Λειτουργικές και γονιδιωματικές μελέτες επί της αποαδενυλίωσης: ο ρόλος του γονιδίου PNLDC1

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Λειτουργικές και γονιδιωματικές μελέτες επί της αποαδενυλίωσης: ο ρόλος του γονιδίου PNLDC1 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΑΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2016

2

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Ιατρικές Επιστήμες του Τμήματος Ιατρικής, του Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Σταθόπουλος (Επιβλέπων Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Διονύσιος ραΐνας (Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Γεώργιος Σπυρούλιας (Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Σταθόπουλος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Διονύσιος ραΐνας Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Σπυρούλιας Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Ζωή Λυγερού Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Νικόλαος Μοσχονάς Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Σταύρος Ταραβήρας Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ιονύσιος Παπαχρήστου Aναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Η παρουσίαση της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε στις 21/01/2016 ενώπιον της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Ιατρικής δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 2). 3

4

-Ευχαριστίες- Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους των οποίων οι υποδείξεις, η βοήθεια και η υποστήριξη υπήρξαν πολύτιμες για την διεκπεραίωση αυτής της εργασίας. Κατ αρχάς, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα Καθηγητή, Κωνσταντίνο Σταθόπουλο για την ευκαιρία που μου έδωσε να πραγματοποιήσω μία ενδιαφέρουσα διατριβή και για την άρτια καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της συγκεκριμένης διατριβής από την οποία αποκόμισα όλα τα απαραίτητα εφόδια για να μπορέσω να συνεχίσω. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Βιοχημείας ιονύσιο ραΐνα για τη φιλική υποστήριξη, την συνεργασία και την προθυμία του να με συμβουλεύσει για οποιοδήποτε πειραματικό ζήτημα και τον Καθηγητή της Φαρμακευτικής Γεώργιο Σπυρούλια για την βοήθεια και για την άψογη και ευχάριστη συνεργασία με όλη την ερευνητική του ομάδα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την συμφοιτήτρια και συνάδελφο Μαρία Αποστολίδη με την οποία εργαστήκαμε τα τελευταία 5 χρόνια περνώντας άπειρες ευχάριστες και δύσκολες ώρες στο εργαστήριο και τους μεταπτυχιακούς φοιτητές Θένια και Ηλία για την ευχάριστη και φιλική συνεργασία. Οφείλω να πω ότι ο Ηλίας βοήθησε πολύ στην διεκπεραίωση της εργασίας αυτής και εγώ με πολύ χαρά τον μύησα στον πάγκο. Και οι δυό μας μάθαμε πολλά κατά την συνεργασία μας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Κατερίνα Γραφανάκη, μέλος του εργαστηρίου και υποψήφια διδάκτορα όχι μόνο για την συνεργασία μας στο επίπεδο του διδακτορικού αλλά και για την ευχάριστη συνεργασία σε άλλα projects όπου πραγματοποιήσαμε αρκετά ενδιαφέροντα πειράματα, τους διδάκτορες πλέον, Χρυσαυγή Τουμπέκη με την οποία είχαμε εποικοδομητική συνεργασία και τον φίλο μου Μάριο Κροκίδη. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους διδακτορικούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές με τους οποίους είχαμε μια πολύ ευχάριστη συνεργασία, την Γωγώ, την Ράνια, την Σοφία Πυθαροπούλου, την Σοφία Κόκορη, τα παιδιά από την ομάδα της κυρίας Λυγερού, Αλεξάνδρα, Νίκο, Πατρούλα και Μαρίνα και την ομάδα του κυρίου Παπαχρήστου, την Έλενα και τον Νίκο. Δεν πρέπει να ξεχάσω να ευχαριστήσω τον Θάνο Παπακυριακού, ερευνητή του Εθνικού Κέντρου Έρευνας Φυσικών Επιστημών «Δημόκριτος», για την κατασκευή του μοντέλου της PNDC1 και τον Πέτρο Γκιάστα, ερευνητή του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, για τις μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Την παρούσα διατριβή αφιερώνω στους γονείς μου και τα αδέλφια μου για την υποστήριξη τους όλα αυτά τα χρόνια. 5

6

-Περιεχόμενα- Περίληψη... 13 Abstract... 15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 17 1. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης πριν την μεταγραφή... 18 2. O κεντρικός ρόλος του μηνυματοφόρου RNA (mrna) στην γονιδιακή έκφραση 23 2.1 Η διαδικασία της μεταγραφής των μορίων mrna... 23 2.2 Μια 5 καλύπτρα προστίθεται στο νέοσυντιθέμενο mrna... 24 2.3 Τα πρόδρομα μόρια mrna πολυαδενυλίωνονται... 25 2.4 Μάτισμα και απομάκρυνση ιντρονίων... 27 3. Μηχανισμοί ελέγχου της ποιότητας του mrna... 28 3.1 Nonsense-mediated decay... 28 3.2 Non-stop decay... 29 3.3 No-go decay... 30 4. Αποικοδόμηση του mrna... 31 4.1 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από αποαδενυλίωση... 32 4.2 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από την αφαίρεση της καλύπτρας... 33 4.3 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση... 34 5. Αποαδενυλίωση... 34 5.1 Ποικιλότητα αποαδενυλασών... 35 5.2 Δομικά χαρακτηριστικά απαδενυλασών... 38 5.3 Βιοχημικά χαρακτηριστικά αποαδενυλασών... 42 5.4 Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της κατάλυσης από αποαδενυλάσες.... 45 5.5 Βιολογική λειτουργία αποαδενυλασών... 46 6. Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης... 48 6.1 Μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων που κωδικοποιούν αποαδενυλάσες... 49 6.2 Υποκυττάριος εντοπισμός αποαδενυλασών... 50 6.3 Εντοπισμός αποαδενυλασών σε κοκκία... 51 6.4 Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης από cis-ρυθμιστικά στοιχεία του mrna, από εξωκυττάρια σήματα και ρυθμιστικές πρωτεΐνες... 53 7

6.5 Αντισταθμιστική πολυαδενυλίωση... 56 6.6 Έλεγχος της αποαδενυλίωσης μέσω συμπλόκων πολλαπλής λειτουργίας... 57 7. Ο ρόλος της RNA παρεμβολής στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω αποαδενυλίωσης... 59 8. Αποαδενυλίωση και ασθένειες... 60 9. Ο ρόλος της αποαδενυλίωσης στη διαφοροποίηση... 62 ΣΚΟΠΟΣ... 65 ΥΛΙΚΑ... 69 1. Χημικά-Kit... 70 2. Ένζυμα-πρωτεΐνες... 72 3. Βακτηριακά στελέχη... 73 4. Αντισώματα... 73 5. Πλασμιδιακοί φορείς... 73 6. Εκκινητές (primers)... 77 7. Oλιγονουκλεοτιδια... 78 ΜΕΘΟΔΟΙ... 79 1. In silico ανάλυση του γονιδίου PNLDC1... 80 1.1 Ομοπαράθεση και φυλογενετική ανάλυση... 80 1.2 Προσομοίωση μοριακής δυναμικής (Molecular Dynamics Simulation)... 80 2. Ανοσοϊστοχημεία Ανοσοφθορισμός... 81 2.1 Ανοσοϊστοχημεία... 81 2.2 Ανοσοφθορισμός... 82 3. Κλωνοποίηση PNLDC1 ανθρώπου και ποντικού σε φορείς έκφρασης... 82 3.1 Στρατηγική κλωνοποίησης... 82 3.2 Αντίστροφη μεταγραφή... 84 3.3 Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR)... 85 3.4 Απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA... 85 3.5 Σύνδεση τμημάτων DNA... 86 8

-Περιεχόμενα- 3.6 Μεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα E. coli με ηλεκτροδιάτρηση... 87 3.7 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα... 88 3.8 Κλωνοποίηση σε φορείς pet και pcdna3.1... 88 4. Μέθοδοι απομόνωσης, καθαρισμού και ανάλυση πρωτεϊνών... 90 4.1 Παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών... 90 4.2 Ηλεκτροφόρηση πολυπεπτιδίων σε πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου... 91 4.3 Χρώση με Coomassie Brilliant Blue... 92 4.4 Ανάλυση με ανοσοαποτύπωση (Western blot analysis)... 92 4.5 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης... 93 4.6 Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic light scattering, DLS)... 94 5. In vitro δοκιμές αποαδενυλίωσης... 95 5.1 Σήμανση ολιγονουκλεοτιδίων στο 5 άκρο τους με γ 32Ρ ΑΤΡ... 95 5.2 Δοκιμές εύρεσης βέλτιστων συνθηκών ενζυμικής δραστικότητας... 95 5.3 Κινητική ανάλυση της PNLDC1... 97 6. ιατήρηση και καλλιέργεια κυτταρικών σειρών... 97 6.1 Απόψυξη κυττάρων... 97 6.2 Ανακαλλιέργεια... 97 6.3 Φύλαξη κυττάρων... 98 6.4 Καλλιέργεια εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού.... 98 6.5 Διαφοροποίηση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων προς νευρικά βλαστικά και μεσόδερμα... 99 6.6 Διαμόλυνση κυττάρων θηλαστικών με χρήση λιποσωμάτων (Lipofection)... 99 6.7 Μονιμοποίηση κυττάρων που περιέχουν φθορίζουσα πρωτεΐνη... 100 6.8 Χορήγηση 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνης σε κυτταρικές σειρές... 100 7. Μέθοδοι απομόνωσης και ελέγχου RNA από κύτταρα και ιστούς... 101 7.1 Απομόνωση RNA από τα κύτταρα με τη χρήση προτυποποιημένων στηλών (Ambion)... 101 7.2 Έλεγχος ποιότητας του απομονωμένου RNA... 102 8. Ανάλυση με μικροσυστοιχίες DNA... 103 9. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο... 103 10. Next generation sequencing σε πλατφόρμα Ion Torrent (Life Technologies).. 106 9

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 109 1. Το γονίδιο PNLDC1 ανιχνεύεται στα γονιδιώματα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών... 110 2. Μελέτες έκφρασης του PNLDC1 υποδηλώνουν επιγενετικό έλεγχο μέσω μεθυλίωσης... 113 3. Το γονίδιο Pnldc1 παρουσιάζει ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης... 114 4. Η έκφραση του Pnldc1 εντοπίζεται σε πρώιμα γαμετοτοκύτταρα... 117 5. Κλωνοποίηση-Απομόνωση και κατάσταση ολιγομερισμού της PNLDC1... 120 6. Βιοχημικός χαρακτηρισμός PNLDC1... 123 6.1 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών in vitro δραστικότητας... 123 6.2 Εύρεση ειδικότητας ως προς το υπόστρωμα... 126 6.3 Κινητική ανάλυση της PNLDC1... 127 7. Προσδιορισμός πιθανών δομικών χαρακτηριστικών της PNLDC1... 129 8. Η PNLDC1 είναι μια αποαδενυλάση που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα... 132 9. Η Pnldc1 παρουσιάζει μεταβαλλόμενο πρότυπο έκφρασης κατά την διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων... 133 10. Έκφραση του PNLDC1 σε διαφοροποιημένα κύτταρα μεταβάλει το πρότυπο έκφρασης των σημαντικότερων αποαδενυλασών.... 136 11. Αποσιώπηση του pnldc1 σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και NGS ανάλυση αποκαλύπτει σημαντικές μεταβολές στην έκφραση σημαντικών παραγόντων της πολυδυναμίας και της διαφοροποίησης.... 139 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 145 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 163 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ... 175 10

-Συντομογραφίες- 2 PDE 2',5'-phosphodiesterase 12 2 PDE 2',5'-phosphodiesterase 12 AGO2 Argonaute protein-2 bp Base pair CAP 5' cap structure CBP80 Nuclear cap-binding protein subunit 1 CCR4b/CNOT6L CCR4-NOT transcription complex subunit 6 - Like CCR4 NOT CCR4-NOT transcription complex CDKN1B CDKN1B protein CFI Cleavage factor I CFII Cleavage factor II CPEB Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein CPSF Cleavage and polyadenylation specificity factor CStF Cleavage stimulatory factor CTD C-terminal domain CUP Transcriptional activator protein DCP2 mrna-decapping enzyme subunit 2 Dhh1 ATP-dependent RNA helicase DHH1 DIS3L2 DIS3-like exonuclease 2 DNMT1 DNA methyltransferase 1 DNMT2 DNA methyltransferase 2 DNMT3a DNA methyltransferase 3a DNMT3b DNA methyltransferase 3b DNMT3L DNA methyltransferase 3L EDC1 Enhancer of mrna-decapping protein 1 EDC3 Enhancer of mrna-decapping protein 3 EEP Exonuclease-endonuclease-phosphatase EF1A EF1a protein eifs Eukaryotic translation initiation factors EJC Exon Junction Complex EMT Epithelial mesenchymal transition epab Embryonic polyadenylate-binding protein erf1 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 erf3 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 3 GAR1 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 1 GLD2 Poly(A) RNA polymerase gld-2 HATs Histone Acetyltransferases HBS1 HBS1-like protein HDACs Histone Deacetylases HuR Putative uncharacterized protein HUR1 IL-8 Interleukin-8 IRE1 Serine/threonine-protein kinase/endoribonuclease IRE1 MAPK mitogen-activated protein kinase mrna Messenger RNA mt-mrna Mitochondrial mrna 11

ncrna Non-coding RNA NGD No-go decay Ngl2 RNA exonuclease NGL2 Ngl2p Potential rrna 3' end processing RNAse Ngl2p Ngl3p Potential rrna 3' end processing RNAse Ngl3p NHP2 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 2 NMD Nonsense-mediated decay NOP10 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit NSD Non-stop decay ORF Open Reading frame PABP4 Polyadenylate-binding protein 4 PAN2 Poly(A) Specific Ribonuclease Subunit PAN2 PAB-dependent poly(a)-specific ribonuclease subunit PAN2 PAN3 PAB-dependent poly(a)-specific ribonuclease subunit PAN3 PAP Poly(A) polymerase PARN Poly(A)-specific ribonuclease PDE12 2',5'-phosphodiesterase 12 PDE12 2',5'-phosphodiesterase 12 PMR1 Calcium-transporting ATPase 1 PNLDC1 Poly(A)-Specific Ribonuclease (PARN)-Like Domain Containing POP2 Poly(A) ribonuclease POP2 POP2 Poly(A) ribonuclease POP2 PUF mrna-binding protein PUF RAN GTP-binding nuclear protein Ran RISC RNA-Induced Silencing Complex RNAi RNA interference RNAse P Ribonuclease P RRM RNA recognition motif rrna Ribosomal RNA SG Stress granule sirna Small interfering RNA snrnas Small nuclear RNAs snrnps Small nuclear RiboNucleoprotein Particles TNF-alpha Tumor necrosis factor-alpha TOB Protein Tob trna Transfer RNA TTP Tristetraprolin UPF1 Regulator of nonsense transcripts 1 UPF2 Regulator of nonsense transcripts 2 UPF3 Regulator of nonsense transcripts 3 UTR Untranslated region VEGF Vascular endothelial growth factor WD40 WD40 domain containing protein XRN1 5'-3' exoribonuclease 1 ΡΑΒΡ Poly(Α) Binding Protein 12

Περίληψη Η γονιδιακή έκφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ελέγχεται σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μετάφρασης και την αποικοδόμησης του mrna. Τόσο η μετάφραση όσο και η σταθερότητα του mrna ρυθμίζονται από μεταβολές του μήκους της poly(a) ουράς τους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η αποικοδόμηση των mrnas ξεκινάει με την μείωση του μήκους της poly(a) ουράς και ακολουθεί αποικοδόμηση από το κυτταροπλασματικό εξώσωμα με 3'-5', ή με απομάκρυνση του 5 καλύμματος από το ένζυμο αφαίρεσης του καλύμματος. Η σταδιακή αποικοδόμηση της poly(a) ουράς που αναφέρεται ως αποαδενυλίωση πραγματοποιείται από μία πληθώρα 3'-5' εξωνουκλεασών που αποκαλούνται αποαδενυλάσες. Οι αποαδενυλάσες είναι μαγνησιο-εξαρτώμενες 3'-5' εξωριβονουκλεάσες και ανήκουν σε μία από τις υπερ-οικογένειες αποαδενυλασών, την DEDD ή την EEP. Οι αποαδενυλάσες τύπου DEDD περιέχουν τρία συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα Asp και ένα κατάλοιπο Glu που σχηματίζουν το ενεργό κέντρο και καθορίζουν την διευθέτηση των ιόντων μαγνησίου τα οποία παίζουν καθοριστικό ρόλο στο καταλυτικό μηχανισμό. Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει την POP2, την CAF1Z, την PAN2 και την poly(a)- specific ribonuclease (PARN). Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το γονίδιο PNLDC1 που βρέθηκε ότι κωδικοποιεί μια νέα DEDD αποαδενυλάση και βρίσκεται σε όλους του ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Ο προαγωγέας του γονιδίου PNLDC1 βρέθηκε μεθυλιωμένος και απομεθυλίωση του DNA οδήγησε στην ανίχνευση της έκφρασής του σε κυτταρική σειρά HEK293. H PNLDC1 βρίσκεται σε δύο ισομορφές οι οποίες προκύπτουν πιθανότατα από εναλλακτικό μάτισμα οι οποίες και μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Τα αποτελέσματα του βιοχημικού χαρακτηρισμού έδειξαν δραστικότητα και εξειδίκευση συγκρίσιμη με αυτή της PARN, ενώ οι δύο ισομορφές εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα και κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Μελέτες έκφρασης του γονιδίου σε διάφορους ιστούς και κυτταρικές σειρές έδειξε υψηλά εξειδικευμένη έκφραση σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, καθώς και σε γαμετικά κύτταρα υποδεικνύοντας έναν πιθανό ρόλο στη ανάπτυξη. Αποσιώπηση του γονιδίου σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικού έδειξε να επηρεάζει σημαντικούς δείκτες πολυδυναμίας καθώς και σημαντικούς παράγοντες της διαφοροποίησης. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι η PNLDC1 πρέπει να κατέχει κεντρικό ρόλο στα αρχικά βήματα της κυτταρικής ανάπτυξης. Ιn silico ανάλυση και σχεδιασμός της δομής βάση ομολογίας και προσομοίωσης μοριακής δυναμική έδειξε ότι η PNLDC1 έχει παρόμοιο ενεργό κέντρο με DEDD αποδενυλάσες και αποτελεί ένα νέο μέλος στο ρεπερτόριο των ενζύμων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του mrna. Ταυτόχρονα αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι υπόκειται σε αυστηρό επιγενετικό έλεγχο και ειδικό υποκυττάριο εντοπισμό με άγνωστη βιολογική λειτουργία που είναι όμως υπό διερεύνηση. Η ρύθμιση των mrnas μέσω αποαδενυλίωσης είναι καθοριστική για πολλά βιολογικά φαινόμενα συμπεριλαμβανομένου των κυτταρικό κύκλο, την απόκριση σε εξωκυττάρια σήματα, ωογένεση και σπερματογένεση, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Επιπλέον τα mirnas προκαλούν μεταφραστική αποσιώπηση και αποσταθεροποίηση του mrna μέσω αποαδενυλίωσης, δίνοντας βαρύτητα στη διαδικασία αυτή στην μετα-μεταγραφική γονιδιακή αποσιώπηση.

14

Abstract Gene expression in eukaryotes is controlled in many levels including mrna translation and decay. Both translation and mrna stability are in general controlled by modulation of the mrna s poly(a) tail length. In the majority of the mrnas, degradation also begins with the shortening of the poly(a) tail and subsequent degradation by the cytoplasmic exosome in a 3'-5' direction or by removal of the 5' cap structure by a decapping enzyme. Shortening of poly(a) (termed deadenylation) is carried out by a variety of 3'-5' exoribonucleases known as deadenylases. Deadenylases are Mg 2+ dependent 3'-5' exoribonucleases that belong to one of two superfamilies, the DEDD type or the exonuclease-endonuclease-phosphatase (EEP) type. DEDD-type nucleases contain three conserved Asp and one Glu residue, which form the active site and coordinate the Mg 2+ that support enzymatic activity. Η ομάδα αυτή περιλαμβάνει την POP2, την CAF1Z, την PAN2 και την poly(a)-specific ribonuclease (PARN). This group includes POP2, CAF1Z, PAN2 and poly(a)-specific ribonuclease (PARN). Herein we study the gene PNLDC1 that has been found to encode a novel deadenylase that is present in higher eukaryotes. PNLDC1 promoter is methylated whereas demethylation led to detectable expression in HEK293 cells. Both PNLDC1 isoforms that are produced through alternative splicing were studied. The biochemical characterization results showed similar activity and specificity with PARN, whereas both isoforms are located in the cytoplasm and mainly in the ER. Studies on the genes expression in various mouse tissue types, as well as cell lines revealed major expression of Pnldc1 in embryonic stem cells and gametes indicating a possible role during development. Silencing of the gene in mouse embryonic stem cells showed a deregulation of major pluripotency and differentiation factors. This observation indicates a central role during early development. In silico analyses through homology modeling and molecular dynamic simulation showed that PNLDC1 has a similar active site with the DEDD deadenylases and is a new member of the mrna surveillance and turnover repertoire. Τhe fact that it exhibits strict epigenetic regulation, and specific subcellular localization is remarkable and has elusive so far physiological role which is currently under investigation. Regulation of mrnas fate by deadenylation is critical for many biological processes including cell cycle, cellular response, oogenesis, spermatogenesis, early development and differentiation. Moreover, mirna interference can trigger translational repression and mrna degradation through deadenylation, emphasizing the unique role of this process in post transcriptional gene silencing. 15

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εισαγωγή 1. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης πριν την μεταγραφή To κεντρικό δόγμα της ροής της γενετικής πληροφορίας, όπως διατυπώθηκε από τον F. Crick το 1968, ιεράρχησε την κατανομή των πιο βασικών συστατικών κατά την διάρκεια της ροής της γενετικής πληροφορίας και ανέδειξε την σημαντικότητα του RNA ως του πλέον σημαντικού ενδιάμεσου μορίου κατά την έκφραση της γονιδιακής πληροφορίας σε πρωτεΐνες στα ριβοσώματα (1,2). Κατά την περίοδο που ακολούθησε πραγματοποιήθηκαν μελέτες που διαχώρισαν και ταυτοποίησαν τρείς κύριες κατηγορίες του RNA (3). Ένα μικρό προσαρμοστικό RNA που επιτελούσε την μετάφραση του γενετικού κώδικα του DNA στον κώδικα των πρωτεϊνών φέροντας ταυτόχρονα τα αμινοξέα που θα πολυμεριστούν για να συνθέσουν τις πρωτεΐνες ονομάστηκε trna (transfer RNA, trna), ενώ στα μεγάλα μόρια RNA που αποτελούσαν το κυριότερο συστατικό των ριβοσωμάτων δόθηκε η ονομασία ριβοσωμικό RNA (ribosomal RNA, rrna). Το RNA όμως που μετέφερε την γενετική πληροφορία από τα γονίδια στα ριβοσώματα ως κώδικας για την σύνθεση των πρωτεϊνών ονομάστηκε αγγελιοφόρο RNA (messenger RNA, mrna). Η κεντρική θέση του RNA στις βασικές λειτουργίες των οργανισμών οδήγησαν στην υπόθεση του κόσμου του RNA, όπου το RNA το ήταν το ενεργό συστατικό του μηχανισμού διατήρησης και έκφρασης της γενετικής πληροφορίας. Αργότερα οι πρωτεΐνες υποβοήθησαν ή ανέλαβαν αποκλειστικά πολλές από αυτές τις λειτουργίες. Η θεωρία του κόσμου του RNA έγινε ευρέως αποδεκτή μετά την ανακάλυψη των καταλυτικών RNA (ριβοένζυμα, RNAse P) και το συμπέρασμα ότι το ριβόσωμα είναι μία μοριακή μηχανή με καταλυτικό RNA (4-6). Το mrna αποτελούσε αδιαμφισβήτητα πλέον το ενδιάμεσο μόριο με το οποίο ρέει η γενετική πληροφορία, το επόμενο μεγάλο ερώτημα, ήταν το πώς μπορεί αυτή η διαδικασία να ρυθμίζεται. Λεπτομερή ρύθμιση της ροής αυτών των πληροφοριών επιτρέπει σε μονοκύτταρους οργανισμούς να ανταποκριθούν στις μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες, ενώ αλλαγές στα πρότυπα της ρύθμισης αυτής αποτελεί την κύρια δύναμη διαφοροποίησης τους σε πολυκύτταρους οργανισμούς. Λεπτομερής ρύθμιση συμβαίνει κάθε στιγμή μέσα σε ένα κύτταρο είτε για να πολλαπλασιαστεί είτε να επιτελέσει μία συγκεκριμένη λειτουργιά. Επίσης η διαφορετικότητα στα πρότυπα αυτά συμβάλλει καθοριστικά στην διαφορετικότητα των οργανισμών. Σημαντικό βήμα για την κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ροή της γενετικής πληροφορίας έγινε στις αρχές της δεκαετίας του 60 από τους François Jacob και Jacques Monod με την αποκάλυψη του μηχανισμού ρύθμισης του οπερονίου της λακτόζης επαληθεύοντας την θεωρία τους, ότι τα επίπεδα των ενζύμων μπορούν να ελέγχονται μέσο ρύθμισης του DNA. Στο μοντέλο αυτό το οπερόνιο της λακτόζης το οποίο αποτελείται από μία ομάδα γονιδίων που καταβολίζουν την λακτόζη ελέγχεται σε επίπεδο μεταγραφής τα διαθέσιμα θρεπτικά (Εικόνα 1) (7). Το κεντρικό μοντέλο που προτάθηκε τη δεκαετία του 1960 θεώρησε δεδομένο ότι η χρησιμοποίηση της γενετικής πληροφορίας ελέγχεται κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής. Ο έλεγχος αυτός επηρεαζόταν από πρωτεΐνες, οι οποίες ονομάστηκαν μεταγραφικοί παράγοντες, και οι οποίοι ανέστειλαν ή προωθούσαν την 18

Εισαγωγή επιτυχία της RNA πολυμεράσης να προσεγγίσει συγκεκριμένες περιοχές που ονομάστηκαν προαγωγείς, από τους οποίους ξεκινάει η μεταγραφή. Εικόνα 1 Το μοντέλο ρύθμισης του οπερονίου της λακτόζης Το μοντέλο αυτό εξηγεί ικανοποιητικά ένα μεγάλο μέρος της μοριακής βιολογίας, ενώ αποτέλεσε το κυρίαρχο δόγμα για δεκαετίες. Μάλιστα εξελίχτηκε σταδιακά ώστε να συμπεριλάβει το ρόλο της χρωματίνης καθώς και σημαντικές επιγενετικές τροποποιήσεις. Παρόλο που ο ρόλος του mrna στην ροή της γενετικής πληροφορίας είναι ο ίδιος σε όλους τους οργανισμούς, ο κύκλος ζωής και η ρύθμιση του αλλάζουν σημαντικά. Εικόνα 2 Στάδια ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στους προκαρυωτικούς οργανισμούς 19

Εισαγωγή Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς η μεταγραφή είναι στενά συνδεδεμένη με την μετάφραση αφού το DNA βρίσκεται διάχυτο στο κυτταρικό διάλυμα και το mrna δεν υφίσταται επεξεργασία. Έτσι προτού ολοκληρωθεί η μεταγραφή τα ριβοσώματα προσδένονται και στο νεοσυντιθέμενο mrna και το μεταφράζουν (Εικόνα 2). Δομικές και λειτουργικές μελέτες των 5 αμετάφραστων (UTR) περιοχών αποκάλυψαν ότι μεταβολίτες και αλλά μόρια προσδένονται απευθείας στο mrna μεταβάλλοντας την δομή του. Η αλλαγή αυτή ρυθμίζει είτε την μεταγραφή είτε την μετάφραση, ανάλογα με τον τύπο της μεταβολής. Οι δομές αυτές που βρίσκονται στις 5 UTR περιοχές mrnas που ελέγχουν γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολίτη που δεσμεύουν ονομάζονται ριβοδιακόπτες και παίζουν σημαντικό ρόλο στην λεπτομερή ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, ενώ για άλλη μια φορά ενισχύουν την θεωρία του κόσμου RNA όπου το RNA επιτελούσε κυρίαρχο λειτουργικό αλλά και ρυθμιστικό ρόλο (Εικόνα 3) (8,9). Εικόνα 3 Οι θερμοαισθητήρες RNA (A) και τα T-box RNAs (Β) είναι ριβοδιακόπτες που ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς το DNA είναι περιορισμένο στον πυρήνα όπου μεταγράφεται σε RNA. Το RNA μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα όπου τα ριβοσώματα το μεταφράζουν σε πρωτεΐνη. Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να συμβεί σε όλα τα στάδια της ροής της γενετικής πληροφορίας (Εικόνα 4). Η μεταγραφή ενός γονιδίου επηρεάζεται από την δομή της χρωματίνης όπου εντοπίζεται το γονίδιο και από παράγοντες που επηρεάζουν τον ρυθμό με τον οποίο οι RNA πολυμεράσες μεταγράφουν το γονίδιο. Η δομή της χρωματίνης αλλάζει ως αποτέλεσμα των τροποποιήσεων των ιστονών, από την μεθυλίωση του DNA, από ncrna ή από DNA-προσδενόμενες πρωτεΐνες. Η μεθυλίωση του DNA είναι ένας συνήθης τρόπος αποσιώπησης ενός γονιδίου στα κύτταρα θηλαστικών (10). Το DNA συνήθως μεθυλιώνεται από μεθυλοτρανσφεράσες σε νουκλεοτίδια κυτοσίνης που 20

Εισαγωγή βρίσκονται πριν από νουκλεοτίδια γουανίνης. Περιοχές του DNA που περιέχουν αρκετά δινουκλεοτίδια CG τα οποία υφίστανται μεθυλίωση στο C αναφέρονται ως νησίδες CpG. Όταν μία τέτοια περιοχή υπάρχει ανοδικά ενός γονιδίου η μεθυλίωση του προκαλεί την αποσιώπηση του γονιδίου. Εικόνα 4 Τα στάδια της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και τα σημεία ρύθμισης Η μεθυλίωση του DNA επηρεάζει την μεταγραφή των γονιδίων με δύο τρόπους. Μπορεί να αποτρέπει την πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων που αναγνωρίζουν μη τροποποιημένο DNA (11). Στα κύτταρα των θηλαστικών η μεθυλίωση του DNA συμβαίνει στον άνθρακα 5 ενός δινουκλεοτιδίου CpG. Κατά των διπλασιασμό των κυττάρων η μεθυλίωση των νησίδων στις ίδιες θέσεις στις νεοσυντιθέμενες αλυσίδες DNA συμβαίνει με μηχανισμούς διατήρησης των μεθυλομάδων (maintenance methylation) ενώ υπάρχουν μηχανισμοί μεθυλιώνουν εκ νέου νησίδες CpG δινουκλεοτίδια. Στην εκ νέου μεθυλίωση 21

Εισαγωγή νησίδων CpG εμπλέκονται οι de novo μεθυλοτρανσφεράσες όπως η μεθυλοτρανσφεράση DNMT1 (DNA methyltransferase 1) η οποία ευθύνεται για την διατήρηση των προτύπων μεθυλίωσης στα θυγατρικά κύτταρα. Η de novo μεθυλίωση του DNA μπορεί να αλλάζει μόνιμα τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων σε κύτταρα που διαφοροποιούνται από τα βλαστικά κύτταρα σε ειδικούς κυτταρικούς τύπους. Η αλλαγές αυτές είναι συνήθως μόνιμες και μη αναστρέψιμες αποτρέποντας την μετατροπή διαφοροποιημένων κυττάρων σε βλαστικά ή σε κυττάρου άλλου ιστού (12). Οι πιο σημαντικές μεθυλοτρανσφεράσες που σχηματίζουν τα πρότυπα μεθυλίωσης κατ την πρώιμη ανάπτυξη είναι οι DNMT3a και DNMT3b. Η DNMT3L είναι μία πρωτεΐνη που παρουσιάζει ομολογία με τις άλλες δύο αλλά δεν έχει ενζυμική δράση και κατέχει ρυθμιστικό ρόλο ενώ η DNMT2 (TRDMT1) είχε χαρακτηριστεί ως DNA μεθυλοτρανσφεράση λόγω της ομολογίας που παρουσιάζει ωστόσο o πραγματικός της ρόλος είναι να μεθυλιώνει την κυτοσίνη 38 στην θηλιά αντικωδικονίου στο trna (13). Η ακετυλίωση των ιστονών παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της έναρξης της μεταγραφής. Όταν ακετυλοτρανσφεράσες (Histone Acetyltransferases, HATs) ακετυλιώνουν κατάλοιπα λυσίνης στο αμινοτελικό άκρο των ιστόνων με αποτέλεσμα να χάνεται το θετικό τους φορτίο γεγονός που ευνοεί την αλληλεπίδραση με το αρνητικά φορτισμένο DNA για να σχηματιστούν τα νουκλεοσώματα. Έτσι χωρίς την αλληλεπίδραση αυτή το DNA γίνεται προσβάσιμο στην μεταγραφική μηχανή (Εικόνα 5). Εικόνα 5 Γενικός μηχανισμός ρύθμισης της μεταγραφής μέσω μεθυλίωσης του DNA και τροποποίησης των ιστονών. Αντιθέτως οι αποακετυλάσες (Histone Deacetylases, HDACs) αφαιρούν της ακετυλομάδες επαναφέροντας το αρνητικό φορτίο των ιστονών με αποτέλεσμα το DNA να συσφίγγεται γύρω από αυτές δυσχεραίνοντας την πρόσβαση της μεταγραφικής μηχανής. Από την στιγμή που ο προαγωγέας του γονιδίου είναι προσβάσιμος για την μεταγραφική μηχανή η μεταγραφή του γονιδίου καθορίζεται κυρίως από μεταγραφικούς παράγοντες που καθορίζουν την πρόσδεση της μεταγραφικής μηχανής και την έναρξη και επιμήκυνση της μεταγραφής. Αφού το DNA μεταγραφεί σε mrna ξεκινάει ο περίπλοκος κύκλος ζωής του ευκαρυωτικού mrna ο οποίος περιλαμβάνει μία πληθώρα από ελέγχους και ρυθμίσεις. 22

Εισαγωγή 2. O κεντρικός ρόλος του μηνυματοφόρου RNA (mrna) στην γονιδιακή έκφραση 2.1 Η διαδικασία της μεταγραφής των μορίων mrna To mrna χαρακτηρίσθηκε αρχικά ως ένα ασταθές μόριο που μεταφέρει την πληροφορία από των πυρήνα στα ριβοσώματα (14). Κατά τη μεταγραφή (transcription) παράγεται ένα μονόκλωνο μόριο RNA, όμοιο στην αλληλουχία με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA, ενώ η μετάφραση (translation) μετατρέπει τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του mrna στην αλληλουχία αμινοξέων που αποτελούν μια πρωτεΐνη. Ένα μόριο mrna δε μεταφράζεται σε ολόκληρο το μήκος του, αλλά κάθε mrna περιέχει τουλάχιστον μία κωδική περιοχή (coding region), η οποία σχετίζεται με μια πρωτεϊνική αλληλουχία μέσω του γενετικού κώδικα: κάθε νουκλεοτιδική τριπλέτα (κωδικόνιο) της κωδικής περιοχής αντιστοιχεί σε ένα αμινοξύ. Μόνο η μία αλυσίδα του δίκλωνου DNA μεταγράφεται σε αγγελιαφόρο RNA. Η μία αλυσίδα του DNA η οποία κατευθύνει τη σύνθεση του mrna δημιουργώντας ζεύγη συμπληρωματικών βάσεων αποκαλείται αλυσίδα-μήτρα (template strand) ή μη-νοηματική αλυσίδα (antisense strand). Ο όρος «μη-νοηματική» χρησιμοποιείται γενικά για την περιγραφή μιας αλληλουχίας του DNA ή RNA που είναι συμπληρωματική με το mrna ενώ η αλυσίδα του DNA που φέρει την ίδια αλληλουχία με το mrna (με εξαίρεση ότι περιέχει Τ αντί για U) ονομάζεται κωδική αλυσίδα (coding strand). Την αντίδραση πολυμερισμού του νεοσυντιθέμενου mrna καταλύει η RNA πολυμεράση ΙΙ. Η παραγωγή του ευκαρυωτικού mrna περιλαμβάνει επιπρόσθετα στάδια μετά τη μεταγραφή. Η μεταγραφή γίνεται με το συνήθη τρόπο, ξεκινώντας με τη δημιουργία ενός μετάγραφου με 5' τριφωσφορικό άκρο. Ωστόσο, το 3' άκρο δημιουργείται με αποκοπή του μεταγράφου και όχι με τερματισμό της μεταγραφής σε μια προκαθορισμένη θέση. Όσα RNA προέρχονται από γονίδια που περιέχουν ιντρόνια πρέπει να υποστούν μάτισμα, ώστε να αφαιρεθούν τα ιντρόνια και να παραχθεί ένα μικρότερο mrna που να περιέχει μια άθικτη κωδική αλληλουχία. Η μεταγραφή στα ζωϊκά κύτταρα συμβαίνει με τη ίδια περίπου ταχύτητα που συμβαίνει και στα βακτήρια (περίπου 40 νουκλεοτίδια ανά δευτερόλεπτο). Εικόνα 6 Τα βασικά στάδια ωρίμανσης του mrna περιλαμβάνουν την πρόσθεση της 5 καλύπτρας, το µάτισµα και πολυαδενυλίωση 23

Εισαγωγή Πολλά ευκαρυωτικά γονίδια είναι μεγάλα, π.χ. ένα γονίδιο 10.000 bp χρειάζεται περίπου 5 λεπτά για να μεταγραφεί (15). Η μεταγραφή του mrna δεν τερματίζεται με την αποδέσμευση του ενζύμου της RNA πολυμεράσης από το DNA. Αντίθετα, το ένζυμο συνεχίζει τη μεταγραφή και μετά το τέλος του γονιδίου. Μια συντονισμένη σειρά γεγονότων δημιουργεί το 3' άκρο του mrna με αποκοπή ενός τμήματος και προσθήκη μιας αλληλουχίας poly(α) στο πρόσφατα δημιουργημένο 3' άκρο. Το 5' άκρο του RNA τροποποιείται αμέσως μετά την εμφάνιση του, εξαιτίας της προσθήκης μιας «καλύπτρας». Η τριφωσφορική ομάδα του αρχικού μεταγράφου αντικαθίσταται από ένα νουκλεοτίδιο που προστίθεται σε αντίθετο προσανατολισμό (3'- 5'), «σφραγίζοντας» με αυτόν τον τρόπο το άκρο (Εικόνα 6). Ένα ώριμο ευκαρυωτικό mrna αποτελείται από την 5 καλύπτρα (CAP) μία 5 αμετάφραστη περιοχή (5 Untranslated Region, 5 UTR), την περιοχή που μεταφράζεται από τα ριβοσώματα που ονομάζεται ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (Open Reading frame, ORF) μία 3 αμετάφραστη περιοχή (3 untranslated Region, 3 UTR) και την 3 poly(a) ουρά (Εικόνα 7). Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης ξεκινάει με ένα κωδικόνιο έναρξης AUG και τελειώνει με ένα κωδικόνιο λήξης UAA, UAG ή UGA. Εικόνα 7 Ένα ώριμο ευκαρυωτικό mrna αποτελείται από την 5 καλύπτρα (CAP) μία 5 αμετάφραστη περιοχή το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης, μία 3 αμετάφραστη περιοχή και την 3 poly(a) ουρά 2.2 Μια 5 καλύπτρα προστίθεται στο νέοσυντιθέμενο mrna Αμέσως μετά την έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II (RNA pol II) και μόλις το μετάγραφο φτάσει ένα μήκος 25 30 νουκλεοτιδίων, μία 7-μεθυλογυανοσίνη προστίθεται στο 5 άκρο. Η διαδικασία αυτή που αποτελεί το πρώτο βήμα στην επεξεργασία και ωρίμανση των mrna, καταλύεται από ένα διμερές ένζυμο (γουανιδυλο-τρανσφεράση) το οποίο βρίσκεται συνδεδεμένο στη φωσφορυλιωμένη καρβοξυτελική περιοχή της RNA πολυμεράσης II. Φωσφορυλίωση της RNA πολυμεράσης II συμβαίνει κατά την έναρξη της μεταγραφής, ενώ η γουανιδυλο-τρανσφεράση προσδένεται επιλεκτικά στην πολυμεράση II και όχι στις Ι και ΙΙΙ και για το λόγο αυτό μόνο σε μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙ προστίθεται η καλύπτρα. Η μία υπομονάδα του ενζύμου προσθήκης της καλύπτρας αφαιρεί το γ-φώσφορο από το νεοσυντιθέμενο 5 ακρο που εξέρχεται από την επιφάνεια της RNA πολυμεράσης IΙ και στη συνέχεια η άλλη υπομονάδα μεταφέρει από ένα GTP την μονοφωσφορική γουανοσίνη στο 5 διφωσφορικό άκρο του νεοσυντιθέμενου mrna δημιουργώντας δομή 5-5 τριφωσφορικής γουανοσίνης Στα τελευταία βήματα ξεχωριστά ένζυμα μεταφέρουν μεθυλομάδες από την S-αδενοσυλμεθειονίνη στην Ν7 θέση της γουανίνης και στα 2 οξυγόνα των ριβοζών στο 5 άκρο του νεοσυντιθέμενου μετάγραφου (Εικόνα 8). 24

Εισαγωγή Εικόνα 8 Βήματα προσθήκης και τροποποίησης της (A) καλύπτρας και (B) τελική δομή της καλύπτρας Η πρώτη μεθυλίωση γίνεται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και αποτελείται από την προσθήκη μιας μεθυλομάδας στη θέση 7 της ακραίας γουανίνης. Μια καλύπτρα που έχει μόνο τη μεθυλομάδα στη θέση 7 της ακραίας γουανίνης ονομάζεται καλύπτρα 0 (cap 0). Στους μονοκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η αντίδραση σταματά σε αυτό το σημείο. Το ένζυμο που ευθύνεται για την τροποποίηση αυτή λέγεται 7-μεθυλοτρανσφεράση της γουανίνης. 2.3 Τα πρόδρομα μόρια mrna πολυαδενυλίωνονται Στα κύτταρα των θηλαστικών όλα τα mrnas, εκτός από τα mrna των ιστόνων φέρουν μία 3 poly(α) ουρά. Αρχικές μελέτες έδειξαν ότι κατάλοιπα αδενίνης προστίθενται στο 3 άκρο μετά από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση ενώ οι πρώτες αλληλουχίες cdna κλώνων από κύτταρα θηλαστικών ταυτοποίησαν μία αλληλουχία AAUAAA 10 με 35 νουκλεοτίδια ανοδικά της poly(α) ουράς. Επιπρόσθετες μελέτες έδειξαν πως υπάρχει μία περιοχή πλούσια σε GU απαραίτητη για την διαδικασία διάσπασης και πολυαδενυλίωσης του πρώιμου mrna περίπου 50 νουκλεοτίδια καθοδικά του σημείου κοπής του. Η ταυτοποίηση και απομόνωση των πρωτεϊνών υπεύθυνων για την ενδονουκλεοτιδική διάσπαση και πολυαδυνυλίωση των πρόδρομο mrna έχει οδηγήσει σε ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο ένας παράγοντας 360-kDa (cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF), αποτελούμενος από τέσσερα διαφορετικά πολυπεπτίδια σχηματίζει αρχικά ένα ασταθές σύμπλοκο με το πλούσιο σε AU poly(α) σήμα ανοδικά του σημείου κοπής. Τότε τουλάχιστον τρείς επιπρόσθετες πρωτεΐνες, μία ετεροτριμερής πρωτεΐνη 200-kDa (cleavage stimulatory factor, CStF), μία ετεροτριμερές 150-kDa (cleavage factor I, CFI), και ένας δεύτερος παράγοντας διάσπασης (second cleavage factor, CFII), που δεν έχει μελετηθεί εκτενώς προσδένονται στο σύμπλοκο CPSF-RNA. Η αλληλεπίδραση μεταξύ CStF και της GU 25

Εισαγωγή ή της U-πλούσια καθοδικής, σταθεροποιεί το πολυ-πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Τελικά μία poly(α) πολυμεράση (poly(a) polymerase, PAP) προσδένεται στο σύμπλοκο πριν μπορεί να λάβει χώρα η διάσπαση. Η καθομολόγηση της PAP σχετίζεται χρονικά με την κοπή και την άμεση πολυαδενυλίωση έτσι ώστε τα ελεύθερα 3 άκρα που δημιουργούνται να πολυαδενυλίωνονται ταχύτατα. Ακολουθώντας την ενδονουκλεοτιδική διάσπαση, η πολυαδενυλίωση συμβαίνει σε δύο βήματα. Η προσθήκη περίπου 12 αδενοσινικών συμβαίνει αργά και ακολουθεί ταχεία προσθήκη επιπρόσθετων 200-250 καταλοίπων αδενίνης. Η ταχεία φάση απαιτεί την πρόσδεση πολλών αντιγράφων μίας poly(α) προσδενόμενης πρωτεΐνης που περιέχει το RNP μοτίβο. Στην πρωτεΐνη αυτή έχει δοθεί η ονομασία PABII για να ξεχωρίζει από τις κυτταροπλασματικές poly(α) πσροσδενόμενες πρωτεΐνες. Η PABII προσδένεται στις πρώτες περίπου 12 αδενοσίνες που προστίθενται αρχικά στο μετάγραφο από την PAP διεγείροντας την δραστικότητα της. Με έναν άγνωστο μηχανισμό η ίδια η PABII τερματίζει τον πολυμερισμό όταν η poly(α) ουρά έχει μήκος 200-250 κατάλοιπα (Εικόνα 9). Εικόνα 9 Μοντέλο αποκοπής και πολυαδενυλίωσης των πρόδρομων mrna στα ευκαρυωτικά κύτταρα Στο κυτταρόπλασμα η πρόσδεση της κυταροπλασματικής poly(α) προσδενόμενης πρωτεΐνης ΡΑΒΡ στον παράγοντα έναρξης elf4g δημιουργεί έναν κλειστό βρόχο, στον οποίο τα 5' και 3' άκρα του mrna συγκρατούνται στο ίδιο πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Ο σχηματισμός αυτού του συμπλόκου μπορεί να ευθύνεται για κάποιες από τις επιδράσεις της poly(α) στις ιδιότητες του mrna. Η poly(α) αλληλουχία συνήθως σταθεροποιεί το mrna. Η ικανότητα της poly(α) ουράς να προστατεύει το mrna από την αποικοδόμηση απαιτεί τη σύνδεση της με την ΡΑΒΡ. Η αφαίρεση της poly(α) αναστέλλει την έναρξη της μετάφρασης in vitro και η μείωση της ΡΑΒΡ έχει το ίδιο αποτέλεσμα στο ζυμομύκητα in vivo. Αυτές οι επιδράσεις μπορεί να εξαρτώνται από την πρόσδεση της ΡΑΒΡ στο σύμπλοκο έναρξης, στο 5' άκρο του mrna. Σε μερικές περιπτώσεις, τα mrna αποθηκεύονται σε μη πολυαδενυλιωμένη μορφή και η poly(α) προστίθεται όταν είναι απαραίτητη η μετάφραση τους. Σε άλλες περιπτώσεις, τα poly(α)+ mrna αποαδενυλιώνονται, με συνέπεια τη μείωση της μετάφρασης τους. 26

Εισαγωγή 2.4 Μάτισμα και απομάκρυνση ιντρονίων Στο τελευταίο βήμα της ωρίμανσης ενός ευκαρυωτικού mrna, απομακρύνονται τα ιντρόνια και ενώνονται τα εξόνια μέσο δύο αντιδράσεων εστεροποίησης. Σε μικρά μετάγραφα η διαδικασία αυτή συμβαίνει εφόσον έχει προστεθεί η poly(α) ουρά ενώ για μεγάλα μετάγραφα η διαδικασία μπορεί να ξεκινήσει πριν την ολοκλήρωση της μεταγραφής του γονιδίου. Συνήθως στα άκρα των ιντρονίων υπάρχουν στο 5 GU και στο 3 AG. Εικόνα 10 Το μάτισμα των εξονίων στα πρόδρομα mrnas. Τα ιντρόνια απομακρύνονται και ενώνονται τα εξόνια μέσω δύο αντιδράσεων trans-εστεροποίησης. Σε κάθε αντίδραση τρανσεστεροποίησης ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός ανταλλάσσεται με κάποιον άλλον Σε κάθε αντίδραση εστεροποίησης ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός ανταλλάσσεται με κάποιον άλλον. Από τη στιγμή δεν αλλάζει ο αριθμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών δεν καταναλώνεται ενέργεια κατά το μάτισμα. Το συνολικό αποτέλεσμα είναι τα δύο εξόνια να ενώνονται και το ιντρόνιο να απομακρύνεται σαν μία θηλιά (Εικόνα 10) (16). Στον μηχανισμό εμπλέκονται τα μικρά πυρηνικά RNA (small nuclear RNAs, snrnas). Αρχικές μελέτες έδειξαν μία συνήθη αλληλουχία στο 5 άκρο των ιντρονίων είναι συμπληρωματική με το U1 μικρό πυρηνικό RNA. Συνολικά λαμβάνουν μέρος πέντε πλούσια σε U μικρά πυρηνικά RNA (U1, U2, U4, U5, και U6), με κυμαινόμενο μήκος από 107 έως 210 νουκλεοτίδια. Στον πυρήνα αυτά τα μικρά RNA βρίσκονται προδεδομένα με 6 έως 10 πρωτεΐνες σχηματίζοντας τα μικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωματίδια (small nuclear RiboNucleoprotein Particles, snrnps). Μερικές από τις πρωτεΐνες αυτές είναι κοινές σε όλα τα σωματίδια ενώ άλλες παρουσιάζουν ειδικότητα για συγκεκριμένα snrnps. Με τη διαδοχική συναρμολόγηση των snrnps πάνω στο πρόδρομο mrna δημιουργείται ένα 27

Εισαγωγή μεγαλύτερο σύμπλοκο το οποίο αποκαλείται επανασυνδεόσωμα (spliceosome) το οποίο έχει μέγεθος ανάλογο των ριβοσωμάτων. Μόνο μετά την ολοκλήρωση όλων των τροποποιήσεων και της επεξεργασίας μπορεί το mrna να μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Κατά μέσο όρο, το mrna καθυστερεί περίπου 20 λεπτά για να εξέλθει από τον πυρήνα. Μόλις το mrna εισέλθει στο κυτταρόπλασμα, αναγνωρίζεται από τα ριβοσώματα και μεταφράζεται. O κύκλος ζωής του ευκαρυωτικού είναι πιο παρατεταμένος από αυτόν του βακτηριακού mrna. Το ευκαρυωτικό mrna αποτελεί μόνο ένα μικρό ποσοστό το συνολικού κυτταρικού RNA (-3% της μάζας του). Ο χρόνος ημιζωής των mrnas στους ζυμομύκητες είναι σχετικά μικρός και κυμαίνεται από 1 έως 60 λεπτά. Υπάρχει μια αξιοσημείωτη αύξηση της σταθερότητας στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς: το mrna των ζωικών κυττάρων είναι σχετικά σταθερό, με χρόνο ημιζωής μεταξύ 1 και 24 ωρών. Τα ευκαρυωτικά πολυσώματα είναι σχετικά σταθερά. Οι τροποποιήσεις και στα δυο άκρα του mrna συνεισφέρουν σε αυτή τη σταθερότητα. 3. Μηχανισμοί ελέγχου της ποιότητας του mrna Κάθε βήμα στην παραγωγή ενός ώριμου μεταγράφου παρέχει δυνατότητες εισαγωγής λαθών. Για να εξασφαλίζεται η πιστότητα της μεταγραφής το κύτταρο έχει αναπτύξει την ικανότητα να εντοπίζει τα ελαττωματικά μετάγραφα και να τα αποικοδομεί, προφυλάσσοντας το κύτταρο από τοξικές πρωτεΐνες. Ο έλεγχος της ωρίμανσης του mrna συμβαίνει στον πυρήνα, ενώ οι πορείες ελέγχου που αναφέρονται παρακάτω σχετίζονται με τη μετάφραση και ανιχνεύουν ελαττωματικά ριβονουκλεϊνικά σύμπλοκα στο κυτταρόπλασμα. 3.1 Nonsense-mediated decay Στη διαδικασία αυτή (NMD) τα mrna που περιέχουν μια πρόωρη αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται (Εικόνα 11). Η πρόωρη αλληλουχία τερματισμού μπορεί να προκύψει από σημειακές μεταλλάξεις, μετατοπίσεις αναγνωστικού πλαισίου, ελαττωματική ωρίμανση του μεταγράφου, προβληματική έναρξη της μετάφρασης και εκτενή 3 αμετάφραστη περιοχή (17). Τα μετάγραφα αυτά θα οδηγούσαν στην παραγωγή ελαττωματικής πρωτεΐνης. Το μονοπάτι αυτό έχει βρεθεί σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ενώ τα κυριότερα συστατικά του NMD συμπλόκου UPF1, UPF2 και UPF3, είναι διατηρημένα. Παρόλο αυτά η αναγνώριση του πρόωρου κωδικονίου τερματισμού και ο μηχανισμός αποικοδόμησης φαίνεται να αποκλίνουν από οργανισμό σε οργανισμό. Σε γενικές γραμμές σε όλους του οργανισμούς αναγνωρίζεται μία εσφαλμένη διαμόρφωση των ριβονουκλεϊνικών συμπλόκων. Στα κύτταρα θηλαστικών, είναι γνωστό ότι σε ελαττωματικά μετάγραφα είναι δυνατόν να παραμένουν προσδεδεμένα τα σύμπλοκα σημείου συνένωσης εξονίων (Exon Junction Complex, EJC). 28

