι γενικά γνωστός από τη σύσταση του διαλύματος και συνήθως θεωρείται ότι έχει τιμή 1.4 για τα υδατικά διαλύματα (πολύ κοντά στο δείκτη διάθλασης του νερού, n νερού = 1.33). Η μεγαλύτερη αβεβαιότητα για τον υπολογισμό του R 0 οφείλεται στον προσδιορισμό της τιμής του παράγοντα προσανατολισμού κ 2. Ανάλογα με τον σχετικό προσανατολισμό μεταξύ των δύο φθορισμοφόρων το κ 2 μπορεί να πάρει τιμές από 0 έως 4. Για παράλληλα δίπολα κ 2 =1, ενώ για παράλληλα και συγγραμικά κ 2 =4. Λόγω της εμφάνισης του κ 2 ως έκτης ρίζας στον υπολογισμό του R 0 παρεκκλίσεις μεταξύ των τιμών 1 και 4 μπορούν να οδηγήσουν σε σφάλμα 26%. Σε πολύ σοβαρότερο σφάλμα μπορεί να οδηγήσει η περίπτωση τα δίπολα να είναι κάθετα μεταξύ τους, οπότε κ 2 =0. Με μετρήσεις ανισοτροπίας των δύο φθορισμοφόρων είναι δυνατόν να οριστούν κάποια όρια στην τιμή του κ 2 και να 41

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET μειωθεί το σφάλμα. Γενικά, όμως, το κ 2 θεωρείται ίσο με 2 3, τιμή για φθορισμοφόρα τα οποία έχουν τυχαίους προσανατολισμούς λόγω περιστροφικής διάχυσης και αυτή η τιμή λαμβάνεται υπόψη στον υπολογισμό του R 0 (Dale et al. 1979). Η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας Ε μπορεί να προσδιοριστεί με διάφορους τρόπους (Van Der Meer et al. 1994) αλλά για FRET μεμονωμένων μορίων χρησιμοποιούνται κυρίως δύο προσεγγίσεις. Σύμφωνα με την μία, η απόδοση υπολογίζεται μετρώντας τη διάρκεια ζωής του δότη στη διεγερμένη κατάσταση παρουσία (τ DA ) και απουσία (τ D ) δέκτη και δίνεται από τη σχέση: Ε = 1 - DA D (10) Πιο εφαρμόσιμη, όμως, πειραματικά είναι η δεύτερη προσέγγιση, η λεγόμενη αναλογιομετρική προσέγγιση (Deniz et al. 2001), όπου η απόδοση υπολογίζεται μετρώντας τις εντάσεις φθορισμού του δότη και του δέκτη και δίνεται από τη σχέση: Ε = F A F A F D (11) όπου, F D και F A οι εντάσεις φθορισμού του δότη και του δέκτη, αντίστοιχα και γ ένας παράγοντας διόρθωσης, που λαμβάνει υπ όψη τις κβαντικές αποδόσεις του δότη και του δέκτη, καθώς και τις αποδόσεις του συστήματος ανίχνευσης για τα αντίστοιχα εύρη μηκών κύματος. Υπολογίζοντας με έναν από τους παραπάνω τρόπους την απόδοση της μεταφοράς ενέργειας, Ε και την ακτίνα Förster, R 0 για ένα συγκεκριμένο ζεύγος δότη-δέκτη, είναι δυνατό από τη σχέση (8) να βρεθεί η απόσταση μεταξύ των φθορισμοφόρων για μια δεδομένη χρονική στιγμή. Α.3.4. Εναλλασσόμενη διέγερση δείγματος (ALEX) Μελέτες όπου η διέγερση των φθορισμοφόρων πραγματοποιείται με μία δέσμη laser παρουσιάζουν το πρόβλημα ότι στα ιστογράμματα της απόδοσης Ε του FRET εμφανίζεται μία κορυφή με μηδενικό Ε. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε μόρια που περιέχουν μόνο δότη, σε φωτόσβεση (photobleaching) του δέκτη, σχηματισμό μη φθοριζουσών τριπλών καταστάσεων ή συνεισφορές από τον διαλύτη. Η παρουσία αυτής της κορυφής περιπλέκει την εξαγωγή μίας μέσης τιμής για την απόδοση Ε του FRET και συμπερασμάτων για την βαρύτητα των υποπληθυσμών του ιστογράμματος. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το πρόβλημα η διέγερση πραγματοποιείται εναλλασσόμενα (Alternating-Laser Excitation, ALEX) μεταξύ διέγερσης του δότη και 42

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET απευθείας διέγερσης του δέκτη σε χρονική κλίμακα μικροδευτερολέπτων (μs-alex) (Kapanidis et al. 2004). Η τεχνική αυτή επιτρέπει τη συλλογή και καταμέτρηση των D φωτονίων που εκπέμπονται από το δότη και το δέκτη λόγω διέγερσης του δότη (F D A και F D ), καθώς και των φωτονίων που εκπέμπονται με απευθείας διέγερση του A δέκτη (F ). Υπολογίζονται δύο αναλογίες: η κλασική αναλογία της απόδοσης Ε του FRET, που είχε περιγραφεί από τη σχέση (11) και δίνεται πιο αναλυτικά παρακάτω: Ε = F A D F A D F D D (12) καθώς και η ανεξάρτητη από την απόσταση αναλογία S, που δίνει τη στοιχειομετρία μεταξύ δότη και δέκτη: S = F D F D F A (13) όπου η απουσία των πάνω δεικτών υποδεικνύει ότι όλα τα σήματα έχουν προστεθεί. Για δείγματα με μόνο δότη θα είναι Ε~0 και S~1, ενώ για δέιγματα με μόνο δέκτη θα είναι Ε~1 και S~0. Σε δείγματα όπου υπάρχουν και τα δύο φθορισμοφόρα το Ε μπορεί να έχει οποιαδήποτε τιμή μεταξύ 0 και 1 και το S θα είναι ~0.5. Με αυτό τον τρόπο μπορεί να γίνει διάκριση μεταξύ μηδενικής μεταφοράς ενέργειας λόγω απόστασης και πληθυσμών που περιέχουν μόνο δότη και να βγουν συμπεράσματα που οφείλονται αποκλειστικά στην απόδοση του FRET. Α.3.5. Πειραματική διάταξη Η πειραματική διάταξη για μονομοριακό FRET περιλαμβάνει ένα μικροσκόπιο ευρέως πεδίου (wide-field microscope) με διδιάστατους ανιχνευτές, όπως είναι μία κάμερα CCD. Αυτή η διάταξη επιτρέπει τη συλλογή δεδομένων από πολλά μεμονωμένα μόρια παράλληλα, σε αντίθεση με το ομοεστιακό μικροσκόπιο (confocal microscope), το οποίο χρειάζεται να σαρώσει σημείο προς σημείο την προς εξέταση περιοχή. Ένας αντικειμενικός φακός με μεγάλο αριθμητικό άνοιγμα (ΝΑ=1.4), που χρησιμοποιεί λάδι ως υγρό βύθισης, εστιάζει τη δέσμη laser πάνω στο δείγμα. Το φως που εκπέμπεται από τα φθορισμοφόρα του δείγματος περνάει μέσα από ένα διχρωματικό κάτοπτρο (Dichroic Mirror, DM) και προσπίπτει πάνω σε ένα σφηνοειδές διχρωματικό κάτοπτρο (Wedged Mirror, WM), το οποίο διαχωρίζει το 43

ΕΙΣΑΓΩΓΗ FRET φως που εκπέμπεται από τον δότη και το φως που εκπέμπεται από τον δέκτη. Και τα δύο ανιχνεύονται συγχρόνως από διαφορετικές περιοχές της ίδιας κάμερας CCD. Για να είναι εφικτή η τεχνική μs-alex κατά τη διάρκεια των μετρήσεων αντί για μία δέσμη laser, υπάρχει η δυνατότητα χρήσης δύο δεσμών. Η μία δέσμη (laser ιόντων Αr +, λ=488 nm) περνάει από έναν διαχωριστή (Beam Splitter, BS). Μέρος της δέσμης καθοδηγείται μέσω ενός διχρωματικού κατόπτρου στο δείγμα για διέγερση του δότη. Το υπόλοιπο της δέσμης ενεργοποιεί ένα laser, που χρησιμοποιεί μία οργανική χρωστική ως μέσο ενίσχυσης της έντασης του φωτός (dye laser, λ=640 nm) και το οποίο χρησιμοποιείται για απευθείας διέγερση του δέκτη. Η οργανική χρωστική που χρησιμοποιήθηκε ήταν το DCM (4-DiCyanoMethylene-2-methyl-6-pdimethylaminostylyl-4H-pyran), αιωρημένο σε μίγμα 1:1 v/v αιθυλενογλυκόλης : βενζυλαλκοόλης. Και οι δύο δέσμες περνάνε μέσα από ένα ακουστο-οπτικά ρυθμιζόμενο φίλτρο (Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF), το οποίο μπορεί και εκτρέπει τις δέσμες laser κατά βούληση. Αυτό επιτυγχάνεται αλλάζοντας τον δείκτη διάθλασης ενός οπτικού κρυστάλλου με εφαρμογή ενός ακουστικού κύματος (Εικόνα Α.22). Εικόνα Α.22. Πειραματική διάταξη για την διεξαγωγή ενός πειράματος FRET. BS διαχωριστής δέσμης, M καθρέφτης, DM διχρωματικό κάτοπτρο, WM σφηνοειδές διχρωματικό κάτοπτρο, AOTF ακουστο-οπτικά ρυθμιζόμενο φίλτρο, Ο αντικειμενικός φακός, L συγκεντρωτικός φακός και EF φίλτρο εκπομπής. 44

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Η ανά χείρας διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο να εξετάσει θεμελιώδη ερωτήματα της βιοσύνθεσης πρωτεϊνών, τα οποία ύστερα από πολύχρονες και εξαντλητικές μελέτες συνεχίζουν ως ένα βαθμό να υφίστανται, υπό το πρίσμα ενός καινούριου πεδίου της έρευνας που αφορά τη μελέτη μεμονωμένων μορίων. Ένας από τους στόχους της διατριβής ήταν να μετρηθούν οι δυνάμεις που ασκούνται στην νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα κατά τη διάρκεια της σύνθεσης από το ριβόσωμα. Οι δυνάμεις αυτές είναι στην κλίμακα των piconewton (pn) και ήταν μέχρι τώρα τεχνικά αδύνατο να μετρηθούν. Στην διατριβή αυτή γίνεται χρήση των οπτικών λαβίδων, μιας εκ των πλέον σύγχρονων τεχνικών, η οποία κάνει τα πρώτα της βήματα στο χώρο των βιοεπιστημών, με σκοπό να μετρηθούν οι δυνάμεις αυτές σε μεμονωμένα ριβοσώματα που βιοσυνθέτουν καθηλωμένα και ταυτόχρονα λειτουργικά σε επιφάνειες υάλου. Για να καταστεί αυτό δυνατό, έπρεπε πρώτα να δημιουργηθεί ένα κατάλληλο βιοχημικό σύστημα το οποίο να επιτρέπει την ελεγχόμενη βιοσύνθεση in vitro. Ένας άλλος στόχος της διατριβής ήταν να ρίξει φως στη διαδικασία της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της σύνθεσής τους από τα ριβοσώματα, η οποία αναμένεται να διαφέρει αρκετά από τη τρέχουσα γνώση που πηγάζει από πειράματα όπου πλήρεις πρωτεΐνες μετουσιώνονται και στη συνέχεια αναδιπλώνονται. Σε αυτή τη διατριβή έγινε χρήση του φαινομένου FRET, το οποίο μπορεί να μετρήσει με μεγάλη ακρίβεια αποστάσεις μεταξύ δύο κατάλληλα τοποθετημένων φθορισμοφόρων. Ο σκοπός ήταν να μελετηθεί η συμμεταφραστική αναδίπλωση μεμονωμένων πρωτεϊνών από ριβοσώματα που βιοσυνθέτουν. 45

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΛΙΚΑ Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1. ΥΛΙΚΑ Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τις εταιρείες: Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA), Merck (Darmstadt, Germany), Serva (Heidelberg, Germany), Fluka (Buchs, Switzerland), Roth (Karlsruhe, Germany) Riedel de Haen (Seelze, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και PVDF ήταν της εταιρείας BioRad (Hercules, CA, USA). Τα αντιδραστήρια για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών με τη μέθοδο BCA (BiCinchoninic Acid), καθώς και για την ανίχνευση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη με τη μέθοδο ECL (Enhanced ChemiLuminescence) ήταν της εταιρείας Pierce (Rockford, IL, USA). Το αντιδραστήριο NBT/BCIP, για τον έλεγχο της βιοτινυλίωσης των ριβοσωμάτων με χρωματομετρική μέθοδο, προμηθεύτηκε από την Roche (Mannheim, Germany). Τα φθορισμοφόρα, για την in vitro σήμανση των πρωτεϊνών, ήταν τα: Atto655- μαλεϊμίδιο της ATTO-TEC (Siegen, Germany) και Alexa633-μαλεϊμίδιο της Molecular Probes (Carlsbad, CA, USA). Το τροποποιημένο trna που μεταφέρει μία λυσίνη με το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR, για την in vivo σήμανση των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών ήταν μία ευγενική προσφορά της εταιρείας RiNA (Berlin, Germany). Το αντιδραστήριο Vectabond για την αμινοσιλανοποίηση των αντικειμενοφόρων πλακών ήταν της Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA), ενώ ο NHS εστέρας του mpeg και το βιοτινυλιωμένο παράγωγό του, για τη μετέπειτα επικάλυψη των γυαλιών, ήταν της εταιρείας Nektar Therapeutics (Huntsville, AL, USA). Οι χάντρες, που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα των οπτικών λαβίδων, ήταν διαμέτρου 3μm από SiO 2 (silica) επικαλυμμένες με στρεπταβιδίνη και προμηθεύτηκαν απο την εταιρεία Kisker-Biotech (Steinfurt, Germany). Β.1.2. Υλικά χρωματογραφίας Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών με ουρά 6 ιστιδινών, χρησιμοποιήθηκε υλικό χρωματογραφίας αγχιστείας (σφαιρίδια Ni-NTA), της εταιρείας Qiagen (Hilden, 46

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΛΙΚΑ Germany). Για την απομάκρυνση της περίσσειας των φθορισμοφόρων, μετά την in vitro σήμανση των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκαν στήλες μοριακής διήθησης (υλικό Sephadex G-25), της εταιρείας Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden). Β.1.3. Βιολογικό υλικό Όλα τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από το βακτήριο E.coli. Τα στελέχη XL1 και TOP10 χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό και απομόνωση των πλασμιδίων, το BL21(DE3) για την υπερέκφραση των πρωτεϊνών και το AVB101 για την in vivo βιοτινυλίωση των ριβοσωμάτων. Δύο μεταλλαγμένα στελέχη E.coli, από τα ριβοσώματα των οποίων έλειπε η πρωτεΐνη L24 ή L29, αντίστοιχα, παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Prof. K.Nierhaus του Ινστιτούτου Μοριακής Γενετικής Max-Planck στο Βερολίνο. Β.1.4. Υλικά μοριακής βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού ήταν από τις εταιρείες: New England Biolabs (Frankfurt am Main, Germany), Takara (Otsu-Shiga, Japan), Fermentas (St.Leon-Rot, Germany). Η Τ4 DNA λιγάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν επίσης από την Fermentas, ενώ η πολυμεράση από την Finnzymes (Espoo, Finland). Ως εκμαγείο για την απομόνωση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο pet11a της Novagen (Madison, WI, USA). Για τον έλεγχο της νουκλεοτιδικής ακολουθίας των γονιδίων έγινε χρήση του πλασμιδίου PCR-Blunt της Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Για την υπερέκφραση των πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο pet27b(+) της Novagen, ενώ η έκφραση της GFPem έγινε στο πλασμίδιο prset/emgfp της Invitrogen-Life Technologies. Ως φορέας βιοτινυλίωσης χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο pan5 της Avidity (Denver, CO, USA). Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν των εταιρειών DIFCO Laboratories, (Detroit, MI, USA) και AppliChem (Darmstadt, Germany). Οι εκκινητές για τις αντιδράσεις PCR παρασκευάστηκαν από την εταιρεία MWG (Ebersberg, Germany). Τέλος, το in vitro σύστημα συζευγμένης μεταγραφής-μετάφρασης ήταν μία προσφορά της εταιρείας RiNA (Berlin, Germany). 47

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.1. Καλλιέργεια κυττάρων Ε.coli Τα στελέχη Ε.coli αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό LB (Luria-Bertani) (Sambrook et al. 1989), του οποίου η σύσταση είναι η παρακάτω: Θρεπτικό υλικό LB Τρυπτόνη 1.0 % w/v Εκχύλισμα ζύμης 0.5 % w/v NaCl 1.0 % w/v Το ph ρυθμίζεται στο 7 με προσθήκη NaOH. Επίσης χρησιμοποιήθηκε και ένα πλουσιότερο θρεπτικό υλικό, το dyt του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: Θρεπτικό υλικό dyt Τρυπτόνη 1.6 % w/v Εκχύλισμα ζύμης 1.0 % w/v NaCl 0.5 % w/v Η αποστείρωση του θρεπτικού υλικού γίνεται στους 120 ο C υπό πίεση 1.2 atm για 20 min. Ο εμβολιασμός γίνεται με stock κυττάρων σε γλυκερόλη σε αναλογία 1:1000. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C για 12 16 ώρες, με έντονη ανάδευση, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού επιλογής για κάθε περίπτωση. Β.2.2. Μέθοδοι προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών Β.2.2.1. Φασματοφωτομετρική μέθοδος Τα πρωτεϊνικά διαλύματα έχουν την ιδιότητα να απορροφούν το φως στην υπεριώδη περιοχή με μέγιστο στα 280 nm. Η απορρόφηση αυτή οφείλεται στην ύπαρξη τριών αμινοξέων με αρωματικό δακτύλιο, της τυροσίνης, της τρυπτοφάνης, και της φαινυλαλανίνης, με την τελευταία να συμβάλλει σε πολύ μικρότερο ποσοστό στο φάσμα απορρόφησης. Διάλυμα πρωτεΐνης με συγκέντρωση 1 mg/ml δίνει απορρόφηση στα 280 nm ίση με τη μονάδα. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι η ταχύτητα εκτέλεσής της, η ευκολία και η δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης του δείγματος. Το μειονέκτημά της είναι ότι δεν παρουσιάζει υψηλή ακρίβεια λόγω της διαφορετικής αμινοξικής σύστασης των πρωτεϊνών καθώς και της συνύπαρξης άλλων ουσιών που απορροφούν στο υπεριώδες-όπως τα νουκλεϊνικά οξέα. 48

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.2.2. Χρωματομετρική μέθοδος Bradford, τροποποιημένη απο τον Bearden Η χρωματομετρική μέθοδος Bradford βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσμεύεται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465 nm και έχει καστανό χρώμα. Η δημιουργία του συμπλόκου έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση κυανού χρώματος, που μετράται φωτομετρικά στα 595 nm. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάζεται ως εξής: η χρωστική CBB G-250 διαλύεται σε 85% φωσφορικό οξύ, σε συγκέντρωση 1 mg/ml, με ανάδευση για 16-20 ώρες. Στη συνέχεια γίνεται αραίωση του διαλύματος 1:5 με απιονισμένο νερό και διήθηση. Το αντιδραστήριο φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη για προστασία από το φως. Ο προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών στα δείγματα γίνεται με ανάμειξη δείγματος αραιωμένου στα 2 ml με απιονισμένο νερό με 2 ml αντιδραστηρίου Bradford, ανάδευση και μέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών υπολογίζεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που γίνεται με γνωστές ποσότητες αλβουμίνης βόειου ορού (Bovine Serum Albumin, BSA) (Bradford 1976; Bearden 1978). Β.2.2.3. Χρωματομετρική μέθοδος BCA Η χρωματομετρική μέθοδος BCA (BiCinchoninic Acid) συνδυάζει την αναγωγή κατιόντων χαλκού Cu 2+ σε Cu 1+ από πρωτεΐνες σε αλκαλικό διάλυμα και την πολύ ευαίσθητη και ειδική χρωματομετρική ανίχνευση του Cu 1+ από το BCA (Smith, P. K. et al. 1985). Ο πεπτιδικός δεσμός και τέσσερα αμινοξέα (κυστεΐνη, κυστίνη, τρυπτοφάνη και τυροσίνη) ανάγουν τα κατιόντα χαλκού σε αλκαλικό διάλυμα και αλλάζουν το χρώμα του διαλύματος από ανοιχτό μπλε σε ιώδες (Wiechelman et al. 1988). Η αντίδραση αυτή έχει χαμηλή ευαισθησία και είναι δύσκολο να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα για τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης. Η προσθήκη του BCA εντείνει σημαντικά το σχηματισμό του ιώδους χρώματος. Το BCA σχηματίζει χηλική ένωση με τα ανηγμένα ιόντα χαλκού Cu 1+ σε αναλογία 2:1 και το σύμπλοκο αυτό απορροφά ισχυρά στα 562 nm. Η απορρόφηση είναι γραμμική για αυξανόμενες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης σε ένα εύρος από 20-2000 μg/ml. Το αντιδραστήριο παρασκευάζεται με ανάμειξη δύο διαλυμάτων, του διαλύματος Α και του διαλύματος Β, σε αναλογία 50:1. Το διάλυμα Α περιλαμβάνει Na 2 CO 3, 49

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ NaHCO 3, BCA και τρυγικό νάτριο (Na 2 C 4 H 4 O 6 ) σε 0.1Μ NaOH. Το διάλυμα Β είναι διάλυμα 4% σε CuSO 4. Ο προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών στα δείγματα γίνεται με προσθήκη 0.1 ml δείγματος σε 2 ml αντιδραστηρίου, ανάδευση και θέρμανση για 30 min στους 60 ο C. Ακολουθεί ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου (θ.δ.) και μέτρηση της απορρόφησης στα 562 nm. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών υπολογίζεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που γίνεται με γνωστές ποσότητες αλβουμίνης βόειου ορού (Bovine Serum Albumin, BSA). Β.2.3. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS PAGE) Οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα σωματίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται δια μέσου των πόρων μιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το πολυακρυλαμίδιο, που χρησιμοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως είναι η χημική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερμοκρασία, και η επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. Η δημιουργία των πηκτών πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται με τον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου, και του Ν,Ν-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου, (bis-ακρυλαμιδίου) σε αναλογία 30:0.8 w/w. Το bis-ακρυλαμίδιο, συντελεί στο σχηματισμό γεφυρών μεταξύ των αλυσίδων των πολυμερών του ακρυλαμιδίου. Κατ αυτόν τον τρόπο, δημιουργείται ένα τριδιάστατο πολυμερές πλέγμα, το μέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης των μονομερών του ακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός πραγματοποιείται με μηχανισμό ελευθέρων ριζών. Ως καταλύτης έναρξης σχηματισμού των ελευθέρων ριζών χρησιμοποιείται το υπερθειϊκό αμμώνιο, (Ammonium PerSulfate, APS). Στη συνέχεια προστίθεται ο φωτοχημικός καταλύτης Ν,Ν,-τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη, (TEtra Methyl Ethylene Diamine, TEMED), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν 2- και δίνει ελεύθερες ρίζες, (S 2 O 8 2 SO - 4 ), που διαδίδονται σε άλλα μόρια ακρυλαμιδίου προς σχηματισμό του πολυμερούς (Εικόνα Β.1). 50

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Εικόνα Β.1. Αντίδραση πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου Κατά την ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE), οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση, ενώ διαχωρίζονται με βάση το μοριακό τους βάρος, λόγω της παρουσίας του ανιονικού απορρυπαντικού SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Το αρνητικά φορτισμένο SDS δεσμεύεται στις υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών, οι οποίες αποδιατάσσονται και δημιουργούνται επιμήκη μόρια με αρνητικό φορτίο. Το ποσό του SDS που δεσμεύεται ανά μονάδα βάρους πρωτεΐνης είναι σταθερό (1.4 gr SDS / gr πρωτεΐνης). Έτσι, το φορτίο του συμπλόκου SDS πρωτεΐνης είναι συνάρτηση του μεγέθους της πρωτεΐνης και η ηλεκτροφορητική της κινητικότητα εξαρτάται αποκλειστικά από το μοριακό της μέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό γλυκοσυλίωσης, Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσμεύουν μικρότερα ποσά SDS ανά μονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου με αποτέλεσμα να παρουσιάζουν φαινόμενο μοριακό βάρος υψηλότερο του πραγματικού. Το σύστημα ηλεκτροφόρησης μπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο ασυνεχές σύστημα, που είναι το πιο συνηθισμένο, χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), όπου γίνεται συμπύκνωση των πρωτεϊνών του 51

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ δείγματος σε μια λεπτή στοιβάδα, (χαμηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~7), και η πηκτή διαχωρισμού (separating gel), όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος, (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~9) (Laemmli 1970; Okajima et al. 1993). Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγματος, δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισμού και επιστοίβαξης είναι η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης Ακρυλαμίδιο 4.0 % w/v bis-ακρυλαμίδιο 0.1 % w/v SDS 0.1 % w/v Tris-HCl ph 6.8 0.125 M APS 0.05 % w/v TEMED 0.1 % v/v Πηκτή διαχωρισμού Ακρυλαμίδιο 20 % w/v bis-ακρυλαμίδιο 0.5 % w/v SDS 0.1 % w/v Tris-HCl ph 8.8 0.750 M APS 0.03 % w/v TEMED 0.06 % v/v Το ρυθμιστικό διάλυμα των ηλεκτροδίων (running buffer) προστίθεται στους δύο θαλάμους (chambers) των ηλεκτροδίων της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Η σύστασή του είναι η παρακάτω: Διάλυμα ηλεκτροδίων Tris 25 mm Γλυκίνη 192 mm SDS 0.1 % w/v Στα δείγματα πριν την ηλεκτροφόρηση προστίθεται το διάλυμα δειγμάτων (loading buffer). Το διάλυμα παρασκευάζεται 5 φορές πιο πυκνό (5x). Τα δείγματα θερμαίνονται για 5 min στους 100 ο C για να αποδιαταχθούν πλήρως οι πρωτεΐνες και για να δημιουργηθεί το σύμπλοκο SDS-πρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσμούς και αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες. Η σύσταση του διαλύματος δειγμάτων είναι η παρακάτω: 52

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Διάλυμα δειγμάτων (1x) SDS 0.4 % w/v Tris-HCl ph 6.8 12 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 1% v/v Γλυκερόλη 5 % v/v Κυανούν της βρωμοφαινόλης 0.02% w/v Αφού εισαχθούν τα δείγματα, η συσκευή ηλεκτροφόρησης συνδέεται με τροφοδοτικό και εφαρμόζεται σταθερή τάση 180-200 V μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Β.2.4. Στερέωση και χρώση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Β.2.4.1. Χρώση με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 Για την εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου η πηκτή υποβάλλεται σε μία κατεργασία στερέωσης και χρώσης, με την χρωστική CBB R-250. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη δημιουργία συμπλόκου κυανού χρώματος μεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής CBB R-250. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση μέχρι και 0.1 μg πρωτεΐνης. Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών η πηκτή εμβαπτίζεται στο διάλυμα χρώσης (staining solution), που στην ουσία είναι το διάλυμα της στερέωσης συν την χρωστική. Έτσι, η στερέωση και η χρώση γίνονται ταυτόχρονα. Η χρώση γίνεται για μία ώρα με ήπια ανάδευση και έπειτα αφαιρείται με το διάλυμα αποχρωματισμού (destaining solution). Η σύσταση των διαλυμάτων είναι η εξής: Διάλυμα χρώσης CBB R-250 0.25 % w/v Αιθανόλη 25 % v/v Διάλυμα Οξικό οξύ 10 % v/v Στερέωσης Διάλυμα αποχρωματισμού Οξικό οξύ 10% v/v Β.2.5. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου- SDS σε μεμβράνη Η μεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου-sds σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή πολυβινυλοδιφθοριδίου ((PolyVinylidene DiFluoride, PVDF), με 53

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου, είναι επίσης γνωστή ως Western Blot. Η μέθοδος στηρίζεται στο γεγονός ότι τα σύμπλοκα SDS-πρωτεϊνών, που είναι αρνητικά φορτισμένα, κινούνται προς το θετικό πόλο κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου, εξέρχονται από την πηκτή και καθηλώνονται στη μεμβράνη λόγω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Πρωτεΐνες που έχουν καθηλωθεί σε μεμβράνη μπορούν να ανιχνευθούν με χρήση αντισωμάτων ή να γίνει προσδιορισμός της αμινοξικής ακολουθίας τους (protein sequencing) σε αυτόματο αναλυτή (στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται αποκλειστικά η μεμβράνη PVDF). Μετά το τέλος της SDS-PAGE ακολουθεί εμβάπτιση της πηκτής και της μεμβράνης, σε διάλυμα μεταφοράς (transfer buffer). Αν χρησιμοποιείται μεμβράνη PVDF, είναι απαραίτητη η ενεργοποίησή της με μεθανόλη 100% για ένα λεπτό, πριν την εμβάπτιση στο διάλυμα της μεταφοράς Η σύσταση του διαλύματος μεταφοράς είναι η εξής: Διάλυμα μεταφοράς Γλυκίνη 39 mm Tris 48 mm Μεθανόλη 20 % v/v Στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς (semi-dry blotter της H.Holzel GmbH), το κάτω ηλεκτρόδιο είναι το αρνητικό. Σε αυτό τοποθετούνται 6 φύλλα Whatmann κομμένα στο μέγεθος της πηκτής και διαβρεγμένα με διάλυμα μεταφοράς. Από πάνω τοποθετείται η πηκτή, έπειτα η μεμβράνη (επίσης κομμένη στο μέγεθος της πηκτής) και τέλος άλλα 6 φύλλα Whatmann. Δίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων, που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Το θετικό ηλεκτρόδιο τοποθετείται από πάνω και κλείνει τη συσκευή. Όπως γίνεται αντιληπτό, η πηκτή τοποθετείται προς το αρνητικό ηλεκτρόδιο και η μεμβράνη προς το θετικό. Για την μεταφορά εφαρμόζεται σταθερή ένταση ηλεκτρικού ρεύματος 1 ma/cm 2 της πηκτής επί 2 ώρες. Β.2.6. Χρώση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη Β.2.6.1. Χρώση με διάλυμα Ponceau S Για να ελεγχθεί κατά πόσο ήταν επιτυχής η ηλεκτρομεταφορά, η μεμβράνη υποβάλλεται σε μία διαδικασία χρώσης με τη χρωστική Ponceau S, ώστε να γίνουν 54

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ ορατές οι πρωτεϊνικές ζώνες που μεταφέρθηκαν από την πηκτή στη μεμβράνη. Το Ponceau S είναι μία αρνητικά φορτισμένη χρωστική, η οποία δεσμεύεται στις θετικά φορτισμένες αμινομάδες των πρωτεϊνών, καθώς και στις μη πολικές περιοχές τους. Μετά την ηλεκτρομεταφορά η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε διάλυμα 0.2 % (w/v) Ponceau S σε 3 % τριχλωροοξικό οξύ (TriChloroAcetic acid, TCA) για 5 min. Πλύσεις με απιονισμένο νερό καθαρίζουν το υπόβαθρο και εμφανίζουν τις ζώνες των πρωτεϊνών με κόκκινο χρώμα. Με αυτή τη μέθοδο μπορούν να ανιχνευτούν έως και 250-500 ng πρωτεΐνης, έχει δηλαδή περίπου ίδια ευαισθησία με τo CBB R-250. Το πλεονέκτημα του Ponceau S είναι η χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών χωρίς στερέωση. Η χρώση, δηλαδή, μπορεί εύκολα να απομακρυνθεί με πλύσεις με απιονισμένο νερό και η μεμβράνη να χρησιμοποιηθεί παραπέρα για ανοσοανίχνευση των πρωτεϊνών (Salinovich and Montelaro 1986). Β.2.7. Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών καθηλωμένων σε μεμβράνη (Western Blot) Η ανοσοανίχνευση επιτρέπει τον εντοπισμό μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης (πρωτεΐνη-στόχος), που βρίσκεται καθηλωμένη σε μεμβράνη, με τη βοήθεια πολυκλωνικού ή μονοκλωνικού αντισώματος. Η αρχή της τεχνικής στηρίζεται ουσιαστικά στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης-στόχου με το κατάλληλο αντίσωμα. Η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο εκτός του ότι αναγνωρίζει και δεσμεύεται στο πρώτο αντίσωμα, είναι συζευγμένο με ένα ένζυμοδείκτη το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί με κάποια από τις μεθόδους που αναλύονται παρακάτω. Συνήθως η ανοσοανίχνευση γίνεται σε δύο στάδια. Έτσι, το δεύτερο αντίσωμα μπορεί να είναι ένα γενικό αντίσωμα, που αναγνωρίζει ένα μεγάλο αριθμό πρώτων αντισωμάτων, εξειδικευμένα να αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένες πρωτεΐνεςστόχους. Τα τελευταία χρόνια, όμως, υπήρξε ενδιαφέρον στην ανάπτυξη συστημάτων ανοσοανίχνευσης ενός σταδίου, λόγω της ταχύτερης ανίχνευσης των πρωτεϊνών. Σε αυτά τα συστήματα το αντίσωμα αναγνωρίζει την πρωτεΐνη-στόχο και συγχρόνως είναι συζευγμένο με ένα ένζυμο-δείκτη. Η αναγνώριση της πρωτεΐνης-στόχου συνήθως γίνεται μέσω κάποιας μικρής αλληλουχίας σήμανσης (protein tag), όπως η ουρά 6 ιστιδινών ή η βιοτίνη. 55

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.7.1. Μέθοδος ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) Χημειοφωταύγεια είναι η διεργασία κατά την οποία απελευθερώνεται ενέργεια με τη μορφή φωτός, λόγω μίας χημικής αντίδρασης. Η μέθοδος της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Enhanced ChemiLuminescence, ECL) εκπέμπει φως όταν το υπόστρωμα έρχεται σε επαφή με την υπεροξειδάση του χρένου (αγριοράπανου) (HorseRadish Peroxidase, HRP). Η HRP καταλύει την οξείδωση της λουμινόλης με υπεροξείδιο του υδρογόνου και παράγεται 3-αμινοφθαλικό ιόν σε διεγερμένη κατάσταση. Αυτό επανέρχεται στην βασική κατάσταση εκπέμποντας φως. (Εικόνα Β.2). Εικόνα Β.2. Αντίδραση κατάλυσης της οξείδωσης της λουμινόλης από την HRP και εκπομπή φωτός. Η μέθοδος αυτή είναι η πιο ευαίσθητη από τις υπάρχουσες μεθόδους ανίχνευσης. Μπορεί να ανιχνεύσει ποσότητες πρωτεΐνης της τάξης των pg (10-12 g) και τελευταία ακόμα και της τάξης των fg (10-15 g). Η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε διάλυμα κορεσμού και αναδεύεται για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό γίνεται για τον κορεσμό της επιφάνειας της μεμβράνης, έτσι ώστε οι ελεύθερες υδρόφοβες ομάδες της να καλυφθούν και να μην αλληλεπιδράσουν με το αντίσωμα. Έτσι, λαμβάνει χώρα μόνο ειδική δέσμευση του αντισώματος στην πρωτεΐνη-στόχο, που δίνει πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. Το διάλυμα κορεσμού έχει την παρακάτω σύσταση: Διάλυμα κορεσμού Σκόνη γάλακτος 10 % w/v Αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) 5 % w/v TBS-T (20 mm Tris-HCl, ph 7.6, 137 mm NaCl, 0.1 % (v/v) Tween-20) Κατόπιν, η μεμβράνη επωάζεται με το κατάλληλο αντίσωμα σε καθορισμένη αραίωση, σε διάλυμα κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C ή για 56

