Κεντρικό δόγμα της βιολογίας DNA RNA Πρωτεΐνη
Μεταγραφή Σύνθεση (μονόκλωνου) RNA από ένα δίκλωνο μόριο DNA κυρίως με τη βοήθεια του ενζύμου RNA πολυμεράση Το προϊόν της μεταγραφής ονομάζεται πρωτογενές μετάγραφο από το οποίο προκύπτουν: mrna trna rrna
Μεταγραφή: Βασικές αρχές
Ορισμός της μεταγραφικής μονάδας
Ημεταγραφικήθηλειά Προσωρινή δομή, μήκους 12-14 βάσεων, που δημιουργείται από την RNA πολυμεράση. Το μήκος του υβριδικού μορίου DNA:RNA είναι κατά τι μικρότερο (8-9 βάσεις)
Ημεταγραφικήθηλειά Καθώς η μεταγραφική θηλιά προχωρά, το δίκλωνο DNA επανασχηματίζεται πίσω της, εκτοπίζοντας το RNA στη μορφή μονόκλωνης πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας.
Κατά τη μεταγραφή, η θηλιάδιατηρείταιμέσαστηrna πολυμεράση, η οποία αποδιατάσσει και επαναδιατάσσει το DNA συνθέτοντας RNA.
Το ένζυμο προσδένεται στον υποκινητή και αποδιατάσσει το DNA, παραμένει στάσιμο στην έναρξη, μετακινείται κατά μήκος του DNA στην επιμήκυνση και αποσυνδέεται στον τερματισμό. Στάδια της μεταγραφής
RNA πολυμεράση του φάγου Τ7 Η T7 RNA πολυμεράση έχει ένα βρόχο ειδικότητας που προσδένει τις θέσεις -7 έως -11 του υποκινητή, ενώ οι θέσεις -1 έως -4 εισέρχονται στο ενεργό κέντρο.
Βακτηριακή RNA πολυμεράση Οι υπομονάδες β (κυανό) και β (ροζ) της βακτηριακής RNA πολυμεράσης έχουν ένα κανάλι για την αλυσίδαμήτρα του DNA. Η σύνθεση ενός μεταγράφου RNA (χρώμα του χαλκού) έχει μόλις αρχίσει. Μέσα σε μια μεταγραφική θηλιά η αλυσίδα-μήτρα (κόκκινο) και η κωδική αλυσίδα (κίτρινο) έχουν διαχωριστεί.
RNA πολυμεράση στους ευκαρυωτικούς ΗθέσηδέκαυπομονάδωντηςRNA πολυμεράσης έχει χαρτογραφηθεί στην κρυσταλλική δομή (πλήν των 4 και 7).
Η πλευρική άποψη της κρυσταλλικής δομής της RNA πολυμεράσης ΙΙ του ζυμομύκητα δείχνει ότι το DNA συγκρατείται καθοδικά από ένα ζεύγος σιαγόνων.
H οπίσθια άποψη της κρυσταλλικής δομής της RNA πολυμεράσης ΙΙ δείχνει ότι το DNA περιβάλλεται κατά ~270 από τις υπομονάδες.
Το DNA αναγκάζεται να κάνει μια στροφή στο ενεργό κέντρο εξαιτίας ενός τοιχώματος του ενζύμου και τα νουκλεοτίδια εισέρχονται στο ενεργό κέντρο μέσα από έναν πόρο.
εσμοί DNA, RNA και RNA πολυμεράσης Η μετακίνηση μιας πολυμεράσης νουκλεϊκών οξέων απαιτεί ρήξη και επανασύνδεση δεσμών με νουκλεοτίδια που καταλαμβάνουν σταθερές θέσεις στη δομή του ενζύμου. Τα νουκλεοτίδια που βρίσκονται στις θέσεις αυτές του ενζύμου αλλάζουν κάθε φορά που το ένζυμο μετακινείται κατά μία βάση, κατά μήκος του υποστρώματος.
Οκύκλοςεπιμήκυνσηςτης RNA πολυμεράσης (βακτηριακής και ευκαρυωτικής) αρχίζει με την πρωτεϊνική γέφυρα σε ευθυτενή διάταξη, δίπλα στη θέση εισόδου των νουκλεοτιδίων. Μετά την προσθήκη του νουκλεοτιδίου, το ένζυμο μετακινείται κατά ένα ζεύγος βάσεων και η γέφυρα κάμπτεται διατηρώντας την επαφή με το νουκλεοτίδιο που μόλις προστέθηκε. Όταν αποδεσμευτεί η γέφυρα, ο κύκλος μπορεί να ξαναρχίσει.
Οι RNA πολυμεράσες των ευβακτηρίων αποτελούνται από τέσσερα είδη υπομονάδων: οι υπομονάδες α, β και β έχουν σχετικά σταθερά μεγέθη σε διάφορα είδη βακτηρίων, ενώ η υπομονάδα σ ποικίλλει σε μέγεθος.