Εισαγωγή Εικόνα 11 Nonsense-mediated decay. Στη διαδικασία αυτή τα mrna που περιέχουν µια πρόωρη αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδοµούνται Ένα EJC πάνω στο ώριμο mrna είναι σημάδι ελαττωματικής συναρμογής όπου παραμένει 20-24 νουκλεοτίδια ανοδικά από το σημείο συνένωσης εξωνίων (18). Εφόσον τα περισσότερα ιντρόνια εντοπίζονται στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης τα EJC συνήθως εκτοπίζονται από τα ριβοσώματα που μεταφράζουν το mrna. Στα mrna με πρόωρο κωδικόνιου τερματισμού είναι πολύ πιθανόν να βρεθεί ένα EJC μετά από το σημείο αυτό οπού και ανιχνεύεται από τους μηχανισμούς ελέγχου (Εικόνα 11). Ένα EJC σε λάθος θέση δεν είναι πάντα το έναυσμα για αποικοδόμηση (19). Στους οργανισμούς D. melanogaster και S. cerevisiae αλλά και σε συγκεκριμένα μετάγραφα στα θηλαστικά, όπως στην περίπτωση του mrna της ανοσοσφαιρίνης Μ, αυτό που παίζει ρόλο είναι η απόσταση του κωδικονίου τερματισμού από την poly(a) ουρά. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί καταστροφής mrna με πρόωρο κωδικώνιο τερματισμού. Στο S. cerevisiae, ο κύριος μηχανισμός λαμβάνει χώρα στα σωμάτια P (P bodies), ξεκινάει από την αφαίρεση της καλύπτρας και είναι ανεξάρτητος από την αποδενυλίωση. Ωστόσο υπάρχει ένας μηχανισμός ταχείας αποαδενυλίωση και ακολούθως τα άλλα 5 3 και 3 5 μονοπάτια ολοκληρώνουν την καταστροφή (20). 3.2 Non-stop decay Παρομοίως σε μια διαδικασία που αναφέρεται ως non-stop decay (NSD) τα mrna στα οποία δεν υπάρχει αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται ταχύτατα με κατεύθυνση 3-5 από το κυτταροπλασματικό εξώσωμα (21,22). Τέτοια μετάγραφα μπορούν να προκύψουν από διάσπαση, από την απουσία αλληλουχίας 29

Εισαγωγή τερματισμού μέσα στη κωδικοποιούμενη περιοχή καθώς επίσης και από πρόωρη πολυαδενυλίωση κατά τη μεταγραφή (Εικόνα 12). Μέχρι τώρα έχουν χαρακτηριστεί δύο διαφορετικά μονοπάτια NSD τα οποία πιθανόν δρουν συνεργατικά. Εικόνα 12. Non-stop decay. Τα mrna στα οποία δεν υπάρχει αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδοµούνται ταχύτατα µε κατεύθυνση 3 5 από το κυτταροπλασµατικό εξώσωµα Το αρχικό μοντέλο NSD το οποίο είναι διατηρημένο και στο ζυμομύκητα αλλά και σε κύτταρα θηλαστικών προτείνει ότι το κυτταροπλασματικό εξώσωμα, το σύμπλοκο SKI (SKI2, SKI3 και SKI8), και η πρωτεΐνη προσαρμογέας SKI7 είναι απολύτως απαραίτητα για το μηχανισμό (21,22). Όταν το ριβόσωμα δεν βρίσκει κωδικόνιο τερματισμού παραμένει πάνω στο 3 άκρο του mrna. Η καρβοξυτελική περιοχή της SKI7 που μοιάζει δομικά με την περιοχή GTPάσης των παραγόντων επιμήκυνσης EF1A και erf3 προσδένεται στην άδεια P θέση του ριβοσώματος απελευθερώνοντας το. Η SKI7 επιστρατεύει το εξώσωμα και το συνδεδεμένο σε αυτό σύμπλοκο SKI για να αποαδενυλιώσουν και να καταστρέψουν ταχύτατα το ελαττωματικό mrna. 3.3 No-go decay Ένας τελευταίος μηχανισμός επιτήρησης είναι ο no-go decay (NGD) (Εικόνα 13), ο οποίος ανακαλύφθηκε πρόσφατα στον ζυμομύκητα και δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Κατά τη διαδικασία αυτή ανιχνεύονται ριβοσώματα τα οποία έχουν ακινητοποιηθεί πάνω σε ένα mrna λόγω δημιουργίας τοπικών τριτοταγών δομών που δεν επιτρέπουν την κίνησή 30

Εισαγωγή τους και την περαιτέρω μετάφραση. Ως αποτέλεσμα, το mrna μόριο υπόκειται σε ενδονουκλεοτιδική διάσπαση κοντά στο σημείο αυτό και ακολουθεί πλήρης αποικοδόμησή του. Τα ριβοσώματα απελευθερώνονται και τα παραγόμενα τμήματα RNA αποικοδομούνται από το εξώσωμα και την XRN1 εξωριβονουκλεάση, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην 5-3 αποικοδόμηση πολλών μορίων RNA (23). Εικόνα 13 No-go decay Κατά τη διαδικασία αυτή ανιχνεύονται ριβοσώµατα τα οποία έχουν κολλήσει πάνω σε ένα mrna µε αποτέλεσμα να διασπάται το mrna µόριο µε ενδονουκλεοτιδική διάσπαση κοντά στο σημείο αυτό Παρόλο που ο μηχανισμός NGD δεν είναι πλήρως κατανοητός και το σύνολο των ενζύμων που εμπλέκονται κατά την ενδονουκλεοτιδική διάσπαση δεν είναι πλήρως γνωστές, έχει δειχθεί ότι η διαδικασία εξαρτάται από τις πρωτεΐνες DOM34 και HBS1. Οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες σχετίζονται με τους παράγοντες erf1 και erf3 αντίστοιχα και έτσι αλληλεπιδρούν με το ακινητοποιημένο ριβόσωμα προκειμένου να αποκολλήσουν και να απελευθερώσουν τις δύο ριβοσωμικές υπομονάδες. 4. Αποικοδόμηση του mrna Οι περίπλοκοι μηχανισμοί ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης περιλαμβάνον τον έλεγχο της μεταγραφής, κυρίως μέσω μεταγραφικών παραγόντων της επεξεργασία και σταθερότητα του mrna, του μεταφραστικού ρυθμού και της σταθερότητα της παραγόμενης πρωτεΐνης. Όσον αφορά το ίδιο το mrna πολύ σημαντικό ρόλο παίζει η σταθερότητα του. Η ανακατανομή των ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων έχουν ως αποτέλεσμα τη διευκόλυνση ή την αναστολή της αποικοδόμησης ενώ κυτταρικοί παράγοντες και σηματοδοτικοί μηχανισμοί ρυθμίζουν αποκλειστικά την αποικοδόμηση του 31

Εισαγωγή mrna. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, τα περισσότερα από τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του mrna έχουν ταυτοποιηθεί ενώ πολλές μελέτες αφιερώνονται πλέον στη διαλεύκανση των μηχανισμών που καθορίζουν τη μεταβολική τύχη του mrna (24). 4.1 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από αποαδενυλίωση Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως τα ευκαρυωτικά μόρια mrna ωριμάζουν με την πρόσθεση δύο χαρακτηριστικών που προσδίδουν δομική ακεραιότητα. Στο 5 άκρο προστίθεται μία μεθυλιωμένη γουανίνη με τριφωσφορικό δεσμό 5-5 ενώ στο 3 άκρο προστίθεται η poly(α) ουρά. Αυτοί οι δύο παράγοντες αλληλεπιδρούν με τους κυτταροπλασματικούς παράγοντες έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης eif4e και poly(a)- binding protein (PABP), αντίστοιχα για να προστατεύουν το μετάγραφο από τις εξωνουκλεάσες και να προαγάγουν την έναρξη της μετάφρασης. Για να ξεκινήσει η αποικοδόμηση πρέπει είτε ένας από τους δύο παράγοντες να αποδεσμευτεί είτε να κοπεί το mrna ενδονουκλεοτιδικά. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η πλειοψηφία των μορίων mrna αποικοδομείται με ένα μονοπάτι που ξεκινάει από τη βράχυνση της poly(a) ουράς. Το πρώτο βήμα στo μονοπάτι της αποικοδόμησης είναι μοναδικό από την άποψη ότι είναι αντιστρεπτό. Μετάγραφα που δέχονται ένα ειδικό σήμα μπορεί να επαναδενυλιωθούν και να επιστρέψουν στα πολυσώματα. Από την άλλη εάν ένα μετάγραφο θα πρέπει να οδηγηθεί προς καταστροφή, μία από τις δύο παρακάτω πορείες θα ακολουθήσει (Εικόνα 14). Εικόνα 14 Μονοπάτια αποικοδόμησης μορίων mrna εξαρτώμενα από το βήμα αποαδενυλίωσης 32

Εισαγωγή Είτε αφαιρείται η 5 καλύπτρα, γεγονός που επιτρέπει την εξωνουκλεοτιδική διάσπαση από την XRN1 εξωριβονουκλεάση, είτε το 3 άκρο δέχεται επίθεση από το εξώσωμα. Αυτές οι δύο πορείες δεν είναι όμως απαραίτητα ανεξάρτητες. Στο S. cerevisiae αποσιωπώντας συστατικά του 3 ή 5 μονοπατιού το μεταγραφόσωμα επηρεάζεται ελάχιστα, γεγονός που υποδηλώνει πλεονασμό των μηχανισμών αποικοδόμησης (25,26). 4.2 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από την αφαίρεση της καλύπτρας Παρόλο που τα περισσότερα μετάγραφα αποικοδομούνται με μία πορεία που ξεκινάει με την αποαδενυλίωση υπάρχουν μερικές εξαιρέσεις. Ειδικά mrna φαίνεται να παρακάμπτουν τη συνήθη πορεία για να επιτρέπουν ιδιαίτερο έλεγχο της αποικοδόμησης τους. Δύο μη-σχετιζόμενα μεταξύ τους μετάγραφα το RPS28B και το EDC1 παρακάμπτουν το στάδιο της αποαδενυλίωσης, και αφαιρείται η καλύπτρα με έναν αυτορυθμιστικό μηχανισμό (Εικόνα 15). Η πρωτεΐνη RPS28B προσδένεται σε μία δομή θηλιάς στην 3 αμετάφραστη περιοχή του δικού της μεταγράφου και στρατολογεί την EDC3, έναν προαγωγό της αφαίρεσης της. Αυτό επιφέρει σύνδεση και άλλων παραγόντων αφαίρεσης της καλύπτρας και επιτρέπει την αποικοδόμηση που είναι ανεξάρτητη από την αποαδενυλίωση (27). Το EDC1 mrna του S. cerevisiae, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη EDC1 που ρυθμίζει την αφαίρεση της καλύπτρας, επίσης αποικοδομείται με πορείες ανεξάρτητες της αποαδενυλίωσης. Εικόνα 15 Μονοπάτι αποικοδόμησης εξαρτώμενο από την αφαίρεση της καλύπτρας Στην περίπτωση αυτή η αποαδενυλίωση φαίνεται να προλαμβάνεται από την αλληλεπίδραση της poly(a) ουράς και μία περιοχή poly(u) που βρίσκεται στο 3 UTR. Αυτό το ενδομοριακό ζευγάρωμα βάσεων εμποδίζει την πρόσβαση των αποαδενυλασών. Κατά τον μηχανισμό ανατροφοδοτικής ρύθμισης το προϊόν της μετάφρασης αποικοδομεί το μετάγραφο του. Η αφαίρεση του EDC1 mrna απαιτεί την παρουσία υπομονάδων του συμπλόκου CCR4 NOT γεγονός που υποδηλώνει συσχέτιση μεταξύ αφαίρεσης της καλύπτρας και αποαδενυλίωσης. 33

Εισαγωγή 4.3 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση Ένας αποτελεσματικός τρόπος καταστροφής του mrna είναι μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης, όπου παράγονται δύο τμήματα που είναι ευάλωτα σε εξωνουκλεάσες (Εικόνα 16). Εικόνα 16 Μονοπάτι αποικοδόμησης εξαρτώμενο από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση Ενδονουκλεάσες που στοχεύουν το mrna έχουν χαρακτηριστεί πρόσφατα συμπεριλαμβανομένου τις PMR1, IRE1 και το ένζυμο επεξεργασίας του ριβοσωμικού RNA (RNase MRP) το οποίο φαίνεται να επιτελεί επιπρόσθετο ρόλο αφού επιτίθεται και σε συγκεκριμένα μόρια mrna (28). Επιπλέον ενδονουκλεάσες φαίνεται να εμπλέκονται στην αποικοδόμηση ελαττωματικών mrna, ενώ τα sirnas ξεκινούν την αποικοδόμηση μέσο ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης όπου εμπλέκεται η Argonaute protein-2 (Ago2) (25,26,29,30). 5. Αποαδενυλίωση Όπως έχει ήδη αναφερθεί η αποικοδόμηση του mrna υπό φυσιολογικές συνθήκες συνήθως ξεκινάει από τη βράχυνση της poly(a) ουράς. Η αποαδενυλίωση είναι το σημαντικότερο στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και την μεταφραστική καταστολή του mrna (Εικόνα 17). Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Τα ένζυμα που καταλύουν την αποαδενυλίωση είναι εξωνουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg 2+ που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση 3-5, παράγοντας 5 -AMP. Οι poly(a) ουρές είναι το κυριότερο υπόστρωμα των ενζύμων αυτών, ωστόσο μερικές αποαδενυλάσες μπορούν να διασπούν και άλλα μόρια RNA in vitro (21). Από τη στιγμή που η poly(a) ουρά έχει αφαιρεθεί από το mrna, επιπρόσθετες σημαντικές ριβονουκλεάσες ξεκινούν την διαδικασία αποικοδόμησής του. 34

Εισαγωγή Εικόνα 17 Στάδια ωρίμανσης, αποικοδόμησης και μεταφραστικής καταστολής του mrna 5.1 Ποικιλότητα αποαδενυλασών Για την απλή υδρόλυση της poly(α) ουράς μόλις μία ριβονουκλέαση θα ήταν αρκετή. Παρόλο αυτά υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις τύποι ριβονουκλεασών στον ζυμομύκητα (CCR4, CAF1, PAN2, και ANGEL) οι οποίες είναι πολύ συντηρημένες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στους πολυκύτταρους οργανισμούς ο αριθμός αυτός αυξάνεται (Πίνακας 1). Για παράδειγμα στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν βρεθεί τουλάχιστον πέντε οικογένειες ορθόλογων της CCR4 του ζυμομύκητα μέσω βιοχημικών μελετών αλλά και βιοπληροφορικής, που ωστόσο η δράση αυτών δεν έχει αποδειχθεί (31-33). Στα θηλαστικά έχουν βρεθεί τουλάχιστον 12 οι οποίες περιλαμβάνουν ορθόλογες των CCR4 και CAF1 και τουλάχιστον την poly(α) εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN) μία σημαντική αποαδενυλάση, που εμφανίζεται μόνο στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Βάση φυλογενετικών αναλύσεων, μέλη των οικογενειών POP2 (γνωστή και ως CAF1), PARN και CCR4 έχουν υποστεί γονιδιακό διπλασιασμό στα μετάζωα από τον οποίο προέρχονται οι CNOT8, PARNL (PNLDC1) και CNOT6L αντίστοιχα (34). 35

Εισαγωγή Πίνακας 1 Κατηγορίες αποαδενυλασών. Οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε µία από της δύο υπέρ-οικογένειες, την DEDD ή την exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) Οι POP2 και CCR4 διπλασιαστήκαν κατά την εξέλιξη των τελεοστέων, ενώ πιθανόν η PARN διπλασιάστηκε κατά την ακτινοβόληση των αρθροπόδων αφού PARNL (PNLDC1) έχει βρεθεί σε αυτά. Παρόλο αυτά δεν έχουν βρεθεί ομόλογες της στο Xenopus tropicalis και στo Zebrafish (Danio rerio) (34). Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να ταυτοποιηθούν όλες οι δραστικές αποαδενυλάσες και να διευκρινιστεί ο βιολογικός τους ρόλος. Δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητό το πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσων πολλών αποαδενυλασών. Είναι πιθανόν ειδικές αποαδενυλάσες να στοχεύουν σε διακριτές ομάδες mrna με αποτέλεσμα να ελέγχεται κάθε ομάδα από τη δράση ενός ενζύμου. Επιπλέον είναι δυνατόν διαφορετικές αποαδενυλάσες να δρουν στο ίδιο mrna με διακριτές αλλά αλληλοεπικαλυπτόμενες δράσεις. 36

Εισαγωγή Στο S. cerevisiae η PAN2 αποαδενυλιώνει νεοσυντιθέμενα μόρια mrna μέσα στον πυρήνα (35). Παρόλο αυτά αν ακολουθήσουμε το mrna στο κυτταρόπλασμα θα δούμε ότι η CCR4 είναι η επικρατούσα αποαδενυλάση (36). Σε κύτταρα θηλαστικών, σε ένα μοντέλο βασιζόμενο σε πειράματα με το mrna της β-σφαιρίνης προτάθηκε ότι οι κυριότερες κυτταροπλασματικές αποαδενυλάσες είναι η PAN2 και η CCR4. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό η PAN2 αφαιρεί τη μισή ουρά, και ακολούθως μέλη της POP2 και CCR4 αποικοδομούν την υπόλοιπη (Εικόνα 18) (37). Η DCP2 αφαιρεί την καλύπτρα μετά την αποαδενυλίωση και βεβαιώνει ότι το mrna θα καταστραφεί. Επίσης μπορεί να αφαιρεί την καλύπτρα μετά την αρχική αποαδενυλίωση από την PAN2 και μπορεί να οδηγεί το mrna προς καταστροφή χωρίς να χρειάζεται το δεύτερο βήμα αποαδενυλίωσης και έτσι να εξυπηρετεί ως εναλλακτικό μονοπάτι αποικοδόμησης. Γενικά η ποικιλία των αποαδενυλασών μεταβάλλεται μέσα στα είδη. Μέλη των POP2, CCR4, PAN2 και ANGEL οικογενειών εντοπίζονται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ενώ άλλες αποαδενυλάσες είναι λιγότερο συντηρημένες. Για παράδειγμα από τη D. melanogaster λείπουν η PARN και CAF1Z. Στο A. thaliana υπάρχουν 26 αποαδενυλάσες, πιθανότατα λόγω γεγονότων γενωμικού διπλασιασμού (Πίνακας 1). Εικόνα 18 Μοντέλο αναπαράστασης των βημάτων αποαδενυλίωσης στα κύτταρα θηλαστικών. Με κίτρινο φαίνεται το ένζυμο αφαίρεσης της καλύπτρας DCP1 DCP2, με πράσινο το διμερές PAN2 PAN3 και με κόκκινο το CCR4 CAF1. Με κυανό χρώμα φαίνονται οι PABP Μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης έχουν προβλεφθεί νέες αποαδενυλάσες όπως η ANGEL1 αλλά και η Poly(A)-specific ribonuclease (PARN)-like domain containing 1 (PNLDC1) η οποία αποτελεί αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής (31,38). Το γονίδιο PNLDC1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και ο προαγωγέας περιέχει CpG νησίδες και υπερμεθυλιώνεται σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου 37

Εισαγωγή και περιφερικά κύτταρα αίματος (39). Επίσης σε μία πρόσφατη μελέτη φαίνεται ότι η υπεύθυνη de novo μεθυλοτρανσφεράση για την αποσιώπηση του γονιδίου είναι η DMNT3B. Παρόλο που μελετήθηκε σε επίπεδο επιγενετικής ρύθμισης η έλλειψη βιβλιογραφίας επί του γονιδίου αυτού περιόρισε τις μελέτες σε επίπεδο DNA. Τουλάχιστον ένα ορθόλογο από κάθε οικογένεια διαθέτει δράση νουκλεάσης και το μοτίβο νουκλεάσης είναι συντηρημένο. Σε ορισμένες περιπτώσεις η δράση αποαδενυλάσης επιδείχθηκε χρησιμοποιώντας in vitro και in vivo τεχνικές. Η ταυτοποίηση της ANGEL και της 2 PDE είναι περιστασιακή. Η ανθρώπινη ANGEL έχει βρεθεί σε σύμπλοκο αποαδενυλίωσης (40) και διατηρεί τα κατάλοιπα του ενεργού κέντρου, ενώ η Ngl2, μια ορθόλογη της ANGEL στον μύκητα, είναι μία εξωνουκλεάση (41). 5.2 Δομικά χαρακτηριστικά αποαδενυλασών Σύμφωνα με συγκριτικές μελέτες των περιοχών με δράση ριβονουκλεάσης των ενζύμων αυτών, όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε μία από της δύο ομάδες, την DEDD ή την exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) οικογένεια (Εικόνα 19). Οι DEDD νουκλεάσες ονομάστηκαν έτσι εξαιτίας των συντηρημένων καταλυτικών αμινοξικών καταλοίπων Asp και Glu τα οποία είναι διάσπαρτα σε τρία μοτίβα εξωνουκλεάσης που δεσμεύουν ιόντα μαγνησίου (40). Μέλη της ομάδας αυτής περιλαμβάνουν τις οικογένειες της POP2, της poly(a) εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης (PARN), την CAF1Z, και την PAN2. Ένα πέμπτο κατάλοιπο (His or Tyr) διαχωρίζει την οικογένεια αυτή στους DEDDh ή DEDDy, υποοικογένειες αντίστοιχα. Η περισσότερες DEDD αποαδενυλάσες ανήκουν στην DEDDh υποοικογένεια και παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομοιότητα στις ανώτερες δομές που διαμορφώνουν την περιοχή που λαμβάνει χώρα η αποαδενυλίωση. Τα ένζυμα της ομάδας EEP περιέχουν πέντε πολύ συντηρημένα κατάλοιπα NEDDH στο ενεργό κέντρο (42). Η πρόσφατη ανάλυση των κρυσταλλικών δομών αποκάλυψε ότι η ανθρώπινη και του ζυμομύκητα CCR4 παρουσιάζουν τυπική αναδίπλωση και δομή του ενεργού κέντρου της EEP οικογένειας (43,44). Τα μέλη της ομάδας αυτής περιλαμβάνουν εκτός από την CCR4, την Nocturinin, την ANGEL και 2 phosphodiesterase (2 PDE) (Εικόνα 19) (45). Είναι πιθανό να υπάρχουν και άλλες νουκλεάσες εκτός των οικογενειών DEDD και EEP ωστόσο δεν έχει ταυτοποιηθεί καμία ακόμη. Ανάμεσα σε όλες τις αποαδενυλάσες η CAF1 είναι η μικρότερη αφού αποτελείται μόνο από την περιοχή νουκλεάσης. Σε κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχει μία επιπρόσθετη περιοχή πλούσια σε Q/N στο αμινοτελικό άκρο, και παίζει ρόλο στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στα P-bodies (46). Όλες η άλλες φαίνεται να περιέχουν τουλάχιστον μία επιπρόσθετη περιοχή. Η δομή και η λειτουργία των επιπρόσθετων λειτουργικών περιοχών δεν έχει αποσαφηνιστεί για τις NOC, ANGEL, και PDE12 (Εικόνα 19). 38

Εισαγωγή Εικόνα 19 Σχηματική αναπαράσταση των επικρατειών ανάμεσα σε διάφορες αποαδενυλάσες Αυτές οι μη καταλυτικές περιοχές έχουν πιθανόν δύο λειτουργίες να αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες και να ρυθμίζουν τη δράση της περιοχής νουκλεάσης. Για παράδειγμα η LRR περιοχή της CCR4 είναι ξεχωριστή από την περιοχή νουκλεάσης και προσδένεται με την CAF131. Η PARN έχει δύο επιπρόσθετες περιοχές πρόσδεσης στο poly(α) η R3H (CDD accession ID: cl00297) και RRM (CDD accession ID: cl17169), και μία καρβοξυτελική περιοχή (C-terminal domain-ctd) με χαρακτηριστικά μη αναδιπλούμενης περιοχής (47-49). Η καρβοξυ-τελική περιοχή περιέχει μέρος του RRM μοτίβου και έχει προταθεί ότι ευθύνεται για την αλληλεπίδραση της PARN με την CBP80 (50). Και οι δύο περιοχές (R3H και RRM) είναι απαραίτητες για την αποτελεσματική κατάλυση από την PARN (49). Παρόλο που ολόκληρη η δομή της PARN δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως, βιοχημικές, βιοφυσικές και δομικές μελέτες δείχνουν ότι οι περιοχές R3H, RRM, και η περιοχή νουκλεάσης μπορούν να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους προκειμένου να ρυθμιστεί αλοστερικά το ένζυμο (51-54). Η PAN2 επίσης περιέχει δύο υποψήφιες λειτουργικές περιοχές. Την WD40 (CDD accession ID: cl02567) και την UCH1/peptidase_C19 (CDD accession ID: cl02553). Η πιθανή ιδιότητα πρωτεϊνικής πρόσδεσης της UCH-1/peptidase_C19 υποδηλώνει ότι αυτές οι περιοχές καθορίζουν την αλληλεπίδραση της PAN2 με ρυθμιστικούς παράγοντες. Ένα άλλο ενδιαφέρον δομικό χαρακτηριστικό των αποαδενυλασών είναι να σχηματίζουν σταθερά ομο ή ετερο-διμερή και ομο ή ετερο-ολιγομερή μέσα στα κύτταρα παρόλο που καθαρές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες τουλάχιστον στην περίπτωση των PARN, CCR4, και CAF1 διατηρούν τη δράση αποαδενυλάσης in vitro. H PARN υπάρχει κυρίως σε ομοδιμερές ενώ έχει προταθεί ότι μπορεί να βρίσκεται και σε ολιγομερή κατάσταση στην οποία διαμεσολαβεί η R3H περιοχή και όχι η περιοχή διμερισμού και αυτό έχει φυσιολογική σημασία στο να συγκεντρώνεται η πρωτεΐνη σε περιοχές του κυττάρου όπου απαιτείται συνεχείς παρουσία του ενζύμου (Εικόνα 20) (55,56). 39

Εισαγωγή Εικόνα 20 Οργάνωση των δομικών περιοχών στην PARN Η PAN2 σχηματίζει ετεροδιμερή με την μη καταλυτική υπομονάδα PAN3 (η οποία με τη σειρά της αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη PABP4), και δεν έχει καταλυτική δράση απουσία της (57). Παρόλο αυτά όταν υπερεκφράζεται μόνο η PAN2 στα κύτταρα NIH3T3 παρατηρείται ταχεία αποαδενυλίωση υποδηλώνοντας ότι η PAN3 παίζει ρυθμιστικό ρόλο. Η PABP ρυθμίζει τη δράση του συμπλόκου PAN2 PAN3 προσελκύοντας το στην poly(a) ουρά. Οι CCR4 και CAF1(POP2) στο S. cerevisiae σχηματίζουν ετεροδιμερή (58). Η CAF1 προσαρμόζει την CCR4 και την πλατφόρμα CNOT1 μέσα στο σύμπλοκο CCR4 NOT (Εικόνα 21) (43,44). Οι CCR4d και CAF1z επιστρατεύονται από ένα σύμπλοκο του οποίου τα μέλη δεν έχουν χαρακτηριστεί. Η PARN μπορεί να προσδένεται με το σύμπλοκο εξωσώματος RAN, ενώ δεν είναι ακόμα κατανοητό ο λόγος της ύπαρξης αυτής της ανώτερης σε περιπλοκότητα δομής και όλων αυτών των μη καταλυτικών υπομονάδων (59). Εικόνα 21 Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου CNOT1 CAF1 CCR4 40

Εισαγωγή Συνολικά μέχρι σήμερα, 7 διακριτά σύμπλοκα μεταξύ των αποαδενυλασών έχουν καταγραφεί (38,60). Τα διαφορετικά ετεροδιμερή μπορεί να έχουν διαφορετική ενζυμική ή ρυθμιστική ικανότητα. Σε αυτή τη κατηγορία ανήκει η CNOT8 η οποία είναι μέλος της POP2 οικογένειας και έχει την ικανότητα να προσδένεται στην PUF ρυθμιστική πρωτεΐνη περισσότερο από ότι προσδένεται η CNOT7, ένα άλλο μέλος της POP2 οικογένειας (61). Ανώτερα σύμπλοκα όσον αφορά το επίπεδο οργάνωσης προσθέτουν επιπλέον λειτουργίες και ρυθμιστική δυνατότητα. Υπάρχουν ειδικά ετεροδιμερή αποτελούμενα από την CCR4 και την POP2 πρωτεΐνη σε διάφορα είδη, συνδέονται με πρωτεΐνες NOT για να σχηματίσουν μεγάλα συμπλέγματα πολλαπλών υπομονάδων (Εικόνα 22) (38,58). Εικόνα 22 Σύμπλοκα και ομο- ή ετεροδιμερή αποαδενυλασών στο yeast και στα θηλαστικά Το σύμπλοκο CCR4 POP2 NOT εμφανίζεται σε διαφορετικές μορφές με μοριακά βάρη να κυμαίνονται από 0,65 έως 2 MDa και ενίοτε αναφέρεται ως σύμπλοκο CCR4 NOT (58,62). Οι πρωτεΐνες NOT μπορούν να δρουν ως συνδέτες. Η NOT4 του D. melanogaster συνδέει το σύμπλοκο αποαδενυλίωσης σε μία 3 UTR ρυθμιστική πρωτεΐνη. Μεταξύ ετεροδιμερών και υψηλού επιπέδου πολυπλοκότητας συμπλόκων στα οποία μπορούν να προσδένονται διαφορετικές πρωτεΐνες, το ρεπερτόριο των αποαδενυλασών και του βιολογικού τους ρόλου είναι αρκετά εκτενές. Ωστόσο για να εξακριβωθεί η βιολογική 41

Εισαγωγή δράση ενός συμπλόκου είναι εξαιρετικά δύσκολο καθώς πρέπει να μελετώνται υπερμοριακά συμπλέγματα που περιλαμβάνουν περίπλοκες και πιθανόν με διαφορετική ισχύ πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Πληροφορίες για υπερμοριακά σύμπλοκα αποαδενυλίωσης υπάρχουν για το CCR4 NOT όπου έχει δειχθεί ο ρόλος τους στα γαμετικά κύτταρα και βλαστικά κύτταρα και έχουν βρεθεί οι υπομονάδες που περιλαμβάνουν σε κάθε περίπτωση για να επιτελέσουν την συγκεκριμένη βιολογική λειτουργία. Επίσης είναι είδη γνωστό ότι το ίδιο σύμπλοκο εμπλέκεται στην γονιδιακή αποσιώπηση μέσο mirna αλλά και στον έλεγχο της ποιότητας του mrna. 5.3 Βιοχημικά χαρακτηριστικά αποαδενυλασών Οι αποεδυνυλάσες χαρακτηρίζονται από την προτίμηση τους για 3 poly(α) αλληλουχίες. Μέχρι στιγμής οι μοναδικές δομές που έχουν αποσαφηνιστεί και περιλαμβάνουν την παρουσία υποστρώματος είναι αυτή της PARN και της CCR4b/CNOT6L (PDB accession IDs 2A1R, 3NGO) (Εικόνα 23). Συγκριτική ανάλυση των δομών έδειξε ότι η περιοχή νουκλεάσης από μόνη της έχει υψηλή συγγένεια για poly(α), και αυτό εξηγεί γιατί άλλες αποαδενυλάσες που δεν έχουν επιπλέον επικράτειες πρόσδεσης στο RNA έχουν παρόλο αυτά υψηλή συγγένεια για poly(a) (55,63). Η PARN έχει δύο επιπρόσθετες περιοχές, τις R3H και RRM δομικές περιοχές. Η RRM παρουσιάζει ειδικότητα για poly(a) ενώ η R3H όχι (49,54). Ο ακριβής ρόλος των περιοχών αυτών τόσο στην δέσμευση υποστρωμάτων όσο και στην κατάλυση δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί.. Εικόνα 23 Τρινουκλεοτίδιο αδενίνης δεσμευμένο στο ενεργό κέντρο τη PARN (PDB ID: 2A1R) Μερικές αποαδενυλάσες μπορούν να υδρολύουν και άλλα υποστρώματα εκτός από poly(α). Για παράδειγμα η Ngl2p συμμετέχει στο τελευταίο στάδιο της 3 επεξεργασίας του 5.8S rrna, ενώ η Ngl3p μπορεί να διασπά poly(u), poly(c), poly(da), με μικρή ταχύτητα ενώ δεν μπορεί να διασπά poly(g) (64). Η PDE12 μπορεί να διασπά poly(c) με μικρότερη 42

Εισαγωγή ταχύτητα και με μικρότερη αγχιστεία (διπλάσια τιμή Km) συγκριτικά με όταν διασπά poly(α) (65). Η PARN μπορεί επίσης να διασπά poly(u) με πολύ μικρότερη ταχύτητα από ότι διασπά το φυσιολογικό της υπόστρωμα ενώ μπορεί επίσης να διασπά και poly(da) λιγότερο αποτελεσματικά (66,67). Πρόσφατα, έχει αναδειχθεί η σημαντικότητα της 3 ουριδινυλίωσης των mrna ενώ το υπεύθυνο ένζυμο για την απομάκρυνση της oligo(u) ουράς είναι η DIS3L2 η οποία εμπλέκεται στην αποικοδόμηση ουριδινιλιωμένου pre-let-7 πρόδρομου mirna (68-70). Πιθανόν και η PARN να παίζει ρόλο στην αποουριδινυλίωση μορίων RNA καθώς μπορεί να υδρολύει τέτοιου είδους υποστρώματα in vitro (66). Η δράση της PARN σε άλλα υποστρώματα μέσα στο κύτταρο δεν έχει μελετηθεί μην αποκλείοντας το γεγονός να διασπά και άλλα πολυμερή ανάλογα με την ρύθμιση την οποία δέχεται. Η in vitro δραστικότητα των αποαδενυλασών πάνω σε άλλα υποστρώματα έχει δειχθεί αλλά δεν είναι γνωστό αν υπάρχει αντίστοιχη φυσιολογική σημασία της δράσης αυτής μέσα στα κύτταρα. Οι αποαδενυλάσες έχουν πολύ διαφορετική αποτελεσματικότητα αναφορικά με την κατάλυση του υποστρώματος, παρόλο που δεν έχει γίνει ταυτόχρονη σύγκριση της ταχύτητας κατάλυσης σε ίδιες πειραματικές συνθήκες. Η PARN φαίνεται αν είναι η πιο αποτελεσματική, τουλάχιστον in vitro, αφού παρουσιάζει 100 φορές μεγαλύτερη ταχύτητα από την CAF1 είτε της ανθρώπινης είτε του ζυμομύκητα (71). Μια άλλη σημαντική διαφορά είναι η σχέση μεταξύ του μήκους της poly(α) ουράς και της συγγένειας των αποαδενυλασών για αυτές. Η PAN2-PAN3 δεν μπορεί να υδρολύει ουρές κάτω από 80 nt (37). Η CCR4 μπορεί να αφαιρέσει όλη την poly(α) ουρά από το mrna ενώ η δραστικότητα της CAF1 μειώνεται δραματικά όταν το μήκος της poly(a) είναι μικρότερο των 6 νουκλεοτιδίων (66). Η PAN2 PAN3 υδρολύει με βοήθεια της PABP την poly(α) ουρά μέχρι το μήκος των 80 nt και από κει και πέρα αναλαμβάνει είτε το σύμπλοκο CCR4 NOT είτε η PARN (35). Εκτός όμως από άλλα υποστρώματα με αποαδενυλίωση είναι δυνατό να αφαιρεθούν και η 3 poly(a) ουρά που προστίθενται σε μη κωδικοποιούμενα μόρια. Το πυρηνικό σύμπλοκο εξωσώματος εμπλέκεται σε τέτοιες αποαδενυλιώσεις, με την RRP6 υπομονάδα η οποία είναι μια DEDD τύπου εξωνουκλεάση, να είναι πιθανόν το καταλυτικό ένζυμο του συμπλόκου(45,72). Η ανθρώπινη 2 PDE μπορεί να διασπά το poly(a) όταν το 5 φωσφορική ομάδα κάθε αδενοσίνης είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με το 2 ή 3 υδροξύλιο. Ωστόσο ο μοναδικός βιολογικός ρόλος της φαίνεται να είναι μέχρι σήμερα, η αποικοδόμηση του 2-5 oligo(a). Όλες οι αποαδενυλάσες που έχουν χαρακτηριστεί μέχρι τώρα εξαρτώνται από την παρουσία Mg 2+ και μονοσθενών κατιόντων για κατάλυση. Οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης είναι συνήθως οι φυσιολογικές συγκεντρώσεις των ιόντων μέσα στο κύτταρο. Οι φυσιολογικές συγκεντρώσεις του Mg 2+ μέσα στα κύτταρα κυμαίνονται από 0.5 εως 1mM ανάλογα τον κυτταρικό τύπο ενώ για το Να + περίπου 20mM και για το Κ + 150mM ανάλογα τον κυτταρικό τύπο και την ηλεκτροφυσιολογία τους (63). Μονοσθενή ιόντα είναι 43

Εισαγωγή απαραίτητα για τη δραστικότητα της PARN αλλά και δρουν ως μη αλλοστερικοί ρυθμιστές (41,73). Οι περισσότερες αποαδενυλάσες έχουν προτίμηση για τα ιόντα μαγνησίου τα οποία παρατάσσονται σύμφωνα με την διάταξη που παρουσιάζουν τα τέσσερα όξινα συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου (DEDD). H PARN ακολουθεί τυπικό μηχανισμό κατάλυσης δύο μεταλλικών ιόντων (74), μηχανισμός ο οποίος φαίνεται να ισχύει και για τις άλλες αποαδενυλάσες λόγο της ύπαρξης αυτών των συντηρημένων αμινοξικών καταλοίπων του ενεργού κέντρου. Ο μηχανισμός κατάλυσης δύο μεταλλικών ιόντων έχει χαρακτηριστεί για την περιοχή 3-5 εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης I (Klenow fragment) η οποία υδρολύει με κατεύθυνση 3-5 την νεοσυντηθέμενη αλυσίδα του DNA όταν έχει εισαχθεί λάθος νουκλεοτίδιο. Τα αμινοξικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου παίζουν ρόλο στην διευθέτηση των ιόντων μαγνησίου τα οποία σταθεροποιούν τα άτομα οξυγόνου της φωσφορικής ομάδα σε ένα επίπεδο σε σχέση με το φώσφορο καθιστώντας το ευάλωτο για επίθεση από το νερό (Εικόνα 24) (75). Εικόνα 24 Καταλυτικός μηχανισμός της Klenow 3-5 εξωνουκλεάσης παρουσία ιόντων Mg 2+ Οι αποαδενυλάσες τύπου DEDD ακολουθούν τον ίδιο μηχανισμό κατάλυσης διαφοροποιώντας τις από άλλες ριβονουκλεάσες παραδείγματος χάριν από την ριβονουκλεάση Α η οποία καταλύει την υδρόλυση του RNA μέσω ενός κυκλικού ενδιαμέσου της φωσφορικής ομάδας με το 3 υδροξύλιο του RNA ενώ στον μηχανισμό αυτό δεν εμπλέκονται μεταλλικά ιόντα. H ύπαρξη των ιόντων μαγνησίου στο ενεργό κέντρο δεν είναι απαραίτητη μόνο για τη κατάλυση αλλά επηρεάζει τη σταθερότητα και την αλληλεπίδραση του με τις άλλες περιοχές (76,77). Εκτός από μαγνήσιο οι αποαδενυλάσες μπορούν να δράσουν και 44

Εισαγωγή παρουσία άλλων δισθενών ιόντων στο ενεργό κέντρο όπως Mn 2+, Co 2+, Ca 2+, και Zn 2+, και καμία φορά ρυθμίζουν την ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα (71,74,76,78). Βέβαια αυτό μάλλον δεν έχει φυσιολογική σημασία γιατί εκτός από τα δισθενή ιόντα μαγνησίου, τα άλλα δεν βρίσκονται ελεύθερα στο κυτταροδιάλυμα αλλά συμπλοκοποιημένα. 5.4 Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της κατάλυσης από αποαδενυλάσες. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των αποαδενυλασών είναι ότι καταλύουν την αντίδραση υδρόλυσης της τελευταίας αδενοσίνης και συνεχίζουν στην επόμενη με σταθερό ρυθμό χωρίς απαραίτητα να αποδεσμεύονται και να δεσμεύονται εκ νέου στο υπόστρωμα. Η ιδιότητα των ενζύμων να επαναλαμβάνουν κύκλους κατάλυσης χωρίς να αποδεσμεύονται από το πολυμερές υπόστρωμα αναφέρεται ως processivity (επεξεργασιμότητα) για να διαχωρίζει από την έννοια της κοινής ενζυμικής κατάλυσης. Αυτό δίνει την ιδιότητα στις αποαδενυλάσες να προσδένονται σε ένα υπόστρωμα και να ρυθμίζουν τη μοίρα των mrna σαν ένα ροοστάτη ανάλογα με τη ρύθμιση που οι ίδιες επιδέχονται. Με το τρόπο αυτό φαίνεται να δρουν η PARN, η CCR4, η CAF1, η NOC και η PDE12, τουλάχιστον in vitro και κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Η in vitro εικόνα αποαδενυλίωσης με τέτοιον τρόπο χαρακτηρίζεται από μια ταυτόχρονη μείωση του μήκους όλων των μορίων του υποστρώματος (Εικόνα 25) (79). Εικόνα 25 Aυτοραδιογραφία αποαδενυλίωσης από ανασυνδυασμένη CCR4 παρουσία συνθετικού υποστρώματος 25N20A Η αποαδενυλίωση μπορεί να είναι μια διαδικασία με που σκοπό έχει την απομάκρυνση ή την βράχυνση της poly(α) ουράς πολλών υποστρωμάτων μέχρι ενός συγκεκριμένου μήκους, ενώ in vitro χαρακτηρίζεται από μια ομοιόμορφη διάσπαση κατά μήκος της poly(α) ουράς των μορίων του υποστρώματος κατά ασύγχρονο τρόπο. Με τον τρόπο αυτό πιθανόν δρουν οι PAN2 PAN3 και ANGEL/NGL3P (64,80). Η επεξεργασιμότητα της PDE12 είναι υπό αμφισβήτηση καθώς ολόκληρη η πρωτεΐνη παρουσιάζει διαφορετικά βιοχημικά χαρακτηριστικά σε σχέση με μία μικρότερου μήκους 45

Εισαγωγή πρωτεΐνη που αποτελείται μόνο από το ενεργό κέντρο και παρουσιάζει επεξεργασιμότητα. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην ανασταλτική δράση του αμινοτελικού άκρου της στη δραστικότητα του ενζύμου (65). Η επεξεργασιμότητα του κάθε ενζύμου μπορεί να εξαρτάται και από το εκάστοτε μήκος της poly(α) ουράς. Σε μήκος 45 νουκλεοτιδίων η CCR4 ή CAF1 διασπούν την poly(a) επεξεργαστικά. Οι NOC και PDE12 δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς όσον αφορά τον μηχανισμό κατάλυσης. Αντίθετα η PARN είναι μια χαρακτηριστική αποαδενυλάση η οποία δρα με τρόπο επεξεργαστικό τόσο για μακριές όσο και για κοντές poly(α) ουρές. Η PARN ωστόσο χαρακτηρίζεται από την μοναδική ιδιότητα να προσδένει το 5 cap στην RRM δομική περιοχή γεγονός το οποίο βοηθά στον προσανατολισμό του ενζύμου και στην επίτευξη γρήγορης και αποτελεσματικής υδρόλυσης (52,54,73). Όπως ήδη έχει αναφερθεί στα θηλαστικά η αποικοδόμηση των κυτταροπλασματικών mrnas μπορεί να ξεκινά με αποαδενυλίωση δύο φάσεων. Κατά την πρώτη το μήκος των poly(α) ουρών μειώνεται από ~200 στα ~110 nt με σταθερό αργό ρυθμό ενώ κατά τη δεύτερη αποικοδομούνται ταχεία από το CCR4 NOT σύμπλοκο (80). Η δομική βάση της επεξεργασιμότητας δεν έχει διευκρινιστεί. Σε γενικά πλαίσια η επεξεργασιμότητα επιτυγχάνεται με την ολίσθηση των ενζύμων πάνω στο πολυμερές υπόστρωμα πραγματοποιώντας διαδοχικούς κύκλους κατάλυσης προτού αποδεσμευτεί από αυτό (81). Η σταθερά αποδέσμευσης (Κd) της PARN από το poly(α) της είναι της τάξης δεκάδων nμ γεγονός που καθιστά αδύνατη την ολίσθηση του ενζύμου πάνω στο υπόστρωμα. Όμως από την κρυσταλλική δομή παρουσία υποστρώματος φαίνεται ότι η επικράτεια R3H δεν έχει προσβασιμότητα όταν η PARN έχει ήδη προσδέσει το υπόστρωμα γεγονός που φαίνεται να δικαιολογεί τελικά τον τρόπο δράσης του ενζύμου. Ένας πιθανός μηχανισμός είναι μια δομική αλλαγή κατά την πρόσδεση του υποστρώματος να προκαλεί την απομάκρυνση της περιοχής από αυτό και να επιτρέπει τη διολίσθηση του ενζύμου πάνω σε αυτό(55). Δεν είναι κατανοητό πώς οι αποαδευλάσες CCR4, CAF1, και NOC μπορούν να δρουν επεξεργαστικά. Αυτές οι αποαδενυλάσες περιέχουν μόνο μία περιοχή πρόσδεσης μέσα στην επικράτεια νουκλεάσης, Η αντίστοιχη περιοχή νουκλεάσης της PARN από μόνη της έχει πολύ μικρή επεξεργασιμότιτα ακόμα και όταν χρησιμοποιείται υπόστρωμα 200nt poly(α). 5.5 Βιολογική λειτουργία αποαδενυλασών Ο βιολογικός ρόλος των αποαδενυλασών περιλαμβάνει πάρα πολλές λειτουργίες είτε σε κυτταρικό, είτε σε επίπεδο οργανισμού, όπως έχει δειχθεί από πειράματα γενετικής και RNA παρεμβολής (Πίνακας 1). Μερικά από τα ένζυμα αυτά είναι απολύτως απαραίτητα για την βιωσιμότητα των οργανισμών, ενώ μεταλλάγματα των ενζύμων αυτών συσχετίζονται με συγκεκριμένους φαινότυπους. Στα μετάζωα, τα φυτά και τους μύκητες διατάραξη της φυσιολογικής λειτουργίας των αποαδενυλασών επιφέρει ένα εύρος φαινοτύπων (Πίνακας 1), ενώ για την βιωσιμότητα του ζυμομύκητα φαίνεται ότι καμία αποαδενυλάση δεν είναι απολύτως απαραίτητη. Παρόλο που η αποαδενυλίωση δεν αναστέλλεται με μεταλλάξεις στα γονίδια pan2 ή ccr4, μπλοκάρεται σε διπλά μεταλλάγματα pan2 και ccr4. Τα διπλά 46

Εισαγωγή μεταλλάγματα είναι βιώσιμα γεγονός που υποδεικνύει ότι άλλα μονοπάτια αποικοδόμησης του mrna συμπληρώνουν την αποαδενυλίωση μολονότι ο ρυθμός είναι πολύ πιο αργός (82). Ειδικές αποαδενυλάσες είναι απαραίτητες για συγκεκριμένες βιολογικές διαδικασίες, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ρύθμιση των επιπέδων mrna είναι σημαντική για τις διαδικασίες αυτές. ιάφορες αποαδενυλάσες όπως η PARN του A. thaliana και X. laevis, η CCR4 της D. melanogaster και η CCF-1 του C. elegans, είναι κρίσιμες στην εμβρυογένεση (83-87). Άλλες είναι απαραίτητες για την γονιμότητα όπως ή η Cnot7. Ποντίκια στα οποία η Cnot7 είχε απαλειφθεί, παρόλο που ήταν βιώσιμα χωρίς σωματικά ελαττώματα εμφάνιζαν ελαττωματική σπερματογένεση και κατ επέκταση τα αρσενικά ήταν στείρα (88,89). Η CCR4 από την D. melanogaster και η CCF-1 από τον C. elegans παίζουν σημαντικό ρόλο στη γαμετογένεση τόσο ώστε μεταλλάγματα τους να επιφέρουν στειρότητα (84,90) Επιπροσθέτως, οι αποαδενυλάσες παίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία γεγονός που υποστηρίζεται από μελέτες σε Cnot7-knockout ποντίκια τα οποία βρέθηκαν να έχουν αυξημένη μάζα οστών ενώ διατάραξη της φυσιολογικής λειτουργίας της Nocturnin (NOC) του ποντικού προκαλεί ελαττωματικό έλεγχο μεταβολισμού προσφέροντας αντίσταση σε παχυσαρκία προκαλούμενη από την δίαιτα (91). Πράγματι τα ποντίκια αυτά παίρνουν πιο δύσκολα βάρος παρόλο που συμπεριφέρονται και τρέφονται φυσιολογικά (92). Παρόλο που η NOC ρυθμίζεται ρυθμικά σύμφωνα με των ημερονύκτιο ρυθμό τα ποντίκια αυτά δεν παρουσίαζαν προβλήματα στον ημερονύκτιο ρυθμό και στον ύπνο τους. Το γεγονός όμως ότι παρουσιάζουν μεταβολές στον μεταβολισμό και ο φυσιολογικός μεταβολισμός συνδέεται με φυσιολογικό ύπνο υποδηλώνει ότι η NOC εμπλέκεται σε μονοπάτια καθοδικά του ημερονύκτιου φυσιολογικού ρολογιού, και τα οποία σχετίζονται με τον μεταβολισμό. Ο φαινότυπος των Noc / ποντικιών οφείλεται στον συνδυασμό αυξημένης δραστηριότητας, μειωμένης πρόσληψης τροφής και αυξημένων μεταβολικών ρυθμών, χωρίς να έχουν ταχτοποιηθεί οι στόχοι της NOC και ο μηχανισμός με τον προκαλείται ο συγκεκριμένος φαινότυπος. Οι αποαδενυλάσες ελέγχουν την ανάπτυξη ακόμη και σε επίπεδο κυττάρου. Μεταλλάγματα της D. melanogaster CCR4 προκαλούν ελαττωματικό κυτταρικό κύκλο, όπως επίσης και μεταλλάγματα POP2 και CCR4 στον ζυμομύκητα (58). Σε κύτταρα NIH 3T3 (ινοβλάστες), αποσιώπηση της POP2 επιφέρει διαταραχή στον έλεγχο της κυτταρικής μάζας. Στα θηλαστικά υπερ-έκφραση της CNOT7 ή της CAF1Z ή μείωση έκφρασης της CNOT6L, προκαλεί μειωμένη κυτταρική αύξηση (60,93). Όλες αυτές οι αποσπασματικές πληροφορίες δίνουν μία πρώτη εικόνα για τον βιολογικό ρόλο των αποαδενυλασών. Έως τώρα είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς άμεσες ή έμμεσες επιπτώσεις. Για παράδειγμα ο φαινότυπος που προκαλείται παρεμβάλλοντας το γονίδιο της Nocturnin μπορεί να οφείλεται σε διατάραξη πολλών mrna ή μόνο αυτών που εμπλέκονται στον μεταβολισμό. Η ταυτοποίηση των συγκεκριμένων μορίων mrna στόχων των οποίων η απορρύθμιση είναι υπεύθυνη για τους φαινοτύπους που περιγράφηκαν προηγουμένως κρίνεται απαραίτητη. 47