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ 2 ώρες σε θ.δ. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν, για τον έλεγχο των μεταλλαγμένων στελεχών, ενάντια στις πρωτεΐνες L24 και L29, προήλθαν από πρόβατο (αραίωση 1:1000) και το δεύτερο αντίσωμα ενάντια στις ανοσοσφαιρίνες IgG του προβάτου ήταν συζευγμένο με την HRP (αραίωση 1:1000). Για τις πρωτεΐνες που απομονώθηκαν και σημάνθηκαν in vitro έγινε ανοσοανίχνευση ενός σταδίου με αντίσωμα ενάντια στην ουρά 6 ιστιδινών (His-tag), το οποίο ήταν επίσης συζευγμένο με την HRP (αραίωση 1:5 000). Στην περίπτωση της ανοσοανίχνευσης με τα δύο αντισώματα, μετά το πρώτο αντίσωμα γίνονται τρεις δεκάλεπτες πλύσεις της μεμβράνης με TBS-T και ακολουθεί επώαση με το δεύτερο αντίσωμα, αραιωμένο σε διάλυμα κορεσμού για 1 ώρα σε θ.δ. υπό συνεχή ανακίνηση. Κατόπιν, γίνονται τρεις πλύσεις με TBS-T και μία με TBS (ίδιο με το TBS-T χωρίς όμως το Tween-20). Στην περίπτωση της ανοσοανίχνευσης ενός σταδίου μετά το αντίσωμα γίνονται οι τελικές πλύσεις. Για την ανίχνευση, η μεμβράνη τοποθετείται μέσα σε ειδική κασέτα και απλώνεται πάνω της μίγμα διαλύματος λουμινόλης και διαλύματος υπεροξειδίου του υδρογόνου, σε αναλογία 1:1. Μέσα στην κασέτα γίνεται έκθεση ακτινογραφικού φιλμ στο φως που εκπέμπεται από τη μεμβράνη, λόγω της αντίδρασης που λαμβάνει μέρος. Έτσι, πάνω στο φιλμ αποτυπώνονται οι ζώνες της πρωτεΐνης-στόχου. Β.2.7.2. Χρωματομετρική μέθοδος Η μέθοδος στηρίζεται στην οξειδοαναγωγική αντίδραση μεταξύ των ενώσεων NBT (Nitro Blue Tetrazolium chloride) και BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indonyl Phosphate). Το BCIP αποτελεί υπόστρωμα της αλκαλικής φωσφατάσης (Alkaline Phosphatase, AP). Το αποφωσφορυλιωμένο προϊόν οξειδώνεται από το NBT και δίνει χαρακτηριστικό μπλε χρώμα. Το NBT, που ανάγεται δίνει επίσης μπλε χρώμα, κάνοντας την αντίδραση πιο ευαίσθητη (Εικόνα Β.3). 57

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Εικόνα Β.3. Οξειδοαναγωγική αντίδραση μεταξύ NBT και BCIP, που δίνει προϊόντα μπλε χρώματος. Η διαδικασία είναι παρόμοια με την προηγούμενη. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η βιοτινυλίωση των ριβοσωμάτων. Για αυτό το λόγο έγινε χρήση του εμπορικού διαλύματος κορεσμού Roti-Block της Roth, καθώς το γάλα αποτελεί μία από τις πλουσιότερες πηγές βιοτίνης. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με TBS. Αντί για αντίσωμα η μεμβράνη επωάστηκε με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αλκαλική φωσφατάση αραιωμένη σε TBS-T (αραίωση 1:2000), υπό συνεχή ανακίνηση για 1 ώρα σε θ.δ. Κατόπιν, γίνονται τρεις πλύσεις με TBS. Για την ανίχνευση της πρωτεΐνης-στόχου παρασκευάζεται διάλυμα ανίχνευσης με σύσταση: Διάλυμα ανίχνευσης Tris-HCl, ph 9 100 mm NaCl 100 mm MgCl 2 50 mm Η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε 10 ml του διαλύματος ανίχνευσης στο οποίο έχουν προστεθεί 200 μl του διαλύματος NBT/BCIP και η χρωμοαντίδραση λαμβάνει μέρος σε θ.δ. χωρίς ανακίνηση. Ο χρόνος εμφάνισης των ζωνών εξαρτάται από την ποσότητα της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης. Για να σταματήσει η χρωμοαντίδραση η μεμβράνη ξεπλένεται με δις απεσταγμένο νερό, στεγνώνεται και φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο. 58

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.8. Απομόνωση 70S ριβοσωμάτων από E.coli Για την απομόνωση των ριβοσωμάτων από E.coli ακολουθήθηκε η διαδικασία σύμφωνα με τους Rheinberger et al., με κάποιες τροποποιήσεις (Rheinberger et al. 1988). Χρησιμοποιήθηκαν ιοντικές συνθήκες παρόμοιες με τις in vivo συνθήκες (ρυθμιστικό διάλυμα Tico). Η σύσταση του διαλύματος φαίνεται παρακάτω: Ρυθμιστικό διάλυμα Tico Hepes-KOH, ph 7.5 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 6 mm CH 3 COONH 4 30 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 4 mm Παγωμένα κύτταρα E.coli ξεπαγώνουν με αιώρηση σε 1 ml Tico / gr κυττάρων και ανακτώνται με φυγοκέντρηση στα 6 000 rpm για 20 min σε κεφαλή Sorvall GSA (4 C). Τα κύτταρα ζυγίζονται και επαναιωρούνται σε Tico (1.2 ml/gr κυττάρων). Λύση των κυττάρων με τη χρήση ενός ομογενοποιητή (microfluidizer processor), σε πίεση 5 000 psi (345 bar). Φυγοκέντρηση στα 10 000 rpm (16 000 g) για 10 min σε κεφαλή Sorvall GSA (4 C) για απομάκρυνση των άσπαστων κυττάρων. Φυγοκέντρηση του υπερκείμενου στα 15 000 rpm (30 000 g) για 1 ώρα σε κεφαλή Sorvall SA600 (4 C). Το υπερκείμενο (S-30) περιέχει τα ριβοσώματα και διαλυτά ένζυμα και υπερφυγοκεντρείται στα 25 000 rpm (70 000 g) για 19 ώρες σε κεφαλή Beckman 45Ti (4 C), ώστε να κατακρημνιστούν τα 70S ριβοσώματα. Το ίζημα αιωρείται σε Tico και φυγοκεντρείται στα 7 000 rpm (8 000 g) για 10 min σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4 C), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν αδιάλυτα συσσωματώματα. Στην περίπτωση που ακολουθεί ο διαχωρισμός των 70S ριβοσωμάτων στις υπομονάδες τους, το ίζημα αιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού αντί για Tico. Με τη διαδικασία αυτή απομονώνονται 250-300 Α 260 (OD) 70S ριβοσωμάτων ανά γραμμάριο κυττάρων, τα οποία ψύχονται με υγρό άζωτο και φυλάσσονται στους -80 C. 59

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.9. Διαχωρισμός 50S και 30S ριβοσωμικών υπομονάδων Ο διαχωρισμός των 70S ριβοσωμάτων στις υπομονάδες τους λαμβάνει χώρα κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Η σύσταση του διαλύματος φαίνεται παρακάτω: Ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού Hepes-KOH, ph 7.5 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 0.97 mm CH 3 COONH 4 200 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 4 mm Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με φυγοκέντρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού, γραμμικά αυξανόμενης συγκέντρωσης σε σουκρόζη (0 % - 40 %), που σχηματίζει ζώνες διαφορετικής πυκνότητας (sucrose density gradient centrifugation ή zonal centrifugation) (Eikenberry et al. 1970). Οι υπομονάδες διαχωρίζονται με βάση το συντελεστή καθίζησης S. Μεγαλύτερο S οδηγεί σε ζώνη μεγαλύτερης πυκνότητας και βρίσκεται προς το βάθος του σωλήνα φυγοκέντρησης. Για κάθε zonal φυγοκέντρηση χρησιμοποιούνται 5 000 Α 260 70S ριβοσωμάτων αιωρημένα σε ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού. Η φυγοκέντρηση γίνεται στα 24 000 rpm (55 000 g) για 17 ώρες σε κεφαλή zonal Beckman Ti15 (4 C). Μετά τη φυγοκέντρηση, οι ζώνες διαφορετικής πυκνότητας αντλούνται από την κεφαλή με υδατικό διάλυμα 50 % σε σουκρόζη. Από το προφίλ της απορρόφησης των ζωνών στα 270 nm μαζεύονται τα κλάσματα που αντιστοιχούν στις 50S και 30S υπομονάδες (Εικόνα Β.4). Οι 50S και 30S υπομονάδες κατακρημνίζονται με φυγοκέντρηση στα 35 000 rpm (140 000 g) για 20 ώρες σε κεφαλή Beckman 45Ti (4 C). Το ίζημα αιωρείται σε Tico και φυγοκεντρείται στα 7 000 rpm (8 000 g) για 10 min σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4 C), ώστε να απομακρυνθούν τυχόν αδιάλυτα συσσωματώματα. Με τη διαδικασία αυτή ξεκινώντας από 5 000 Α 260 70S ριβοσωμάτων απομονώνονται 1 000-1 500 Α 260 50S υπομονάδων και 300-500 Α 260 30S υπομονάδων, οι οποίες ψύχονται με υγρό άζωτο και φυλάσσονται στους -80 C. 60

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Εικόνα Β.4. Προφίλ απορρόφησης στα 270 nm των ζωνών διαφορετικής πυκνότητας μιας zonal φυγοκέντρησης ριβοσωμάτων κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Φαίνονται οι κορυφές των υπομονάδων 50S και 30S. Β.2.10. Απομόνωση ριβοσωμικών πρωτεϊνών από την 50S υπομονάδα Το σύνολο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών της 50S υπομονάδας (Total Protein 50S, TP50) απομονώνεται από 50S υπομονάδες με την παρακάτω διαδικασία (Nierhaus, K. H. 1990). 50S υπομονάδες αιωρούνται σε Tico σε μία συγκέντρωση 300 A 260 / ml. Προστίθενται 0.1 όγκοι (CH 3 COO) 2 Mg 1 M και 2 όγκοι οξικό οξύ 100 % και το διάλυμα ανεδεύεται για 45 min μέσα σε πάγο. Φυγοκέντρηση στα 8 000 rpm (10 000 g) για 30 min σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4 C). Το ίζημα είναι το rrna, το οποίο δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί παραπέρα. Στο υπερκείμενο, που περιέχει το TP50, προστίθενται 5 όγκοι κρύας ακετόνης και τοποθετείται στους -20 C για τουλάχιστο 3 ώρες, για να κατακρημνιστούν οι πρωτεΐνες. 61

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Φυγοκέντρηση στα 8 000 rpm (10 000 g) για 30 min σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4 C). Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα (ΤΡ50) παραμένει 15 min σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθεί η περίσσεια της ακετόνης. Το ίζημα αιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα Rec4 που περιέχει 6M ουρία σε συγκέντρωση 300 eu/ml, ώστε να αποδιαταχθούν πλήρως όλες οι πρωτεΐνες. 1 eu (equivalent unit) ΤΡ50 είναι η ποσότητα πρωτεϊνών που απομονώνονται από 1 Α 260 50S υπομονάδων. Η σύσταση του διαλύματος Rec4 δίνεται παρακάτω: Ρυθμιστικό διάλυμα Rec4 Hepes-KOH, ph 7.6 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 4 mm CH 3 COONH 4 400 mm EDTA 0.2 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 4 mm Ακολουθεί διαπίδυση έναντι 100 όγκων του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος (Rec4-6M ουρία) για όλο το βράδυ. Τρεις διαπιδύσεις για 45 min η καθεμία ενάντια σε 100 όγκους Rec4 χωρίς ουρία, ώστε να επαναδιπλωθούν οι πρωτεΐνες. Φυγοκέντρηση στα 4 000 rpm (5 000 g) για 5 min σε κεφαλή Sorvall ΗΒ4 (4 C). Μετράται η απορρόφηση στα 230 nm και υπολογίζονται τα eu του ΤΡ50. 1 Α 230 ΤΡ50 ισοδυναμεί με 10 eu. Ακολουθεί ψύξη και αποθήκευση στους -80 C. Β.2.11. Απομόνωση 23S + 5S rrna από την 50S υπομονάδα Η διαδικασία απομόνωσης του 23S + 5S rrna από 50S υπομονάδες γίνεται εξ ολοκλήρου στους 4 C σύμφωνα με τον Nierhaus με ορισμένες τροποποιήσεις (Nierhaus, K. H. 1990). 50S υπομονάδες αιωρούνται σε Tico σε μία συγκέντρωση 250 A 260 / ml. Προστίθενται 0.1 όγκοι SDS 10 % (w/v) και 1.2 όγκοι φαινόλη 70 % και το μίγμα αναδεύεται ισχυρά για 8 min (Vortex). Φυγοκέντρηση στα 12 000 rpm (10 000 g) για 5 min σε φυγόκεντρο eppendorf. Η υδατική φάση (πάνω φάση) μεταφέρεται προσεκτικά σε καινούριο σωλήνα μικροφυγοκέντρου (eppendorf), προστίθεται 1 όγκος μίγματος φαινόλης 70 % : χλωροφορμίου (1:1) και ακολουθεί ισχυρή ανάδευση για 5 min (Vortex). 62

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Φυγοκέντρηση στα 12 000 rpm (10 000 g) για 5 min σε φυγόκεντρο eppendorf. Η υδατική φάση (υπερκείμενη φάση) μεταφέρεται ξανά προσεκτικά, προστίθεται 1 όγκος χλωροφορμίου και ακολουθεί ισχυρή ανάδευση για 5 min (Vortex). Φυγοκέντρηση στα 12 000 rpm (10 000 g) για 5 min σε φυγόκεντρο eppendorf. Η υδατική φάση (υπερκείμενη φάση) μεταφέρεται ξανά προσεκτικά (σε αυτό στο στάδιο πρέπει να αποφευχθεί κάθε νόθευση με τη φαινολική φάση), προστίθενται 0.1 όγκοι 3Μ CH 3 COONa, ph 5.5 και 2.5 όγκοι κρύας αιθανόλης 100 % και τοποθετείται στους -80 C για 2 ώρες. Φυγοκέντρηση στα 12 000 rpm (10 000 g) για 45 min σε φυγόκεντρο eppendorf. Το ίζημα ξεπλένεται με κρύα αιθανόλη 70 % για να απομακρυνθούν τυχόν ίχνη φαινόλης και φυγοκεντρείται στα 12 000 rpm (10 000 g) για 30 min σε φυγόκεντρο eppendorf. Το ίζημα στεγνώνεται για 2 min υπό κενό (speed vac) και αιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΗΜ4 (4 ml ΗΜ4 για κάθε 1 000 Α 260 ). Η σύσταση του ΗΜ4 δίνεται παρακάτω: Ρυθμιστικό διάλυμα ΗΜ4 Hepes-KOH, ph 7.6 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 4 mm EDTA 0.2 mm Β.2.12. Ολική ανασυγκρότηση 50S υπομονάδας Η 50S υπομονάδα μπορεί να ανασυγκροτηθεί από τα συστατικά της με μία διαδικασία δύο σταδίων, όπου η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ και η θερμοκρασία επώασης αλλάζουν για το δεύτερο στάδιο (Nierhaus, K. H. 1990). Αναμιγνύοντας τις πρωτεΐνες της 50S υπομονάδας (ΤΡ50) με το 23S + 5S rrna και επωάζοντας στις συνθήκες των δύο σταδίων, το αποτέλεσμα είναι ένα σωματίδιο που περιέχει ένα αντίγραφο από κάθε συστατικό, με εξαίρεση την πρωτεΐνη L7/L12 που περιέχεται σε 4 αντίγραφα. Δεν είναι εκπληκτικό μόνο το γεγονός ότι επιτυγχάνεται η ανασυγκρότηση, ουσιαστικά από μόνη της, αλλά και ότι οι υπομονάδες που δημιουργούνται είναι σε μεγάλο ποσοστό ενεργές και λειτουργικές. Η διαδικασία των δύο σταδίων επιτρέπει ένα ξεκάθαρο διαχωρισμό μεταξύ των αντιδράσεων συγκρότησης που λαμβάνουν μέρος στην αρχή και αυτών που λαμβάνουν μέρος αργότερα, όπως είχε συζητηθεί στην παράγραφο Α.1.3. 63

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Στα πειράματα που διεξήχθησαν χρησιμοποιήθηκαν TP50 που τους έλειπε είτε η L24 είτε η L29 και οι εν λόγω πρωτεΐνες προστέθηκαν σημασμένες στο μίγμα εξωγενώς. Τα eu για τα ΤΡ50 υπολογίζονται μετρώντας απορρόφηση στα 230 nm και αντιστοιχώντας 1 Α 230 ΤΡ50 με 10 eu. Αντίθετα για μεμονωμένες πρωτεΐνες, όπως οι L24 και L29 η ποσότητα που προστίθεται στο μίγμα υπολογίζεται από τις y-τιμές (Εικόνα Β.5). Αν η y-τιμή για κάθε πρωτεΐνη διαιρεθεί με την τιμή της απορρόφησης στα 230 nm, για διάλυμα της πρωτεΐνης 1 ml (Α 230 / ml), το αποτέλεσμα δίνει τον όγκο σε μl του πρωτεϊνικού διαλύματος που περιέχει 3 eu της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Εικόνα Β.5. y-τιμές των ριβοσωμικών πρωτεϊνών της 50S υπομονάδας Η διαδικασία που ακολουθείται περιγράφεται παρακάτω: Στο 23S + 5S rrna, το οποίο βρίσκεται σε ρυθμιστικό διάλυμα ΗΜ4 προστίθενται 0.1 όγκοι ρυθμιστικού διαλύματος HR50, ώστε να μετατραπεί σε Rec4. Η σύσταση του HR50 δίνεται παρακάτω: Ρυθμιστικό διάλυμα HR50 Hepes-KOH, ph 7.6 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 4 mm CH 3 COONH 4 4.4 M EDTA 0.2 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 44 mm Αναμιγνύονται τα ΤΡ50, η πρωτεΐνη L24 ή L29 και το 23S + 5S rrna. Ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τα 15μl με ρυθμιστικό διάλυμα Rec4. 10 min στον πάγο. 64

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Επώαση 30 min στους 44 C (πρώτο στάδιο). Προστίθεται 1 μl (CH 3 COO) 2 Mg 260 mm, ώστε να αυξηθεί η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ από 4 mm σε 20 mm. Το ρυθμιστικό διάλυμα μετατρέπεται κατά αυτόν τον τρόπο από Rec4 σε Rec20. Επώαση 90 min στους 50 C (δεύτερο στάδιο). Ο έλεγχος της ενεργότητας των 50S υπομονάδων που ανασυγκροτούνται με αυτή τη διαδικασία γίνεται με σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. Β.2.13. Επανασύνδεση ριβοσωμικών υπομονάδων Για την παρασκευή 70S ριβοσωμάτων από τις υπομονάδες τους, γίνεται επώαση των 50S και 30S υπομονάδων, σε αναλογία Α 260 1:1.5 και σε ρυθμιστικό διάλυμα επανασύνδεσης στους 40 C για 60 min. Η συγκέντρωση κατά τη διάρκεια της αντίδρασης πρέπει να είναι 40-140 A 260 /ml. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος επανασύνδεσης δίνεται παρακάτω (Blaha et al. 2002). Ρυθμιστικό διάλυμα επανασύνδεσης Hepes-KOH, ph 7.5 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 20 mm CH 3 COOΚ 30 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 4 mm Αν οι υπομονάδες πριν την αντίδραση είναι αιωρημένες σε Tico, τότε απλά προσαρμόζεται η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ από 6 mm στα 20 mm. Τα ιόντα K + και ΝΗ + 4 θεωρούνται ίδια, καθώς έχουν περίπου το ίδιο μέγεθος. Η περίσσεια σε 30S υπομονάδες είναι απαραίτητη, ώστε να μειωθεί η ποσότητα των ελεύθερων 50S υπομονάδων και να βελτιωθεί ο διαχωρισμός μεταξύ 70S και 50S κατά την φυγοκέντρηση με γραμμικά αυξανόμενη συγκέντρωση σουκρόζης (10 % - 30 %), που ακολουθεί. Η φυγοκέντρηση γίνεται σε ρυθμιστικό διάλυμα επανασύνδεσης για 24 ώρες στα 15 000 rpm (40 000 g) σε κεφαλή Beckman SW28 (4 C). Από το προφίλ της απορρόφησης των ζωνών στα 260 nm συλλέγονται τα κλάσματα που αντιστοιχούν στα 70S ριβοσώματα (Εικόνα Β.6). 65

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Εικόνα Β.6. Προφίλ απορρόφησης στα 260 nm των ζωνών διαφορετικής πυκνότητας φυγοκέντρησης έπειτα από επώαση των ριβοσωμικών υπομονάδων σε συνθήκες επανασύνδεσης. Φαίνεται η κορυφή των 70S ριβοσωμάτων που δημιουργήθηκαν από την επανασύνδεση των υπομονάδων, καθώς και οι κορυφές των 50S και 30S υπομονάδων που δεν αντέδρασαν. Τα 70S ριβοσώματα κατακρημνίζονται με φυγοκέντρηση για 24 ώρες στα 24 000 rpm (65 000 g) σε κεφαλή Beckman 45Ti (4 C). Μεγαλύτερες ταχύτητες φυγοκέντρησης δεν συνιστώνται, καθώς μπορεί να οδηγήσουν σε διαχωρισμό των υπομονάδων. Το ίζημα αιωρείται σε Tico και μετριέται η απορρόφηση στα 260 nm. Η ενεργότητα των 70S ριβοσωμάτων ελέγχεται με σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. Β.2.14. Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης Ένας τρόπος ελέγχου της ενεργότητας των ριβοσωμάτων αποτελεί η ικανότητά τους να συνθέτουν πολυφαινυλαλανίνη. Η διαδικασία με κάποιες, όμως, τροποποιήσεις περιγράφεται από τους Bartetzko και Nierhaus (Bartetzko and Nierhaus 1988)και από τους Rheinberger και Nierhaus (Rheinberger and Nierhaus 1990). Παρασκευή μίγματος με όλα τα απαραίτητα συστατικά για την σύνθεση της πολυφαινυλαλανίνης από τα ριβοσώματα. Ως υπόστρωμα (mrna) χρησιμοποιείται πολυουριδυλικό οξύ (poly (U)). Tο εκχύλισμα S100 περιέχει όλους τους απαραίτητους παράγοντες της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η σύσταση του μίγματος φαίνεται παρακάτω: 66

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Μίγμα απαραίτητων συστατικών για σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης Hepes-KOH, ph 7.6 20 mm (CH 3 COO) 2 Mg 4.5 mm CH 3 COOΝΗ 4 150 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 4 mm Σπερμιδίνη 2 mm Σπερμίνη 0.05 mm ATP 3 mm GTP 1.5 mm Ακετυλοφωσφορικό 5 mm Phe 83 μμ [ 14 C] Phe 10 dpm/pmol Phe Poly (U) 40 μg / 0.2 Α 260 ριβοσωμάτων trna bulk 40 μg / 0.2 Α 260 ριβοσωμάτων S100 1 12 του τελικού όγκου Προσθήκη 0.2 Α 260 (5-6 pmoles) των 70S ριβοσωμάτων που ελέγχονται για την ενεργότητά τους. Αν ελέγχονται 50S υπομονάδες, τότε στο παραπάνω μίγμα προστίθενται, επίσης, 30S υπομονάδες σε διπλάσια αναλογία (10-12 pmoles). Επώαση για 1 ώρα στους 37 C. Κατακρήμνιση πολυφαινυλαλανίνης με 2 ml TCA 5% και 2 σταγόνες BSA 1% για να βοηθηθεί η κατακρήμνιση. Καταστροφή των νουκλεϊνικών οξέων με επώαση στους 90 C για 15 min. Ψύξη στον πάγο. Διήθηση μέσω φίλτρων γυάλινων ινών (glass filters 0.23 mm). Τρεις πλύσεις με 2 ml TCA 5% και στέγνωμα με μία πλύση με 2 ml αιθέρα/αιθανόλη (1:1). Τοποθέτηση φίλτρων σε πλαστικά φιαλίδια σπινθηριστή και προσθήκη 4 ml υγρού σπινθηριστή. Μέτρηση της ραδιενέργειας στον σπινθηριστή (Rack Beta model 1219 της LKB Pharmacia). Με αυτόν τον τρόπο γίνεται προσδιορισμός των pmoles [ 14 C] Phe που ενσωματώθηκαν ανά pmole ριβοσωμάτων. 67

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.15. Σήμανση μορίων με φθορισμοφόρο Β.2.15.1. Σήμανση πρωτεϊνών Τα φθορισμοφόρα είναι μόρια που αλληλεπιδρούν ομοιοπολικά με συγκεκριμένα αμινοξικά υπόλοιπα και δίνουν τη δυνατότητα της παρακολούθησης των σημασμένων πρωτεϊνών με φθορισμόμετρα. Με αυτόν τον τρόπο εξετάζεται η δομή, η λειτουργία και οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών. Τα φθορισμοφόρα είναι συζευγμένα με ομάδες, οι οποίες αντιδρούν είτε με τις αμινομάδες (-ΝΗ 2 ) είτε με τις θειόλες (σουλφυδρυλομάδες, -SH) των προς σήμανση πρωτεϊνών. Επειδή οι θειόλες δεν είναι πολύ συνηθισμένες στις πρωτεΐνες, η σήμανση γίνεται εκλεκτικά και σε συγκεκριμένη θέση. Στις πρωτεΐνες οι θειόλες είναι παρούσες στο αμινοξύ κυστεΐνη. Μπορούν, επίσης, να δημιουργηθούν με αναγωγή δισουλφιδικών δεσμών με αντιδραστήρια, όπως η διθειοθρεΐτόλη (DTT) ή η β-μερκαπτοαιθανόλη. Αυτά τα αντιδραστήρια έχουν, όμως, το μειονέκτημα ότι πρέπει να απομακρυνθούν πριν την αντίδραση με το φθορισμοφόρο, πράγμα που πολλές φορές οδηγεί σε οξείδωση προς επανασχηματισμό των δισουλφιδικών δεσμών. Η πιο διαδεδομένη και χρησιμοποιούμενη ομάδα, που αντιδρά με τις θειόλες, είναι το μαλεϊμίδιο. Η θειόλη συνδέεται με τον διπλό δεσμό του μαλεϊμιδίου προς σχηματισμό ενός σταθερού θειο-αιθερικού δεσμού (Εικόνα Β.7). Έτσι, φθορισμοφόρα που είναι συνδεδεμένα με μαλεϊμίδιο μπορούν να σημάνουν πρωτεΐνες που περιέχουν κυστεΐνες. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε ουδέτερο ph (μεταξύ 7 και 8). Έτσι, επειδή οι αμινομάδες δεν είναι ενεργές σε αυτό το εύρος ph, οι θειόλες μπορούν να σημανθούν εκλεκτικά παρουσία αμινομάδων. Εικόνα Β.7. Αντίδραση μαλεϊμιδίου με θειόλη προς σχηματισμό σταθερού ομοιοπολικού δεσμού. Β.2.15.2. Σήμανση ριβοσωμάτων Τα ριβοσώματα, όπως έχει ήδη αναφερθεί, αποτελούνται κατά το ⅓ της μάζας τους από πρωτεΐνες. Μπορεί, λοιπόν, να γίνει χρήση αυτών των πρωτεϊνών για να 68

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ σημανθεί το ριβόσωμα με φθορισμοφόρο, σε θέσεις όπου υπάρχουν κυστεΐνες. Η σήμανση φυσικά είναι μη-ειδική, καθώς δεν είναι δυνατό να προσδιοριστεί ποιες κυστεΐνες σημαίνονται και ποιες όχι. Η διαδικασία που ακολουθείται για να επιτευχθεί η σήμανση φαίνεται παρακάτω: Ριβοσώματα γνωστής συγκέντρωσης είναι διαλυμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico ph 7-8. Σε αυτό το εύρος ph, οι θειόλες είναι αρκετά πυρηνόφιλες και αντιδρούν σχεδόν αποκλειστικά με το μαλεϊμίδιο. Το ρυθμιστικό διάλυμα Tico δεν περιέχει β-μερκαπτοαιθανόλη, καθώς αντιδρά επίσης με το μαλεϊμίδιο και μειώνει την απόδοση της σήμανσης. Προστίθεται φθορισμοφόρο συζευγμένο με μαλεϊμίδιο σε 5x περίσσεια. Αφήνονται να αντιδράσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες ή στους 4 C για 12-16 ώρες (η αντίδραση πρέπει να προστατεύεται από το φως με χρήση αλουμινόχαρτου). Η περίσσεια του φθορισμοφόρου απομακρύνεται με στήλη μοριακής διήθησης (εξισορροπημένη με το ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης) ή με διαπίδυση. B.2.16. Πρόσδεση λαβών DNA σε χάντρες Για τη μελέτη μεμονωμένων μορίων με οπτικές λαβίδες, τα προς εξέταση μόρια προσδένονται σε μία χάντρα, η οποία συγκρατείται με ένα μικροσιφώνιο. Μία δεύτερη χάντρα, η οποία παγιδεύεται στις οπτικές λαβίδες, αλληλεπιδρά με τα μεμονωμένα μόρια και καταγράφονται οι δυνάμεις που ασκούνται λόγω της αλληλεπίδρασης. Ένα βασικό πρόβλημα είναι οι μη ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο χαντρών, που έρχονται σε εγγύτητα. Αυτό αντιμετωπίζεται με την πρόσδεση μορίων DNA, με κατάλληλα τροποποιημένα άκρα, στην χάντρα που παγιδεύεται από τις οπτικές λαβίδες. Τα μόρια DNA παίζουν το ρόλο λαβών, που αλληλεπιδρούν με τα μεμονωμένα μόρια ειδικά και περιορίζουν τις μη ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των χαντρών, οι οποίες δεν πλησιάζουν πλέον τόσο πολύ. Η διαδικασία δημιουργίας και πρόσδεσης των DNA λαβών σε χάντρες πολυστυρενίου φαίνεται παρακάτω (Hegner, Martin 2000; Husale et al. 2002). Με εκμαγείο το πλασμίδιο ptyb1 της New England Biolabs και δύο εκκινητές, όπου ο ένας φέρει μία σουλφιδρυλομάδα (-SH) και ο άλλος μία βιοτίνη στα 5 -άκρα τους, γίνεται PCR (Παράγραφος Β.3.1) και παράγεται δίκλωνο DNA μήκους 1.3 μm (4000 bp). Οι εκκινητές φαίνονται παρακάτω: 69

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Άνω εκκινητής (Upper Primer, UP) με SH στο 5 άκρο 5 TGT AAC TCG CCT TGA TCG TTG GGA 3 Kάτω εκκινητής (Lower Primer, LP) με βιοτίνη στο 5 άκρο 5 AAT TCT TGA AGA CGA AAG GGC GGC 3 Οι συνθήκες της PCR δίνονται παρακάτω: Συνθήκες PCR 94 C 2 min Προσθήκη DNA πολυμεράσης 94 C 1 min 58 C 2 min 25 κύκλοι 72 C 3.5 min 72 C 7 min 4 C άπειρο Το προϊόν της PCR καθαρίζεται και οι DNA λαβές προσδένονται σε χάντρες πολυστυρενίου με αμινομάδες στην επιφάνειά τους (-ΝΗ 2 ) με την παρακάτω διαδικασία: Καταβύθιση 10 μl χαντρών (360 μμ αμινομάδων) με φυγοκέντρηση και απομάκρυνση υπερκείμενου. Τρεις φορές προσθήκη 100 μl 20mM Hepes, ph 7.5 και καταβύθιση χαντρών με φυγοκέντρηση και απομάκρυνση υπερκείμενου. Διάλυση 3 mg Sulfo-SMCC (Sulfo-Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate) σε 20 mm Hepes, ph 7.5, για τελική συγκέντρωση 16 mm. Το Sulfo-SMCC λειτουργεί ως γέφυρα μεταξύ της χάντρας και των λαβών DNA (Εικόνα Β.8). Προσθήκη χαντρών (12 μμ αμινομάδων) στο διάλυμα Sulfo-SMCC (16 mm) (αμινομάδες : Sulfo-SMCC, 1 : 1000). Ανάδευση για 45 min και καταβύθιση χαντρών με φυγοκέντρηση και απομάκρυνση υπερκείμενου. Δέκα φορές προσθήκη 1 mm παγωμένου MES, ph 6 και καταβύθιση χαντρών με φυγοκέντρηση και απομάκρυνση υπερκείμενου. Προσθήκη DNA (καθαρό μετά την PCR) στις χάντρες (χάντρες : DNA, 1 : 3000) σε τελικό όγκο 20 μl. 70

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Εικόνα Β.8. Πρόσδεση λαβών DNA με βιοτίνη στο ελεύθερο άκρο τους σε χάντρες πολυστυρενίου. Το Sulfo-SMCC λειτουργεί ως γέφυρα. Ενώνεται με τις αμινομάδες της χάντρας μέσω του σουκινιμιδίου και με τις σουλφιδρυλομάδες του DNA μέσω του μαλεϊμιδίου (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldid=02030378). Προσθήκη 3.3 μl ρυθμιστικού διαλύματος 7x και ανάδευση για 2 ώρες. Αποθήκευση στους 4 C. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος φαίνεται παρακάτω. Οι συγκεντρώσεις είναι οι τελικές στο διάλυμα (1x). To TCEP (Tris(2-CarboxyEthyl) Phosphine) είναι ισχυρό αναγωγικό και χρησιμοποιείται για αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών. Ρυθμιστικό διάλυμα (1x) NaCl 0.5 Μ Hepes, ph 7 10 mm EDTA 0.7 mm TCEP 10 nm Β.2.17. Επεξεργασία επιφανειών για ειδική πρόσδεση μορίων Σε πειράματα μεμονωμένων μορίων είναι πολλές φορές επιθυμητή η πρόσδεση των μορίων σε επιφάνειες για την εκτενή μελέτη τους σε βάθος χρόνου. Για να επιτευχθεί ειδική πρόσδεση πρωτεϊνών, οι επιφάνειες πρέπει να τροποποιηθούν με χημικό τρόπο, ώστε να επιτυγχάνεται ειδική αναγνώριση και συγχρόνως να αποφεύγεται η μη-ειδική προσρόφηση των πρωτεϊνών. Η διαδικασία ακολουθείται 71

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ σύμφωνα με τον Groll et al. (Groll et al. 2004) με κάποιες τροποποιήσεις και περιγράφεται παρακάτω: Οι, προς τροποποίηση, επιφάνειες είναι γυαλάκια μικροσκοπίου, πάχους 0.13 0.16 mm (Menzel-Gläser, Braunschweig, Germany). Καθαρισμός των γυαλιών μικροσκοπίου με έκθεση σε πλάσμα για 10 min. Για τη δημιουργία πλάσματος χρησιμοποιείται ο PDC-32G plasma cleaner (Harrick Plasma, Ithaca, NY, USA). Εμβάπτιση 5 min σε ακετόνη και άλλα 5 min στο αμινοσιλάνιο Vectabond (7 ml αντιδραστηρίου σε 350 ml ακετόνη). Η αμινοσιλανοποίηση εισάγει αμινομάδες στην επιφάνεια του γυαλιού. Πλύση της επιφάνειας με διαδοχικές εμβαπτίσεις σε απιονισμένο νερό. Ετοιμασία μίγματος 50 mg/ml πολυαιθυλενογλυκόλης (PolyEthyleneGlycol, PEG) (mpeg-spa, MW 5 000) και 5 ng/ml βιοτινυλιωμένης PEG (biotin-peg-nhs, MW 3 400) σε 50 mm Na 2 CO 3 (αναλογία 1:10 7 ). Η PEG, όπου σε ένα πολύ μικρό ποσοστό είναι βιοτινυλιωμένη, όπως φαίνεται παραπάνω, είναι συζευγμένη με τον N-υδροξυεστέρα του σουκινιμιδίου (N-HydroxySuccinimidyl ester, NHS-ester). Ο εστέρας αυτός αντιδρά με αμινομάδες προς σχηματισμό ομοιοπολικού δεσμού. Το παραπάνω μίγμα PEG και βιοτινυλιωμένου PEG απλώνεται πάνω στην επιφάνεια και αφήνεται να αντιδράσει με τις αμινομάδες της επιφάνειας για 3 ώρες στο σκοτάδι, σε θ.δ. Πλύση της επιφάνειας με διαδοχικές εμβαπτίσεις σε απιονισμένο νερό, ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια του μίγματος. Στέγνωμα της επιφάνειας για 1 ώρα στους 37 C. Σε αυτό το στάδιο τα τροποποιημένα γυαλιά μικροσκοπίου μπορούν να αποθηκευτούν μέσα σε γυάλινα τρυβλία στους 4 C. Προσθήκη στρεπταβιδίνης 2 μg/ml σε 50 mm Na 2 CO 3 για 10 min. Η στρεπταβιδίνη διαθέτει τέσσερις θέσεις δέσμευσης για βιοτίνη. Έτσι, δεσμεύεται στην βιοτίνη της επιφάνειας αλλά συνεχίζει να διαθέτει ελεύθερες θέσεις δέσμευσης. Σε αυτές τις θέσεις μπορούν να δεσμευτούν, πολύ ειδικά και με τον ίδιο προσανατολισμό, πρωτεΐνες βιοτινυλιωμένες σε μία συγκεκριμένη θέση. 72

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Β.2.18. Συζευγμένη μεταγραφή-μετάφραση σε σύστημα ελεύθερο κυττάρων Ενώ στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς οι δύο διαδικασίες της μεταγραφής και της μετάφρασης μελετώνται ξεχωριστά, στους προκαρυωτικούς οργανισμούς συνήθως μελετώνται μαζί. Αυτό οφείλεται σε δύο λόγους: στη δυσκολία απομόνωσης βακτηριακού mrna λόγω του πολύ μικρού χρόνου ημιζωής του και στο γεγονός ότι η μετάφραση του βακτηριακού mrna αρχίζει ενώ η μεταγραφή ακόμη λαμβάνει χώρα (δηλαδή η μεταγραφή και η μετάφραση είναι στενά συζευγμένες). Για αυτό τον λόγο χρησιμοποιείται DNA κατευθυνόμενη πρωτεϊνική σύνθεση σε ένα σύστημα ελεύθερο κυττάρων (cell-free system) (Herrlich and Schweiger 1974; Shimizu et al. 2001). Ως σύστημα ελεύθερο κυττάρων αναφέρεται το εκχύλισμα S-30 (βλέπε παράγραφο Β.2.8), το οποίο περιέχει τα ριβοσώματα καθώς κι όλους τους απαραίτητους παράγοντες της μεταγραφής και της μετάφρασης. Στην περίπτωση που είναι επιθυμητή η χρήση τροποποιημένων ριβοσωμάτων, το εκχύλισμα S-30 διαχωρίζεται περαιτέρω στα συστατικά του (fractionated system) (Εικόνα Β.9), ώστε να προστίθενται τα ριβοσώματα εξωγενώς (Erdmann et al. 1994). Εικόνα Β.9. Σύστημα ελεύθερο κυττάρων διαχωρισμένο στα συστατικά του (fractionated system). 73