RNA πολυμεράση: Κεντρικό ένζυμο (α2ββ ) και ολοένζυμο στα βακτήρια 1. Αρχικά, το κεντρικό ένζυμο προσδένεται αδιακρίτως σε οποιαδήποτε αλληλουχία DNA (χαλαρή πρόσδεση). 2. Στη συνέχεια, ο παράγων σ μειώνει τη συγγένεια για τις τυχαίες αλληλουχίες και παρέχει εξειδίκευση για τους υποκινητές. 3. ΜΟΝΟ το ολοένζυμο μπορεί να αρχίσει την μεταγραφή. 4. Μόλις η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα του RNA φτάσει τις 8-9 βάσεις, ο παράγων σ αποδεσμεύεται και το κεντρικό ένζυμο συνεχίζει την επιμήκυνση => Το κεντρικό ένζυμο μπορεί να συνθέτει RNA παρουσία DNA αλλά ΟΧΙ και να αρχίσει τη μεταγραφή από μόνο του.
Παράγων σ Το κεντρικό ένζυμο προσδένεται αδιακρίτως σε οποιαδήποτε αλληλουχία DNA. Ο παράγοντας σ μειώνει τη συγγένεια για τις τυχαίες αλληλουχίες και παρέχει εξειδίκευση για τους υποκινητές.
Κλειστό δυαδικό σύμπλοκο (DNA σε δίκλωνη μορφή + ολοένζυμο) Ανοικτό δυαδικό σύμπλοκο (DNA εν μέρει σε ανοικτή μορφή + ολοένζυμο) Τριαδικό σύμπλοκο (RNA + DNA εν μέρει σε ανοικτή μορφή + ολοένζυμο) Εκκαθάριση υποκινητή για ΝΕΑ έναρξη!
Το μήκος του DNA που δεσμεύεται από την RNA πολυμεράση αλλάζει καθώς προχωρά από την έναρξη στην επιμήκυνση.
Το κεντρικό ένζυμο και το ολοένζυμο κατανέμονται στο DNA, ενώ υπάρχει πολύ μικρή ποσότητα ΕΛΕΥΘΕΡΗΣ RNA πολυμεράσης.
Εύρεση υποκινητή στα βακτήρια Μήκος υποκινητή: 60 βάσεις Μήκοςγονιδιώματοςβακτηρίου(E.coli): 4.000.000 βάσεις! ΤΡΙΑ πιθανά μοντέλα για την αναγνώριση του υποκινητή: 1. Τυχαία διάχυση προς κάποιον υποκινητή 2. Ολίσθηση κατά μήκος του DNA 3. Τυχαίαδιάχυσηπροςολόκληροτογονιδίωμακαι ΑΜΕΣΗ μετατόπιση
Η κινητική σταθερά πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης στους υποκινητές, όπως έχει μετρηθεί in vitro είναι γρηγορότερη από εκείνη της τυχαίας διάχυσης.
Σύμφωνα με τα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα, η RNA πολυμεράση δεν ολισθαίνει κατά μήκος του DNA.
Η RNA πολυμεράση προσδένεται πολύ γρήγορα σε τυχαίες αλληλουχίες DNA και θα μπορούσε να βρει έναν υποκινητή με άμεση μετατόπιση από μία προσδεδεμένη αλληλουχία DNA σε άλλη.
Οπαράγονταςσκαιτοκεντρικό ένζυμο ανακυκλώνονται σε διαφορετικές φάσεις κατά τη μεταγραφή.
Αλληλουχία ενός τυπικού υποκινητή στα βακτήρια Ένας τυπικός υποκινητής αποτελείται από τρία στοιχεία: 1. Την πρότυπη αλληλουχία στη θέση -35, 2. Την πρότυπη αλληλουχία στη θέση -10 (ΤΑΤΑ box), 3. Το σημείο έναρξης μεταγραφής.
Αλληλουχία ενός τυπικού υποκινητή στα βακτήρια ΜΕ ΠΟΙΟ ΤΡΟΠΟ ΒΡΕΘΗΚΕ/ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΒΡΕΘΕΙ Η ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΟΥ ΤΥΠΙΚΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ;;
Ηαλληλουχία-35 χρησιμοποιείται για την αρχική αναγνώριση του υποκινητή. ΜΕ ΠΟΙΟ ΤΡΟΠΟ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΒΡΕΘΗΚΕ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ;; Ηαλληλουχία-10 χρησιμοποιείται για την αντίδραση τήξης, που μετατρέπει ένα κλειστόσύμπλοκοσε ανοικτό.
Πειραματικός προσδιορισμός των αλληλουχιών ενός τυπικού υποκινητή Ημέθοδοςτηςιχνηλάτησης προσδιορίζει τις θέσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών στο DNA βάσει της προστασίας που παρέχουν ενάντια στη δημιουργία εγκοπών από DNA νουκλεάσες.
Η μία όψη του υποκινητή περιέχει τα σημεία επαφής με την RNA πολυμεράση.
Τερματισμός της μεταγραφής στα βακτήρια Οι αλληλουχίες DNA που απαιτούνται για τον τερματισμό εντοπίζονται πριν την αλληλουχία τερματισμού στη μεταγραφόμενη περιοχή. Ίσως είναι αναγκαίος ο σχηματισμός μιας φουρκέτας στο RNA.