Εισαγωγή 6. Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης Η ρύθμιση της δράσης των αποαδενυλασών είναι αναγκαία, καθώς μη φυσιολογική αποαδενυλίωση επιφέρει γενική απορρύθμιση του κυτταρικού μεταβολισμού. Σταθερά και μεταφραζόμενα mrnas πρέπει να προστατεύονται από την αφαίρεση της poly(a) ουράς, ενώ μη σταθερά ή προβληματικά mrnas πρέπει να αποαδενυλιώνονται και να αποικοδομούνται (94,95). Ταχεία αποαδενυλίωση συγκεκριμένων στόχων ξεχωρίζει σημαντικά από τη φυσιολογική αποαδενυλίωση. Έτσι οι αποαδενυλάσες πρέπει να ρυθμίζονται γενικά αλλά και ειδικά σύμφωνα με τον στόχο (Εικόνα 26). Εικόνα 26 Γενικοί μηχανισμοί ρύθμισης της αποαδενυλίωσης (24) Η ρύθμιση της αποαδενυλίωσης ξεκινάει όπως τα περισσότερα γονίδια από την ρύθμιση της μεταγραφης των γονιδίων που εμπλέκονται. Οι αποαδενυλάσες και οι ρυθμιστές τους εκφράζονται σε δεδομένη χρονική στιγμή και τόπο όταν μπορεί να υπάρχει και η ρύθμιση τους. Για παράδειγμα η έκφραση της Nocturnin είναι ρυθμική, πιθανόν μέσου ημερονυκτίου ρυθμού (96). Άλλες αποαδενυλάσες, όπως μέλη της POP2 και CCR4 οικογένειας εκφράζονται ευρέως και σταθερά (97). Ένας δεύτερος μηχανισμός για γενική ρύθμιση της αποαδενυλίωσης είναι η αναστολή της ενζυμικής δράσης. Eιδικοί παράγοντες που προκαλούν στρες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οξειδωτικά, ωσμωτική πίεση ή θερμικό στρες καθώς και έλλειψη γλυκόζης, αναστέλλουν την αποαδενυλίωση, ενώ μελέτες επί της ανθρώπινης PARN έχουν δείξει ότι αναστέλλεται από νουκλεοτίδια και συνθετικά τους ανάλογα (98-100). Η αποαδενυλίωση επηρεάζεται επίσης από δύο τοπολογικά διακριτές μορφές ελέγχου: α) την πυρηνική κυτταροπλασματική και β) τον εντοπισμό σε κοκκία. ιάφορες αποαδενυλάσες κινούνται παλίνδρομα, από τον πυρήνα στον κυτταρόπλασμα (38,80). Αλλαγές στη διαμερισματοποίηση επιφέρουν δραματικά αποτελέσματα. Στα αμφίβια, αποσύνθεση του πυρήνα κατά τη μείωση απελευθερώνει την PARN στο κυτταρόπλασμα όπου και αποαδενυλιώνει μητρικά mrna (83). 48

Εισαγωγή 6.1 Μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων που κωδικοποιούν αποαδενυλάσες Όπως συμβαίνει με τα περισσότερα γονίδια έτσι και στη περίπτωση των αποαδενυλασών το πρώτο σημείο ελέγχου συμβαίνει στη μεταγραφή. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η NOC η οποία είναι γνωστή από το γεγονός ότι η έκφραση του γονιδίου ακολουθεί έναν ημερονύκτιο ρυθμό (101). Μεταγραφική ρύθμιση των άλλων αποαδενυλασών μέχρι τώρα φαίνεται να σχετίζεται με απόκριση σε στρες και παθολογικές καταστάσεις. Εξαιρετικά ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι το μη χαρακτηρισμένο γονίδιο PNLDC1 που αποτελεί αντικείμενο της παρούσας διατριβής όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, υπόκειται σε μεθυλίωση του προαγωγέα χωρίς να έχει μελετηθεί που και γιατί συμβαίνει αυτή η μεθυλίωση. Παρόλο που η δράση των αποαδενυλασών ρυθμίζεται με πολλούς τρόπου μέτα-μεταφραστικά μία επιπρόσθετη ρύθμιση σε επίπεδο μεταγραφής μπορεί να ελέγχει τη ποσότητα της αποαδενυλάσης και κατά συνέπεια να αυξάνει την αποαδενυλίωση όλων των mrna στόχων σε σχέση με την πολυαδενυλίωση τους, ή ανεξάρτητα με το αν πολυαδενυλιώνονται η όχι στο κυτταρόπλασμα. Η αντίρροπη πολυαδενυλίωση-αποαδενυλίωση είναι μια σημαντική διαδικασία και αλλαγές στα πρότυπα πολυαδενυλίωσης-αποαδενυλίωσης συνδέεται με την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και κατ επέκταση τη ρύθμιση της καρκινογένεσης (102). Αλλαγές στα πρότυπα αυτά μπορεί να προκληθεί και αλλαγές της ποσότητα των αποαδενυλασών. Οι αποαδενυλάσες παίζουν ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, κυτταρικό θάνατο, απόκριση στο στρες και σε βλάβες του DNA (90,103-105). Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης της PARN έχουν βρεθεί να σχετίζονται με οξεία λευχαιμία και καρκίνο του γαστρεντερικού (106,107). Τέλος, η έκφραση της PARN στο A. thaliana αυξάνεται με την παρουσία αμινοβουτιρικού οξέος καθώς και οσμωτικού στρες (108). Γενικά οι περισσότερες αποαδενυλάσες φαίνεται να εκφράζονται σε όλους τους τύπους ιστών στον άνθρωπο, λόγω του σημαντικού τους ρόλου σε βασικές διεργασίες του κυττάρου. Ωστόσο μετάγραφα κάποιων αποαδενυλασών έχουν βρεθεί να διαφέρουν ανάμεσα σε διαφορετικούς ιστούς. Οι δύο ορθόλογες της CCR4 του ζυμομύκητα η CCR4a/CNOT6 και CCR4b/CNOT6L, εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στη καρδιά, στον πλακούντα, στου σκελετικούς μυς, στο πάγκρεας και στους όρχεις ενώ λιγότερη έκφραση παρουσιάζουν στο συκώτι, στους νεφρούς, στον σπλήνα, στο θύμο, στον προστάτη, στα ωοθυλάκια στο λεπτό έντερο και στα λευκοκύτταρα (όπου εκφράζεται μονό η CCR4b/CNOT6L), ενώ δεν εκφράζονται στον εγκέφαλο, στους πνεύμονες και στο κόλον (60). Μετάγραφα των ανθρώπινων ορθόλογων της CAF1 του ζυμομύκητα, η CAF1a/CNOT7 και CAF1b/CNOT8/POP2 ανιχνεύονται στους περισσότερους ιστούς ενώ και τα δύο ισοένζυμα εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στη καρδιά και στο πάγκρεας. Η CAF1a/CNOT7 εκφράζεαι σε υψηλά επίπεδα στου σκελετικούς μυς, οπού η CAF1b/CNOT8 εκφράζεται σε πολύ βασικά επίπεδα (97). Στο ποντίκι η CCR4a/CNOT6, CCR4b/CNOT6L, και CAF1a/ CNOT7 εκφράζονται σχεδόν παντού ενώ η CAF1b/CNOT8 φαίνεται να έχει ιστοειδική έκφραση (109). Κατά τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων μειώνεται η έκφραση των CCR4a/CNOT6 και CAF1b/CNOT8. Τα πρότυπα της έκφρασης των αποαδενυλασών 49

Εισαγωγή μπορεί να αλλάζει ανάμεσα τα είδη γεγονός που συμβαδίζει με τη θεωρία ότι η διαφορετικότητα των οργανισμών οφείλεται και σε αλλαγές στη λεπτομερή ρύθμιση της γονιδιακή έκφρασης και ως γνωστών οι αποαδενυλάσες εμπλέκονται στο περιπλοκότερο και λεπτομερέστερο σημείο ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Η ποσότητα των mrnas που κωδικοποιούν αποαδενυλάσες μπορεί επίσης να ελέγχεται μέσω mirna διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της σταθερότητας. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι η σταθερότητα του mrna της NOC ρυθμίζεται από to mir-122 στο συκώτι του ποντικού (110). Eπιπρόσθετα, έχει δειχθεί ότι η CCR4b/CNOT6L αποτελεί στόχο του mir-146a, το οποίο μειώνει τα επίπεδα των CCR4b/CNOT6L mrna κατά τη μετάπτωση των επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά (EMT)) (Εικόνα 27) (111). Εικόνα 27 Το microrna-146a στοχεύει το CCR4b/CNOT6L προκαλώντας τη μετάπτωση των επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά 6.2 Υποκυττάριος εντοπισμός αποαδενυλασών Η αποαδενυλίωση μπορεί επίσης να επηρεάζεται από χαρακτηριστικά του mrna. Φαίνεται ότι η 5 καλύπτρα διεγείρει την ενεργότητα και τη διαρκή εξωνουκλεοτιδική δράση από την PARN, ενώ δεν έχει επίδραση στη δράση άλλων αποαδενυλασών. Όπως προαναφέρθηκε, αυτή η ιδιαίτερη ιδιότητα της PARN οφείλεται στην ικανότητα πρόσδεσης του ενζύμου αυτού στη 5 καλύπτρα του mrna μέσω της δομικής περιοχής RRM όπως προαναφέρθηκε (112). Σε κάποια μόρια mrna, η poly(a) ουρά μπορεί να προστατευθεί από τις αποαδενυλάσες μέσω ζευγαρώματος βάσεων. Για παράδειγμα το πυρηνικό RNA της PAN στο σάρκωμα Kaposi, προκαλούμενο από ερπιτοϊό, αποτρέπει την αποαδενυλίωση του με ζευγάρωμα των βάσεων μεταξύ της poly(a) ουράς και μίας περιοχής πλούσιας σε ουριδίνη (113,114). Η U-rich περιοχή EDC1 mrna του S.cerevisiae λειτουργεί με τον ίδιο τρόπο (61). Ο περιορισμός της δράσης των αποαδενυλασών σε κάποια περιοχή του κυττάρου της περιορίζει επίσης όσον αφορά τα mrna-στόχους που θα αποαδενυλιώνουν. Μέχρι σήμερα, όλες οι αποαδενυλάσες που έχουν χαρακτηριστεί έχουν βρεθεί να εντοπίζονται είτε στον πυρήνα, είτε στο κυτταρόπλασμα. 50

Εισαγωγή Εικόνα 28 Κατανομή των αποαδενυλασών σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα Οι CCR4, CAF1, PAN2, CCR4d, CAF1z, και PARN εντοπίζονται είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασμα ανάλογα με τον ρόλο που πρέπει να επιτελέσουν. Οι CCR4, CAF1, PAN2, και NOC βρίσκονται κυρός στον κυτταρόπλασμα ενώ η PARN βρίσκεται κυρίως στον πυρήνα (80,115). Οι CCR4d και CAF1z συγκεντρώνονται κυρίως στα σωμάτια Cajal (Cajal bodies) στον πυρήνα(33). Η PDE12 είναι μια μιτοχονδριακή αποαδενυλάση και έχει προταθεί ότι ρυθμίζει τη μετάφραση των πολυαδενυλιωμένων mt-mrna (116). Η PARN συγκεντρώνεται στου πυρηνίσκους και στα σωμάτια Cajal (Cajal bodies) σε κύτταρα U2OS, και παίζει ρόλο στη ωρίμανση μικρών πυρηνισκικών RNA και μικρών RNA των σωματίων Cajal (115). Αυτό υποδηλώνει ότι η δράση των αποαδενυλασών δεν περιορίζεται στην poly(α) ουρά των mrna αλλά όλων των oligo(α) ή poly(α) μέσα στα κύτταρα. Ένα άλλο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό για την PARN είναι ότι μπορεί μετά από αποκοπή της καρβοξυτελικής περιοχής περιλαμβανομένου και του σήματος πυρηνικού εντοπισμού να εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 28) (117,118). 6.3 Εντοπισμός αποαδενυλασών σε κοκκία Οι CCR4, CAF1, PAN2, CCR4d, CAF1z, και PARN εντοπίζονται είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασμα ανάλογα με τον ρόλο που πρέπει να επιτελέσουν. Οι CCR4, CAF1, PAN2, και NOC εντοπίζονται κυρίως στον κυτταρόπλασμα ενώ η PARN κυρίως στον πυρήνα (80,115). Οι CCR4d και CAF1z συγκεντρώνονται κυρίως στα σωμάτια Cajal (Cajal bodies) στον πυρήνα γεγονός που υποδηλώνει την ενεργό συμμετοχή τους στην αποικοδόμηση μορίων RNA (33). Η PARN συγκεντρώνεται στου πυρηνίσκους και στα Cajal bodies σε κύτταρα U2OS, και παίζει ρόλο στη ωρίμανση μικρών πυρηνισκικών RNA και μικρών RNA των σωματίων αυτών (115). Ένα άλλο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό για την PARN είναι ότι μπορεί μετά από αποκοπή της καρβοξυτελικής περιοχής περιλαμβανομένου και του σήματος 51

Εισαγωγή πυρηνικού εντοπισμού να εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 29) (117,118). Τέλος στα μιτοχόνδρια εντοπίζεται η PDE12. Το συγκεκριμένο ένζυμο είναι μια μιτοχονδριακή αποαδενυλάση και έχει προταθεί ότι ρυθμίζει τη μετάφραση των πολυαδενυλιωμένων mtmrna (116). Αυτό υποδηλώνει ότι η δράση των αποαδενυλασών δεν περιορίζεται στην poly(α) ουρά των mrna αλλά όλων των oligo(α) ή poly(α) μέσα στα κύτταρα. Οι αποαδενυλάσες μπορεί επιπρόσθετα να εντοπίζονται και σε ενδοκυτταρικά κοκκία. Υπάρχουν δύο ειδών κοκκία με RNA στο κυτταρόπλασμα, τα στρες σωματίδια (stress granule-sg) και τα GW/RNA σωμάτια επεξεργασίας η αλλιώς, P-bodies (Processing Bodies). Αυτές οι δομές διαχωρίζονται λόγω των βασικών τους συστατικών, ωστόσο μοιράζονται κάποιες κοινές πρωτεΐνες (119). Τα SG περιέχουν mrna τα οποία έχουν σταματήσει στην έναρξη της μετάφρασης ενώ τα P-bodies συσσωρεύουν μεταφραστικά ανενεργά mrnas. Σε αυτά τα σωμάτια έχουν βρεθεί παράγοντες που εμπλέκονται στην έναρξη της μεταγραφής, στην αποαδενυλίωση, στην αφαίρεση του καλύμματος, στην 5 3 εξωνουκλεοτιδική αποικοδόμηση, στο μονοπάτι nonsense-mediated decay και στο μονοπάτι της αποσιώπησης μέσω mirnas (120-122). Εικόνα 29 Α. Ανθρώπινα U2OS σε φυσιολογικές συνθήκες Β. Επωασμένα σε 0.5 mm Na 3 AsO 4 για 45 min (δεξιά) μονιμοποιήθηκαν και έγινε χρώση της LSM1 (πράσινο), της XRN1 (κόκκινο) και του DNA (κυανό). Με το στρες φαίνονται τα P bodies με κίτρινο χρώμα όπου συνεντοπίζονται οι δύο πρωτεΐνες. Οι αποαδενυλάσες ως κύριοι ρυθμιστές του κύκλου ζωής των mrnas είναι λογικό να εμπλέκονται στη δημιουργία τόσο των πυρηνικών αλλά και των κυτταροπλασματικών RNA σωματιδίων. Η PARN έχει παρατηρηθεί ότι εντοπίζεται σε διακριτές κυτταροπλασματικές δομές που περιέχουν υπομονάδες του εξωσώματος (59), όπου οι CCR4, CAF1, και PAN2 PAN3 φαίνεται να συνεντοπίζονται με πρωτεΐνες ειδικές των P-body σε κύτταρα θηλαστικών, στον ζυμομύκητα και στο A. nidulans (46,123). Η αποαδενυλίωση έχει δειχθεί ότι είναι προαπαιτούμενο γεγονός της δημιουργίας των P-bodies (124-127). Η PAN3 έχει δειχθεί ότι μπορεί να εμπλουτίζει τα P-bodies σε CCR4, CAF1, και PAN2 σε κύτταρα NIH3T3 52

Εισαγωγή (124). Η σημαντικότητα των αποαδενυλασών στον σχηματισμό των P-bodies φαίνεται από το γεγονός ότι όταν μειώνεται τεχνητά η αποαδενυλίωση μειώνεται και σχηματισμός τους (124,127). Πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι η NANOS2 προσελκύει το σύμπλοκο CCR4-NOT στα P-bodies και ότι το σχηματιζόμενο σύμπλοκο NANOS2-CCR4-NOT διατηρεί την αποαδενυλίωσή στα σωμάτια. Τα γαμετοκύτταρα, τα νευρωνικά κοκκία και τα P-bodies περιέχουν μόρια mrna μεταφραστικά ανενεργά τα οποία μπορούν να ενεργοποιηθούν εκ νέου μέσω επανα-αδενυλίωσης (128). Ο συνεντοπισμός των ενζύμων με τα υποστρώματά τους μπορεί να διεγείρει την αποαδενυλίωση αλλά αυτό δεν έχει αποδειχθεί πλήρως. Από την άλλη η αποαδενυλίωση δεν φαίνεται να περιορίζεται στα κοκκία γιατί οι ίδιες αποαδενυλάσες έχουν βρεθεί και στο κυτταρόπλασμα (113). 6.4 Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης από cis-ρυθμιστικά στοιχεία του mrna, από εξωκυττάρια σήματα και ρυθμιστικές πρωτεΐνες Η σταθερότητα των περισσοτέρων mrnas σε μεγάλο βαθμό καθορίζεται από ειδικές αλληλουχίες που εμπεριέχουν. Μία σύγκριση των ρυθμιστικών στοιχείων ανάμεσα σε διάφορες αποαδενυλάσες δείχνουν ότι οι αλληλουχίες που περιέχουν τα μετάγραφα παίζουν σημαντικό ρόλο στο να επιστρατεύουν μία ή περισσότερες ειδικές αποαδενυλάσες μέσω RNA προσδενόμενων πρωτεϊνών (Εικόνα 30). Μέχρι σήμερα, η PARN είναι η μόνη αποαδενυλάση που έχει την δυνατότητα να προσδένεται απευθείας στο RNA μέσω αλληλεπίδρασης με το 5 cap. Εικόνα 30 Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης από cis-δρώντα στοιχεία του mrna και προσδενόμενες πρωτεΐνες Η PARN ανταγωνίζεται άλλες CAP ποσδενόμενες πρωτεΐνες όπως το σύμπλοκο πρόσδεσης στην καλύπτρα (cap-binding protein complex, CBC) και οι ευκαρυωτικοί παράγοντες έναρξης της μετάφρασης (eukaryotic translation initiation factors, eifs) (79). Μετά από βλάβη του DNA η PARN προσδένεται στην CSTF50 του CSTF συμπλόκου το οποίο εμπλέκεται στην πολυαδενυλίωση των νεοσυντηθέμενων mrnas κάτω από φυσιολογικές 53

Εισαγωγή συνθήκες και ανταγωνίζεται την δράση του. Η παρουσία της PABP μειώνει την αποαδενυλίωση από την PARN και το σύμπλοκο CCR4 NOT προστατεύοντας ουσιαστικά την poly(a) και προκαλώντας την κυκλοποίηση του mrna κατά την μετάφραση (35). Σε απόκριση σε διάφορα εξωκυττάρια σήματα μπορεί είτε να σταθεροποιούνται κάποια ασταθή μετάγραφα είτε να αποσταθεροποιούνται κάποια σταθερά. Και τα δύο μονοπάτια εμπλέκουν ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση αποαδενυλασών. Εικόνα 31 Μηχανισμοί αναστολής και ενεργοποίησης της αποαδενυλίωσης σε απόκριση σε εξωκυττάρια σήματα Η ρύθμιση ειδικών mrna οφείλεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες που συχνά βρίσκονται στο 3 UTR και προάγουν την αποαδενυλίωση. Στις αλληλουχίες αυτές προσδένονται παράγοντες που στρατολογούν αποαδενυλάσες και διεγείρουν την αποαδενυλίωση. Οι RNA προσδενόμενες πρωτεΐνες (CUG-BP, PUF και CPEB), στρατολογούν τις αποαδενυλάσες αλληλεπιδρώντας άμεσα με αυτές (129,130). Ακόμα και η PABP μπορεί να ενεργοποιήσει την αποαδενυλίωση έλκοντας το σύμπλοκο PAN2 PAN3 στο mrna. Στα θηλαστικά η PABP μπορεί να στρατολογήσει σύμπλοκα μελών των οικογενειών POP2 CCR4 μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που συσχετίζονται με TOB πρωτεΐνες (130). Η συνδυαστική δράση των ρυθμιστών επεκτείνει την πολυπλοκότητα των διαδικασιών αποαδενυλίωσης. Πολλαπλοί καταστολείς είτε πρωτεΐνες είτε mirnas, συχνά προσδένονται στο 3 UTR του ίδιου mrna. Για παράδειγμα οι κατασταλτικές πρωτεΐνες του ζυμομύκητα PUF4 και PUF5 προσδένονται στο 3 UTR του HO mrna και κάθε πρωτεΐνη επιστρατεύει τα σύμπλοκα CCR4 POP2 για να επιταχυνθεί η αποαδενυλίωση (131). Επιπλέον σύμπλοκα που προσδένονται στο 3 -UTR μπορούν να προσελκύσουν αποαδενυλάσες μέσω διαφορετικών υπομονάδων. Στη D. melanogaster οι πρωτεΐνες Pumilio και Nanos προσδένονται στο hunchback mrna και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Το σύμπλοκο Pumilio Nanοs με την σειρά του προσελκύει το σύμπλοκο CCR4 POP2 NOT με αλληλεπιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν και οι δύο υπομονάδες. Η Pumilio προσδένεται στην POP2, ενώ η Nanos προσδένεται στην NOT4 (132). Έλεγχος της αποαδενυλίωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί 54

Εισαγωγή με τροποποίηση της πρόσδεση του ρυθμιστή ενός mrna ή της αποαδενυλάσης. Άλλο ένα σημείο ελέγχου είναι η αλληλεπίδραση ρυθμιστή αποαδενυλάσης. Η PBP1 του ζυμομύκητα προσδένεται στην PABP και αναστέλλει την δραστικότητα της PAN2 PAN3 πιθανόν εμποδίζοντας την πρόσδεση. Πίνακας 2 Παράγοντες που προσελκύουν αποαδενυλάσες και διεγείρουν την αποαδενυλίωση Το υπόστρωμα των αποαδενυλασών, η poly(a) ουρά του mrna είναι καλυμμένη με μόρια PABP που εμποδίζουν την πρόσβαση σε αυτήν, π.χ. η PABP του ζυμομύκητα αναστέλλει την δραστικότητα της απομονωμένης Ccr4n. Στα θηλαστικά η PABP αναστέλλει την PARN (133). Στο X. Laevis, η epab, μια ομόλογη πρωτεϊνη της PABP επίσης αναστέλλει την αποαδενυλίωση του mrna (134). Η ρυθμιζόμενη αποδέσμευση της PABP από την poly(a) του mrna ή η αλληλεπίδραση της PABP με μία αποαδενυλάση μπορεί να διεγείρει την αποαδενυλίωση (135,136). Στον άνθρωπο υπάρχουν τουλάχιστον 6 μορφές της PABP, ενώ υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες που επίσης προσδένονται στη poly(a) ουρά (όπως η NAB2), για τις οποίες δεν είναι γνωστό εάν επηρεάζουν την αποαδενυλίωση. Οι ρυθμιστές είναι δυνατόν να μπλοκάρουν την αποαδενυλίωση με το να σταθεροποιούν σύμπλοκα PABP mrna. Το α-cp σύμπλοκο των RNA προσδενόμενων πρωτεϊνών σταθεροποιεί το mrna της α-globin με το να προσδένεται στην PABP. Συγχρόνως άλλες πρωτεΐνες προσδέτες μπορούν να επηρεάζουν την αποαδενυλίωση. Για παράδειγμα, η CBP80, μία υπομονάδα του πυρηνικού συμπλόκου πρόσδεσης στο 5 κάλυμμα προσδένεται και ανταγωνίζεται τη δράση της PARN, πιθανόν περιορίζοντας τη δράση της σε νεοσυντιθέμενα πρόδρομο mrnas (50). 55

Εισαγωγή Επιπλέον ρυθμιστικές πρωτεΐνες μπορούν να δρουν μέσω της PABP για να διεγείρουν την αποαδενυλίωση του mrna. Πρωτεΐνες συσχετιζόμενες με ελικάση όπως η RHAU μπορούν να διεγείρουν την αποαδενυλίωση αντικαθιστώντας την PABP από την poly(a) ουρά (137). Η TOB των θηλαστικών διεγείρει την αποαδενυλίωση με το να στρατολογεί μέλη της CCR4 POP2 οικογένειας μέσω αλληλεπιδράσεων με την C-τελική περιοχή (non- RNA-binding) της PABP. Τέλος, η λειτουργεί ως γέφυρα συνδέοντας την PABP με σύμπλοκα αποαδενυλίωσης (130). 6.5 Αντισταθμιστική πολυαδενυλίωση Το μήκος των poly(a) ουρών καθορίζεται δυναμικά από τις αντίθετες δράσεις πολυαδενυλίωσης και αποαδενυλίωσης. Οι διαδικασίες αυτές είναι δυνατόν να ρυθμίζονται από το στοιχείο κυτταροπλασματικής πολυαδενυλίωσης (cytoplasmic polyadenylation element, CPE) και της προσδενόμενες σε αυτό πρωτεΐνες (CPE binding proteins, CPEBs). Οι πρωτεΐνες αυτές μπορούν είτε να επιστρατεύουν την PARN άμεσα είτε την CAF1 έμμεσα μέσο των TOB/BTG πρωτεϊνών και αυτό έχει ως συνέπεια την αποσταθεροποίηση συγκεκριμένων mrna (138-140). Κυτταροπλασματικές poly(a) πολυμεράσες της οικογένειας GLD2 είναι δυνατόν να επαναδενυλιώνουν και με αυτόν τον τρόπο να ενεργοποιούν κατασταλμένα μόρια mrna (129). Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα αφορά έναν μηχανισμό στα ωοκύτταρα του X. laevis, όπου ο παράγοντας CPEB προσδένεται στο mrna της κυκλίνης B1 και αλληλεπιδρά ταυτόχρονα με την πολυμεράση GLD2 και την PARN (129) (Πίνακας 2). Τα δύο αυτά ένζυμα είναι ανενεργά μέχρι την φάση της μείωσης. Κατά τη διάρκεια της μείωσης η φωσφορυλίωση της CPEB προκαλεί αποδέσμευση της PARN επιτρέποντας την πολυαδενυλίωση να λάβει χώρα και να ενεργοποιήσει το mrna (129). Αυτός ο τρόπος ελέγχου είναι κοινός όταν κατασταλμένα μόρια mrnas χρειάζεται να αποθηκευτούν και να κινητοποιηθούν σε διαφορετικό στάδιο όπως συμβαίνει στη σύναψη. H ενεργοποίηση του υποδοχέα του NMDA (NMDAR) προκαλεί την ενεργοποίηση της κινάσης Aurora A, που φωσφορυλιώνει την CPEB, προκαλώντας την πολυαδενυλίωση. Με την σειρά της η PABP προσδένεται στη νεοσυντιθέμενη poly(a) ουρά και προσελκύει τον παράγοντα eif4g. Το διμερές PABP-eIF4G αποδεσμεύει την Maskin (μία σημαντική πρωτεΐνη που έχει βρεθεί να ελέγχει την μετάφραση συγκεκριμένων mrna μέσω δέσμευσης με τον eif4e), επιτρέποντας στον eif4g να προσδεθεί στον eif4e και να ξεκινήσει η μετάφραση (Εικόνα 32). Με το μηχανισμό αυτό είναι δυνατόν να παρακάμπτεται η χρονοβόρα διαδικασία ενεργοποίησης της μεταγραφής του γονιδίου σε απόκριση σε ένα σήμα. Έτσι τα κύτταρα μπορούν να αποκριθούν άμεσα για να επιτελέσουν μία ταχεία διαδικασία όπως απαιτείται παραδείγματος χάριν στις νευρικές συνάψεις. 56

Εισαγωγή Εικόνα 32 Μηχανισμός ενεργοποίησης mrna που περιέχουν το στοιχείο CRE στην νευρική σύναψη 6.6 Έλεγχος της αποαδενυλίωσης μέσω συμπλόκων πολλαπλής λειτουργίας Σύμπλοκα αποαδενυλίωσης που επιστρατεύονται από ειδικούς ρυθμιστές μπορεί να είναι πολυλειτουργικά. Τα σύμπλοκα αυτά περιέχουν παράγοντες που μειώνουν τη μετάφραση του mrna και προάγουν την αποικοδόμηση του mrna, μαζί με τα ένζυμα αποαδενυλίωσης. Η πολυλειτουργικότητα έχει δύο σημαντικές επιπτώσεις. Πρώτον, η αποαδενυλίωση δεν είναι επαρκής για ταχεία αποικοδόμηση του mrna εάν, για το συγκεκριμένο mrna, υπάρχουν άλλα καθοριστικά στάδια όπως η απομάκρυνση της καλύπτρας (141). Επίσης η πολυλειτουργικότητα παρέχει ευκαιρίες για τον έλεγχο της αποαδενυλίωσης, της μετάφρασης και της ανακύκλωσης, είτε ανεξάρτητα, είτε σε συνδυασμό, ανάλογα με τη φύση του συμπλόκου (Εικόνα 33) (Πίνακας 2). Πολλοί ρυθμιστές (όπως οι παράγοντες PUF, CPEB, KSRP, Smaug, TTP καθώς και συγκεκριμένα mirnas) στρατολογούν ειδικές αποαδενυλάσες και τους συνπαράγοντες τους, που είτε αναστέλλουν την μετάφραση (όπως οι Dhh1, Maskin, CUP και 4EHP), είτε προάγουν την απομάκρυνση της καλύπτρας (όπως οι DCP1 και DCP2) είτε αποικοδομούν ταχέως το mrna [όπως το εξώσωμα και η εξωριβονουκλεάση-1 (XRN1)] (Εικόνα 33) (Πίνακας 2). Στρατολόγηση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ελικάση όπως η Dhh1 (και οι ορθόλογες της πρωτεΐνες) και η RHAU62, μπορεί να διευκολύνουν τη καταστολή ή την αποικοδόμηση της poly(a) ουράς αναδιαμορφώνοντας τα σύμπλοκα mrna πρωτεΐνης (61,137). 57

Εισαγωγή Εικόνα 33 Πολυλειτουργικότητα των συμπλόκων αποαδενυλίωσης ανάλογα με τον ρυθμιστή Η αναδιαμόρφωση μπορεί να εκτοπίζει παράγοντες από το mrna συμπεριλαμβάνοντας παράγοντες μετάφρασης και ρύθμισης. Από την άλλη μπορεί να επιτρέψει σε άλλους παράγοντες να αποκτήσουν πρόσβαση στο mrna, όπως καταβολικά ένζυμα. Ακόμα και μία μεμονωμένη αποαδενυλάση μπορεί να είναι πολυλειτουργική. Η PARN προσδένεται στην 5 καλύπτρα και διεγείρεται από την πρόσδεση αυτή (112). Όταν στρατολογείται σε ένα mrna, η PARN πιθανόν ανταγωνίζεται τον παράγοντα έναρξης της μετάφρασης 4Ε eif4e ο οποίος προσδένεται επίσης στην 5 καλύπτρα με αποτέλεσμα η PARN να μπορεί ταυτόχρονα να καταλύει την αποαδενυλίωση και να αναστέλλει τη μετάφραση κάτι που έρχεται σε συμφωνία με πειράματα ανταγωνισμού της πρόσδεσης στο mrnas (142). Παρομοίως, η αλληλεπίδραση με την 5 -καλύπτρα μπορεί να εγγυηθεί ότι μόνο μη μεταφραζόμενα μόρια mrna που δεν ταυτίζονται με τον παράγοντα eif4e αποτελούν στόχο για την PARN. Τα σύμπλοκα CCR4 POP2 NOT φαίνεται να είναι επίσης πολυλειτουργικά, και περιλαμβάνουν πρωτεϊνικές υπομονάδες που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο, στη μεταγραφή και στην μεταγωγή σήματος, ενώ πιθανόν ενσωματώνουν την διεργασία της αποικοδόμησης του mrna στις διαδικασίες αυτές (143). Με το να προσελκύουν ένα μοναδικό σύμπλοκο μερικοί ρυθμιστές καθορίζουν πολλές δραστηριότητες. Στο ζυμομύκητα το σύμπλοκο Ccr4 Pop2 Not complex έρχεται σε επαφή με το ένζυμο αφαίρεσης της καλύπτρας και την Dhh1 (143). Αυτό το σύμπλοκο είναι πολυλειτουργικό αφού καταλύει την αποαδενυλίωση, την αφαίρεση της καλύπτρας την αναδιαμόρφωση και την καταστολή της μετάφρασης. Άλλοι ρυθμιστές όπως οι PUF πρωτεΐνες στρατολογούν πολυλειτουργικά σύμπλοκα με μία απλή αλληλεπίδραση με την Pop2 υπομονάδα καταστέλλοντας την μετάφραση και προάγοντας την αποικοδόμηση του mrna (61). Η ετερογένεια των πολυλειτουργικών συμπλόκων μπορεί να εξηγήσει γιατί ένας μοναδικός ρυθμιστής, ή μία οικογένεια ρυθμιστών μπορεί άλλοτε να καταστέλλει τη μετάφραση του mrna και άλλοτε να προάγει την αποικοδόμηση του. Οι διαφορές πιθανόν οφείλονται στη 58

Εισαγωγή σύσταση ή τη τροποποίηση των συμπλόκων αποαδενυλίωσης. Η 3 UTR του mrna καθορίζει το ποια σύμπλοκα αποαδενυλίωσης θα επιδρούν πάνω σε αυτό. Η παρουσία εκατοντάδων RNA προσδενόμενων πρωτεϊνών και mirnas στο ανθρώπινο γονιδίωμα υποδεικνύει ότι η ρύθμιση στο επίπεδο του mrna είναι πιο διαδεδομένη από ότι ήταν γνωστό παλαιότερα. Η πολυμορφία και το πλήθος των mrna αποαδενυλασών και των συμπλόκων τους, παρέχουν δυναμικές και ευέλικτες δυνατότητες στον έλεγχο του mrna. Η στρατολόγηση των συμπλόκων αποαδενυλίωσης σε συγκεκριμένα mrna με RNA προσδενόμενους ρυθμιστές είναι ένα σημαντικό σημείο ελέγχου. Είναι όμως απαραίτητο πλέον να διευθετηθούν διάφορα σημαντικά θέματα. Η ταυτότητα, η δράση και η δομή όλων των αποαδενυλασών πρέπει να μελετηθεί. Λειτουργικές δοκιμές συνεχίζονται ώστε να ταυτοποιηθεί ο βιολογικός τους ρόλος, ωστόσο πρέπει επίσης να αποκαλυφθούν και οι συγκεκριμένοι mrna-στόχοι. Η σύσταση των συμπλοκών αποαδενυλίωσης και των συμπλόκων καταστολής του mrna που τα επιστρατεύουν είναι σημαντική και τα αίτια της ετερογένειάς τους αποτελούν σημαντικά ερωτήματα. Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός ελέγχου σε επίπεδο mrna πρέπει να γνωστοποιηθούν οι αποαδενυλάσες (και τα σύμπλοκα τους), ποιοι RNA προσδενόμενοι ρυθμιστές τις προσελκύουν και οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις που εμπλέκονται. 7. Ο ρόλος της RNA παρεμβολής στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω αποαδενυλίωσης Τα mirnas είναι μικρά μη κωδικά μόρια RNA τα οποία ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση προκαλώντας αποσιώπηση των συμπληρωματικών mrna στόχων σε μεταμεταγραφικό επίπεδο. Τα mirnas είναι διατηρημένα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και παίζουν σημαντικό ρόλο σε όλες τις βιολογικές διαδικασίες (144). Ο αριθμός των mirnas που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα διαφέρει σημαντικά μεταξύ των οργανισμών. Μέσω υπολογιστικής πρόβλεψης και ταυτοποίησης όλων των mirnas του γονιδιώματος του ανθρώπου φαίνεται ότι κάθε mirna μπορεί να προσδένεται σε εκατοντάδες διαφορετικά mrnas καλύπτοντας έτσι περισσότερα από τα μισά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (145). Για να δράσουν τα mirnas αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες αργοναύτες (ΑGO, Argonaute proteins) σχηματίζοντας το βασικό πυρήνα του συμπλόκου RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Τα σύμπλοκα αυτά διαμεσολαβούν στην μετα-μεταγραφική αποσιώπηση των mrnas που περιέχουν αλληλουχίες που είναι εν μέρει ή εξολοκλήρου συμπληρωματικά με τα mirnas από τα οποία στοχεύονται. Πλήρεις συμπληρωματικοί στόχοι διασπώνται ενδονουκλεοτιδικά από της καταλυτικά ενεργές AGO πρωτεΐνες. Ωστόσο στα θηλαστικά οι mrna στόχοι είναι συνήθως εν μέρει συμπληρωματικοί και πολύ σπάνια λαμβάνει χώρα ενδονουκλεοτιδική διάσπαση (146). Στον άνθρωπο μόνο η AGO2 είναι καταλυτικά ενεργή, ενώ AGO1, AGO3 και AGO4 δεν παρουσιάζουν αντίστοιχη ιδιότητα. Στις περιπτώσεις αυτές όπου δηλαδή τα σύμπλοκα RISC δεν έχουν καταλυτική δράση οι AGO 59

Εισαγωγή πρωτεΐνες επιστρατεύουν άλλες πρωτεΐνες που διαμεσολαβούν στην αποσιώπηση η οποία επιτυγχάνεται με συνδυασμό μεταφραστικής καταστολής και αποσταθεροποίησης του mrna (Εικόνα 34). Η αποσταθεροποίηση αυτή οδηγεί σε αποικοδόμηση του mrna-στόχου η οποία ξεκινάει με αποαδενυλίωση και ακολουθείται από αφαίρεση του 5 καλύματος και 5-3 εξωνουκλεοτιδική αποικοδόμηση. Στον ζυμομύκητα η αφαίρεση του καλύμματος γίνεται από το σύμπλοκα αφαίρεσης της καλύπτρας DCP1 DCP2 (147,148). Εικόνα 34 Η αποσιώπηση μέσω mirnas επιτυγχάνεται με συνδυασμό μεταφραστικής μείωσης και αποσταθεροποίησης του mrna. Οι πιο σημαντικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες AGO είναι οι πρωτεΐνες GW182 οι οποίες σχηματίζουν τα κατάλληλα ικριώματα για την προσέλκυση των κυτταροπλασματικών συμπλόκων αποαδενυλίωσης PAN2 PAN3 και CCR4 NOT αλλά και της PARN από τις AGO πρωτεΐνες. Πρόσφατη μελέτη αναδεικνύει τον μοναδικό ρόλο των αποαδενυλασών και των poly(α) ουρών στη γονιδιακή αποσιώπηση με mirnas όπου υποστηρίζεται η άποψη ότι όλοι οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αποσιώπηση (μείωσης της μετάφρασης και αποσταθεροποίησης του mrna) ακόμα και αυτοί που δεν ξεκινούν με την αποαδενυλίωση απαιτούν την παρουσία poly(α) με σύμπλοκο αποαδενυλάσης (149). Τέλος πρόσφατη μελέτη αποδεικνύει τον ρόλο της PARN στην αποαδενυλίωση προκαλούμενη από mirnas. Πιο συγκεκριμένα βρέθηκε ότι το mir-125b σε σύμπλοκο με το RISC συμμετέχει στην ειδική προσέλκυση της PARN στο mrna TP53 προκαλώντας την αποικοδόμησή του και ότι αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να αντιστραφεί από την πρόσδεση στο στοιχείο ARE από την ARE προσδενόμενη πρωτείνη HuR (150). 8. Αποαδενυλίωση και ασθένειες Μελέτες δείχνουν ότι αυξημένη αποικοδόμηση ογκοκατασταλτικών mrna μπορεί να προκαλέσει καρκίνο, ενώ αυξημένη ανακύκλωση του mrna απαιτείται σε ταχέως 60

Εισαγωγή διαιρούμενα κύτταρα προκειμένου να στηρίξει τις απαιτήσεις για υψηλούς ρυθμούς πρωτεϊνοσύνθεσης (102,151). Μεγάλο ποσοστό των μελετών επικεντρώνονται σε παράγοντες σταθεροποίησης του mrna. Η μείωση των παραγόντων αυτών μπορεί να προκαλέσει μείωση της έκφρασης ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Από την άλλη υπερλειτουργία mirna που στοχεύουν ογκοκατασταλτικά γονίδια μπορεί επίσης να προκαλέσει καρκίνο. Πειράματα γενετικής και RNAi έχουν επιδείξει ένα ευρύ πεδίο βιολογικών λειτουργιών όπως στη γονιμότητα και κυτταρική ανάπτυξη. Λίγες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον άμεσο ρόλο των ενζύμων αυτών στο καρκίνο. Η αποαδενυλάση CCR4b του συμπλόκου CCR4b NOT επάγει την κυτταρική αύξηση σε σειρές ινοβλαστών ως πρώτοογκογονίδιο(60). Σε φυσιολογικές συνθήκες το ένζυμο αυτό ρυθμίζει τα επίπεδα του mrna της πρωτεΐνης CDKN1B (p27 Kip1 ), η οποία αναστέλλει της κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες CDK2 και CDK4 ελέγχοντας τον κυτταρικό κύκλο στην φάση G1. Επιπλέον όταν από τα κύτταρα λείπει το ένζυμο αυτό τα επίπεδα του p27 Kip1 mrna αυξάνονται και αναστέλλεται η ανάπτυξη των κυττάρων. Η CCR4b αναστέλλεται in vitro από την TOB πρωτεΐνη η οποία αναστέλλει τoν κυτταρικό πολλαπλασιασμό (152). Ωστόσο δεν υπάρχει καμία μελέτη που να εξετάζει την αλλαγή των επιπέδων της CCR4b σε όγκους, ενώ δεν υπάρχουν μελέτες που να σχετίζουν μία πλεονάζουσα δράση του ενζύμου με τα επίπεδα ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε καρκινικές σειρές. Η PARN από την άλλη μπορεί να δρα ογκοκατασταλτικά με το να στοχεύει τα mrnas των αυξητικών παραγόντων IL-8 και VEGF. Μεταλλάγματα της RNA προσδενόμενης πρωτεΐνης TTP όπου δεν μπορεί πλέον να στρατολογήσει την PARN έχουν βρεθεί σε μεταστατικά γλοιοκύτταρα (153,154). Επίσης η PARN και το σύμπλοκο εξωσώματος στρατολογούνται από τις KSRP και DHAU με αποτέλεσμα να μειώνουν τα επίπεδα των παραγόντων c-jun και upa, οι οποίοι τα οποία αυξάνονται στον καρκίνο (155,156). Ωστόσο η δράση αυτή αφορά τη δράση της PARN σε συγκεκριμένα mrna και τη διατάραξη της δράσης της από τους ρυθμιστές της. Επιπλέον η PARN έχει βρεθεί αυξημένη σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα οπού η αποσιώπηση της αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0/G1 μέσω σταθεροποίηση των p53 και p21 (107). Τέλος, έχει μελετηθεί η αλληλεπίδραση της PARN με την CUG-BP η οποία τη στρατολογεί για να αποσταθεροποιήσουν τα c-fos και TNF-alpha mrnas (157). Είναι γνωστή η σύνδεση της PARN με την απόκριση των κυττάρων στις βλάβες του DNA προκαλούμενες από υπεριώδης ακτινοβολία. Προτείνεται ότι σε φυσιολογικές συνθήκες η CBP80 αλληλεπιδρά με την πυρηνική PARN αναστέλλοντας την δράση της. Όπως όμως έχει αναφερθεί η δράση της PARN είναι ανταγωνιστική της πολυαδενυλίωσης. Πράγματι το σύμπλοκο CBC διεγείρει την πολυαδενυλίωση των pre-mrnas αυξάνοντας την σταθερότητα του συμπλόκου RNA/CstF με αποτέλεσμα τα mrna να πολυαδενυλιώνονται και να ωριμάζουν κανονικά. Βλάβες προκαλούμενες από υπεριώδη ακτινοβολία, μπλοκάρουν την ολίσθηση του RNAP II CstF. Στο σημείο αυτό το BRCA1/BARD1 σύμπλοκο προκαλεί την ουβικιτινιλίωση της RNAP II. Στις συνθήκες αυτές η PARN προσδένεται στο σύμπλοκο. Η πολυαδενυλίωση αναστέλλεται και ενεργοποιείται η αποαδενυλίωση από την PARN προκαλώντας μείωση στα γενικά επίπεδα του mrna (Εικόνα 35) (105). 61

Εισαγωγή Εικόνα 35 Μοντέλο επαγωγής της αποαδενυλίωσης από την PARN από βλάβες του DNA Πρόσφατες μελέτες συνδέουν την PARN με ασθένειες που σχετίζοντας με την σταθερότητα των χρωμοσωμάτων και το μήκος των τελομερών. Σε μία μελέτη βρέθηκαν μεταλλάξεις που επηρεάζουν την δραστικότητα του ενζύμου σε ασθενείς με ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση. Οι μεταλλάξεις αυτές συνδέονται με κοντύτερα τελομερή. Ο μηχανισμός με τον οποίο οι μεταλλάξεις προκαλούν το φαινόμενο αυτό δεν είναι εξακριβωμένος ωστόσο τα H/ACA snornas, στην ωρίμανση των οποίων εμπλέκεται η PARN, σχετίζονται με την σειρά τους στην ωρίμανση των GAR1, NHP2 και NOP10 pre-mrnas. Μεταλλάξεις αυτών έχουν συνδεθεί με την συγγενή δυσκεράτωση μία ασθένεια στην οποία παρατηρούνται επίσης ελαττωματικά τελομερή (115,158). Πράγματι πρόσφατη μελέτη συνδέει άμεσα μεταλλάξεις της PARN με την συγγενή δυσκεράτωση παρόλο που οι ερευνητές δεν συνδέον την PARN με τα τελομερή μέσω των H/ACA snornas και των GAR1, NHP2 και NOP10 πρωτεϊνών (159). Μεταλλάξεις σε ένα αλληλόμορφο έχουν βρεθεί να ευθύνονται για ορισμένες περιπτώσεις αναπτυξιακών και μαθησιακών διαταραχών ενώ σε μία περίπτωση όπου και τα δύο αλληλόμορφα είχαν διαφορετικού είδους μεταλλάξεις ο ασθενής έπασχε από και από σοβαρή ανεπάρκεια του μυελού των οστών και κεντρική υπομυελίνωση (160). 9. Ο ρόλος της αποαδενυλίωσης στη διαφοροποίηση Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης παίζει καθοριστικό ρόλο στους πολυκύτταρους οργανισμούς, όπου μόλις ένα κύτταρο χάρη στην αλλαγή των προτύπων έκφρασης των θυγατρικών κυττάρων διαφοροποιείται σε μία πληθώρα διαφορετικών κυττάρων με διαφορετικά λειτουργικά χαρακτηριστικά. Στον άνθρωπο αυτή η αλλαγή καθορίζει τη διαφοροποίηση και πορεία από ένα γονιμοποιημένο ωάριο προς 282 διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Αυτά τα πολύ διαφορετικά κύτταρα στη συνέχεια για να επιτελέσουν τις συγκεκριμένες λειτουργίες που τα χαρακτηρίζουν έχουν τη δυνατότατα να αλλάζουν την έκφραση συγκεκριμένων πλέον γονιδίων σε απόκριση σε συγκεκριμένα ερεθίσματα και θρεπτικά συστατικά. Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης μέσω του ελέγχου της poly(α) ουράς έδωσε τη δυνατότητα εξέλιξης όλων αυτών των μηχανισμών που διακρίνουν τους πολυκύτταρους οργανισμούς από τους μονοκύτταρους και αποτελεί σημαντικό μέσο δυναμικών αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Η 62

Εισαγωγή PARN παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση του μήκους των poly(α) ουρών στην ανάπτυξη του ωοκυττάρου (83). Σε πρώιμα ωοκύτταρα η PARN διασπά τις poly(α) ουρές έτσι ώστε τα mrna να παραμένουν μεταφραστικά ανενεργά. Καθώς τα ωοκύτταρα ωριμάζουν, η PARN αποδεσμεύεται από αυτά με αποτέλεσμα να πολυαδενυλιώνονται και να μεταφράζονται (161). Όπως αναφέρθηκε προηγούμενος το σύμπλοκο CCR4 NOT έχει διαφορετική βιολογική λειτουργία ανάλογα με τις πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρά. Τρείς πρωτεΐνες που προσδένονται στο RNA έχουν αναφερθεί ότι αλληλεπιδρούν με το σύμπλοκο CCR4 NOT και καθορίζουν την δράση του σε συγκεκριμένα mrna στα γαμετικά και εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Έχει δειχθεί ότι οι πρωτεΐνες Nanos και Pumilio εμπλέκονται στη αποσιώπηση του mrna της κυκλίνης β από το σύμπλοκο CCR4 NOT σε πρωταρχικά γαμετικά κύτταρα τα οποία δίνουν γένεση στα εμβρυϊκά βλαστικά (144). Αυτό απαιτείται για να περιορίζει τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων προτού εισέλθουν στις γονάδες. Η Pumilio αναγνωρίζει ειδικά μοτίβα στην 3 αμετάφραστη περιοχή του mrna της κυκλίνης και προσελκύει το σύμπλοκο CCR4 NOT αλληλεπιδρώντας με την POP2. Αυτή η αλληλεπίδραση είναι διατηρημένη από το ζυμομύκητα μέχρι τον άνθρωπο. Η ρύθμιση του mrna της κυκλίνης β χρειάζεται και την παρουσία της Nanos. Η πρωτεΐνη αυτή αλληλεπιδρά με την NOT4 γεγονός που υποδηλώνει επίσης ότι η NOT4 είναι μέλος του συμπλόκου CCR4 NOT. Σε γαμετικά κύτταρα το σύμπλοκο CCR4 NOT σε συνδυασμό με τις Nanos και Pumilio πρωτεΐνες παίζουν ρόλο στην διατήρηση της γαμετικής σειράς πιθανόν καταστέλλοντας mrnas που σχετίζονται με την διαφοροποίηση. Ένα από αυτά τα mrnas, το mei-p26, κωδικοποιεί την πρωτεΐνη της Trim-NHL, που παίζει σημαντικό ρόλο στην βιολογία των βλαστικών κυττάρων ρυθμίζοντας την αποσιώπηση μέσω mirnas. Το σύμπλοκο CCR4 NOT προσελκύεται στο mrna μέσω αλληλεπίδρασης της Pumilio στην 3 UTR (Εικόνα 36) και η καταστολή του mei-p26 mrna από το CCR4 NOT παίζει καθοριστικό ρόλο στην διατήρηση της γαμετικής σειράς αφού απώλεια των γαμετικών κυττάρων σε διπλά μεταλλάγματα της CCR4 αποκαθίσταται όταν αποσιωπάται στην συνέχεια το mei-p26. 63

Εισαγωγή Εικόνα 36 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ του CCR4 NOT συμπλόκου και άλλων πρωτεϊνών στα γαμετικά (A) και πρώιμα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (B) Η φωσφορυλίωση της RNA προσδενόμενης πρωτεΐνης KSRP από το μονοπάτι p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) αναστέλλει την πρόσδεση της στο RNA και εμποδίζει τη ρύθμιση της αποαδενυλίωσης του mrna στόχου κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης κυττάρων ποντικού σε μυοκύτταρα (131). Παρομοίως η πρωτεΐνη της D. melanogaster OSKAR έχει προταθεί ότι αναστέλλει την πρόσδεση του καταστολέα της μετάφρασης SMAUG στο mrna στόχο μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, που οδηγεί στην ενεργοποίηση του mrna του nanos γονιδίου κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης (162). Όπως είδη έχει αναφερθεί αποαδενυλίωση από το CCR4-NOT σύμπλοκο δεν είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα στην Drosophila (163) αλλά είναι απαραίτητη για την ωογένεση και την πρώιμη ανάπτυξη του εμβρύου (85). Αυτό υποδεικνύει ότι σε σωματικά κύτταρα οι αποαδενυλάσες έχουν πιο γενικό και αλληλεπικαλυπτόμενο ρόλο όπως έχει αποδειχθεί για τον ζυμομύκητα (80), αλλά παίζουν πιο ειδικό και καθοριστικό ρόλο κατά την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και γαμετογένεση όπου απαιτούνται συγκεκριμένες αυστηρά καθορισμένες αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης. 64