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Το σύστημα αυτό τροφοδοτείται με ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (DNA) στο οποίο το μεταγραφόμενο γονίδιο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του Τ7 προαγωγού. Η μεταγραφή γίνεται με την προσθήκη της Τ7 RNA πολυμεράσης ενώ η ενδογενής πολυμεράση καταστέλεται με την προσθήκη του αντιβιοτικού ριφαμπικίνη. Το πλήρες μίγμα για την συζευγμένη μεταγραφή-μετάφραση δίνεται παρακάτω: Μίγμα για συζευγμένη μεταγραφή-μετάφραση Hepes-KOH, ph 7.6 50 mm CH 3 COOΚ 70 mm (CH 3 COO) 2 Mg 5 mm Ρυθμιστικό διάλυμα CH 3 COOΝΗ 4 30 mm ΕDTA 0.1 mm DTT 5 mm PEG 3000 4 % w/v NaN 3 0.02 % w/v Φολικό οξύ 0.1 mm Αμινοξέα 0.35 mm Αναστολέας RNAσης 0.1 U/μl Απροτινίνη 10 μg/ml Λευπεπτίνη 5 μg/ml Αναστολείς πρωτεϊνασών Πεπστατίνη 5 μg/ml Κινάση του πυροσταφυλικού 0.008 mg/ml ATP 1 mm GTP 0.5 mm UTP 0.5 mm Ενεργειακό μίγμα CTP 1 mm Φωσφοενολπυροσταφυλικό 10 mm Ακετυλοφωσφορικό 10 mm S100 (ενζυμικοί παράγοντες) 1.6 mg/ml trna bulk T7 RNA πολυμεράση Ριφαμπικίνη Πλασμίδιο 70S ριβοσώματα 0.5 mg/ml 0.5 U/ml 0.02 mg/ml 5.5 nm 1 μμ 74

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΒΙΟΦΥΣΙΚΗΣ Το μίγμα της αντίδρασης επωάζεται στους 37 C με ανακίνηση για 1 ώρα. Ένας τρόπος ανίχνευσης της πρωτεΐνης που συντίθεται είναι με αυτοραδιογραφία. Σε αυτή την περίπτωση συνήθως προστίθεται ραδιενεργή λευκίνη ( 14 C-Leu) στο μίγμα της αντίδρασης. Ένας δεύτερος τρόπος είναι με χρήση αντισωμάτων (βλέπε παράγραφο Β.2.7). Τέλος, η πρωτεΐνη μπορεί να ανιχνευθεί λόγω φθορισμού, αν σημανθεί με κάποιο φθορισμοφόρο κατά την σύνθεσή της. Β.2.19. Τεχνική του κατασταλτικού trna Τα 20 αμινοξέα συνδέονται ενζυμικά με τα αντίστοιχα trnas (trnas που αναγνωρίζουν το κωδικόνιο του συγκεκριμένου αμινοξέος), με τη βοήθεια των αμινοάκυλο-trna συνθετασών. Οι συνθετάσες αυτές, επιπλέον αναγνωρίζουν τυχόν λανθασμένες συνδέσεις και υδρολύουν το δεσμό μεταξύ αμινοξέος και trna. Ο μηχανισμός αυτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ενσωμάτωση μη φυσικών αμινοξέων σε πρωτεΐνες κατά την διάρκεια της σύνθεσής τους, σε ένα in vitro σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης (Sakamoto et al. 2002; Kobayashi et al. 2005). Σε αυτή την περίπτωση το αντικωδικόνιο του trna Lys τροποποιείται με μετάλλαξη, ώστε να αναγνωρίζει το κωδικόνιο τερματισμού UAG (amber stop codon), το οποίο εισάγεται επίσης με μετάλλαξη στο γονίδιο της πρωτεΐνης, στη θέση που είναι επιθυμητή η ενσωμάτωση του μη φυσικού αμινοξέος. Το γονίδιο του trna Lys εκφράζεται χωρίς το 3 τελικό άκρο CA. Το δινουκλεοτίδιο με μία δεοξυκυτιδίνη και μία αδενοσίνη pdcda αμινοακυλιώνεται με την τροποποιημένη λυσίνη (λυσίνη ενωμένη χημικά με βιοτίνη ή με φθορισμοφόρο), με τη βοήθεια της λυσίνυλο-trna συνθετάσης. Έπειτα το αμινοακυλιωμένο δινουκλεοτίδιο ενώνεται με το trna Lys με το ένζυμο Τ4 RNA λιγάση. Για τα E.coli το ζεύγος trna Lys και λυσίνυλο-trna συνθετάση προέρχονται από ζύμες. Έτσι, η μεν συνθετάση δεν αναγνωρίζει και δεν ενσωματώνει την τροποποιημένη λυσίνη στα trna Lys του E.coli το δε trna Lys δεν αναγνωρίζεται από τις συνθετάσες του E.coli και δεν υδρολύεται ο δεσμός του με την τροποποιημένη λυσίνη (Hendrickson et al. 2004) (Εικόνα Β.10). Κατά την μετάφραση του mrna, το κωδικόνιο τερματισμού UAG αναγνωρίζεται από το trna Lys που μεταφέρει την τροποποιημένη λυσίνη, η οποία ενσωματώνεται στην αλυσίδα της πρωτεΐνης που συντίθεται. Το ριβόσωμα αναγνωρίζει μόνο αλληλεπιδράσεις μεταξύ κωδικονίου και αντικωδικονίου, οι οποίες 75

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ είναι ανεξάρτητες από το αμινοξύ που μεταφέρει το trna. Με αυτόν τον τρόπο παράγονται πρωτεΐνες, οι οποίες σε μία συγκεκριμένη θέση είναι βιοτινυλιωμένες ή φέρουν ένα φθορισμοφόρο. Εικόνα Β.10. Τεχνική του κατασταλτικού trna. Αριστερά φαίνεται το trna με το μη φυσικό αμινοξύ προσδεμένο και το αντικωδικόνιο που αναγνωρίζει το κωδικόνιο τερματισμού amber (Ellman et al. 1991). Β.3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Β.3.1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Επίσης, χρησιμοποιείται για την εισαγωγή μεταλλάξεων, καθώς και για την ραδιοεπισήμανση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειμένου να πραγματοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση, (sequencing). Η τεχνική αυτή μπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, διαδικασία που γίνεται στα κύτταρα, αφού το αποτέλεσμα είναι το ίδιο, η παραγωγή δηλαδή συμπληρωματικών κλώνων DNA από κάποιον ήδη υπάρχοντα κλώνο. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοάντοχης DNA 76

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ πολυμεράσης, η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία είναι συμπληρωματικά μιας περιοχής της επιθυμητής ακολουθίας. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 90 C-98 C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Στάδιο 2 ο : Υβριδισμός Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους 50 C - 75 C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Όσο υψηλότερη είναι η θερμοκρασία τόσο μειωμένη είναι η πιθανότητα λανθασμένων υβριδισμών. Οι εκκινητές επιλέγονται έτσι ώστε να περικλείουν το τμήμα του DNA, του οποίου ο πολλαπλασιασμός είναι επιθυμητός και μπορούν να σχεδιαστούν ώστε στα άκρα τους να περιέχουν θέσεις αναγνώρισης από ενδονουκλεάσες περιορισμού, με σκοπό την κλωνοποίηση του συντιθέμενου τμήματος του DNA σε ένα πλασμίδιο. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 ο : Πολυμερισμός Το στάδιο αυτό γίνεται σε θερμοκρασία περίπου 72 C. Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DNA. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των σταδίων. 77

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Τα τρία αυτά στάδια επαναλαμβάνονται για n κύκλους και παράγονται 2 n μόρια DNA, που έχουν ως άκρα τους δύο εκκινητές. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 C για 5 min, ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός. Το μίγμα της αντίδρασης φαίνεται παρακάτω: Μίγμα αντίδρασης PCR (50μl) DNΑ εκμαγείο 2-10 ng Εκκινητής 5 100 pmoles Εκκινητής 3 100 pmoles Μίγμα dntps 200 μm Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 5x 1x DNΑ πολυμεράση (Phusion) 1 unit Η DNA πολυμεράση Phusion συνθέτει DNA με μεγάλη ακρίβεια και μεγάλη ταχύτητα. Για αυτό το λόγο, ο χρόνος κάθε σταδίου είναι αρκετά σύντομος. Ο υβριδισμός και ο πολυμερισμός πραγματοποιούνται στην ίδια θερμοκρασία, οπότε στην ουσία αποτελούν ένα στάδιο. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR περιγράφονται παρακάτω: Συνθήκες PCR 98 C 30 s Προσθήκη DNA πολυμεράσης Phusion 98 C 10 s 45 κύκλοι 72 C 30 s 72 C 5 min 4 C άπειρο Β.3.2. Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR Μετά από το τέλος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) ή μετά από πέψη με ένζυμα περιορισμού, το τμήμα του DNA που έχει υποστεί την κατεργασία πρέπει να διαχωριστεί από τους εκκινητές, τα νουκλεοτίδια, τα άλατα και την πολυμεράση για να χρησιμοποιηθεί, καθαρό πλέον, σε άλλες αντιδράσεις. Αυτό γίνεται με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της Qiagen. Η διαδικασία έχει ως εξής: Προσθήκη 5 όγκων διαλύματος ΡΒ, που περιέχει κάποιο χαοτροπικό παράγοντα, στο PCR προϊόν και ανάμιξη. 78

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διαβίβαση διαλύματος από μία στήλη Qiaquick. Φυγοκέντρηση για 1 min στα 13 000 g, ώστε να συγκρατηθεί το DNA στη στήλη και να διέλθουν τα υπόλοιπα συστατικά. Πλύση της στήλης με αιθανολικό διάλυμα ΡΕ (0.1 Μ NaCl, 10 mm Tris-HCl, 1mM EDTA, ph 7.5). Φυγοκέντρηση για 1 min στα 13 000 g. Έκλουση του DNA με 30 μl αποστειρωμένου νερού ή ενός ελαφρώς βασικού διαλύματος AE (5 mm Tris-HCl, ph 8.5). Με αυτό τον τρόπο παραλαμβάνεται καθαρό πλέον το DNA (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 2002). Β.3.3. Ηλεκτροφόρηση DNA και RNA σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση DNA και RNA σε πηκτή αγαρόζης βασίζεται στην μετακίνηση των αρνητικά φορτισμένων μορίων προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων εξαρτάται από το μέγεθός τους (για γραμμικά δίκλωνα μόρια η ταχύτητα είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεών τους), από τη διαμόρφωσή τους (υπερελικωμένα, κυκλικά ή γραμμικά), τη συγκέντρωση της αγαρόζης, το δυναμικό που εφαρμόζεται, καθώς επίσης και από τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιείται. Η αγαρόζη είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού μοριακού μεγέθους. Πρόκειται για ένα γραμμικό πολυμερές, με βασική μονάδα την D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-Lγαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται με θέρμανση, παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης TAE. Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης από 1-2 % w/v και τα εξής διαλύματα: Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης TAE Tris-acetate 40 mm EDTA, ph 8.0 2.5 mm Διάλυμα δειγμάτων για DNA Σουκρόζη 5 % w/v Kυανούν της βρωμοφαινόλης 0.025 % w/v 79

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διάλυμα δειγμάτων για RNA Φορμαμίδιο 95 % v/v SDS 0.025 % w/v Kυανούν της βρωμοφαινόλης 0.025 % w/v Kυανούν του ξυλενίου 0.025 % w/v Βρωμιούχο αιθίδιο 0.025 % w/v ΕDTA 0.5 mm Αρχικά, γίνεται διάλυση της αγαρόζης στο ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ με θέρμανση στους 100 C, ακολουθεί ελάττωση της θερμοκρασίας, (μέχρι τους 60 C περίπου), προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου, (EtBr), σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml και απόχυση στην ειδική συσκευή. Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης είναι το ΤΑΕ. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA ή του RNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 nm και στα 366 nm και να την επανεκπέμπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσματος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA ή RNA και είναι δυνατή η ανίχνευση μικρών ποσοτήτων DNA ή RNA. Β.3.4. Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης Η μέθοδος χρησιμοποιείται για καθαρισμό του DNA έπειτα από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού ή έπειτα από PCR. Χρησιμοποιείται το σύστημα καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen. Αυτό περιέχει μικρές στήλες με μεμβράνη από silica gel στην οποία δεσμεύεται το DNA ενώ οι προσμίξεις διέρχονται από τη στήλη. Η διαδικασία έχει ως εξής: Εντοπισμός της ζώνης του DNA που πρόκειται να εκχυλιστεί από την πηκτή της αγαρόζης, προσεκτική κοπή και τοποθέτηση σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης (eppendorf). Προσθήκη 700 ml διαλύματος QX1, που είναι το διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης και θέρμανση στους 50 ο C για πλήρη διάλυση της αγαρόζης. Διαβίβαση του διαλύματος σε στήλη Qiaquick και δέσμευση του DNA με φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 1 min σε επιτραπέζια φυγόκεντρο. Πλύση της στήλης ξανά με 700 ml διαλύματος QX1 για απομάκρυνση των τελευταίων ιχνών αγαρόζης. 80

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Πλύση της στήλης δύο φορές με 700 ml αιθανολικού διαλύματος ΡΕ (0.1 Μ NaCl, 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 7.5). Έκλουση του DNA με διάλυμα ΑΕ (5 mm Tris-HCl, ph 8.5). Έπειτα από αυτή τη μέθοδο το DNA παραλαμβάνεται σε καθαρή μορφή. Η ανάκτηση της μεθόδου φτάνει το 80 % και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τμήματα DNA από 100 bp έως 10 kb (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 2002). Β.3.5. Προσδιορισμός συγκέντρωσης DNA και RNA Β.3.5.1. Φασματοφωτομετρική μέθοδος Ο φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA ή του RNA σε υδατικά τους διαλύματα στηρίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος με μέγιστο στα 260 nm. Απορρόφηση στα 260 nm ίση με 1 (Α 260 = 1) αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 50 μg/ml δίκλωνου DNA, σε 40 μg/ml μονόκλωνου DNA και RNA και σε ~ 20 μg/ml μονόκλωνων ολιγουνουκλεοτιδίων. Ο έλεγχος της καθαρότητας του διαλύματος των νουκλεϊνικών οξέων δίνεται από τον λόγο Α 260 /Α 280. Για καθαρά διαλύματα DNA και RNA (χωρίς προσμίξεις από πρωτεΐνες ή φαινόλη) ο λόγος αυτός είναι 1.8 και 2, αντίστοιχα (Sambrook et al. 1989). Β.3.6. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Κατά την κλωνοποίηση, γίνεται εισαγωγή ενός τμήματος DNA στο γονιδίωμα ενός αυτόνομα πολλαπλασιαζόμενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασμιδίου. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι μικρά κυκλικά μόρια δίκλωνου DNA, που μπορούν να αναπτύσσονται αυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασμιδιακός φορέας, όσο και το ξένο τμήμα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν, επωάζονται με τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισμού και στη συνέχεια, επανακυκλοποιούνται συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, αντίδραση που καταλύεται από μια DNA λιγάση. 81

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Β.3.6.1. Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ένζυμα, τα οποία έχουν την ικανότητα να διασπούν το DNA σε αυστηρά καθορισμένες θέσεις, που καθορίζονται από τη δομή των νουκλεοτιδίων που περιβάλλουν το σημείο υδρόλυσης του DNA. Τα περισσότερα ένζυμα περιορισμού υδρολύουν το DNA σε τμήματα που περιέχουν άκρα που χαρακτηρίζονται ως μονόκλωνα και έχουν συμπληρωματική δομή. Επειδή το κομμάτι του DNA μπορεί να εισαχθεί στο πλασμίδιο και αντίστροφα αν επωαστεί με ένα ένζυμο περιορισμού, συνήθως γίνεται επώαση με δύο διαφορετικά ένζυμα περιορισμού, ώστε να υπάρχει μόνο μία πιθανή εισαγωγή. Προκειμένου να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει: το DNA, (πλασμιδιακός φορέας, ή το τμήμα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση, τα ένζυμα περιορισμού και σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουμίνη. Ο συνολικός όγκος του μίγματος κυμαίνεται από 20 μl έως 50 μl. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως στους 37 C, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύμων που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10 % v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δυο ώρες. Μερικές φορές όμως, για τα τμήματα του DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ κοντά στα άκρα, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η πέψη. Μετά την επώαση το μίγμα ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και οι επιθυμητές ζώνες κόβονται και καθαρίζονται (Παράγραφος Β.3.4) Β.3.6.2. Αποφωσφορυλίωση πλασμιδίου Αφού γίνει η πέψη του πλασμιδίου με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού και πριν την προσθήκη της DNA λιγάσης, η οποία θα συνδέσει το επιθυμητό τμήμα DNA με το πλασμίδιο, συνήθως γίνεται αποφωσφορυλίωση της 5 φωσφορικής ομάδας του πλασμιδίου. Με αυτό τον τρόπο, το πλασμίδιο δεν μπορεί να κλείσει από μόνο του κατά την αντίδραση λιγάσης, χωρίς δηλαδή να έχει εισαχθεί το τμήμα του DNA. Για την αποφωσφορυλίωση απαιτείται μία φωσφατάση, ένα ένζυμο το οποίο αφαιρεί τα 5 φωσφορυλιωμένα άκρα μορίων DNA και RNA. Στην προκειμένη εργασία, 82

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ χρησιμοποιήθηκε η αλκαλική φωσφατάση από έντερο μοσχαριού (Calf Intestine Alkaline Phosphatase, CIAP). Μετά την πέψη με τα ένζυμα περιορισμού, προστίθενται 3 μl φωσφατάσης στα 50 μl του μίγματος της πέψης. Η επώαση συνεχίζεται για 1 ώρα στους 37 C και άλλη 1 ώρα στους 50 C. Μετά την επώαση το μίγμα ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και η ζώνη του πλασμιδίου κόβεται και καθαρίζεται (Παράγραφος Β.3.4). Β.3.6.3. Αντίδραση λιγάσης Η ενσωμάτωση του τμήματος του DNA που μας ενδιαφέρει στον πλασμιδιακό φορέα γίνεται με τη βοήθεια μιας DNA λιγάσης. Με την T4 DNA λιγάση δημιουργούνται οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί ανάμεσα από τα 5 ή τα 3 άκρα του πλασμιδίου με τα 3 ή 5 άκρα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί στο πλασμίδιο. Το πλασμίδιο με το κομμάτι του DNA βρίσκονται σε κάποια αναλογία moles ώστε να είναι περίπου οι ίδιες ποσότητες σε ng και το ρυθμιστικό διάλυμα της λιγάσης είναι 10 φορές πιο πυκνό (10x). Χρησιμοποιήθηκε τόσο η Τ4 DNA λιγάση της Fermentas όσο και το Zero Blunt PCR ligation kit της Invitrogen. Στην πρώτη περίπτωση το μίγμα επωάζεται σε θ.δ. για τουλάχιστο 4 ώρες. Μίγμα λιγάσης Πλασμίδιο 2 μl Κομμάτι DNA προς ενσωμάτωση 15 μl Ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης (10x) 2 μl Τ4 DNA λιγάση 1 μl Το Zero Blunt PCR ligation kit χρησιμοποιείται για ενσωμάτωση τμημάτων DNA ακριβώς μετά την αντίδραση PCR χωρίς πέψη με ένζυμα περιορισμού (Blunt ends). Το τμήμα DNA που ενσωματώνεται μπορεί κατόπιν να ελεγχθεί για την νουκλεοτιδική του αλληλουχία (DNA sequencing). Το μίγμα επωάζεται στους 20 C για 30 min. Μίγμα λιγάσης Πλασμίδιο pcr-blunt 0.5 μl Κομμάτι DNA προς ενσωμάτωση 7.5 μl Ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης (10x) 1 μl Τ4 DNA λιγάση 1 μl 83

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Β.3.7. Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό κυττάρων (competent cells) Β.3.7.1. Μέθοδος ψυχρών διαλυμάτων CaCl 2 για άμεση χρήση των κυττάρων Τα βακτήρια, έπειτα από κατεργασία με ψυχρά διαλύματα CaCl 2, είναι ικανά να προσλάβουν DNA προερχόμενο από διάφορες πηγές (Mandel and Higa 1970). Η συγκεκριμένη τεχνική αναλυτικά έχει ως εξής: Εμβολιασμός 4 ml θρεπτικού υλικού LB ή dyt, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, με κύτταρα και επώαση στους 37 C για 12-16 ώρες με ανάδευση. Eμβολιασμός 10 ml θρεπτικού υλικού LB ή dyt, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, με 100 μl (1 % v/v) από την προηγούμενη καλλιέργεια και επώαση της νέας καλλιέργειας στους 37 C μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει περίπου ίση με 0.3 (αρχή της λογαριθμικής φάσης). Παραμονή καλλιέργειας στον πάγο για 10 min για να σταματήσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Φυγοκέντρηση στα 9 000 g για 10 min και συλλογή κυττάρων. Αιώρηση κυττάρων σε 5 ml ( 1 2 του αρχικού όγκου) CaCl 2 100 mm. Παραμονή στον πάγο για 20 min. Φυγοκέντρηση στα 9 000 g για 10 min για απομάκρυνση τυχόν υπολειμμάτων θρεπτικού υλικού. Αιώρηση κυττάρων σε 1 ml ( 1 10 του αρχικού όγκου) CaCl 2 50 mm. Παραμονή στον πάγο για 45 min Τα κύτταρα είναι πλέον ικανά να δεχτούν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Για κάθε δείγμα DNA χρησιμοποιούνται 200 μl επιδεκτικών κυττάρων. Τα κύτταρα χρησιμοποιούνται άμεσα και δεν μπορούν να αποθηκευτούν. B.3.7.2. Μέθοδος CaCl 2 για διατήρηση των κυττάρων Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ίδια αρχή, όπως και αυτή της παραγράφου Β.3.7.1. Τα κύτταρα μπορούν, όμως, να αποθηκευτούν για μετέπειτα χρήση. Τα κύτταρα μεγαλώνουν στο θρεπτικό υλικό SOB. Το θρεπτικό υλικό και τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: 84

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Θρεπτικό υλικό SOB Τρυπτόνη 2.0 % w/v Εκχύλισμα ζύμης 0.5 % w/v NaCl 0.06 % w/v KCl 0.02 % w/v Μετά την αποστείρωση του θρεπτικού υλικού γίνεται προσθήκη MgCl 2 και MgSO 4 σε τελική συγκέντρωση: MgCl 2 5 mm MgSO 4 5 mm Διάλυμα TFB-I, ph 6 CH 3 COONa 30 mm MgCl 2 50 mm NaCl 100 mm CaCl 2 10 mm Γλυκερόλη 15 % v/v Διάλυμα TFB-II, ph 7 MOPS 10 mm CaCl 2 75 mm NaCl 10 mm Γλυκερόλη 15 % v/v Εμβολιασμός 4 ml θρεπτικού υλικού LB ή dyt, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, με κύτταρα και επώαση στους 37 C για 12-16 ώρες με ανάδευση. Εμβολιασμός 100 ml θρεπτικού υλικού SOB, που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, με 1 ml από την προηγούμενη καλλιέργεια (1 % v/v) και επώαση της νέας καλλιέργειας στους 37 C μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει περίπου ίση με 0.45-0.5. Ψύξη στον πάγο για 10-15 min. Φυγοκέντρηση στα 3 000 g για 10 min στους 4 C. Απαλή αιώρηση των κυττάρων σε 20 ml ( 1 5 του αρχικού όγκου), διαλύματος TFB-I. Ψύξη στον πάγο για 10 min. Φυγοκέντρηση στα 3 000 g για 15 min στους 4 C. Αιώρηση των κυττάρων σε 4 ml ( 1 25 του αρχικού όγκου), διαλύματος TFB-IΙ. 85

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ψύξη στον πάγο για τουλάχιστο 2 ώρες. Το αιώρημα που προκύπτει, χωρίζεται σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), σε κλάσματα των 100 μl και αυτά ψύχονται με υγρό άζωτο. Με τη διαδικασία αυτή, επιτυγχάνεται η άμεση ψύξη των κλασμάτων, τα οποία μπορούν κατόπιν να διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα στους -80 C και να χρησιμοποιούνται όταν απαιτείται. Β.3.8. Εισαγωγή πλασμιδίου στα επιδεκτικά κύτταρα (μετασχηματισμός) Τα επιδεκτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασμιδιακού DNA (καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Σε 100 μl επιδεκτικών κυττάρων προστίθενται 40-80 ng πλασμιδιακού DNA ή 5-10 μl από το μίγμα της αντίδρασης της λιγάσης. Παραμονή στον πάγο για 30 min. Heat shock στους 42 C για 1.5 min. Ψύξη στον πάγο για 1 min. Προσθήκη 800 μl θρεπτικού υλικού LB ή dyt στον απαγωγό. Επώαση στους 37 C για 1 ώρα ώστε να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται τα κύτταρα. Φυγοκέντρηση στα 13 000 g για 1 min. Απόχυση μέρους του υπερκείμενου και επαναιώρηση των κυττάρων σε περίπου 100 μl θρεπτικού υλικού. Επίστρωση σε τρυβλία που περιέχουν θρεπτικό υλικό dyt με άγαρ και το κατάλληλο αντιβιοτικό, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το πλασμίδιο. Τα τρυβλία τοποθετούνται στους 37 C για 12-16 ώρες. Τα πλασμίδια προσδίδουν στα κύτταρα ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό, με αποτέλεσμα οι αποικίες που εμφανίζονται στα τρυβλία να αποτελούνται μόνο από κύτταρα που περιέχουν τον πλασμιδιακό φορέα, (μόνο του ή ανασυνδυασμένο).. Τα κύτταρα στα οποία δεν εισήλθε το πλασμίδιο δεν παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό και επομένως δεν αναπτύσσονται. 86

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Β.3.9. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (mini prep) Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA (mini-prep) έγινε με τη χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (Düren, Germany). Η διαδικασία έχει ως εξής (Plasmid DNA Purification User Manual, Macherey-Nagel 2005). Εμβολιασμός 4 ml θρεπτικού υλικού LB ή dyt, παρουσία αντιβιοτικού, με μία αποικία μετασχηματισμένων κυττάρων. Η καλλιέργεια αναδεύεται στους 37 C για 12-16 ώρες. Συλλογή κυττάρων από 3 ml καλλιέργειας με φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 1min σε επιτραπέζια φυγόκεντρο. Αιώρηση των κυττάρων με 250 μl διαλύματος Α1 (50 mm Tris-HCl, ph 8, 10 mm EDTA, ph 8, RNΑση 100 μg/ml). Λύση των κυττάρων με προσθήκη 250 μl διαλύματος Α2 (0.2 Μ ΝαΟΗ, 1 % SDS) και ήπια ανάδευση. Εξουδετέρωση της βάσης με προσθήκη 300 μl διαλύματος Α3 (3 Μ οξικό κάλιο, ph 5.5) και ήπια ανάδευση. Φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 10 min για διαχωρισμό πλασμιδιακού και χρωμοσωμικού DNA. Διαβίβαση υπερκείμενου από στήλη NucleoSpin Plasmid και φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 1 min. Το DNA συγκρατείται ενώ οι πρωτεΐνες διέρχονται από την στήλη. Πλύση της στήλης με 600 μl αιθανολικού διαλύματος Α4 για απομάκρυνση των προσμίξεων και φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 1 min. Στέγνωμα της στήλης με επιπλέον φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 2 min. Έκλουση του DNA με 100 µl διαλύματος ΑΕ (5 mm Tris-ΗCl, ph 8.5). Β.3.10. Εύρεση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας DNA (DNA sequencing) Η εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός τμήματος DNA (DNA sequencing) γίνεται με βιοχημικές μεθόδους. Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι με διακοπή της αλυσίδας με χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntps). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί μία αντίδραση PCR για αντιγραφή ενός κλώνου DNA (εκμαγείο). Το δείγμα χωρίζεται σε τέσσερις αντιδράσεις. Ο εκκινητής, ο οποίος είναι σημασμένος είτε με ραδιενέργεια είτε με κάποιο φθορισμοφόρο, επιμηκύνεται από μία DNA πολυμεράση, η οποία χρησιμοποιεί τα κανονικά 87

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ δεοξυνουκλεοτίδια (dntps, όπου Ν: G, A, T, C). Προστίθεται, όμως επιπλέον σε μικρό ποσοστό, ένα μόνο από τα τέσσερα ddntps σε κάθε μία από τις τέσσερις αντιδράσεις. Τα ddntps είναι αυτά που σταματούν την αλυσίδα, καθώς τους λείπει το 3 -ΟΗ που απαιτείται για τη δημιουργία του φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ δύο νουκλεοτιδίων. Τις περισσότερες φορές η πολυμεράση προσθέτει ένα κανονικό dntp και η αλυσίδα συνεχίζεται. Κάθε τόσο όμως (5 % πιθανότητα), η πολυμεράση προσθέτει ένα ddntp και η αλυσίδα σταματά. Αργά ή γρήγορα, όλα τα νέα αντίγραφα θα σταματήσουν σε όλα τα πιθανά σημεία. Το μίγμα της PCR, λοιπόν, αποτελείται από αλυσίδες διαφορετικών μεγεθών σταματημένες σε μία συγκεκριμένη εκ των τεσσάρων βάσεων. Για να διαχωριστούν αυτές οι διαφορετικού μεγέθους αλυσίδες, τα μίγματα των τεσσάρων διαφορετικών αντιδράσεων PCR ηλεκτροφορούνται σε μία πηκτή πολυακρυλαμιδίου-ουρίας. Οι αλυσίδες είναι ορατές λόγω της σήμανσης του εκκινητή. Βλέποντας σε ποια από τις τέσσερις αντιδράσεις δίνει σήμα μία αλυσίδα συγκεκριμένου μεγέθους φανερώνεται η βάση που αντιστοιχεί στην συγκεκριμένη θέση. Για αλληλούχηση των προϊόντων PCR, έγινε κλωνοποίησή τους στο πλασμίδιο pcr-blunt. Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές συμπληρωματικοί με τις περιοχές του πλασμιδίου που περικλείουν το κλωνοποιημένο προϊόν της PCR. Οι εκκινητές είναι τροποποιημένοι στο 5 άκρο τους με την ομάδα IRD800, η οποία απορροφά στην υπέρυθρη περιοχή του φάσματος. Οι εκκινητές και η διαδικασία αναλυτικά περιγράφονται παρακάτω: Άνω εκκινητής (Upper Primer, UP) 5 GTA AAA CGA CGG CCA GT 3 Κάτω εκκινητής (Lower Primer, LP) 5 GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3 Σε κάθε δείγμα προστίθεται διμεθυλοσουλφοξείδιο (DiMethylSulfOxide, DMSO) για να βοηθήσει στην αποδιάταξη των δύο κλώνων καθώς και ένας εκ των δύο εκκινητών: DNA εκμαγείο 5.7 μl (100 150 ng / 1000 bp) DMSO 50 % 0.7 μl Εκκινητής UP ή LP (2 μm) 0.6 μl 88

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Το παραπάνω μίγμα χωρίζεται στα τέσσερα (από 1.5 μl). Για κάθε μία αντίδραση προστίθενται επιπλέον 1.5 μl μίγματος που περιέχει την DNA πολυμεράση, τα τέσσερα κανονικά dntps και ένα μόνο εκ των τεσσάρων ddntps, διαφορετικό για κάθε μία από τις τέσσερις αντιδράσεις του δείγματος. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR φαίνονται παρακάτω: Συνθήκες PCR για sequencing 94 C 2 min 94 C 40 s 50 C 40 s 30 κύκλοι 70 C 1 min 4 C άπειρο Μετά την PCR προστίθενται 3 μl διαλύματος δειγμάτων για sequencing σε κάθε αντίδραση και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου-ουρίας. Η σύσταση του διαλύματος δειγμάτων φαίνεται παρακάτω: Διάλυμα δειγμάτων για sequencing Φορμαμίδιο 95 % v/v EDTA 20 mm Κυανούν του ξυλενίου 0.1 % w/v Η ηλεκτροφόρηση είναι συνεχής, υπάρχει μόνο πηκτή διαχωρισμού. Για την παρασκευή της πηκτής χρησιμοποιείται το RapidGel XL της USB (Cleveland, OH, USA), το οποίο είναι ένα διάλυμα 40 % μίγματος ακρυλαμιδίου και bis-ακρυλαμιδίου σε αναλογία 19:1. Προστίθεται και ουρία ως αποδιατακτικό και διαλύονται στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης TBE. Η σύστασή τους φαίνεται παρακάτω: Πηκτή πολυακρυλαμιδίου-ουρίας Ουρία 7 Μ ΤΒΕ 10x 1x DMSO 1 % v/v RapidGel XL 4.5 % v/v APS 0.07 % w/v TEMED 0.1 % v/v Ρυθμιστικό διλάυμα ηλεκτροφόρησης ΤΒΕ Tris 135 mm Βορικό οξύ 44.5 mm EDTA 3 mm 89

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Η ηλεκτροφόρηση γίνεται υπό σταθερό ρεύμα 40 ma για 20 ώρες. Μία δέσμη laser αναγνωρίζει και καταγράφει αυτόματα τον φθορισμό της ομάδας IRD800. Η αλληλουχία του DNA βρίσκεται διαβάζοντας, από κάτω προς τα πάνω, τις τέσσερις στήλες της πηκτής, που αντιστοιχούν στις αντιδράσεις του δείγματος με τα τέσσερα ddntps. Για τον έλεγχο και χειρισμό της όλης διαδικασίας χρησιμοποιείται το λογισμικό e-seq v.2.0. Β.3.11. Υπερέκφραση γονιδίων στο σύστημα pet Το σύστημα pet της Novagen αποτελεί ένα από τα καλύτερα συστήματα για την κλωνοποίηση και την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα Ε.coli, εξασφαλίζοντας υψηλά επίπεδα έκφρασης και αυστηρό έλεγχο στο βασικό επίπεδο της μετάφρασης. Το γονίδιο-στόχος κλωνοποιείται στο πλασμίδιο pet κάτω από τον έλεγχο του προαγωγέα από Τ7 βακτηριοφάγο, ενώ η επαγωγή της έκφρασης γίνεται από την Τ7 RNA πολυμεράση, η οποία είναι τόσο επιλεκτική και δραστική ώστε το σύνολο σχεδόν των αποθεμάτων του κυττάρου να μετατρέπονται σε προϊόν έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Αρχικά, τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια μετασχηματίζονται σε κύτταρα ξενιστές που δεν περιέχουν το γονίδιο της Τ7 πολυμεράσης (XL1 ή TOP10), έτσι ώστε το γονίδιο στόχος να είναι ανενεργό και επομένως να μην προκαλέσει αστάθεια του πλασμιδίου λόγω της παραγωγής πρωτεϊνών, τοξικών για το κύτταρο. Στη συνέχεια γίνεται μεταφορά του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε βακτηριακά στελέχη τα οποία περιέχουν στο χρωμόσωμα τους ένα αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης (λde3 λυσογόνο), το οποίο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του lacuv5 προαγωγέα και η έκφρασή του επάγεται με την προσθήκη του ισοπροπυλ-β- D-1-θειογαλακτοπυρανοζιδίου (IsoPropyl-β-D-1-ThioGalactopyranoside, IPTG). Στην περίπτωση των λde3 λυσογόνων, λόγω της ύπαρξης του lacuv5 προαγωγέα, μπορεί να επιτευχθεί η μεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και η έκφραση γονιδίων που τα προϊόντα τους δεν είναι τοξικά για την ανάπτυξη των κυττάρων, χωρίς την προσθήκη του IPTG. Όταν όμως απαιτείται αυστηρότερος έλεγχος, τότε χρησιμοποιούνται κύτταρα ξενιστές που περιέχουν το πλασμίδιο plyss ή plyse. Τα πλασμίδια αυτά παράγουν σε μικρά και μεγάλα ποσά την Τ7 λυσοζύμη η οποία είναι φυσικός καταστολέας της Τ7 RNA πολυμεράσης. Ακόμη αυστηρότερος έλεγχος της μεταγραφής από την Τ7 RNA πολυμεράση επιτυγχάνεται με τη 90