Τερματισμός της μεταγραφής στα βακτήρια Οι αλληλουχίες DNA που απαιτούνται για τον τερματισμό της μεταγραφής μπορεί να διαφέρουν στην αποτελεσματικότητά τους στον τερματισμό. Σε κάποιες από αυτές, ο τερματισμός μπορεί να αποτραπεί από ειδικούς βοηθητικούς παράγοντες (αντιτερματισμός), οι οποίοι αλληλεπιδρούν με την RNA πολυμεράση => φαινόμενο read through.
Ομοιότητες έναρξης και τερματισμού μεταγραφής στο βακτήρια ιάσπαση δεσμών υδρογόνου κατά την τήξη του DNA και την αποδιάταξη του υβριδίου RNA:DNA. Αλληλεπίδραση επιπλέον πρωτεϊνών με τη κεντρικό ένζυμο της RNA πολυμεράσης. Και τα 2 στάδια διεκπεραιώνονται από εναλλακτικές μορφές της RNA πολυμεράσης.
Αλληλουχίες τερματισμού μεταγραφής στα βακτήρια Ενδογενείς τερματιστές: Θέσεις τερματισμού της μεταγραφής απουσία κάθε άλλου παράγοντα. Rho-εξαρτόμενοι τερματιστές: Αλληλουχίες στο νεοσυντιθέμενο RNA στις οποίες προσδένεται ο παράγων ρ (Rho), μια πρωτεϊνη τερματισμού της μεταγραφής.
Οι ενδογενείς αλληλουχίες τερματισμού περιλαμβάνουν παλίνδρομες περιοχές οι οποίες σχηματίζουν φουρκέτες (δομές στελέχουςβρόχου) με ποικίλο μήκος, από 7-20 bp. Η δομή στελέχους-βρόχου περιλαμβάνει μια περιοχή πλούσια σε G-C και ακολουθείται από μια σειρά καταλοίπων U. 1.100 αλληλουχίες (50% των γονιδίων) στο γονιδίωμα της E.coli πληρούναυτάτακριτήρια.
Ένας Rho-εξαρτώμενος τερματιστής έχει αλληλουχία πλούσια σε C και φτωχή σε G, και εντοπίζεται πριν από την ακριβή θέση (ή θέσεις) τερματισμού. Η αλληλουχία παρουσιάζεται με τη μορφή του RNA. Αντιπροσωπεύει το 3 άκροτουrna.
Ο παράγοντας Rho «καταδιώκει» την RNA πολυμεράση κατά μήκος του RNA και μπορεί να προκαλέσει τερματισμό όταν προλάβει το στάσιμο ένζυμο σε μια Rho-εξαρτώμενη αλληλουχία τερματισμού.
Ιδιότητες παράγοντα ρ Η κίνηση του παράγοντα ρ κατά μήκος της νεοσυντιθεμένης αλυσίδας του RNA εξασφαλίζεται από την ενέργεια που παρέχει η υδρόλυση ΑΤΡ (RNA-εξαρτώμενη ενεργότητα). Ο παράγων ρ πρέπει να έχει πρόσβαση στην αλληλουχία πρόσδεσής του και να μπορεί να κινηθεί κατά μήκος του RNA => παρεμποδίζεται από ριβοσώματα => ο τερματισμός της μεταγραφής εξαρτάται από τη μετάφραση.
Αντιτερματισμός Ο αντιτερματισμός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της μεταγραφής, καθορίζοντας το αν η RNA πολυμεράση θα τερματίσει τη σύνθεση του RNA ή αν θα πραγματοποιήσει αναγνωστική διέλευση προχωρώντας προς την περιοχή που ακολουθεί. Ο αντιτερματισμός επιτυγχάνεται από τις πρωτεΐνες αντιτερματισμού που προσδένονται στην RNA πολυμεράση και επιτρέπουν τη διέλευσή της από την/ις αλληλουχία/ες-τερματιστή/ες. Ανακαλύφθηκε στους φάγους σαν ρυθμιστικός μηχανισμός της γονιδιακής έκφρασης.
Η RNA πολυμεράση του ξενιστή μεταγράφει τα γονίδια του φάγου λ και τερματίζει τη μεταγραφή στις θέσεις t. ΗπρωτεΐνηpN επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση της RNA πολυμεράσης από τις αλληλουχίες τερματισμού tl και tr. Η πρωτεΐνηpq επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση της RNA πολυμεράσης από την αλληλουχία τερματισμού tr. Τασημείασταοποίαδραη pn (nut) και η pq (qut) εντοπίζονται αντίστοιχα σε διαφορετικές σχετικές θέσεις στις μεταγραφικές μονάδες.
GENES VIII Κεφάλαιο 9: Παράγραφοι 9.1 9.14 (σελ. 333-358) Παράγραφοι 9.20 9.24 (σελ. 371-379)
Βοηθητικοί παράγοντες προσδένονται στην RNA πολυμεράση καθώς διέρχεται από τη θέση nut. Αυτοί εμποδίζουν τον Rho να προκαλέσει τερματισμό, όταν η πολυμεράση φτάσει στην αλληλουχία τερματισμού.