ΣΚΟΠΟΣ

Σκοπός Το ευκαρυωτικό mrna ως ο κύριος διαμεσολαβητής στην ροή της γενετικής πληροφορίας αποτελεί και τον κύριο στόχο των μηχανισμών ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Η εξέλιξη των ευκαρυωτικών οργανισμών οδήγησε στην ανάπτυξη συστημάτων ελέγχου ανεξάρτητων από την διαδικασία της μεταγραφής δεδομένου το ότι το mrna θα πρέπει να μεταφερθεί εκτός του πυρήνα για μετάφραση και παραγωγή των σωστών πρωτεϊνών. Η poly(α) ουρά είναι αντιπροσωπεύει μια σημαντική μετα-μεταγραφική τροποποίηση που πρόσθεσε σημαντικά πλεονεκτήματα στον κύκλο ζωής του mrna. Έτσι είναι απαραίτητη για να σταθεροποιεί το μόριο mrna, εμπλέκεται στην μεταφορά του από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα και παρέχει δυναμικές και ευέλικτες δυνατότητες έλεγχου από μία πληθώρα μηχανισμών που καθορίζουν την μοίρα του κυττάρου. Η αποαδενυλίωση είναι μία διαδικασία που έδωσε την δυνατότητα ρύθμισης των mrna σε όλα τα στάδια, από την επιτήρηση της βιογένεσης τους μέχρι τη ρύθμιση της ποσότητας τους και της δράσης τους. Την αντίδραση αποαδενυλίωσης καταλύουν ένζυμα που ονομάζονται αποαδενυλάσες που υδρολύουν την poly(a) ουρά με κατεύθυνση 3-5. Η ρύθμιση της μετάφρασης και της αποικοδόμησης της του mrna μέσω αποαδενυλίωσης θεωρείται πλέον σημαντικό σημείο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Την υπόθεση αυτή ενισχύει το γεγονός ότι υπάρχουν μία πληθώρα αποαδενυλασών που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του mrna ενώ ουσιαστικά πρόκειται για ένα είδος αντίδρασης. Για να κατανοηθούν με λεπτομέρεια όλοι αυτοί η μηχανισμοί που επιδρούν στην ροή της γενετικής πληροφορίας μέσω της poly(a) ουράς θα πρέπει να ταυτοποιηθούν να χαρακτηριστούν όλες οι αποαδενυλάσες ξεχωριστά. Η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης, ο τρόπος με τον οποίο οι διάφορες αποαδενυλάσες βρίσκουν τον στόχο τους και ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζονται θα είναι το πρώτο βήμα για να αποσαφηνιστεί ο τρόπος ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης μέσω αποαδενυλίωσης. Είναι πλέον γνωστό ότι η αποαδενυλίωση εμπλέκεται σε όλες της βιολογικές διεργασίες αλλά δεν έχει όμως εξακριβωθεί ο συγκεκριμένος ρόλος της κάθε αποαδενυλάσης ξεχωριστά ενώ θα πρέπει να ταυτοποιηθούν επίσης οι αλληλεπιδρασεις και τα σύμπλοκα στα οποία συμμετέχουν. Οι μελέτες επί όλων αυτών των μηχανισμών που επιδρούν στην γονιδιακή έκφραση μέσω αποαδενυλίωσης προσθέτουν ολοένα και περισσότερη σημαντική βασική πληροφορία, ενώ μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση φαρμακευτικών στόχων που να συνδέονται με συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους ή με μία συγκεκριμένη κυτταρική λειτουργία αντίθετα από κλασσικούς στόχους που μπορεί να εμπλέκονται στην βιωσιμότητα ή τη φυσιολογία όλων των κυττάρων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή γίνεται μελέτη επί του γονιδίου PNLDC1 το οποίο είναι παράλογο του γονιδίου που κωδικοποιεί την ανθρώπινη PARN, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 και πιθανόν παράγει δύο μετάγραφα μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Σκοπός της διατριβής είναι η κλωνοποίηση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των ισομορφών και ο έλεγχος της δραστικότητας του ενζύμου που κωδικοποιεί επί poly(a) υποστρωμάτων. Επόμενος στόχος είναι η μελέτη με συνεστιακή μικροσκοπία ο εντοπισμός και των δύο 66

Σκοπός ισομορφών αλλά και ο έλεγχος των επιπέδων έκφρασης τόσο σε ιστούς όσο και σε κυτταρικές σειρές του ανθρώπου και του ποντικού. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε την παρατήρηση μέσω βιοπληροφορικής αναλυσης ότι πιθανή μεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου ελέγχει την έκφραση και των δύο ισομορφών θα γίνουν μελέτες με χορήγηση του απομεθυλιωτικού παράγοντα 5-Aza-Deoxycytidine, και έλεγχος με qrt-pcr για να διερευνηθεί εάν παρουσιάζει ιστοειδική έκφραση, ενώ παράλληλα θα γίνει έλεγχος σε διάφορες καρκινικές σειρές για να βρεθεί τυχόν συσχέτιση με συγκεκριμένο τύπο καρκίνου. Με ανοσοιστοχημικές μεθόδους θα μελετηθεί ο εντοπισμός του ενζύμου σε τομείς ιστών ποντικού που θα εντοπιστεί έκφραση. Τέλος, πιθανή ειδική έκφραση του γονιδίου σε γαμετικά και σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα θα εκτιμηθεί με αποσιώπηση του γονιδίου και με έλεγχο της έκφρασης του σε σχέση με σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση. Από την μελέτη του γονιδίου αυτού αναμένεται να προκύψει μια νέα χαρακτηρισμένη αποαδενυλάση, η οποία έχει εξειδικευμένη δραστικότητα, έκφραση και εντοπισμό, γεγονός που θα προσδώσει ακόμα μεγαλύτερη βαρύτητα στη διαδικασία της αποαδενυλίωσης σε μεταβολές που σχετίζονται με την διαφοροποίηση και ανάπτυξη. 67

ΥΛΙΚΑ

Υλικά 1. Χημικά-Kit 2-mercaptoethanol Serva 28625 Acetic acid MERK 1.000.632.511 Acid Phenol Ambion 1210005 Acrylamide Sigma A8887 Acrylamide 2X Serva S10675 Agarose Biorad 161-3102 Amino Allyl MessageAmp arna Kit Ambion AM1753 Ammonium persulfate Serva S13375 Ampicillin sodium salt Applichem AO839.0010 Bioquant protein Merck HC309760 Boric acid Merck 1. 00165. 1000 Chemiluminescent HRP substrate kit GenScript L00221V60 Chloroform Merck 1,02445,1000 Citric acid monohydrate Merck 1002440500 Coomassie G250 Fluka 27815 Coomassie R250 Panreac 254932 CyDye Post labeling Reaction Dye Amersham RPN5661 DAB Substrate kit Thermo 34002 DE52 Whatman 4057050 DEPC Research Organics 2106D Dialysis Tubing Sigma D-9777 Dimethyl sulfoxide Sigma D4540-100ML DMEM Biosera 9574 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma RNBC8301 EDTA Serva S-11280 Ethanol Abs Merck 1,00983,2511 FBS Biosera S1810/50 Fragmentation Reagents Ambion AM8740 GelRed Nucleic Acid Stain Biotium 41003 Glycerol Duchefa G1345. 100 Glycine Merck 1. 04201. 0250 H 2 O 2 MERK 107211000 HEPES Sigma H-3375 Hydrochloric acid Merck 1003171000 Imidazole Alfa A10221 Immobilon PVDF membrane Merk-Millipore IPVH 00010 Ion torrent Magnetic bead clean up Ambion 1304013 Ion total RNA Seq-Kit V2 Ion Torrent 4475936 70

Υλικά Ion total RNA-Seq Primer Set V2 Ion Torrent 1306011 Ion Xpress Tm RNA-seq Ion Torrent 01-16 kit IPTG Duchefa 925901 Kanamycin sulfate Serva 90352 KAPA 2G Fast PCR kit KAPA KK5021 KAPA HiFi PCR Kit with DNTP's KAPA 53326 KAPA SYBR Fast qpcr KIT KAPA KK4602 Lipofectamine LTX and Plus Reagent Invitrogen 1215383 Liquified phenol Sigma 34004245 Lysozyme Fluka 62971 Magnesium chloride hexahydrate Merck 1. 05833. 1000 Methanol p.a. Panreac 1.310.911.214 Methylene-bisacrylamide Serva 29195 Mirvana mirna isolation kit Ambion 1210069 Na 2 HPO 4. 2H 2 O Merck 6580 NEA Biochrom 1206A Ni-NTA Agarose Macherey-Nagel 745400.25 N-N methylane bis-acrylamide Serva 13225 Nucleobond Xtra Midi (10 preps) Macherey-Nagel 740 410.10 Nucleospin Extract II Macherey-Nagel 740609.50 Nucleospin Gel & PCR Clean-up Macherey-Nagel 740 609.50 Nucleospin plasmid Macherey-Nagel 740588.50 OneArray Phalanx HOA 0050001 OPTIMEM GIBCO 51985 PBS (Phosphate Buffer) Takara T900 PCR Cloning Kit Strataclone psca Agilent 6125125 Peptone Merck 110.859 Peptone Enzymatic Digest Sigma 82962 Phenol equilibrated, stabilized Applichem A0889.0100 Polyethylene glycol 40000 Serva 33139 Potassium chloride Merck 1. 04936. 1000 Potassium dihydrogen phosphate Merck 1. 04873. 1000 dipotassium hydr. Phosph. anhydrate Panreac 191754 Potassium hydroxide pellets Merck 1. 05033. 1000 Precipitation Inactiv. Buffer RNASES Ambion 1010021 Prestain protein markers NEB P7710S Prime script Reagent kit Takara AK4501 Propanol-2 SDS 09 50522 Protein Ladder NEB P7703S 71

Υλικά Pure Link RNA mini kit Ambion 12183018A RETROscript Ambion AM1710-1104049 Ribo Minus Core Module V2 Ambion 1431057 RiboMinus Mag. bead cleanup Module Ambion 1309007 RNALater Ambion AM7020 RNAqueous - 4PCR Ambion 1914-1104057 Rnase free Dnase set Ambion 142334056 SDS Serva 20771.02 Sodium acetate trihydrate Merck 106265 Sodium Chloride Sigma 31434 Sodium hydrogen carbonate JT baker 1780 Sodium hydroxide Merck 1. 06498. 1000 SSPE Buffer 20X GIBCO 15591-043 TEMED Research Organics T9281 Tris ultrapure Applichem A1086.1000 Triton-X-100 Merck 1086431000 Trizol reagent Ambion 13150102 Tween-20 Panreac 2.123.121.611 Xylene cyanol Merck 9710-25GM Yeast extract Sigma 70161 Urea Sigma U5378 2. Ένζυμα-πρωτεΐνες 0,1% BSA TAKARA A1301A ACCIII TAKARA 1113A ACCIII Buffer TAKARA KA201A BamHI TAKARA 1010A BamHI Fermentas 6211 DNaseI NEB M0303S EcoRI TAKARA 10405 EcoRI Fermentas 2911 HindIII NEB R0104S Kapa 2G Fast PCR Kit Kapa Biosystems KK5021 Kapa HiFi Kapa Biosystems KE2006 Kapa SYBR Fast QPCR Master Mix (2X) Kapa Biosystems KM4108 KpnI NEB R0142S NCOI NEB R0193S NdeI NEB R0111S NheI NEB R0131S 72

Υλικά NotI TAKARA KA9452A PNK Fermentas 53476 Protein Ladder (10-250 kda) NEB P7703S Purified BSA 100X NEB B9001S Recimbinant Rnase Inhibitor TAKARA 2313A SalI NEB R0138S T4 DNA ligase NEB M0202S XbaI TAKARA K3301B XhoI TAKARA 1094A 3. Βακτηριακά στελέχη DH5α [γονότυπος: F-φ80lacΖ Μ15 (lacζυα-argf) U169 deor reca1 enda1 hsdr17(rk-, mk+) phoa supe44 thi-1 gyra96 rela1 λ-] BL21 (DE3) Rosetta [γονότυπος: E. coli F- ompt hsdsb(rb-, mb-) gal dcm prare2 (Camr) StratacloneTM Solopack Competent Cells : Tα συγκεκριμένα κύτταρα παρέχονται από το Strataclone PCR Cloning Kit της Stratagene και διαθέτουν την ικανότητα έκφρασης της ρεκομπινάσης Cre, η οποία απαιτείται για την κυκλοποίηση των γραμμικών μορίων DNA που παράγονται από την τοποϊσομεράση Ι. Επίσης, τα κύτταρα αυτά υποστηρίζουν την επιλογή βάσει των μπλε και άσπρων αποικιών (blue/white screening) όταν μετασχηματισθούν με το πλασμίδιο psc-a, το οποίο παρέχεται από το ίδιο kit και εξασφαλίζουν μετασχηματισμό υψηλής απόδοσης. 4. Αντισώματα Rabit anti PNLDC1 ACRIS AP53365PU-N Goat anti PNLDC1 SC Biotech sc-243835 5. Πλασμιδιακοί φορείς psc-a: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 3.5 kb που χρησιμοποιείται για τη κλωνοποίηση γονιδίων. H διαδικασία της κλωνοποίησης με το συγκεκριμένο φορέα εκμεταλλεύεται τις συνδυασμένες δράσεις της τοποϊσομεράσης Ι από το ιό Vaccinia και της ρεκομπινάσης Cre από τον βακτηριοφάγο P1. In vivo, η τοποϊσομεράση Ι συμμετέχει στην αντιγραφή του DNA χαλαρώνοντας και επανασυνδέοντας τις έλικες του DNA. Ειδικότερα, η τοποϊσομεράση Ι κόβει τη φωσφοδιεστερική ραχοκοκαλιά μιας αλυσίδας DNA ακριβώς μετά την αλληλουχία 5-CCCTT δημιουργώντας μια ενδιάμεση ένωση DNA-ενζύμου, η οποία συντηρεί την ενέργεια δεσμού που πρόκειται να χρειαστεί για την επανελίκωση του κομμένου DNA πίσω στη σωστή έλικα. Από τη στιγμή που δημιουργηθεί το ενδιάμεσο αυτό, η αντίδραση επανελίκωσης μπορεί επίσης να συμβεί με ένα ετερόλογο τμήμα DNA. Η Cre καταλύει τον ανασυνδιασμό μεταξύ δύο loxp αλληλουχιών αναγνώρισης. 73

Υλικά Το μείγμα φορέων που παρέχεται με το PCR cloning kit της Stratagene περιέχει βραχίονες DNA δύο ειδών, καθένας από τους οποίους στο ένα άκρο του φέρει μια τοποϊσομεράση Ι και στο άλλο μια περιοχή αναγνώρισης loxp. Τα φορτισμένα με την τοποϊσομεράση άκρα διαθέτουν μια προεξοχή τροποποιημένης ουριδίνης (U*). Με αυτόν τον τρόπο τα ενισχυμένα με Taq πολυμεράση προϊόντα της PCR, τα οποία φέρουν 3-Α προεξοχές μπορούν να ενωθούν αποτελεσματικά με τους παραπάνω βραχίονες μέσω του σχηματισμού δεσμών Α-U*, ακολουθούμενου από την σύνδεση των αλυσίδων DNA με τη βοήθεια της τοποϊσομεράσης Ι. Εικόνα 37 Χάρτης του πλασμιδίου psc-a που χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση PCR προϊόντων Το γραμμικό μόριο DNA που προκύπτει στη συνέχεια, μετασχηματίζει επιδεκτικά κύτταρα που έχουν την ικανότητα σύνθεσης της ρεκομπινάσης Cre, η οποία με τη σειρά της ανασυνδιάζει τις περιοχές loxp στα άκρα του γραμμικού μορίου. Έτσι, σχηματίζεται ο κυκλικός φορέας psc-a που έχει την ικανότητα ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο παρουσία αμπικιλλίνης και περιέχει το οπερόνιο της λακτόζης (lacz). Το συγκεκριμένο οπερόνιο παίζει ρόλο στον έλεγχο της επιτυχίας της κλωνοποίησης με βάση την εμφάνιση μπλε ή άσπρου χρώματος των αποικιών (blue/white screening). Ο φορέας έχει επεξεργαστεί κατάλληλα έτσι ώστε να είναι κομμένος εντός του γονιδίου της β-γαλακτοσιδάσης. Oι αποικίες που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο ή το πλασμίδιο δεν έχει ενσωματώσει το επιθυμητό γονίδιο, παρουσιάζουν μπλε χρώμα, καθώς ο φορέας επανακυκλοποιείται, 74

Υλικά εκφράζεται το lacz και επομένως διασπάται η λακτόζη. Ο μηχανισμός αυτός, λοιπόν, είναι ιδιαίτερα χρήσιμος για την κλωνοποίηση γονιδίων σε βακτηριακούς φορείς και μάλιστα σε συνδυασμό με την ανάπτυξη των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με το κατάλληλο αντιβιοτικό, καθιστά αρκετά αξιόπιστη και ακριβή την διαδικασία επιλογής των αποικιών που έχουν προσλάβει τον φορέα με το επιθυμητό ένθετο. Πλασμιδιακοί φορείς pet-28b(+), pet-33b(+) (NOVAGEN) Πρόκειται για πλασμιδιακούς φορείς μεγέθους που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων μέσω της Τ7 RNA πολυμεράσης σε βακτηριακό σύστημα. Μετά τον προαγωγέα της Τ7 RNA πολυμεράσης υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυμα περιορισμού. Εικόνα 38 Τα κυριότερα στοιχεία και ο χάρτης του πλασμιδιακού φορέα pet28. Ο φορέας pet33 προέρχεται από τον ίδιο φορέα περιέχοντας μία αλληλουχία 15bp που κωδικοποιούν το πεπτίδιο που αναγνωρίζεται και φωσφορυλιώνεται από την πρωτεϊνική κινάση Α (protein kinase A, PKA) Με τη χρήση των κατάλληλων ενζύμων είναι δυνατή η εισαγωγή του επιθυμητού γονιδίου, όπως είναι στη συγκεκριμένη περίπτωση το γονίδιο pnldc1 στο εσωτερικό του polylinker και στη συνέχεια, η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου αυτού μετά από την πρόσδεση της Τ7 RNA πολυμεράσης στον προαγωγέα της. Προστίθενται έξι τριάδες νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν έξι ιστιδίνες στην αρχή ή στο τέλος της αμινοξικής αλληλουχίας. pet-28pnldc1_1 Το πλασμίδιο αυτό κατασκευάστηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής το Πανεπιστημίου Πατρών σε προηγούμενη ερευνητική Εργασία (βλέπε μεταπτυχιακή εργασία Δημήτριος Αναστασάκης 2011). Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη φέρει τόσο στο αμινοτελικό τόσο στο καρβοξυτελικό άκρο ιστιδινικές ουρές. 75

Υλικά pet-33parn74 Το πλασμίδιο αυτό φέρει το γονίδιο που κωδικοποιεί την ανθρώπινη PARN με την ιστιδινική ουρά στο αμινοτελικό άκρο pcdna 3.1+ (Invitrogen) Ευκαρυωτικός φορέας έκφρασης 5.4 kb σχεδιασμένος για υψηλή έκφραση ένθετου γονιδίου σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Περιέχει τα εξής απαραίτητα στοιχεία. CMV προαγωγέα (προαγωγέας του ανθρώπινου κυτταρομεγαλοϊού) για υψηλή έκφραση στις περισσότερες ευκαρυωτικές κυτταρικές σειρές, περιοχή εισαγωγής του επιθυμητού γονιδίου, γονίδιου ανθεκτικότητας στην νεομυκίνη για επιλογή σε ευκαρυωτικά κύτταρα και γονίδιο αντίστασης σε αμπικιλλίνη. Εικόνα 39 Χάρτης πλασμιδίου pcdna3.1 pcdna 3.1(+)EGFP για την επισήμανση πρωτεϊνών με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη έχει εισαχθεί στον φορέα pcdna 3.1 το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου EGFP μεταξύ των θέσεων BamHI και XhoI.Η EGFP είναι μία μεταλλαγμένη μορφή της GFP με καλύτερες ιδιότητες φθορισμού. pmturquoise2-er: Το πλασμίδιο αυτό φέρει μία μεταλλαγμένη μορφή της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης με διαφορετικό μήκος κύματος απορρόφησης και εκπομπής του φωτός ενώ χάρη σε ένα επιπρόσθετο πεπτιδικό σήμα αγκυροβολείται στο ενδοπλασματικό δίκτυο επιτρέποντας της ανίχνευση του σε ζωντανά κύτταρα. 76

Υλικά Εικόνα 40 Χάρτης πλασμιδίου pmturquoise2-er 6. Εκκινητές (primers) Όνομα εκκινητή PNLDC1_1F NdeI PNLDC1_2F NdeI PNLDC1R BamHI PNLDC1_1F NheI PNLDC1_2F NheI mpnldc1_1f NdeI mpnldc1_1r XhoI mpnldc1_1f NheI mpnldc1_1r HindIII mpl1f mpl1r mpl2f mpl2r mparnf mparnr mtubb5f mtubb5r mb2mf Αλληλουχία 5-3 GGCTAGCATGTTCTGCACCCGAGGACT GGCTAGCATGGACGTGGGCGCCGACG GGATCCTCAGGTACCAGATCTTCCAAGG GGCTAGCATGTTCTGCACCCGAGGACT GGCTAGCATGGACGTGGGCGCCGACG GCATATGGACGTGGGCGCGGACGA CTCGAGTCAGGGCATGGGTCTTCCCAGGAG ACCCAAGCTGGCTAGCATGGACGTGGGCGCGGACGAA GCTCGGTACCAAGCTTGGGCATGGGTCTTCCCAGGAG GGGCGCGGACGAATTTGAGC CTGCACACTAGATGCCTGGAAAGA GGTGAGCCAGCCACAACGCT TGGAGACCCGTGGGAAACGC AGCGCCTTCGGTAACATTCA AACTCCCCCAGGCCATATCT TTAGAACCTTCCTGCGGTCG CCTCCCAGAACTTAGCACCG GACCGGCCTGTATGCTATCC 77

Υλικά mb2mr PNLDC1F PNLDC1R PARNF PARNR mbmp2f mbmp2r mshhf Mshhr Mnanogf mnanogr mdnmt3b mfoxa2 mfoxa2 Mnestinf mnestinr moct4f moct4r msox2f msox2f mklff mklfr mmycf mmycr mlin28f mlin28r mpax6f mpax6r TCAGTCTCAGTGGGGGTGAA TATCCCAGTATCCGACCTCCC TGTTCCGCGCATCCTTAAAC GCGCTGTGTTCACTTTCCAG GCGTTTGTCGTTGCTGTGAT TCTCTGACCTGTCAGCTTGC GCTCTCACGGGTTAGGTTTT AGACTGTTAACGCACACATATACA AAACTACAGGCTCCATCCTCG TGCTTGCTTGTCCTTGGAGT CAGCTGGCATCGGTTCATCA CCAGAAAGGTAAACTCTGGGCA GACCAGGAGAAAGGAGAAAAACAC GCCAGAACACACATTTATAAGCC ATGCCCAGAGGAGCAGCAAT ACAGCTTTATTCAAGGGAGGAAGA CTTTCCCTCTGTTCCCGTCA CTCTTGTCTACCTCCCTTGCC TGGTTACCTCTTCCTCCCACT GGGGCAGTGTGCCGTTAAT TCCCAAGTATGCCTTTAAGCAG AGTATGCAAAATACAAACTCCACA TGACAGAACTGATGCGCTGGAA AAAGCCCCAGCCAAGGTTGT TGCCTGGGGTGTTTTATTTCCT AGTACCAACTCTGGAGTACCA TCACAGTCCAATCATTTTGTGC TGTGAACAACTGCAAAACACT 7. Oλιγονουκλεοτιδια Για την αποσιώπηση της PNLDC1 σε εμβρυικά κύτταρα ποντικού χρησιμοποιήθηκε esirna (EMU079411 Sigma). Tα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν στις in vitro αντιδράσεις συντέθηκαν από την εταιρία vbc-biotech: N9A15 GUCCGCCCCAAAAAAAAAAAAAAA A12 AAAAAAAAAAAA RNA C12 CCCCCCCCCCCC U12 UUUUUUUUUUUUU G12 GGGGGGGGGGGG DNA da12 ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 78

ΜΕΘΟΔΟΙ

Μέθοδοι 1. Ιn silico ανάλυση του γονιδίου PNLDC1 1.1 Ομοπαράθεση και φυλογενετική ανάλυση Το γονίδιο PNLDC1 απαντάται στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Πραγματοποιήθηκε ομοπαράθεση των αμινοξικών αλληλουχιών της πρωτεΐνης αυτών χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων Uniprot (http://www.uniprot.org) και τον αλγόριθμο CLUSTALW. Από αυτή τη στοίχιση μπορούν να προβλεφθούν οι μεταλλάξεις (ενθέσεις/απαλοιφές και αντικαταστάσεις) που εμφανίστηκαν κατά την εξέλιξη. Μπορεί, επίσης, να προσδιοριστούν τα αμινοξικά κατάλοιπα που είναι απαραίτητα για τη λειτουργία μιας πρωτεΐνης. Με τη βοήθεια των παραπάνω, κατασκευάστηκε και το φυλογενετικό δέντρο στο οποίο φαίνονται οι γενετικές αποστάσεις των οργανισμών αυτών. Στα φυλογενετικά δέντρα, ο βαθμός της εξελικτικής σχέσης μεταξύ των χρησιμοποιούμενων μονάδων εκφράζεται ως συνάρτηση της θέσης κάθε μονάδας ενδιαφέροντος (π.χ. είδος, πληθυσμός, γονίδιο) ως προς την άλλη. Οι μονάδες που είναι περισσότερο συγγενικές μεταξύ τους τοποθετούνται πιο κοντά, ενώ οι μονάδες που είναι λιγότερο συγγενικές μεταξύ τους τοποθετούνται σε διαφορετικούς κλάδους του δέντρου. Επίσης, πραγματοποιήσαμε πολλαπλή στοίχιση της αμινοξικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης hpnldc1 τόσο με την mpnldc1 όσο και με την PARN με σκοπό να διαπιστωθεί η ομολογία των πρωτεϊνών αυτών. 1.2 Προσομοίωση μοριακής δυναμικής (Molecular Dynamics Simulation) H μοντελοποίηση ομολογίας της πρωτεΐνης ανθρώπινης PNLDC1 βασίστηκε στην ομοπαράθεση αλληλουχίας με την PARN του ανθρώπου και του ποντικού η οποία πραγματοποιήθηκε με Clustal W. Ο σχεδιασμός της πιθανής δομής της περιοχής νουκλεάσης της hpnldc1 η οποία σχηματίζεται από τα κατάλοιπα (Met)1 131(Arg) και (Leu)232 403(Ala) βασίστηκε στην κρυσταλλική δομή της hparn (PDB IDs: 2A1S και 2A1R), παρουσιάζοντας 30% ομολογία (90/303 κατάλοιπα). Τα αντίστοιχα κατάλοιπα (Leu)12 143(Arg) και (Leu)264 427(Val) της hparn εξήχθησαν από τα αρχεία PDB υπερθέτοντας κάθε διμερές ξεχωριστά. Το μοριακό μοντέλο της hpnldc1 με τη χαμηλότερη ενέργεια επιλέχτηκε ανάμεσα σε 50 δομές, όπως υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα Modeller (v9.10) (164). Στη συνέχεια έγινε διαδοχική υπέρθεση του μοντέλου με κάθε υπομονάδα της καταλυτικής περιοχής του διμερούς hparn-rna συμπλόκου (από την κρυσταλλική δομή με PDB ID:2A1R). Με αυτόν τον τρόπο εξήχθη το μοντέλο του διμερούς της hpnldc1, στο οποίο προστέθηκαν τα συν-κρυσταλλωμένα κατάλοιπα του πολυ-νουκλεοτιδίου αδενοσίνης (Α8-10) που προσδιορίστηκαν στη δομή της hparn. Για να βελτιστοποιηθεί η δομή του μοντέλου του διμερούς hpnldc1-rna συμπλόκου πραγματοποιήθηκε ελαχιστοποίηση ενέργειας με το πρόγραμμα AMBER (v12) (165). Αυτό έγινε σε 3 στάδια: α) αρχικά αφήνοντας μόνο τα άτομα υδρογόνου ελεύθερα, β) απελευθερώνοντας στη συνέχεια τις πλευρικές ομάδες του ενζύμου και του νουκλεοτιδίου, και γ) τέλος επιτρέποντας σε όλα τα άτομα του συστήματος να κινηθούν. Σε κάθε στάδιο 80

Μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν 5.000 βήματα σε κενό με μεταβαλλόμενη διηλεκτρική σταθερά ως προς την απόσταση. Η πρωτονίωση πλευρικών ομάδων βασίστηκε στον υπολογισμό pka στον H++ server και μετά από οπτική επιτήρηση των καταλοίπων που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. 2. Ανοσοϊστοχημεία Ανοσοφθορισμός 2.1 Ανοσοϊστοχημεία Προκειμένου να ταυτοποιήσουμε τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν την PNLDC1 σε ιστούς πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοϊστοχημείας. Με την μονιμοποίηση οι ιστοί διατηρούνται σε παρόμοια κατάσταση με εκείνη που βρίσκονται μέσα στον ζωντανό οργανισμό. Η μονιμοποίηση επιτυγχάνεται με την εμβάπτιση των τμημάτων ιστού σε φορμαλδεϋδη, η οποία είναι καλά ανεκτή από τους ιστούς και έχει μεγάλη διεισδυτικότητα. Οι προς μελέτη ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεϋδης 4% για 24 ώρες. Ακολουθεί εμπέδωση των ιστών σε κύβους και με τη χρήση μικροτόμου, λήφθηκαν τομές πάχους 4μm, οι οποίες τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες (Menzel-Gleaser, Freiburg, Germany), οι οποίες έχουν στην επιφάνεια θετικά φορτισμένες ενώσεις που βοηθούν την προσκόλληση των τομών. 1. Αποπαραφίνωση των ιστικών τομών σε κλίβανο 60 ο C για 30min. 2. Εμβάπτιση των τομών διαδοχικά τρείς ξυλόλες 56 ο C, 5min στην καθεμία 3. Εμβάπτιση των τομών σε ξυλόλη σε θερμοκρασία δωματίου για 2min. 4. Εμβάπτιση των τομών σε ισομοριακό μίγμα ξυλόλης/αλκοόλης για 2min. 5. Ενυδάτωση των τομών σε σειρά διαλυμάτων αλκοόλης (100%v/v, 96%v/v, 80%v/v) 1min. 6. Ξέπλυμα με dh 2 O και τοποθέτηση των τομών στο buffer (TBS) για 5 min. 7. Ανάκτηση αντιγονικών επιτόπων σε διάλυμα κιτρικού οξέος και χρήση του φούρνου μικροκυμάτων στα 800W για 2 min και στη συνέχεια στα 300W για 7 min. Στη συνέχεια οι τομές αφήνονται να κρυώσουν για 30 min. και ακολούθως τοποθετούνται σε TBS. 8. Οι τομές τοποθετούνται σε διάλυμα H 2 O 2 3% για 20min σε σκοτεινό θάλαμο. Στη συνέχεια ξεπλένονται με αποσταγμένο νερό και τοποθετούνται στο buffer. 9. Blocking μη ειδικών αντιγονικών επιτόπων. Τοποθέτηση διαλύματος BSA 2% (100λ για κάθε τομή) για 12 min. Ξέπλυμα και τοποθέτηση των τομών σε TBS. 10. Τοποθέτηση του πρωτογενούς αντισώματος. 11. Ξέπλυμα με buffer και τοποθέτηση του δεύτερου αντισώματος. 12. Τοποθέτηση διαλύματος DAB 2% σε κάθε τομή για 5-7 min. Ξέπλυμα με buffer. 13. Αιματοξυλίνη χρώση για 2 min. 14. Αφυδάτωση. Εμβαπτίσεις (περίπου 20) των τομών διαδοχικά σε αλκοόλη 80%, αλκοόλη 90%, αλκοόλη 100%. 15. Εμβάπτιση των τομών σε ξυλόλες, 3 φορές από 5 min στην κάθε μία, και στη συνέχεια κόλλημα των καλυπτρίδων με Moviol. 81

Μέθοδοι Διαλύματα: Tris-buffered saline (TBS) (1X): 50 mm Tris-Cl, ph 7.5, 150 mm NaCl (6.05 g Tris, 8.76 g NaCl σε 800 ml H 2 O. ρύθμιση του ph στις 7.5 μονάδες με 1 M HCl και στην συνεχεία προσθήκη dh2o μέχρι του 1 L. Κιτρικό Νάτριο: 1000mL H2O +2.1gr κιτρικό, ph 6 BSA 2%: Bόϊα Αλβουμίνη διαλυμένη σε TBS H 2 O 2 30% 2.2 Ανοσοφθορισμός Γι τον ανοσοφθορισμό ακολουθούνται τα βήματα που περιγράφηκαν στην ενότητα ανοσοϊστοχημείας μέχρι και το βήμα 7 και στην συνέχεια: 8. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων προσδέσεως των αντισωμάτων (blocking) με επώαση με διάλυμα 3%BSA / 10%FBS σε 1x ΤBS, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανάδευση. 9. Στη συνέχεια, ακολουθεί επώαση στους 4 ο C για 16 ώρες, σε κάθε καλυπτρίδα του αντίστοιχου πρώτου αντισώματος και στην κατάλληλη αραίωση σε διάλυμα blocking (1:150). 10. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, από 5min η καθεμία, με διάλυμα 0,1% PBS-Tween, υπό ανάδευση. 11. Στο επόμενο στάδιο ανήκει η επώαση με το δεύτερο αντίσωμα, στην κατάλληλη αραίωση στο διάλυμα blocking. 12. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, από 5min η καθεμία, με διάλυμα 0,1% ΤBS-Tween,υπό ανάδευση. 13. Οι καλυπτρίδες υφίστανται μία ταχεία πλύση με αποστειρωμένο ddh2o. 14. Στην συνέχεια γίνεται εμβάπτιση σε 1/5000 DAPI το οποίο βάφει πυρήνες. Τέλος, τοποθετούνται με την επιφάνεια των κυττάρων προς τα κάτω στην αντικειμενοφόρο πλάκα, στο σημείο ακριβώς όπου πριν έχει τοποθετηθεί μικρή ποσότητα (6-7μl) mounting medium. 3. Κλωνοποίηση PNLDC1 ανθρώπου και ποντικού σε φορείς έκφρασης 3.1 Στρατηγική κλωνοποίησης Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής κλωνοποιήθηκε η δεύτερη ισομορφή της ανθρώπινης PNLDC1 (PNLDC1_2), μία μεταλλαγμένη μορφή χωρίς το αμινοτελικό άκρο και η PNLDC1 του ποντικού (mpnldc1) για την εισαγωγή σε φορείς έκφρασης pet για την έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε προκαρυωτικό σύστημα έκφρασης αλλά και σε φορείς έκφρασης pcdna3.1 και pcdna3.1egfp για την έκφραση και τον εντοπισμό σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Για την κλωνοποίηση της ανθρώπινης PNLDC1_1 σε φορέα έκφρασης pcdna3.1egfp πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με τους εκκινητές PNLDC1_1F NheI και PNLDC1R BamHI που έχει θέσεις περιορισμού BamH I και Kpn I. Η θέση BamH I 82

Μέθοδοι προστίθεται με την επιπλέον αλληλουχία του εκκινητή ενώ η θέση Kpn I βρίσκεται ήδη μέσα στην αλληλουχία του γονιδίου ακριβώς πριν το κωδικόνιο λήξης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να κλωνοποιηθεί το προϊόν στην συνέχεια στους ευκαρυωτικούς φορείς έκφρασης απομακρύνοντας το κωδικόνια λήξης επιτρέποντας την μετάφραση της αλληλουχίας που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη EGFP. PNLDC1_2: Η ανθρώπινη PNLDC1_2 κλωνοποιήθηκε ως εξής. Τμήμα του γονιδίου πολλαπλασιάστηκε από cdna από κύτταρα HEK 293 T τα οποία έχουν επωαστεί με τον απομεθυλιωτικό παράγοντα 5 aza-deoxycytidine (βλέπε ενότητες καλλιέργεια κυτταρικών σειρών χορήγηση 5 aza-deoxycytidine, απομόνωση RNA δημιουργία cdna). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι PNLDC1_2F Nhe I και PNLDC1R. Το τμήμα αυτό του γονιδίου κλωνοποιήθηκε σε φορέα psc-a και στην συνέχεια απομονώθηκε το τμήμα με τα περιοριστικά ένζυμα Nhe I και Acc III και το τμήμα εισάχθηκε ανάμεσα στις ίδιες θέσεις στο πλασμίδιο pcdna3.1pnldc1_1 EGFP του οποίου η κατασκευή περιγράφθηκε προηγουμένως. Τα πλασμίδια pcdna3.1pnldc1_1egfp και pcdna3.1pnldc1_2egfp χρησιμοποιήθηκαν για υπόστρωμα για ενίσχυση με PCR με τους εκκινητές PNLDC1_1F Nhe I - PNLDC1R BamHI και PNLDC1_2F Nhe I - PNLDC1R BamHI και τα προϊόντα εισήχθησαν με την σειρά τους σε psc-a. Τα ένθετα από τα πλασμίδια psc-a PNLDC1_1F Nhe I - PNLDC1R BamHI και PNLDC1_2F Nhe I - PNLDC1R BamHI κομμένα με NheI- BamHI εισήχθησαν στον φορέα pcdna3.1 επίσης κομμένο με NheI-BamHI. Έτσι δημιουργούνται τα pcdna3.1pnldc1_1 και pcdna3.1pnldc1_2 τα οποία εκφράζουν τις δύο ισομορφές χωρίς επιπρόσθετη αλληλουχία. Με τον ίδιο τρόπο κατασκευάστηκαν τα πλασμίδια pet28(b)pnldc1_2 και pet28(b)δpnldc1_2(1-500). mousepnldc1: Η mpnldc1 κλωνοποιήθηκε ως εξής. Δύο τμήματα του γονιδίου ενισχύθηκαν ξεχωριστά από υπόστρωμα cdna που παρασκευάστηκε από ολικό RNA από όρχεις ποντικού. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα ζεύγη mpnldc1 NdeΙ Forward - mpl2r και mpl2f - mpnldc1r XhoΙ. Τα προϊόντα PCR εισήχθησαν σε φορέα psc- A. Το ένθετο NdeΙ - KpnI από το psc-a mpnldc1ndeιf/mpl2r ενώθηκε με το ένθετο KpnI- XhoI από το psc-a/ mpl2f - mpnldc1r XhoΙ σε κομμένο πλασμίδιο pet28 κομένο με NdeΙ - XhoΙ. Έτσι κατασκευάστηκε το γονίδιο ολοκληρωμένο μέσα στο πλασμίδιο pet28(b). Το πλασμίδιο pet28mpnldc1 χρησιμοποιήθηκε για υπόστρωμα για ενίσχυση με PCR με τους εκκινητές mpnldc1_1f NheI και mpnldc1_1r HindIII και το προϊόν εισήχθη με την σειρά του σε psc-a. Τα ένθετα από το πλασμίδιο psc-a mpnldc1_1f NheI και mpnldc1_1r HindIII κομμένο με NheI- HindIII εισήχθησαν στον φορέα pcdna3.1 EGFP επίσης κομμένο με NheI- HindIII. Έτσι δημιουργείται το pcdna3.1mpnldc1_1 EGFP. 83

Μέθοδοι Τελικά προϊόντα κλωνοποίησης: pet28(b)pnldc1_2, pet28(b)mpnldc1 Τα πλασμίδια κατασκευάστηκαν για την έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες φέρουν τόσο στο αμινοτελικό τόσο στο καρβοξυτελικό άκρο ιστιδινικές ουρές. pet28(b)δpnldc1_2(1-500) Το πλασμώδιο αυτό κατασκευάστηκε προκειμένου να παραχθεί μία μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης PNLDC1_2 από την οποία λείπει το υδρόφοβο καρβοξυτελικό άκρο για πιθανή βελτίωση της διαλυτότητας της πρωτεΐνης. pcdna3.1pnldc1_1egfp, pcdna3.1pnldc1_2egfp, pcdna3.1mpnldc1egfp. Τα πλασμίδια αυτά κατασκευάστηκαν για την έκφραση των πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα και την επισήμανση τους με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη προκειμένου να γίνουν η μελέτες υποκυττάριου εντοπισμού. 3.2 Αντίστροφη μεταγραφή Για την μετατροπή του mrna σε cdna ακολουθείται η διαδικασία όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο που ακολουθεί. Ολικό RNA 1-5µg Εκκινητής 1µL 10mM dntp mix 1µL DEPC Η 2 Ο μέχρι 10µL Ο εκκινητής μπορεί να είναι oligo (dt)18 (10µM) ή random hexamer (40µM) ή ο ειδικός για το γονίδιο reverse εκκινητής. Το δείγμα επωάζεται στους 70 C για 5 min, και ψήχεται στον πάγο για τουλάχιστον 1 min. Με την θέρμανση αποδιατάσσονται οι δευτεροταγείς δομές του RNA για να μπορεί να μεταγραφεί σε cdna. Κατά την διάρκεια της επώασης προετοιμάζεται το μίγμα του ενζύμου: Αντιδραστήριο Όγκος 5x RT Buffer 4µL RNase Inhibitor 1µL BioScript Reverse Transcriptase (200u/µl) 1µL DEPC Η 2 Ο μέχρι 10µL 84

Μέθοδοι Με το πέρας της πρώτης επώασης προστίθενται 10µL από το μίγμα της αντίστροφης μεταγραφάσης και επωάζεται η αντίδραση στους 42 C for 30 min. Στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται τυχαία εξαμερή το τελικό μίγμα επωάζεται για 10 min στους 25 C και στην συνέχεια στους 42 C for για 30 min. Η αντίδραση τερματίζεται με θέρμανση στους 85 C για 5 min,και ψήχεται στον πάγο. Η αντίδραση φυλάσσεται στους -20 C για μακροχρόνια αποθήκευση ή χρησιμοποιείται αμέσως στην PCR. 3.3 Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Η PCR χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου PNLDC1_2 από cdna αλλά και για την εισαγωγή των επιθυμητών θέσεων περιορισμού και των δύο ισομορφών για την ένθεση στους επιθυμητούς πλασμιδιακούς φορείς σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθεί. Αντιδραστήριο Όγκος Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης (5x) 5 μl Premixed dntps (10mM) 0.75 μl Forward primer(10μμ) 0.75 μl Reverse primer (10μΜ) 0.75 μl Υπόστρωμα* - DNA πολυμεράση (HiFi, Kapa Biosystems) (1U/μL) 0.5 μl Sterile ddη 2 Ο 16.25 μl Συνολικός όγκος 25 μl Η αντίδραση PCR ξεκινάει με ένα στάδιο μετουσίωσης σε θερμοκρασία 95 ο C για 4 λεπτά. Μετά την πάροδο αυτού του χρονικού διαστήματος προστίθεται με προσοχή η πολυμεράση και το πρόγραμμα συνεχίζεται. Ακολουθούν 25 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από ένα βήμα μετουσίωσης στους 95 ο C για 30 δευτερόλεπτα, ένα στάδιο υβριδισμού για την σύνδεση των εκκινητών στους 60 ο C για 45 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο πολυμερισμού κατά το οποίο δρα η πολυμεράση στους 72 ο C για 1,5 λεπτά. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με ένα στάδιο σε θερμοκρασία υβριδισμού 72 ο C για 10 λεπτά όπου προστίθεται επιπλέον 0.5 μl Taq πολυμεράση, προκειμένου στα προϊόντα του πολυμερισμού να προστεθούν 3 Α άκρα 3.4 Απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA Για το διαχωρισμό τμημάτων DNA και τον προσδιορισμό του μεγέθους του καθενός χρησιμοποιείται η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης. Χρησιμοποιείται πηκτή αγαρόζης 1.5 %, η οποία παρασκευάζεται με την προσθήκη 0.6g αγαρόζης, αντίστοιχα, σε 40mL ΤΑΕ buffer 1x. με προσθήκη 3μl Gel Red, ήπια ανάδευση και στη συνέχεια το διάλυμα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης όπου και αφήνεται να πήξει. Προετοιμάζονται τα δείγματα και οι μάρτυρες του μοριακού βάρους που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν με την προσθήκη σε αυτά loading buffer 6x (Εικόνα 41). 85

Μέθοδοι Εικόνα 41 Ενδεικτική εικόνα ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR με τους εκκινητές PNLDC1_2F Nhe I - PNLDC1R BamHI Η απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (DNA extraction from agarose gels) έγινε με βάση το πρωτόκολλο του kit NucleoSpin Extract II της MACHEREY-NAGEL Εξαγωγή του τμήματος DNA- ιάλυση της πηκτής: Αρχικά εξάγεται από την πηκτή αγαρόζης η ζώνη με το τμήμα του DNA που επιθυμούμε να απομονώσουμε με την βοήθεια ενός αποστειρωμένου νυστεριού. Η εξαγωγή πραγματοποιείται με προσοχή ώστε να ελαχιστοποιηθεί όσο το δυνατόν ο περιττός όγκος της πηκτής. Το κομμάτι αυτό διαλύεται σε buffer NT σε αναλογία 200 μl buffer για κάθε 100mg πηκτής αγαρόζης (για πηκτή αγαρόζης μέχρι και 2%). Η διάλυση επιτυγχάνεται με θέρμανση της πηκτής στους 50 C για 5-10 λεπτά με ανάδευση κάθε 2-3 λεπτά. έσμευση του DNA- Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Το δείγμα φορτώνεται σε στήλη, η οποία τοποθετείται σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2mL. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g, απομακρύνεται το έκλουσμα και επανατοποθετείται η στήλη στο συλλεκτικό σωλήνα. Ακολούθως, προστίθενται ακόμη 600 μl NT3 buffer, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης- Έκλουση του DNA Τα δείγμα φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις 11000 x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer NT3. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Ακολούθως, η στήλη μεταφέρεται σε νέο σωλήνα (Recovery Tube) και προστίθενται 50 μl του Elution Buffer NE. Ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό με σκοπό την αύξηση της απόδοσης της έκλουσης του DNA. Τέλος, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g. Το εκλουόμενο DNA φυλάσσεται στους -20 ο C. 3.5 Σύνδεση τμημάτων DNA Επωάζεται γραμμικός φορέας παρουσία των τμημάτων, που επιθυμούμε να συνδέσουμε, σε αναλογία φορέα προς τμήμα DNA 1:3, με την προσθήκη 1 Unit Τ4 DNA 86

Μέθοδοι λιγάσης (1u/μl). Επιπλέον, είναι απαραίτητη η προσθήκη στο διάλυμα του ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος της λιγάσης το οποίο κατασκευάζεται από την ίδια εταιρεία. Το διάλυμα επωάζεται για 12-14h στους 16 ο C στην περίπτωση που χρησιμοποιείται ο φορέας pet-20b. Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθεί ο πλασμιδιακός φορέας psc-a, προστίθενται με την ακόλουθη σειρά τα εξής συστατικά: Αντιδραστήριο Όγκος Strataclone Cloning Buffer 3 μl PCR product (5-50ng) 2 μl Strataclone Vector Mix 1 μl Το μίγμα επωάζεται για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου 3.6 Μεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα E. coli με ηλεκτροδιάτρηση Σε 50 μl ηλεκτροεπιδεκτικών κυττάρων γίνεται προσθήκη 1-2 μl του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA και επώαση στον πάγο για 1 λεπτό. Στη συνέχεια τα κύτταρα μεταφέρονται σε κυβέττα 0.2cm (Biorad Gene Pulser ) και πραγματοποιείται ηλεκτρικό shock των κυττάρων ( pulse ) στο micropulser στο πρόγραμμα Ec2 (Biorad MicroPulserTM). Έπειτα το μίγμα DNA-κυττάρων αφαιρείται από την κυβέττα και μεταφέρεται σε 1mL SOC medium. Ακολουθεί επώαση για 1,5 ώρες στους 37 ο C υπό ανάδευση (160 rpm). Τέλος, επιστρώνονται 100-200 μl της μετασχηματισμένης καλλιέργειας σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό μέσο LB agar το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, ανάλογα με τα γονίδια ανθεκτικότητας που διαθέτει το εκάστοτε πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για το μετασχηματισμό (π.χ. για pet-20b αμπικιλλίνη). Επίσης, σε περίπτωση που το πλασμίδιο που χρησιμοποιείται διαθέτει το οπερόνιο της λακτόζης (π.χ. psc-a), είναι απαραίτητη η προσθήκη 20 μl X-gal (2%) πριν την επίστρωση των κυττάρων, για να είναι δυνατή, στη συνέχεια, η επιλογή των λευκών αποικιών που θα περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο (blue/white screening). Τέλος, πραγματοποιείται επώαση των τρυβλίων στους 37 ο C για 12-14 h. Οι θετικές αποικίες ενοφθαλμίζονται σε 3mL LB broth που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό. Ακολουθεί επώαση των καλλιεργειών για 12-14h στους 37 o C υπό ανάδευση (210 rpm). Η ακόλουθη διαδικασία πραγματοποιείται με βάση το πρωτόκολλο απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από κύτταρα E.coli του kit NucleoSpin Plasmid της MACHEREY-NAGEL. SOC (υγρό θρεπτικό μέσο για μετασχηματισμό βακτηρίων) 0.5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 10 mm NaCl, 2.5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 10 mm MgSO 4, 20mM glucose Στερεό θρεπτικό μέσο (LB Agar) 0.5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 0.5% v/w NaCl, 1.5% agar, ph 7.2 Υγρό θρεπτικό μέσο (LB Broth) 0.5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 0.5% v/w NaCl, ph 7.2 87

Μέθοδοι 3.7 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα Συλλογή των βακτηριακών κυττάρων: 1.5mL από την καλλιέργεια E. coli που αναπτύχθηκε σε ένα σωλήνα και φυγοκεντρούνται για 30s στις 11000 x g. Απομακρύνεται το υπερκείμενο και επαναλαμβάνεται αυτό το βήμα. Λύση των κυττάρων: Προστίθενται 250 μl buffer A1 και επαναδιαλύεται το ίζημα με τη βοήθεια πιπέτας και έντονη ανάδευση στο vortex. Ακολουθεί προσθήκη 250 μl buffer A2 και ανάμειξη αναποδογυρίζοντας ήπια μερικές φορές χωρίς τη χρήση του vortex. Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 2-3 λεπτά. Ακολούθως προστίθενται 300 μl buffer A3 και πραγματοποιείται ήπια ανάδευση αποφεύγοντας τη χρήση vortex. Φυγοκέντρηση για 5-10 λεπτά στις 11000 x g σε θερμοκρασία δωματίου. έσμευση του DNA: Τοποθετείται η στήλη σε ένα σωλήνα συλλογής (collecting tube) των 2mL στην οποία φορτώνεται το υπερκείμενο που έχει προκύψει από τη φυγοκέντρηση του προηγούμενου βήματος. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g και απομάκρυνση του εκλούσματος. Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης: Επανατοποθετείται η στήλη στο σωλήνα συλλογής και προστίθενται 600 μl buffer A4 (με αιθανόλη). Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης - Έκλουση του DNA: Επανατοποθετείται η στήλη στο σωλήνα συλλογής και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στις 11000 x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer Α4. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Τοποθετείται η στήλη σε νέο σωλήνα και προστίθενται 50 μl buffer AE ή ddh 2 O. Στη συνέχεια, επωάζεται το δείγμα για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 11000 x g. Το εκλουόμενο πλασμιδικό DNA φυλάσσεται στους -20 ο C. Τα πλασμίδια τα οποία έχουν προκύψει από ένθεση προϊόντος PCR ελέγχονται με αλληλούχιση. Η αλληλούχιση του πλασμιδίου psc-a γίνεται με τους εκκινητές M13 Reverse και Μ13-20 Forward που υβριδοποιούνται ανοδικά και καθοδικά του σημείου ένθεσης καλύπτοντας έτσι όλο το ένθετο. Μία αντίδραση Sanger μπορεί να καλύψει έως και 750 βάσεις καλύπτοντας ένα ένθετο των 1500 βάσεων που είναι το γονίδιο PNLDC1. Τα χρωματογραφήματα αναλύονται με λογισμικό Chromas (http://technelysium.com.au) και το ApE (http://biologylabs.utah.edu) για να επιβεβαιωθεί η ορθότητα της αλληλουχίας. 3.8 Κλωνοποίηση σε φορείς pet και pcdna3.1 Από το πλασμίδιο psc-α αποκόπτεται με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού το κάθε ένθεμα και εισάγεται σε φορείς έκφρασης οι οποίοι έχουν κοπεί με τα ίδια περιοριστικά ένζυμα. Το πλασμιδιακό DNA επωάζεται με το ένζυμο σε αναλογία 2 Units (ενζυμικές μονάδες)/μg DNA, παρουσία του κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο προτείνεται από την κατασκευαστική εταιρεία. Η ενζυμική μονάδα (Unit) ορίζεται ως η 88

Μέθοδοι ποσότητα του ενζύμου που υδρολύει 1 μg DNA από βακτηριοφάγο σε μια ώρα, στους 37 o C. Η αντίδραση διαρκεί περίπου 2-3 ώρες στους 37 ο C. Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα NdeI (10u/μl) και BamHI (10u/μl) για την υποκλωνοποίηση σε φορεις pet και pcdna3.1egfp. Η κάθε μια αντίδραση περιέχει τα εξής: Αντιδραστήριο Ρυθμιστικό διάλυμα 10x Ενζυμο 10U/μL Ενζυμο2 10U/μL Αρχικό πλασμίδιο με ένθετο ddh 2 O sterile μέχρι τελικού όγκου Ποσότητα 4 μl 1 μl 1 μl 500ng 20 μl Το μίγμα επωάζεται για 2 hrs στους 37 o C. Τα προϊόντα ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης για τον έλεγχο της αντίδρασης και τον διαχωρισμό των προϊόντων. Οι ζώνες που αντιστοιχούν στο γραμμικό πλασμίδιο pet ή pcdna και στο ένθετο με κολλώδη άκρα απομονώνονται όπως περιγράφηκε παραπάνω για τα προϊόντα PCR και χρησιμοποιούνται σε αντίδραση συνένωσης για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου pet-pnldc1 ή pcdna- PNLDC1. Η Τ4 DNA λιγάση καταλύει τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ 3 - ΟΗ και 5 -Ρ άκρων. Το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει τα εξής: Αντιδραστήριο Ένθετο 20 ng/ μl Πλασμίδιο 40 ng/μl T4 DNA Ligase (350 U/μl) 10x T4 DNA Ligase Buffer ddh 2 O Όγκος 8μl 4μl 1μl 2μl 6μl Το μίγμα επωάζεται στους 16 ο C για 16 hrs και προϊόντα της αντίδρασης συνένωσης χρησιμοποιούνται για μετασχηματισμό δεκτικών DH5a με την διαδικασία που περιγράφηκε. ΤΑΕ (50x) Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης : Tris base 24.2% v/w, Οξικό οξύ 5.71% w/w, EDTA 0.05M, ph 8.6 Loading buffer (6x) Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων: Bromophenol Blue 0.09%, Xylene Cyanol 0.09%, Γλυκερόλη 60%, EDTA 60mM 89