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ χρησιμοποίηση του Τ7 lac προαγωγέα ο οποίος περιλαμβάνει μια ακολουθία 25 bp του lac χειριστή μετά από την περιοχή των 17 bp του Τ7 προαγωγέα. Ο lac καταστολέας δεσμεύεται στην περιοχή του χειριστή ελαττώνοντας σημαντικά την μεταγραφή από την Τ7 RNA πολυμεράση. Με την προσθήκη του IPTG επάγεται τόσο η έκφραση του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης, όσο και η έκφραση του κλωνοποιημένου στο peτ γονιδίου. (Εικόνα Β.11). Εικόνα Β.11. Στοιχεία ελέγχου του συστήματος pet στα κύτταρα BL21 (DE3). B.3.12. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών με ουρά 6 ιστιδινών (His-tag) Η έκφραση πρωτεϊνών με ουρά 6 ιστιδινών (His-tag) έχει το πλεονέκτημα της εύκολης απομόνωσης και καθαρισμού των πρωτεϊνών με στήλες αγχιστείας. To Histag μπορεί στη συνέχεια να απομακρυνθεί, κόβοντας ειδικά με κάποια πρωτεϊνάση, αν και συνήθως δεν υπάρχει λόγος, καθώς δεν παρεμποδίζει τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Η στήλη αγχιστείας που χρησιμοποιείται αποτελείται από σφαιρίδια Ni-NTA (Νickel-ΝitriloΤriΑcetic acid), δηλαδή σφαιρίδια που φέρουν στο πλέγμα τους παγιδευμένα ιόντα νικελίου. Τα ιόντα αυτά δεσμεύουν τις πρωτεΐνες με His-tag, σχηματίζοντας ενώσεις συναρμογής. Η έκφραση των πρωτεϊνών γίνεται στο 91

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ σύστημα pet (Παράγραφος Β.3.10) με χρήση του πλασμιδίου pet27b(+). Η διαδικασία της έκφρασης και του καθαρισμού αναλυτικά έχει ως εξής: Βακτηριακά κύτταρα BL21(DΕ3), που έχουν μετασχηματιστεί με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pet27b(+), απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό dyt/άγαρ που περιέχει καναμυκίνη (50 μg/ml) και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Εμβολιασμός 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού dyt, που περιέχει καναμυκίνη, με μια αποικία η οποία επιλέγεται από το τρυβλίο. Επώαση της καλλιέργειας υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. Εμβολιασμός 1.5 lt θρεπτικού υλικού dyt, που περιέχει καναμυκίνη, με 10 ml από την προηγούμενη καλλιέργεια. Ανάπτυξη της καλλιέργειας με ισχυρή ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων στα 600 nm φτάσει περίπου στο 0.6. Προσθήκη 1 mm IPTG και συνέχεια της επώασης στους 37 C για 3 ώρες. Συλλογή κυττάρων με φυγοκέντρηση στα 6 000 rpm (4 500 g) για 20 min σε κεφαλή Beckman JA 25.50. Ακολουθεί ο καθαρισμός της υπερπαραγμένης πρωτεΐνης με το His-tag. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται φαίνονται παρακάτω: Διάλυμα λύσης κυττάρων Tris-HCl, ph 8 50 mm NaCl 600 mm Ιμιδαζόλιο 2.5 mm Διάλυμα πλύσης Tris-HCl, ph 8 50 mm NaCl 600 mm Ιμιδαζόλιο 5 mm Διάλυμα έκλουσης Tris-HCl, ph 8 50 mm NaCl 600 mm Ιμιδαζόλιο 250 mm Αιώρηση των κυττάρων σε διάλυμα λύσης. Λύση των κυττάρων με υπερήχους, 6 φορές των 20 s, ενώ ενδιάμεσα μεσολαβεί κάθε φορά μία παύση 40 s σε παγόλουτρο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. 92

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 20 min και λήψη του υπερκείμενου εκχυλίσματος των πρωτεϊνών. Εξισορρόπηση στήλης Ni-NTA με το διάλυμα λύσης. Ανάμιξη του εκχυλίσματος των πρωτεϊνών με την εξισορροπημένη στήλη. Ανάδευση για 2 ώρες στους 4 C, ώστε να επιτευχθεί η δέσμευση της πρωτεΐνης με το His-tag στη στήλη. Φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 1 min, ώστε να κατακαθίσουν τα σφαιρίδια της στήλης και λήψη του υπερκείμενου (πρωτεΐνες που δεν δεσμεύτηκαν). Πλύση της στήλης 3-5 φορές με διάλυμα πλύσης για 10 min η κάθε μία, στους 4 C υπό ανάδευση. Φυγοκέντρηση στα 14 000 rpm για 1 min και λήψη του υπερκείμενου (πρωτεΐνες χαλαρά δεσμευμένες στη στήλη) Έκλουση των δεσμευμένων πρωτεϊνών 2-3 φορές με διάλυμα έκλουσης για 10 min η κάθε μία, στους 4 C υπό ανάδευση. Τα εκλούσματα, που περιέχουν την καθαρή πρωτεΐνη με το His-tag, φυλάσσονται στους -20 C. Β.3.13. Βιοτινυλίωση πρωτεϊνών in vivo Η γρήγορη επέκταση των τεχνολογιών της βιοχημείας, της ανοσολογίας, της βιολογίας κυττάρων και της βιοτεχνολογίας, που βασίζονται στις πολύ υψηλής αγχιστείας αλληλεπιδράσεις της βιοτίνης με τις πρωτεΐνες αβιδίνη και στρεπταβιδίνη, σκιάζουν το γεγονός ότι η βιοτίνη είναι, πάνω από όλα, μια βιταμίνη (βιταμίνη Η) απαραίτητη για όλες τις μορφές ζωής. Συντίθεται από τα φυτά, τα περισσότερα βακτήρια και μερικούς μύκητες, και δρα ως συνένζυμο. Η βιοτίνη ενώνεται ομοιοπολικά στο ενεργό κέντρο ορισμένων ενζύμων (καρβοξυλασών), που μεταφέρουν το διοξείδιο του άνθρακα από το όξινο ανθρακικό στα οργανικά οξέα για να διαμορφώσουν τους κυτταρικούς μεταβολίτες. Οι καρβοξυλάσες έχουν βασικούς ρόλους στην γλυκονεογένεση, την λιπογένεση, το μεταβολισμό των αμινοξέων και την ενεργειακή μετατροπή. Η αντίδραση που συνδέει την βιοτίνη σε αυτά τα ένζυμα είναι εντυπωσιακά εξειδικευμένη (Chapman-Smith and Cronan 1999). Η BPL (Biotin Protein Ligase) είναι το ένζυμο, το υπεύθυνο για την ένωση της βιοτίνης σε μια συγκεκριμένη λυσίνη στο ενεργό κέντρο των νεοσυντιθέμενων καρβοξυλασών. Η βιοτινυλίωση είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση 93

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ εξαιρετικής εξειδίκευσης. Στα E.coli αναγνωρίζεται μόνο μία λυσίνη της BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein) υπομονάδας της ακετυλο-coa καρβοξυλάσης και βιοτινυλιώνεται από την BirA (την BPL του E.coli) (Chapman-Smith et al. 2001). Η σύνδεση της βιοτίνης είναι μια αντίδραση δύο σταδίων που οδηγεί στο σχηματισμό ενός αμιδικού δεσμού μεταξύ της καρβοξυλικής ομάδας της βιοτίνης και της ε-αμινομάδας της τροποποιημένης λυσίνης (Εικόνα Β.12). Εικόνα Β.12. Αντίδραση βιοτινυλίωσης που καταλύεται από το ένζυμο BirA (Chapman-Smith and Cronan 1999). Οι ακολουθίες των in vivo βιοτινυλιωμένων υποστρωμάτων είναι υψηλά συντηρημένες ανάμεσα στα είδη. Το μικρότερο δυνατό υπόστρωμα που μπορεί να βιοτινυλιωθεί από την BirA είναι ένα 14-μερές πεπτίδιο (G-L-N-D-I-F-E-A-Q-K-I-E- W-H) (Beckett et al. 1999). Για την in vivo βιοτινυλίωση πρωτεϊνών έχουν αναπτυχθεί συστήματα, όπως το στέλεχος AVB101 του βακτηρίου E.coli (Εικόνα Β.13). Αυτό το στέλεχος περιέχει ένα πλασμίδιο (pbiracm), στο οποίο είναι ενσωματωμένο το γονίδιο της BirA. Μπορεί, επιπλέον, να δεχτεί ένα δεύτερο πλασμίδιο (pan5), το οποίο περιέχει την νουκλεοτιδική ακολουθία του 14-μερούς πεπτιδίου που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo. Ακριβώς μετά από αυτήν την ακολουθία είναι δυνατό να κλωνοποιηθεί το 94

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ γονίδιο της προς βιοτινυλίωση πρωτεΐνης. Με προσθήκη IPTG, αρχικά, υπερπαράγεται η πρωτεΐνη ενωμένη στο Ν-τελικό άκρο της με το 14-μερές πεπτίδιο και δεύτερον, εκφράζεται το ένζυμο BirA, το οποίο αναγνωρίζει το 14-μερές πεπτίδιο και το βιοτινυλιώνει in vivo. Αυτό, δηλαδή, έχει ως αποτέλεσμα να παράγεται η πρωτεΐνη με το ένα άκρο της βιοτινυλιωμένο (www.avidity.com). Εικόνα Β.13. Κύτταρα AVB101 με τα δύο επαγόμενα με IPTG πλασμίδια. Φαίνονται το γονίδιο του ενζύμου BirA (πορτοκαλί), το γονίδιο της πρωτεΐνης προς βιοτινυλίωση (μπλε) και η νουκλεοτιδική ακολουθία του 14-μερούς πεπτιδίου (κόκκινο) (www.avidity.com). 95

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το πρώτο μέρος των αποτελεσμάτων αναφέρεται στις τροποποιήσεις που έγιναν σε ριβοσώματα και νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες, ώστε να δημιουργηθεί ένα σύστημα ικανό να χρησιμοποιηθεί για μετρήσεις με οπτικές λαβίδες. Επίσης περιγράφονται τα πειράματα με τη χρήση των οπτικών λαβίδων για την μέτρηση των δυνάμεων που ασκούνται στην νεοσυντιθέμενη πρωτεϊνική αλυσίδα. Το δεύτερο μέρος αναφέρεται επίσης στη διαδικασία δημιουργίας ενός αντίστοιχου συστήματος, ώστε να παρατηρηθεί η αναδίπλωση μιας πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της σύνθεσής της από μεμονωμένα ριβοσώματα, με την τεχνική του FRET. Επιπλέον περιγράφονται οι μετρήσεις με την παραπάνω τεχνική. Γ.1. ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Γ.1.1. Βιοτινυλίωση της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης in vivo Γ.1.1.1. Απομόνωση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης Για την απομόνωση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης έγινε PCR. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο pet11a, στο οποίο ήταν κλωνοποιημένο το γονίδιο της L4 από τον οργανισμό T. thermophilus. Ο χάρτης του πλασμιδίου δίνεται στο παράρτημα (σελ. 162). Οι εκκινητές για την αντίδραση PCR σχεδιάστηκαν με βάση την ήδη γνωστή ακολουθία του γονιδίου της L4 (Pfeiffer et al. 1995). Ο εκκινητής TthL4 Up Avid είχε μήκος 35 bp, με αλληλουχία όμοια με το 5 άκρο του γονιδίου της L4. Επίσης πριν από το εναρκτήριο κωδικόνιο ATG προστέθηκαν κάποιες βάσεις, για να δημιουργηθεί η θέση αναγνώρισης του ενζύμου XhoI. TthL4 Up Avid αρχή γονιδίου L4 5 CC gga CTC gag ATg AAg gag gta gcg gtg TAC CAg 3 XhoI 96

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Ο εκκινητής TthL4 Low Avid είχε μήκος 28 bp με αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο του γονιδίου της L4. Επίσης μετά το συμπληρωματικό του κωδικονίου τερματισμού ΤGA, που είναι το ACT (αντικωδικόνιο), προστέθηκαν πάλι κάποιες βάσεις, για να δημιουργηθεί η θέση αναγνώρισης του ενζύμου BamHI. TthL4 Low Avid τέλος γονιδίου L4 5 CgC gga TCC TCA CgC CTC ACC CCC TAT g 3 BamHI Με κόκκινη υπογράμμιση εμφανίζονται το εναρκτήριο κωδικόνιο και το κωδικόνιο τερματισμού, και με μπλε χρώμα οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Τα μπλε βέλη δείχνουν τις θέσεις που κόβουν τα ένζυμα. Κατά την αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκαν 2 ng του πλασμιδίου pet11a στο οποίο είχε ήδη κλωνοποιηθεί το γονίδιο της L4. Το μίγμα της αντίδρασης, καθώς και οι συνθήκες της PCR, περιγράφονται στην παράγραφο Β.3.1. Ο έλεγχος της απομόνωσης του γονιδίου της L4 έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%w/v. Προέκυψε ένα προϊόν στα 650 bp, που αντιστοιχούσε στο αναμενόμενο μέγεθος του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης (Εικόνα Γ.1). Το κομμάτι αυτό εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen (Παράγραφος B.3.4). 1 2 1018bp 506bp PCR προϊόν (γονίδιο L4) στα 650 bp Εικόνα Γ.1. PCR με εκμαγείο το πλασμίδιο pet11a για την απομόνωση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης. Ανάλυση των προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Διαδρομή 1: μάρτυρες, Διαδρομή 2: προϊόν στα 650 bp. 97

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Γ.1.1.2. Κλωνοποίηση του γονιδίου της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης στο πλασμίδιο pan5 Το προϊόν της αντίδρασης PCR (γονίδιο της L4), μετά το καθαρισμό του από την πηκτή αγαρόζης, επωάστηκε με τα ένζυμα περιορισμού XhoI και BamHI, οι θέσεις αναγνώρισης των οποίων βρίσκονταν στα δύο άκρα του γονιδίου. Η επώαση έγινε στους 37 C για 3 ώρες και ο καθαρισμός από τα ένζυμα και τα άλατα της αντίδρασης έγινε με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της Qiagen (Παράγραφος B.3.2). Το πλασμίδιο pan5 με μέγεθος 4204 bp εισάγει την νουκλεοτιδική ακολουθία του 14-μερούς πεπτιδίου, που μπορεί να βιοτινυλιωθεί in vivo (Παράγραφος Β.3.13), στο αμινοτελικό άκρο της πρωτείνης (AviTag πλασμίδιο). Το πλασμίδιο pan5 επωάστηκε με τα ίδια ένζυμα περιορισμού, XhoI και BamHI, τα οποία βρίσκονται σε μία περιοχή του πλασμιδίου αμέσως μετά την νουκλεοτιδική ακολουθία του 14- μερούς πεπτιδίου. Η επώαση έγινε στους 37 C για 3 ώρες και προέκυψε ένα γραμμικό κομμάτι, το οποίο καθαρίστηκε με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της Qiagen. Ο χάρτης περιορισμού του πλασμιδίου δίνεται στο παράρτημα (σελ.164). Το γραμμικό, πλέον, πλασμίδιο αποφωσφορυλιώθηκε με τη φωσφατάση CIAP (στα 5 -άκρα του), έτσι ώστε να μην μπορέσει να επανακυκλοποιηθεί με την αντίδραση λιγάσης χωρίς την ενσωμάτωση του γονίδιου της L4. Για την κλωνοποίηση του γονιδίου της L4 στο πλασμίδιο pan5 χρησιμοποιήθηκε η T4 DNA λιγάση (Παράγραφος Β.3.6.3) σε τελικό όγκο 20 μl. Από το μίγμα της αντίδρασης της λιγάσης χρησιμοποιήθηκαν 10 μl για μετασχηματισμό κυττάρων XL1 από E.coli. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα απλώθηκαν σε τρυβλία παρουσία του αντιβιοτικού αμπικιλλίνη και αναπτύχθηκαν στους 37 C. Από τις αποικίες που προέκυψαν επιλέχτηκε ένας αντιπροσωπευτικός αριθμός και ακολούθησε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA (pan5 + L4) με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep) (Παράγραφος Β.3.9). Για να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη του γονιδίου της L4 στο πλασμίδιο pan5 (θετικοί κλώνοι) ακολούθησε επώαση του απομονωμένου πλασμιδιακού DNA με τα ένζυμα περιορισμού XhoI και BamHI για 1 ώρα στους 37 C. Η αναμενόμενη ζώνη στα 650 bp ήταν αρκετά ασθενής, οπότε επαναλήφθηκε PCR με τους ίδιους εκκινητές (TthL4 Up Avid και TthL4 Low Avid) στις ίδιες συνθήκες και εκμαγείο αυτή τη φορά το πλασμιδιακό DNA (pan5 + L4). Πράγματι στην πηκτή αγαρόζης παρατηρήθηκε 98

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ προϊόν στα 650 bp, όπως ήταν αναμενόμενο, που σημαίνει ότι το γονίδιο της L4 κλωνοποιήθηκε επιτυχώς στο πλασμίδιο pan5. Γ.1.1.3. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων AVB101 από E. coli με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4 για την υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης Για την υπερέκφραση και βιοτινυλίωση της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (pan5 + L4) εισήχθη σε κύτταρα AVB101, τα οποία αποτελούν ένα σύστημα in vivo βιοτινυλίωσης (Παράγραφος Β.3.13), αναπτύχθηκαν παρουσία του αντιβιοτικού χλωραμφαινικόλη (10 μg/ml τελική συγκέντρωση), κατέστησαν επιδεκτικά με την μέθοδο CaCl 2 (Παράγραφος Β.3.7.1) και μετασχηματίστηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.8. Τα κύτταρα παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στην χλωραμφαινικόλη λόγω του πλασμιδίου pbiracm που περιέχουν και με την εισαγωγή του πλασμιδίου pan5 αποκτούν ανθεκτικότητα και στην αμπικιλλίνη. Έτσι, απλώθηκαν σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό dyt και άγαρ παρουσία των αντιβιοτικών αμπικιλλίνη (100 μg/ml) και χλωραμφαινικόλη (10 μg/ml) και επωάστηκαν στους 37 C για 12-16 ώρες. Επιλέχτηκε ένας θετικός κλώνος που περιείχε την L4 στο πλασμίδιο pan5 και μεταφέρθηκε σε σωλήνα με 4 ml θρεπτικού υλικού dyt παρουσία των αντιβιοτικών χλωραμφαινικόλη και αμπικιλλίνη σε τελικές συγκεντρώσεις 10 μg/ml και 100 μg/ml, αντίστοιχα. Η ανάπτυξη των κυττάρων έγινε στους 37 C για 12-16 ώρες. Από την καλλιέργεια αυτή έγινε αραίωση 1:50 σε κωνικές φιάλες που περιείχαν 200 ml αποστειρωμένου dyt παρουσία χλωραμφαινικόλης και αμπικιλλίνης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει ~0.6. Στο σημείο αυτό προστέθηκαν βιοτίνη και IPTG σε τελικές συγκεντρώσεις 50 μμ και 1 mm αντίστοιχα. Το IPTG επάγει τη σύνθεση τόσο του ενζύμου BirA όσο και της πρωτεΐνης L4, η οποία έχει ενωμένο στο αμινοτελικό της άκρο το 14-μερές πεπτίδιο. Η προστιθέμενη βιοτίνη συνδέεται από το BirA στο αμινοτελικό άκρο της L4. Η επώαση συνεχίστηκε για 3 ώρες στην ίδια θερμοκρασία. Κρατήθηκε 1 ml δείγματος πριν από την επαγωγή και 1 ml δείγματος μετά την τρίωρη επώαση και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση του ολικού εκχυλίσματος των κυττάρων σε πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου 12% w/v αφού προηγουμένως έγινε λύση με διαδοχικό πάγωμαξεπάγωμα και προσθήκη 6Μ ουρίας, Tris-HCl ph 7.5. Στην πηκτή εμφανίζεται 99

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ εντονότερη η ζώνη μετά την επαγωγή στα 23 kd, όπου αναμενόταν η L4 ριβοσωμική πρωτεΐνη (Εικόνα Γ.2). 1 Μ 2 35 kd 25 kd L4 στα 23 kd 15 kd 10 kd Εικόνα Γ.2. SDS-ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% w/v ολικού εκχυλίσματος των κυττάρων AVB101 μετασχηματισμένων με pan5 + L4. Διαδρομή 1: πριν την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή 2: μετά την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή Μ: μάρτυρες. Φαίνεται η L4 υπερεκφρασμένη στα 23 kd. Γ.1.1.4. Έλεγχος βιοτινυλίωσης της L4 ριβοσωμικής πρωτεΐνης Ο έλεγχος της βιοτινυλίωσης της L4 έγινε με επίσταξη μικρής ποσότητας κυττάρων, μετά την λύση τους με 6Μ ουρία, σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Dot Blot) και ως αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε η νουτραβιδίνη συζευγμένη με υπεροξειδάση του χρένου (NeutrAvidin Horseradish Peroxidase Conjugate), το οποίο δίνει μία χρωμοαντίδραση παρουσία βιοτίνης. Για το Dot Blot χρειάστηκε ένα δείγμα με το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων μετά την επαγωγή, ένα θετικό και ένα αρνητικό control. Για αρνητικό control μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία οποιαδήποτε πρωτεΐνη, αρκεί να μην είναι βιοτινυλιωμένη. Στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη HPNAP (Helicobacter Pylori Neutrophil Activating Protein) του Helicobacter pylori. Για θετικό control σημάνθηκε in vitro με βιοτίνη μία γνωστή γλυκοπρωτεΐνη, η φετουΐνη. Η σήμανση έγινε σε δύο στάδια, ένα στάδιο οξείδωσης και ένα στάδιο βιοτινυλίωσης. Στο πρώτο στάδιο, 10 μg φετουΐνης διαλύθηκαν σε 50 μl οξικού νατρίου 0.1 Μ, ph 4.5 και προστέθηκε διάλυμα 0.5 Μ υπεριωδικού νατρίου σε τελική 100

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ συγκέντρωση 10 mm. Η αντίδραση έλαβε χώρα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, τερματίσθηκε με την προσθήκη 1 / 10 του όγκου 0.5 Μ αιθυλενογλυκόλης και ακολούθησε διαπίδυση σε PBS (Phosphate Buffered Saline) για 12-16 ώρες. Στο δεύτερο στάδιο, προστέθηκε του όγκου υδραζίδιο της βιοκυτίνης (υδραζίδιο που περιέχει βιοτίνη) και η βιοτινυλίωση της φετουΐνης έλαβε χώρα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης έγινε επίσταξη μίας σταγόνας από το θετικό control, μίας σταγόνας από το αρνητικό control, και από μία σταγόνα με ολικό εκχύλισμα κυττάρων μετά την επαγωγή χωρίς διάλυμα δειγμάτων και με διάλυμα δειγμάτων, αντίστοιχα. Η μεμβράνη έμεινε σε διάλυμα κορεσμού (blocking solution) για 1 ώρα και με το αντίσωμα για 2.5 ώρες. Ακολούθησαν δύο πλύσεις με PBS και έπειτα προστέθηκε διάλυμα διαμινοβενζιδίνης με 30 % υπεροξείδιο του υδρογόνου για να γίνει η χρωμοαντίδραση. Πράγματι, εμφανίστηκαν οι κηλίδες στο θετικό control και στα δύο δείγματα των κυττάρων ενώ στο αρνητικό control δεν εμφανίστηκε τίποτα. Αυτό αποτελεί ένδειξη ύπαρξης βιοτινυλιωμένου προϊόντος μέσα στα κύτταρα AVB101 (Εικόνα Γ.3). Θετικό control Αρνητικό control Ολικό εκχύλισμα χωρίς διάλυμα δειγμάτων Ολικό εκχύλισμα με διάλυμα δειγμάτων Εικόνα Γ.3. Dot Blot σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ολικού εκχυλίσματος κυττάρων μετά την επαγωγή με IPTG. Από πάνω προς τα κάτω: βιοτινυλιωμένη φετουΐνη (θετικό control), HPNAP (αρνητικό control), δείγμα μετά την επαγωγή με IPTG χωρίς διάλυμα δειγμάτων και δείγμα μετά την επαγωγή με IPTG με διάλυμα δειγμάτων. 101

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Γ.1.2. Απομόνωση ριβοσωμάτων με ενσωματωμένη την βιοτινυλιωμένη L4 Γ.1.2.1. Απομόνωση ριβοσωμάτων από κύτταρα AVB101 μετασχηματισμένα με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4 Από 7.5 gr κυττάρων AVB101 μετασχηματισμένων με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4 απομονώθηκαν 70S ριβοσώματα, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.8. Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε με την προσθήκη των αντιβιοτικών αμπικιλλίνη και χλωραμφαινικόλη στους 37 C και σε απορρόφηση Α 600 ~0.6 προστέθηκαν IPTG και βιοτίνη. Η συλλογή των κυττάρων έγινε 3 ώρες μετά την επαγωγή σε απορρόφηση Α 600 ~1.2. Κατ αυτόν τον τρόπο βιοτινυλιώνεται η L4 ριβοσωμική πρωτεΐνη και στη συνέχεια ενσωματώνεται in vivo στα ριβοσώματα των κυττάρων. Ως έλεγχο (control) χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα XL1, τα οποία αναπτύχθηκαν παρουσία του αντιβιοτικού τετρακυκλίνη σε τελική συγκέντρωση 12 μg/ml και μετά από 5 ώρες στους 37 C (Α 600 ~1.2) συλλέχτηκαν 10 gr. Από αυτά απομονώθηκαν 70S ριβοσώματα για να χρησιμοποιηθούν ως control (μη τροποποιημένα). Γ.1.2.2. Έλεγχος ενσωμάτωσης της βιοτινυλιωμένης L4 στα ριβοσώματα Για τον έλεγχο της ενσωμάτωσης της βιοτινυλιωμένης L4 στα ριβοσώματα έγινε Dot Blot και χρησιμοποιήθηκε ως αντίσωμα στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αλκαλική φωσφατάση (Streptavidin Alkaline Phosphatase Conjugate). Σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης έγινε επίσταξη μίας σταγόνας ριβοσωμάτων που απομονώθηκαν από κύτταρα XL1 (control) και μίας σταγόνας ριβοσωμάτων που απομονώθηκαν από κύτταρα AVB101. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφηκε στην παράγραφο 2.7.2 και δίνει μία χρωμοαντίδραση παρουσία βιοτίνης. Στα ριβοσώματα που απομονώθηκαν από κύτταρα XL1 (control) δεν εμφανίζεται κηλίδα, διότι δεν υπάρχει τίποτα βιοτινυλιωμένο. Αντίθετα στα ριβοσώματα, που απομονώθηκαν από κύτταρα AVB101 φαίνεται μία έντονη κηλίδα, που επιβεβαιώνει τη βιοτινυλίωση και ενσωμάτωση της L4 στα ριβοσώματα (Εικόνα Γ.4). Εν κατακλείδι, απομονώθηκαν ριβοσώματα ειδικά βιοτινυλιωμένα σε μία συγκεκριμένη θέση. 102

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Ριβοσώματα από XL1 κύτταρα Ριβοσώματα από AVB101 κύτταρα Εικόνα Γ.4. Dot Blot σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Από πάνω προς τα κάτω: ριβοσώματα από κύτταρα XL1 (control) και ριβοσώματα από κύτταρα. AVB101. Γ.1.3 Μη ειδική σήμανση ριβοσωμάτων με φθορισμοφόρο Τα ριβοσώματα, που είχαν βιοτινυλιωθεί στην L4 πρωτεΐνη, σημάνθηκαν μη ειδικά σε θέσεις όπου υπάρχουν κυστεΐνες με το φθορισμοφόρο Atto655 συζευγμένο με μαλεϊμίδιο όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Β.2.15.2. Η περίσσεια του φθορισμοφόρου απομακρύνθηκε με στήλη μοριακής διήθησης, και συλλέχθηκαν τα κλάσματα που περιείχαν τα σημασμένα ριβοσώματα. Ο υπολογισμός της απόδοσης της σήμανσης των ριβοσωμάτων, έγινε με μέτρηση των κλασμάτων της στήλης σε φθορισμόμετρο Shimadzu RF-1501. Πριν μετρηθούν τα κλάσματα στο φθορισμόμετρο έγιναν καμπύλες αναφοράς τόσο για τη συγκέντρωση των ριβοσωμάτων όσο και του φθορισμοφόρου. Πρώτα, μετρήθηκε ο φθορισμός των τρυπτοφανών για γνωστή συγκέντρωση ριβοσωμάτων. Έγινε διέγερση στα 280 nm και μετρήθηκε η ένταση φθορισμού (Fluorescence Intensity, F.I.) στα 300-450 nm (Εικόνα Γ.5). Κατόπιν, μετρήθηκε ο φθορισμός του φθορισμοφόρου για συγκέντρωση ίση με αυτής των ριβοσωμάτων. Έγινε διέγερση στα 630 nm και μετρήθηκε η F.I. στα 640-750 nm (Εικόνα Γ.6). 103

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Εικόνα Γ.5. Καμπύλη αναφοράς για τη συγκέντρωση των ριβοσωμάτων. Με κόκκινο φαίνεται η ένταση φθορισμού των τρυπτοφανών για μήκη κύματος 300-450 nm, αφού έχει αφαιρεθεί ο φθορισμός του ρυθμιστικού διαλύματος. Εικόνα Γ.6. Καμπύλη αναφοράς για τη συγκέντρωση του φθορισμοφόρου Atto655. Με κόκκινο φαίνεται η ένταση φθορισμού του φθορισμοφόρου για μήκη κύματος 640-750 nm, αφού έχει αφαιρεθεί ο φθορισμός του ρυθμιστικού διαλύματος. Τα κλάσματα της στήλης μετρήθηκαν για φθορισμό τρυπτοφανών και φθορισμοφόρου στις ίδιες συνθήκες με τα δείγματα αναφοράς και έγινε σύγκριση των καμπυλών αυτών με τις καμπύλες αναφοράς. Έτσι, υπολογίστηκε για κάθε κλάσμα η συγκέντρωση των ριβοσωμάτων και του φθορισμοφόρου και η αναλογία μεταξύ τους. 104

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Από την αναλογία αυτή υπολογίστηκε η απόδοση της σήμανσης στο 80-90 %, που σημαίνει ότι κάθε ριβόσωμα έχει κατά πάσα πιθανότητα ένα φθορισμοφόρο. Γ.1.4. Τροποποίηση γονιδιακής αλληλουχίας πρωτεϊνών για πειράματα οπτικών λαβίδων Τα γονίδια των πρωτεϊνών, που θα μεταφράζονται από τα ριβοσώματα προκειμένου να χρησιμοποιηθούν για μετρήσεις με οπτικές λαβίδες, έπρεπε να τροποποιηθούν κατάλληλα όπως φαίνεται στο πιο κάτω σχήμα: (Γονίδιο A) Αμέσως μετά το εναρκτήριο κωδικόνιο ATG εισάγεται το κωδικόνιο τερματισμού ΤAG (amber stop codon), το οποίο θα χρησιμοποιηθεί για την εισαγωγή/ενσωμάτωση βιοτίνης κατά τη διάρκεια της σύνθεσης της πρωτεΐνης. Ακολουθεί μία ενδιάμεση αλληλουχία που κωδικοποιεί για 30-40 αμινοξέα και αμέσως μετά μία που κωδικοποιεί για έξι ιστιδίνες (6xHis ή His-tag). Μετά το Histag ακολουθεί η αλληλουχία της πρωτεΐνης συνοδευόμενη από μία δεύτερη αλληλουχία που κωδικοποιεί για επιπλέον 31 αμινοξέα στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Αν κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης δεν προστεθεί ιστιδίνη η σύνθεση θα σταματήσει όταν φτάσει στο His-tag, καθώς το γονίδιο δεν κωδικοποιεί για ιστιδίνη πριν απο αυτό το σημείο. Το amber κωδικόνιο, όμως, θα έχει προβάλει από την έξοδο του ριβοσωμικού καναλιού, λόγω των 30-40 αμινοξέων που ακολουθούν. Σε αυτή τη φάση είναι δυνατή η σύνδεση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας με τη χάντρα που βρίσκεται παγιδευμένη στις οπτικές λαβίδες. Με προσθήκη ιστιδίνης η σύνθεση συνεχίζεται. Πριν από το κωδικόνιο τερματισμού υπάρχει θέση αναγνώρισης από ένζυμο περιορισμού. Δίνεται έτσι η δυνατότητα είτε να χρησιμοποιηθεί το γονίδιο ως έχει και να απελευθερωθεί η πρωτεΐνη από το ριβόσωμα είτε να κοπεί πριν το κωδικόνιο τερματισμού και να παραμείνει συνδεδεμένη στο ριβόσωμα μετά τη σύνθεσή της, καθώς δεν θα υπάρχει σήμα απελευθέρωσης. Στη δεύτερη περίπτωση, τα 31 αμινοξέα στο καρβοξυτελικό 105

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ άκρο εξασφαλίζουν τόσο την έξοδο ολόκληρης της πρωτεΐνης από το κανάλι του ριβοσώματος όσο και την αναδίπλωση της. Χρησιμοποιήθηκαν τα γονίδια των πρωτεϊνών GFPem (Green Fluorescent Protein emerald), η οποία φθορίζει στα 509 nm μόλις αποκτήσει την τελική της διαμόρφωση και ουβικιτίνης, η οποία είναι μία μικρή πρωτεΐνη με πιο απλή τριτοταγή δομή. Παρακάτω αναφέρεται λεπτομερώς η διαδικασία τροποποίησης των γονιδίων τους, ώστε να αποκτήσουν την επιθυμητή αλληλουχία του γονιδίου Α. Γ.1.4.1. Εισαγωγή 31 αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο της GFPem Το γονίδιο της πρωτεΐνης GFPem ήταν ήδη κλωνοποιημένο στο πλασμίδιο prset της Invitrogen (prset/emgfp). Ο χάρτης του πλασμιδίου δίνεται στο παράρτημα (σελ. 166). Σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές με βάση την αλληλουχία βάσεων του γονιδίου της GFPem. Ο εκκινητής FP GFPem είχε μήκος 42 bp, με αλληλουχία όμοια με το 5 άκρο του γονιδίου της GFPem. Περιείχε επίσης θέσεις αναγνώρισης για τα ένζυμα BamHI, EcoRI και NcoI. FP GFPem αρχή γονιδίου 5 gcg gat CCg AAT TCg CCA Tgg TgA gca Agg gcg Agg AgC 3 BamHI EcoRI NcoI Ο εκκινητής RP GFPem είχε μήκος 122 bp με αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο του γονιδίου της GFPem. Επίσης μεταξύ των θέσεων αναγνώρισης για τα ένζυμα XhoI και HindIII εισήχθησαν βάσεις που κωδικοποιούν για 31 επιπλέον αμινοξέα. RP GFPem τέλος γονιδίου 5 gct TAA AgC TTg CTg TTA gac TTg AAg AAA Cgg ACT TTT TTA CCg HindIII TCT TCg AAT CTA Aag CCT ACA Cgg TCA gcc TTg CCg gtt gcc gca TTC TCg AgC TTg TAC AgC TCg TCC Atg CCg Ag 3 XhoI 106

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Με κόκκινη υπογράμμιση εμφανίζονται το εναρκτήριο κωδικόνιο και το κωδικόνιο τερματισμού, και με μπλε και πράσινο χρώμα οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Τα μπλε και πράσινα βέλη δείχνουν τις θέσεις που κόβουν τα ένζυμα. Κατά την αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκαν 100 ng του πλασμιδίου prset στο οποίο υπήρχε ήδη το γονίδιο της GFPem. Το μίγμα της αντίδρασης, καθώς και οι συνθήκες της PCR, περιγράφηκαν στην παράγραφο Β.3.1. Επιπλέον προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης DMSO 10 % v/v, ώστε να εμποδίσει τυχόν αναδιπλώσεις του μεγάλου εκκινητή. Παρόλα αυτά ήταν δύσκολο να παρεμποδιστεί πλήρως η αναδίπλωση του εκκινητή και στο γονίδιο της GFPem προστέθηκε η αλληλουχία για μόνο 12 επιπλέον αμινοξέα αντί για 31, όπως αναμενόταν. Σχεδιάστηκε, λοιπόν, δεύτερος εκκινητής για να συμπληρώσει 18 ακόμα αμινοξέα στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Ο εκκινητής RP GFPem 2 είχε μήκος 80 bp και αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο του γονιδίου της GFPem με τα επιπλέον 12 αμινοξέα. RP GFPem 2 τέλος γονιδίου 5 gct TAA AgC TTC gcc TTC TCg TTC AgT AAA gtc TTA Acg CgT gcg HindIII ACA TCg CgA CgC Acg CCT ACA Cgg TCA gcc TTg CC 3 Χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές FP GFPem και RP GFPem 2. Η PCR έγινε στις ίδιες συνθήκες με την πρώτη φορά και το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Το προϊόν (GFPem + 31aa) εμφανίστηκε στα 800 bp περίπου, όπως αναμενόταν και εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen. Γ.1.4.2. Κλωνοποίηση του GFPem + 31aa στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας Το προϊόν (GFPem + 31aa) που προέκυψε από την PCR, μετά τον καθαρισμό του από την πηκτή αγαρόζης, κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr-blunt χρησιμοποιώντας το Zero Blunt PCR ligation kit (Παράγραφος Β.3.6.3). Η αντίδραση 107