Μέθοδοι 4. Μέθοδοι απομόνωσης, καθαρισμού και ανάλυση πρωτεϊνών 4.1 Παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Σε 5mL LB Broth με αντιβιοτικό εκλογής (αναλόγως του πλασμιδίου που χρησιμοποιείται) σε τελική συγκέντρωση 0.1mg/mL, ενοφθαλμίζονται κύτταρα BL21(DE3)Rosetta, που περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο και επωάζονται για 12-14h στους 37 Ο C υπό ανάδευση (210 rpm). Ακολουθεί μεταφορά 2.5 ml της Ο/Ν καλλιέργειας σε 2L θρεπτικού μέσου LB broth με αντιβιοτικό (τα πλασμίδια pet28-33 φέρουν γονίδια ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη). Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 600nm (OD600) και επώαση στους 37 Ο C υπό ανάδευση μέχρι το OD600 να φτάσει περίπου το 0.6 που αντιστοιχεί στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Προστίθενται 0.1-1mM IPTG (0.1M) (Isopropyl Thio Galactosyl). Το IPTG δρα ως επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης της οποίας ο προαγωγέας στο πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση του γονιδίου, βρίσκεται μπροστά από τον polylinker. Η έκφραση του γονιδίου αυτού στα κύτταρα του E. coli αναστέλλεται από τον καταστολέα LacIQ. Το IPTG δεσμεύει και απομακρύνει τον καταστολέα από το DNA επιτρέποντας έτσι την έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης, η οποία με τη σειρά της θα αναγνωρίσει τον προαγωγέα της στο πλασμίδιο και θα μεταγράψει τα γονίδια που βρίσκονται μετά από αυτόν, που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι το γονίδιο PNLDC1. Μετά την προσθήκη του IPTG συνεχίζεται η επώαση της καλλιέργειας σε θερμοκρασία 20 Ο C μέχρι το OD600 να φτάσει περίπου το 1.2. Τέλος, φυγοκεντρούνται οι καλλιέργειες στις 4000 rpm για 15 min στους 4 Ο C, αφαιρείται το υπερκείμενο και το ίζημα αποθηκεύεται στους -80 Ο C. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μπορεί να συντίθεται σε διαλυτή μορφή, αλλά σε μεγάλο ποσοστό μόρια συσσωματώνονται και σχηματίζουν αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια (inclusion bodies). Ο σχηματισμός των έγκλειστων σωματίων επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως η φύση του πρωτεϊνικού μορίου, το είδος του βακτηριακού στελέχους και του πλασμιδίου έκφρασης του συστήματος, και κυρίως, από τις συνθήκες καλλιέργειας και επαγωγής της έκφρασης του ετερόλογου γονιδίου. Ομογενοποίηση κυττάρων-απομόνωση ανσυνδυασμένων πρωτεϊνών Πριν την ομογενοποίηση το ίζημα των κυττάρων επωάζεται στον πάγο μέχρι να ξεπαγώσει. Στη συνέχεια αναδιαλύεται σε 20 ml διαλύματος λύσης/gr βάρους κυττάρων. Το διάλυμα λύσης περιέχει 2 έως 10 mm ιμιδαζόλιο, το οποίο ανταγωνίζεται κατάλοιπα ιστιδινών για την πρόσδεση στη στήλη, προκαλώντας έτσι μείωση της μη ειδικής πρόσδεσης πρωτεϊνών με ιστιδίνες κατά τη χρωματογραφία. Στο κυτταρικό διάλυμα προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 1 mg/ml, ώστε να διευκολυνθεί η λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων και ακολουθεί επώαση στο πάγο για 30 min και ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Η ομογενοποίηση των κυττάρων γίνεται σε συσκευή υπερήχων με 10 χτυπήματα (bursts) σε ισχύ 25-50 W, διάρκειας 30 sec το καθένα, στον πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 20000 g για 60 min στους 4 o C. Το υπερκείμενο αποτελεί το εκχύλισμα των διαλυτών πρωτεϊνών. Το ίζημα αποτελείται από, μεμβράνες, βακτηριακά 90

Μέθοδοι τοιχώματα, DNA και αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια. Στο υπερκείμενο προστίθεται 5 ml εναιωρήματος Ni-NTA αγαρόζη (περιέχει υλικό για 2.5 ml πακεταρισμένης στήλης) και το μίγμα τίθεται υπό ελαφρά ανακίνηση στους 4 C για 1.5 h, ώστε να προσδεθεί η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο χρωματογραφικό υλικό. Ακολούθως το εναιώρημα πακετάρεται σε στήλη με τη ροή που προκαλείται από την δύναμη της βαρύτητας. Το διάλυμα που διέρχεται της στήλης συλλέγεται (flow-through). Η στήλη εκπλένεται με >30 ml διαλύματος έκπλυσης και στη συνέχεια η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκλούεται με διάλυμα έκλουσης 250 mm ιμιδαζολίου. Σε όλα τα στάδια της απομόνωσης κρατούνται δείγματα 50-100 μl για την ανάλυση με SDS/PAGE. Τα δείγματα καθαρής πρωτεΐνης συλλέγονται και με διαπίδυση αλλάζει η σύσταση του διαλύματος που βρίσκονται η πρωτεΐνες ενώ απαλλάσσονται και από την παρουσία ιμιδαζολίου (Εικόνα 42). Τέλος οι απομονωμένες πρωτεΐνες υπόκεινται σε επιπλέον στάδιο καθαρισμού με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Εικόνα 42 Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών επισημασμένων με ουρά ιστιδινών ιάλυμα λύσης: (50 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm KCl, 0.1% Triton X-100, 5% glycerol, 2mM β-mercaptoethanol, 5 mm imidazole, 0.1 mm PMSF, 10μg/mL lysozyme). Τα υλικά Triton X-100, β-mercaptoethanol και lysozyme προστήθονται στο διάλυμα λύσης πριν την διαδικασία λύσης των κυττάρων. ιάλυμα έκπλυσης στήλης: (50 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm KCl, 0.1% Triton X- 100, 5% glycerol, 2mM β-mercaptoethanol, 20 mm imidazole) ιάλυμα έκλουσης: (50 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm KCl, 0.1% Triton X-100, 5% glycerol, 2mM β-mercaptoethanol, 250 mm imidazole) Διάλυμα διαπίδυσης: (20mM Hepes ph7.5, 100mM NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1mM DTT, 10% glycerol) 4.2 Ηλεκτροφόρηση πολυπεπτιδίων σε πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν φορτωθούν στην πηκτή περιλαμβάνει την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος Loading Dye (2x) και τη θέρμανση των δειγμάτων στους 98 ο C, για 5 λεπτά. Τα δείγματα ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Το ανώτερο μέρος του πηκτώματος (πήκτωμα πακεταρίσματος, stacking gel) είναι περιεκτικότητας 4% σε ακρυλαμίδιο και έχει ph 6.8. Η 91

Μέθοδοι περιεκτικότητα του κατώτερου μέρους του πηκτώματος (πήκτωμα διαχωρισμού, separating gel) εξαρτάται από το εύρος μοριακών βαρών των πρωτεϊνών για το οποίο το πήκτωμα επιθυμούμε να έχει την μέγιστη διαχωριστική ικανότητα, ενώ το ph είναι 8.8. Για τον βέλτιστο διαχωρισμό πρωτεϊνών με μοριακά βάρη από 20 έως 90 kda το διαχωριστικό πήκτωμα πρέπει να είναι 10 %, ενώ για εύρος 10 έως 20 kda η περιεκτικότητα πρέπει να είναι 16 %. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 7 cm x 9 cm x 1 mm και η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 120V για 2 hrs. ιαλύματα για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Sample Buffer (2x): 90 mm Tris-HCl ph 6.8, 20% γλυκερόλη, 2% SDS, 0.02% bromophenol blue, 0.1 M DTT Running buffer (10x): Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου: Tris base 1.5 % w/v, Γλυκίνη 7.2% w/v, SDS 0.5% w/v, ph 8.3 ιαλύματα για πήκτωμα ακρυλαμιδίου Ρυθμιστικό διάλυμα Tris- HCl ph 8.8, 1.5M Ρυθμιστικό διάλυμα Tris- HCl ph 6.8, 0.5M SDS 10% w/v Ακρυλαμίδιο 30% v/w acrylamide / bis-acrylamide (29/1) σε ddh20 Ανάλογα με την συσκευή και την περιεκτικότητα ακρυλαμιδίου που θα χρειαστούμε θα αναζητήσουμε τους πίνακες για την αναλογία των διαλυμάτων στοκ που θα πρέπει να αναμείξουμε και προσθέτουμε στο τέλος τους καταλύτες APS 10% και TEMED. 4.3 Χρώση με Coomassie Brilliant Blue Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης αφαιρούμε το πήκτωμα διαχωρισμού και το φέρουμε σε διάλυμα χρώσης (staining solution) Coomassie Brilliant Blue. Το διάλυμα θερμαίνεται ελαφρώς για 10 min και στη συνέχεια το πήκτωμα κατεργάζεται με διάλυμα αποχρωματισμού 1 h υπό ανάδευση για την εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών. ιάλυμα χρώσης: 1gr/L Coomassie Brilliant Blue, 48% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ. ιάλυμα αποχρωματισμού: 45% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ. 4.4 Ανάλυση με ανοσοαποτύπωση (Western blot analysis) Με αυτή τη μεθοδολογία οι πρωτεΐνες μεταφέρονται με ηλεκτρομεταφορά από το πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) σε μεμβράνη PVDF. Μετά από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, το πήκτωμα διαχωρισμού ξεπλένεται από την περίσσεια SDS με ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς. Κόβουμε τη μεμβράνη PVDF στις διαστάσεις του πηκτώματος διαχωρισμού και την καθιστούμε υδρόφιλη, εμβαπτίζοντάς την για 2-3 sec σε απόλυτη μεθανόλη. Τοποθετούμε με τη σειρά 3 κομμάτια χαρτιού Whatman 3ΜΜ, το πήκτωμα, τη μεμβράνη PVDF και 3 κομμάτια χαρτί Whatman (όλα εμποτισμένα με διάλυμα μεταφοράς) χωρίς να εγκλωβιστούν φυσαλίδες αέρα. Ακολούθως, τοποθετούμε το «σάντουιτς» στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς με την μεμβράνη προς την άνοδο. Η ηλεκτρομεταφορά πραγματοποιείται στα 100 V για 1 h στους 4 C. Μετά το πέρας, η 92

Μέθοδοι μεμβράνη επωάζεται σε διάλυμα δέσμευσης των μη ειδικών θέσεων της μεμβράνης στους 4 C για τουλάχιστον 1 h. Η μεμβράνη μετά το τέλος της δέσμευσης πλένεται με διάλυμα TBS-Tween/Triton δύο φορές από 10 min και με διάλυμα TBS για 10 min. Ακολουθεί επώαση με πρωτεύων αντίσωμα, αραιωμένο 1/500 σε διάλυμα δέσμευσης, για 3 h σε θερμοκρασία δωματίου ή για 16 ώρες στους 4 ο C. Η μεμβράνη ξεπλένεται 3 φορές με διάλυμα TBS- Tween/Triton, από 10 min. Στην συνέχεια η μεμβράνη επωάζεται για μία ώρα με το δευτερεύον αντίσωμα στην προκειμένη περίπτωση Goat anti Rabbit HRP. Ακολουθεί ξέπλυμα 3 φορές με διάλυμα TBS- Tween/Triton, από 10 min και ένα ξέπλυμα με TBS. H μεμβράνη επωάζεται με διάλυμα ανίχνευσης υπεροξειδάσης (Chemicon) για 1.5 min και στη συνέχεια εκτίθεται σε φιλμ. Ρυθμιστικό διάλ. μεταφοράς: 25mM Tris, 150mM γλυκίνη, 20% μεθανόλη, ph 8.3 Ρυθμιστικό διάλυμα TBS: 10 mm Tris HCl ph 7.5, 150 mm NaCl ιάλυμα δέσμευσης: TBS, 3% BSA ιάλυμα TBS-Tween/Triton: 20 mm Tris-HCl ph 7.5, 500 mm NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20, 0.2% (v/v) Triton X-100 4.5 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη καθαρότητα και ποσότητα από τη χρωματογραφία συγγένειας μεταφέρονται σε διάλυμα αντίδρασης με την διαδικασία της διαπίδυσης. Εν συντομία το διάλυμα της πρωτεΐνης εγκλίνεται σε μεμβράνη ημιπερατή η οποία επιτρέπει την ανταλλαγή νερού, ιόντων και μικρών μορίων και δεν επιτρέπει την διαρροή της πρωτεΐνης. Πριν την διαπίδυση εάν επιθυμούμε να συμπυκνώσουμε την πρωτεΐνη τοποθετούμε την μεμβράνη με την πρωτεΐνη σε ένα ποτήρι ζέσεως και την σκεπάζουμε με PEG 40000, ένα υδρόφιλο πολυμερές που προσροφά νερό και μαζί ιόντα και μικρά μόρια έξω από την μεμβράνη μειώνοντας τον όγκο που υπάρχει μέσα στην μεμβράνη. Με τον τρόπο αυτό αυξάνουμε την συγκέντρωση της πρωτεΐνης. Αυτό έχει ως συνέπεια τον καλύτερο διαχωρισμό στο επόμενο βήμα αλλά και τον καθαρισμό περισσότερης πρωτεΐνης. Στην συνέχεια η μεμβράνη που περιέχει την πρωτεΐνη εμβαπτίζεται στο διάλυμα το οποίο είναι τουλάχιστον 500 φορές τον όγκο του διαλύματος της πρωτεΐνης. Η διαπίδυση κρατά από 12-16 ώρες. Μετά το πέρας της διαπίδυσης η πρωτεΐνη υπόκειται σε καθαρισμό με χρωματογραφία μοριακής διήθησης (size exclusion chromatography) σε στήλη Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Στη χρωματογραφία μοριακής διήθησης οι πρωτεΐνες μετακινούνται διαμέσου ενός πορώδους υλικού και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους. Τα μικρότερα μόρια παγιδεύονται στους πόρους του υλικού της στήλης και διανύουν μεγαλύτερη απόσταση μέχρι την έξοδο από αυτήν. Έτσι οι πρωτεΐνες μεγαλύτερου μεγέθους που δεν εισέρχονται στους πόρους του υλικού, εκλούονται πρώτες από τη στήλη της μοριακής διήθησης και ακολουθούν οι μικρότερες. Η έξοδος της στήλης συνδέεται με ένα φασματοφωτόμετρο UV. Καθώς οι πρωτεΐνες εκρέουν από την στήλη συλλέγουμε τα κλάσματα με την μεγαλύτερη απορρόφηση. Τα κλάσματα ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/ πολυακρυλαμιδίου για την επιβεβαίωση καθαρότητας και 93

Μέθοδοι μεγέθους της πρωτεΐνης. Τα δείγματα καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης διατηρούνται στους 4 C για άμεση in vitro δοκιμή. Εικόνα 43 Το σύστημα FPLC με αντλίες GE P-500 που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Εναλλακτικά χρησιμοποιείται στήλη 10/400mm με υλικό πλήρωσης Sephacryl S-200 HR. Η πλήρωση και προετοιμασία της στήλης γίνεται σύμφωνα με το εγχειρίδιο χρήσης Sephacryl S-100, S-200, S-300, S-400, S-500 High Resolution Instructions Διάλυμα διαπίδησης και Χρωματογραφίας Μοριακής Διήθησης: 20 mm HEPES, ph 7.5, 75 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2 4.6 Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic light scattering, DLS) H DLS μετρά τις διακυμάνσεις που υφίσταται η σκεδαζόμενη ακτίνα του φωτός κατά τη χρονική διάρκεια των μετρήσεων και καταγράφει τις χρονικές στιγμές που συμβαίνουν οι μέγιστες διακυμάνσεις με σκοπό την εξαγωγή φυσικοχημικών παραμέτρων για ένα βιολογικό μακρομόριο. Η πιο σημαντική χρήση αφορά τον προσδιορισμό του μεγέθους των μακρομορίων μέσα σε ένα διάλυμα. Για τις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε Zetasizer Nano ZS (Malven Instruments) Εικόνα 44 Μέτρηση της μάζας των μακρομορίων με δυναμική σκέδαση φωτό 94

Μέθοδοι 5. In vitro δοκιμές αποαδενυλίωσης 5.1 Σήμανση ολιγονουκλεοτιδίων στο 5 άκρο τους με γ 32Ρ ΑΤΡ Η αντίδραση σήμανσης στο 5 άκρο των υποστρωμάτων έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθεί: Αντιδραστήριο 10x T4 PNK ρυθμ. δ/μα Αποφωσφορ. RNA μετάγρ. (1pmol/μL) γ 32Ρ ΑΤΡ (6000 Ci/mmol, 10 μci/μl) RNasin (10 U/μL) T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μL) ddh 2 O μέχρι Όγκος 2 μl 10 μl 6 μl 1 μl 1 μl 20 μl Το μίγμα επωάζεται στους 37 o C για 1 h και τερματίζεται με την προσθήκη 1 μl EDTA 200 mm ph8 (C τελ =10 mm). Στη συνέχεια στην αντίδραση προστίθενται 5 μl διαλύματος φορτώματος RNA και η αντίδραση ηλεκτροφορείται σε αποδιατακτικό PAGE 8%/8M Urea. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 20x20 cm ενώ η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται με 30 ma μέχρι η χρωστική του μετώπου να φτάσει στην άκρη του πηκτώματος. Τα προϊόντα της αντίδρασης οπτικοποιούνται με αυτοραδιογραφία και ακολουθείται η διαδικασία έκλουσης των ραδιενεργών RNA μετάγραφων πλήρους μήκους από το πήκτωμα μετά από αυτοραδιογραφία. 5.2 Δοκιμές εύρεσης βέλτιστων συνθηκών ενζυμικής δραστικότητας Η εύρεση των βέλτιστων συνθηκών κρίνεται απαραίτητη πριν την κινητική ανάλυση του ενζύμου. Για κάθε παράγοντα αντίδρασης (NaCl, MgCl 2, ph και θερμοκρασία) που μεταβάλλεται διατηρείται το βασικό διάλυμα ίδιο (20 mm HEPES, ph 7.5, 75 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 37 o C) πλην του μεταβαλλόμενου. Έλεγχος συγκεντρώσεων NaCl: Βασικό διάλυμα 10x: (200mM Hepes ph 7.5, 15mM MgCl 2, 1mM DTT)) 0 25mM 100mM 200mM 300mM Βασικό διάλυμα 10x (μl) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Διάλυμα ενζύμου (μl) 7 7 7 7 7 RRI+Υπόστρωμα (μl) 2 2 2 2 2 NaCl (μl) - 0.375 (1Μ) 1.5 (1Μ) 1 (3Μ) 1.5 (3Μ) H 2 O 4.5 4.125 3 3.5 3 95

Μέθοδοι Έλεγχος ph: Βασικό διάλυμα 10x: 750mM NaCl, 15mM MgCl 2, 1mM DTT. Control 6,5 7 7,5 8 8,5 Βασικό διάλυμα 10x (μl) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Διάλυμα ενζύμου (μl) - 7 7 7 7 7 RRI+Υπόστρωμα (μl) 2 2 2 2 2 2 1M Hepes (μl) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 H 2 O (μl) 11.7 4.2 4.2 4.2 4.2 4.2 Έλεγχος συγκεντρώσεων MgCl 2 : Βασικό διάλυμα 10x: 200mM Hepes ph 7.5, 750mM NaCl, 1mM DTT. 0 0.5mM 1mM 1.5mM 2.5mM 5mM Βασικό διάλυμα 10x (μl) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Διάλυμα ενζύμου (μl) 7 7 7 7 7 7 RRI+Υπόστρωμα (μl) 2 2 2 2 2 2 MgCl 2 (μl) - 0.75 (10mΜ) 1.5 (10mΜ) 2.25 (10mΜ) 0.325 (100mΜ) 0.75 (100mM H 2 O (μl) 4.5 3.75 3 1.25 4.175 3.75 Έλεγχος θερμοκρασίας: Βασικό διάλυμα 10x: 200 mm Hepes ph 7.5, 100mM NaCl, 15mM MgCl 2, 1mM DTT Βασικό διάλυμα 10x 12 μl Enzyme 28 μl RRI 16 μl Βασικό διάλυμα 10x 12 μl Enzyme 28 μl RRI 16 μl Για κάθε αντίδραση ετοιμάζεται και μία αντίδραση-μάρτυρας απουσία ενζύμου για τον έλεγχο τυχαίας υδρόλυσης των υποστρωμάτων αλλά και την κανονικοποίηση του σήματος κατά την αυτοραδιογραφία. Το μίγμα των αντιδράσεων επωάζεται για 40 min. Οι αντιδράσεις τερματίζονται με την προσθήκη 2μl EDTA 0.5M και τοποθετούνται στον πάγο. Αφού συλλεχθούν όλες οι αντιδράσεις γίνεται απομόνωση των νουκλεικών οξέων με φαινόλη και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 30% παρουσία ουρίας. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 15 ma για περίπου 2.5 ώρες. Το πήκτωμα αφαιρείται από τα τζάμια και διεγείρει πλάκα φωτοδιεγειρόμενου φθορισμού για 16h η οποία σαρώνεται με τον σαρωτή FLA 3000 (FujiFilm). 96

Μέθοδοι 5.3 Κινητική ανάλυση της PNLDC1 Για την εύρεση της αγχιστείας του ενζύμου για τα διάφορα υποστρώματα πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων υποστρώματος. Σε κάθε αντίδραση προστίθεται ποσότητα σεσημασμένου προκειμένου να γίνει η ποσοτικοποίηση η ποσότητα του οποίου είναι αμελητέα και δεν υπολογίζεται στην ανάλυση (50-100pM). H συγκέντρωση του διαλύματος ενζύμου είναι 0.1μΜ. Control 0 min 10 nm 50 nm 100 nm 500 nm 1000 nm Υπόστρωμα 0.5 μl 0.5 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl Αρχική Αραίωση - - 300nM 1.5mM 3mM 15mM 30mM Διάλυμ. Αντίδ. 12.5 μl 4 μl 8 μl 8 μl 8 μl 8 μl 8 μl RRI (1U/μl) 2 μl 2 μl 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl Ραδιενεργό 20 cps 20cps 40 cps 40 cps 40 cps 40 cps 40 cps υπόστρωμα Διάλυμα PNLDC1-8.5 μl 17 μl 17 μl 17 μl 17 μl 17 μl 15 μl 15 μl 30 μl 30 μl 30 μl 30 μl 30 μl Το control επωάζεται και αυτό στους 37 ο C για 50 λεπτά. Η δεύτερη αντίδραση συλλέχθηκε αμέσως. Οι υπόλοιπες συλλέχθηκαν σε δύο χρόνους, 25 και 50 λεπτά. Στη συνέχεια ηλεκτροφορήθηκαν και έγινε εμφάνιση όπως αναφέρθηκε παραπάνω. 6. ιατήρηση και καλλιέργεια κυτταρικών σειρών 6.1 Απόψυξη κυττάρων Ένα δοχείο κατάψυξης κυττάρων που περιέχει 10 7 περίπου κύτταρα μεταφέρεται παγωμένο κατευθείαν σε υδατόλουτρο στους 37 o C μέχρι να τηχθεί όλο το θρεπτικό υλικό που περιέχει τα κύτταρα. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15 ml falcon tubes με 5 ml PBS και φυγοκεντρούνται σε 1000 g για 5 λεπτά. Αφαιρείται το υπερκείμενο και τα κύτταρα αναδιαλύονται σε θρεπτικό μέσο και μεταφέρονται σε φλάσκα 75 cm 2 (Τ75 flask) ή σε τρυβλίο 100mm ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες σε τελικό όγκο θρεπτικό 12 ml. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το θρεπτικό και συμπληρώνεται με φρέσκο θρεπτικό μέσο κυτταροκαλλιεργειών. 6.2 Ανακαλλιέργεια Όταν τα κύτταρα καλύψουν 80-100% την επιφάνεια της φλάσκας πριν αρχίσουν και δημιουργούν διπλοστοιβάδες πρέπει να αποκολληθούν, να αραιωθούν και να στρωθούν στη φλάσκα σε ποσότητα τέτοια να καλύπτει το 10-20% της επιφάνειας (αραίωση 1/10-1/5). Για κύτταρα τα οποία προσκολλούνται ισχυρά στο πλαστικό μέσο εξωκυττάριων γλυκοπρωτεϊνών είναι απαραίτητη η επεξεργασία με θρυψίνη. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού (Ε14). Για να δράσει η θρυψίνη πρέπει να ξεπλυθούν τα κύτταρα δύο φορές με PBS για να απομακρυνθεί κάθε ίχνος θρεπτικού. Προστίθεται διάλυμα θρυψίνης 1x τόσο ώστε να καλυφθεί όλη η επιφάνεια της φλάσκας 97

Μέθοδοι (2-3mL). Ακολουθεί επώαση στους 37 o C μέχρι να αποκολληθούν τα κύτταρα (αποκτούν στρογγυλή μορφή όταν τα παρατηρήσουμε στο ανάστροφο μικροσκόπιο). Τα Ε14 εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού χρειάζονται περίπου 10 λεπτά για να αποκολληθούν. Προστίθεται φρέσκο θρεπτικό μέσο το οποίο απενεργοποιεί την θρυψίνη και τα κύτταρα αποκολλώνται με ελαφρό πιπετάρισμα. Τα κύτταρα ΗΕΚ 293 Τ αποκολλώνται χωρίς θρυψίνη μετά από επώαση με 10 ml PBS στους 37 o C για 10 λεπτά και ισχυρό χτύπημα της φλάσκας στο πλάι με το χέρι, είτε με την παραπάνω διαδικασία της θρυψίνης για ~1 λεπτό και σε συγκέντρωση θρυψίνης την μισή της προβλεπόμενης (0,5x τελική). Το εναιώρημα κυττάρων φυγοκεντρείται και αναδυαλύεται σε θρεπτικό μεταφέρουμε το ~1/5 σε νέα φλάσκα σε τελικό όγκο 12 ml πλήρης θρεπτικού. 6.3 Φύλαξη κυττάρων Όταν τα κύτταρα καλύπτουν το 70% της επιφάνειας αποκολλώνται και αναδιαλύονται. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15 ml falcon και φυγοκεντρούνται σε 1000 g για 5 λεπτά. Αφαιρείται το υπερκείμενο, αναδιαλύονται σε 1mL διάλυμα ψύξης (90% FBS 10% DMSO) και μεταφέρονται σε ειδικά φυαλίδια τα οποία χρησιμοποιούνται για πάγωμα (cryovials). Στην συνέχεια τοποθετούνται με ειδικό δοχείο βραδείας ψύξης που περιέχει ισοπροπανόλη σε κατάψυξη -80 o C και την επομένη μέρα μεταφέρονται από το δοχείο αυτό σε δοχείο υγρού αζώτου που φέρει θήκες για τοποθέτηση φιαλιδίων. Εάν τα κύτταρα παραμείνουν στους -80 o C θα πρέπει να ξεπαγώσουν σε διάστημα όχι περισσότερα από ένα χρόνο καθώς μειώνεται δραματικά η βιωσιμότητα των κυττάρων ύστερα από μεγαλύτερης διάρκειας αποθήκευσης τους. Πλήρης θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών: DMEM high glucose stable glutamine, 5-10 % fetal bovine serum (FBS), 1x penicillin-streptomycin ιάλυμα ψύξης: FBS, 10% DMSO 6.4 Καλλιέργεια εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού. Για την καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων χρειάζεται ειδικό θρεπτικό που αποτρέπει την τυχαία διαφοροποίηση τους ενώ στο τρυβλίο καλλιέργειας προστίθεται διάλυμα ζελατίνης 0.1% σε ίδια ποσότητα με αυτή που τοποθετείται το θρεπτικό υλικό και επωάζεται για 1 ώρα στον επωαστικό θάλαμο. Αναρροφάται το διάλυμα, ξεπλένεται το τρυβλίο δύο φορές με PBS και Αναρροφάται το PBS μέχρι το τρυβλίο στεγνώσει εντελώς (σχηματίζονται σταγονίδια PBS λόγω της ζελατίνης, πρέπει να αναρροφηθούν και αυτά). Παρασκευή διαλύματος ζελατίνης 0.1%: 0.2g ζελατίνης (Gelatin Sigma cat. no. G1890-100G) αναδιαλύονται με 200mL PBS. Στην συνέχεια το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο και φυλάσσεται στους 4 o C. Θρεπτικό μέσω για την καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων E14 (mescs) (για 100mL): 83mL GMEM BHK-12 (Invitrogen cat. no. 21710-025) 10mL Stem Cell Quality FBS (10%) (Invitrogen cat. no. 16141-061) 1 ml NEAA (non essential amino acids) (1%) (Invitrogen cat. no. 11140-035) 1 ml Sodium Pyruvate (1%) (Invitrogen cat. no. 11360-039) 98

Μέθοδοι 3.3mL Sodium Bicarbonate (3.3%) (Invitrogen cat. no. 25080-060) 1mL L-Glutamine (1%) (Invitrogen cat. no. 25030-024) 500 μl penicillin/streptomycin (0.5%) (Invitrogen cat. no. 15140-122) 100 μl β-mercaptoethanol (0.1%) (Invitrogen cat. no. 31350-010) 10000 U LIF (Santa Cruz, LIF hba cat. no. sc-4988). 6.4 Διαφοροποίηση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων προς νευρικά βλαστικά και μεσόδερμα Διαφοροποίηση προς νευρικά βλαστικά: 5 15 10 4 κύτταρα στρώνονται σε κάθε πηγάδι από το 6well plate και προστίθεται θρεπτικό N2B27. Το θρεπτικό μέσο ανανεώνεται κάθε 2 μέρες. Το θρεπτικό N2B27 αποτελείται από ίσο όγκο DMEM/F12 με επιπρόσθετα 25 µg/ml insulin, 100 µg/ml apotransferrin, 6 ng/ml progesterone, 16 µg/ml putrescine, 30 nm sodium selenite και 50 µg/ml bovine serum albumin fraction V ( Gibco) και Neurobasal θρεπτικό με B27 (Gibco) (166,167). Διαφοροποίηση προς μεσόδερμα: Τα Ε14 εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται κυρίως προς μεσόδερμα όταν δεν υπάρχει ο παράγοντας LIF στο θρεπτικό μέσο. Παρασκευάζεται πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς LIF. Ικανός αριθμός κυττάρων 5 15 10 4 επιστρώνομται σε κάθε πηγάδι από το 6-well plate και προστίθεται θρεπτικό απουσία LIF. Το θρεπτικό μέσο ανανεώνεται κάθε 2 μέρες. Την τρίτη, πέμπτη και έβδομη μέρα συλλέγονται τα κύτταρα από κάθε πηγαδάκι. 6.5 Διαμόλυνση κυττάρων θηλαστικών με χρήση λιποσωμάτων (Lipofection) Σε κάθε πηγάδι ενός 6-well plate προσθέτουμε το 1/12 από τα κύτταρα μίας πλήρης Τ75 flask έτσι ώστε να έχουμε πληρότητα περίπου 90% την επόμενη μέρα σε κάθε πηγάδι μετά από επώαση στους 37 o C. Στον πυθμένα έχουμε τοποθετήσει στρογγυλές καλυπτρίδες που έχουν επικαλυφθεί με πολύλυσίνη για καλύτερη προσκόλληση των κυττάρων. Η επίστρωση των καλυπτρύδων με poly-d-lysine γίνεται ως εξής: Αραιώνονται 20µl πολυλυσίνης σε τελικό όγκο 10mL PBS 1x (50mg/mL) και το διάλυµα αυτό φιλτράρεται µε την χρήση συρριγικών φίλτρων 0.2µm. Στην συνέχεια οι καλυπτρίδες επωάζονται στο φιλτραρισµένο διάλυµα στους 37 o C για 15min. Τέλος οι καλυπτρίδες ξεπλένονται από την περίσσεια πολυλυσίνης µε εµβάπτιση σε ddh 2 O και στεγνώνουν. Για τη διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκε λιποφεκταμίνη, ένα πολυκατιονικό συνθετικό λιπίδιο αναμειγμένο με φωσφατιδυλο-αιθανολαμίνη. Το αντιδραστήριο αυτό συνδυαζόμενο με DNA, σχηματίζει λιποσώματα που συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων-στόχων και αποχύνουν το περιεχόμενο DNA στο εσωτερικό του κυττάρου. Την ημέρα της διαμόλυνσης αφαιρούμε προσεκτικά το θρεπτικό από κάθε πηγάδι και το αντικαθιστούμε με 2mL φρέσκο πλήρες θρεπτικό μέσο. Για κάθε πιγαδάκι του 6-well με κύτταρα προς διαμόλυνση διαλύονται 2μg πλασμιδιακού DNA σε 500 μl Opti- MEM I Reduced Serum Media χωρίς αντιβιοτικά. Στην συνέχεια προστήθονται 5 μl Lipofectamine LTX Reagent στο παραπάνω διάλυμα Opti-MEM :DNA. Το μίγμα αναμιγνύται και επωάζεται 30min σε θερμοκρασία δωματίου για να σχηματιστούν τα 99

Μέθοδοι συσσωματώματα DNA-Lipofectamine LTX. Μετά το πέρας της επώασης το προστίθεται μίγμα κατευθείαν σε κάθε πηγάδι. Το μίγμα αναμιγνύεται με απαλή κίνηση του τρυβλίου προς-πίσω. Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 Ο C μέσα σε CO 2 επωαστήρα για 18-24 ώρες. Για την διαμόλυνση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού (Ε14) με esirna έναντι του PNLDC1 mrna χρησιμοποιήθηκε Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogene) ακλουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. 6.6 Μονιμοποίηση κυττάρων που περιέχουν φθορίζουσα πρωτεΐνη Το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο απομακρύνεται και τα κύτταρα πλένονται 2 φορές με PBS και μονιμοποιούνται με την προσθήκη 1 ml παραφορμαλδευδης 4%. Ακολουθείται επώαση 10 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια τα κύτταρα πλένονται με PBS 5 min, υπό ήπια ανάδευση δύο φορές. Η μεμβράνη των κυττάρων διαρρηγνύεται με την προσθήκη 1 ml διαλύματος 0,3% Triton (διαλυμένο σε PBS 1x) και τα κύτταρα επωάζονται για 5 min, υπό ανάδευση. Το διάλυμα Triton 0.3% πρέπει κάθε φορά να είναι φρέσκο. Λόγω αυξημένου ιξώδους το Triton είναι παχύρευστο και για την προσθήκη του χρησιμοποιείται κομμένο πλαστικό ρύγχος. Ακολούθως οι καλυπτρίδες εμβαπτίζονται σε διάλυμα Hoechst 1:2000 για την παρατήρηση σε UV μικροσκόπιο φθορισμού (NIKON ZEIS) ή Draq5 (1/1000) για την παρατήρηση στο συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica TCS SP5 με καταδιτικό φακό 63x 1.4NA). Ακολουθεί ξέπλυμα (σε PBS 1x) για 2 min, δύο φορές. Για παρατήρηση στο συνεστιακό μικροσκόπιο οι καλυπτρίδες στερεώνονται στις αντικειμενοφόρους με moviol (Polyvinyl-alchool) ως μονιμοποιητικό μέσο. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η λογισμικό ImageJ (http://imagej.net/welcome) και η λειτουργία Coloc2 του ιδίου προγράμματος. 6.7 Χορήγηση 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνης σε κυτταρικές σειρές Ο απομεθυλιωτικός παράγοντας 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνη, ως νουκλεοσιδικό ανάλογο ενσωματώνεται στο DNA κατά την αντιγραφή, αναστέλλοντας τις μεθυλοτρανσφεράσες DNMT και κατ επέκταση μεθυλίωση του DNA (Εικόνα 45). Καλλιέργειες κυττάρων σε 10 cm τρυβλίο με αρχική πληρότητα 20-30% αναπτύσσονται τρεις μέρες σε πλήρη θρεπτικό υλικό παρουσία η απουσία 100μΜ 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνης κάθε μέρα γίνεται αλλαγή με φρέσκο υλικό το οποίο περιέχει 100μΜ του φαρμάκου. Την τρίτη μέρα τα κύτταρα πλένονται με 10mL PBS και απομονώνεται το ολικό RNA. Εικόνα 45 Χημική δομή του φαρμάκου 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνη 100

Μέθοδοι 7. Μέθοδοι απομόνωσης και ελέγχου RNA από κύτταρα και ιστούς 7.1 Απομόνωση RNA από τα κύτταρα με τη χρήση προτυποποιημένων στηλών (Ambion) Αρχικά γίνονται οι απαραίτητες ανασυστάσεις των αντιδραστηρίων όπως περιγράφονται και απαιτούνται από το εγχειρίδιο χρήσης (RNAqueous kit, Ambion). Στην περίπτωση που το αρχικό υλικό είναι κύτταρα προστίθενται 500 μl Lysis/Binding solution σε 10 2-10 7 κύτταρα ιστού, και ανακινούνται έντονα. Στην περίπτωση που το αρχικό υλικό είναι ιστός προστίθενται 500 μl Lysis/Binding solution σε 50 mg ιστού και ο ιστός ομογενοποιείται με μικρό ομογενοποιητή T8 Ultra Turrax. Για να μη δημιουργηθεί πρόβλημα στην ροή της στήλης το ομοιογενοποίημα φυγοκεντρείται στα 15000x g για 3 min και συλλέγεται το υπερκείμενο σε νέο σωλήνα. Στο στάδιο αυτό είναι σημαντικό ο ιστός να μην εκτίθεται καθόλου σε θερμοκρασία δωματίου πριν την ομογενεποίηση του προς αποφυγή υδρόλυσης του RNA. Στο ομοιογενοποίημα προστίθεται ίσος όγκος 64% αιθανόλης και αναμιγνύεται απαλά. Από το μίγμα αυτό μεταφέρονται έως 700 μl στη στήλη και φυγοκεντρείται στις 15.000x g για 1 min. Το διήθημα απορρίπτεται και η διαδικασία επαναλαμβάνεται εάν χρειάζεται. Στην συνέχεια προστίθενται 700 μl Wash Solution #1 και φυγοκεντρείται. Το διήθημα απορρίπτεται και στην στήλη προστίθενται 500 μl wash solution #2/3 και φυγοκεντρείται. Το διήθημα απορρίπτεται. Το βήμα αυτό (με wash solution #2/3) επαναλαμβάνεται άλλη μία φορά. Στην συνέχεια η στήλη καθαρίζεται από τυχόν σταγονίδια και ξεραίνεται με μία επιπλέον φυγοκέντρηση 2min. Η στήλη μεταφέρεται σε νέο σωλήνα Eppendorf και προστίθενται 50 μl (40-60μl) elution solution το οποίο έχουμε προθερμάνει 70-80 ο C. Προσοχή να πέσει στο κέντρο της στήλης. Φυγοκεντρείται στις 15000 x g για 1 min σε θερμοκρασία δωματίου και προστίθενται επιπλέον 50 μl (40-60μL) elution solution προθερμασμένο στους 70-80 ο C. Πέψη με DNase1 και απενεργοποίηση της: Προστίθεται 0.1X vol 10x DNase 1 Buffer (10μl) και 1 μl DNase 1 και το δείγμα επωάζεται για 30 min στους 37 ο C. Στην συνέχεια προστίθενται 0.1X vol DNase Inactivation Reagent (10μl) (Χρειάζεται vortex και ανάδευση κατά την αναρρόφηση) και επωάζεται για 2min σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος με φυγοκέντρηση στα 10.000x g 2 min κατακρημνίζεται το υλικό απενεργοποίησης και μεταφέρεται το υπερκείμενου σε νέο σωλήνα eppendorf. Εναλλακτικά μπορεί να απομονωθεί υψηλής ποιότητας RNA και με χρήση όξινου φαινολικού διαλύμα θειοκυανικής γουανιδίνης. H διαδικασία αυτή είναι βασισμένη στην μέθοδο των Chomczynski και Sacchi (168) στην οποία χρησιμοποιείται για ομογενοποίηση κυττάρων ή ιστού και εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων, όξινο φαινολικό διάλυμα θειοκυανικής γουανιδίνης TRIzol (Ambion). Είναι μία γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδος απομόνωσης RNA καθώς το δείγμα διαλυτοποιείται άμεσα σε συνθήκες που αποτρέπουν οποιαδήποτε υδρόλυση του RNA ενώ παράλληλα διαχωρίζεται από όλα τα υπόλοιπα συστατικά των 101

Μέθοδοι κυττάρων (DNA, πρωτεΐνες και λιπίδια). Για τα βήματα της απομόνωσης ακολουθείται το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το RNA φωτομετρείται στα 260 και 280 nm και υπολογίζεται ο λόγος OD260/OD280. Η ποιότητα του RNA ελέγχεται με την χρήση Bioanalyzer ενώ εάν χρειαστεί μπορεί να πραγματοποιηθεί συμπύκνωση του RNA με κατακρήμνιση έπειτα από προσθήκη 0.1 Χ vol. 5Μ οξικό αμμώνιο και 0.01-0.02 X vol. γραμμικό ακρυλαμίδιο και αναδεύεται ή εναλλακτικά προστίθεται 0.1 X vol οξικό αμμώνιο 3Μ ph 5.2 παρουσία 2-2.5 Χ vol. απόλυτης αιθανόλης. Το δείγμα τοποθετείται -80 o C για 30min προκειμένου να επιτευχθεί η κατακρήμνιση και ακολούθως φυγοκεντρείται στα 15000 x g για 30min στους 4 o C. Απομακρύνεται το υπερκείμενο και προστίθεται 70% αιθανόλη και φυγοκεντρείται εκ νέου στα 15000 x g για 10min στους 4 o C. Το ίζημα που περιέχει το RNA επαναδιαλύεται σε 60μL elution solution ή Η 2 Ο ελεύθερο νουκλεασών. Η επαναδιάλυση διευκολύνεται με επώαση στους 65 ο C για 5min με τακτικές αναδεύσεις. 7.2 Έλεγχος ποιότητας του απομονωμένου RNA Ποσότητα (2-3μl) από κάθε δείγμα αραιώνεται με νερό (1:200-1:300) σε τελικό όγκο 600μl. Γίνεται φωτομέτρηση στα 260 και 280nm για τον έλεγχο παρουσίας πρωτεϊνών. Χρησιμοποιείται κυβέτα χαλαζία. Ο επιθυμητός λόγος OD 260 / OD 280 είναι μεγαλύτερος από 1,8. Η συγκέντρωση του RNA προκύπτει από την ακόλουθη σχέση: O.D. 260 x συντελεστής αραίωσης x 40 =ng/ μl RNA Η ακεραιότητα του RNA διαπιστώνεται με ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιείται στη συσκευή BioAnalyzer της Agilent. Όταν στο ηλεκτροφόρημα υπάρχουν μόνο δύο ζώνες, το RNA θεωρείται ότι δεν έχει διασπαστεί από ριβονουκλεάσες. Η προετοιμασία και ηλεκτροφόρηση γίνεται βάσει του εγχειριδίου Agilent bioanalyzer RNA 6000 Nano Assay Protocol. Εικόνα 46 Το chip ανάλυσης RNA (Α), η συσκευή Bioanalyzer (Β) και ένα χαρακτηριστικό χρωματογράφημα ολικού RNA οπου διακρίνονται οι κορυφές ακέραιου ριβοσωμικού RNA (Γ) 102

Μέθοδοι 8. Ανάλυση με μικροσυστοιχίες DNA Οι μικροσυστοιχίες DNA χρησιμοποιούνται για την μελέτη των επιπέδων έκφρασης πολλών γονιδίων ταυτόχρονα. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν μικροσυστοιχίες από την εταιρεία One Array και καλύπτουν 32,679 γονίδια. Η προετοιμασία δειγμάτων για τον υβριδισμό στις μικροσυστοιχίες αλλά και ανάλυση η σάρωση τους περιγράφονται στο παράρτημα. Από την τελική ανάλυση προκύπτουν ένα αρχείο csv ή gpr που περιέχει πλήθος πληροφορίες για την ένταση του κάθε φθοριοχρώματος, την ένταση του σήματος θορύβου, τις αναλογίες εκπομπής κάθε φθοριοχρώματος και πλήθος στατιστικών παραμέτρων. Τελικά γίνεται τακτοποίηση βάση των παραμέτρων που μας ενδιαφέρουν (Log2 Fold change και p_value) για να επιλέξουμε μία λίστα γονιδίων που παρουσιάζουν μεταβολή. Το λεπτομερές πρωτόκολλο της διαδικασίας αναφέρεται στο παράρτημα της παρούσας διατριβής. Εικόνα 47 Ο σαρωτής PerkinElmer ProScanArray που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη H ανάλυση του μεταγραφώματος των κυττάρων HEK293T έγινε στην πλατφόρμα ScanArray Express της PERKIN ELMER χρησιμοποιώντας το λογισμικό της εταιρείας και τα αποτελέσματα της ανάλυσης επιβεβαιώθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, όπως περιγράφεται πιο κάτω. 9. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Real time PCR, QPCR) είναι μία ποσοτική μέθοδος όπου ανιχνεύεται σε κάθε κύκλο αντίδρασης της PCR (σε πραγματικό χρόνο) το παραγόμενο προϊών (δίκλωνο DNA) λόγο της παρουσίας στην αντίδραση μία φθορίζουσας χρωστικής που φθορίζει όταν προσδένεται σε δίκλωνο DNA. Η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη της ποσότητας του δίκλωνου DNA (αυξάνεται εκθετικά σε μία PCR) και αποτυπώνεται σε ένα διάγραμμα έντασης φθορισμού/κύκλων. Ο κύκλος όπου ξεπερνάει το κατώφλι είναι αντιπροσωπευτικός της αρχικής ποσότητας του γονιδίου που μελετάται. Ο αριθμός αυτός (Ct Value) είναι η τιμή που λαμβάνεται υπόψη για την ποσοτικοποίηση. H καμπύλη φτάνει σε κορεσμό σε σχέση με την παραγωγή προϊόντος (ενίσχυση του τμήματος ενδιαφέροντος) καθώς καταναλώνονται τόσο οι εκκινητές και νουκλεοτίδια. Το υπόστρωμα 103

Μέθοδοι για μία Real time PCR μπορεί να είναι είτε cdna είτε RNA. Στην περίπτωση που το υπόστρωμα είναι RNA η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιείται στην ίδια αντίδραση με την PCR (περιέχει και αντίστροφη μεταγραφάση) και ονομάζεται one-step RT-QPCR όπου εκκινητής για την αντίστροφη μεταγραφή είναι ο REVERSE εκκινητής που χρησιμοποιείται στην αντίδραση της PCR. Αντίδραση one step με το KAPASYBR FAST One-Step qrt-pcr Kit στο MxPro3000: Αντιδραστίριο Τελική Συγκέντρωση Όγκος Nuclease-free water 7.4 µl KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix (2X) 1X 10 µl Forward Primer (10 µm) 200 nm 0.4 µl Reverse Primer (10 µm) 200 nm 0.4 µl ROX Low 5.7 nm 0.4 µl KAPA RT Mix (50X) 1X 0.4 µl Template RNA 50ng/μl 0.25ng/μl 1 µl Στην περίπτωση όπου το υπόστρωμα μας είναι cdna η αντίδραση ονομάζεται QPCR. Το cdna παρασκευάζεται με υπόστρωμα RNA όπου χρησιμοποιούνται είτε oligodt εκκινητές είτε εκκινητές με τυχαία αλληλουχία (random hexamers) (βλέπε ενότητα Αντίστροφη μεταγραφή). 20 μl αντίστροφης μεταγραφής αραιώνεται ανάλογα με τον αριθμό των αντιδράσεων που πρόκειται να πραγματοποιηθούν μέχρι και 1/10 αραίωση. Μια τυπική αντιδράση με το KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix στην πλατφόρμα MxPro3000 (Agilent) περιλαμβάνει το εξής μίγμα αντιδραστηρίων: Αντιδραστήριο Τελική Συγκέντρωση Ποσότητα Nuclease-free water 7.8 µl KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix (2X) 1X 10 µl Forward Primer (10 µm) 200 nm 0.4 µl Reverse Primer (10 µm) 200 nm 0.4 µl ROX Low 5.7 nm 0.4 µl Template cdna Diluted cdna 1 µl Η χρωστική ROX χρησιμοποιείται προαιρετικά για την εξομάλυνση των σφαλμάτων αλλά και μετρήσεων του μηχανήματος. Στο Mx3000P χρησιμοποιείται η ROX Low. 104

Μέθοδοι Εικόνα 48 Η πλατφόρμα Mx3000P (Agilent) που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή και μία χαρακτηριστική γραφική παράσταση φθορισμού σε σχέση με τους κύκλους αντίδρασης Σχεδιασμός πειράματος συγκριτικής ποσοτικοποίησης: Σε ένα πείραμα Real time PCR συνήθως συγκρίνονται τα επίπεδα έκφρασης ενός γονιδίου σε διαφορετικά δείγματα (Comparative Quantitation). Για κάθε δείγμα εκτός από το προς μελέτη γονίδιο (Gene Of Interest, GOI) μετράται και ένα γονίδιο αναφοράς ή γονίδιο κανονικοποιητής (normalizer, NORM). Κάθε αντίδραση πραγματοποιείται 3 φορές. Γονίδια που χρησιμοποιούνται για NORM είναι το actinb, ενώ για τα πειράματα διαφοροποίησης στα βλαστικά κύτταρα ποντικού το tubb5. Οι θερμοκρασίες αντίδρασης εξαρτώνται από την πολυμεράση τους εκκινητές και την συσκευή που χρησιμοποιείται: Βήμα Θερμοκρασία Διάρκεια Κύκλοι Σύνθεση cdna (1) 42 5 min 1 Αρχική αποδιάταξη 95 3 min 1 Αποδιάταξη 95 3 sec 40 Υβριδισμός/επέκταση (2) 60 30 sec Καμπύλη αποδιάταξης (3) 55 30 sec 1 95 1 min 1 95 30 sec 1 (1) Το πρώτο βήμα (42 ο C 5 min) αφορά την αντίστροφη μεταγραφή και συμπεριλαμβάνεται στο πρόγραμμα μόνο στην περίπτωση του One-Step qrt-pcr όπου το RNA είναι το αρχικό υπόστρωμα της αντίδρασης. (2) Στο τέλος κάθε κύκλου επέκτασης μετράται ο φθορισμός. (3) Κατά την τελική αποδιάταξη για την εύρεση της καμπύλης αποδιάταξης η θερμοκρασία από 55 ο C στους 95 o C ανεβαίνει σταδιακά και μετράται ο φθορισμός για κάθε βαθμό θερμοκρασίας που ανεβαίνει. Κατόπιν της αντίδρασης τα δεδομένα τα οποία είναι οι κύκλοι (τιμές Ct) εξάγονται και τακτοποιούνται σε φύλο excel. Στην πρώτη στήλη εισάγονται τιμές Ct από τις αντιδράσεις με το γονίδιο αναφοράς (Normalizer) π.χ act. Στην πρώτη γραμμή εισάγονται όλα τα δεδομένα από τα δείγματα αναφοράς (Calibrator) π.χ. από κύτταρα σε φυσιολογικές συνθήκες. Στην δεύτερη στήλη εισάγεται σε όλα τα κουτάκια η τιμή Ct του Normalizer του 105

Μέθοδοι δείγματος αναφοράς. Ακολουθούν οι τιμές Ct από τα προς μελέτη δείγματα. Στην τρίτη στήλη εισάγονται οι τιμές Ct από το γονίδιο προς μελέτη (Gene of interest, GOI) για τα αντίστοιχα δείγματα (Εικόνα 49). Εικόνα 49 Αναπαράσταση συγκριτικής ποσοτικοποίησης δεδομένων από Real time PCR σε φύλλο εργασίας του Excel Με τον τύπο 2 -ΔΔCt υπολογίζεται η διαφορά της έκφρασης του γονιδίου του προς μελέτη δείγματος από το δείγμα αναφοράς. Προς μελέτη δείγμα: ΔCt=Ct GOI -Ct NORM Δείγμα αναφοράς: ΔCt=Ct GOI -Ct NORM ΔΔCt=ΔCt Προς μελέτη δείγμα ΔCt Δείγμα αναφοράς Έκφραση γονιδίου του προς μελέτη δείγματος/έκφραση γονιδίου του δείγματος αναφοράς = 2 -ΔΔCt = 2 - ((Ct GOI -Ct NORM ) Προς μελέτη δείγμα - (Ct GOI -Ct NORM ) Δείγμα αναφοράς ). Σε ένα συγκεκριμένο πείραμα με ένα δείγμα αναφοράς και ένα ή περισσότερα δείγματα που θα συγκριθούν ξεχωριστά με το δείγμα αναφοράς παραδείγματος χάριν όταν συγκρίνονται δύο κυτταρικές σειρές με την επίδραση διαφορετικού φαρμάκου σε σχέση με μία κυτταρική σειρά που δεν έχει επωαστεί με φάρμακο πραγματοποιούνται οι υπολογισμοί για κάθε πειραματικό αντίγραφο και προκύπτουν για κάθε ένα από αυτά μία τιμή διαφορικής έκφρασης. Στην συνέχεια μπορεί να κατασκευαστεί διάγραμμα με τις τιμές αυτές και να απεικονίζονται και τα σφάλματα. 10. Next generation sequencing σε πλατφόρμα Ion Torrent (Life Technologies) Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η πλατφόρμα ION TORRENT (Εικόνα 50) που βασίζεται στην αλληλούχηση μέσω χρήσης ημιαγωγών για την ανίχνευση μεταβολής διαφοράς δυναμικού. Η τεχνολογία αυτή στηρίζεται στην ανίχνευση των ιόντων Η + που παράγονται σε κάθε αντίδραση ενσωμάτωσης ενός νουκλεοτιδίου κατά τον πολυμερισμό της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA. Εν συντομία σε ένα μικροπηγάδι ενός πλακιδίου 318 chip εναποτίθεται ένα σφαιρίδιο που φέρει το προϊών της PCR από έναν μοναδικό κλώνο cdna. Το μικροπηγάδι περιέχει και DNA πολυμεράση. Κάθε κύκλος αντίδρασης περιλαμβάνει την ροή πάνω από όλα τα μικρο-πηγάδια διαλύματος ενός από τα τέσσερα τριφοσφωρικά νουκλεοτίδια (dntp). 106

Μέθοδοι Εικόνα 50 Η τεχνολογία Ion Torrent στηρίζεται στην ανίχνευση των Η + που παράγονται σε κάθε αντίδραση ενσωμάτωσης ενός νουκλεοτιδίου (Α) κατά την διάρκεια πολυμερισμού των μορίων cdna σε ένα chip (B) και γίνεται με την συσκευή ION PGM (Γ) Εάν το νουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό με το προέχων νουκλεοτίδιο της αντιγραφόμενης αλυσίδας DNA ενσωματώνεται κατά τον πολυμερισμό της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA. Αυτό προκαλεί την απελευθέρωση ενός πυροφοσφωρικού και ενός Η + το οποίο διεγείρει έναν ανιχνευτή ιόντων διεγειρόμενου πεδίου ο οποίος με την σειρά του διεγείρει έναν κοινό ημιαγωγό σαν τους ημιαγωγούς της μνήμης RAM. Έτσι η τεχνολογία αυτή μετατρέπει ένα χημικό σήμα σε ηλεκτρικό άμεσα χωρίς να παρεμβάλλεται οπτική μέτρηση και επεξεργασία όπως στις άλλες τεχνολογίες. Με το πέρας της αντίδρασης το chip ξεπλένεται και περνάει διαφορετικό νουκλεοτίδιο. Η τεχνολογία αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολλούς σκοπούς. Για παράδειγμα, με την αλληλούχιση πολλών προϊόντων PCR από συγκεκριμένα τμήματα του γονιδιώματος (amplicon sequencing) μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην διάγνωση αφού δίνει την δυνατότητα γρήγορης και ταυτόχρονης ανίχνευσης όλων των πιθανών μεταλλάξεων που εμπλέκονται σε ασθένειες. Εικόνα 51 318 chip με το οποίο έγινε αλληλούχιση cdna βιβλιοθηκών από εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού 107

Μέθοδοι Μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης για την ταυτοποίηση όλων των μικροοργανισμών από ένα σωματικό υγρό για άμεση διάγνωση και θεραπεία αλλά και για την αλληλούχιση του γονιδιώματος ενός μη χαρακτηρισμένου μικροοργανισμού στην έρευνα. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε για μελέτη των επιπέδων έκφρασης γονιδίων σε βλαστικά κύτταρα μετά από αποσιώπηση του γονιδίου PNLDC1. Αναλυτικό πρωτόκολλο αλληλούχισης μορίων mrna βρίσκεται στο παράρτημα της παρούσας διατριβής (Πρωτόκολλο αλληλούχισης μορίων mrna με την πλατφόρμα ION TORRENT). Στην Εικόνα 51 απεικονίζεται το chip to οποίο περιέχει 11,287,275 πηγαδάκια στα οποία γίνεται αλληλούχιση. Με το τέλος της αλληλουχισης κατεβάζουμε από τον server το αρχείο fastq το οποίο περιέχει της όλες της αλληλουχίες και αναλύουμε στον διαδικτυακό τόπο 108

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αποτελέσματα 1. Το γονίδιο PNLDC1 ανιχνεύεται στα γονιδιώματα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών Το γονίδιο PNLDC1 (Refseq ID: NM_173516) στον άνθρωπο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και διαθέτει όλα τα απαραίτητα χαρακτηριστικά για να κωδικοποιήσει μία πρωτεΐνη όπως κωδικόνιο έναρξης και τερματισμού, στοιχεία απαραίτητα για μάτισμα κυρίως όμως καταχωρημένα EST στην βάση δεδομένων του NCBI (169). Το γονίδιο αυτό φαίνεται να υπάρχει στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Εικόνα 52). Η ομπαράθεση όλων των προβλεπόμενων πρωτεϊνών στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (βλέπε παράρτημα/ομοπαράθεση) δείχνει ότι η PNLDC1 είναι πάρα πολύ συντηρημένη. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι το γονίδιο είναι λειτουργικό και κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη με σημαντική δράση. Εικόνα 52 Εξελικτικό δέντρο της πρωτεΐνης PNLDC1 στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Για την αρχική μελέτη και την in silico ανάλυση της πρωτεΐνης PNLDC1 πραγματοποιήθηκε ομοπαράθεση της αλληλουχίας με τις αλληλουχίες της humanparn και mouseparn χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο CLUSTAL W. Από την ομοπαράθεση αυτή φαίνεται ότι οι δύο πρωτεΐνες (PARN και PNLDC1) παρουσιάζουν σημαντική ομολογία. Πιο συγκεκριμένα παρουσιάζεται ομολογία με την περιοχή νουκλεάσης της PARN, όπου 90 αμινοξέα από τα 303 είναι πανομοιότυπα στις δύο πρωτεΐνες (Εικόνα 53).

Αποτελέσματα Εικόνα 53 Ομοπαράθεση αλληλουχίας της ανθρώπινης PNLDC1 με την PARN του ανθρώπου και του ποντικού για τις οποίες υπάρχουν κρυσταλλογραφικά δεδομένα. Με πράσινο χρώμα φαίνεται η περιοχή νουκλεάσης, με κόκκινο η περιοχή R3H και με κυανό η RRM περιοχή σύμφωνα με τις κρυσταλλικές δομές της PARN. Η περιοχή νουκλεάσης της ανθρώπινης PARN είναι μία δομημένη περιοχή για την οποία υπάρχουν τόσο κρυσταλλογραφικά όσο και λειτουργικά δεδομένα. Έτσι με τα 111

Αποτελέσματα δεδομένα αυτά πραγματοποιήθηκε περαιτέρω βιοπληροφορική ανάλυση της πρωτεΐνης PNLDC1 και κατασκευή μίας πιθανής δομής του ενζύμου για να συγκριθεί με τα βιοχημικά δεδομένα της παρούσας μελέτης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω στον άνθρωπο το γονίδιο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 στην περιοχή q25.3 με συντεταγμένες chr6 160141290-160161725 στον θετικό κλώνο (+). Το συνολικό μήκος του γονιδίου ανέρχεται στις 20.44 Kb και φαίνεται να παράγει δύο μετάγραφα μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Η διαφορά αυτή οφείλεται σε αλλαγή του πρώτου εξονίου με αποτέλεσμα οι δύο πρωτεΐνες που παράγονται να διαφέρουν στο αμινοτελικό άκρο. Πιο συγκεκριμένα η ισομορφή 1 (60.124 kda) προέρχεται από την συνένωση 18 εξωνίων ενώ η οσομορφή 2 (61.311 kda) προέρχεται από την συνένωση 19 εξωνίων. Το αρχικό πεπτίδιο του αμινοτελικού άκρου MFCTRGLLFFAFLA της ισομορφής 1 το οποίο κωδικοποιείται από ένα εξόνιο αλλάζει σε MDVGADEFEESLPLLQELVQEADFV στην ισομορφή 2 το οποίο κωδικοποιείται από δύο εξόνια (Εικόνα 54). Εικόνα 54 Δομή του γονιδίου PNLDC1 που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6. Το συνολικό μήκος του γονιδίου αυτού είναι 20.44 Kb. Ανάλογα με το μάτισμα μπορεί να περιλαμβάνει 18 ή 19 εξόνια Είναι χαρακτηριστικό ότι η ισομορφή 2 είναι η πιο συντηρημένη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αφού οι περισσότεροι οργανισμοί παρουσιάζουν μία πρωτεΐνη που ταυτίζεται με αυτή (βλέπε παράρτημα/ομοπαράθεση). Επιπρόσθετα στην παρούσα μελέτη μελετάται το γονίδιο Pnldc11 στο ποντίκι για το οποίο υπάρχουν δεδομένα μόνo για μία πρωτεΐνη η οποία έχει το ίδιο αμινοτελικό άκρο με την ισομορφή 2 του ανθρώπου. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του γονιδίου είναι ότι βρίσκεται σε μία περιοχή του χρωμοσώματος 6 όπου υπάρχουν πολλές νησίδες CpG στους προαγογείς των γονιδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι πιθανό να βρίσκεται υπό επιγενετικό έλεγχο της έκφρασής του μέσω μεθυλίωσης. 112

Αποτελέσματα 2. Μελέτες έκφρασης του γονιδίου PNLDC1 υποδηλώνουν επιγενετικό έλεγχο μέσω μεθυλίωσης Προκειμένου να ελέγξουμε την έκφραση του γονιδίου PNLDC1 προχωρήσαμε σε μελέτες έκφρασης του γονιδίου σε κυτταρικές σειρές HEK293T και HaCaT. Παρόλα αυτά δεν ήταν δυνατόν να ανιχνευθεί με PCR. Επιπλέον, προσπάθειες ανίχνευσης της PNLDC1 μέσω ανοσοαποτύπωσης χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης δεν απέφεραν αποτέλεσμα. Μετά από προσεκτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων της βιοπληροφορικής ανάλυσης πραγματοποιήσαμε μελέτες ανίχνευσης της έκφρασης του γονιδίου μετά από απομεθυλίωση. Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω το γονίδιο PNLDC1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και ο προαγωγέας περιέχει CpG νησίδες που μεθυλιώνονται σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου και περιφερικά κύτταρα αίματος (39). Για να ελεγχθεί αν η έκφραση και των δύο ισομορφών του ανθρώπινου γονιδίου αυξάνεται με απομεθυλίωση, κύτταρα HEK293 T επωάστηκαν με τον απομεθυλιωτικό παράγοντα 5-Aza-Deoxycytidine. Απομονώθηκε ολικό RNA και πραγματοποιήθηκε ημιποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Οι forward εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι PNLDC1_1F NheI και PNLDC1_2F NheI οι οποίοι υβριδοποιούνται στην αρχή του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης, περιοχή η οποία είναι μεταβλητή ανάμεσα στις δύο ισομορφές. Για reverse εκκινητής χρησιμοποιήθηκε ο PNLDC1R ο οποίος ανιχνεύει και τις δύο ισομορφές αφού υβριδοποιείται μετά την μεταβλητή περιοχή. Με απομεθυλίωση του DNA επάγεται η έκφραση και των δύο ισομορφών του γονιδίου PNLDC1 ενώ δεν επηρεάζεται η έκφραση του παράλογου γονιδίου parn και της αποαδενυλάσης CNOT7 (Εικόνα 55). 800 bp 600bp 400 bp 200 bp Εικόνα 55 Τα προϊόντα της ημιποσοτικής PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5 % για να επιβεβαιωθεί η ειδική ενίσχυση τμήματος των επιθυμητών γονιδίων. ιαδροµές 2,4,6,8: Μη επεξεργασμένα κύτταρα µε εκκινήτες ακτίνης, PNLDC1, PARN και CNOT7 αντίστοιχα. ιαδροµές 3,5,7,9: Επεξεργασμένα µε φάρμακο κύτταρα µε εκκινητές ΑΚΤΗΝΗΣ, PNLDC1, PARN, και CNOT7 αντίστοιχα Δεν έχει αναφερθεί επιγενετικός έλεγχος για τις αποαδενυλάσες PARN και CNOT7, ενώ εκφράζονται στα περισσότερα είδη κυττάρων. Μετά από απομεθυλίωση των κυττάρων ΗΕΚ293 δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων αυτών. Η PARN και η CNOT7 είναι δύο σημαντικές αποαδενυλάσες που εμπλέκονται στην 113

Αποτελέσματα ανακύκλωση των μορίων mrna όλων των κυττάρων και σε βασικές κυτταρικές διαδικασίες παρόλο που μπορεί να εμπλέκονται και σε πιο ειδικές διαδικασίες σε επίπεδο οργανισμού. Η απουσία της έκφρασης του γονιδίου PNLDC1 και η δραματική αύξηση μετά από χορήγηση του φαρμάκου 5 Aza-deoxycytidine υποδηλώνει στενό επιγενετικό έλεγχο ενώ παράλληλα ταυτοποιείται η έκφραση και των δύο ισομορφών. Εκτός όμως από την επιβεβαίωση της έκφρασης και των δύο ισομορφών το πείραμα αυτό πραγματοποιήθηκε και για να για να κλωνοποιηθεί η δεύτερη ισομορφή που όπως αναφέρθηκε προηγουμένως διαφέρει στην αμινοτελική περιοχή όπου ενδεχομένως το υδρόφοβο τμήμα που βρίσκεται στην ισομορφή 1 να επηρεάζει την απομόνωση με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου. Το γεγονός ότι μία πρωτεΐνη που ενδεχομένως εμπλέκεται στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης με το να αποικοδομεί mrna, ρυθμίζεται επιγενετικά μέσω μεθυλίωσης του προαγωγέα υποδηλώνει την πιθανή συμμετοχή της σε μηχανισμούς που εμπλέκονται στην εμβρυογένεση και διαφοροποίηση. Ο στενός έλεγχος του γονιδίου με αυτόν τον μηχανισμό οδήγησε στην μελέτη της διαφορικής έκφρασής του τους ιστούς του ποντικού. 3. Το γονίδιο Pnldc1 παρουσιάζει ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης Οι περισσότερες αποαδενυλάσες όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή φαίνεται να εκφράζονται σε όλους τους τύπους ιστών στον άνθρωπο, λόγω του σημαντικού τους ρόλου σε βασικές διεργασίες του κυττάρου. Διαφορές στα επίπεδα της έκφρασης ορισμένων αποαδενυλασών ανάμεσα σε διαφορετικούς ιστούς έχουν αναφερθεί για ορισμένες αποαδενυλάσες. Η CNOT6 και CNOT6L, εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στη καρδιά, στον πλακούντα, στους σκελετικούς μυς, στο πάγκρεας και στους όρχεις ενώ λιγότερη έκφραση παρουσιάζουν στο συκώτι, στους νεφρούς, στον σπλήνα, στο θύμο, στον προστάτη, στα ωοθυλάκια στο λεπτό έντερο και στα λευκοκύτταρα (όπου εκφράζεται μονό η CNOT6L), ενώ δεν εκφράζονται στον εγκέφαλο, στους πνεύμονες και στο κόλον (60). Η CNOT7 και POP2 ανιχνεύονται στους περισσότερους ιστούς ενώ εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στη καρδιά και στο πάγκρεας. Η CNOT7 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στου σκελετικούς μυς, οπού η CNOT8 εκφράζεται σε πολύ βασικά επίπεδα. Το γεγονός ότι το γονίδιο PNLDC1 δεν εκφράζεται υπό φυσιολογικές συνθήκες σε κυτταρικές σειρές ΗΕΚ και HaCaΤ, και υπόκειται σε στενό έλεγχο μέσω μεθυλίωσης του προαγωγέα οδήγησε στην μελέτη της έκφρασης του σε ιστούς. Αρχικά απομονώθηκαν βασικοί ιστοί (ήπαρ, πάγκρεας, νεφροί, καρδιά, πνεύμονες, εγκέφαλος, μυϊκός ιστός, λιπώδεις ιστός, σπλήνας, εντερικός ιστός, όρχεις και ωοθήκες). Πραγματοποιήθηκε real time PCR με του εκκινητές mpl1f και mpl1r προκειμένου να γίνει τόσο συγκριτική αλλά και απόλυτη ποσοτικοποίηση στους ιστούς. Σημαντική έκφραση εντοπίστηκε κυρίως στα εσωτερικά αναπαραγωγικά όργανα (όρχεις και ωοθήκες). Αντίθετα από τις άλλες αποαδενυλάσες η PNLDC1 δεν φαίνεται να εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς. Οι ιστοί στους οποίους εκφράζεται η PNLDC1 διακρίνονται για το γεγονός ότι περιλαμβάνουν γαμετικά βλαστικά κύτταρα. To γεγονός αυτό αποτέλεσε ισχυρή ένδειξη ότι το γονίδιο μπορεί να εκφράζεται στα συγκεκριμένα κύτταρα. 114

Relative Quantity [%] Αποτελέσματα 100 50 0 Testis Ovaries Skin Brown adipose tissue White adipose tissue Spleen Intestines Liver Pancreas Kidney Heart Lung Brain Muscle Εικόνα 56 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου Pnldc1 σε διάφορους ιστούς Η μεγάλη έκφραση της PNLDC1 στα εσωτερικά αναπαραγωγικά όργανα όπου υπάρχουν τα κύτταρα της γαμετικής σειράς οδήγησε στην μελέτη της έκφρασης του γονιδίου σε εμβρυϊκά κύτταρα ποντικού E14. Παράλληλα απομονώθηκαν βλαστικά κύτταρα του μυελού των οστών, μεσεχγυματικά βλαστικά κύτταρα και οστεοβλάστες. Υψηλή έκφραση του γονιδίου εντοπιστικέ στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (Εικόνα 57). Η παρατήρηση αυτή ήταν εξαιρετικά σημαντική για την μετέπειτα μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου ενώ το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το ότι δεν εκφράζεται στους ιστούς δίνει βαρύτητα στην λειτουργία του γονιδίου σε ένα επίπεδο παραπάνω από τις βασικές διεργασίες του κυττάρου. Εικόνα 57 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου Pnldc1 σε εμβρυονικά και και αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα 115

Αποτελέσματα Τα τελευταία χρόνια γίνεται μία προσπάθεια να αποσαφηνιστεί ό ρόλος των γονιδίων που εκφράζονται ειδικά στα βλαστικά κύτταρα λόγω της προοπτικής της χρήσης των κυττάρων αυτών στην αναγεννητική ιατρική. Στη συνέχεια η έκφραση του γονιδιού αυτού στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα οδήγησε στην μελέτη των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου κατά τα στάδια ανάπτυξης του εμβρύου. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης σε έμβρυα 6.5, 10.5 και 15.5 ημερών και συγκρίθηκαν με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Στην Εικόνα 58 φαίνονται τα σχετικά επίπεδα έκφρασης σε λογαριθμική κλίμακα προκειμένου να είναι ευδιάκριτη η μείωση των επιπέδων έκφρασης κατά τα στάδια της ανάπτυξης αφού η έκφραση στα έμβρυα τις πρώτες 6 μέρες μειώνεται σε επίπεδα 4% της έκφρασης στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Εικόνα 58 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου pnldc1 σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια εμβρύου ποντικού ο άξονας Y αριθμείται λογαριθμικά προκειμένου να φανούν οι διαφορές στα αναπτυξιακά στάδια του εμβρύου Παρατηρείται σταδιακή μείωση της έκφρασης του γονιδίου στα στάδια της ανάπτυξης του εμβρύου. Παρόλο που ορισμένες αποαδενυλάσες έχουν σχετιστεί με την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση, δεν παρουσιάζουν διαφορικά πρότυπα έκφρασης κατά την ανάπτυξη του εμβρύου και πιο σημαντικά καμία αποαδενυλάση δεν έχει συσχετιστεί αποκλειστικά με τις διαδικασίες αυτές. 116

Αποτελέσματα 4. Η έκφραση του Pnldc1 εντοπίζεται σε πρώιμα γαμετοτοκύτταρα Ο επιγενετικός έλεγχος του Pnldc1 και η ιστοειδική έκφραση οδήγησε στην ιστολογική μελέτη του ενζύμου προκειμένου να ταυτοποιηθούν τα συγκεκριμένα κύτταρα που εκφράζουν την PNLDC1. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα διαθέσιμα αντισώματα τα οποία όμως είναι πολυκλωνικά και δεν έχει επιβεβαιωθεί η ειδικότητα τους ως προς την PNLDC1. Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι το Rabbit anti PNLDC1 (ACRIS AP53365PU-N) το οποίο στοχεύει την περιοχή 456-486 της ανθρώπινης PNLDC1. To αντίσωμα έχει παρασκευαστεί χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο συνθετικό πεπτίδιο ίδιο με ίδια αλληλουχία με την περιοχή αυτή της PNLDC1. Η αγχιστεία για την PNLDC1 επιβεβαιώθηκε σε αποτύπωση κατά Western μόνο με υπερεκφρασμένη PNLDC1 από τα στάδια του καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου. Για την ανοσοιστοχημεία χρησιμοποιήθηκαν βιοψίες από ασθενή με σεμίνωμα (συχνότερος τύπος καρκίνου των όρχεων) οι οποίες περιλαμβάνουν και φυσιολογικό ιστό. Εικόνα 59 Ανοσοϊστοχημική χρώση τομών παραφίνης με αντίσωμα Rabbit-anti PNDC1 οπού φαίνεται έντονη χρώση στα γαμετικά κύτταρα Όπως φαίνεται στην Εικόνα 59 η PNLDC1 εκφράζεται στο εσωτερικό των σπερματικών πόρων και ειδικότερα στα σπερματοκύτταρα. Η έκφραση της PNLDC1 στα σπερματοκύτταρα επιβεβαιώνει την συσχέτιση με την βιολογία των βλαστικών κυττάρων και είναι λογική εφόσον εκφράζεται σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, όρχεις και ωοθήκες. Ωστόσο στις τομές αυτές παρατηρήθηκε έντονη έκφραση στα λεία μυϊκά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι το γονίδιο αυτό δεν εμπλέκεται μόνο στην βιολογία των βλαστικών κυττάρων και των γαμετικών αλλά και σε άλλα πιο διαφοροποιημένα κύτταρα. Ενδεχομένως η έκφραση να αυξάνεται σε ειδικές περιπτώσεις διαφοροποίησης συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων. 117

Αποτελέσματα Εικόνα 60 Ανοσοϊστοχημική χρώση τομών παραφίνης με αντίσωμα Rabbit-anti PNDC1 οπού φαίνεται έντονη χρώση στα λεία μυϊκά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων Στην Εικόνα 60 διακρίνεται η πολύ έντονη χρώση γύρο από τον πυρήνα των λείων μυϊκών κυττάρων. Η ακεραιότητα των κυττάρων αυτών στις τομές δίνουν μία καλύτερη εικόνα εντοπισμού που επιβεβαιώνει την παρατήρηση με συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού όπου φαίνεται έντονος εντοπισμός της πρωτεΐνης γύρο από τον πυρήνα (Εικόνα 80). Στην τομή αυτή φαίνονται τα καρκινικά κύτταρα του όγκου τα οποία είναι αρνητικά για την χρώση. Παρόλο αυτά γύρω από τον όγκο διακρίνεται χρώση που όμως δεν μπορεί να διακριθεί εάν είναι ειδική και τι είδους κύτταρα είναι αυτά. Α Β Εικόνα 61 Ανοσοιστοχημεία τομών παραφίνης με αντίσωμα Rabbit-anti PNDC1 όπου φαίνεται ότι τα κύτταρα του όγκου δεν εκφράζουν PNLDC1 (A) ενώ υπάρχει χρώση περιμετρικά του όγκου μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του στρώματος (B) Είναι γνωστό ότι τον όγκο περιβάλουν και διεισδύουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η διαφοροποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού είναι μία περίπλοκη διαδικασία και τυχόν εμπλοκή της PNLDC1 αποτελεί εξαιρετικά ενδιαφέρον γεγονός που χρήζει περεταίρω διερεύνησης. Επειδή το αντίσωμα είναι πολυκλωνικό για την 118

Αποτελέσματα επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοφθορισμού σε τομές όρχεων από ποντίκι. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με διαφορετικό αντίσωμα (Goat anti PNLDC1, SC Biotech sc-243835) που παρασκευάστηκε με τον ίδιο τρόπο για την αμινοτελική περιοχή της PNLDC1 ενώ θεωρητικά αντιδρά και με την mousepnldc1. Με τις εικόνες ανοσοφθορισμού επιβεβαιώνονται τα αποτελέσματα τόσο για τα σπερματοκύτταρα τόσο και για τα λεία μυϊκά κύτταρα. Εικόνα 62 Ανοσοφθορισμός τομών όρχεων (σπερματικοί πόροι) από ποντίκι με αντίσωμα Goat anti PNLDC1 και δεύτερο αντίσωμα Alexa568 anti-goat. Οι τομές βάφτηκαν και με DAPI για χρώση των πυρήνων Ο ανοσοφθορισμός τομών όρχεων από ποντίκι με αντίσωμα Goat anti PNLDC1 και δεύτερο αντίσωμα Alexa568 anti-goat έδειξε πως στους σπερματικούς πόρους φθορισμός να εντοπίζεται γύρω από τους πυρήνες των γαμετικών κυττάρων (Εικόνα 62). Εικόνα 63 Ανοσοφθορισμος τομών όρχεων (τριχοειδή αγγεία) από ποντίκι με αντίσωμα Goat anti PNLDC1 και δεύτερο αντίσωμα Alexa568 anti-goat. Οι τομές βάφτηκαν και με DAPI για χρώση των πυρήνων. Ο φθορισμός εντοπίζεται γύρω από τους πυρήνες των λείων μυϊκών κυττάρων των αγγείων Παρατηρείται επίσης έντονη χρώση γύρω από τους πυρήνες των λείων μυϊκών κυττάρων των αγγείων επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας. 119

Αποτελέσματα 5. Κλωνοποίηση-Απομόνωση και κατάσταση ολιγομερισμού της PNLDC1 Αφού επιβεβαιώθηκε η παρουσία της PNLDC1 σε συγκεκριμένα κύτταρα και ιστούς το επόμενο βήμα ήταν να χαρακτηριστεί το ένζυμο και να αναπτυχθεί μία αποτελεσματική μέθοδος απομόνωσης ανασυνδυασμένου ενζύμου και μελέτης της δραστικότητας. Οι βέλτιστες συνθήκες απομόνωσης της PNLDC1 έχουν βρεθεί από προηγούμενες μελέτες (Δ. Αναστασάκης Μεταπτυχιακή Εργασία 2011). Στην παρούσα διατριβή κλωνοποιήθηκε και η δεύτερη ισομορφή που έχει μία διαφορετική αλληλουχία στο αμινοτελικό άκρο και η mouse PNLDC1 η οποία παρουσιάζει στο αντίστοιχο αμινοτελικό άκρο ομολογία με την ανθρώπινη ισομορφή 2. Παράλληλα κλωνοποιήθηκε μία μεταλλαγμένη μορφή που αποτελείται από το ενεργό κέντρο του ενζύμου χωρίς την καρβοξυτελική περιοχή pet28δpnldc1(1-500). Oι τέσσερις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώθηκαν από 2L καλλιέργειες με επαγωγή της έκφρασης με 0.5mM IPTG. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν ταυτόχρονα σε θερμοκρασία 20 Ο C για 16 ώρες. Η πρωτεΐνες απομονώθηκαν με 1,5 ml στήλη νικελίου. Εικόνα 64 Ηλεκτροφορόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) δειγμάτων από κάθε στάδιο απομόνωσης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου. A:PNLDC1_1, B:PNLDC1_2,Γ: PNLDC1_1 1-500, Δ: mousepnldc1 Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκε η δεύτερη ισομορφή του ανθρώπου εφόσον παρουσιάζει σχετικά καλή εικόνα απομόνωσης. Καθώς είναι η πρώτη φορά που χαρακτηρίζεται η συγκεκριμένη πρωτεΐνη είναι απαραίτητο να ταυτοποιηθεί ότι η πρωτεΐνη που παρουσιάζεται στο επιθυμητό μέγεθος είναι πράγματι η PNLDC1. Με την 120

Αποτελέσματα χρωματογραφία συγγένειας είναι δυνατόν να απομονώνονται βακτηριακές πρωτεΐνες ιδίως στην περίπτωση που η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη βρίσκεται σε μεγάλο ποσοστό στα αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια και έτσι από το διαλυτό εκχύλισμα προσδένονται στην στήλη άλλες πρωτεΐνες με λιγότερη συγγένεια. Καθώς το συγκεκριμένο ένζυμο δεν έχει προηγουμένως χαρακτηριστεί είναι απαραίτητη η ταυτοποίηση των προϊόντων απομόνωσης με αποτύπωση κατά WESTERN. Για επιβεβαίωση ότι η πρωτεΐνη που απομονώνεται είναι η PNLDC1 πραγματοποιήθηκε αποτύπωση κατά WESTERN με το αντίσωμα Rabit anti PNLDC1 (ACRIS AP53365PU-N). Εικόνα 65 Ανοσοαποτύπωση των βημάτων απομόνωσης της PNLDC1_2 με αντίσωμα Rabit anti PNLDC1 Για τον περαιτέρω καθαρισμό ακολουθήθηκαν δύο τρόποι καθαρισμού με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Στην μία περίπτωση χρησιμοποιήθηκε στήλη 10/400mm παρασκευασμένη στο εργαστήριο με υλικό πλήρωσης Sephacryl S-200 HR. Με την στήλη αυτή δεν διαχωρίζονται πρωτεΐνες με παρόμοιο μοριακό βάρος. Με την στήλη Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) είναι δυνατόν να διαχωριστούν πρωτεΐνες με παρόμοιο μοριακό βάρος και να απομονωθεί καθαρή ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. Τα κλασματα καθαρής πρωτείνης συλλέχθηκαν χωριστά και ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή ακρυλαμιδίου 10%. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε χρώση για να ταυτοποιηθεί το μέγεθος και η καθαρότητα της πρωτεΐνης και υποβλήθηκε σε δοκιμασία αποαδενυλίωσης παρουσία του συνθετικού υποστρώματος Ν9Α15 για να ταυτοποιηθεί η δραστικότητα πολύ καθαρών κλασμάτων πρωτεΐνης (Εικόνα 66). Με τον τρόπο αυτό αποφεύγεται η μη ειδική υδρόλυση από τυχών νουκλεάσες του βακτηριακού εκχυλίσματος. Οι συνθήκες αντίδρασης είναι 20 mm HEPES, ph 7, 75 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 37 o C οι οποίες είναι συνηθισμένες για αντιδράσεις αποαδενυλίωσης ενώ η συγκέντρωση της πρωτεΐνης μεταβάλλεται ανάλογα με την συγκέντρωση της σε κάθε κλάσμα. 121

Αποτελέσματα Εικόνα 66 (Α) Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης σε στήλη Superdex 200 10/300 GL. Στο διάγραμμα φαίνεται η απορρόφηση στα 260nm του εκλούσματος κατά την διάρκεια της χρωματογραφίας (Β) ανάλυση των πρωτεϊνών από τα κλάσματα και (Γ) δοκιμή δραστικότητας Από την εικόνα φαίνεται ότι τα 3 κλάσματα παρουσιάζουν δραστικότητα αποαδενυλάσης ενώ στα προηγούμενα κλάσματα δεν φαίνεται ειδική υδρόλυση του RNA υποστρώματος. Η καθαρότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης είναι σημαντική για τον μετέπειτα χαρακτηρισμό της καθώς μη ειδική υδρόλυση από νουκλεάσες του βακτηριακού εκχυλίσματος μπορεί να μην κάνουν επιτρεπτή την ανίχνευση της ειδικής υδρόλυση ειδικά στην περίπτωση ενός αργού επεξεργαστικού ενζύμου όπως η PNLDC1. Εικόνα 67 Κατανομή του μεγέθους των μακρομορίων σε διάλυμα καθαρής ανασυνδυασμένης PNLDC1 με μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός 122

Αποτελέσματα Από πειράματα Δυναμικής σκέδασης φωτός (Dynamic light scattering, DLS) με την οποία προσδιορίζεται το μέγεθος των σωματιδίων σε ένα διάλυμα διαπιστώθηκε ότι η ανασυδυασμένη πρωτεΐνη παρουσίαζε διάμετρο των 10nm όσο είναι και η διάμετρος του θεωρητικού μοντέλου της PNLDC1 ως διμερές (Εικόνα 67). Για τις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε Zetasizer Nano ZS (Malven Instruments). Στο σημείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι μελέτες φυσικοχημικών παραμέτρων της PARN η οποία έχει μάζα 74 kda, έδειξαν ότι παρουσιάζει μέγιστη διάμετρο 10.9 nm επιβεβαιώνοντας την κρυσταλλική δομή όπου η PARN σχηματίζει ομοδιμερή (170). To γεγονός ότι η PNLDC1 παρουσιάζει 10 nm μέγιστη διάμετρο είναι μία ισχυρή ένδειξη ότι το ένζυμο αυτό βρίσκεται ως ομοδιμερές μέσα στο διάλυμα. 6. Βιοχημικός χαρακτηρισμός PNLDC1 6.1 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών in vitro δραστικότητας Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή οι αποαδενυλάσες που έχουν χαρακτηριστεί μέχρι τώρα εξαρτώνται από Mg 2+ και μονοσθενή κατιόντα. Οι βέλτιστες συνθήκες δραστικότητας των DEDD αποαδενυλασών έχει αναφερθεί ότι είναι συνήθως κυμαίνονται κοντά στις φυσιολογικές συγκεντρώσεις των ιόντων μέσα στο κύτταρο (171). Τα Mg 2+ δεσμεύονται στις περιοχές του ενεργού κέντρου σύμφωνα με την διάταξη που παρουσιάζουν τα τέσσερα όξινα συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπά του (DEDD). Παρόλα αυτά για την περίπτωση της PARN είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι στην διαθέσιμη κρυσταλλική δομή δεν έχει περιγραφεί η παρουσία ιόντων Mg 2+ (74). Αφού επιβεβαιώθηκε η διαδικασία απομόνωσης στην συνέχεια έγινε έλεγχος για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών όπου η PNLDC1 παρουσιάζει την μέγιστη δραστικότητά της in vitro προκειμένου οι συνθήκες αυτές να χρησιμοποιηθούν για τη περαιτέρω βιοχημική ανάλυση του ενζύμου. Για κάθε παράγοντα αντίδρασης (NaCl, MgCl 2, ph και θερμοκρασία) για τον οποίο γινόταν έλεγχος για την εύρεση της καλύτερης τιμής, το διάλυμα αντίδρασης παρέμενε αμετάβλητο (20 mm HEPES-ΚΟΗ, ph 7.5, 75 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 37 o C) πλην της μεταβαλλόμενου παράγοντα. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου που αφορούσαν την hparn είχαν δείξει ότι το ρυθμιστικό HEPES-KOH ήταν το καταλληλότερο. Παρόλα αυτά στην βιβλιογραφία αναφέρονται επίσης ρυθμιστικά διαλύματα με βάση το Tris-HCl ph 7.8 (67). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 68 οι βέλτιστες συνθήκες είναι για το ph μεταξύ 7.5 και 8 ενώ για το Μg 2+ συγκεντρώσεις από 0,5 έως 2 δεν φαίνεται να έχουν μεγάλη διαφορά στην ταχύτητα. Όσον αφορά το NaCl, οι βέλτιστες συγκεντρώσεις είναι μεταξύ 100 και 200 mm ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία είναι 37 ο C. Ανάλογες μελέτες για άλλες αποαδενυλάσες έχουν δείξει παρόμοιες απαιτήσεις (117). 123

Αποτελέσματα Εικόνα 68 Εύρεση ιδανικών συνθηκών in vitro αποαδενυλίωσης από την PNLDC1_2 Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε αντίδραση παρουσία του συνθετικού υποστρώματος σε διαφορετικούς χρόνους. Το υπόστρωμα Ν9Α15 που χρησιμοποιήθηκε για τον σκοπό αυτό είναι ένα συνθετικό υπόστρωμα παρόμοιο με άλλα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για τον χαρακτηρισμό ανάλογων ενζύμων. Η εικόνα αντίδρασης ενός τέτοιου υποστρώματος σε βάθος χρόνου μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για το πώς δρα το συγκεκριμένο ένζυμο. Εικόνα 69 Αυτοραδιογραφία προϊόντων δοκιμής ενζυμικής δραστικότητας παρουσία συνθετικού υποστρώματος Ν9Α15 σε διαφορετικούς χρόνους επώασης 124

Αποτελέσματα Πραγματοποιήθηκε αντίδραση αποαδενυλίωσης σε συνθήκες 20 mm HEPES, ph 7.5, 100 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 37 o C με συγκέντρωση ενζύμου 0.1μM. Η PNLDC1 υδρολύει την oligo(a) ουρά του συνθετικού υποστρώματος (Εικόνα 69). Στην αυτοραδιογραφία απεικονίζεται το συνθετικό ολιγοριβονουκλεοτίδιο το οποίο υδρολύεται από το 3 άκρο μέχρι το τέλος της oligo(a) ουράς υποδηλώνοντας την προτίμηση του ενζύμου για τα αδενιλικά. Παρόμοια in vitro χαρακτηριστικά υδρόλυσης παρουσιάζουν τα ένζυμα της κατηγορίας αυτής. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των αποαδενυλασών είναι ότι καταλύουν την αντίδραση υδρόλυσης της τελευταίας αδενοσίνης και συνεχίζουν στην επόμενη με σταθερό ρυθμό χωρίς απαραίτητα να αποδεσμεύονται και να δεσμεύονται εκ νέου στο υπόστρωμα. Η ιδιότητα των ενζύμων να επαναλαμβάνουν κύκλους κατάλυσης χωρίς να αποδεσμεύονται από το πολυμερές υπόστρωμα αναφέρεται ως processivity (επεξεργασιμότητα) για να διαχωρίζει από την έννοια της κοινής ενζυμικής κατάλυσης. Αυτό δίνει την ιδιότητα στις αποαδενυλάσες να προσδένονται σε ένα υπόστρωμα και να ρυθμίζουν τη μοίρα των mrna σαν ένα ροοστάτη ανάλογα με τη ρύθμιση που οι ίδιες επιδέχονται. Με το τρόπο αυτό φαίνεται να δρουν η PARN, η CCR4, η CAF1, η NOC και η PDE12, τουλάχιστον in vitro και κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Για τον λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν αντιδράσης παρουσία του συνθετικού υποστρώματος N9A15 Αυξάνοντας την συγκέντρωση του ενζύμου στα 2 μμ (Εικόνα 70). Εικόνα 70 Αυτοραδιογραφία προϊόντων δοκιμής ενζυμικής δραστικότητας παρουσία συνθετικού υποστρώματος Ν9Α15 σε διαφορετικούς χρόνους επώασης σε συγκέντρωση 2μΜ ενζύμου O χαρακτηριστικός τρόπος με τον οποίο η PNLDC1 υδρολύει το συγκεκριμένο υπόστρωμα κάτω από τις συνθήκες δείχνει ότι δρα περισσότερο με επεξεργαστικό τρόπο. Στην αντίδραση αυτή τα μόρια του ενζύμου είναι πολύ παραπάνω (2μΜ) από τα μόρια του υποστρώματος (~10nM). Στις συνθήκες αυτές σε κάθε μόριο υποστρώματος έχει προσδεθεί ένα μόριο ενζύμου. 125

Αποτελέσματα 6.2 Εύρεση ειδικότητας ως προς το υπόστρωμα Στην συνέχεια για να ταυτοποιηθεί η δράση του ενζύμου πάνω στην poly(a) ουρά πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις παρουσία διαφορετικών συνθετικών υποστρωμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν μικρά συνθετικά μόρια RNA 12 νουκλεοτιδίων (U12,C12,G12 και Α12 αντίστοιχα), και ενός συνθετικού μονόκλωνου DNA 12 αδενινών (da12). Εικόνα 71 Αυτοραδιογραφία πηκτώματος ηλεκτροφόρησης προϊόντων ενζυμικής υδρόλυσης μικρών συνθετικών υποστρωμάτων Από τις αντιδράσεις αυτές φαίνεται η προτίμηση του ενζύμου για συνθετικό υπόστρωμα oligo(a). Εκτός από την υδρόλυση του συνθετικού ολιγοριβονουκλεοτιδου αδενοσίνης παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη υδρόλυση του ολιγοδεοξυριβονουκλεοτιδιου. Για να διερευνηθεί εάν αυτό αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου ενζύμου σε σχέση με την PARN πραγματοποιήθηκε αντίδραση παρουσία συνθετικού υποστρώματος μονόκλωνου DNA με ανασυνδυασμένη PARN και διαπιστώθηκε ότι και αυτή υδρολύει συνθετικό υπόστρωμα oligo(da). Εικόνα 72 Αυτοραδιογραφία πηκτώματος ηλεκροφόρησης προϊόντων ενζυμικής υδρόλυσης συνθετικού μονόκλωνου DNA da12 από τη PARN Η υδρόλυση DNA υποστρώματος από δύο RNA εξωνουκλεάσες αντικατοπτρίζει την εξέλιξη τους από την περιοχή με δραστικότητα εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης I. Στο μηχανισμό κατάλυσης δύο μεταλλικών ιόντων που έχει χαρακτηριστεί για την περιοχή 126

Αποτελέσματα 3-5 εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης I (Klenow fragment) η οποία υδρολύει με κατεύθυνση 3-5 την νεοσυντηθέμενη αλυσίδα του DNA όταν έχει εισαχθεί λάθος νουκλεοτίδιο. Τα αμινοξικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου παίζουν ρόλο στην διευθέτηση των ιόντων Μαγνησίου τα οποία σταθεροποιούν τα άτομα οξυγόνου της φωσφορικής ομάδας σε ένα επίπεδο σε σχέση με το φώσφορο καθιστώντας το ευάλωτο για επίθεση από το νερό. Προκειμένου να βρεθεί ο τρόπος δράσεις του συγκεκριμένου ενζύμου ήταν απαραίτητο να δοκιμαστούν υποστρώματα με διαφορετικές ιδιότητες π.χ. όπως κάποια δευτεροταγή δομή. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις παρουσία υποστρώματος trna ser(gcu) (Εικόνα 73) Εικόνα 73 Δομή του trna ser(gcu) (Α) Αυτοριαδιογραφία δοκιμής in vitro δραστικότητας της PNLDC1 σε σύγκριση με την PARN σε μόριο trna ser(gcu) Η PNLDC1 δεν φαίνεται να δρα πάνω σε μόρια trna. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει ότι έχει προτίμηση για poly(a) και ότι δεν φαίνεται να διεγείρεται η δράση της από κάποιες δομές που ενδεχομένως παίρνουν τα RNA μόρια. Αντιθέτως η PARN υδρολύει την 3 μη δομημένη ουρά του μορίου αυτού, ενώ φαίνεται να σταματά με το που συναντήσει το σημείο εκκίνησης του δίκλωνου τμήματος που είναι ο βραχίονας υποδοχής του αμινοξέος (acceptor stem). Παρόλο που η δραστικότητα της PARN έχει μελετηθεί εκτενώς, το φαινόμενο αυτό δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως στην βιβλιογραφία και αποτελεί εξαιρετικά ενδιαφέρον γεγονός και μπορεί να σχετίζεται με την δράση της PARN στην ωρίμανση των μορίων mirna (172). 6.3 Κινητική ανάλυση της PNLDC1 Πραγματοποιήθηκε κλασική κινητική Michaelis-Menten για την εύρεση της αγχιστείας του ενζύμου ως προς το συνθετικό υπόστρωμα Ν9Α15. Στην Εικόνα 74 απεικονίζεται το διάγραμμα Michaelis-Menten και το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου. 127

Αποτελέσματα Εικόνα 74 Διάγραμμα υποστρώματος Ν9Α15 Michaelis-Menten και διπλού αντιστρόφου της PNLDC1 παρουσία του Οι σταθερές Κm και k cat υπολογίστηκαν με την παραδοχή ότι το ένζυμο ακολουθεί κλασική κινητική Km=175± 21 nm k cat =1,7*10-3 * sec -1. Οι τιμές αυτές του ενζύμου από την μία φανερώνουν την υψηλή αγχιστεία του ενζύμου και την χαμηλή ταχύτητα κατάλυσης. Πραγματοποιώντας κινητική ανάλυση του ενζύμου για τα μικρά υποστρώματα τα οποία υδρολύει το συγκεκριμένο ένζυμο ταυτοποιήθηκε η υψηλή αγχιστεία του ενζύμου για το μονόκλωνο Α12 RNA (Εικόνα 75). Εικόνα 75 Συγκριτική κινητική ανάλυση παρουσία υποστρωμάτων Α12 και da12 Πραγματοποιήθηκε συγκριτική κινητική ανάλυση των δύο ολιγομερών Α12 και da12 και διαπιστώθηκε ότι η τιμή Κm είναι μικρότερη για το RNA ολιγομερές από ότι για το DNA ολιγομερές παρόλο που στις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες το ένζυμο παρουσίαζε μεγαλύτερη Vmax παρουσία του da12. Η αποτελεσματικότητα ενός ενζύμου υπολογίζεται από τον λόγο Κ cat /Km για κάθε υπόστρωμα. Έτσι η αποτελεσματικότητα για το RNA υπόστρωμα υπολογίζεται να είναι 1,8 φορές της αποτελεσματικότητας για το DNA υπόστρωμα. 128

Αποτελέσματα 7. Προσδιορισμός πιθανών δομικών χαρακτηριστικών της PNLDC1 Με βάση την ομολογία την hpnldc1 και mpnldc1 και στην συνέχεια με προσομοίωση μέσω μοριακής δυναμικής έγινε πρόβλεψη και σχεδιασμός της πιθανής δομή της περιοχής νουκλεάσης της hpnldc1. Εικόνα 76 Μοντέλο της περιοχής νουκλεάσης της ανθρώπινης PNLDC1 με το προσδεδεμένο υπόστρωμα στο ενεργό κέντρο Η προβλεπόμενη δομή της hpnldc1 επειδή έχει βασιστεί στη γνωστή δομή της hparn οποία σχηματίζει ομοδιμερές με δύο αντικριστά ενεργά κέντρα. H δομή της περιοχής νουκλεάσης της hpnldc1 σχηματίζεται από τα κατάλοιπα (Met)1 131(Arg) και (Leu)232 403(Ala) και παρουσιάζει 30% ομολογία (90/303 κατάλοιπα) με την περιοχή νουκλεάσης της hparn (PDB IDs: 2A1S και 2A1R). Υπολογισμοί των pka έδειξαν ότι τα κατάλοιπα Asp17 και στις δύο υπομονάδες είναι περίπου 8.5 8.9 με αποτέλεσμα να είναι σε πρωτονιομένη μορφή σε φυσιολογικό pη, ενώ το ίδιο συμβαίνει και για τα κατάλοιπα ιστιδίνης 255, 284 και 349, τα οποία θεωρήθηκαν πρωτονιωμένα στο μοντέλο. Όλα τα άλλα κατάλοιπα ιστιδίνης τέθηκαν σε φυσιολογική κατάσταση N δ1 or N ε2. Στην κατάσταση αυτή του ενεργού κέντρου της hpnldc1 τα κατάλοιπα Asp17 (Asp28 στην hparn) μπορεί να συνδέονται με δεσμό υδρογόνου με το Asp260 (Asp292), ενώ το His349 (His377) με τα Glu19 (Glu30) και Asp354 (Asp382). Μία σύγκριση των συντηρημένων καταλοίπων του ενεργού κέντρου φαίνεται στην (Εικόνα 77). Εκτός από τα κατάλοιπα που παίζουν ρόλο στον καταλυτικό μηχανισμό αρκετά άλλα είναι συντηρημένα που φαίνεται να παίζουν ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με το υπόστρωμα. Πιο συγκεκριμένα τα Phe31, Phe115, Ser112, Asn288 και Lys326 της hparn είναι συντηρημένα και στην hpnldc1 και φαίνεται να έχουν την ίδια διευθέτηση στο θεωρητικό μοντέλο με την μικρότερη ενέργεια. 129

Αποτελέσματα Εικόνα 77 Σύγκριση των καταλυτικών κέντρων της hparn (Α) και hpnldc1 (Β) με ένα τρινουκλεοτίδιο προσδεδεμένο όπως έχει αναγνωριστεί στην κρυσταλλική δομή της PARN (PDB ID 2A1R). Τα άτομα των πλευρικών αλυσίδων φαίνονται με κυανό οι άνθρακες ενώ με πορτοκαλί τα άτομα άνθρακα του RNA. Με μπλε φαίνονται τα άτομα αζώτου, με κόκκινο τα άτομα οξυγόνου και με χακί τα άτομα φωσφόρου Επιπρόσθετα η πιθανή δομή αποκάλυψε και την ύπαρξη μη συντηρημένων καταλοίπων στο ενεργό κέντρο, γεγονός που πιθανόν να σχετίζεται με τις καταλυτικές ιδιότητες του ενζύμου. Οι πιο σημαντικές διαφορές μεταξύ των ενεργών κέντρων της hparn και hpnldc1 φαίνονται στην Εικόνα 77. Η Gly29 (hparn) σε Ile18 (hpnldc1) η οποία είναι ανάμεσα σε δύο σημαντικά καταλυτικά κατάλοιπα Asp/Glu και παρεμποδίζει την κινητικότητα τους στο μοντέλο της hpnldc1. Το κατάλοιπο Ile34 στην hparn που αλληλεπιδρά με το RNA αντιστοιχεί στο Leu23 στην hpnldc1. Τα δύο κατάλοιπα Arg24 και Arg308 στην hpnldc1 μπορεί να αλληλεπιδρούν με το αρνητικά φορτισμένο υπόστρωμα και αντιστοιχούν στα πολικά αλλά όχι φορτισμένα κατάλοιπα Ser35 και Asn340 στην δομή της hparn. Άλλες διαφορές που μπορεί να επηρεάζουν την αλληλεπίδραση με το υπόστρωμα και τις καταλυτικές ιδιότητες του ενζύμου είναι τα κατάλοιπα Ala344 σε Leu312, Gln119 σεtyr107 και Leu291 σε Met259 μεταξύ της hparn και hpnldc1 αντίστοιχα. Η περιοχή διμερισμού της PARN παρουσιάζει ορισμένα κατάλοιπα που αλληλεπιδρούν και δεν υπάρχουν στην πιθανή περιοχή διμερισμού της hpnldc1. Η πιο σημαντική διαφορά είναι ότι τα κατάλοιπα Lys105 και Phe127 της hparn αλλάζουν σε Glu93 και Leu115 στην hpnldc1, αντίστοιχα (Εικόνα 78). Επιπλέον τα Cys108, Ile113, Phe123 και Arg128 της hparn αντιστοιχούν στα κατάλοιπα Phe96, Val101, Tyr111 και Lys116 στην hpnldc1. Ανάμεσα στα μη συντηρημένα κατάλοιπα τα Ile113 και Phe123 της hparn έχουν δείξει ότι είναι σημαντικά για τον διμερισμό ενώ η Phe127 φαίνεται να παίζει επίσης σημαντικό ρόλο. Από την άλλη τα Phe93 και Phe106 που παίζουν καθοριστικό ρόλο είναι συντηρημένα και στην hpnldc1. 130

Αποτελέσματα Εικόνα 78 Σύγκριση της περιοχής διμερισμού μεταξύ της hparn (άνθρακες των πλευρικών ομάδων σε πορτοκαλί χρώμα) και hpnldc1 άνθρακες των πλευρικών ομάδων σε κυανό χρώμα Μία άλλη αξιοσημείωτη διαφορά της PNLDC1 αποτελεί η απουσία των καταλοίπων που σχηματίζουν την περιοχή πρόσδεσης με το κάλυμμα και υπάρχουν στην PARN. Η PARN ξεχωρίζει από άλλες αποαδενυλάσες από το γεγονός ότι έχει την ικανότητα να προσδένεται στο 5 κάλυμα. Τα αμινοξικά κατάλοιπα που ευθύνονται για την ιδιότητα αυτή βρίσκονται διάσπαρτα στην RRM περιοχή της PARN που βρίσκεται κοντά στην καρβοξυτελική της περιοχή. Δομικές μελέτες με NMR έδειξαν ότι τα κατάλοιπα που αλληλεπιδρούν με το 5 κάλυμμα είναι τα K447, W449, D471, W468 (173). Παλαιότερη μελέτη έδειξε ότι η πρόσδεση του καλύμματος και ανάλογων μορίων του προκαλούν αλλοστερική ρύθμιση στη PARN. Πιο συγκεκριμένα χαμηλές συγκεντρώσεις ενεργοποιούν το ένζυμο ενώ αντίθετα οι υψηλές το αναστέλλουν (174). Εικόνα 79 Συνθετικό ανάλογο του καλύμματος (cap analogue) (Α) Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου της κινητικής ανάλυσης της PNLDC1 παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του αναλόγου (Β) 131