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ της λιγάσης έλαβε χώρα στους 20 C για 30 min. Ο χάρτης του πλασμιδίου pcr-blunt φαίνεται στο παράρτημα (σελ. 165). Από το μίγμα της αντίδρασης της λιγάσης χρησιμοποιήθηκαν 5 μl για μετασχηματισμό επιδεκτικών κυττάρων TOP10 από E.coli. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα απλώθηκαν σε τρυβλία παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη (50 μg/ml) και αναπτύχθηκαν στους 37 C. Από τις αποικίες που προέκυψαν επιλέχτηκε ένας αντιπροσωπευτικός αριθμός και ακολούθησε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA (pcr-blunt + GFPem + 31aa) με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep). Για να επιβεβαιωθεί ότι το κομμάτι που κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr- Blunt είναι το επιθυμητό έγινε έλεγχος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του (DNA sequencing) όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.3.10 και επιβεβαιώθηκε η εισαγωγή της αλληλουχίας των 31 αμινοξέων και όλων των θέσεων αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Επίσης δεν βρέθηκαν ανεπιθύμητες μεταλλάξεις στην αλληλουχία του γονιδίου της GFPem. Μετά την επιβεβαίωση της ορθότητας της αλληλουχίας της GFPem + 31aa, έγινε επώαση του pcr-blunt + GFPem + 31aa με τα ένζυμα περιορισμού BamHI και HindIII για 3 ώρες στους 37 C. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1 % w/v και εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμάτι GFPem + 31aa. Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το πλασμίδιο prset/emgfp, που περιείχε το αρχικό γονίδιο της GFPem χωρίς τα επιπλέον αμινοξέα, για 3 ώρες στους 37 C. Από την πηκτή αγαρόζης εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμένο πλασμίδιο χωρίς το γονίδιο της GFPem. Κατόπιν το κομμάτι GFPem + 31aa κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο prset μεταξύ των θέσεων περιορισμού BamHI και HindIII, με τη βοήθεια της T4 DNA λιγάσης. Γ.1.4.3. Εισαγωγή κωδικονίου amber και His-tag στο αμινοτελικό άκρο της GFPem Μετά την κλωνοποίηση του κομματιού GFPem + 31aa στο πλασμίδιο prset προέκυψε το γονίδιο GFPem 1 που φαίνεται παρακάτω: 108

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ (Γονίδιο GFPem 1) Με βάση το γονίδιο αυτό σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές, οι οποίοι υβριδίζονται στις περιοχές που υποδεικνύουν τα κίτρινα βέλη στο παραπάνω σχήμα. Ο εκκινητής FP Xba Amber είχε μήκος 38 bp, με αλληλουχία όμοια με το 5 άκρο της ενδιάμεσης περιοχής που κωδικοποιεί για τα 30-40 αμινοξέα. Επίσης πριν από την αλληλουχία που υβριδίζεται προστέθηκαν κάποιες βάσεις, για να δημιουργηθεί η θέση αναγνώρισης του ενζύμου XbaI και η τριπλέτα TAG (amber stop codon). FP Xba Amber amber stop codon 5 CgT CTA gaa TgT Agg gta Tgg CTA gca TgA CTg gtg ga 3 XbaI Ο εκκινητής RP His Nco είχε μήκος 50 bp με αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο της ενδιάμεσης περιοχής που κωδικοποιεί για τα 30-40 αμινοξέα. Επίσης προστέθηκαν κάποιες βάσεις για να εισαχθούν έξι ιστιδίνες (6xHis ή His-tag) και η θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού NcoI. RP His Nco His-tag 5 gcc ATg gtg TgA Tgg TgA Tgg TgA Tgg gcg AAT TCg gat CCC CAT CgA NcoI TC 3 Με κόκκινη υπογράμμιση εμφανίζονται το κωδικόνιο amber και η ουρά έξι ιστιδινών και με μπλε χρώμα οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Τα μπλε βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις που κόβουν τα ένζυμα. Η PCR έγινε στις ίδιες συνθήκες που έχουν περιγραφεί στην παράγραφο Β.3.1 και το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 2% w/v. Το προϊόν (amber-31aa- 109

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ His) εμφανίστηκε στα 125 bp περίπου, όπως αναμενόταν και εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen. Γ.1.4.4. Κλωνοποίηση του amber-31aa-his στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας Το προϊόν της PCR (amber-31aa-his) επίσης κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr-blunt χρησιμοποιώντας το Zero Blunt PCR ligation kit. Με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίστηκαν επιδεκτικά κύτταρα TOP10 από E.coli. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα απλώθηκαν σε τρυβλία παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη (50 μg/ml) και αναπτύχθηκαν στους 37 C. Από τις αποικίες που προέκυψαν ακολούθησε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA (pcr-blunt + amber- 31aa-His) με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep). Για να επιβεβαιωθεί ότι το κομμάτι που κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr- Blunt είναι το επιθυμητό έγινε έλεγχος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του (DNA sequencing). Βρέθηκε ότι εισήχθησαν όλες οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού, το κωδικόνιο amber και η ουρά έξι ιστιδινών Έπειτα έγινε επώαση του pcr-blunt + amber-31aa-his με τα ένζυμα περιορισμού XbaI και NcoI για 3 ώρες στους 37 C και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2 % w/v, από όπου εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμάτι amber-31aa-his. Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το πλασμίδιο prset, που περιείχε το γονίδιο GFPem 1, για 3 ώρες στους 37 C. Από την πηκτή αγαρόζης εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμένο πλασμίδιο χωρίς το κομμάτι μεταξύ των θέσεων XbaI και NcoI. Κατόπιν το amber-31aa-his εισήχθη στο παραπάνω πλασμίδιο μεταξύ των θέσεων περιορισμού XbaI και NcoI, με τη βοήθεια της T4 DNA λιγάσης. Έτσι, προέκυψε το γονίδιο GFPem 2, που είναι και το απαιτούμενο γονίδιο με την αλληλουχία της GFPem. (Γονίδιο GFPem 2) 110

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Γ.1.4.5. Απομόνωση γονιδίου ουβικιτίνης Το γονίδιο της πρωτεΐνης ουβικιτίνης ήταν ήδη κλωνοποιημένο στο πλασμίδιο pxhis-2xubi Amb2, μία ευγενική προσφορά της εταιρείας RiNA. Όπως φανερώνει και το όνομα του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου, υπάρχουν δύο ουβικιτίνες στη σειρά και ανάμεσά τους βρίσκεται θέση αναγνώρισης του ενζύμου XhoI. Επίσης πριν την πρώτη ουβικιτίνη υπάρχει ένα κωδικόνιο amber και ακολουθεί μία ουρά έξι ιστιδινών. Το γονίδιο Ubi 1 φαίνεται σχηματικά παρακάτω: (Γονίδιο Ubi 1) Χρειάζεται να απομακρυνθεί το κωδικόνιο amber και στη θέση του να εισαχθεί η θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού NcoI. Επίσης, πρέπει να απομονωθεί μόνο μία εκ των δύο ουβικιτινών. Για αυτό πριν την PCR κόπηκε το γονίδιο Ubi 1 με το ένζυμο περιορισμού XhoI. Σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές με βάση τα παραπάνω. Ο εκκινητής FP Nco His Ubi είχε μήκος 64 bp και αλληλουχία όμοια με το 5 άκρο του γονιδίου Ubi 1, όμως αντί για την τριπλέτα amber περιείχε τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού NcoI. FP Nco His Ubi His-tag 5 CgC CAT ggt gag ggg ATC gca TCA CCA TCA CCA TCA Cgg ATC CTA NcoI BamHI TTT Agg TgA CAC TAT AgA A 3 Ο εκκινητής RP XhoI Ubi είχε μήκος 32 bp με αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο της ουβικιτίνης. Ο εκκινητής αυτός υβριδίζεται στο 3 άκρο και των δύο ουβικιτινών, όμως ο εκκινητής FP Nco His Ubi υβριδίζεται στο 5 άκρο μόνο της πρώτης, οπότε απομονώνεται μόνο η πρώτη ουβικιτίνη. 111

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ RP XhoI Ubi 5 CgC TCg AgC CCA CCT CTg AgA Cgg AgC ACC Ag 3 XhoI Η PCR έγινε στις συνθήκες που έχουν περιγραφεί στην παράγραφο Β.3.1 και το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 2% w/v. Το προϊόν (His-Ubi) εμφανίστηκε στα 315 bp περίπου, όπως αναμενόταν και εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen. Γ.1.4.6. Κλωνοποίηση του His-Ubi στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας Το προϊόν της PCR (His-Ubi) κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr-blunt χρησιμοποιώντας το Zero Blunt PCR ligation kit και όπως και προηγουμένως μετασχηματίστηκαν κύτταρα TOP10 και αναπτύχθηκαν στους 37 C. Από τις αποικίες που προέκυψαν απομονώθηκε το πλασμιδιακό DNA (pcr-blunt + His-Ubi) με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep). Έπειτα έγινε έλεγχος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (DNA sequencing) και βρέθηκε ότι το κομμάτι είναι το επιθυμητό. Ακολούθησε επώαση του pcr-blunt + His-Ubi με τα ένζυμα περιορισμού NcoI και XhoI για 3 ώρες στους 37 C και από την πηκτή αγαρόζης εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμάτι His-Ubi. Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το πλασμίδιο prset, που περιείχε το γονίδιο GFPem 2, για 3 ώρες στους 37 C. Από την πηκτή αγαρόζης εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμένο πλασμίδιο χωρίς την GFPem. Κατόπιν το His-Ubi κλωνοποιήθηκε στο παραπάνω πλασμίδιο μεταξύ των θέσεων περιορισμού NcoI και XhoI, με τη βοήθεια της T4 DNA λιγάσης. Έτσι, προέκυψε το γονίδιο Ubi 2, που είναι και το απαιτούμενο γονίδιο με την αλληλουχία της ουβικιτίνης. Υπάρχουν δύο His-tag, ένα πριν και ένα μετά τη θέση περιορισμού NcoI, αλλά αυτό δεν επηρεάζει την επιθυμητή λειτουργία του γονιδίου. (Γονίδιο Ubi 2) 112

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Γ.1.5. Ετοιμασία συστήματος για μέτρηση με οπτικές λαβίδες Γ.1.5.1. Σύνδεση ριβοσωμάτων σε χάντρες στρεπταβιδίνης Η στρεπταβιδίνη είναι μια τετραμερής πρωτεΐνη με τέσσερις θέσεις σύνδεσης για βιοτίνη, η οποία είναι παρόμοια με την αβιδίνη στη μοριακή δομή της. Η αλληλεπίδραση μεταξύ στρεπταβιδίνης και βιοτίνης είναι ένας από τους ισχυρότερους μη ομοιοπολικούς δεσμούς (Ka=10 15 έναντι 10 7-10 11 για την αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου). Αυτή η συμπληρωματικότητα, που συνδυάζεται με το μικρό μέγεθος της βιοτίνης (MW=244.3), δίνει ένα ιδανικό σύστημα για σύνδεση αγχιστείας, με πολυάριθμες εφαρμογές. Επιπλέον, η στρεπταβιδίνη έχει το πλεονέκτημα έναντι της αβιδίνης ότι στερείται τους υδρογονάνθρακες που μπορούν να οδηγήσουν σε μη ειδικές αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες. Χρησιμοποιήθηκαν χάντρες SiO 2 (silica) διαμέτρου 3 μm, οι οποίες ήταν επικαλυμμένες με στρεπταβιδίνη και βρίσκονταν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico (Παράγραφος Β.2.8). Το Tico σε αυτή την περίπτωση περιέχει 150 mm CH 3 COOΝΗ 4 αντί για 30 mm, επειδή ευνοεί την ταχύτερη σύνδεση μεταξύ βιοτίνης και στρεπταβιδίνης. Στις χάντρες προστέθηκαν ριβοσώματα από κύτταρα AVB101 σε 100πλάσια συγκέντρωση, τα οποία είχαν ενσωματωμένη την βιοτινυλιωμένη L4. Το αμινοτελικό άκρο της L4, στο οποίο βρίσκεται η βιοτίνη, εντοπίζεται στην επιφάνεια του ριβοσώματος και είναι δυνατό να αντιδράσει. Η αντίδραση παρέμεινε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και έπειτα στους 4 C για 12-16 ώρες. Μετά από σύντομη φυγοκέντρηση και αφού απομακρύνθηκε το υπερκείμενο, στις χάντρες προστέθηκε διάλυμα βιοτίνης (300 μμ τελική συγκέντρωση), έτσι ώστε να παρεμποδιστούν οι ελεύθερες στρεπταβιδίνες στην επιφάνεια των χαντρών. Η αντίδραση έλαβε χώρα για 1 ώρα στους 4 C και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε μετά από σύντομη φυγοκέντρηση. Γ.1.5.2. In vitro μεταγραφή-μετάφραση χωρίς την προσθήκη ιστιδίνης Τα ριβοσώματα, που έχουν συνδεθεί στις χάντρες SiO 2, είναι ικανά να συνθέσουν πρωτεΐνες in vitro, αν προστεθούν όλοι οι απαραίτητοι παράγοντες για την μεταγραφή και την μετάφραση. Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται όλα τα απαραίτητα συστατικά για την in vitro συζευγμένη μεταγραφή-μετάφραση (Πίνακας 1). 113

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Πίνακας 1 Το σύστημα είναι το ίδιο που περιγράφηκε προηγουμένως (Παράγραφος Β.2.18), αλλά για πειραματική ευκολία πολλά από τα συστατικά ήταν ήδη αναμεμιγμένα. Το S100-Mix περιείχε όλα τα απαραίτητα ένζυμα. Tο T-Mix περιείχε το ρυθμιστικό διάλυμα καθώς και όλα τα αμινοξέα εκτός της ιστιδίνης. Το E-Mix ήταν το ενεργειακό μίγμα και το trna bulk περιείχε όλα τα απαραίτητα trna μόρια. Το πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το prset, που περιείχε είτε το γονίδιο GFPem 2 είτε το γονίδιο Ubi 2, και το οποίο είχε προηγουμένως κοπεί με το ένζυμο HindIII, ώστε να μην περιέχει το κωδικόνιο τερματισμού. Η πρωτεΐνη, όμως, παρά την απουσία σήματος τερματισμού, μπορεί να απελευθερωθεί από το ριβόσωμα, λόγω του tmrna μηχανισμού που περιγράφηκε στην εισαγωγή (Παράγραφος Α.1.5.4). Για αυτό το λόγο, σχεδιάστηκε ένα ολιγονουκλεοτίδιο με αλληλουχία συμπληρωματική με αυτή του tmrna (AntiSense tmrna, AS-tmRNA), ώστε να υβριδιστεί μαζί του και να το παρεμποδίσει να δράσει στο ριβόσωμα. Η αλληλουχία βάσεων του AS-tmRNA φαίνεται παρακάτω: AS-tmRNA 5 ATC AgC gtt TgC TgC TTT TgA TgC gaa ATC gtc gaa TT 3 Τέλος προστέθηκε και ένα τροποποιημένο trna Lys, ώστε να αναγνωρίζει το κωδικόνιο amber, όπου η λυσίνη ήταν βιοτινυλιωμένη. Σύμφωνα με την τεχνική του 114

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ κατασταλτικού trna (Παράγραφος Β.2.19), κατά τη βιοσύνθεση της πρωτεΐνης, θα ενσωματωθεί η βιοτινυλιωμένη λυσίνη στη θέση της τριπλέτας amber. Το μίγμα που φαίνεται στον πίνακα 1, με συνολικό όγκο 25 μl, προστέθηκε στις χάντρες με τα συνδεμένα ριβοσώματα και η αντίδραση της βιοσύνθεσης έλαβε μέρος για 20-30 min στους 37 C. Λόγω της απουσίας του αμινοξέος ιστιδίνη, η σύνθεση προχώρησε μέχρι την εμφάνιση της ουράς έξι ιστιδινών και σε εκείνο το σημείο σταμάτησε. Τα αμινοτελικά, όμως, άκρα των πρωτεϊνών με την ενσωματωμένη βιοτίνη είχαν ήδη ξεπροβάλει από την έξοδο του ριβοσωμικού καναλιού. Ακολούθησε επώαση του μίγματος με διάλυμα στρεπταβιδίνης (100 μg/ml), η οποία αντιδρά με τα βιοτινυλιωμένα άκρα των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων. Η αντίδραση έλαβε χώρα για 1-2 ώρες στους 4 C. Κατόπιν, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με σύντομη φυγοκέντρηση και οι χάντρες επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico. Γ.1.5.3. Εισαγωγή συστήματος στο θάλαμο των οπτικών λαβίδων και σύλληψη της νεοσυντιθέμενης πρωτεϊνικής αλυσίδας με λαβή DNA Οι χάντρες SiO 2 με τα συνδεδεμένα ριβοσώματα και στρεπταβιδίνη στα αμινοτελικά άκρα των πρωτεϊνικών αλυσίδων εισήχθησαν στο θάλαμο των οπτικών λαβίδων. Ο θάλαμος δέχεται γύρω στα 30 μl δείγματος και η εισαγωγή επιτυγχάνεται με ένα αυτόματο σύστημα βαλβίδων (Παράγραφος Α.2.6.3). Μετά την εισαγωγή των χαντρών στο θάλαμο, κάποια από αυτές παγιδεύτηκε στις οπτικές λαβίδες. Καθοδηγώντας το μικροσιφώνιο με πιεζοκρυστάλλους προς τις οπτικές λαβίδες, η χάντρα στερεώθηκε στο μικροσιφώνιο με αναρρόφηση. Οι υπόλοιπες χάντρες ξεπλύθηκαν με συνεχή ροή ρυθμιστικού διαλύματος. Κατόπιν, στο θάλαμο εισήχθησαν χάντρες πολυστυρενίου, στις οποίες είχαν προσδεθεί μόρια DNA, με βιοτινυλιωμένα άκρα. Τα μόρια DNA παίζουν το ρόλο λαβών, οι οποίες αλληλεπιδρούν με τη στρεπταβιδίνη των πρωτεϊνικών αλυσίδων και περιορίζουν τις μη ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των χαντρών (Παράγραφος Β.2.16). Όπως και προηγουμένως, κάποια από τις χάντρες αυτές παγιδεύτηκε στις οπτικές λαβίδες. Η ροή των χαντρών σταμάτησε και με κίνηση του μικροσιφωνίου προς την παγιδευμένη, από τις οπτικές λαβίδες, χάντρα πολυστυρενίου έγινε προσπάθεια σύλληψης της πρωτεϊνικής αλυσίδας με την DNA λαβή, μέσω του δεσμού βιοτίνηςστρεπταβιδίνης. 115

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Για να ελεγχθεί κάθε φορά αν η σύλληψη της πρωτεϊνικής αλυσίδας ήταν επιτυχημένη, το μικροσιφώνιο απομακρύνεται σιγά σιγά και παρατηρείται αν μετατοπίζεται από τη θέση της η χάντρα πολυστυρενίου. Παρατηρήθηκε ότι η ειδική σύνδεση μεταξύ DNA και πολυπεπτιδικής αλυσίδας επιτυγχάνεται σε ένα εύρος δυνάμεων 6-20 pn, με μέσο όρο γύρω στα 10 pn. Άσκηση μεγαλύτερων δυνάμεων οδήγησε σε ρήξη της σύνδεσης (Εικόνα Γ.7). Εικόνα Γ.7. Διάγραμμα δύναμης σε συνάρτηση με την μετατόπιση από το κέντρο της οπτικής παγίδας. Με εφαρμογή σταθερής δύναμης μικρότερης από 10 pn, παρατηρείται ότι η σύνδεση διατηρείται (Εικόνα Γ.8). Εικόνα Γ.8. Διάγραμμα απομάκρυνσης από το κέντρο της οπτικής παγίδας σε συνάρτηση με το χρόνο για σταθερή δύναμη 6.5 pn. 116

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Γ.2. ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ ΜΕ FRET Γ.2.1. Βιοτινυλίωση και απομόνωση ριβοσωμάτων από μεταλλαγμένα στελέχη που τους λείπουν οι πρωτεΐνες L24 και L29 Γ.2.1.1. Έλεγχος μεταλλαγμένων στελεχών Τα μεταλλαγμένα στελέχη E.coli, από τα οποία έλειπε είτε η πρωτεΐνη L24 είτε η πρωτεΐνη L29, μεγάλωσαν σε θρεπτικό υλικό dyt χωρίς αντιβιοτικά στους 37 C και στη συνέχεια απομονώθηκαν ριβοσώματα. a b c d Εικόνα Γ.9. Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων πρωτεϊνών μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας (ΤΡ50) από E.coli. (a) Πηκτή με τις θέσεις των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, (b) Πηκτή με control ΤΡ50 από κύτταρα E.coli που περιέχουν και την L24 και την L29, (c) Πηκτή με ΤΡ50 από το μεταλλαγμένο στέλεχος χωρίς την L24, όπου φαίνεται μόνο η L29 και (d) Πηκτή με ΤΡ50 από το μεταλλαγμένο στέλεχος χωρίς την L29, όπου φαίνεται μόνο η L24. 117

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Για να ελεγχθεί η απουσία των πρωτεϊνών L24 ή L29 από τα ριβοσώματα έγινε ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων (2D SDS-PAGE). Στην πρώτη διάσταση, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σύμφωνα με το φορτίο τους, ενώ στη δεύτερη διάσταση σύμφωνα με το μέγεθός τους. Το σύνολο των πρωτεϊνών των μεγάλων υπομονάδων των ριβοσωμάτων (ΤΡ50) ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή δύο διαστάσεων (Εικόνα Γ.9). Από τις ηλεκτροφορήσεις δύο διαστάσεων προέκυψε ότι τα μεταλλαγμένα στελέχη από E.coli, πράγματι στερούνται των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 ή L29, αντίστοιχα. Γ.2.1.2. Μεταφορά του συστήματος βιοτινυλίωσης στα μεταλλαγμένα στελέχη Για την απομόνωση βιοτινυλιωμένων ριβοσωμάτων, που τους έλειπαν είτε η L24 είτε η L29, κρίθηκε απαραίτητη η μεταφορά του συστήματος της βιοτινυλίωσης από το στέλεχος AVB101 στα μεταλλαγμένα στελέχη. Κύτταρα AVB101, τα οποία περιείχαν μόνο το πλασμίδιο με το γονίδιο του ενζύμου BirA (pbiracm), αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό dyt με χλωραμφαινικόλη (10 μg/ml), για να χρησιμοποιηθούν ως control. Μετασχηματισμένα κύτταρα AVB101, με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 που έφερε το γονίδιο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης L4 (pan5 + L4 / pbiracm), αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό dyt με αμπικιλλίνη (100 μg/ml) και χλωραμφαινικόλη (10 μg/ml). Από τις παραπάνω καλλιέργειες απομονώθηκε το πλασμίδιο pbiracm και μίγμα των δύο πλασμιδίων pan5 + L4 / pbiracm, με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep). Τα μεταλλαγμένα στελέχη επίσης αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό dyt χωρίς αντιβιοτικά και κατόπιν κατέστησαν επιδεκτικά με την μέθοδο του CaCl 2 για άμεση χρήση (Παράγραφος Β.3.7.1). Ακολούθησε μετασχηματισμός των επιδεκτικών κυττάρων είτε με το πλασμίδιο pbiracm είτε με το μίγμα των δύο πλασμιδίων. Από τις αποικίες που προέκυψαν στα τρυβλία αναπτύχθηκαν κύτταρα από τα δύο μεταλλαγμένα στελέχη, που περιείχαν είτε μόνο το ένα πλασμίδιο είτε το μίγμα των δύο πλασμιδίων, με τα αντίστοιχα αντιβιοτικά. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει ~0.6. Στο σημείο αυτό προστέθηκαν βιοτίνη και IPTG σε τελικές συγκεντρώσεις 50 μμ και 1 mm αντίστοιχα. Η επώαση συνεχίστηκε για 3 ώρες στην ίδια θερμοκρασία. Κρατήθηκε από κάθε δείγμα 1 ml πριν από την επαγωγή και 1 ml μετά την τρίωρη 118

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET επώαση και ακολούθησε λύση των κυττάρων με διαδοχικό πάγωμα-ξεπάγωμα και προσθήκη 6Μ ουρίας, Tris-HCl ph 7.5. Γ.2.1.3. Έλεγχος βιοτινυλίωσης της L4 στα μεταλλαγμένα στελέχη Για να ελεγχθεί η βιοτινυλίωση της L4 στα μεταλλαγμένα στελέχη έγινε επίσταξη, σε μεμβράνη PVDF, μικρής ποσότητας κυττάρων μετά την λύση τους με 6Μ ουρία (Dot Blot). Ως αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αλκαλική φωσφατάση, η οποία δίνει μία χρωμοαντίδραση παρουσία βιοτίνης. Για το Dot Blot χρειάστηκε ένα δείγμα από κάθε μεταλλαγμένο στέλεχος με το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων μετά την επαγωγή (μίγμα πλασμιδίων) και ένα δέιγμα control από κάθε στέλεχος με το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων μετά την επαγωγή (μόνο πλασμίδιο pbiracm) όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.7.2. Πράγματι, εμφανίστηκαν κηλίδες στα μεταλλαγμένα στελέχη με το μίγμα των πλασμιδίων ενώ στα control δεν εμφανίστηκε τίποτα. Αυτό δείχνει ότι τα μεταλλαγμένα στελέχη με τα δύο πλασμίδια βιοτινυλιώνουν την L4 ριβοσωμική πρωτεΐνη, ενώ τα αντίστοιχα στελέχη που περιέχουν μόνο το ένζυμο, αν και ικανά για βιοτινυλίωση δεν βιοτινυλιώνουν τίποτα, καθώς λείπει το πλασμίδιο με το 14-μερές πεπτίδιο. Στη συνέχεια το σύστημα βιοτινυλίωσης μεταφέρθηκε επιτυχώς στα μεταλλαγμένα στελέχη και ήταν εξ ίσου λειτουργικό με τα αρχικά κύτταρα AVB101 (Εικόνα Γ.10). -L24 κύτταρα control (μόνο πλασμίδιο pbiracm) -L24 κύτταρα (μίγμα πλασμιδίων) -L29 κύτταρα control (μόνο πλασμίδιο pbiracm) -L29 κύτταρα (μίγμα πλασμιδίων) Εικόνα Γ.10. Dot Blot σε μεμβράνη PVDF. Ολικό εκχύλισμα από κύτταρα AVB101 μετά από επαγωγή και βιοτινυλίωση. Τα control δεν εμφανίζουν κηλίδες ενώ τα δείγματα με τα δύο πλασμίδια εμφανίζουν. 119

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Γ.2.1.4. Απομόνωση ριβοσωμάτων από μεταλλαγμένα στελέχη μετασχηματισμένα με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4 Από 4.5 gr μεταλλαγμένων κυττάρων, που τους λείπει είτε η L24 είτε η L29, μετασχηματισμένων με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pan5 + L4 απομονώθηκαν 70S ριβοσώματα. Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε παρουσία των αντιβιοτικών αμπικιλλίνη και χλωραμφαινικόλη στους 37 C. Σε απορρόφηση Α 600 ~0.6 προστέθηκαν IPTG (1 mm) και βιοτίνη (50 μμ). Η συλλογή των κυττάρων έγινε 3 ώρες μετά την επαγωγή σε απορρόφηση Α 600 ~1.2. Κατά αυτό τον τρόπο και σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα βιοτινυλιώνεται η L4 ριβοσωμική πρωτεΐνη και κατόπιν ενσωματώνεται στα ριβοσώματα που τους λείπει είτε η L24 είτε η L29. Γ.2.2. Έκφραση και σήμανση ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 και L29 Γ.2.2.1. Εισαγωγή μετάλλαξης στα γονίδια των πρωτεϊνών L24 και L29 Η σήμανση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 και L29 με φθορισμοφόρο σε συγκεκριμένη θέση μπορεί να επιτευχθεί μέσω του αμινοξέος κυστεΐνη. Καμμία από τις δύο πρωτεΐνες δεν περιείχε το αμινοξύ κυστεΐνη, οπότε χρειάστηκε να εισαχθεί με μετάλλαξη στα γονίδια των πρωτεϊνών. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το χρωμοσωμικό DNA από στελέχη XL1 του E.coli. Με βάση τη γνωστή αλληλουχία του γονιδίου της πρωτεΐνης L24 από E.coli (Wittmann-Liebold 1979; Cerretti et al. 1983), σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές για την απομόνωσή του και ένας επιπλέον για την εισαγωγή της μετάλλαξης. Ο εκκινητής FP Nde His L24 είχε μήκος 48 bp, με αλληλουχία όμοια με το 5 άκρο του γονιδίου της L24. Επίσης προστέθηκαν κάποιες βάσεις, για να δημιουργηθεί η θέση αναγνώρισης του ενζύμου NdeI και αμέσως μετά από το εναρκτήριο κωδικόνιο ATG εισήχθει η αλληλουχία για His-tag. FP Nde His L24 αρχή γονιδίου L24 His-tag 5 gcc ATA TgC ACC ATC ACC ATC ACC ATg CAg CgA AAA TCC gtc gtg NdeI ATg 3 120

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Ο εκκινητής RP Hind Nhe L24 είχε μήκος 42 bp με αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο του γονιδίου της L24. Επίσης δημιουργήθηκαν οι θέσεις αναγνώρισης για τα ένζυμα περιορισμού HindIII και NheI. RP Hind Nhe L24 τέλος γονιδίου L24 5 gca AgC TTT CAg CTA gcc TTg ATA gtt TCg CTg TTA gac TTg 3 HindIII NheI Ο εκκινητής της μετάλλαξης FP I58C L24 είχε μήκος 25 bp και εισήγαγε την τριπλέτα TGC, που κωδικοποιεί για κυστεΐνη. FP I58C L24 κωδικόνιο ιστιδίνης 5 CCg ggt ggc TgC gtt gaa AAA gaa g 3 Με κόκκινη υπογράμμιση εμφανίζονται το εναρκτήριο κωδικόνιο, το κωδικόνιο τερματισμού και το κωδικόνιο της μετάλλαξης, ενώ με διπλή πράσινη υπογράμμιση εμφανίζεται το His-tag. Με μπλε χρώμα είναι οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Τα μπλε βέλη δείχνουν τις θέσεις που κόβουν τα ένζυμα. Αρχικά έγινε μία αντίδραση PCR για απομόνωση του γονιδίου της L24 από το χρωμοσωμικό DNA με τους δύο πρώτους εκκινητές. Το μίγμα της αντίδρασης, καθώς και οι συνθήκες της PCR περιγράφονται στην παράγραφο Β.3.1. Προέκυψε ένα προϊόν περίπου στα 300 bp, που αντιστοιχούσε στο αναμενόμενο μέγεθος του γονιδίου της L24. Το κομμάτι αυτό εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen και εισήχθη στο πλασμίδιο pcr-blunt, ώστε να ελεγχθεί η νουκλεοτιδική του αλληλουχία (DNA sequencing). Αφού επιβεβαιώθηκε η σωστή νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου της L24, αντικαταστάθηκε η ισολευκίνη στη θέση 58 από κυστεΐνη με την τεχνική του megaprimer. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της L24 που εισήχθη στο πλασμίδιο pcr-blunt. Σύμφωνα με τη τεχνική αυτή, έγινε μία αντίδραση PCR με τον εκκινητή της μετάλλαξης FP I58C L24 και τον RP Hind Nhe L24, ώστε να δημιουργηθεί το καρβοξυτελικό τμήμα με την μετάλλαξη. Αφού καθαρίστηκε αυτό 121

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET το κομμάτι από την πηκτή αγαρόζης, χρησιμοποιήθηκε ως εκκινητής (megaprimer) σε συνδυασμό με τον εκκινητή FP Nde His L24, για να δώσει το πλήρες γονίδιο με την μετάλλαξη. Το προϊόν επίσης εισήχθη στο πλασμίδιο pcr-blunt και ελέγχθηκε η νουκλεοτιδική του αλληλουχία. Βρέθηκε ότι πράγματι η μετάλλαξη εισήχθη επιτυχημένα. Επίσης με βάση τη γνωστή αλληλουχία του γονιδίου της πρωτεΐνης L29 από E.coli (Bitar 1975) σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές για την απομόνωσή του. Η τριπλέτα της μετάλλαξης ενσωματώθηκε στον ένα εκ των εκκινητών. Ο εκκινητής FP Nde His Nhe L29 είχε μήκος 59 bp, με αλληλουχία όμοια με το 5 άκρο του γονιδίου της L29. Προστέθηκαν κάποιες βάσεις, για να δημιουργηθούν οι θέσεις αναγνώρισης για τα ένζυμα NdeI και NheI. Επίσης, αμέσως μετά από το εναρκτήριο κωδικόνιο ATG εισήχθει η αλληλουχία για His-tag. FP Nde His Nhe L29 αρχή γονιδίου L29 His-tag 5 gcc ATA TgC ACC ATC ACC ATC ACC ATg CTA gca AAg CAA AAg NdeI NheI AgC TgC gtg AgA AgA 3 Ο εκκινητής RP Hind L29 A63C είχε μήκος 39 bp με αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο του γονιδίου της L29. Επίσης δημιουργήθηκε η θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού HindIII και πριν το κωδικόνιο τερματισμού η τριπλέτα που κωδικοποιεί για κυστεΐνη. RP Hind L29 A63C τέλος γονιδίου L29 5 gca AgC TTT ΤAg CΑA CCC gcc TTC TCg TTC AgT AAA gtc 3 HindIII κωδικόνιο κυστεΐνης Με κόκκινη υπογράμμιση εμφανίζονται το εναρκτήριο κωδικόνιο και, το κωδικόνιο τερματισμού, ενώ με διπλή πράσινη υπογράμμιση εμφανίζεται το His-tag και το κωδικόνιο της μετάλλαξης. Με μπλε χρώμα είναι οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Τα μπλε βέλη δείχνουν τις θέσεις που κόβουν τα ένζυμα. 122

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Η απομόνωση του γονιδίου της L29 από το χρωμοσωμικό DNA και η αντικατάσταση της αλανίνης στη θέση 63 από κυστεΐνη έγινε με την ίδια αντίδραση PCR. Το μίγμα της αντίδρασης, καθώς και οι συνθήκες της PCR περιγράφονται στην παράγραφο Β.3.1. Προέκυψε ένα προϊόν περίπου στα 190 bp, που αντιστοιχούσε στο αναμενόμενο μέγεθος του γονιδίου της L29. Το κομμάτι αυτό εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen και εισήχθη στο πλασμίδιο pcr-blunt, ώστε να ελεγχθεί η νουκλεοτιδική του αλληλουχία (DNA sequencing). Βρέθηκε ότι το γονίδιο είχε τη σωστή νουκλεοτιδική αλληλουχία και ότι η τριπλέτα της κυστεΐνης εισήχθη επιτυχώς. Γ.2.2.2. Κλωνοποίηση των γονιδίων των πρωτεϊνών L24 I58C και L29 A63C στο πλασμίδιο pet27b Τα μεταλλαγμένα γονίδια L24 I58C και L29 A63C, μετά το καθαρισμό τους από την πηκτή αγαρόζης, επωάστηκαν με τα ένζυμα περιορισμού NdeI και HindIII, οι θέσεις αναγνώρισης των οποίων βρίσκονταν στα δύο άκρα των γονιδίων. Η επώαση έγινε στους 37 C για 3 ώρες και ο καθαρισμός από τα ένζυμα και τα άλατα της αντίδρασης έγινε με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της Qiagen. Το πλασμίδιο pet27b επωάστηκε με τα ίδια ένζυμα περιορισμού στους 37 C για 3 ώρες και προέκυψε ένα γραμμικό κομμάτι, το οποίο καθαρίστηκε με το σύστημα Qiaquick PCR Purification Kit της Qiagen. Ο χάρτης περιορισμού του πλασμιδίου δίνεται στο παράρτημα (βλέπε σελίδα 167). Το γραμμικό, πλέον, πλασμίδιο αποφωσφορυλιώθηκε με τη φωσφατάση CIAP (στα 5 -άκρα του) και η κλωνοποίηση του κάθε γονιδίου στο πλασμίδιο έγινε με την T4 DNA λιγάση. Στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν επιδεκτικά κύτταρα ΤΟΡ10 από E.coli, απλώθηκαν σε τρυβλία παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη και αναπτύχθηκαν στους 37 C. Από τις αποικίες που προέκυψαν ακολούθησε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA (pετ27b + L24 I58C ή pετ27b + L29 A63C) με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep). Για να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη των γονιδίων στο πλασμίδιο pετ27b (θετικοί κλώνοι) ακολούθησε επώαση του απομονωμένου πλασμιδιακού DNA με τα ένζυμα περιορισμού NdeI και HindIII για 1 ώρα στους 37 C. Επειδή οι αναμενόμενες ζώνες δεν ήταν ευδιάκριτες, επαναλήφθηκε PCR στις ίδιες συνθήκες και εκμαγείο αυτή τη 123