Αποτελέσματα Έτσι πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις παρουσίας διαφορετικών συγκεντρώσεων ενός ανάλογου του καλύμματος μορίου (Εικόνα 79) για την εύρεση πιθανής επίδρασης στην δράση της PNLDC1. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι η δραστικότητα της PNLDC1 δεν μεταβάλλεται από την παρουσία του cap ανάλογου υποδηλώνοντας ότι δεν περιέχει τα απαραίτητα δομικά στοιχεία για την πρόσδεση του καλύμματος. Αυτό έρχεται σε συμφωνία με την ανάλυση του μοντέλου της δομής που φαίνεται να μην παρουσιάζεται στο ένζυμο αυτό η αντίστοιχη περιοχή πρόσδεσης στο κάλυμμα. 8. Η PNLDC1 είναι μια αποαδενυλάση που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή ο ενδοκυττάριος εντοπισμός των αποαδενυλασών παίζει καθοριστικό ρόλο στην βιολογική τους λειτουργία. Η PNLDC1 δεν διαθέτει το πυρηνικό σήμα εντοπισμού που διαθέτει η PARN ενώ έχει δύο ισομορφές από τις οποίες η ισομορφή 1 διαφέρει στο αμινοτελικό άκρο τόσο από την ισομορφή 2 όσο και από την PARN. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υποκυττάριου εντοπισμού προκειμένουν να βρεθεί σε ποιο υποκυττάριο διαμέρισμα εντοπίζεται και δρα το συγκεκριμένο ένζυμο. Για τον σκοπό αυτό, παρασκευάστηκαν τα πλασμίδια pcdna3.1pnldc1_1egfp και pcdna3.1pnldc1_2egfp τα οποία δίνουν την δυνατότητα έκφρασης της PNLDC1 σε σύζευξη με την EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). Εικόνα 80 Υπoκυττάριος εντοπισμός PNLDC1_1EGFP και PNLDC1_2EGFP. Με πράσινο φαίνεται η πρωτεΐνη EGFP, με κόκκινο φαίνεται η πρωτεΐνη mturquiose2-er. Η χρώση της mturquiose2-er με κόκκινο είναι τεχνιτή για πιο εύκολη οπτική παρατήρηση και πιο ευδιάκριτο συνεντοπισμό. Με κυανό χρώμα διακρίνονται οι πυρήνες 132

Αποτελέσματα Τα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν για να διαμολύνουν κύτταρα HEK293T. Από τα αρχικά πειράματα παρατηρήθηκε μεγάλη συγκέντρωση της ανασυνδυασμενης υβριδικής πρωτεΐνης γύρω από τον πυρήνα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν με ταυτόχρονα διαμόλυνση πλασμιδίου που κωδικοποιεί μία μεταλλαγμένη φθορίζουσα turquoise πρωτεΐνη που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (mturquiose2-er). Στην Εικόνα 80 φαίνεται ότι και οι δύο ισομορφές της PNLDC1 αποκλείονται από τον πυρήνα αλλά εντοπίζονται κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. To αποτέλεσμα αυτό είναι διαφορετικό από τον υποκυττάριο εντοπισμό της PARN η οποία έχει δειχθεί ότι μπορεί να εντοπίζεται τόσο στο κυτταρόπλασμα, όσο και στον πυρήνα. Η διαφορά αυτή πιθανότατα αντικατοπτρίζει σημαντικές λειτουργικές ιδιαιτερότητες αναφορικά με τα υποστρώματα που αναγνωρίζουν. Είναι γνωστό ότι η PARN εμπλέκεται εκτός από την αποικοδόμηση μορίων mrna και στην βιογένεση και ωρίμανση mirnas μέσα στον πυρήνα γεγονός που απαιτεί την παρουσία της εντός του πυρηνικού περιβάλλοντος. Κάτι τέτοιο δεν φαίνεται να ισχύει στην περίπτωση της PNLDC1. 9. Η Pnldc1 παρουσιάζει μεταβαλλόμενο πρότυπο έκφρασης κατά την διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων Το αυξανόμενο ενδιαφέρον που αποκτά η βιολογία των βλαστικών κυττάρων επικεντρώνεται κυρίως σε παράγοντες που εκφράζονται ειδικά στα κύτταρα αυτά. Η υψηλή έκφραση του γονιδίου στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικού E14 σε συνδυασμό με τον στενό επιγενετικό έλεγχο που επιβεβαιώθηκε οδήγησαν στην προσπάθεια χρονικού προσδιορισμού της έκφρασης του γονιδίου αυτού κατά της πρώτες μέρες διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων. Η μοναδική αναφορά για την μεθυλίωση του προαγογέα του γονιδίου αφορά την μεθυλοτρανσφεράση 3b (DNMT3B) η οποία είναι μία de novo μεθυλοτρανσφεράση που καθορίζει πρότυπα μεθυλίωσης κατά την διαφοροποίηση των κυττάρων. Η μεθυλοτρανσφεράση αυτή βρέθηκε να αποσιωπά πλήρως το γονίδιο Pnldc1 μέσω μεθυλίωσης του προαγωγέα (175). Το γεγονός όμως ότι η μεθυλοτράνσφεράση αυτή εκφράζεται στα εμβρυϊκά κύτταρα σε πολύ υψηλότερα επίπεδα από τα σωματικά κύτταρα έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα μας που δείχνουν ότι η PNLDC1 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ενώ απουσιάζει από τα διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα. Για τον προσδιορισμό της έκφρασης του γονιδίου κατά την διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων E14 καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες που να επάγουν την διαφοροποίηση τους. Η πειραματική διαδικασία περιλάμβανε είτε την αφαίρεση του LIF (Leukemia inhibitory factor) από το θρεπτικό μέσο, γεγονός που προκαλεί τυχαία διαφοροποίηση των κυττάρων, κυρίως προς μεσοδερμικά κύτταρα είτε την προσθήκη θρεπτικού N2B27 που αποτελείται από ίσο όγκο DMEM/F12 με παράγοντες που οδηγούν τα κύτταρα προς νευρικά. Την τρίτη, πέμπτη και έβδομη μέρα συλλέχθηκαν τα κύτταρα απομονώθηκε ολικό RNA το οποίο μετατράπηκε σε cdna. Στην συνέχεια μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης που εμπλέκονται 133

Αποτελέσματα στην διατήρηση της βλαστικότητας αλλά και γονίδια που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση για να επιβεβαιωθεί η διαφοροποίηση. ενώ μελετήθηκε παράλληλα και η έκφραση του γονιδίου dnmt3b. Στην εεικόνα 81 παρουσιάζονται οι παράγοντες που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση των κυττάρων. Ο BMP2 αυξάνεται κατά την διαφοροποίηση των κυττάρων και όπως και ο παράγοντας Sonic Hedgehog ο οποίος είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας κατά την διαφοροποίηση των κυττάρων που κατευθύνονται προς νευρικά κύτταρα. Τέλος ο παράγοντας NANOG ο οποίος είναι γνωστός ότι εμπλέκεται στην βλαστικότητα των κυττάρων και αποτελεί έναν από τους παράγοντες Yamanaka. Ο παράγοντας αυτός μαζί με τους SOX2, KLF και OCT-4, ρυθμίζουν την μεταγραφή των παραγόντων πολυδυναμίας. Εικόνα 81 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων bmp2 Sonic Hedgehog και Nanog κατά την διαφοροποίηση βλαστικών κυττάρων E14 σε μεσοδερμικά και νευρικά κύτταρα Η συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων bmp2, shh και nanog επιβεβαιωνει την διαφοροποίηση των κυττάρων. H έκφραση του γονίδιου nanog μειώνεται ενώ των γονιδίων bmp2 και shh αυξάνεται. Πιο συγκεκριμενα η έκφραση του γονιδίου shh αυξάνεται περισσότερο στα κύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν στο θρεπτικό μέσο N2B27 επιβεβαιώνοντας την διαφοροποίηση τους προς νευρικά κύτταρα. Η αύξηση του παράγοντα αυτού στην περίπτωση της διαφοροποίησης προς νευρικά κύτταρα ήταν απαραίτητη για να επιβεβαιωθεί ότι τα κύτταρα αυτά δεν διαφοροποιούνται με τυχαίο τρόπο. 134

Αποτελέσματα Εικόνα 82 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης γονιδίων Pnldc1 Parn και Dnmt3b κατά την διαφοροποίηση βλαστικών κυττάρων E14 σε μεσοδερμικά και νευρικά κύτταρα Στην ίδια σειρά πειραμάτων το γονίδιο Pnldc1 παρουσιάζει αυξημένη έκφραση στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα κατά την πρώτη ημέρα και μειώνεται σταδιακά από τις πρώτες μέρες της διαφοροποίησης (Εικόνα 82). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η δράση της Pnldc1 είναι πολύ συγκεκριμένη σε σχέση με τις άλλες αποαδενυλάσες ενώ παράλληλα διερευνήθηκε ο ρόλος της Dnmt3b στον έλεγχο του γονιδίου Pnldc1. Η DNMT3B είναι μία μεθυλοτρανσφεράση η οποία καθορίζει τα πρότυπα μεθυλίωσης των κυττάρων de novo. Τις πρώτες μέρες της διαφοροποίησης αυξάνεται με αποτέλεσμα να μεθυλιώνει τον προαγωγέα του γονιδίου Pnldc1 και στην συνέχεια μειώνεται εφόσον έχει καθορίσει τα πρότυπα μεθυλίωσης. Στην συνέχεια άλλες μεθυλοτρανσφεράσες διατηρούν τα πρότυπα μεθυλίωσης συμπεριλαμβανομένου και του γονιδίου Pnldc1. Παράλληλα φαίνεται ότι τα συνολικά επίπεδα της PARN δεν μεταβάλλονται στο τέλος της διαφοροποίησης. 135

Αποτελέσματα 10. Έκφραση του pnldc1 σε διαφοροποιημένα κύτταρα μεταβάλει το πρότυπο έκφρασης των σημαντικότερων αποαδενυλασών Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, η ποικιλότητα των αποαδενυλασών και ο ρόλος τους δεν είναι ακόμη πλήρες κατανοητός. Πιθανόν οι αποαδενυλάσες να στοχεύουν σε διακριτές ομάδες mrna, και με αυτόν τον τρόπο ο ρόλος τους είναι διακριτός αλλά μπορεί επίσης διαφορετικές αποαδενυλάσες να στοχεύουν το ίδιο mrna. Έτσι οι αποαδενυλάσες έχουν διακριτές αλλά αλληλοεπικαλυπτόμενες δράσεις. Το γεγονός αυτό εγείρει δύο πολύ βασικά ερωτήματα. Το πρώτο σχετίζεται με το πoια μόρια mrna ή άλλα RNA (π.χ. mirna) στοχεύει η κάθε αποαδενυλάση και το δεύτερο εάν έχουν ανταγωνιστικές δράσεις οι αποαδενυλάσες μέσα στο κύτταρο. Αυτό φαίνεται ακόμα πιο ενδιαφέρον όταν πρόκειται για μία αποαδενυλάση η οποία υπόκειται σε αυστηρό έλεγχο στα διαφοροποιημένα κύτταρα. Για τον λόγο αυτό εκφράστηκε η πρωτεΐνη PNLDC1 σε διαφοροποιημένα κύτταρα με σκοπό την γονιδιωματική ανάλυση μέσω μικροσυστοιχίων arrays αλλά και ανάλυση των επιπέδων των άλλων αποαδενυλασών. Για το σκοπό αυτό εισήχθησαν σε κύτταρα HEK 293 πλασμίδια που εκφράζουν και τις δύο ισομορφές της PNLDC1 και αυτό γιατί έχει επιβεβαιωθεί όπως περιγράφθηκε παραπάνω η επαγωγή της έκφρασης και των δύο ισομορφών με απομεθυλίωση του DNA στα συγκεκριμένα κύτταρα. Τα κύτταρα συλλέχτηκαν μετά από 48 ώρες και αναλύθηκε η μεταβολή που η έκφραση αυτή επιφέρει στον σύνολο της γονιδιακής έκφρασης της συγκεκριμένης κυτταρικής σειράς με DNA arrays για να βρεθούν γονίδια που μεταβάλουν την έκφραση μετά από έκφραση της PNLDC1. Η σύγκριση έγινε σε σχέση με κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον ίδιο φορέα pcdna3.1 χωρίς ένθετο. Πραγματοποιήθηκε ανοσοαποτύπωση προκειμένου να επιβεβαιωθεί η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στα ΗΕΚ 293 (Εικόνα 83). 80 kda 60 kda Εικόνα 83 Ανοσοαποτύπωση σε εκχυλίσματα κυττάρων HEK 293 τα οποία διαμολύνθηκαν είτε με άδειο πλασμίδιο pcdna3.1 είτε με πλασμίδια που φέρουν τα ανασυνδυασμένα γονίδια PNLDC1_1 και PNLDC1_2 Αρχικά θελήσαμε να δούμε την επίδραση της έκφρασης της PNLDC1 στις άλλες αποαδενυλάσες. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση για της πιο σημαντικές ανθρώπινες αποαδενυλάσες (Εικόνα 84). Παρόλο που θα περίμενε κανείς η έκφραση της PARN να μεταβάλλεται η πιο σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν για τις αποαδενυλάσες CNOT6L και CNOT7. 136

log2 Fold change Αποτελέσματα 1.5 1.0 0.5 0.0-0.5 PARN PAN2 CNOT6 CNOT6L CNOT7 CNOT8 Εικόνα 84 Συγκριτική έκφραση γονιδίων μετά από έκφραση PNLDC1 σε κύτταρα HEK 293 Η αύξηση των επιπέδων της CNOT6L και CNOT7 είναι μία πολύ σημαντική παρατήρηση καθώς έχει αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες αυτές εμπλέκονται στην ανάπτυξη αλλά και στην αναπαραγωγή (176,177). Η PNLDC1 στα κύτταρα τα οποία εκφράζεται είναι πιθανόν να εμπλέκεται και στον έλεγχο άλλων αποαδενυλασών καθώς είναι πολύ συγκεκριμένη η έκφραση σε ιστούς και κύτταρα τα οποία έχουν να κάνουν με αναπαραγωγή και ανάπτυξη ενώ φαίνεται να ρυθμίζει την έκφραση του όταν εκφράζεται στις κυτταρικές σειρές. Τα πειράματα ανάλυσης της έκφρασης των γονιδίων μέσω μικροσυστοιχίων πραγματοποιήθηκαν δύο φορές ενώ από ανάλυση της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων επιλέχτηκαν αυτά με την μεγαλύτερη και στατιστικά σημαντική μεταβολή. Gene Id Name Log2 fold change znf138 Zinc finger protein 138 10,366 tsg101 Tumor susceptibility gene 101 protein 9,132 cnn3 Calponin-3 8,522 nkx3-1 Homeobox protein Nkx-3.1 8,345 thrb Thyroid hormone receptor beta 8,327 ctnna3 Catenin alpha-3 8,309 znf117 Zinc finger protein 117 8,096 pou4f3 POU domain, class 4, transcription factor 3 8,032 fshb Follitropin subunit beta 8,032 fam134b Reticulophagy receptor FAM134B 7,993 gpr143 G-protein coupled receptor 143 7,958 chchd1 Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein1 7,847 Πίνακας 3 Γονίδια των οποίων η έκφραση αυξήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293 που εκφράζουν PNLDC1 μετά από ανάλυση με DNA arrays Στον Πίνακας 3 απεικονίζονται τα γονίδια που παρουσίασαν σημαντική αύξηση της έκφρασης τους σε κύτταρα ΗΕΚ 293 που διαμολύνθηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν τις δύο ισομορφές PNLDC1. Είναι αξιοσημείωτο να αναφερθεί ότι από τα 12 γονίδια που 137

Αποτελέσματα παρουσίασαν την μεγαλύτερη αύξηση τα 5 γονίδια κωδικοποιούν παράγοντες μεταγραφής (znf138, thrb, znf117, pou4f3, nkx3-1), δύο γονίδια αφορούν παράγοντες ενδοκυτταρικής κυστιδίακής μεταφοράς (fam134b, tsg101) ενώ είναι χαρακτηριστική η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου fshb που κωδικοποιεί την β υπομονάδα της ορμόνης FSH η οποία είναι απαραίτητη για την ωογένεση και σπερματογένεση και γενικότερα για την λειτουργία των αναπαραγωγικών οργάνων. Το αποτέλεσμα αυτό συσχετίζεται άμεσα με το γεγονός ότι η PNLDC1 εκφράζεται στους αναπαραγωγικούς ιστούς, και με το ότι τα ιστολογικά δεδομένα δείχνουν να εκφράζεται σε πρώιμα σπερματοκύτταρα. Gene Id Name Log2 fold change bach1 Transcription regulator protein BACH1-2,585 exoc8 Exocyst complex component 8-2,593 znf167 Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 7-2,593 znf582 Zinc finger protein 582-2,603 atp5a1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 c alpha 1-5,088 mtf1 metal-regulatory transcription factor 1-5,15 gpr124 G protein-coupled receptor 124-5,184 aggf1 angiogenic factor with G patch and FHA domains 1-5,267 camsap1 calmodulin regulated spectrin-associated protein 1-5,322 prcp prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C) -5,358 mier3 mesoderm induction early response 1-5,427 psip1 PC4 and SFRS1 interacting protein 1-5,492 Πίνακας 4 Γονίδια των οποίων η έκφραση μειώθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293 που εκφράζουν PNLDC1 Την υπόθεση πιθανής συσχέτισης της λειτουργίας της PNLDC1 με την ρύθμιση της μεταγραφής ενισχύει το γεγονός ότι και από τα γονίδια που παρουσιάζουν την μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης, τα 5 αφορούν και πάλι μεταγραφικούς παράγοντες (bach1, znf167, znf582, mtf1, mier3 και psip1). Είναι ενδεικτικό ότι από τους παράγοντες αυτούς ο PSIP1 (PC4 and SFRS1 interacting protein 1) εμπλέκεται στην διαφοροποίηση των νευροεπιθηλιακών βλαστικών κυττάρων. Είναι πιθανόν δηλαδή όταν εκφράζεται η PNLDC1 να εμποδίζεται η διαφοροποίηση σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους γεγονός που να εξηγεί εν μέρει την παρουσία της στα αδιαφοροποίητα βλαστικά κύτταρα. Από τα αποτελέσματα αυτά είναι χαρακτηριστική επίσης η μείωση της ATP5A1 μίας μιτοχονδρικής ATP συνθάσης αλλά και της EXOC8 η οποία εμπλέκεται στην εξωκυττάρωση με κυστίδια. 138

Αποτελέσματα 11. Αποσιώπηση του Pnldc1 σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και NGS ανάλυση αποκαλύπτει σημαντικές μεταβολές στην έκφραση σημαντικών παραγόντων της πολυδυναμίας και της διαφοροποίησης Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τον ρόλο της αποαδενυλίωσης στην διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι υπάρχει μία δραματική μεταβολή του μήκους της poly(a) ουράς όλων των mrnas την στιγμή που διαφοροποιείται ένα κύτταρο με σκοπό να ελεγχτεί άμεσα η γονιδιακή έκφραση, επισημαίνοντας τον σημαντικότατο ρόλο αυτής της διαδικασίας στην διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων (178). Επιπλέον τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν μία πολύ ειδική έκφραση του γονιδίου Pnldc1 στα αδιαφοροποίητα κύτταρα αλλά και ότι είναι ένα ένζυμο που δρα διαφορετικά από την PARN τόσο στο γεγονός ότι δεν προσδένει το κάλυμμα των μορίων mrna αλλά και επειδή δρα σε διαφορετικό κυτταρικό διαμέρισμα και με ιδιαίτερο χαρακτηριστικά αλληλεπίδρασης με το RNA. Έχοντας υπόψη τα παραπάνω πραγματοποιήθηκε αποσιώπηση του γονιδίου Pnldc1 και ανάλυση με NGS για να μελετηθούν τα επίπεδα έκφρασης των όλων των γονιδίων προκειμένου να βρεθούν οι αλλαγές των προτύπων έκφρασης που να συνδέουν την νέα αυτή αποαδενυλάση με έναν πιθανό βιολογικό ρόλο κατά την διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων. Η πειραματική διαδικασία περιλάμβανε την διαμόλυνση των κυττάρων χρησιμοποιώντας RNAi MAX με sirna έναντι της PNLDC1 και στην συνέχεια συλλέχτηκαν τα κύτταρα από 24, 48, και 72 ώρες. Σε πρώτο βήμα επιβεβαιώθηκε η μείωση των επιπέδων της PNLDC1 ενώ παράλληλα μελετήθηκε και η PARN για την εύρεση πιθανής λειτουργικής συσχέτισης των γονιδίων αυτών αλλά και πιθανής ανταγωνιστικότητας μέσα στα κύτταρα. Στην Εικόνα 85 φαίνεται η μείωση των επιπέδων της PNLDC1 κυρίως στις 24 ώρες ενώ φαίνεται να αυξάνεται πάλι μετά τις 48 ώρες. Εικόνα 85 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου Pnldc1 μετά από διαμόλυνση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων με sirna που στοχεύει τα mrna της mpnldc1 139

Αποτελέσματα Αξιοσημείωτη είναι και η διαφορά των επιπέδων έκφρασης που παρουσιάζει το γονίδιο parn. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως είναι σημαντικό να βρεθεί τυχόν λειτουργική συσχέτιση και πιθανός ανταγωνισμός μεταξύ των δύο αυτών αποαδενυλασών. Πιθανή συνεργατική δράση ενδεχομένως να αλληλοσυμπληρώνει την δράση τους εντός των κυττάρων και σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης. Στην συνέχεια μελετήθηκαν τα επίπεδα των παραγόντων Yamanaka και άλλων παραγόντων πολυδυναμίας αλλά και σημαντικοί παράγοντες διαφοροποίησης των κυττάρων. Η ανάλυση έγινε για όλους τους χρόνους του πειράματος ενώ συγκριτική ποσοτικοποίηση έγινε έχοντας ως μάρτυρα τα κύτταρα τα οποία έχουν διαμολυνθεί με sirna που δεν στοχεύει κάποιο γονίδιο του ποντικού, ενώ για την κανονικοποίηση του σήματος χρησιμοποιήθηκε η έκφραση του γονιδίου tubb5. Η ανάλυση αυτή πραγματοποιήθηκε προκειμένου να βρεθεί τυχόν συσχέτιση του ενζύμου αυτού με την σταθερότητα των παραγόντων πολυδυναμίας και διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων. Εικόνα 86 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης παραγόντων πολυδιναμικότητας Yamanaka και διαφοροποίησης μετά από αποσιώπηση της PNLDC1 σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα Από τα αποτελέσματα αυτά φαίνονται αξιοσημείωτες διαφορές στα επίπεδα των παραγόντων SOX2 NANOG KLF2 και MYC οι οποίοι μειώνονται σημαντικά. Το γεγονός αυτό είναι εξαιρετικά ενδιαφέρον γιατί οι παράγοντες αυτοί έχουν περιγραφεί από τον Yamanaka ως οι απαραίτητοι παράγοντες πολυδυναμίας. Πιο συγκεκριμένα η μεγαλύτερη μεταβολή παρατηρήθηκε για τον παράγοντα SOX2 (sex determining region Y, SRY-box 2), ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για την διατήρηση της πολυδυναμίας των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Ο παράγοντας LIF (Leukemia inhibitory factor) που χρησιμοποιείται για την διατήρηση της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων, ενεργοποιεί τον SOX2 μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού JAK-STAT με επακόλουθη ενεργοποίηση του KLF4 (Kruppel-like factor 4) ο οποίος παρουσίαζε σημαντική μείωση. Ο παράγοντας αυτός είναι μέλος των μεταγραφικών παραγόντων KLF και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό την διαφοροποίηση και την απόπτωση των σωματικών κυττάρων ενώ στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα είναι ένας δείκτης για την πολυδυναμία τους. Οι 140

Αποτελέσματα παράγοντες OCT-4, SOX2 και NANOG ρυθμίζουν την μεταγραφή των παραγόντων πολυδυναμίας στο μονοπάτι του LIF (179). Εικόνα 87 Συγκριτική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των παραγόντων πολυδυναμίας OCT4 και LIN28 μετά από αποσιώπηση της PNLDC1 σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα κύτταρα στα οποία έχει γίνει διαμόλυνση με sirna έναντι της PNLDC1 τείνουν να διαφοροποιηθούν. Παράλληλα με τη μελέτη της έκφρασης των παραγόντων πολυδυναμίας αναλύθηκαν και οι παράγοντες διαφοροποίησης Sonic Hedgehog o οποίος παρουσιάζει αξιοσημείωτη αύξηση ειδικότερα στις 72 ώρες ενισχύοντας την υπόθεση αυτή. Εικόνα 88 Σχετικά επίπεδα των παραγόντων διαφοροποίησης PAX6 SHH FOXA2 και NESTIN Το γεγονός η έκφραση του γονιδίου sonic hedgehog αυξάνεται μετά τις 48 ώρες μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι ο παράγοντας αυτός όπως φαίνεται και από τα πειράματα διαφοροποίησης αργεί να αυξηθεί σε σχέση με τους υπολοίπους, ενώ η μείωση που παρατηρείται για τον SOX2 NANOG KLF2 περιορίζεται στην πρώτη μέρα μετά την διαμόλυνση και μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η αποσιώπηση είναι παροδική. Τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα έχουν πολύ μικρό χρόνο διπλασιασμού και επιλέχθηκαν τα 141

Αποτελέσματα κύτταρα μετά από 24 ώρες που παρουσιάζουν και την μεγαλύτερη μείωση για την PNLDC1 για περεταίρω ανάλυση. Πραγματοποιήθηκε NGS γα την αλληλούχιση βιβλιοθηκών cdna στην πλατφόρμα ION TORRENT για να βρεθούν γονίδια των οποίων η έκφραση αλλάζει μετά από την αποσιώπηση της PNLDC1. H διαδικασία περιλαμβάνει την κατάτμηση των μορίων mrna προκειμένου να αλληλουχιθούν σωστά σε μήκος περίπου 100 nt γεγονός που διακρίνεται από την (Εικόνα 89) όπου φαίνεται η κατανομή του μήκους των reads. Εικόνα 89 Διάγραμμα κατανομής του μήκους των reads των βιβλιοθηκών από εμβρυϊκά βλαστικά Τα δεδομένα από την αλληλούχιση σε μορφή fastq αναλύθηκαν περαιτέρω στον διαδικτυακό τόπο https://galaxyproject.org με τον αλγόριθμο TopHat. Η ανάλυση περιλαμβάνει βήματα που τελικό σκοπό έχουν την μέτρηση των μετάγραφων κάθε γονιδίου. Από τις μετρήσεις αυτές είναι δυνατόν να εξάγουμε συμπεράσματα για την σχετική έκφραση των γονιδίων μεταξύ δύο ομάδων δειγμάτων. Η σχετική έκφραση όλων των γονιδίων μπορεί να αναπαριστά σε ένα διάγραμμα scatter στο οποίο η τιμή της έκφρασης κάθε γονιδίου αναπαρίσταται με την τιμή της έκφρασης του ίδιου γονιδίου από τα δείγματα ελέγχου και μπορεί να μας δώσει μια εικόνα για την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας αλλά και μια πρώτη εκτίμηση του αριθμού των γονιδίων που μεταβάλλονται σημαντικά ανάμεσα στα δείγματα. 142

Control Αποτελέσματα 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 pnldc1 knockdown Εικόνα 90 Γραφική παράσταση της σχετικής έκφρασης όλων των γονιδίων μετά από αποσιώπηση του γονιδίου Pnldc1 Η ανάλυση και η εύρεση πιθανών γονιδίων που μπορεί να απορυθμίζονται με την αποσιώπηση του γονιδίου Pnldc1 μπορεί να δώσει κρίσιμες πληροφορίες για την λειτουργία του ενζύμου. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε ανάλυση των αποτελεσμάτων και ταξινόμηση με βάση την στατιστική σημαντικότητα και την διαφορική έκφραση. Τα γονίδια τα οποία αυξήθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακας 5. gene id Name log2 fold change timm50 translocase of inner mitochondrial membrane 50 1,38658 lgals3 lectin, galactose binding, soluble 3 1,15995 maf1 Maf1 1,0333 eif6 eukaryotic translation initiation factor 6 1,03276 nphs1 nephrosis 1 0,874746 galk1 galactokinase 1 0,873176 klf2 Kruppel-like factor 2 (lung) 0,781973 ctsl cathepsin L 0,773724 twf2 twinfilin, actin-binding protein, homolog 2 0,729066 timm13 translocase of inner mitochondrial membrane 13 0,708143 Πίνακας 5 Γονίδια των οποίων η έκφραση αυξάνεται με αποσιώπηση του γονιδίου Pnldc1 Είναι χαρακτηριστική η αύξηση του παραγόντων που συσχετίζονται με βιογένεση των μιτοχονδρίων (TIMM50 και TIMM13) η οποίες μεταφέρουν πρωτεΐνες μέσα στον ενδιάμεσο χώρο των μιτοχονδρίων. Σημαντική παρατήρηση είναι η αύξηση του παράγοντα έναρξης της μετάφρασης Eif6 αλλά και του μεταγραφικού παράγοντα Klf2, ο οποίος είναι μέλος των μεταγραφικών παραγόντων Krüppel-like και εμπλέκεται σε μία πληθώρα διαδικασιών συμπεριλαμβανομένου την αιμοποίηση γεγονός που αναδεικνύει την σημασία της μελέτης της PNLDC1 στην διαδικασία αυτή (180). 143

Αποτελέσματα gene id Name log2 fold change qser1 glutamine and serine rich 1-0,974015 l1td1 LINE-1 type transposase domain containing 1-0,985081 hnrnpd heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D -1,07052 smc3 structural maintenance of chromosomes 3-1,07822 cul5 cullin 5-1,08324 zfp930 zinc finger protein 930-1,12906 cltc clathrin, heavy polypeptide (Hc) -1,14443 eif5b eukaryotic translation initiation factor 5B -1,15302 trim59 tripartite motif-containing 59-1,42941 pabpc1 poly(a) binding protein, cytoplasmic 1-1,54284 lars2 mitochondrial leucyl-trna synthetase 2-3,22839 trappc13 Mus musculus trafficking protein particle complex 13-3,30406 Πίνακας 6 Γονίδια των οποίων η έκφραση μειώνεται με αποσιώπηση του γονιδίου Pnldc1 Η έκφραση πολλών γονιδίων μειώθηκε μετά από αποσιώπηση του γονιδίου Pnldc1 (Πίνακας 6). Εκτός από τα γονίδια που παρουσιάζονται στον πίνακα πολλών άλλων η έκφραση μειώθηκε όπως των naa50, naa15, naa35, τα οποία κωδικοποιούν N- ακετυλοτρανσφεράσες, του vkorc1l1 (vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1-like 1), uba6 (ubiquitin-like modifier activating enzyme 6), ppp2r2a protein phosphatase 2, regulatory subunit B, alpha, srrm1 (serine/arginine repetitive matrix 1) και του fxyd6 FXYD domain-containing ion transport regulator 6. Η πρωτεΐνη QSER1 αλληλεπιδρά με τον παράγοντα NANOG και φαίνεται ότι αυτή η αλληλεπίδραση εμπλέκεται στην πολυδυναμία των επαγόμενων βλαστικών κυττάρων (181). Η πρωτεΐνη QSER1 δεν είναι η μοναδική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην πολυδυναμία των κυττάρων που μειώνεται, αφού η LINE-1 type transposase domain containing 1 επίσης είναι απαραίτητη για την διατήρηση της πολυδυναμίας των αδιαφοροποίητων βλαστικών κυττάρων (182). Η πρωτεΐνη αυτή βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα στα αδιαφοροποίητα βλαστικά κύτταρα και μειώνεται όταν αυτά διαφοροποιούνται. Είναι χαρακτηριστικό ότι ενώ ο παράγοντας έναρξης eif6 αυξάνεται, ο παράγοντας eif5 παρουσιάζει σημαντική μείωση υποδηλώνοντας επίδραση της αποσιώπησης στο επίπεδο της ρύθμισης της μετάφρασης. Μεγαλύτερη μείωση παρουσιάζουν η poly(a) binding protein, cytoplasmic 1, η μιτοχονδριακή αμυνοακυλο-trna συνθετάση της λευκίνης (LARS2) και μία πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην ενδοκυτταρική κυστιδιακή μεταφορά (TRAPPC13). Η πρωτεΐνη αυτή προσδένεται στην poly(a) ουρά των mrna στο κυτταρόπλασμα ενώ πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι αλληλεπιδρά με την AGO2 στο μονοπάτι των mirnas (183). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η PABPC1 παρουσιάζει διαφορική έκφραση κατά την σπερματογένεση αφού αυξάνεται στα σπερματοκύτταρα και μειώνεται στις σπερματίδες ακολουθώντας το πρότυπο έκφρασης της PNLDC1 (184). 144

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Συζήτηση Το mrna μεταφέρει τον κώδικα της γενετικής πληροφορία και αποτελεί ένα σημαντικό ενδιάμεσο μόριο κατά την ροή από τα γονίδια τις πρωτεΐνες. Λεπτομερή ρύθμιση της ροής της γενετικής πληροφορίας επιτρέπει σε μονοκύτταρους οργανισμούς να ανταποκριθούν στις μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες, ενώ αλλαγές στα πρότυπα της ρύθμισης αυτής αποτελεί την κύρια δύναμη διαφοροποίησης τους σε πολυκύτταρους οργανισμούς. Παρότι λεπτομερής ρύθμιση συμβαίνει κάθε στιγμή μέσα σε ένα κύτταρο είτε για να πολλαπλασιαστεί είτε να επιτελέσει μία συγκεκριμένη λειτουργιά, σημαντικό ρόλο παίζει η διαφορετικότητα στα πρότυπα της ρύθμισης, διαφορετικότητα η οποία συμβάλλει καθοριστικά στην διαφορετικότητα και ποικιλομορφία των οργανισμών. Η πρόσφατη ανακάλυψη μάλιστα του κεντρικού ρόλου του μη-κωδικού RNA στην ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας σε όλα σχεδόν τα επίπεδα, επιβεβαίωσε την διαφορετικότητα αλλά και διεύρυνε τον τρόπο σκέψης σχετικά με τις διαδικασίες ρύθμισης, τοποθετώντας τα μόρια RNA στο επίκεντρο, όπως είχε συμβεί και πριν από 30 χρόνια με την ανακάλυψη της καταλυτικής ιδιότητας του RNA. Οι περίπλοκοι μηχανισμοί ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης περιλαμβάνουν τον έλεγχο της μεταγραφής, κυρίως μέσω μεταγραφικών παραγόντων, τις διαδικασίες επεξεργασίας και σταθερότητας του mrna, του μεταφραστικού ρυθμού και της σταθερότητας της παραγόμενης πρωτεΐνης. Όσον αφορά το ίδιο το mrna πολύ σημαντικό ρόλο παίζει η σταθερότητα του, αλλά και η μεταμεταγραφική του αλληλεπίδραση με μικρά ή μεγάλα ρυθμιστικά μη-νοηματικά μόρια RNA τα οποία είτε προκαλούν την καταστολή της μετάφρασής τους παρεμποδίζοντας τα ριβοσώματα, είτε προσελκύουν ριβονουκλεάσες προς την ταχεία και ελεγχόμενη αποικοδόμησή τους (35). Είτε με τον ένα, είτε με το άλλο τρόπο, κάθε στιγμή μέσα στο κύτταρο μια πλειάδα μορίων mrna ανακυκλώνεται συνεχώς προς την παραγωγή νουκλεοτιδίων που επαναχρησιμοποιούνται ως υποστρώματα για την παραγωγή νέων μορίων RNA, όλων των ειδών και λειτουργιών. Μια από τις πιο σημαντικές ιδιότητες των μορίων mrna τα οποία τα καθιστούν διαθέσιμα για μετάφραση και κατά συνέπεια για απρόσκοπτη ροή της πληροφορίας που μεταφέρουν είναι η σταθερότητά του σε κυτταρικό περιβάλλον. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το 40 με 50% των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης μετά από απόκριση των κυττάρων σε διάφορα σήματα επιτυγχάνεται με την σταθερότητα των επιπέδων πολλών μορίων mrna (185). Η σταθερότητα αυτή εξαρτάται από τον ρυθμό βιοσύνθεσής του και από τον ρυθμό αποικοδόμησής τους (15). Η ισορροπία ανάμεσα στις δύο αυτές αντίρροπες κυτταρικές διαδικασίες επιτρέπει την μεταβολή του καθαρής συγκέντρωσης αρκετών μορίων mrna, γεγονός που τελικά καθορίζει όχι μόνο τον κύκλο ημιζωής του mrna αλλά και την τύχη του ρυθμού της πρωτεϊνοσύνθεσης (Εικόνα 91). 146

Συζήτηση Εικόνα 91 O περίπλοκος κύκλος ζωής των μυνηματοφόρων μορίων RNA Η ανακατανομή των ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων έχουν ως αποτέλεσμα τη διευκόλυνση η την αναστολή της αποικοδόμησης. Κυτταρικοί παράγοντες και σηματοδοτικοί μηχανισμοί ρυθμίζουν αποκλειστικά την αποικοδόμηση του mrna. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, τα περισσότερα από τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του mrna έχουν ταυτοποιηθεί ενώ πολλές μελέτες αφιερώνονται πλέον στη διαλεύκανση των μηχανισμών που καθορίζουν τη μοίρα του mrna (24). Όπως έχει ήδη αναφερθεί η αποικοδόμηση του mrna υπό φυσιολογικές συνθήκες συνήθως ξεκινάει από τη βράχυνση της poly(a) ουράς. Η αποαδενυλίωση είναι το σημαντικότερο στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και την μεταφραστική αποσιώπηση του mrna. Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Τα ένζυμα που καταλύουν την αποαδενυλίωση είναι εξωνουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg 2+ που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση 3-5 (Εικόνα 92). Οι poly(a) ουρές είναι το κυριότερο υπόστρωμα των ενζύμων αυτών, ωστόσο μερικές αποαδενυλάσες μπορούν να διασπούν και άλλα μόρια RNA in vitro (25). Από τη στιγμή που η poly(a) ουρά έχει αφαιρεθεί από το mrna, άλλα υδρολυτικά ένζυμα ξεκινούν τη διάσπαση του. Για την απλή υδρόλυση της poly(α) ουράς μόλις μία ριβονουκλεαση θα ήταν αρκετή. Παρόλο αυτά υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις τύποι ριβονουκλεασών στον ζυμομύκητα (CCR4, CAF1, PAN2, και ANGEL) οι οποίες είναι πολύ συντηρημένες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στους πολυκύτταρους οργανισμούς ο αριθμός αυτός αυξάνεται. Για παράδειγμα στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν βρεθεί τουλάχιστον πέντε οικογένειες ορθόλογων της CCR4 του ζυμομύκητα μέσω βιοχημικών μελετών αλλά και βιοπληροφορικής, που ωστόσο η δράση αυτών δεν έχει αποδειχθεί (35), 147

Συζήτηση (36), (37). Στα θηλαστικά έχουν βρεθεί τουλάχιστον 12 οι οποίες περιλαμβάνουν ορθόλογες των CCR4 και CAF1 και τουλάχιστον την poly(α) εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN) μία σημαντική αποαδενυλάση, που εμφανίζεται μόνο στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Βάση φυλογενετικών αναλύσεων, μέλη των οικογενειών POP2 (γνωστή και ως CAF1), PARN α CCR4 έχουν υποστεί γονιδιακό διπλασιασμό στα μετάζωα από τον οποίο προέρχονται οι CNOT8, PARNL (PNLDC1) και CNOT6L αντίστοιχα (38). Οι POP2 και CCR4 διπλασιαστήκαν κατά την εξέλιξη των τελεοστέων, ενώ πιθανόν η PARN διπλασιάστηκε κατά την ακτινοβόληση των αρθροπόδων αφού PARNL (PNLDC1) έχει βρεθεί σε αυτά. Παρόλο αυτά δεν έχουν βρεθεί ομολογες της στο βάτραχο (Xenopus tropicalis) και στo Zebrafish (Danio rerio) (38). Εικόνα 92 Η ζωή ενός μορίου mrna πολλές περιλαμβάνει πολλές αλληλεπιδράσεις και υπόκειται σε στενό έλεγχο σε όλα τα στάδια Με βάση την ομολογία την hpnldc1 και mpnldc1 φαίνεται ότι η PNLDC1 είναι μία DEDD εξωνουκλεάση διατηρώντας τα κατάλοιπα Asp και Glu τα οποία είναι διάσπαρτα σε τρία μοτίβα εξωνουκλεάσης που δεσμεύουν ιόντα μαγνησίου (40). Επιπρόσθετα παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομοιότητα τεταρτοταγούς δομής της περιοχής του ενεργού κέντρου σύμφωνα με προσομοίωση της μοριακής δυναμικής που σχεδιάστηκε για την περιοχή νουκλεάσης της hpnldc1 η οποία σχηματίζει ομοδιμερές με δύο ενεργά κέντρα αντικριστά. H PARN επίσης υπάρχει κυρίως σε ομοδιμερές σύμφωνα με τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα, ενώ είναι χαρακτηριστικό επίσης περιλαμβάνει δύο ισομορφές, 74 ΚDa και 54 KDa αντίστοιχα (Εικόνα 20) (55). Στην περίπτωση της PARN η δεύτερη ισομορφή προέρχεται από πρωτεολυτική διάσπαση του καρβοξυτελικού άκρου με ένα άγνωστο ακόμα μηχανισμό μετα-μεταφραστικής τροποποίησης του ενζύμου και η μικρότερη ισομορφή χάνει μέρος της NLS αλληλουχίας της με αποτέλεσμα να εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο κυτταρόπλασμα. Αντίθετα στην περίπτωση της PNLDC1 έχουμε δύο ισομορφές οι οποίες παράγονται μέσω εναλλακτικού ματίσματος και οι οποίες εντοπίζονται και οι δύο εκτός πυρήνα. Αυτή είναι μια από τις σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα δύο 148

Συζήτηση ένζυμα που υποδηλώνει και πιθανούς βιολογικούς ρόλους μέσα στο κύτταρο. Είναι χαρακτηριστικό ότι έχει προταθεί για την PARN ότι μπορεί να βρίσκεται και σε ολιγομερή κατάσταση στην οποία διαμεσολαβεί η R3H περιοχή και όχι η περιοχή διμερισμού και αυτό έχει φυσιολογική σημασία στο να συγκεντρώνεται η πρωτεΐνη σε περιοχές του κυττάρου όπου απαιτείται συνεχείς παρουσία του ενζύμου (56). Παρόλα αυτά, μέχρι σήμερα δεν υπάρχει διαθέσιμη δομή της PARN με πολυμερές υπόστρωμα προκειμένου να διαπιστωθεί εάν ο ολιγομερισμός της συσχετίζεται με μεγαλύτερη αγχιστεία ως προς τα υποστρώματα ή με μεγαλύτερη επεξεργασιμότητα που παρουσιάζει η PARN εξαιτίας της περιοχής δέσμευσης του 3 cap το οποίο δεν διαθέτει η PNLDC1 (56). Εκτός από τα κατάλοιπα DEDD που παίζουν ρόλο στον καταλυτικό μηχανισμό αρκετά άλλα είναι συντηρημένα που φαίνεται να παίζουν ρόλο στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με το υπόστρωμα. Πιο συγκεκριμένα τα Phe31, Phe115, Ser112, Asn288 και Lys326 της hparn είναι συντηρημένα και στην hpnldc1 και φαίνεται να έχουν την ίδια διευθέτηση στο θεωρητικό μοντέλο με την μικρότερη ενέργεια. Στην παρούσα διατριβή κλωνοποιήθηκε και η δεύτερη ισομορφή που έχει μία διαφορετική αλληλουχία στο αμινοτελικό άκρο και η mouse PNLDC1 η οποία παρουσιάζει στο αντίστοιχο αμινοτελικό άκρο ομολογία με την ανθρώπινη ισομορφή 2 (Εικόνα 93). Παράλληλα κλωνοποιήθηκε μία μεταλλαγμένη μορφή που αποτελείται από το ενεργό κέντρο του ενζύμου χωρίς την καρβοξυτελική περιοχή η οποία έχει πολλά υδρόφοβα αμινοξέα που θεωρητικά μειώνουν την διαλυτότητα της πρωτεΐνης. Εικόνα 93 Ομοπαράθεση αμινοξικής αλληλουχίας των πρωτεϊνών humanpnldc1 humanpnldc1_2 και mousepnldc1 στο αμινοτελικό άκρο Καθώς οι πρωτεΐνες παρουσίαζαν πρόβλημα με την διαλυτότητά τους σε μεγάλες συγκεντρώσεις, προκειμένου να συγκριθεί η αποτελεσματικότητα της έκφρασης τους στο ετερόλογο σύστημα απομονώθηκαν με στήλη νικελίου ταυτόχρονα από καλλιέργειες με επαγωγή της έκφρασης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών παρουσία 0.5mM IPTG. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν ταυτόχρονα σε θερμοκρασία 20 Ο C για 16 ώρες. Μετά την απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και την εκτίμηση της συγκέντρωσής τους ήταν εμφανές ότι η αποκοπή της υδρόφοβης καρβοξυτελικής περιοχής βελτίωσε πολύ λίγο την διαλυτότητα της πρωτεΐνης και έτσι προτιμήθηκε να χρησιμοποιηθεί η δεύτερη ισομορφή του ανθρώπου εφόσον παρουσίαζε την καλύτερη εικόνα απομόνωσης. Με την χρωματογραφία συγγένειας είναι δυνατόν να απομονώνονται πρωτεΐνες οι οποίες ενδεχομένως επιμολύνουν το τελικό μας παρασκεύασμα ιδίως στην περίπτωση που η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη δεν βρίσκεται σε μεγάλο ποσοστό σε διαλυτή μορφή και έτσι 149

Συζήτηση είναι πιθανόν να αλληλεπιδρά και να συν-απομονώνεται με πρωτεΐνες της ίδιας ή παρόμοιας μοριακής μάζας. Η πρωτεΐνη PNLDC1 δεν έχει προηγουμένως χαρακτηριστεί και ήταν απαραίτητη η ταυτοποίηση των προϊόντων απομόνωσης με ανοσοαποτύπωση με το αντίσωμα Rabit anti PNLDC1 (ACRIS AP53365PU-N). Με πειράματα ανοσοαποτύπωσης ταυτοποιήθηκε ότι η πρωτεΐνη που παρουσιάζεται στο επιθυμητό μέγεθος είναι πράγματι η PNLDC1. Παρόλα αυτά, η χρησιμοποίηση anti-his 6 αντισώματος κατά την πειραματική διαδικασία μας έδωσε μια πιο σαφή εικόνα για την παρουσία της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Όλα τα εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα τα οποία δοκιμάσθηκαν στην παρούσα μελέτη, φάνηκε ότι δεν αναγνώριζαν σε όλες τις περιπτώσεις, είτε την ανασυνδυασμένη, είτε την φυσική μορφή της PNLDC1. To φαινόμενο αυτό το οποίο έχει παρατηρηθεί και για άλλες πρωτεΐνες πιθανότατα οφείλεται στο γεγονός ότι τα συγκεκριμένα αντισώματα είναι πολυκλωνικά και έχουν παραχθεί με βάση την αναγνώριση της τριτοταγούς διαμόρφωσης που προσλαμβάνει το ένζυμο. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται αποδιαταγμένη, δημιουργούνται προβλήματα στην αναγνώρισή της από αντισώματα μια και τα κατάλοιπα των επιτόπων τα οποία βρίσκονται κοντά στις ανώτερες διαμορφώσεις, ενδεχομένως να είναι τοπολογικά σε απομακρυσμένες θέσεις στην πρωτοταγή δομή του ενζύμου με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η ισχυρή αναγνώρισή τους από τα αντίστοιχα αντισώματα. Έτσι παρατηρήθηκε πολύ καλή αναγνώριση της PNLDC1 σε τομές ιστών κατά την ανοσοϊστοχημική ανάλυση όπου η πρωτεΐνη βρίσκεται ακινητοποιημένη αλλά στην τρισδιάστατη μορφή της, αλλά κάτι ανάλογο δεν ήταν πάντα δυνατόν μετά από αποδιάταξη της πρωτεΐνης που είναι προϋπόθεση για ανάλυση κατά western. Aναφορικά με τον ολιγομερικό χαρακτήρα της PNLDC1, η χρωματογραφία μοριακής διήθησης με την στήλη Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) έδειξε ότι η PNLDC1 εκλούεται σε μια συμμετρική κορυφή και σε χρόνο έκλουσης που είναι ενδεικτική διμερούς. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώθηκε και από πειράματα δυναμικής σκέδασης φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) με την οποία προσδιορίζεται το μέγεθος των σωματιδίων σε ένα διάλυμα. Διαπιστώθηκε ότι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σχηματίζει εύκολα συσσωματώματα ενώ τα μικρότερα σωματίδια που ανιχνευθήκανε είχαν την διάμετρο των 10 nm όσο είναι και η διάμετρος του μοντέλου της PNLDC1 ως διμερές επιβεβαιώνοντας το θεωρητικό μοντέλο που κατασκευάστηκε. Παρόμοια διάμετρος σωματιδίων έχει περιγραφεί στην βιβλιογραφία για την PARN (~11 nm). Με βάση το λογισμικό του μηχανήματος, η μοριακή μάζα της πρωτεΐνης PNLDC1 ως διμερές που προκύπτει από πειράματα δυναμικής σκέδασης φωτός υπολογίστηκε στα 173 ΚDa, ωστόσο ο υπολογισμός αυτός βασίζεται στην παραδοχή μέτρησης μίας σφαιρικής πρωτεΐνης και για όχι διμερές πρωτεΐνης η οποία δεν πληροί τα χαρακτηριστικά μίας θεωρητικής σφαίρας διαμέτρου 10nm. Η κατάσταση ολιγομερισμού της PNLDC1 πιθανότατα έχει φυσιολογική σημασία καθώς όπως έχει αναφερθεί για την PARN, βρίσκεται σε ολιγομερή κατάσταση την οποία 150

Συζήτηση διαμεσολαβεί η R3H περιοχή και όχι η περιοχή διμερισμού. Μέσω του ολιγομερισμού το ένζυμο μεταβάλλει την τοπική του συγκέντρωση σε διαφορετικές περιοχές του κυττάρου όπου απαιτείται η συνεχής παρουσία του (56). Εικόνα 94 Υποθετικό μοντέλο για τον ρόλο του ολιγομερισμού της PARN. Όταν το ένζυμο αυτό στοχεύει συγκεκριμένα μόρια μέσα στο κύτταρο μπορεί να συγκεντρώνεται γύρω από αυτά με αποτέλεσμα να είναι διαθέσιμη και για άλλα μόρια που μπορεί να υπάρχουν στο σημείο. Με τον ίδιο τρόπο είναι πιθανόν να δρα και η PNLDC1. Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή οι αποαδενυλάσες που έχουν χαρακτηριστεί μέχρι τώρα εξαρτώνται από την παρουσία Mg 2+ για βέλτιστη δραστικότητα. Οι βέλτιστες συνθήκες βρέθηκαν συγκρίσιμες με αυτές των υπολοίπων αποαδενυλασών οι οποίες αναφέρονται για το ph 7.5-8 για την θερμοκρασία στους 37 ο C για τα μονοσθενή 80-150 mm και για το Mg 2+ 1-2 mm. Είναι χαρακτηριστικό ότι οι τιμές προσεγγίζουν τις φυσιολογικές συγκεντρώσεις και συνθήκες στο κύτταρο. Είναι επίσης χαρακτηριστικό προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μονοσθενή ιόντα είναι απαραίτητα για τη δραστικότητα της PARN αλλά και δρουν ως μη αλλοστερικοί ρυθμιστές (76). Οι περισσότερες αποαδενυλάσες έχουν προτίμηση για τα ιόντα Mg 2+ τα οποία συντονίζουν τα τέσσερα όξινα συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου (DEDD) προκειμένου να επιτευχθεί η κατάλυση μέσω ενός SN2 διαμεσολαβούμενου μηχανισμού. Ο ίδιος μηχανισμός φαίνεται να χρησιμοποιείται από μια πληθώρα ριβονουκλεασών συμπεριλαμβανομένης της RNase P. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι ακόμα δεν είναι γνωστό πόσα ιόντα Mg 2+ διαμεσολαβούν την κατάλυση. Είναι χαρακτηριστικό ότι τόσο η κρυσταλλική δομή μιας βραχυνόμενης ισομορφής της PARN, όσο και δομικά δεδομένα από άλλες DEDD αποαδενυλάσες δεν ξεκαθαρίζουν τον τρόπο με τον οποίο επιτυγχάνεται η κατάλυση ή έστω η ακριβής αναγνώριση και δέσμευσης του υποστρώματος. Είναι μάλιστα χαρακτηριστικό ότι έχει προταθεί πως δεν υπάρχει ένας γενικός και κοινός μηχανισμός για την αποικοδόμηση RNA η οποία διαμεσολαβείτε από μέταλλα όπως το Mg 2+ (186). Οι αντιδράσεις αποαδενυλίωσης πραγματοποίθηκαν παρουσία του συνθετικού υποστρώματος σε διαφορετικούς χρόνους. Το υπόστρωμα Ν9Α15 που χρησιμοποιήθηκε για 151