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET φορά το πλασμιδιακό DNA που απομονώθηκε. Πράγματι στην πηκτή αγαρόζης παρατηρήθηκε προϊόν στα 300 bp και στα 190 bp, αντίστοιχα, που επιβεβαιώνει την επιτυχή κλωνοποίηση των δύο μεταλλαγμένων γονιδίων στο πλασμίδιο pετ27b. Γ.2.2.3. Υπερέκφραση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 I58C και L29 Α63C Τα δύο πλασμίδια με τα μεταλλαγμένα γονίδια των πρωτεϊνών εισήχθησαν σε κύτταρα BL21(DE3) για την υπερέκφραση των L24 I58C και L29 Α63C ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Τα κύτταρα BL21(DE3) είχαν καταστεί προηγουμένως επιδεκτικά με τη χρήση διαλυμάτων CaCl 2 (Παράγραφος Β.3.7.2) και με την εισαγωγή του πλασμιδίου pετ27b απέκτησαν ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη. Έτσι, απλώθηκαν σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό dyt και άγαρ παρουσία καναμυκίνης (50 μg/ml) και επωάστηκαν στους 37 C για 12-16 ώρες. Επιλέχτηκε ένας θετικός κλώνος για κάθε γονίδιο και μεταφέρθηκε σε σωλήνα με 4 ml θρεπτικού υλικού dyt παρουσία καναμυκίνης. Η ανάπτυξη των κυττάρων έγινε στους 37 C για 12-16 ώρες. Από την καλλιέργεια αυτή έγινε αραίωση 1:50 σε κωνικές φιάλες που περιείχαν 200 ml αποστειρωμένου dyt παρουσία καναμυκίνης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει ~0.6. Στο σημείο αυτό προστέθηκε IPTG σε τελική συγκέντρωση 1 mm και η επώαση συνεχίστηκε για 3 ώρες στην ίδια θερμοκρασία. Κρατήθηκαν δείγματα από κάθε καλλιέργεια 1 ml πριν από την επαγωγή και 1 ml μετά την τρίωρη επώαση. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση του ολικού εκχυλίσματος των κυττάρων σε πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου 20% w/v αφού προηγουμένως έγινε λύση με διαδοχικό πάγωμαξεπάγωμα και προσθήκη 6Μ ουρίας, Tris-HCl ph 7.5. Στην πηκτή εμφανίστηκαν εντονότερα οι ζώνες μετά την επαγωγή στα 12 kd και στα 7 kd, όπου αναμενόταν η L24 I58C και η L29 Α63C, αντίστοιχα (Εικόνα Γ.11). 124

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET 1 Μ 2 Μ 3 4 L24 I58C στα 12 kd L29 A63C στα 7kD Εικόνα Γ.11. SDS-ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 20% w/v ολικών εκχυλισμάτων κυττάρων BL21(DE3). Διαδρομές 1 και 2: L24 I58C πριν και μετά την επαγωγή με IPTG, Διαδρομές 3 και 4: L29 Α63C πριν και μετά την επαγωγή με IPTG. Οι υπερεκφρασμένες πρωτεΐνες σημειώνονται με βέλη. Γ.2.2.4. Σήμανση πάνω στη στήλη Ni-NTA και καθαρισμός των σημασμένων L24 I58C και L29 Α63C Η σήμανση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L24 I58C και L29 Α63C έγινε κατά τη διάρκεια του καθαρισμού τους με στήλη αγχιστείας Ni-NTA, η οποία δεσμεύει το His-tag των πρωτεϊνών. Η διαδικασία του καθαρισμού και τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν έχουν περιγραφεί στην παράγραφο Β.3.12. Η μόνη διαφορά ήταν το επιπλέον βήμα της σήμανσης πάνω στη στήλη. Ακριβώς μετά τη σύνδεση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, που περιέχουν το His-tag, πάνω στη στήλη Ni-NTA, προστέθηκε το φθορισμοφόρο Alexa633 συζευγμένο με μαλεϊμίδιο διαλυμένο σε 1 ml διαλύματος λύσης των κυττάρων. Το φθορισμοφόρο συνδέεται ειδικά με την κυστεΐνη της κάθε πρωτεΐνης. Αυτός ο τρόπος σήμανσης οδήγησε σε μεγαλύτερη απόδοση (~70 %), λόγω της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών σε μικρότερο όγκο, καθώς και του αδρού πρώτου καθαρισμού από τις υπόλοιπες πρωτεΐνες των κυττάρων, που δεν περιέχουν His-tag. Το ρυθμιστικό διάλυμα περιείχε ιμιδαζόλιο, το οποίο δεν είναι επιθυμητό και για αυτό το λόγο έγινε αλλαγή σε 10 mm Tris, ph 7.5, με χρήση στήλης PD10 (Sephadex G25). Παρακάτω φαίνονται οι δύο πρωτεΐνες L24 I58C και L29 A63C, με και χωρίς το φθορισμοφόρο Alexa633 (Εικόνα Γ.12). Οι σημασμένες πρωτεΐνες έχουν μοριακό βάρος υψηλότερο κατά 1 kd λόγω του φθορισμοφόρου. 125

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET 1 2 Μ 3 4 Μ 1 2 Μ 3 4 Μ Εικόνα Γ.12. Αριστερά: SDS-ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 20% w/v. Δεξιά: Έκθεση της πηκτής πολυακρυλαμιδίου σε υπεριώδες φως. Διαδρομές 1 και 2: L24 I58C χωρίς και με φθορισμοφόρο Alexa633, Διαδρομές 3 και 4: L29 Α63C χωρίς και με φθορισμοφόρο Alexa633. Μόνο οι σημασμένες πρωτεΐνες δίνουν σήμα στο υπεριώδες φως. Γ.2.3. Aνασυγκρότηση ριβοσωμάτων με σημασμένη την L24 ή L29 Γ.2.3.1. Ολική ανασυγκρότηση 50S υπομονάδων που τους λείπει η πρωτεΐνη L24 ή L29 με τις σημασμένες L24 I58C και L29 A63C Για τη δημιουργία 50S υπομονάδων, σημασμένων ειδικά σε συγκεκριμένη θέση των πρωτεϊνών L24 ή L29, έγινε ολική ανασυγκρότηση από 50S υπομονάδες που τους έλειπε είτε η L24 είτε η L29 με τις σημασμένες με Alexa633 L24 I58C και L29 A63C. Αρχικά, τα ριβοσώματα που απομονώθηκαν από τα μεταλλαγμένα στελέχη E.coli (Παράγραφος Γ.2.1.4) επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού και διαχωρίστηκαν στις υπομονάδες τους με zonal φυγοκέντρηση (Παράγραφος Β.2.9). Τα κλάσματα της φυγοκέντρησης, που αντιστοιχούσαν στις 50S ριβοσωμικές υπομονάδες, συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για 20 ώρες στα 140 000 g, ώστε να κατακρημνιστούν και να απομονωθούν οι 50S υπομονάδες των ριβοσωμάτων. Οι υπομονάδες αυτές ήταν βιοτινυλιωμένες στην L4 πρωτεΐνη και τους έλειπε είτε η L24 είτε η L29 πρωτεΐνη. Στη συνέχεια, απομονώθηκε το σύνολο των πρωτεϊνών από τις 50S υπομονάδες (ΤΡ50 L24 ή ΤΡ50 L29) όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.10 και από μία άλλη ποσότητα ιδίων 50S υπομονάδων από E.coli απομονώθηκε το ριβοσωμικό RNA (23S + 5S rrna) (Παράγραφος Β.2.11). Η ολική ανασυγκρότηση των 50S υπομονάδων έγινε με ανάμιξη ΤΡ50 L24 ή ΤΡ50 L29, την αντίστοιχη σημασμένη πρωτεΐνη και 23S + 5S rrna, ακολουθώντας τη διαδικασία των δύο σταδίων, που αναφέρθηκε εκτενώς (Παράγραφος Β.2.12). Οι αναλογίες που έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα στην ανασυγκρότηση των 50S υπομονάδων ήταν 0.125 eu ΤΡ50 L24 ή ΤΡ50 L29 και 0.75 eu σημασμένων L24 126

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET I58C ή L29 A63C για 0.5 Α 260 23S + 5S rrna. Κρατώντας σταθερές αυτές τις αναλογίες και αυξάνοντας τις ποσότητες 120 φορές, έγινε ολική ανασυγκρότηση μεγάλης κλίμακας. Αμέσως μετά την ανασυγκρότηση, το μίγμα της αντίδρασης φυγοκεντρήθηκε σε 20 % διάλυμα σουκρόζης, ώστε να απομονωθούν οι 50S ανασυγκροτημένες υπομονάδες. Το κυανίζον ίζημα που παρατηρήθηκε και στις δύο περιπτώσεις, δείχνει ότι οι σημασμένες πρωτεΐνες L24 I58C και L29 A63C είχαν ενσωματωθεί στις 50S υπομονάδες κατά την ανασυγκρότηση. Γ.2.3.2. Επανασύνδεση 50S ανασυγκροτημένων υπομονάδων με 30S υπομονάδες Οι 50S υπομονάδες, που απομονώθηκαν μετά την ανασυγκρότηση, έπρεπε να επανασυνδεθούν με 30S υπομονάδες, ώστε να σχηματιστούν πλήρη 70S ριβοσώματα, τα οποία θα έχουν ενσωματωμένες τις σημασμένες L24 I58C και L29 A63C. Χρησιμοποιήθηκαν 30S υπομονάδες από E.coli, οι οποίες δεν περιείχαν RNAσες και επανασυνδέθηκαν με τις ανασυγκροτημένες 50S υπομονάδες (Παράγραφος Β.2.13). Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 24 ώρες σε 10 % - 30 % σουκρόζη και συλλέχθηκαν τα κλάσματα που αντιστοιχούσαν στην κορυφή των 70S ριβοσωμάτων. Κατόπιν έγινε φυγοκέντρηση των παραπάνω κλασμάτων, ώστε να απομονωθούν τα 70S ριβοσώματα (70S recl24 και 70S recl29). Για να ελεγχθεί η ενεργότητα των 70S recl24 και 70S recl29, πραγματοποιήθηκε σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (Παράγραφος Β.2.14). Τα ανασυγκροτημένα 70S ριβοσώματα παρουσίασαν ενεργότητα ~25 % της ενεργότητας των 70S ριβοσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν ως control και είχαν απομονωθεί από στελέχη των E.coli. Γ.2.4. Τροποποίηση γονιδιακής αλληλουχίας της GFPem Γ.2.4.1. Εισαγωγή κωδικονίου amber και His-tag στο αμινοτελικό άκρο της GFPem χωρίς ενδιάμεση αλληλουχία Για τα πειράματα με FRET αρχικά είναι επιθυμητό να σταματάει η σύνθεση της πρωτεΐνης GFPem αμέσως μετά την εισαγωγή του φθορισμοφόρου-δότη στη δεύτερη θέση του αμινοτελικού άκρου, ώστε το φθορισμοφόρο να βρίσκεται ακόμα μέσα στο κανάλι του ριβοσώματος και αρκετά μακρυά από τον δέκτη για να μην δίνει σήμα FRET. 127

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Χρειάζεται δηλαδή το γονίδιο GFPem 2 (Παράγραφος Γ.1.4.4) χωρίς όμως την ενδιάμεση αλληλουχία των 30-40 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο. Με βάση το γονίδιο αυτό σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές, οι οποίοι υβριδίζονται στις περιοχές που δείχνουν τα κίτρινα βέλη στο παραπάνω σχήμα. Ο εκκινητής FP Xba Amber His Nco είχε μήκος 42 bp. Πριν από την αλληλουχία που υβριδίζεται προστέθηκαν κάποιες βάσεις, για να δημιουργηθεί η θέση αναγνώρισης του ενζύμου XbaI και η τριπλέτα TAG (amber stop codon). FP Xba Amber His Nco amber stop codon 5 TCT AgA ATg TAg CAT CAC CAT CAC CAT CAC ACC ATg gtg AgC 3 XbaI His-tag Ο εκκινητής RP GFPem 2 είχε μήκος 80 bp και αλληλουχία συμπληρωματική με το 3 άκρο του γονιδίου της GFPem και ήταν ο ίδιος που χρησιμοποιήθηκε και προηγουμένως (Παράγραφος Γ.1.4.1). RP GFPem 2 τέλος γονιδίου 5 gct TAA AgC TTC gcc TTC TCg TTC AgT AAA gtc TTA Acg CgT gcg HindIII ACA TCg CgA CgC Acg CCT ACA Cgg TCA gcc TTg CC 3 Με κόκκινη υπογράμμιση εμφανίζονται το κωδικόνιο amber και το κωδικόνιο τερματισμού, με πράσινη διπλή υπογράμμιση η ουρά έξι ιστιδινών και με μπλε χρώμα οι θέσεις αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού. Τα μπλε βέλη δείχνουν τις θέσεις που κόβουν τα ένζυμα. Η PCR έγινε στις ίδιες συνθήκες που έχουν περιγραφεί στην παράγραφο Β.3.1 και το μίγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Το προϊόν (γονίδιο 128

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET GFPem 3) εμφανίστηκε στα 900 bp περίπου, όπως αναμενόταν και εκχυλίστηκε από την αγαρόζη με τη μέθοδο καθαρισμού Qiaquick Gel Extraction Kit της Qiagen. (Γονίδιο GFPem 3) Γ.2.4.2. Κλωνοποίηση του γονιδίου GFPem 3 στο πλασμίδιο pcr-blunt και έλεγχος της νουκλεοτιδικής του αλληλουχίας Το προϊόν της PCR (γονίδιο GFPem 3) κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr- Blunt χρησιμοποιώντας το Zero Blunt PCR ligation kit και μετασχηματίστηκαν επιδεκτικά κύτταρα TOP10 από E.coli. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα απλώθηκαν σε τρυβλία παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη (50 μg/ml) και αναπτύχθηκαν στους 37 C. Από τις αποικίες που προέκυψαν ακολούθησε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με χρήση του Plasmid DNA Purification kit της Macherey-Nagel (mini prep). Για να επιβεβαιωθεί ότι το κομμάτι που κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pcr- Blunt είναι το επιθυμητό έγινε έλεγχος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του (DNA sequencing). Βρέθηκε ότι έγινε εισαγωγή όλων των θέσεων αναγνώρισης των ενζύμων περιορισμού, το κωδικόνιο amber, η ουρά έξι ιστιδινών και το κωδικόνιο τερματισμού. Ακολούθησε επώαση με τα ένζυμα περιορισμού XbaI και HindIII για 3 ώρες στους 37 C και έπειτα ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1 % w/v, από όπου εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμάτι του γονιδίου GFPem 3. Με τα ίδια ένζυμα περιορισμού επωάστηκε και το πλασμίδιο prset, που περιείχε το γονίδιο GFPem 2, για 3 ώρες στους 37 C. Από την πηκτή αγαρόζης εκχυλίστηκε η ζώνη που αντιστοιχούσε στο κομμένο πλασμίδιο χωρίς το κομμάτι μεταξύ των θέσεων XbaI και HindIII. Κατόπιν το γονίδιο GFPem 3 εισήχθη στο παραπάνω πλασμίδιο μεταξύ των θέσεων περιορισμού XbaI και HindIII, με τη βοήθεια της T4 DNA λιγάσης. 129

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Γ.2.5. Σύνδεση ριβοσωμάτων σε επιφάνειες Γ.2.5.1. Σύνδεση μη ειδικά σημασμένων ριβοσωμάτων σε επιφάνειες και σύνθεση GFPem Η προετοιμασία των επιφανειών έγινε όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.17. Στις στρεπταβιδίνες που ήταν εκτεθειμένες στην επιφάνεια προσδέθηκαν ριβοσώματα από κύτταρα AVB101 (40 nm), τα οποία είχαν βιοτινυλιωθεί in vivo στην πρωτεΐνη L4 και είχαν σημανθεί μη ειδικά με το φθορισμοφόρο Atto655. Η αντίδραση έλαβε χώρα για 10 min στους 37 C. Στη συνέχεια προστέθηκαν όλοι οι απαραίτητοι παράγοντες για την μεταγραφή και την μετάφραση, με σκοπό να συντεθεί η πρωτεΐνη GFPem και να παραμείνει προσκολλημένη στο ριβόσωμα μετά τη σύνθεσή της. Το πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το prset, που περιείχε το γονίδιο GFPem 1 και το οποίο είχε προηγουμένως κοπεί με το ένζυμο HindIII, ώστε να μην περιέχει το κωδικόνιο τερματισμού. Χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια συστατικά, που αναφέρθηκαν στον Πίνακα 1 (Παράγραφος Γ.1.5.2), με τη διαφορά ότι το T-Mix περιείχε όλα τα αμινοξέα συμπεριλαμβανομένης της ιστιδίνης και δεν προστέθηκε το BioLys-tRNA, καθώς δεν υπήρχε amber κωδικόνιο στο γονίδιο GFPem 1. Η επιμήκυνση του καρβοξυτελικού άκρου της GFPem κατά 31 αμινοξέα, εξασφάλισε τη σωστή αναδίπλωση της πλήρους πρωτεΐνης εκτός του ριβοσωμικού καναλιού, το οποίο παρεμποδίζει τον σχηματισμό τριτοταγών δομών (Etchells and Hartl 2004). Η προσθήκη του ολιγονουκλεοτιδίου AS-tmRNA, κράτησε την νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη GFPem προσκολλημένη στο ριβόσωμα μετά τη σύνθεσή της και έδωσε τη δυνατότητα να παρατηρηθεί ο φθορισμός της για εκτεταμένο χρονικό διάστημα (Εικόνα Γ.13). Λαμβάνοντας την τελική της διαμόρφωση, η GFPem σχηματίζει το χρωμοφόρο της, το οποίο αποτελείται από τα αμινοξέα Ser 65-Tyr 66-Gly 67 και αρχίζει να φθορίζει (Tsien 1998). Για την παρατήρηση των νεοσυντιθέμενων μορίων της GFPem και των σημασμένων με Αtto655 ριβοσωμάτων έγινε διέγερση στα 488 nm και στα 640 nm, αντίστοιχα. Με το μικροσκόπιο ευρέως πεδίου, που περιγράφηκε στην εισαγωγή (Παράγραφος Α.3.5), κατέστη δυνατό να φανεί ο φθορισμός μεμονωμένων ριβοσωμάτων στα 670 nm και ο φθορισμός των μορίων της GFPem στα 509 nm, με προβολή δύο διακριτών εικόνων (κόκκινο και πράσινο κανάλι εκπομπής) σε μία κάμερα CCD (Cognet et al. 2000) (Εικόνα Γ.14). 130

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Εικόνα Γ.13. Σχηματική παρουσίαση επιφάνειας με προσδεμένα ριβοσώματα, που έχουν συνθέσει GFPem, η οποία παραμένει προσκολλημένη ακόμα και μετά τη σύνθεσή της. Με κόκκινο χρώμα συμβολίζονται οι βιοτίνες και με μπλε χρώμα οι στρεπταβιδίνες. Αρχικά, έγινε διέγερση του φθορισμοφόρου των ριβοσωμάτων Atto655 με δέσμη laser στα 640 nm και καταγράφηκε ο φθορισμός στα 670 nm με την κάμερα CCD, ως φωτεινές κουκίδες (κόκκινο κανάλι εκπομπής). Κάθε κουκίδα αντιστοιχούσε σε ένα ριβόσωμα, καθώς η απόδοση της σήμανσης ήταν στο 80-90 %, που σημαίνει ότι κάθε ριβόσωμα έχει περίπου ένα φθορισμοφόρο (Εικόνα Γ.14a και Γ.14b). Πειράματα φωτόσβεσης επαλήθευσαν το γεγονός αυτό, καθώς η συντριπτική πλειοψηφία των κουκίδων έπαυε να φθορίζει σε ένα διακριτό βήμα. Κατόπιν, έγινε διέγερση των μορίων της GFPem στα 488 nm και καταγράφηκε ο φθορισμός στα 509 nm με την ίδια κάμερα CCD (πράσινο κανάλι εκπομπής). Κάθε κουκίδα αντιστοιχούσε σε ένα μόριο GFPem, η οποία παρέμενε προσκολλημένη σε ένα ριβόσωμα (Εικόνα Γ.14c). Επικάλυψη των κουκίδων που φθορίζουν στα 670 nm με αυτές που φθορίζουν στα 509 nm φανερώνει την συνεντόπιση μεμονωμένων ριβοσωμάτων με μεμονωμένα μόρια πλήρως αναδιπλωμένων και ενεργών πρωτεϊνών GFPem, τα οποία παραμένουν προσκολλημένα σε αυτά τα ριβοσώματα (Εικόνα Γ.14d). 131

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Εικόνα Γ.14. Εικόνες μικροσκοπίου ευρέως πεδίου με μεμονωμένα ριβοσώματα προσδεμένα σε επιφάνειες. (a) Πλήρης εικόνα μεμονωμένων ριβοσωμάτων σημασμένων με το φθορισμοφόρο Atto655, που φθορίζουν στα 670 nm. (b) Περιοχή της πλήρους εικόνας που σημειώνεται με το κόκκινο πλαίσιο (c) Για την ίδια περιοχή, μεμονωμένα μόρια GFPem, που φθορίζουν στα 509 nm και παραμένουν προσκολλημένα στα ριβοσώματα μετά την αντίδραση μεταγραφής-μετάφρασης (d) Υπέρθεση του κόκκινου (ριβοσώματα) και του πράσινου (GFPem) καναλιού. Οι κίτρινες κουκίδες φανερώνουν την συνεντόπιση κόκκινων και πράσινων κουκίδων. Σε μία δεύτερη σειρά πειραμάτων, παρατηρήσαμε την εμφάνιση μεμονωμένων νεοσυντιθέμενων μορίων της GFPem σε συνάρτηση με το χρόνο (Εικόνα Γ.15). Σε προσδεμένα ριβοσώματα προστέθηκαν όλοι οι απαραίτητοι παράγοντες για την in vitro μεταγραφή-μετάφραση, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Η προσθήκη έγινε in situ στην επιφάνεια με τα προσδεμένα ριβοσώματα, ενώ βρισκόταν στο μικροσκόπιο. Κάθε 15 δευτερόλεπτα γινόταν διέγερση για 2 δευτερόλεπτα με δέσμη laser στα 488 nm, με σκοπό να καταγραφεί ο χρόνος εμφάνισης κάθε κουκίδας (φθορισμός στα 509 nm), που αντιστοιχεί στην πλήρη σύνθεση και αναδίπλωση της πρωτεΐνης GFPem. Η κατανομή των χρόνων εμφάνισης μεμονωμένων μορίων GFPem δείχνει ότι ο φθορισμός εμφανίζεται σχετικά γρήγορα, μέσα στα πρώτα 5 λεπτά μετά την έναρξη 132

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET της πρωτεϊνοσύνθεσης (Εικόνα Γ.15a). Σύμφωνα με την σχετικά περιορισμένη σταθερότητα της GFPem (Shaner et al. 2005), παρατηρήθηκε στις περισσότερες περιπτώσεις φωτόσβεση μετά από περιορισμένο αριθμό εκθέσεων (Εικόνα Γ.15b). Ο χρόνος εμφάνισης του φθορισμού των μορίων της GFPem περιγράφηκε ικανοποιητικά με μία απλή εκθετική συνάρτηση (Εικόνα Γ.15c), με χαρακτηριστική σταθερά χρόνου 1/k chrom = 5.3 λεπτά, που αποτελεί έναν από τους ταχύτερους χρόνους ωρίμανσης για οποιονδήποτε τύπο GFP. Τυπικοί χρόνοι ωρίμανσης άλλων μεταλλαγμένων τύπων GFP κυμαίνονται μεταξύ 15 και 45 λεπτών, ενώ η φυσιολογική GFP ωριμάζει έπειτα από 2 ώρες. Μια λογική εξήγηση των αποτελεσμάτων χρειάζεται να λάβει υπ όψη τουλάχιστον τρεις επιμέρους διεργασίες ως μέρος της βιοσύνθεσης. Η πρώτη αφορά την επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας με ρυθμό 1-5 αμινοξέων ανά δευτερόλεπτο για συστήματα ελεύθερα κυττάρων (Fedorov and Baldwin 1997), ενώ ο αντίστοιχος ρυθμός in vivo είναι 10-20 αμινοξέα ανά δευτερόλεπτο. Για το μόριο της GFPem με 306 αμινοξέα (36aa+GFPem+31aa) όλη η διαδικασία διαρκεί από 1 έως 5 λεπτά για την πρώτη περίπτωση, ενώ για την δεύτερη μόνο 15-30 δευτερόλεπτα. Η δεύτερη διεργασία αφορά την αναδίπλωση της πρωτεΐνης. Ο ρυθμός της αναδίπλωσης είναι γνωστός από μελέτες μετυσίωσης και επαναδίπλωσης. Για κορεσμένα πρωτεϊνικά διαλύματα η αναδίπλωση διαρκεί 4-5 λεπτά (Ward and Bokman 1982; Reid and Flynn 1997), ενώ σε μελέτες μεμονωμένων μορίων διαρκεί 10-20 δευτερόλεπτα (Cannone et al. 2005). Η τελευταία διεργασία αφορά τον σχηματισμό του χρωμοφόρου (Zimmer 2002). Κατά την de novo αναδίπλωση ο σχηματισμός του χρωμοφόρου απαιτεί τουλάχιστον 5-10 λεπτά και συνεπώς καθορίζει το ρυθμό της ωρίμανσης της πρωτεΐνης (Reid and Flynn 1997). Καθώς μία απλή εκθετική συνάρτηση είναι αρκετή για να περιγράψει τον χρόνο εμφάνισης του φθορισμού των μορίων της GFPem, μόνο μία από τις παραπάνω διεργασίες είναι καθοριστική για το ρυθμό της βιοσύνθεσης. Κατά πάσα πιθανότητα ο χαρακτηριστικός χρόνος των 5.3 λεπτών, που βρέθηκε από την προσαρμογή της συνάρτησης στα πειραματικά δεδομένα, αναφέρεται στον σχηματισμό του χρωμοφόρου. Για να αναλυθεί η επίδραση των δύο πρώτων διεργασιών, της σύνθεσης και αναδίπλωσης της πρωτεΐνης, έγινε προσπάθεια περιγραφής του χρόνου εμφάνισης του φθορισμού των μορίων της GFPem με μία συνάρτηση, που περιγράφει μία μη αντιστρεπτή διεργασία δύο διαδοχικών βημάτων (Nölting 1999) 133

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET k N a k N a N t = 2 2 ( ) exp( k t) + N a k t + N k k k k exp( ( ) ( ) ) 1 2 1 2 1 2 a όπου N a είναι ο αριθμός όλων των μορίων GFP που συντίθενται de novo και k 1, k 2 είναι οι ρυθμοί του πρώτου και δεύτερου βήματος, αντίστοιχα. Το πρώτο βήμα αναφέρεται στην πρωτεϊνική σύνθεση και αναδίπλωση και το δεύτερο βήμα αναφέρεται στον σχηματισμό του χρωμοφόρου. Τα αποτελέσματα της προσαρμογής της συνάρτησης αυτής στα πειραματικά δεδομένα έδωσαν έναν μικρό χαρακτηριστικό χρόνο (1/k 1 = 0.1 λεπτά) και έναν μεγαλύτερο χαρακτηριστικό χρόνο (1/k 2 = 5.2 λεπτά). Αυτοί οι χρόνοι συμφωνούν με την προσαρμογή που είχε γίνει με την εκθετική συνάρτηση πρώτου βαθμού. Κατά συνέπεια βγαίνει το συμπέρασμα ότι η πρωτεϊνική σύνθεση και αναδίπλωση είναι ταχείες διεργασίες και διαρκούν και οι δύο μαζί λιγότερο από ένα λεπτό. Υποθέτωντας μεγαλύτερη διάρκεια (για παράδειγμα 1/k 1 = 2 λεπτά), η καμπύλη οδηγεί σε μία φανερή απόκλιση από τα πειραματικά δεδομένα (πράσινη καμπύλη στην Εικόνα Γ.15c). Τα αποτελέσματα αυτά φανερώνουν ότι η συμμεταφραστική αναδίπλωση και ωρίμανση συμβαίνουν αρκετά γρήγορα (Katranidis et al. 2009). Οι υψηλοί ρυθμοί αναδίπλωσης και ωρίμανσης κατά πάσα πιθανότητα παίζουν σημαντικό ρόλο στο να αποφεύγει το κύτταρο ανεπιθύμητες αντιδράσεις, όπως λανθασμένη αναδίπλωση ή συσσωμάτωση, καθώς και πρωτεόλυση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Με αυτό τον τρόπο βελτιώνεται η απόδοση της βιοσύνθεσης μέσα στο κύτταρο. 134

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET a b c Εικόνα Γ.15. (a) Κατανομή των χρόνων εμφάνισης φθορισμού από μεμονωμένα μόρια GFPem. (b) Εμφάνιση μεμονωμένων μορίων GFPem μετά την έναρξη της βιοσύνθεσης. Η κάθε κορυφή έντασης φθορισμού αναφέρεται σε ολοκλήρωση μιας περιοχής 2x2 εικονοστοιχείων (pixels). (c) Ο συνολικός αριθμός των μορίων της GFPem σε συνάρτηση με τον χρόνο περιγράφηκε με την απλή εκθετική συνάρτηση N(t) = N 0 (1-exp(-k chrom t)) (κόκκινη καμπύλη).το μοντέλο των δύο βημάτων περιγράφεται από την συνάρτηση Ν(t) = (k 2 N a exp(-k 1 t) / (k 1 - k 2 )) + ((-k 2 N a / (k 1 - k 2 )) - N a ) exp(-k 2 t) + N a (πράσινη καμπύλη). Γ.2.5.2. Σύνδεση ειδικά σημασμένων ριβοσωμάτων σε επιφάνειες και FRET Η προετοιμασία των επιφανειών και η σύνδεση των ριβοσωμάτων έγινε ακριβώς όπως και προηγουμένως (Παράγραφος Γ.2.5.1). Η μόνη διαφορά ήταν ότι αυτή τη φορά προσδέθηκαν ριβοσώματα ειδικά σημασμένα με το φθορισμοφόρο Alexa633 (δέκτης) στην πρωτεΐνη L24 ή στην πρωτεΐνη L29, τα οποία ήταν επίσης βιοτινυλιωμένα στην πρωτεΐνη L4. Η αντίδραση έλαβε μέρος για 10 min στους 37 C. 135

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Ακολούθησε in vitro μεταγραφή και μετάφραση ώστε να συντεθεί η πρωτεΐνη GFPem. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης έγινε και η σήμανση της GFPem με το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR (δότης) (Εικόνα Γ.16). Η καμπύλη της απόδοσης της μεταφοράς ενέργειας για το συγκεκριμένο ζεύγος φθορισμοφόρων δίνει ακτίνα Förster R 0, γύρω στα 70 Å (Εικόνα Γ.17). Εικόνα Γ.16. Αλληλεπικάλυψη φάσματος εκπομπής BODIPY-TMR με φάσμα απορρόφησης Alexa633. Εικόνα Γ.17. Απόδοση της μεταφοράς ενέργειας σε συνάρτηση με την απόσταση μεταξύ του δότη Bodipy-TMR και του δέκτη Alexa633. 136

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET Το πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το prset, που περιείχε το γονίδιο GFPem 3 και το οποίο είχε προηγουμένως κοπεί με το ένζυμο HindIII, ώστε να μην περιέχει το κωδικόνιο τερματισμού. Χρησιμοποιήθηκαν τα συστατικά που αναφέρονται στον Πίνακα 2. Προστέθηκε το trna που αναγνωρίζει το κωδικόνιο τερματισμού amber και μεταφέρει το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, αντί να απελευθερωθεί η πρωτεΐνη από το ριβόσωμα, εισάγεται η λυσίνη που μεταφέρει το φθορισμοφόρο στη συγκεκριμένη θέση σύμφωνα με όσα αναφέρθηκαν στην παράγραφο Β.2.19. Το T-Mix δεν περιείχε ιστιδίνη, με σκοπό να σταματήσει τη σύνθεση της GFPem μόλις φτάσει στο His-tag, αμέσως μετά την εισαγωγή του φθορισμοφόρου BODIPY- TMR στην δεύτερη θέση του αμινοτελικού άκρου. Ακολούθησαν πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα Tico, ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια του φθορισμοφόρου BODIPY-TMR, που δεν εισήχθη κατά την σύνθεση της πρωτεΐνης. Πίνακας 2 Αρχικά, έγινε διέγερση του δέκτη Alexa633 με δέσμη laser στα 640 nm και καταγράφηκε ο φθορισμός στα 670 nm με την κάμερα CCD, ως φωτεινές κουκίδες (Εικόνα Γ.18 Αριστερά). Κάθε κουκίδα αντιστοιχούσε σε ένα ριβόσωμα, καθώς τα ριβοσώματα ήταν ειδικά σημασμένα με ένα φθορισμοφόρο στην πρωτεΐνη L24 ή L29. Έπειτα έγινε διέγερση του δότη BODIPY-TMR με δέσμη laser στα 528 nm και 137

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ FRET καταγράφηκε ο φθορισμός στα 560 nm με την κάμερα CCD, ως φωτεινές κουκίδες (Εικόνα Γ.18 Κέντρο). Δεν παρατηρήθηκε φθορισμός του δέκτη σε αυτή τη φάση, καθώς ο δότης βρισκόταν βαθιά μέσα στο κανάλι του ριβοσώματος, κοντά στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, σε μια απόσταση 111 Å από τον δέκτη. Σε αυτή την απόσταση σύμφωνα με την καμπύλη της απόδοσης της μεταφοράς ενέργειας το FRET είναι αμελητέο (Εικόνα Γ.17). Σε αυτό το σημείο που θεωρήθηκε ως t = 0, έγινε ξανά αντίδραση in vitro μεταγραφής και μετάφρασης. Αυτή τη φορά δεν προστέθηκε φθορισμοφόρο ούτε πλασμίδιο. Προστέθηκε όμως επιπλέον το αμινοξύ ιστιδίνη (C τ = 0.35 mm) ώστε να συνεχιστεί η σύνθεση της πρωτεΐνης GFPem. Η πρωτεΐνη μετά τη σύνθεσή της παραμένει προσκολλημένη στο ριβόσωμα λόγω της έλλειψης κωδικονίου τερματισμού από το καρβοξυτελικό της άκρο, καθώς και λόγω της προσθήκης του AS-tmRNA. Η προσθήκη έγινε στην επιφάνεια με τα προσδεμένα ριβοσώματα, ενώ βρισκόταν στο μικροσκόπιο. Κάθε 10 δευτερόλεπτα γινόταν διέγερση για 1.5 δευτερόλεπτα με δέσμη laser στα 528 nm και καταγράφονταν ο φθορισμός του δότη και του δέκτη. Παρατηρήθηκε φθορισμός ορισμένων δεκτών σε διάφορες χρονικές στιγμές, ο οποίος οφειλόταν σε FRET, καθώς τα δύο φθορισμοφόρα έρχονται σε κοντινή απόσταση κατά την σύνθεση της πρωτεΐνης και την έξοδό της από το κανάλι του ριβοσώματος (Εικόνα Γ.18 Δεξιά). Με αυτό τον τρόπο ήταν δυνατόν να προσδιοριστεί η χρονική στιγμή της εμφάνισης FRET για οποιοδήποτε ζεύγος φθορισμοφόρων, με απώτερο σκοπό τον ακριβή προσδιορισμό της έντασης φθορισμού για κάθε χρονική στιγμή και τον υπολογισμό της απόστασης μεταξύ των φθορισμοφόρων. Εικόνα Γ.18. Αριστερά: Απευθείας διέγερση δέκτη (Alexa633) στα 640 nm. Κέντρο: Διέγερση δότη (BODIPY-TMR) στα 528 nm. Δεξιά: Διέγερση δότη (BODIPY-TMR) στα 528 nm κατά την διάρκεια της αντίδρασης και παρατήρηση φθορισμού δέκτη (Alexa633), χαρακτηριστική περίπτωση FRET. 138

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δ.1. ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Τα τελευταία χρόνια έχει ανοίξει μία νέα εποχή στις μηχανικές μελέτες βιομορίων καθώς αναπτύχθηκαν οπτικά και μηχανικά εργαλεία αρκετά ευαίσθητα να χειριστούν και να μετρήσουν μεμονωμένα βιολογικά μόρια. Ένας γενικός στόχος της μοριακής βιοφυσικής είναι ο μηχανικός χαρακτηρισμός της συμπεριφοράς μεμονωμένων μορίων. Ενώ παλαιότερα τα πειράματα απαιτούσαν εξαγωγή συμπερασμάτων από μετρήσεις σε διάλυμα, οι καινούριες τεχνικές επιτρέπουν άμεση παρατήρηση των παραμέτρων σε μεμονωμένα μόρια. Καθώς η τεχνική των οπτικών λαβίδων αναπτύχθηκε, είχε ολοένα και περισσότερες εφαρμογές στις βιολογικές επιστήμες. Κάποιες από αυτές είναι η παρατήρηση του βήματος μεμονωμένων μορίων κινεσίνης (Svoboda et al. 1993) και αργότερα του ρυθμού της κίνησης αυτής (Svoboda and Block 1994), οι πρώτες καμπύλες δύναμης σε συνάρτηση με την έκταση δίκλωνων μορίων DNA (Smith et al. 1996) και η παρατήρηση της κίνησης μεμονωμένης πρωτεΐνης στην εξωτερική μεμβράνη E.coli (Oddershede et al. 2002). Προηγούμενες μελέτες μεμονωμένων μορίων έκαναν χρήση της μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων (AFM) για να χαρακτηρίσουν την μηχανική μετουσίωση και αναδίπλωση πρωτεϊνών, όπως η GFP (Dietz and Rief 2004). Αν και χρήσιμη, αυτή η προσέγγιση περιοριζόταν στον χαρακτηρισμό της μετουσίωσης των πρωτεϊνών με χρήση υψηλών δυνάμεων. Η άμεση παρατήρηση της διαδικασίας αναδίπλωσης ήταν δύσκολη, εν μέρει λόγω της υψηλής σταθεράς k του βραχίονα του AFM, που ασκεί μεγάλα φορτία δυνάμεων. Αντίθετα, οι οπτικές λαβίδες, έχουν μειωμένη μηχανική σκληρότητα, οπότε μπορούν να ασκήσουν σημαντικά μικρότερα φορτία δυνάμεων και να χαρακτηρίσουν καλύτερα την μετουσίωση και στη συνέχεια αναδίπλωση μορίων RNA (Liphardt et al. 2001) και μεμονωμένων πρωτεϊνών, όπως η RNase H (Cecconi et al. 2005). Πρόσφατες μελέτες με οπτικές λαβίδες επικεντρώθηκαν στη διαδικασία της μεταγραφής με την παρατήρηση της RNA πολυμεράσης, καθώς και στην μελέτη της κίνησης ενός μορίου mrna κατά τη διάρκεια της μετάφρασης από μεμονωμένα ριβοσώματα, όπου επιβεβαιώθηκε ότι η μετάφραση δεν είναι μία συνεχής διεργασία 139

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ αλλά λαμβάνει χώρα μέσω πολλαπλών κύκλων μετακίνησης και παύσης (Wen et al. 2008). Η δική μας προσέγγιση, αν και χρησιμοποιεί παρόμοια διάταξη με την τελευταία εργασία, επικεντρώνεται στην κίνηση της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας και στην μέτρηση των δυνάμεων που ασκούνται πάνω της κατά τη διάρκεια της μετάφρασης. Το πλεονέκτημα είναι ότι μπορούμε να παρατηρήσουμε τα ίδια φαινόμενα, όπως τους κύκλους μετακίνησης και παύσης και να υπολογίσουμε το ρυθμό της βιοσύνθεσης, όμως επιπλέον μπορούμε να παρατηρήσουμε και την αναδίπλωση της πρωτείνης. Στόχος μας είναι να παρατηρήσουμε για πρώτη φορά την αναδίπλωση μιας πρωτεΐνης συμμεταφραστικά, δηλαδή κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης. Κάτι τέτοιο δεν θα ήταν δυνατό με τη χρήση AFM, διότι με την άσκηση υψηλών δυνάμεων η πολυπεπτιδική αλυσίδα θα εκριζώνονταν μέσα από το κανάλι του ριβοσώματος. Βασική προϋπόθεση για τη διεξαγωγή του πειράματος με τις οπτικές λαβίδες και τη μέτρηση των δυνάμεων που ασκούνται στη νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα ήταν η πρόσδεση των ριβοσωμάτων σε χάντρα SiO 2 και η πρόσδεση της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης σε χάντρα πολυστυρενίου. Η χάντρα SiO 2 ακινητοποιήθηκε με μία μικροπιπέτα ενώ η χάντρα πολυστυρενίου παγιδεύτηκε στις οπτικές λαβίδες. Η πρόσδεση των ριβοσωμάτων στη χάντρα SiO 2 έγινε μέσω της αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. Ο δεσμός που δημιουργείται δεν είναι ομοιοπολικός αλλά είναι πολύ ισχυρός (Ka=10 15 έναντι 10 7-10 11 για την αλληλεπίδραση αντισώματοςαντιγόνου), οπότε δεν υπάρχει κίνδυνος να σπάσει κατά την άσκηση δυνάμεων από τις οπτικές λαβίδες. Επιλέχτηκαν, λοιπόν, χάντρες SiO 2 επικαλυμμένες με στρεπταβιδίνη και αποφασίστηκε να βιοτινυλιωθεί το ριβόσωμα σε συγκεκριμένη θέση στη ριβοσωμική πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας L4. Η επιλογή της συγκεκριμένης ριβοσωμικής πρωτεΐνης έγινε λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι και το αμινοτελικό αλλά και το καρβοξυτελικό άκρο της L4 βρίσκονται στην επιφάνεια του ριβοσώματος και επομένως είναι προσιτά σε οποιαδήποτε τροποποίηση. Έτσι μπορεί ένα από αυτά τα άκρα να βιοτινυλιωθεί και μετά να συνδεθεί με τη χάντρα, που είναι επικαλυμμένη με στρεπταβιδίνη. Το δεύτερο κριτήριο επιλογής της L4 αποτελεί το γεγονός ότι τα άκρα της απέχουν αρκετά από την έξοδο του καναλιού. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η πρωτεϊνοσύνθεση να προχωρεί κανονικά χωρίς πρόβλημα και μετά τη σύνδεση της 140

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ χάντρας. Το τρίτο κριτήριο ήταν η εντόπιση της L4 στο ριβόσωμα (Ban et al. 2000; Worbs et al. 2000). Ως γνωστόν η L4 δεν είναι καθαρά επιφανειακή πρωτεΐνη, διαπερνά μέρος του ριβοσώματος, είναι σταθερά συνδεμένη, σε αντίθεση με πολλές άλλες ριβοσωμικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι επιφανειακά συνδεμένες και αποκολλώνται εύκολα. Αναφορικά με την βιοτινυλίωση της L4 επελέγη η in vivo σήμανση για τους δύο πιο κάτω λόγους. Ο βασικότερος λόγος είναι η διατήρηση της δομικής-λειτουργικής ακεραιότητας της πρωτεΐνης και δευτερευόντως η απόδοση είναι μεγαλύτερη σε σχέση με μία in vitro τεχνική. Χρησιμοποιήθηκαν τα κύτταρα AVB101 από E.coli, τα οποία περιέχουν ήδη ένα πλασμίδιο, που παράγει το ένζυμο BirA. Το ένζυμο αυτό αναγνωρίζει και βιοτινυλιώνει πρωτεΐνες που περιέχουν την ακολουθία ενός συγκεκριμένου 14- μερούς πεπτιδίου. Η νουκλεοτιδική ακολουθία αυτού του πεπτιδίου περιέχεται σε ένα άλλο πλασμίδιο, το pan5, στο οποίο μπορεί να κλωνοποιηθεί οποιοδήποτε γονίδιο και να εκφραστεί ως πρωτεΐνη συζευγμένη με το 14-μερές πεπτίδιο στο αμινοτελικό της άκρο. Για να απομονωθεί ικανοποιητική ποσότητα πλασμιδίου χρειάστηκε μεγάλη καλλιέργεια, επειδή το pan5 δεν βρίσκεται σε πάρα πολλά αντίγραφα μέσα στο κύτταρο (medium copy plasmid). Μετά την αντίδραση λιγάσης με το γονίδιο της L4, έγινε έλεγχος των αποικιών αλλά οι κλώνοι φαίνονταν να είναι όλοι αρνητικοί. Επειδή, όμως, σε έναν από τους κλώνους φαινόταν αχνά μία ζώνη στο επιθυμητό μέγεθος (650 bp), έγινε PCR με εκμαγείο το πλασμίδιο αυτού του κλώνου. Πράγματι, η PCR έδωσε προϊόν στα 650 bp, που σημαίνει ότι το γονίδιο της L4 είχε όντως κλωνοποιηθεί στο πλασμίδιο pan5. Και άλλοι κλώνοι που δοκιμάστηκαν με PCR έδωσαν επίσης προϊόν. Ο έλεγχος της βιοτινυλίωσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης L4 έγινε με Dot Blot. Χρησιμοποιήθηκε βιοτινυλιωμένη φετουΐνη ως θετικό control, μία μη βιοτινυλιωμένη πρωτεΐνη ως αρνητικό control και το ολικό εκχύλισμα των πρωτεϊνών μετά την επαγωγή. Το αντίσωμα ενάντια στη βιοτίνη έδωσε σήμα, που σημαίνει ότι κάτι είχε βιοτινυλιωθεί μέσα στα κύτταρα. Αφού απομονώθηκαν ριβοσώματα από τα AVB101 κύτταρα επαναλήφθηκε το Dot Blot με ριβοσώματα από XL1 ως αρνητικό control. Τα ριβοσώματα από τα AVB101 κύτταρα έδωσαν έντονο σήμα κατά την ανίχνευση με το αντίσωμα. Κατέστη φανερό ότι η L4 είχε βιοτινυλιωθεί, όπως αναμενόταν, και επιπλέον είχε ενσωματωθεί στα ριβοσώματα του κυττάρου. Το γεγονός ότι μπόρεσε 141

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ και αντέδρασε με το αντίσωμα, το οποίο έχει κάποιες υπολογίσιμες διαστάσεις, σημαίνει ότι το βιοτυνιλιωμένο άκρο της L4 βρισκόταν πράγματι στην εξωτερική πλευρά του ριβοσώματος και ήταν προσβάσιμο. Επομένως, αυτό που επιτεύχθηκε ήταν να γίνει βιοτινυλίωση ολόκληρου του 70S ριβοσώματος σε σημείο που να μπορεί να αντιδράσει με τη στρεπταβιδίνη της χάντρας. Η σήμανση των ριβοσωμάτων έγινε με το φθορισμοφόρο Atto655. Το Atto655 ήταν συζευγμένο με μαλεϊμίδιο, το οποίο συνδέεται στις ομάδες SH των κυστεϊνών. Η περιοχή του ph στην οποία προτείνεται να γίνει η σήμανση είναι μεταξύ 7 και 8. Σε αυτήν την περιοχή του ph οι ομάδες SH είναι αρκετά πυρηνόφιλες για να αντιδράσουν με το μαλεϊμίδιο ενώ οι ΝΗ 2 ομάδες, που μπορούν να αντιδράσουν μη ειδικά, έχουν μικρή δραστικότητα λόγω του μεγάλου βαθμού πρωτονίωσης. Η σήμανση δοκιμάστηκε σε όλο το εύρος της παραπάνω περιοχής του ph και η καλύτερη απόδοση παρατηρήθηκε σε ph 7.8 8. Η απόδοση της σήμανσης υπολογίστηκε στο 80 90 %, που σημαίνει ότι σχεδόν κάθε ριβόσωμα είχε ένα φθορισμοφόρο. Ο έλεγχος της σήμανσης των ριβοσωμάτων έγινε εύκολα, λόγω της ιδιότητας του φθορισμοφόρου να φθορίζει σε ελαφρώς μεγαλύτερα μήκη κύματος όταν είναι συνδεμένο. Έτσι, με αντιπαραβολή της καμπύλης φθορισμού κάθε κλάσματος της στήλης με την αντίστοιχη του ελεύθερου φθορισμοφόρου ήταν δυνατό να γίνει έλεγχος της σήμανσης. Οι δύο πρωτεΐνες, που επιλέχτηκαν να συντεθούν από τα ριβοσώματα κατά τη διάρκεια των πειραμάτων με τις οπτικές λαβίδες, ήταν η GFPem (Green Fluorescent Protein emerald) και η ουβικιτίνη. Η κλασική GFP έχει δομή β-βαρελιού, που αποτελείται από 11 β-ελάσματα, ενώ κατά μήκος του άξονα του κυλίνδρου υπάρχει μία α-έλικα, η οποία φέρει ένα χρωμοφόρο. Το χρωμοφόρο δημιουργείται από τα αμινοξέα 65-67 (Ser-Tyr-Gly). Αρχικά δημιουργείται μία ιμιδαζολινόνη και στη συνέχεια συζεύγνυται με τον αρωματικό δακτύλιο της τυροσίνης, γεγονός που δίνει τη δυνατότητα στο χρωμοφόρο να αποκτήσει απορρόφηση και φθορισμό στο ορατό φάσμα (Tsien 1998). Το σημαντικό είναι ότι το χρωμοφόρο σχηματίζεται μετά την απόκτηση της τριδιάστατης δομής της πρωτεΐνης και κατά συνέπεια φθορισμός παρατηρείται μόνο εφόσον η πρωτεΐνη έχει πάρει τη σωστή τελική της διαμόρφωση. Οπότε, παρατήρηση φθορισμού από την GFP αποτελεί έναν έλεγχο ότι τα ριβοσώματα συνθέτουν πλήρεις και λειτουργικές πρωτεΐνες. Η GFPem είναι ένα παράγωγο της κλασικής GFP, με 6 σημειακές μεταλλάξεις (F64L, S65T, S72A, 142

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ N149K, M153T, I167T), η οποία φθορίζει στα 509 nm μέσα σε λίγα λεπτά και μάλιστα αρκετά ισχυρότερα, κυρίως λόγω βελτιωμένης αναδίπλωσης. Η ουβικιτίνη, από την άλλη, είναι μία μικρή πρωτεΐνη με πιο απλή τριτοταγή δομή και αποτελεί έτσι ένα πιο εύκολο σύστημα για μελέτη με τις οπτικές λαβίδες (Vijay-Kumar et al. 1987). Για τις μετρήσεις με οπτικές λαβίδες, τα γονίδια των παραπάνω πρωτεϊνών χρειάστηκε να τροποποιηθούν κατάλληλα και να πάρουν τη μορφή του γονιδίου Α (Παράγραφος Γ.1.4). Έτσι, εισήχθη το κωδικόνιο τερματισμού ΤAG (amber) στη δεύτερη θέση, ακριβώς μετά την εναρκτήρια μεθειονίνη. Το κωδικόνιο amber χρησιμοποιείται για να εισαχθεί μία βιοτινυλιωμένη λυσίνη στη συγκεκριμένη θέση κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης. Μετά το κωδικόνιο amber υπήρχε μία αλληλουχία που κωδικοποιούσε για 30-40 αμινοξέα και αμέσως μετά εισήχθη ουρά έξι ιστιδινών (His-tag). Αυτές ήταν οι τροποποιήσεις στο αμινοτελικό άκρο των γονιδίων. Στο καρβοξυτελικό άκρο προστέθηκε μία αλληλουχία που κωδικοποιούσε για 30 επιπλέον αμινοξέα. Το His-tag στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε για να σταματήσει την πρωτεϊνοσύνθεση. Αυτό συνέβη με απουσία του αμινοξέος ιστιδίνη από το μίγμα της in vitro μεταγραφής-μετάφρασης. Η ενδιάμεση, όμως, αλληλουχία των 30-40 αμινοξέων καλύπτει το μήκος του ριβοσωμικού καναλιού (Picking et al. 1992) σπρώχνοντας στην ουσία τη βιοτινυλιωμένη λυσίνη, που βρίσκεται στη δεύτερη θέση, εκτός καναλιού. Η βιοτίνη, λοιπόν, που ξεπρόβαλε από το κανάλι ήταν ικανή να συνδεθεί μέσω στρεπταβιδίνης με μία χάντρα πολυστυρενίου παγιδευμένη στις οπτικές λαβίδες. Αναφορικά με την παύση ή την συνέχιση της πρωτεϊνοσύνθεσης μπορούσε ανά πάσα στιγμή να ελεγχθεί μέσω της προσθήκης ή της απουσίας της ιστιδίνης. Πριν από το κωδικόνιο τερματισμού υπήρχε θέση αναγνώρισης από ένζυμο περιορισμού. Κατά αυτό τον τρόπο τα γονίδια μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν είτε ως είχαν και να απελευθερωθεί η νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη από το ριβόσωμα στο διάλυμα είτε να κοπούν πριν το κωδικόνιο τερματισμού και να παραμείνει η νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη συνδεμένη στο ριβόσωμα μετά τη σύνθεσή της, διότι δεν υπήρχε σήμα απελευθέρωσης. Στη δεύτερη περίπτωση, τα 30 αμινοξέα στο καρβοξυτελικό άκρο εξασφάλιζαν ότι η πρωτεΐνη ξεπρόβαλε ολόκληρη από την έξοδο του ριβοσωμικού καναλιού και είχε τη δυνατότητα να αποκτήσει τη τελική της διαμόρφωση. 143

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Αρχικά, λοιπόν, έγινε προσπάθεια εισαγωγής των 30 επιπλέον αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο της GFPem με αντίδραση PCR. Χρησιμοποιήθηκε ένας εκκινητής με 122 bp, ο οποίος λόγω του μεγέθους του, ήταν δυνατόν να αναδιπλωθεί και να δημιουργήσει δίκλωνα κομμάτια. Για αυτό τον λόγο στην PCR προστέθηκε DMSO, το οποίο ανοίγει τη δομή και δεν επιτρέπει αναδιπλώσεις του εκκινητή. Παρόλα αυτά στον έλεγχο της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που ακολούθησε (DNA sequencing), έγινε φανερό ότι δεν είχε εισαχθεί ολόκληρη η επιπλέον αλληλουχία στο καρβοξυτελικό μέρος της GFPem, αλλά μόνο κομμάτι αυτής. Επανάληψη της PCR έδινε το ίδιο αποτέλεσμα για όλους τους κλώνους. Για αυτό το λόγο σχεδιάστηκε δεύτερος εκκινητής για να προσθέσει μία διαφορετική αλληλουχία στην ήδη υπάρχουσα ημιτελή. Ο έλεγχος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας έδειξε ότι είχε εισαχθεί ολόκληρη η αλληλουχία για την κωδικοποίηση επιπλέον 30 αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο της GFPem. Κατόπιν, τροποποιήθηκε το αμινοτελικό άκρο της GFPem, με εισαγωγή του κωδικονίου amber και του His-tag, με τη βοήθεια δύο επιπλέον εκκινητών και έδωσε το γονίδιο GFPem 2 (Παράγραφος Γ.1.4.4). Το γονίδιο της ουβικιτίνης ήταν κλωνοποιημένο στο πλασμίδιο pxhis-2xubi Amb2 ως διμερές με θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού XhoI ακριβώς ανάμεσα και το κωδικόνιο amber στο αμινοτελικό άκρο. Αρχικά το πλασμίδιο κόπηκε με το ένζυμο περιορισμού XhoI, ώστε να χωριστούν τα δύο συνεχόμενα γονίδια της ουβικιτίνης. Ο ένας εκκινητής είχε την ίδια ακριβώς αλληλουχία με το 5 άκρο μόνο που του έλειπε η τριπλέτα για το κωδικόνιο amber. Ο άλλος εκκινητής μπορούσε να υβριδιστεί στο 3 άκρο και των δύο γονιδίων της ουβικιτίνης, καθώς είχαν την ίδια αλληλουχία. Δίκλωνο κομμάτι, όμως, μπορούσε να δημιουργηθεί μόνο από το πρώτο γονίδιο, καθώς είχε εκκινητές και στα δύο άκρα του. Κατόπιν χρησιμοποιήθηκε το ήδη έτοιμο γονίδιο GFPem 2, όπου αντικαταστάθηκε η αλληλουχία της GFPem με αυτή της ουβικιτίνης και έδωσε το γονίδιο Ubi 2 (Παράγραφος Γ.1.4.6). Τα ριβοσώματα συνδέθηκαν σε χάντρες SiO 2 μεγέθους 3 μm επικαλυμμένες με στρεπταβιδίνη, μέσω της βιοτινυλιωμένης L4. Το πλεονέκτημα των χαντρών SiO 2 σε σχέση με τις χάντρες πολυστυρενίου είναι ότι δεν παρουσιάζουν αυτοφθορισμό στο ίδιο εύρος με τα χρησιμοποιούμενα φθορισμοφόρα, οπότε δεν τίθεται θέμα παρανόησης. Η αντίδραση έγινε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου (eppendorf) χαμηλής συνάφειας, ώστε να μη χάνεται ποσότητα ριβοσωμάτων λόγω προσκόλλησης στα τοιχώματα. Μετά την αντίδραση πρόσδεσης των ριβοσωμάτων, προστέθηκε περίσσεια βιοτίνης στις χάντρες, ώστε να παρεμποδιστούν οι ελεύθερες 144

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ στρεπταβιδίνες της επιφάνειας. Η βιοτίνη έχει ένα δεσμό αγχιστείας για στρεπταβιδίνη. Μετά την σύνδεσή της δεν είναι δυνατόν δεύτερη βιοτίνη να συνδεθεί στο ίδιο σημείο, αλλά ούτε και δεύτερη στρεπταβιδίνη να συνδεθεί με το ίδιο μόριο βιοτίνης. Προσθήκη του in vitrο μίγματος μεταγραφής-μετάφρασης, το οποίο περιείχε το πλασμίδιο με το γονίδιο GFPem 2 ή με το γονίδιο Ubi 2, οδήγησε τα συνδεμένα στις χάντρες ριβοσώματα να παράγουν την αντίστοιχη πρωτεΐνη. Το μίγμα περιείχε όλα τα αμινοξέα εκτός της ιστιδίνης, γεγονός που οδήγησε σε παύση της σύνθεσης, μόλις έφτασε στο His-tag. Σε φυσιολογικές συνθήκες, παύση της σύνθεσης οδηγεί σε ενεργοποίηση ενός μηχανισμού απελευθέρωσης και πρωτεόλυσης της ημιτελούς αλυσίδας. Ο μηχανισμός αυτός περιλαμβάνει το μόριο tmrna, το οποίο δρα αρχικά ως trna και έπειτα ως mrna. Εισέρχεται στο ριβόσωμα ως trna και κωδικοποιεί μία αλληλουχία 10 επιπλέον αμινοξέων και ενός κωδικονίου τερματισμού. Λόγω του κωδικονίου τερματισμού η πολυπεπτιδική αλυσίδα απελευθερώνεται από το ριβόσωμα και λόγω της αλληλουχίας των 10 αμινοξέων αναγνωρίζεται από ειδικές πρωτεάσες που αρχίζουν την πρωτεόλυση από το καρβοξυτελικό άκρο. Προς αποφυγή της απελευθέρωσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας το μίγμα της in vitrο μεταγραφής-μετάφρασης περιείχε ένα ολιγονουκλεοτίδιο (AS-tmRNA) με συμπληρωματική αλληλουχία ως προς την αλληλουχία του tmrna, που κωδικοποιεί για τα 10 επιπλέον αμινοξέα. Το ολιγονουκλεοτίδιο αυτό υβριδίστηκε με την αντίστοιχη αλληλουχία του tmrna και το εμπόδισε να αντιδράσει με το ριβόσωμα. Το μίγμα περιείχε επίσης ένα BioLys-tRNA, το οποίο έφερε μία λυσίνη χημικά συζευγμένη με βιοτίνη. Το αντικωδικόνιο του BioLys-tRNA είχε μεταλλαχθεί κατάλληλα, ώστε να αναγνωρίζει το κωδικόνιο amber. Με την τεχνική αυτή, του κατασταλτικού trna, ενσωματώθηκε η βιοτινυλιωμένη λυσίνη αμέσως μετά την εναρκτήρια μεθειονίνη. Αν δεν είχαν παρεμποδιστεί προηγουμένως οι ελεύθερες στρεπταβιδίνες των χαντρών, πολύ μεγάλο μέρος του BioLys-tRNA θα κατέληγε στην επιφάνεια των χαντρών. Λόγω των επί πλέον 30-40 αμινοξέων που ακολουθούσαν το γονίδιο της GFPem 2 ή της ουβικιτίνης (Ubi 2) μέχρι το His-tag, όπου σταμάτησε η αλυσίδα, το βιοτινυλιωμένο αμινοτελικό άκρο είχε ξεπροβάλει από το ριβοσωμικό κανάλι. Για τον έλεγχο της εμφάνισης της βιοτίνης εκτός του ριβοσωμικού καναλιού, έγινε προσθήκη στρεπταβιδίνης συζευγμένης με το φθορισμοφόρο cy5. Ο φθορισμός που παρατηρήθηκε σημαίνει ότι η βιοτίνη της πολυπεπτιδικής αλυσίδας είναι προσιτή, 145

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ καθώς η στρεπταβιδίνη-cy5 δεν μπορεί να αντιδράσει με άλλη ομάδα. Η άποψη αυτή ενισχύεται επιπρόσθετα με την προσθήκη στρεπταβιδίνης-cy5 σε ριβοσώματα που δεν είχαν συνθέσει πρωτεΐνη, όπου δεν παρατηρήθηκε φθορισμός. Στη συνέχεια στο προσιτό βιοτινυλιωμένο αμινοτελικό άκρο προστέθηκε στρεπταβιδίνη προκειμένου να δεσμευτεί. Η στρεπταβιδίνη έχει τέσσερις θέσεις δέσμευσης για βιοτίνη, οπότε μένουν τρεις θέσεις ελεύθερες για να αντιδράσουν με δεύτερο μόριο βιοτίνης. Σε χάντρες πολυστυρενίου συνδέθηκαν δίκλωνα μόρια DNA μήκους περίπου 1.3 μm. Η σύνδεση στις χάντρες έγινε με τη χρήση μίας γέφυρας, η οποία στο ένα άκρο περιείχε σουκινιμίδιο και στο άλλο μαλεϊμίδιο. Η γέφυρα αυτή σχηματίζει ομοιοπολικούς δεσμούς με τις αμινομάδες των χαντρών και τις σουλφιδρυλομάδες των DNA μορίων, αντίστοιχα. Τα μόρια DNA ήταν βιοτινυλιωμένα στο ελεύθερο άκρο τους και ήταν σε θέση να αντιδράσουν με τις στρεπταβιδίνες στα αμινοτελικά άκρα των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών. Τα μόρια DNA και το μήκος τους δίνουν τη δυνατότητα ευκολότερης πρόσβασης στα αμινοτελικά άκρα των πρωτεϊνών και μειώνουν αισθητά τις μη ειδικές συνδέσεις μεταξύ των χαντρών, οι οποίες είναι αναπόφευκτες όταν οι χάντρες πλησιάζουν πολύ μεταξύ τους (< 1 μm). Οι χάντρες SiO 2 με τα ριβοσώματα εισήχθησαν στο θάλαμο των οπτικών λαβίδων, ο οποίος δέχεται γύρω στα 30 μl δείγματος. Η ροή ρυθμίστηκε κατάλληλα ώστε οι χάντρες να κινούνται σχετικά αργά, ώστε να αυξηθεί η πιθανότητα δέσμευσης μίας εξ αυτών στις οπτικές λαβίδες. Οι οπτικές λαβίδες αποτελούνταν από δύο αντίθετα διαδιδόμενες δέσμες laser στα 830 nm, για σταθερότερη παγίδευση. Μετά την παγίδευση μίας εκ των χαντρών η ροή σταματάει, ώστε να μην παγιδευτούν περισσότερες χάντρες και διαταράξουν τις μετρήσεις. Στη συνέχεια, η χάντρα αναρροφήθηκε στο μικροσιφώνιο του θαλάμου, αποσπάστηκε απο τις οπτικές λαβίδες και οι υπόλοιπες χάντρες απομακρύνθηκαν με συνεχή ροή ρυθμιστικού διαλύματος, καθώς δεν ήταν πλέον απαραίτητες. Κατόπιν, στο θάλαμο εισήχθησαν οι χάντρες πολυστυρενίου με τα μόρια DNA και όπως και προηγουμένως, κάποια από αυτές παγιδεύτηκε στις οπτικές λαβίδες. Φέρνοντας τις δύο χάντρες πλησιέστερα έγιναν προσπάθειες σύνδεσης του DNA με το αμινοτελικό άκρο της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης. Το Tico, που χρησιμοποιήθηκε ως ρυθμιστικό διάλυμα, περιείχε 150 mm CH 3 COONH 4 αντί για 30 mm, επειδή οι συνθήκες αυτές ευνοούν τη σύνδεση μεταξύ βιοτίνης και στρεπταβιδίνης. 146

ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΠΤΙΚΕΣ ΛΑΒΙΔΕΣ Ο έλεγχος επιτυχημένης σύνδεσης έγινε με αυτόματη απομάκρυνση της μικροπιπέτας και παρατήρηση της συμπεριφοράς της παγιδευμένης στις οπτικές λαβίδες χάντρας. Σε περίπτωση μετατόπισής της από το κέντρο της δέσμης γινόταν καταγραφή των δυνάμεων μέχρι το σημείο ρήξης της σύνδεσης. Παρατηρήθηκε ότι η ειδική σύνδεση μεταξύ του DNA και της πολυπεπτιδικής αλυσίδας επιτυγχάνεται σε ένα εύρος δυνάμεων 6-20 pn, με μέσο όρο γύρω στα 10 pn. Άσκηση μεγαλύτερων δυνάμεων οδηγούσε σε ρήξη της σύνδεσης. Η σύνδεση βιοτίνης-στρεπταβιδίνης καταστρέφεται στα 160 pn, ενώ ο ομοιοπολικός δεσμός σε nn. Η μόνη εξήγηση για τη ρήξη γύρω στα 10 pn είναι η καταστροφή των δεσμών υδρογόνου μεταξύ κωδικονίου και αντικωδικονίου στη σύνδεση του mrna με το trna. Πράγματι, το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από προηγούμενες μελέτες (Uemura et al. 2007). Από την παραπάνω παρατήρηση έγινε φανερό ότι έπρεπε να χρησιμοποιηθούν δυνάμεις μικρότερες των 10 pn. Εφαρμόζοντας μία σταθερή δύναμη 6.5 pn, η σύνδεση παρέμεινε ανέπαφη. Σε αυτό το στάδιο δίνεται η δυνατότητα να προστεθεί μίγμα in vitro μεταγραφής-μετάφρασης με όλα τα αμινοξέα παρόντα, ώστε να συνεχιστεί η σύνθεση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και να γίνει καταγραφή των δυνάμεων που ασκούνται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα κατά την διάρκεια της σύνθεσης. Είναι δυνατόν να δοκιμαστούν επίσης πολυπεπτιδικές αλυσίδες με α-έλικες ή β-ελάσματα και να προσδιοριστούν τυχόν διαφορές στις δυνάμεις που ασκούνται πάνω τους. Κάτι τέτοιο θα έδινε μελλοντικά τη δυνατότητα προσδιορισμού της δευτεροταγούς δομής άγνωστων πρωτεϊνών, απλά και μόνο με τη μέτρηση των δυνάμεων που ασκούνται πάνω στα διάφορα τμήματά τους κατά τη διάρκεια της σύνθεσης και αναδίπλωσής τους. 147

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET Δ.2. FRET Η τρέχουσα γνώση για την αναδίπλωση των πρωτεϊνών πηγάζει από πειράματα στα οποία πλήρεις πρωτεΐνες μετουσιώνονται και ξαναποκτούν την τελική τους διαμόρφωση. Αρχικά κυριάρχησε η υπόθεση ότι οι ίδιες αρχές διέπουν την αναδίπλωση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων κατά τη σύνθεσή τους απο τα ριβοσώματα, όμως το μονοπάτι που ακολουθούν μπορεί να διαφέρει σημαντικά μεταξύ των δύο, λόγω κάποιων διαφορών (Fedorov and Baldwin 1997; Elcock 2006). Μία εμφανής διαφορά έγκειται στο γεγονός ότι τα ριβοσώματα συνθέτουν πρωτεΐνες γραμμικά από το αμινοτελικό προς το καρβοξυτελικό άκρο. Έτσι, ενώ στα πειράματα μετουσίωσης και αναδίπλωσης όλα τα αμινοξέα είναι εξαρχής παρόντα, ώστε να επηρεάσουν την αναδίπλωση, κατά τη σύνθεση στα ριβοσώματα, μόνο τα αμινοτελικά αμινοξέα είναι αρχικά διαθέσιμα για αναδίπλωση. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι in vivo οι πρωτεΐνες αναδιπλώνονται διαδοχικά από το αμινοτελικό προς το καρβοξυτελικό άκρο, ώστε να αποκτήσουν την τριδιάστατη δομή τους. Αυτό συμβαίνει, κυρίως, λόγω της ανάγκης των νεοσυντιθέμενων πολυπεπτιδίων να διατηρήσουν κάποιου είδους διαμόρφωση, ώστε να προστατευτούν από πρωτεόλυση ή μη παραγωγική αλληλεπίδραση με άλλες αλυσίδες (Feldman and Frydman 2000). Αρκετές μελέτες, λοιπόν, επικεντρώθηκαν στη συμμεταφραστική αναδίπλωση πρωτεϊνών, οι οποίες αποκτούν μία πλήρως ενεργή ενζυμικά διαμόρφωση. Η συνολική ενεργότητα των παραγόμενων πρωτεϊνών παρακολουθούνταν συνεχώς μέσα στο διάλυμα (Kolb et al. 1994; Kudlicki et al. 1995; Makeyev et al. 1996; Kolb et al. 2000). Σε πολλές περιπτώσεις παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ της συμμεταφραστικής αναδίπλωσης και των πειραμάτων μετουσίωσης, όσον αφορά τον ρυθμό της αναδίπλωσης, την εμφάνιση ενδιάμεσων μορφών και την τελική απόδοση (Frydman et al. 1999; Clark and King 2001). Για αυτό τον λόγο, ένας βασικός στόχος είναι η κατανόηση της σχέσης μεταξύ της επιμήκυνσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και της αναδίπλωσής της. Το συνεχώς αναπτυσσόμενο πεδίο των τεχνικών μεμονωμένων μορίων προσφέρει την δυνατότητα να αποκτηθούν μοναδικές πληροφορίες για ετερογενείς πληθυσμούς, όπως σπάνια ή ασύγχρονα φαινόμενα, τα οποία παραμένουν κρυμμένα στις μελέτες διαλυμάτων, όπου λαμβάνεται μόνο μία μέση τιμή. Με FRET μεμονωμένων μορίων παρατηρήθηκαν οι δύο υποπληθυσμοί της πλήρως αναδιπλωμένης και της μετουσιωμένης πρωτεΐνης καθώς και η μετάβαση από τη μία 148

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET μορφή στην άλλη με αυξανόμενη συγκέντρωση αποδιατακτικής ουσίας (Schuler et al. 2002). Τελευταία έγιναν αρκετές μελέτες με διάφορες τεχνικές μεμονωμένων μορίων, που αφορούσαν το ριβόσωμα, όπως η παρατήρηση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Sytnik et al. 1999), οι αλλαγές στην διαμόρφωση των trnas κατά την μετάφραση (Blanchard et al. 2004) και η αποσταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης Shine-Dalgarno με την δημιουργία των πρώτων πεπτιδικών δεσμών (Uemura et al. 2007). Επίσης, ο Johnson και η ομάδα του εισήγαγαν δύο φθορισμοφόρα στην ίδια αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα για να παρατηρήσουν τον σχηματισμό δευτεροταγών δομών μεταξύ των φθορισμοφόρων (Johnson 2004; Woolhead et al. 2004; Woolhead et al. 2006). Πρόσφατα δημοσιέυτηκε μία εργασία όπου ακινητοποιημένα ριβοσώματα παρήγαγαν την πρωτεΐνη GFP (Uemura et al. 2008), η οποία επαληθεύει μεγάλο μέρος των δικών μας αποτελεσμάτων. Ο βασικός σκοπός μας είναι να παρατηρήσουμε την αναδίπλωση μορίων πρωτεΐνης κατά τη σύνθεσή τους από μεμονωμένα ριβοσώματα απ ευθείας με FRET. Στο σύστημά μας το ένα φθορισμοφόρο είναι ακίνητο πάνω στο ριβόσωμα και το δεύτερο εισάγεται στην αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Το πλεονέκτημα αυτού του συστήματος είναι ότι μπορούμε να παρατηρήσουμε την αναδίπλωση της πρωτεΐνης συμμεταφραστικά από μεμονωμένα ριβοσώματα και όχι απλά τον σχηματισμό μιας δευτεροταγούς δομής μεταξύ δύο φθορισμοφόρων. Είναι επίσης δυνατός ο υπολογισμός του ρυθμού της βιοσύνθεσης μετρώντας την ταχύτητα του δεύτερου φθορισμοφόρου μέσα στο κανάλι του ριβοσώματος. Ένα μειονέκτημα είναι ότι εκτός της σχετικής κίνησης μεταξύ των φθορισμοφόρων λόγω της αναδίπλωσης της πρωτεΐνης, υπάρχει κίνηση και λόγω της διάχυσης ολόκληρου του μορίου μέσα στο διάλυμα. Πιθανή όμως μείωση της ταχύτητας κίνησης του μορίου μπορεί να οφείλεται σε σχηματισμό δευτεροταγούς δομής. Για τον σχεδιασμό του συστήματος χρησιμοποιήθηκε ένα ζεύγος φθορισμοφόρων, από τα οποία το ένα βρισκόταν ενσωματωμένο στην νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα και το άλλο σε μία ριβοσωμική πρωτεΐνη πολύ κοντά στην έξοδο του ριβοσωμικού καναλιού. Το ριβόσωμα περιέχει αρκετές κυστεΐνες, οπότε μπορεί να σημανθεί μόνο μη ειδικά, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως με το φθορισμοφόρο Atto655-μαλεϊμίδιο. Η μόνη περίπτωση να σημανθεί ειδικά σε συγκεκριμένη θέση είναι να ενσωματωθεί στο ριβόσωμα μία ήδη σημασμένη ριβοσωμική πρωτεΐνη. Για αυτό το λόγο, 149

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET χρησιμοποιήθηκαν μεταλλαγμένα στελέχη E.coli, από τα οποία έλειπε είτε η πρωτεΐνη L24 είτε η πρωτεΐνη L29 (προσφορά του καθηγητή K.Nierhaus). Τα ριβοσώματα που απομονώθηκαν από τα παραπάνω στελέχη στερούνταν επίσης των πρωτεϊνών L24 ή L29, αντίστοιχα. Ο έλεγχος των ριβοσωμάτων αυτών έγινε με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων (2D SDS-PAGE). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση το φορτίο τους και το μέγεθός τους. Έτσι, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας (ΤΡ50) ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή δύο διαστάσεων και συγκρίνοντας με βιβλιογραφικά δεδομένα, όπου δίνεται η ακριβής θέση κάθε πρωτεΐνης μετά από ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, επιβεβαιώθηκε η έλλειψη των L24 ή L29, αντίστοιχα. Για τα πειράματα με FRET, τα μεταλλαγμένα ριβοσώματα έπρεπε να μπορούν να συνδεθούν σε επιφάνειες μέσω του δεσμού βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. Για αυτό το λόγο, χρειάστηκε να μεταφερθεί το σύστημα βιοτινυλίωσης από τα κύτταρα AVB101 στα μεταλλαγμένα στελέχη των E.coli. Η μεταφορά έγινε επιτυχώς με εισαγωγή των δύο πλασμιδίων του AVB101 στα μεταλλαγμένα στελέχη. Όπως και προηγουμένως, βιοτινυλιώθηκε η ριβοσωμική πρωτεΐνη L4 και ενσωματώθηκε στα ριβοσώματα, που τους έλειπε είτε η L24 είτε η L29. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες L24 και L29 επιλέχτηκαν για τα πειράματα με FRET για διάφορους λόγους. Το βασικότερο ρόλο έπαιξε η απόστασή τους από την έξοδο του ριβοσωμικού καναλιού, καθώς είναι οι πιο κοντινές σε αυτήν. Επίσης, οι πρωτεΐνες αυτές δεν περιέχουν καμία κυστεΐνη στην πρωτοταγή τους δομή, γεγονός που επιτρέπει την εισαγωγή τους, με μετάλλαξη, στις επιθυμητές θέσεις και την ειδική σήμανση των πρωτεϊνών. Τέλος, με την εισαγωγή των κυστεϊνών στις πρωτεΐνες L24 και L29, το φθορισμοφόρο απέχει από την έξοδο του ριβοσωμικού καναλιού κατά 20 Å και 50 Å, αντίστοιχα, γεγονός που επιτρέπει να βγουν συμπληρωματικά συμπεράσματα για το ίδιο ζεύγος φθορισμοφόρων. Οι κυστεΐνες εισήχθησαν με μετάλλαξη, οπότε δημιουργήθηκαν οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες L24 I58C και L29 A63C. Για τις μεταλλάξεις επιλέχτηκαν θέσεις, οι οποίες δεν φαινόταν να επηρεάζουν τη δομή και λειτουργία των πρωτεϊνών. Έτσι, η ισολευκίνη της L24 βρισκόταν σε ένα βρόγχο χωρίς εμφανή δευτεροταγή δομή, ενώ η αλανίνη της L29 αποτελούσε το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Επίσης, εισήχθη ουρά έξι ιστιδινών (His-tag) στο αμινοτελικό άκρο κάθε πρωτεΐνης, ώστε να είναι δυνατή η απομόνωσή τους από το ολικό εκχύλισμα των κυττάρων. 150

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET Μάλιστα, για να ελεγχθεί κατά πόσο οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες είναι ικανές να ενσωματωθούν στα ριβοσώματα, έγινε απομόνωση ριβοσωμάτων από τα κύτταρα και dot blot με χρήση αντισώματος ενάντια στο His-tag. Η εμφάνιση του φιλμ έδειξε ότι οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ενσωματώνονται κανονικά στα ριβοσώματα, γεγονός που δείχνει μηδαμινές ή έστω ελάχιστες αλλαγές στη δομή των εν λόγω πρωτεϊνών. Η σήμανση των πρωτεϊνών έγινε με το φθορισμοφόρο Alexa633, το οποίο ήταν συζευγμένο με μαλεϊμίδιο. Η σήμανση έλαβε μέρος συγχρόνως με την απομόνωση των πρωτεϊνών, μέσω του His-tag με στήλη Ni-NTA. Με αυτόν τον τρόπο η απόδοση της σήμανσης έφτασε το 70 %, σε αντίθεση με αρχικές προσπάθειες απομόνωσης των πρωτεϊνών και μετέπειτα σήμανσης με το φθορισμοφόρο, οι οποίες έδιναν σήμανση 35 40 %. Πιθανότατα η απόδοση να αυξάνεται λόγω της συγκέντρωσης της προς σήμανση πρωτεΐνης σε πολύ μικρό όγκο και της ακινητοποίησής της πάνω στη στήλη Ni-NTA. Αρχικά είχε γίνει προσπάθεια σήμανσης των πρωτεϊνών με το φθορισμοφόρο Atto655, επειδή είναι πιο σταθερό και παρουσιάζει λιγότερο έντονη φωτόσβεση, όμως η απόδοση της σήμανσης ήταν για άγνωστο λόγο πολύ μικρή. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών, πριν και μετά τη σήμανση, για τον προσδιορισμό της απόδοσης της σήμανσης, δεν ήταν δυνατός με μέτρηση της απορρόφησης στα 280 nm, καθώς καμία από τις δύο πρωτεΐνες δεν περιείχε τρυπτοφάνες, τυροσίνες ή φαινυλαλανίνες. Έτσι, η συγκέντρωσή τους υπολογίστηκε ύστερα από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και σύγκριση με πρότυπες ζώνες γνωστής ποσότητας πρωτεΐνης. Για την εισαγωγή των σημασμένων πρωτεϊνών L24 I58C και L29 A63C στα ριβοσώματα που τους έλειπε η L24 ή L29, αντίστοιχα, αρχικά δοκιμάστηκε να γίνει μερική ανασυγκρότηση της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος. Κατά την μερική ανασυγκρότηση ακολουθήθηκε μόνο το δεύτερο στάδιο της ολικής ανασυγκρότησης. 50S ριβοσώματα που τους έλειπε είτε η πρωτεΐνη L24 είτε η L29 επωάστηκαν για 90 min στους 50 C με τις σημασμένες πρωτεΐνες. Έλεγχος με 2D ηλεκτροφόρηση έδειξε ότι δεν κατέστη δυνατή η εισαγωγή των σημασμένων πρωτεϊνών. Αυτό ήταν λίγο πολύ αναμενόμενο καθώς οι πρωτεΐνες L24 και L29 εισέρχονται στα αρχικά στάδια της συγκρότησης της 50S υπομονάδας (Παράγραφος Α.1.3). Μάλιστα η L24 δεσμεύεται στο 23S rrna χωρίς καμία συνέργεια και επάγει την ορθή συγκρότηση της 50S υπομονάδας. Έτσι αναπόφευκτα, χρειάστηκε να γίνει ολική ανασυγκρότηση της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος, για την εισαγωγή των L24 I58C και L29 A63C. 151

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET Αρχικά, τα ριβοσώματα διαχωρίστηκαν στις υπομονάδες τους, κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (χαμηλή συγκέντρωση μαγνησίου). Τα ριβοσώματα λειτουργούν βέλτιστα σε μία συγκέντρωση μαγνησίου 4 5 mm. Αποδιατακτικές συνθήκες επιτυγχάνονται όταν η συγκέντρωση του μαγνησίου είναι χαμηλότερη του 1 mm, οπότε οι δύο υπομονάδες διαχωρίζονται. Φυγοκέντρηση των αποδιαταγμένων υπομονάδων σε διάλυμα σουκρόζης 10 30 % έδωσε τη δυνατότητα συλλογής των επιθυμητών κλασμάτων. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνθηκαν ταυτόχρονα και οι RNAσες, οι οποίες ήταν προσκολλημένες στα ριβοσώματα. Στα μεταλλαγμένα στελέχη υπήρχαν RNAσες, οι οποίες απομακρύνθηκαν κατά την αποδιάταξη των υπομονάδων και εμφανίστηκαν πριν από τις 30S υπομονάδες στο διάλυμα σουκρόζης, λόγω του μικρού τους μεγέθους. Η ολική ανασυγκρότηση επιτεύχθηκε με ανάμιξη όλων των ριβοσωμικών πρωτεϊνών της μεγάλης υπομονάδας με το 23S + 5S rrna, αντί όμως των L24 και L29, στο μίγμα υπήρχαν οι σημασμένες πρωτεΐνες L24 I58C και L29 A63C, αντίστοιχα. Πολύ σημαντική παράμετρος στις αντιδράσεις ολικής ανασυγκρότησης είναι η αναλογία μεταξύ των συστατικών. Συνήθως η αναλογία μεταξύ των πρωτεϊνών και του rrna είναι 1:1, αλλά αυτό μπορεί κάλλιστα να διαφέρει σε διαφορετικά συστήματα. Στη συγκεκριμένη περίπτωση για 0.5 Α 260 23S + 5S rrna προστέθηκαν 0.125 eu ΤΡ50 L24 ή ΤΡ50 L29 και 0.75 eu σημασμένων L24 I58C ή L29 A63C. Οι αναλογίες αυτές έδωσαν ανασυγκροτημένες 50S υπομονάδες με ενεργότητα έως και 65 70 %, σε σχέση με υπομονάδες που δεν είχαν υποστεί τη διαδικασία της ανασυγκρότησης. Κατά την απομόνωση των ανασυγκροτημένων 50S υπομονάδων, μετά τη φυγοκέντρηση παρατηρήθηκε ίζημα κυανίζον παρόμοιο με του φθορισμοφόρου Alexa633, το οποίο παραπέμπει σε ενσωμάτωση των σημασμένων πρωτεϊνών στα ριβοσώματα. Ο έλεγχος της ενσωμάτωσης έγινε με φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες, χωρίς όμως να προηγηθεί ανασυγκρότηση. Η απουσία του ίζηματος αντίστοιχου χρώματος επαλήθευσε τα αποτελέσματά μας. Οι 50S υπομονάδες χρειάστηκε, στη συνέχεια, να επανασυνδεθούν με 30S υπομονάδες, οι οποίες προήλθαν από στελέχη ελεύθερα από RNAσες. Μετά τη φυγοκέντρηση σε διάλυμα σουκρόζης 10 30 %, συλλέχτηκε η κορυφή που αντιστοιχούσε στα επανασυνδεμένα 70S ριβοσώματα. Οι 30S υπομονάδες που προστέθηκαν στην αντίδραση βρίσκονταν σε περίσσεια 1.5x, ώστε να δεσμεύσουν όσο το δυνατόν περισσότερες 50S υπομονάδες. Με αυτό τον τρόπο, η κορυφή που αντιστοιχεί στις ελεύθερες 50S υπομονάδες μειώνεται και διευκολύνει τη συλλογή 152

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET των κλασμάτων που αντιστοιχούν στα επανασυνδεμένα 70S ριβοσώματα. Παρόλα αυτά έγινε φανερό ότι μέρος των 50S υπομονάδων δεν επανασυνδέθηκε με 30S υπομονάδες, παραμένοντας ελεύθερο. Η ενεργότητα των επανασυνδεμένων 70S recl24 και 70S recl29 ριβοσωμάτων ελέγχθηκε με σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης και υπολογίστηκε στο 25 %, σε σχέση με 70S ριβοσώματα τα οποία δεν είχαν υποστεί καμία τροποποίηση ούτε τις παραπάνω διαδικασίες. Για την πρόσδεση των ριβοσωμάτων σε επιφάνειες, μέσω του δεσμού βιοτίνηςστρεπταβιδίνης, χρησιμοποιήθηκαν υάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, οι οποίες τροποποιήθηκαν με χημικό τρόπο. Για να αποφευχθεί η μη ειδική προσρόφηση χρησιμοποιήθηκε πολυαιθυλενογλυκόλη, η οποία κάλυπτε την επιφάνεια με υψηλή ομοιογένεια, ώστε να μη δημιουργούνται κενές περιοχές, που να παγιδεύουν ριβοσώματα μη ειδικά. Σε πολύ μικρό ποσοστό η πολυαιθυλενογλυκόλη ήταν αναμιγμένη με το βιοτινυλιωμένο της παράγωγο (αναλογία 1:10 7 ). Η αναλογία αυτή επιλέχτηκε, ώστε όταν στη συνέχεια προσδεθούν τα βιοτινυλιωμένα ριβοσώματα, μέσω στρεπταβιδίνης να δημιουργηθεί μία πυκνότητα ενός ριβοσώματος ανά μm 2. Κατά αυτόν τον τρόπο ήταν ευκολότερη η παρατήρηση και η εξαγωγή των αποτελεσμάτων. Ένα επιπλέον πλεονέκτημα της παραπάνω μεθόδου αποτελεί το γεγονός ότι όλα τα ριβοσώματα προσδένονταν με την ίδια διαμόρφωση, οπότε και τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα μεταξύ τους. Για τον έλεγχο των επιφανειών, αρχικά προσδέθηκαν ριβοσώματα μη ειδικά σημασμένα με Atto655 και παρατηρήθηκε φθορισμός στα 670 nm. Ως control δοκιμάστηκε να προσδεθούν τα ίδια ριβοσώματα σε επιφάνειες που δεν περιείχαν το βιοτινυλιωμένο παράγωγο της πολυαιθυλενογλυκόλης, αλλά δεν παρατηρήθηκε φθορισμός στα 670 nm. Το γεγονός αυτό επιβεβαίωσε την ειδική πρόσδεση των ριβοσωμάτων μέσω του δεσμού στρεπταβιδίνης-βιοτίνης και απέκλεισε το ενδεχόμενο μη ειδικής πρόσδεσης λόγω προσρόφησης στην επιφάνεια. Για τον έλεγχο της ενεργότητας των ριβοσωμάτων κάτω από αυτές τις συνθήκες, ελέγχθηκε η ικανότητα των παραπάνω μη ειδικά σημασμένων ριβοσωμάτων να παράγουν την πρωτεΐνη GFPem. Χρησιμοποιήθηκε το μίγμα in vitro μεταγραφήςμετάφρασης και το πλασμίδιο prset με το γονίδιο GFPem 1. Στα 670 nm παρατηρήθηκε το φθορισμοφόρο Atto655 των ριβοσωμάτων με την επιθυμητή πυκνότητα. Κατόπιν, στα 509 nm φάνηκε το φθορισμοφόρο της GFPem. Αυτή η παρατήρηση έδειξε ότι τα ριβοσώματα ήταν ενεργά, έστω και προσδεμένα και 153

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET μάλιστα συνέθεσαν πλήρως λειτουργικές πρωτεΐνες, καθώς για να φανεί το φθορισμοφόρο της GFPem χρειάζεται η πρωτεΐνη να αποκτήσει τη τελική της διαμόρφωση. Η αντίδραση επαναλήφθηκε in situ, ώστε να παρατηρηθεί ο χρόνος κατά τον οποίο εμφανίζονται οι GFPem στα ριβοσώματα. Αρχικά, φάνηκαν τα ριβοσώματα προσδεμένα στην επιφάνεια και μετά την εισαγωγή του μίγματος της in vitro μεταγραφής-μετάφρασης στο θάλαμο ακολούθησαν συνεχείς διεγέρσεις της ίδιας περιοχής στα 488 nm. Οι διεγέρσεις διάρκειας 2 s λάμβαναν χώρα κάθε 15 s αυτόματα, για μία χρονική περίοδο 30 min. Το πρόβλημα της GFPem ήταν η ταχεία φωτόσβεσή της (photobleaching), καθώς η ένταση φθορισμού της μειώνεται σχεδόν αμέσως στο 40 % (Shaner et al. 2005). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα ο φθορισμός της GFPem να παραμένει για πολύ μικρό χρονικό διάστημα και μετά να εξαφανίζεται. Συγκρίνοντας το φθορισμό των μορίων GFPem με το φθορισμό του Atto655 των ριβοσωμάτων, έγινε φανερό ότι μόνο το 10 % περίπου των ριβοσωμάτων συνέθεταν την πρωτεΐνη GFPem. Το αποτέλεσμα αυτό συμφωνούσε απόλυτα με πρόσφατη μελέτη (Uemura et al. 2008) καθώς και με προηγούμενες μετρήσεις μας σε διάλυμα, όπου ριβοσώματα παρήγαγαν συνεχώς την πρωτεΐνη GFPem. Η πρωτεΐνη απελευθερωνόταν στο διάλυμα και κάθε 2 min γινόταν μέτρηση του φθορισμού του διαλύματος. Τα παραπάνω ριβοσώματα δεν είχαν υποστεί καμία τροποποίηση και προέρχονταν από στελέχη E.coli ελεύθερα RNAσών. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι το μικρό ποσοστό των ριβοσωμάτων που παράγει την GFPem δεν οφείλεται σε παρεμπόδιση λόγω της σύνδεσης στην επιφάνεια ούτε λόγω των τροποποιήσεων που υπέστησαν τα ριβοσώματα, αλλά ούτε και λόγω καταστροφής τους από RNAσες. Κατά πάσα πιθανότητα οφείλεται σε ατελή παρεμπόδιση της απελευθέρωσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, καθώς και σε κάποιο ποσοστό μη λειτουργικών ριβοσωμάτων. Τα πειραματικά δεδομένα που αντιστοιχούσαν στους χρόνους εμφάνισης του φθορισμού των μορίων της GFPem περιγράφηκαν με την απλή εκθετική συνάρτηση N(t) = N 0 (1-exp(-k chrom t)). Η χαρακτηριστική σταθερά χρόνου 1/k chrom, θεωρήθηκε ότι σχετίζεται με τον χρόνο σχηματισμού του χρωμοφόρου και βρέθηκε ίση με 5.3 λεπτά. Για να ελεγχθεί η επίδραση της χαρακτηριστικής σταθεράς χρόνου για την αναδίπλωση της πρωτεΐνης 1/k fol στην συνολική διαδικασία, εφαρμόστηκε ένα 154

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET μοντέλο δύο βημάτων που περιγράφεται από την συνάρτηση k N a k N a N t = 2 2 ( ) exp( k t) + N a k t + N k k k k exp( ( ) ( ) ) 1 2 1 2 1 2 Λόγω της εμφανούς απόκλισης του μοντέλου αυτού από τα πειραματικά δεδομένα θεωρήθηκε ότι ο παρατηρούμενος χρόνος εμφάνισης του φθορισμού των μορίων της GFPem οφείλεται κυρίως στο χρόνο σχηματισμού του χρωμοφόρου και οι διεργασίες πριν από αυτή τη χρονική στιγμή λαμβάνουν χώρα πολύ γρήγορα και κατά πάσα πιθανότητα ταχύτερα από ένα λεπτό. Καθώς το σύστημα των προσδεμένων ριβοσωμάτων λειτουργούσε με τον επιθυμητό τρόπο, στη συνέχεια δοκιμάστηκαν να γίνουν τα πειράματα FRET. Χρειάστηκε, όμως, να τροποποιηθεί το γονίδιο της πρωτεΐνης GFPem, ώστε από την μορφή του γονιδίου Α να απομακρυνθεί η ενδιάμεση αλληλουχία των 30-40 αμινοξέων. Δημιουργήθηκε λοιπόν το γονίδιο GFPem 3, το οποίο είχε το κωδικόνιο τερματισμού amber ακριβώς μετά την αρχική μεθειονίνη και αμέσως μετά ουρά έξι ιστιδινών (His-tag). Ακολούθησε πρόσδεση στις επιφάνειες των ριβοσωμάτων που ήταν ειδικά σημασμένα με το φθορισμοφόρο Alexa633 είτε στην πρωτεΐνη L24 είτε στην πρωτεΐνη L29. Χρησιμοποιήθηκε το μίγμα in vitro μεταγραφής-μετάφρασης χωρίς ιστιδίνες και το πλασμίδιο prset με το γονίδιο GFPem 3. Στο μίγμα της in vitro μεταγραφής-μετάφρασης προστέθηκε το trna, που κουβαλούσε μία λυσίνη χημικά συζευγμένη με το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR. Το αντικωδικόνιο του συγκεκριμένου trna είχε μεταλλαχθεί κατάλληλα, ώστε να αναγνωρίζει το κωδικόνιο amber. Με την τεχνική αυτή, του κατασταλτικού trna, ενσωματώθηκε το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR αμέσως μετά την εναρκτήρια μεθειονίνη. Λόγω της μη παρουσίας ιστιδινών η σύνθεση της πρωτεΐνης GFPem σταμάτησε στο His-tag ακριβώς μετά την εισαγωγή του φθορισμοφόρου. Αυτό το σημείο θεωρήθηκε ως χρόνος έναρξης του πειράματος (t = 0). Τα δύο αυτά φθορισμοφόρα αποτελούν ένα ζεύγος FRET, όπου το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR είναι ο δότης και το φθορισμοφόρο Alexa633 ο δέκτης, με ακτίνα Förster R 0 περίπου 70 Å. Κατά το χρόνο t = 0, ο δότης βρίσκεται βαθιά μέσα στο κανάλι του ριβοσώματος σε μία απόσταση 111 Å από τον δέκτη που βρίσκεται στη πρωτεΐνη L29 του ριβοσώματος. Σύμφωνα με την καμπύλη της a 155

ΣΥΖΗΤΗΣΗ FRET απόδοσης της μεταφοράς ενέργειας για το συγκεκριμένο ζέυγος φθορισμοφόρων, το FRET είναι αμελητέο για αυτή την απόσταση. Πράγματι, με διέγερση του δείγματος στα 528 nm ο δότης έδωσε φθορισμό, όμως δεν παρατηρήθηκε φθορισμός του δέκτη, όπως ήταν αναμενόμενο. Με απ ευθείας, όμως, διέγερση του δότη στα 640 nm φάνηκε ο φθορισμός των ριβοσωμάτων. Οι κουκκίδες που παρατηρήθηκαν ήταν αρκετά λιγότερες σε σχέση με τις κουκκίδες του δότη. Αυτό οδήγησε στο συμπέρασμα ότι δεν ήταν όλα τα ριβοσώματα σημασμένα με το φθορισμοφόρο Alexa633. Στη συνέχεια συνεχίστηκε η σύνθεση της πρωτεΐνης με επανάληψη προσθήκης μίγματος in vitro μεταγραφής-μετάφρασης, το οποίο περιείχε αυτή τη φορά όλα τα αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένης της ιστιδίνης. Η πρωτεΐνη μετά το τέλος της σύνθεσης εξακολουθεί να παραμένει συνδεμένη με το ριβόσωμα λόγω της έλλειψης κωδικονίου τερματισμού και της προσθήκης του ολιγοπεπτιδίου AS-tmRNA. Γινόταν διέγερση του δότη κάθε 10 δευτερόλεπτα για 1.5 δευτερόλεπτα στα 528 nm. Εκτός από τον φθορισμό του δότη άρχισε να παρατηρείται και φθορισμός ορισμένων δεκτών, οι οποίοι εμφανίζονταν σε διάφορες χρονικές στιγμές. Οι κουκκίδες αυτές, οι οποίες δεν είχαν παρατηρηθεί προηγουμένως οφείλονταν αποκλειστικά στο φαινόμενο του FRET. Αυτό συμβαίνει μετά την επανέναρξη της σύνθεσης της πρωτεΐνης, καθώς ο δότης βγαίνοντας από το κανάλι του ριβοσώματος πλησιάζει τον δότη. Από ένα σημείο και μετά βρίσκεται μέσα στα όρια της απόστασης, κατά την οποία μπορεί να δώσει σήμα FRET. Το παραπάνω πείραμα απέδειξε ότι το σύστημα λειτουργεί και δίνει σήμα FRET. Μελλοντικά πειράματα με πιο ακριβείς μετρήσεις είναι δυνατόν να προσδιορίσουν επακριβώς τις εντάσεις φθορισμού των δύο φθορισμοφόρων για κάθε χρονική στιγμή, ώστε να καταστή δυνατός ο υπολογισμός της απόστασης μεταξύ των φθορισμοφόρων. Αυτό μπορεί να δώσει ουσιαστικές απαντήσεις στον τρόπο με τον οποίο αναδιπλώνονται οι πρωτεΐνες κατά την διάρκεια της σύνθεσής τους από το ριβόσωμα και κατά πόσο διαφέρει το μονοπάτι που ακολουθούν από πρωτείνες που αναδιπλώνονται in vitro έπειτα από μετουσίωση, αλλά και μεταξύ των μεμονωμένων μορίων. 156

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στο πρώτο μέρος της διατριβής, ριβοσώματα μη ειδικά σημασμένα με το φθορισμοφόρο Atto655 συνδέθηκαν σε χάντρες SiO 2 επικαλυμμένες με στρεπταβιδίνη. Η σύνδεση έγινε μέσω της ριβοσωμικής πρωτεΐνης L4, η οποία βιοτινυλιώθηκε in vivo και κατόπιν ενσωματώθηκε στα ριβοσώματα. Οι χάντρες SiO 2 με τα συνδεδεμένα ριβοσώματα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα με οπτικές λαβίδες. Τα ριβοσώματα συνέθεσαν τις πρωτεΐνες GFPem και ουβικιτίνη πάνω σε μία χάντρα με την εισαγωγή ενός μίγματος in vitro μεταγραφήςμετάφρασης, το οποίο δεν περιείχε το αμινοξύ ιστιδίνη, ώστε να σταματάει η σύνθεση σε μία ουρά έξι ιστιδινών. Το αμινοτελικό άκρο των πρωτεϊνών, το οποίο είχε βιοτινυλιωθεί κατά την σύνθεση με την τεχνική του κατασταλτικού trna, ξεπρόβαλε από το κανάλι του ριβοσώματος και ήταν προσβάσιμο για να συνδεθεί μέσω στρεπταβιδίνης σε μία χάντρα πολυστυρενίου, η οποία ήταν παγιδευμένη στις οπτικές λαβίδες. Με τις οπτικές λαβίδες κατέστη δυνατό να μετρηθούν δυνάμεις στην κλίμακα των pn. Αποδείχθηκε ότι απαιτείται δύναμη μικρότερη των 10 pn, ώστε να διατηρηθεί ανέπαφη η σύνδεση του συστήματος, καθώς με εφαρμογή μεγαλύτερης δύναμης παρατηρήθηκε ρήξη της σύνδεσης. Το επόμενο βήμα θα ήταν να συνεχιστεί η σύνθεση της πρωτεΐνης και να προσδιοριστούν οι δυνάμεις που ασκούνται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα κατά τη διάρκεια της σύνθεσης. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, τα ίδια ριβοσώματα μη ειδικά σημασμένα με το φθορισμοφόρο Atto655 συνδέθηκαν πάνω σε επιφάνειες μέσω της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης L4. Τα ριβοσώματα αυτά ανιχνεύθηκαν πάνω στην επιφάνεια λόγω του φθορισμού τους με ένα μικροσκόπιο ευρέως φάσματος και ήταν ικανά να συνθέσουν, in situ πάνω στο μικροσκόπιο, πλήρως λειτουργική πρωτεΐνη GFPem. Η πρωτεΐνη είχε τροποποιηθεί κατάλληλα ώστε να παραμένει προσκολλημένη στο ριβόσωμα μετά το τέλος της σύνθεσης και ανιχνεύθηκε λόγω του ενδογενούς φθορισμού της. Με το σύστημα αυτό έγινε δυνατή η παρατήρηση των χρόνων εμφάνισης πλήρως λειτουργικών πρωτεϊνών GFPem από μεμονωμένα ριβοσώματα. Ακολούθησε η σύνδεση στις επιφάνειες αυτή τη φορά ριβοσωμάτων ειδικά σημασμένων είτε στην πρωτεΐνη L24 είτε στην πρωτεΐνη L29 με το φθορισμοφόρο 157

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Alexa633 (δέκτης). Τα ριβοσώματα αυτά συνέθεσαν την πρωτεΐνη GFPem, στην οποία εισήχθη το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR (δότης) κατά την διάρκεια της σύνθεσης με την τεχνική του κατασταλτικού trna. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, γινόταν διέγερση μόνο του δότη ανά τακτά χρονικά διαστήματα αλλά ανίχνευση του φθορισμού και του δότη και του δέκτη. Η σύνθεση σταμάτησε και πάλι σε μία ουρά έξι ιστιδινών, αμέσως μετά την εισαγωγή του BODIPY-TMR. Σε αυτό το σημείο τα φθορισμοφόρα απείχαν μεταξύ τους 111 Å, απόσταση αρκετά μακρινή και δεν παρατηρήθηκε FRET. Με την επανέναρξη, όμως, της σύνθεσης, παρατηρήθηκε ότι κάποιοι από τους δέκτες άρχισαν να φθορίζουν, γεγονός που οφειλόταν αποκλειστικά στο φαινόμενο του FRET. Το επόμενο βήμα θα ήταν να προσδιοριστούν επακριβώς οι εντάσεις φθορισμού των δύο φθορισμοφόρων για κάθε χρονική στιγμή, ώστε να υπολογιστούν οι αποστάσεις μεταξύ τους και να δοθεί μία πρώτη εντύπωση για το πως αναδιπλώνεται η πρωτεΐνη κατά τη διάρκεια της σύνθεσής της. 158

SUMMARY SUMMARY In the first part of the thesis, ribosomes unspecifically labeled with the fluorescent dye Atto655 were tethered onto SiO 2 beads covered with streptavidin. The ribosomes were tethered via protein L4, which was biotinylated in vivo and incorporated into the ribosomes. The ribosomes tethered onto the beads were used for experiments with optical tweezers. The ribosomes synthesized the proteins GFPem and ubiquitin on a bead by adding an in vitro transcription-translation mix without histidine, in order to stop synthesis in a His-tag. The N-terminus of the proteins, which was biotinylated during synthesis using the suppressor trna technique, was barely sticking out of the ribosomal tunnel and it was accessible to bind via streptavidin to a polystyrene bead, which was trapped with the optical tweezers. With the optical tweezers it was possible to measure forces in a pn scale. It was shown that in order to keep a steady hook-up, a force lower than 10 pn should be applied, since higher forces lead to a rupture. The next step would be to continue synthesis of the protein and determine the forces applied on the polypeptide chain during synthesis. In the second part of the thesis, the same kind of ribosomes, unspecifically labeled with the dye Atto655, were tethered onto surfaces via the biotinylated protein L4. These ribosomes were detected on the surface due to their fluorescence using a wide field microscope and they were able to produce a fully active GFPem protein in situ. The protein was modified in order to remain attached to the ribosome after synthesis and it was detected due to its intrinsic fluorescence. Time resolved measurements were made and the time of appearance of fully active GFPem proteins synthesized by single ribosomes was observed. Surface tethering of specifically labeled ribosomes on protein L24 or L29 with the dye Alexa633 (acceptor) followed. These ribosomes synthesized protein GFPem, where the dye BODIPY-TMR (donor) was incorporated during synthesis using the suppressor trna technique. During the experiments, the donor was excited at certain times but both donor and acceptor were detected. Synthesis was stopped again in a His-tag, immediately after the incorporation of BODIPY-TMR. At this point, the two dyes were 111 Å apart, quite far away to 159

SUMMARY observe FRET. But by continuing synthesis, the appearance of some acceptor fluorescence was observed, exclusively due to FRET. The next step would be to determine exactly the fluorescence intensities of both dyes in a time resolved manner and calculate the distances between them. After that a first impression of how the protein folds co-translationally could be given. 160

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 2D SDS-PAGE 30S 40S 50S 60S 70S 80S Α 280, Α 260, Α 600 aa-trna AFM ALEX AOTF AP APS ATP BCA BCCP BCIP BPL BS BSA CBB CCD CIAP CP DCM DM DMSO DNA dntps : Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων : Μικρή υπομονάδα προκαρυωτικού ριβοσώματος : Μικρή υπομονάδα ευκαρυωτικού ριβοσώματος : Μεγάλη υπομονάδα προκαρυωτικού ριβοσώματος : Μεγάλη υπομονάδα ευκαρυωτικού ριβοσώματος : Πλήρες προκαρυωτικό ριβόσωμα : Πλήρες ευκαρυωτικό ριβόσωμα : Απορρόφηση στα 280, 260 και 600 nm, αντίστοιχα : Αμινοάκυλο-tRNA : Μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων : Εναλλασσόμενη διέγερση δείγματος με laser : Ακουστο-οπτικά ρυθμιζόμενο φίλτρο : Αλκαλική φωσφατάση : Υπερθειϊκό αμμώνιο : Αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ : Δικιγχονινικό οξύ : Μεταφορική πρωτεΐνη της καρβοξυλάσης της βιοτίνης : 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-φωσφορικό : Πρωτεϊνική λιγάση της βιοτίνης : Διαχωριστής δέσμης : Αλβουμίνη βόειου ορού : Coomasie Brilliant Blue : Στοιχείο συζευγμένου φορτίου : Αλκαλική φωσφατάση από έντερο μοσχαριού : Κεντρική προεξοχή στην κεφαλή της 50S υπομονάδας : 4-δικυανομεθύλενο-2-μέθυλο-6-p- διμεθυλαμινοστύλυλο -4H-πυράνιο : Διχρωματικό κάτοπτρο : Διμεθυλοσουλφοξείδιο : Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ : Τριφωσφορικοί εστέρες δεοξυριβονουκλεοζιτών 161

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ddntps dsdna DTT dyt ECL EDTA EF EtBr eu F.I. FI FP ή UP FRET GDP GFPem GTP HEPES His-tag HPNAP HRP IF IPTG LB LED MES MOPS mrna NA NBT NHS ester Ni-NTA ORF PAGE PBS : Τριφωσφορικοί εστέρες διδεοξυριβονουκλεοζιτών : Δίκλωνο μόριο δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος : Διθειοθρεϊτόλη : Θρεπτικό υλικό : Ενισχυμένη χημειοφωταύγεια : Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ : Παράγοντες επιμήκυνσης της πεπτιδικής αλυσίδας : Βρωμιούχο αιθίδιο : Ισοδύναμη μονάδα : Ένταση φθορισμού : Φίλτρο χαμηλής συχνότητας : Άνω εκκινητής : Μεταφορά ενέργειας λόγω συντονισμού κατά Förster : Γουανοσινοδιφωσφορικό οξύ : Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη emerald : Γουανοσινοτριφωσφορικό οξύ : Ν-2-υδροξυαιθυλ-πιπεραζιν-Ν -2-αιθανοσουλφονικό οξύ : Ουρά 6 ιστιδινών : Πρωτεΐνη από το H. pylori που ενεργοποιεί τα ουδετερόφιλα : Υπεροξειδάση του χρένου (αγριοράπανου) : Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης : Ισοπροπυλ-β-D-1-θειογαλακτοπυρανοζίδιο : Θρεπτικό υλικό Luria-Bertani : Δίοδος εκπομπής φωτός : 2-(N-μορφόλινο)αιθανοσουλφονικό οξύ : 3-(Ν-μορφόλινο)προπανοσουλφονικό οξύ : Μόριο αγγελιοφόρου ριβονουκλεϊκού οξέος : Αριθμητικό άνοιγμα φακού : Κυανούν του νιτροτετραζολίου : N-υδροξυεστέρας του σουκινιμιδίου : Σφαιρίδια νικελίου-νιτριλοοξικού οξέος : Ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο : Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου : Διαχωριστής πολωμένης δέσμης 162

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ PCR PEG poly (U) PTC PVDF : Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης : Πολυαιθύλενο γλυκόλη : Πολυουριδυλικό οξύ : Κέντρο της πεπτίδυλοτρανσφεράσης : Πολυβινυλοδιφθορίδιο QW : Πλακίδια καθυστέρησης φάσης λ 4 RF RNA RNP RP ή LP rpm RRF rrna SD SDS SOB Sulfo-SMCC TAE TBE TCA TCEP TEMED TF TMR tmrna TP50 Tris trna trna f met : Παράγοντες απελευθέρωσης : Ριβονουκλεϊκό οξύ : Ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο : Κάτω εκκινητής : Στροφές ανά λεπτό : Παράγοντας ανακύκλωσης του ριβοσώματος : Ριβοσωμικό ριβονουκλεϊκό οξύ : Περιοχή Shine-Dalgarno : Άλας του θειϊκού δωδεκυλίου με νάτριο : Θρεπτικό υλικό : Σουλφο-σουκινιμίδυλο-4-(N-μαλεϊμιδομέθυλο) κυκλοεξάνο 1-καρβοξυλικός εστέρας : Tris-οξικό EDTA : Tris-βορικό EDTA : Τριχλωροοξικό οξύ : Τρις-(2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη : Ν,Ν,-τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη : Βοηθητικός παράγοντας των βακτηρίων που παίζει ενεργό ρόλο στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών : Τετραμέθυλο-ροδαμίνη : Μόριο που δρα αρχικά ως trna και έπειτα ως mrna : Σύνολο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών της 50S υπομονάδας : Τρις-υδροξυ-μεθυλ-αμινομεθάνιο : Μόριο μεταφορικού ριβονουκλεϊκού οξέος : Εναρκτήριο μόριο trna που αναγνωρίζει τo εναρκτήριο κωδικόνιο AUG 163

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ trna met v/v w/v WM : Μόριο trna που αναγνωρίζει τα κωδικόνια των εσωτερικών μορίων της μεθειονίνης : Όγκος κατ όγκο : Βάρος κατ όγκο : Σφηνοειδές διχρωματικό κάτοπτρο 164

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1. ΧΑΡΤΗΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟΥ pet11a 165

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 2. ΧΑΡΤΗΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟΥ pbiracm 166