Συζήτηση τον σκοπό αυτό είναι ένα συνθετικό υπόστρωμα παρόμοιο με άλλα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για τον χαρακτηρισμό ανάλογων ενζύμων. Η εικόνα αντίδρασης ενός τέτοιου υποστρώματος σε βάθος χρόνου μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για το πώς δρα το συγκεκριμένο ένζυμο. Η PNLDC1 παρουσιάζει τυπική εικόνα αποαδενυλίωσης με μεγαλύτερη προτίμηση για τα νουκλεοτίδια αδενίνης όπως ήταν αναμενόμενο. Η εικόνα υδρόλυσης του συγκεκριμένου ενζύμου μοιάζει με την εικόνα υδρόλυσης του συνθετικών υποστρωμάτων από άλλα ένζυμα της κατηγορίας αυτής. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των αποαδενυλασών είναι ότι καταλύουν την αντίδραση υδρόλυσης της τελευταίας αδενοσίνης και συνεχίζουν στην επόμενη με σταθερό ρυθμό χωρίς απαραίτητα να αποδεσμεύονται και να δεσμεύονται εκ νέου στο υπόστρωμα. Η ιδιότητα των ενζύμων να επαναλαμβάνουν κύκλους κατάλυσης χωρίς να αποδεσμεύονται από το πολυμερές υπόστρωμα αναφέρεται ως processivity (επεξεργασιμότητα) για να διαχωρίζει από την έννοια της κοινής ενζυμικής κατάλυσης. Αυτό δίνει την ιδιότητα στις αποαδενυλάσες να προσδένονται σε ένα υπόστρωμα εξ αρχής και να ρυθμίζουν την αποικοδόμηση των mrnas σαν ένα ροοστάτη ανάλογα με τη ρύθμιση που οι ίδιες επιδέχονται, εξασφαλίζοντας ότι είναι πιο πιθανό να προχωρήσουν σε αν ακόμα βήμα υδρόλυσης (κατάλυση) από το να αποδεσμευθούν και να επαναδεσμεύσουν το υπόστρωμα. Με το τρόπο αυτό φαίνεται να δρουν η PARN, η CCR4, η CAF1, η NOC και η PDE12, τουλάχιστον in vitro και κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. Κάτι παρόμοιο φαίνεται και για τα δεδομένα μας από την δράση της PNLDC1. Η in vitro εικόνα αποαδενυλίωσης μέσω επεξεργασιμότητας χαρακτηρίζεται από μια ταυτόχρονη μείωση του μήκους όλων των μορίων του υποστρώματος. Αυξάνοντας την συγκέντρωση σε 2 μμ του ενζύμου έτσι ώστε τα μόρια του ενζύμου να είναι δε περίσσεια έναντι των μορίων του υποστρώματος (~10nM) εξασφαλίσαμε ότι στις συνθήκες αυτές σε κάθε μόριο υποστρώματος έχει προσδεθεί τουλάχιστον ένα μόριο ενζύμου και για τον λόγο αυτό παρατηρείται ακόμα εντονότερα το φαινόμενο της αποικοδόμησης μέσω επεξεργασιμότητας (Εικόνα 70). Στις αντιδράσεις παρουσία διαφορετικών συνθετικών υποστρωμάτων χρησιμοποιήθηκαν μικρά συνθετικά μόρια RNA 12 νουκλεοτιδίων ουρακίλης, θυμίνης, γουανίνης και αδενίνης (U12, C12, G12 και Α12 αντίστοιχα), και ενός συνθετικού μονόκλωνου oligo d(a) 12 αδενινών (da12) φαίνεται η προτίμηση του ενζύμου για συνθετικό υπόστρωμα oligo(a) (Εικόνα 71). Εκτός από την υδρόλυση του συνθετικού ολιγοριβονουκλεοτιδου αδενοσίνης παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη υδρόλυση του ολιγοδεοξυριβονουκλεοτιδιου. Για να διερευνηθεί εάν αυτό αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου ενζύμου σε σχέση με την PARN πραγματοποιήθηκε αντίδραση παρουσία συνθετικού υποστρώματος μονόκλωνου DNA με ανασυνδυασμένη PARN και διαπιστώθηκε ότι και αυτή υδρολύει συνθετικό υπόστρωμα oligo(da) (Εικόνα 72). Η υδρόλυση DNA υποστρώματος από δύο RNA εξωνουκλεάσες αντικατοπτρίζει την εξέλιξη τους από την περιοχή με δραστικότητα εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης I, δραστικότητα η οποία εμφανίστηκε μαζί με την εγκαθίδρυση του DNA ως του μορίου που αποθηκεύει την γενετική πληροφορία. 152

Συζήτηση Οι σταθερές Κm και kcat είναι φαινομενικές και υπολογίστηκαν με την παραδοχή ότι το ένζυμο ακολουθεί κλασική κινητική τύπου Michaelis-Menten σε περίσσεια υποστρώματος έναντι του ενζύμου. Ωστόσο όπως ήδη αναφέρθηκε το ένζυμο αυτό είναι ένα επεξεργαστικό ένζυμο και η κινητική ανάλυση διαφέρει από την κλασσική ανάλυση Michaelis-Menten η οποία προϋποθέτει την ύπαρξη ενός μόνο καταλυτικού βήματος. Oι υπολογισμοί των κινητικών σταθερών για κάθε υδρόλυση ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα σε δύο αδενινο-νουκλεοτίδια, προϋποθέτει την δυνατότητα μέτρησης με μεθοδολογίες κινητικής ροής (flow kinetics). Για τον σκοπό του υπολογισμού κάθε βήματος κατάλυσης θα πρέπει να υπολογιστεί ο παράγοντας επεξεργασιμότητας q οποίος υπολογίζεται από τον τύπο όπου οι τιμές k -α και k c περιγράφουν την αρχική και την τελική σταθερά κατάλυσης σύμφωνα με το κινητικό σχήμα της επεξεργασιμότητας (174): Ο υπολογισμός στην περίπτωση της PNLDC1 της Κ m και ο υπολογισμός της σταθεράς k cat έγινε υπολογίζοντας την συνολική υδρόλυση και απομάκρυνση της oligo(a) ουράς του συνθετικού υποστρώματος N9A15 σε αντιδράσεις τελικού σημείου. Οι φαινομενικές αυτές τιμές των κινητικών σταθερών του ενζύμου από την μία φανερώνουν την υψηλή αγχιστεία του ενζύμου ως προς την poly(a) ουρά και από την άλλη την χαμηλή ταχύτητα κατάλυσης (Εικόνα 79). Παρόλα αυτά η PNLDC1 φαίνεται διατηρεί υψηλή επεξεργασιμότητα σε βάθος χρόνου γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανόν να παρεμποδίζεται η ολίσθηση του ενζύμου σε αρχικά στάδια (55). Υπενθυμίζεται πως η PARN ξεπερνάει αυτό το πρόβλημα καθώς όταν προσδένεται στο υπόστρωμα υπόκειται σε αλλαγή της διαμόρφωσης με αποτέλεσμα να απομακρύνεται από το υπόστρωμα η R3H περιοχή επιτρέποντας την ολίσθηση του ενζύμου. Φαίνεται ότι η PNLDC1 πιθανότατα χρησιμοποιεί διαφορετικό μηχανισμό, καθώς τα δεδομένα δείχνουν ότι η ολίσθηση του ενζύμου είναι εξαιρετικά αργή. Πιθανόν η ολίσθηση του ενζύμου να επιτρέπεται μέσα στα κύτταρα ύστερα από αλληλεπίδραση με επιπρόσθετους πρωτεϊνικούς συμπαράγοντες ή μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων οι οποίες όπως δεν μπόρεσαν να προσδιοριστούν. Εάν η αργή ταχύτητα της PNLDC1 οφείλεται στα χαρακτηριστικά αυτά τότε ένα υπόστρωμα με μικρότερη συγγένεια που όμως αποτελεί υπόστρωμα του ενζύμου στις in vitro αντιδράσεις θα μπορούσε να υδρολυθεί με μεγαλύτερη ταχύτητα. Πράγματι συγκρίνοντας τις τιμές K m και V max της PNLDC1 για τα υποστρώματα da12 και A12 είναι εμφανές ότι το ένζυμο παρουσιάζει μικρότερη αγχιστεία για το ολιγονουκλεοτίδιο da12 αλλά μεγαλύτερη ταχύτητα κατάλυσης 153

Συζήτηση από ότι για το Α12, γεγονός που πιθανόν να υποστηρίζει μια τέτοια καταλυτική συμπεριφορά. Επίσης, διαφορά στις επιμέρους ταχύτητες μπορεί να σχετίζονται και με το γεγονός ότι υπάρχουν μη συντηρημένα κατάλοιπα στο ενεργό κέντρο της PNLDC1. Επιπρόσθετα η περιοχή διμερισμού της hpnldc1 παρουσιάζει διαφορές με αυτή της PARN ενώ είναι χαρακτηριστικό ότι στην κρυσταλλική δομή της hparn σε σύμπλοκο με το RNA το κατάλοιπο Arg99 αλληλεπιδρά με μία αδενίνη του υποστρώματος, μια παρατήρηση η οποία προέκυψε και από την in silico ανάλυση της παρούσας διατριβής (Εικόνα 95). Η συγκεκριμένη αλληλεπίδραση φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση και δέσμευση του υποστρώματος. Το κατάλοιπο αυτό είναι συντηρημένο και στην mparn αλλά παραδόξως λείπει από την hpnldc1. Αυτό σε συνδυασμό με τα διαφορετικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου που αλληλεπιδρούν με το υπόστρωμα υποδηλώνει πιθανόν ένα πολύ διαφορετικό μηχανισμό προσέγγισης του υποστρώματος από την PNLDC1 μέσα στο κύτταρο όπου μπορεί να απαιτεί την σύνδεση με μία άλλη πρωτεΐνη ώστε να επιτευχθεί η σύνδεση με το RNA. Μελλοντικά πειράματα μεταλλαξιγένεσης θα διευκρινήσουν την σημαντικότητα του καταλοίπου αυτού στην δράση του ενζύμου. Εικόνα 95 Στην κρυσταλλική δομή της hparn σε σύμπλοκο με το RNA το κατάλοιπο Arg99 αλληλεπιδρά με μία αδενίνη του υποστρώματος (PDB IDs: 2A1S και 2A1R) Μία άλλη αξιοσημείωτη διαφορά ανάμεσα στα δύο ένζυμα που είναι πολύ πθανό να επηρεάζει την συνολική βιοχημική τους συμπεριφορά αποτελεί η περιοχή πρόσδεσης με το 5 cap η οποία βρίσκεται στην PARN, αλλά απουσιάζει από την PNLDC1. Τα κατάλοιπα που ευθύνονται για την ιδιότητα αυτή βρίσκονται διάσπαρτα στην RRM περιοχή της PARN που βρίσκεται κοντά στην καρβοξυτελική της περιοχή και φαίνεται ότι είναι πολύ σημαντικά για την σταθεροποίηση του ενζύμου επί του υποστρώματος. Είναι επίσης σημαντικό να αναφερθεί ότι η PARN φάνηκε στην παρούσα μελέτη να μην παρουσιάζει τουλάχιστον in vitro, την ίδια εξειδίκευση σε υποστρώματα εκτός των συνθετικών mrna, όπως πρόδρομα μόρια trna τα οποία φέρουν 3 επιπρόσθετες αλληλουχίες. Η PNLDC1 δεν μπορούσε να αναγνωρίσει τις μονόκλωνες 3 επιπρόσθετες αλληλουχίες, σε αντίθεση με την PARN η οποία τις αποικοδομούσε και σταματούσε στο σημείο εκκίνησης του δίκλωνου τμήματος 154

Συζήτηση που είναι ο βραχίονας υποδοχής του αμινοξέος (acceptor stem). H ιδιότητα αυτή της PARN ενδεχομένως βρίσκεται σε συμφωνία με τις πρόσφατες παρατηρήσεις ότι η PARN εμπλέκεται στην ωρίμανση των 3 άκρων pre-mirnas που μεταφέρονται από την AGO2 (172). Εικόνα 96 Η PARN εμπλέκεται στην ωρίμανση των μορίων mirna Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή ο ενδοκυττάριος εντοπισμός των αποαδενυλασών παίζει καθοριστικό ρόλο στην βιολογική τους λειτουργία. Η PNLDC1 δεν διαθέτει το πυρηνικό σήμα εντοπισμού που διαθέτει η PARN ενώ έχει δύο ισομορφές από τις οποίες η ισομορφή 1 διαφέρει στο αμινοτελικό άκρο τόσο από την ισομορφή 2 αλλά και την από την PARN. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα υποκυττάριου εντοπισμού για να βρεθεί που δρα το συγκεκριμένο ένζυμο. Κατασκευάστηκαν τα πλασμίδια pcdna3.1pnldc1_1egfp και pcdna3.1pnldc1_2egfp με τα οποία διαμολύνθηκαν κύτταρα HEK293 T. Από τα αρχικά πειράματα παρατηρήθηκε μεγάλη συγκέντρωση της ανασυνδυασμενης υβριδικής πρωτεΐνης γύρο από τον πυρήνα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν με ταυτόχρονα διαμόλυνση πλασμιδίου που κωδικοποιεί μία μεταλλαγμένη φθορίζουσα turquoise πρωτεΐνη που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (mturquiose2-er). Οι δύο ισομορφές αποκλείονται από τον πυρήνα σε αντίθεση με την PARN και εντοπίζονται κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Ο επιγενετικός έλεγχος της PNLDC1 οδήγησε στην μελέτη της ιστοειδικής της έκφρασης σε παρασκευάσματα από ποντικό. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα εμπορικά διαθέσιμα πολυκλωνικά αντισώματα τα οποία είχαν παρουσιάσει σε πειράματα ανοσοαποτύπωσης μειωμένη αναγνώριση ως προς την PNLDC1. Το πρώτο αντίσωμα που 155

Συζήτηση χρησιμοποιήθηκε είναι το Rabbit anti PNLDC1 (ACRIS AP53365PU-N) το οποίο στοχεύει την περιοχή 456-486 της ανθρώπινης PNLDC1. To αντίσωμα έχει παρασκευαστεί χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο συνθετικό πεπτίδιο ίδιο με ίδια αλληλουχία με την περιοχή αυτή της PNLDC1. Η αγχιστεία για την PNLDC1 επιβεβαιώθηκε σε αποτύπωση κατά Western με υπερεκφρασμένη PNLDC1 από τα στάδια του καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου. Για την ανοσοιστοχημεία χρησιμοποιήθηκαν βιοψίες από ασθενή με σεμίνωμα (συχνότερος τύπος καρκίνου των όρχεων) οι οποίες περιλαμβάνουν και φυσιολογικό ιστό. Η PNLDC1 εκφράζεται στο εσωτερικό των σπερματικών πόρων και ειδικότερα στα σπερματογόνια. Η έκφραση της PNLDC1 στα σπερματογόνια επιβεβαιώνει την συσχέτιση με την βιολογία των βλαστικών κυττάρων και είναι λογική εφόσον εκφράζεται σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, όρχεις και ωοθήκες. Στις τομές αυτές παρατηρήθηκε έντονη έκφραση στα λεία μυϊκά κύτταρα των τριχοειδή αγγείων η ακεραιότητα των οποίων στις τομές δίνουν μία καλύτερη εικόνα εντοπισμού επιβεβαιώνοντας την παρατήρηση με συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού όπου φαίνεται έντονη εντόπιση της πρωτεΐνης γύρο από τον πυρήνα. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι το γονίδιο αυτό δεν εμπλέκεται μόνο στην βιολογία των βλαστικών κυττάρων και των γαμετικών αλλά και σε άλλα πιο διαφοροποιημένα κύτταρα. Πιθανόν η έκφραση να αυξάνεται σε ειδικές περιπτώσεις διαφοροποίησης συγκεκριμένου τύπου κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα του όγκου είναι αρνητικά για την χρώση παρόλο αυτά, γύρο από τον όγκο διακρίνεται χρώση που όμως δεν μπορεί να διακριθεί εάν είναι ειδική και τι είδους κύτταρα είναι αυτά. Είναι γνωστό ότι τον όγκο περιβάλουν και διεισδύουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η διαφοροποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού είναι μία περίπλοκη διαδικασία και τυχόν εμπλοκή της PNLDC1 αποτελεί εξαιρετικά ενδιαφέρον γεγονός που χρήζει περεταίρω διερεύνησης. Λόγω όμως της πολυκλωνικότητας του αντισώματος για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοφθορισμού σε τομές όρχεων από ποντίκι. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με διαφορετικό αντίσωμα (Goat anti PNLDC1, SC Biotech sc-243835) που παρασκευάστηκε με τον ίδιο τρόπο για την αμινοτελική περιοχή της PNLDC1 ενώ θεωρητικά αντιδρά και με την mousepnldc1. Με τις εικόνες ανοσοφθορισμού επιβεβαιώνονται τα αποτελέσματα τόσο για τα γαμετικά τόσο και για τα λεία μυϊκά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα στους σπερματικούς πόρους ο φθορισμός εντοπίζεται γύρω από τους πυρήνες των σπερματοκυττάρων και όχι στα σπερματογόνια. Επειδή η σπερματογένεση είναι μια διαδικασία η οποία συμβαίνει ανά τακτά χρονικά διαστήματα και η οποία προϋποθέτει τη διαφοροποίησης πρώιμων σπερματικών κυττάρων είναι πολύ πιθανό να απαιτεί τη ρύθμιση συγκεκριμένων μεταγράφων τα οποία ρυθμίζονται από την PNLDC1 (Εικόνα 97). Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι η PNLDC1 εντοπίζεται εκτός του πυρήνα, ενώ αντίθετα σε αντίστοιχα πειράματα τα οποία έχουν αναφερθεί, η PARN εντοπίζεται εντός του πυρήνα. 156

Συζήτηση Εικόνα 97 Στάδια σπερματογένεσης και ωογένεσης (γαμετογένεση). Στο ποντίκι όλα τα στάδια της σπερματογένεσης διαρκούν από 33.5 έως 35.5 μέρες (187) Το γονίδιο PNLDC1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και ο προαγωγέας περιέχει CpG νησίδες που μεθυλιώνονται σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου και περιφερικά κύτταρα αίματος. Μια από τις πιο σημαντικές παρατηρήσεις που προέκυψαν από την διατριβή ήταν το γεγονός ότι το συγκεκριμένο γονίδιο εκφράζεται σε διαφοροποιημένα κύτταρα HEK293T μετά από επώαση με τον απομεθυλιωτικό παράγοντα 5-aza-deoxycytidine ο οποίος φαίνεται να επάγει την έκφραση και των δύο ισομορφών του γονιδίου, ενώ δεν επηρεάζεται η έκφραση του παράλογου γονιδίου parn και της αποαδενυλάσης CNOT7. Η έκφραση και των δύο ισομορφών αφενός διευκόλυνε την κλωνοποίηση της δεύτερης ισομορφής και αφετέρου επιβεβαίωσε την παρατήρηση ότι το γονίδιο παράγει δύο διαφορετικά μετάγραφα μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Το γεγονός ότι ένα σημαντικό ένζυμο αποικοδόμησης του mrna, ρυθμίζεται επιγενετικά μέσω μεθυλίωσης του προαγωγέα υποδεικνύει την σημαντικότητα της σε μηχανισμούς που εμπλέκονται στην εμβρυογένεση και διαφοροποίηση. Επιπρόσθετα, ο επιγενετικός έλεγχος του γονιδίου σε συνδυασμό με την σημαντική έκφραση που εντοπίστηκε κυρίως στους όρχεις και στις ωοθήκες ποντικού υποδεικνύει πιθανή εμπλοκή του γονιδίου στην βιολογία των γαμετικών κυττάρων και οδήγησε στην μελέτη της έκφρασης του γονιδίου σε εμβρυϊκά και αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα. Για εμβρυϊκά βλαστικά χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα Ε14 embryonic stem cells ενώ απομονώθηκαν και βλαστικά κύτταρα του μυελού των οστών, μεσεχγυματικά βλαστικά κύτταρα και οστεοβλάστες και φαίνεται η έκφραση του γονιδίου να περιορίζεται μόνο στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Η παρατήρηση αυτή ήταν πολύ σημαντική γιατί για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία σχετίζεται η ειδική έκφραση γονιδίου που κωδικοποιεί μια αποαδενυλάση με την βιολογία εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Ο έλεγχος της έκφρασης 157

Συζήτηση του γονιδίου σε γαμετικούς ιστούς και σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα εγείρει ερωτήματα σχετικά με τον ρόλο της PNLDC1 στην ανακύκλωση και έλεγχο συγκεκριμένων μεταγράφων παραγόντων που ελέγχουν την πολυδυναμία και την διαφοροποίηση. Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή μελέτες επί της μεθυλοτρανσφεράσης Dnmt3b στο ποντίκι υπέδειξαν εμπλοκή της μεθυλοτρανσφεράσης αυτής στην σίγηση του γονιδίου PNLDC1. Η μεθυλοτρανσφεράση αυτή εκφράζεται στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και μειώνεται σε πιο διαφοροποιημένα κύτταρα. Στην παρούσα διατριβή διαπιστώθηκε παρόμοια συμπεριφορά γεγονός που ενισχύει την πεποίθηση ότι η PNLDC1 εμπλέκεται για συγκεκριμένο σκοπό κατά τα πρώτα στάδια της διαφοροποίησης και σταδιακά περιορίζεται η έκφρασή της μέσω μεθυλίωσης του προαγωγέα της. Τα πειράματα διαφοροποίησης εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ήταν ενδεικτικά της υπόθεσής μας. Η πειραματική διαδικασία περιελάμβανε είτε την αφαίρεση του LIF που προκαλεί τυχαία διαφοροποίηση κυρίως προς μεσοδερμικά κύτταρα είτε την προσθήκη θρεπτικού N2B27 που οδηγεί τα κύτταρα προς νευρικά. Πολύ σημαντικοί παράγοντες που ευθύνονται για την διατήρηση της ολοδυναμικότιτας των βλαστικών κυττάρων βρίσκονται σε υψηλά επίπεδα στα κύτταρα αυτά και μειώνονται όταν αρχίζουν να διαφοροποιούνται. Στα πειράματα μας ήταν ενδεικτική η μείωση των παραγόντων αυτών. Πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι ο NANOG ο οποίος έχει μεγάλη ειδική έκφραση στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ενώ ευθύνεται για την ανανέωση τους στην κατάσταση της πολυδυναμικότιτας. Είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που δρα σε συνεργασία με τους OCT-4 και SOX2 για να καθορίζει τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων. Η έκφραση του μελετήθηκε καθώς είναι γνωστό ότι βλαστικά κύτταρα που εκφράζουν NANOG είναι δυνατόν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα εξωδέρματος, ενδοδέρματος και μεσοδέρματος ενώ η έκφραση του μειώνεται όταν τα κύτταρα αποκτήσουν συγκεκριμένη κατεύθυνση. Κατά την διαφοροποίηση των κυττάρων η έκφρασης του μειώθηκε από τις τρείς πρώτες μέρες. Για να επιβεβαιωθεί η διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων προς εξώδεμα και συγκεκριμένα προς νευρικά κύτταρα μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου shh. To γονίδιο αυτό κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Sonic Hedgehog η οποία είναι ένας μορφογενετικός παράγοντας και εμπλέκεται στην δημιουργία του νευρικού συστήματος. Ο παράγοντας αυτός αυξήθηκε χαρακτηριστικά σε κύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν στο θρεπτικό μέσω N2B27 επιβεβαιώνοντας την διαφοροποίηση τους προς νευρικά κύτταρα. Η αύξηση του παράγοντα αυτού στην περίπτωση της νευρικής διαφοροποίησης ήταν απαραίτητη παρατήρηση για να επιβεβαιωθεί ότι τα κύτταρα αυτά δεν διαφοροποιούνται με τυχαίο τρόπο. Η PNLDC1 μειώνεται δραματικά από τις τρείς πρώτες μέρες της διαφοροποίησης και ακολουθεί τα πρότυπα έκφρασης των παραγόντων πολυδυναμίας και ιδιαίτερα του παράγοντα NANOG ο οποίος όπως αναφέρθηκε παραπάνω είναι ένας σημαντικός παράγοντας με ειδική έκφραση στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Για πρώτη φόρα στην βιβλιογραφία αναφέρεται ότι μία αποαδενυλάση υπόκειται σε αυστηρό επιγενετικό έλεγχο και εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε αδιαφοροποίητα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. 158

Συζήτηση Ταυτόχρονα διαλευκάνθηκε ο ρόλος της μεθυλίωσης του προαγωγέα του γονιδίου Pnldc1 από την μεθυλοτρανσφεράση DNMT3B. Η έκφραση της DNMT3B σε αδιαφοροποίητα κύτταρα φτάνει στα υψηλότερα επίπεδα κατά τις 3 πρώτες μέρες της διαφοροποίησης μεθυλιώνοντας και τον προαγωγέα του γονιδίου Pnldc1 και έπειτα μειώνεται σε ακόμα μικρότερα επίπεδα από τα αρχικά έχοντας καθορίσει τα πρότυπα μεθυλίωσης. Στη συνέχεια άλλες μεθυλοτρανσφεράσες διατηρούν τα πρότυπα μεθυλίωσης συμπεριλαμβανομένου και του γονιδίου Pnldc1. Εικόνα 98 Σχετική έκφραση των γονιδίων dnmt3b και pbldc1 κατά την διαφοροποίηση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων Ε14 Έγινε προσπάθεια εύρεσης του πιθανού βιολογικού ρόλου της νέας αυτής αποαδενυλάσης με ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος. Η ανάλυση αυτή πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HEK 293 τα οποία είχαν διαμολυνθεί με πλασμίδια που κωδικοποιούν τις δύο ισομορφές της PNLDC1 καθώς και σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα στα οποία πραγματοποιήθηκε αποσιώπηση του γονιδίου. Από την ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων σε διαφοροποιημένα κύτταρα (ΗΕΚ293) μετά από έκφραση της PNLDC1 φαίνεται να υπάρχει μία λειτουργική συσχέτιση της PNLDC1 με άλλες αποαδενυλάσες. Είναι ενδιαφέρον ότι αυξήθηκαν τα επίπεδα της CNOT6L και της CNOT7 καθώς έχει αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες αυτές εμπλέκονται στην ανάπτυξη αλλά και στην αναπαραγωγή (176,177). Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι υπήρχε δραματική μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης παραγόντων που εμπλέκονται στην μεταγραφή όπως οι ZNF138, THRB, ZNF117, POU4F3, και NKX3-1 οι οποίοι παρουσίασαν αύξηση και οι BACH1, ZNF167, ZNF582, MTF1, MIER3 και PSIP1 (ο οποίος εμπλέκεται στην διαφοροποίηση των νευροεπιθηλιακών βλαστικών κυττάρων) οι οποίοι παρουσίασαν μείωση. Δύο παράγοντες ενδοκυτταρικής κυστιδιακής μεταφοράς (FAM134B, TSG101) αυξήθηκαν ενώ χαρακτηριστική είναι και η αύξηση της FSHB, μίας υπομονάδας της ορμόνης FSH η οποία είναι απαραίτητη για την ωογένεση και σπερματογένεση. Η παρατήρηση αυτή συνδέεται με το γεγονός ότι η PNLDC1 βρίσκεται στους αναπαραγωγικούς ιστούς και κυρίως στα σπερματοκύτταρα. Είναι χαρακτηριστική επίσης η μείωση πρωτεϊνών που σχετίζονται με τα μιτοχόνδρια ενώ φαίνεται ότι 159

Συζήτηση μεταβάλλονται και παράγοντες αγγειογένεσης. Το γεγονός αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα ιστολογικά δεδομένα που δείχνουν ότι η PNLDC1 εκφράζεται και στα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων. Παράγοντες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της μεταγραφής, στην κυτταρική κυστιδιακή μεταφορά και στην λειτουργία των μιτοχονδρίων βρέθηκαν να μεταβάλλονται και μετά από αποσιώπηση της PNLDC1 στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (Εικόνα 99). Επιπρόσθετες λειτουργίες στις οποίες εμπλέκονται παράγοντες με διαφορική έκφραση στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα είναι η ρύθμιση της μετάφρασης, του μεταβολισμού και πιο συγκεκριμένα ο μεταβολισμός της γαλακτόζης. Το πιο σημαντικό όμως είναι το γεγονός ότι μεταβάλλονται παράγοντες πολυδυναμίας και διαφοροποίησης. Δύο πρωτεΐνες που παρουσιάζουν σημαντική μείωση είναι η πρωτεΐνη QSER1 και η L1TD1 οι οποίες είναι σημαντικές για την διατήρηση της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων (181,182). Το γεγονός ότι απορυθμίζονται παράγοντες πολυδυναμίας ενισχύεται ακόμα περισσότερο από τη μελέτη της έκφρασης των παραγόντων Yamanaka οι οποίοι μειώνονται δραματικά όταν αποσιωπάται η PNLDC1. Πιο χαρακτηριστική μείωση παρουσιάζει ο SOX2 ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας απολύτως απαραίτητος για την διατήρηση της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων. Εικόνα 99 Διαδικασίες που ρυθμίζουν οι παράγοντες που μεταβάλλονται είτε σε κύτταρα ΗΕΚ293 μετά από έκφραση της PNLDC1 είτε σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα αποσιωπώντας την Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή συνέβαλε στην κατανόηση της διαδικασίας της αποαδενυλίωσης και ανέδειξε την πιθανή εμπλοκή της στην διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων. Η PNLDC1 αντιπροσωπεύει ένα νέο μέλος της οικογένειας των DEDD αποαδενυλασών που παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες αλλά και σημαντικές διαφορές με την PARN. Ο υποκυττάριος εντοπισμός της περιορίζεται εκτός του πυρήνα, γεγονός που φαίνεται να υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή της στην ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης, είτε μέσω της φυσιολογικής ανακύκλωσης των mrnas είτε μέσω προσέλκυσής της από τον μηχανισμό της mirna διαμεσολαβούμενης αποσιώπησης. Λαμβάνοντας μάλιστα υπόψη 160

Συζήτηση παρατηρήσεις οι οποίες αναφέρουν πως πολλές αποαδενυλάσες υπερεκφράζονται σε πολλά είδη καρκίνου και κυρίως σε αιματολογικές νεοπλασίες, είναι σημαντικό σε επόμενα βήματα να μελετηθεί η λειτουργία της PARN σε τέτοιου είδους νοσήματα. Είναι γνωστό ότι όσο πιο γρήγορος είναι ο ρυθμός ανακύκλωσης του mrna και όσο πιο πολύ επηρεάζεται η σταθερότητα συγκεκριμένων μετάγραφων (ογκογονιδίων ή ογκοκατασταλτικών γονιδίων), τόσο πιο εύθραυστη είναι η ισορροπία της σωστής και απρόσκοπτης ροής της γενετικής πληροφορίας. Επιπρόσθετα, είναι γεγονός ότι επειδή η αποαδενυλίωση είναι μια διαδικασία που ρυθμίζει το ρυθμό και τα επίπεδα της πρωτεϊνοσύνθεσης, και επειδή στον καρκίνο τα επίπεδα της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι υψηλά, η στοχευόμενη αναστολή αποαδενυλασών θα ήταν μια σημαντική προσέγγιση για αντικαρκινική θεραπεία σε μοριακό επίπεδο (Εικόνα 100). Εικόνα 100 Ο ρυθμός βιογένεσης και ανακύκλωσης του mrna ρυθμίζει τον ρυθμό της πρωτεϊνοσύνθεσης Η πιο σημαντική παρατήρηση όμως της παρούσας διατριβής ήταν η συσχέτιση της έκφρασης και του επιγενετικού ελέγχου της PNLDC1 σε βλαστικά κύτταρα. Η παρατήρηση αυτή γίνεται για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία και αποτελεί ένα επόμενο ερευνητικό στόχο όπου θα μελετηθεί η έκφραση και η λειτουργία της PNLDC1 σε ένα ολοκληρωμένο μοντέλο διαφοροποίησης στον άνθρωπο. 161

Συζήτηση 162

163 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Βιβλιογραφία 1. Leslie, I.A.N. (1961) Biochemistry of Heredity: A General Hypothesis. Nature, 189, 260-268. 2. Crick, F. (1970) Central dogma of molecular biology. Nature, 227, 561-563. 3. Rheinberger, H.-J. (2006), Protein Synthesis and Ribosome Structure. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, pp. 1-51. 4. Kruger, K., Grabowski, P.J., Zaug, A.J., Sands, J., Gottschling, D.E. and Cech, T.R. (1982) Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell, 31, 147-157. 5. Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Marsh, T., Pace, N. and Altman, S. (1983) The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell, 35, 849-857. 6. Steitz, T.A. and Moore, P.B. (2003) RNA, the first macromolecular catalyst: the ribosome is a ribozyme. Trends in biochemical sciences, 28, 411-418. 7. Jacob, F., Perrin, D., Sanchez, C., Monod, J. and Edelstein, S. (2005) [The operon: a group of genes with expression coordinated by an operator. C.R.Acad. Sci. Paris 250 (1960) 1727-1729]. Comptes rendus biologies, 328, 514-520. 8. Wachter, A. (2014) Gene regulation by structured mrna elements. Trends in genetics : TIG, 30, 172-181. 9. Garst, A.D., Edwards, A.L. and Batey, R.T. (2011) Riboswitches: structures and mechanisms. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3. 10. Razin, A. and Cedar, H. (1991) DNA methylation and gene expression. Microbiological reviews, 55, 451-458. 11. Jones, P.A. and Takai, D. (2001) The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science (New York, N.Y.), 293, 1068-1070. 12. Li, E. (2002) Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet, 3, 662-673. 13. Goll, M.G., Kirpekar, F., Maggert, K.A., Yoder, J.A., Hsieh, C.L., Zhang, X., Golic, K.G., Jacobsen, S.E. and Bestor, T.H. (2006) Methylation of trnaasp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science (New York, N.Y.), 311, 395-398. 14. Brenner, S., Jacob, F. and Meselson, M. (1961) An unstable intermediate carrying information from genes to ribosomes for protein synthesis. Nature, 190, 576-581. 15. Ben-Ari, Y.a., Brody, Y., Kinor, N., Mor, A., Tsukamoto, T., Spector, D.L., Singer, R.H. and Shav-Tal, Y. (2010) The life of an mrna in space and time. Journal of Cell Science, 123, 1761-1774. 16. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D. and Darnell, J. (2001) In Freeman, W. H. (ed.). 4 ed, New York. 17. Conti, E. and Izaurralde, E. (2005) Nonsense-mediated mrna decay: molecular insights and mechanistic variations across species. Current opinion in cell biology, 17, 316-325. 18. Le Hir, H., Izaurralde, E., Maquat, L.E. and Moore, M.J. (2000) The spliceosome deposits multiple proteins 20-24 nucleotides upstream of mrna exon-exon junctions. The EMBO journal, 19, 6860-6869. 19. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F.D., Bork, P. and Izaurralde, E. (2003) Nonsense-mediated mrna decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO journal, 22, 3960-3970. 20. Mitchell, P. and Tollervey, D. (2003) An NMD pathway in yeast involving accelerated deadenylation and exosome-mediated 3'-->5' degradation. Molecular cell, 11, 1405-1413. 21. van Hoof, A., Frischmeyer, P.A., Dietz, H.C. and Parker, R. (2002) Exosome-mediated recognition and degradation of mrnas lacking a termination codon. Science (New York, N.Y.), 295, 2262-2264. 164

Βιβλιογραφία 22. Frischmeyer, P.A., van Hoof, A., O'Donnell, K., Guerrerio, A.L., Parker, R. and Dietz, H.C. (2002) An mrna surveillance mechanism that eliminates transcripts lacking termination codons. Science (New York, N.Y.), 295, 2258-2261. 23. Doma, M.K. and Parker, R. (2006) Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mrnas with stalls in translation elongation. Nature, 440, 561-564. 24. Goldstrohm, A.C. and Wickens, M. (2008) Multifunctional deadenylase complexes diversify mrna control. Nature reviews. Molecular cell biology, 9, 337-344. 25. He, F., Li, X., Spatrick, P., Casillo, R., Dong, S. and Jacobson, A. (2003) Genome-wide analysis of mrnas regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mrna decay pathways in yeast. Molecular cell, 12, 1439-1452. 26. Houalla, R., Devaux, F., Fatica, A., Kufel, J., Barrass, D., Torchet, C. and Tollervey, D. (2006) Microarray detection of novel nuclear RNA substrates for the exosome. Yeast (Chichester, England), 23, 439-454. 27. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y.S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M. and Becker, K.G. (2005) Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mrna transcription and mrna stability. BMC genomics, 6, 75. 28. Gill, T., Cai, T., Aulds, J., Wierzbicki, S. and Schmitt, M.E. (2004) RNase MRP cleaves the CLB2 mrna to promote cell cycle progression: novel method of mrna degradation. Molecular and cellular biology, 24, 945-953. 29. Liu, J., Carmell, M.A., Rivas, F.V., Marsden, C.G., Thomson, J.M., Song, J.J., Hammond, S.M., Joshua-Tor, L. and Hannon, G.J. (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science (New York, N.Y.), 305, 1437-1441. 30. Song, J.J., Smith, S.K., Hannon, G.J. and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science (New York, N.Y.), 305, 1434-1437. 31. Dupressoir, A., Morel, A.P., Barbot, W., Loireau, M.P., Corbo, L. and Heidmann, T. (2001) Identification of four families of yccr4- and Mg2+-dependent endonucleaserelated proteins in higher eukaryotes, and characterization of orthologs of yccr4 with a conserved leucine-rich repeat essential for hcaf1/hpop2 binding. BMC genomics, 2, 9. 32. Lau, N.C., Kolkman, A., van Schaik, F.M., Mulder, K.W., Pijnappel, W.W., Heck, A.J. and Timmers, H.T. (2009) Human Ccr4-Not complexes contain variable deadenylase subunits. The Biochemical journal, 422, 443-453. 33. Wagner, E., Clement, S.L. and Lykke-Andersen, J. (2007) An unconventional human CCR4-CAF1 deadenylase complex in nuclear cajal bodies. Mol. Cell Biol., 27, 1686-1695. 34. Pavlopoulou, A., Vlachakis, D., Balatsos, N.A. and Kossida, S. (2013) A comprehensive phylogenetic analysis of deadenylases. Evolutionary bioinformatics online, 9, 491-497. 35. Garneau, N.L., Wilusz, J. and Wilusz, C.J. (2007) The highways and byways of mrna decay. Nature reviews. Molecular cell biology, 8, 113-126. 36. Tucker, M., Valencia-Sanchez, M.A., Staples, R.R., Chen, J., Denis, C.L. and Parker, R. (2001) The transcription factor associated Ccr4 and Caf1 proteins are components of the major cytoplasmic mrna deadenylase in Saccharomyces cerevisiae. Cell, 104, 377-386. 37. Yamashita, A. (2005) Concerted action of poly(a) nucleases and decapping enzyme in mammalian mrna turnover. Nature Struct. Mol. Biol., 12, 1054-1063. 38. Wagner, E., Clement, S.L. and Lykke-Andersen, J. (2007) An unconventional human Ccr4-Caf1 deadenylase complex in nuclear cajal bodies. Molecular and cellular biology, 27, 1686-1695. 165

Βιβλιογραφία 39. Tessema, M., Willink, R., Do, K., Yu, Y.Y., Yu, W., Machida, E.O., Brock, M., Van Neste, L., Stidley, C.A., Baylin, S.B. et al. (2008) Promoter methylation of genes in and around the candidate lung cancer susceptibility locus 6q23-25. Cancer research, 68, 1707-1714. 40. Zuo, Y. and Deutscher, M.P. (2001) Exoribonuclease superfamilies: structural analysis and phylogenetic distribution. Nucleic acids research, 29, 1017-1026. 41. Faber, A.W., Van Dijk, M., Raue, H.A. and Vos, J.C. (2002) Ngl2p is a Ccr4p-like RNA nuclease essential for the final step in 3'-end processing of 5.8S rrna in Saccharomyces cerevisiae. RNA (New York, N.Y.), 8, 1095-1101. 42. Wang, H., Morita, M., Yang, X., Suzuki, T., Yang, W., Wang, J., Ito, K., Wang, Q., Zhao, C., Bartlam, M. et al. (2010) Crystal structure of the human CNOT6L nuclease domain reveals strict poly(a) substrate specificity. The EMBO journal, 29, 2566-2576. 43. Basquin, J., Roudko, V.V., Rode, M., Basquin, C., Seraphin, B. and Conti, E. (2012) Architecture of the nuclease module of the yeast Ccr4-not complex: the Not1-Caf1- Ccr4 interaction. Molecular cell, 48, 207-218. 44. Petit, A.P., Wohlbold, L., Bawankar, P., Huntzinger, E., Schmidt, S., Izaurralde, E. and Weichenrieder, O. (2012) The structural basis for the interaction between the CAF1 nuclease and the NOT1 scaffold of the human CCR4-NOT deadenylase complex. Nucleic acids research, 40, 11058-11072. 45. Dlakic, M. (2000) Functionally unrelated signalling proteins contain a fold similar to Mg2+-dependent endonucleases. Trends in biochemical sciences, 25, 272-273. 46. Reijns, M.A., Alexander, R.D., Spiller, M.P. and Beggs, J.D. (2008) A role for Q/N-rich aggregation-prone regions in P-body localization. J Cell Sci, 121, 2463-2472. 47. He, G.J., Zhang, A., Liu, W.F., Cheng, Y. and Yan, Y.B. (2009) Conformational stability and multistate unfolding of poly(a)-specific ribonuclease. The FEBS journal, 276, 2849-2860. 48. Niedzwiecka, A., Lekka, M., Nilsson, P. and Virtanen, A. (2011) Global architecture of human poly(a)-specific ribonuclease by atomic force microscopy in liquid and dynamic light scattering. Biophysical chemistry, 158, 141-149. 49. He, G.J., Zhang, A., Liu, W.F. and Yan, Y.B. (2013) Distinct roles of the R3H and RRM domains in poly(a)-specific ribonuclease structural integrity and catalysis. Biochimica et biophysica acta, 1834, 1089-1098. 50. Balatsos, N.A., Nilsson, P., Mazza, C., Cusack, S. and Virtanen, A. (2006) Inhibition of mrna deadenylation by the nuclear cap binding complex (CBC). The Journal of biological chemistry, 281, 4517-4522. 51. Liu, W.F., Zhang, A., He, G.J. and Yan, Y.B. (2007) The R3H domain stabilizes poly(a)- specific ribonuclease by stabilizing the RRM domain. Biochemical and biophysical research communications, 360, 846-851. 52. Wu, M., Nilsson, P., Henriksson, N., Niedzwiecka, A., Lim, M.K., Cheng, Z., Kokkoris, K., Virtanen, A. and Song, H. (2009) Structural basis of m(7)gpppg binding to poly(a)-specific ribonuclease. Structure (London, England : 1993), 17, 276-286. 53. Zhang, A., Liu, W.F. and Yan, Y.B. (2007) Role of the RRM domain in the activity, structure and stability of poly(a)-specific ribonuclease. Archives of biochemistry and biophysics, 461, 255-262. 54. Nilsson, P., Henriksson, N., Niedzwiecka, A., Balatsos, N.A., Kokkoris, K., Eriksson, J. and Virtanen, A. (2007) A multifunctional RNA recognition motif in poly(a)-specific ribonuclease with cap and poly(a) binding properties. The Journal of biological chemistry, 282, 32902-32911. 55. Wu, M. (2005) Structural insight into poly(a) binding and catalytic mechanism of human PARN. EMBO J., 24, 4082-4093. 166

Βιβλιογραφία 56. He, G.J. and Yan, Y.B. (2014) Self-association of poly(a)-specific ribonuclease (PARN) triggered by the R3H domain. Biochimica et biophysica acta, 1844, 2077-2085. 57. Brown, C.E., Tarun, S.Z., Jr., Boeck, R. and Sachs, A.B. (1996) PAN3 encodes a subunit of the Pab1p-dependent poly(a) nuclease in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology, 16, 5744-5753. 58. Denis, C.L. and Chen, J. (2003) The CCR4-NOT complex plays diverse roles in mrna metabolism. Progress in nucleic acid research and molecular biology, 73, 221-250. 59. Lin, W.J., Duffy, A. and Chen, C.Y. (2007) Localization of AU-rich element-containing mrna in cytoplasmic granules containing exosome subunits. The Journal of biological chemistry, 282, 19958-19968. 60. Morita, M., Suzuki, T., Nakamura, T., Yokoyama, K., Miyasaka, T. and Yamamoto, T. (2007) Depletion of mammalian CCR4b deadenylase triggers elevation of the p27kip1 mrna level and impairs cell growth. Molecular and cellular biology, 27, 4980-4990. 61. Goldstrohm, A.C., Hook, B.A., Seay, D.J. and Wickens, M. (2006) PUF proteins bind Pop2p to regulate messenger RNAs. Nature structural & molecular biology, 13, 533-539. 62. Morel, A.P., Sentis, S., Bianchin, C., Le Romancer, M., Jonard, L., Rostan, M.C., Rimokh, R. and Corbo, L. (2003) BTG2 antiproliferative protein interacts with the human CCR4 complex existing in vivo in three cell-cycle-regulated forms. Journal of cell science, 116, 2929-2936. 63. Jonstrup, A.T., Andersen, K.R., Van, L.B. and Brodersen, D.E. (2007) The 1.4-A crystal structure of the S. pombe Pop2p deadenylase subunit unveils the configuration of an active enzyme. Nucleic acids research, 35, 3153-3164. 64. Feddersen, A., Dedic, E., Poulsen, E.G., Schmid, M., Van, L.B., Jensen, T.H. and Brodersen, D.E. (2012) Saccharomyces cerevisiae Ngl3p is an active 3'-5' exonuclease with a specificity towards poly-a RNA reminiscent of cellular deadenylases. Nucleic acids research, 40, 837-846. 65. Poulsen, J.B., Andersen, K.R., Kjaer, K.H., Durand, F., Faou, P., Vestergaard, A.L., Talbo, G.H., Hoogenraad, N., Brodersen, D.E., Justesen, J. et al. (2011) Human 2'- phosphodiesterase localizes to the mitochondrial matrix with a putative function in mitochondrial RNA turnover. Nucleic acids research, 39, 3754-3770. 66. Henriksson, N., Nilsson, P., Wu, M., Song, H. and Virtanen, A. (2010) Recognition of adenosine residues by the active site of poly(a)-specific ribonuclease. The Journal of biological chemistry, 285, 163-170. 67. He, G.J. and Yan, Y.B. (2012) A deadenylase assay by size-exclusion chromatography. PloS one, 7, e33700. 68. Malecki, M., Viegas, S.C., Carneiro, T., Golik, P., Dressaire, C., Ferreira, M.G. and Arraiano, C.M. (2013) The exoribonuclease Dis3L2 defines a novel eukaryotic RNA degradation pathway. The EMBO journal, 32, 1842-1854. 69. Lubas, M., Damgaard, C.K., Tomecki, R., Cysewski, D., Jensen, T.H. and Dziembowski, A. (2013) Exonuclease hdis3l2 specifies an exosome-independent 3'-5' degradation pathway of human cytoplasmic mrna. The EMBO journal, 32, 1855-1868. 70. Chang, H.M., Triboulet, R., Thornton, J.E. and Gregory, R.I. (2013) A role for the Perlman syndrome exonuclease Dis3l2 in the Lin28-let-7 pathway. Nature, 497, 244-248. 71. Liu, W.F. and Yan, Y.B. (2008) Biophysical and biochemical characterization of recombinant human Pop2 deadenylase. Protein expression and purification, 60, 46-52. 72. Badis, G., Saveanu, C., Fromont-Racine, M. and Jacquier, A. (2004) Targeted mrna degradation by deadenylation-independent decapping. Molecular cell, 15, 5-15. 167

Βιβλιογραφία 73. Liu, W.F., Zhang, A., Cheng, Y., Zhou, H.M. and Yan, Y.B. (2009) Allosteric regulation of human poly(a)-specific ribonuclease by cap and potassium ions. Biochemical and biophysical research communications, 379, 341-345. 74. Ren, Y.G., Kirsebom, L.A. and Virtanen, A. (2004) Coordination of divalent metal ions in the active site of poly(a)-specific ribonuclease. The Journal of biological chemistry, 279, 48702-48706. 75. Beese, L.S. and Steitz, T.A. (1991) Structural basis for the 3'-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. The EMBO journal, 10, 25-33. 76. Liu, W.F., Zhang, A., Cheng, Y., Zhou, H.M. and Yan, Y.B. (2007) Effect of magnesium ions on the thermal stability of human poly(a)-specific ribonuclease. FEBS letters, 581, 1047-1052. 77. He, G.J., Liu, W.F. and Yan, Y.B. (2011) Dissimilar roles of the four conserved acidic residues in the thermal stability of poly(a)-specific ribonuclease. International journal of molecular sciences, 12, 2901-2916. 78. Zhang, J.Q., He, G.J. and Yan, Y.B. (2013) Biochemical and biophysical characterization of the deadenylase CrCaf1 from Chlamydomonas reinhardtii. PloS one, 8, e69582. 79. Virtanen, A., Henriksson, N., Nilsson, P. and Nissbeck, M. (2013) Poly(A)-specific ribonuclease (PARN): an allosterically regulated, processive and mrna capinteracting deadenylase. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 48, 192-209. 80. Yamashita, A., Chang, T.C., Yamashita, Y., Zhu, W., Zhong, Z., Chen, C.Y. and Shyu, A.B. (2005) Concerted action of poly(a) nucleases and decapping enzyme in mammalian mrna turnover. Nature structural & molecular biology, 12, 1054-1063. 81. Breyer, W.A. and Matthews, B.W. (2001) A structural basis for processivity. Protein science : a publication of the Protein Society, 10, 1699-1711. 82. Tucker, M., Staples, R.R., Valencia-Sanchez, M.A., Muhlrad, D. and Parker, R. (2002) Ccr4p is the catalytic subunit of a Ccr4p/Pop2p/Notp mrna deadenylase complex in Saccharomyces cerevisiae. The EMBO journal, 21, 1427-1436. 83. Korner, C.G., Wormington, M., Muckenthaler, M., Schneider, S., Dehlin, E. and Wahle, E. (1998) The deadenylating nuclease (DAN) is involved in poly(a) tail removal during the meiotic maturation of Xenopus oocytes. The EMBO journal, 17, 5427-5437. 84. Molin, L. and Puisieux, A. (2005) C. elegans homologue of the Caf1 gene, which encodes a subunit of the CCR4-NOT complex, is essential for embryonic and larval development and for meiotic progression. Gene, 358, 73-81. 85. Morris, J.Z., Hong, A., Lilly, M.A. and Lehmann, R. (2005) Twin, a CCR4 homolog, regulates cyclin poly(a) tail length to permit Drosophila oogenesis. Development, 132, 1165-1174. 86. Chiba, Y., Johnson, M.A., Lidder, P., Vogel, J.T., van Erp, H. and Green, P.J. (2004) AtPARN is an essential poly(a) ribonuclease in Arabidopsis. Gene, 328, 95-102. 87. Reverdatto, S.V., Dutko, J.A., Chekanova, J.A., Hamilton, D.A. and Belostotsky, D.A. (2004) mrna deadenylation by PARN is essential for embryogenesis in higher plants. RNA (New York, N.Y.), 10, 1200-1214. 88. Berthet, C., Morera, A.M., Asensio, M.J., Chauvin, M.A., Morel, A.P., Dijoud, F., Magaud, J.P., Durand, P. and Rouault, J.P. (2004) CCR4-associated factor CAF1 is an essential factor for spermatogenesis. Molecular and cellular biology, 24, 5808-5820. 89. Nakamura, T., Yao, R., Ogawa, T., Suzuki, T., Ito, C., Tsunekawa, N., Inoue, K., Ajima, R., Miyasaka, T., Yoshida, Y. et al. (2004) Oligo-astheno-teratozoospermia in mice lacking Cnot7, a regulator of retinoid X receptor beta. Nature genetics, 36, 528-533. 168

Βιβλιογραφία 90. Morris, J.Z., Hong, A., Lilly, M.A. and Lehmann, R. (2005) twin, a CCR4 homolog, regulates cyclin poly(a) tail length to permit Drosophila oogenesis. Development (Cambridge, England), 132, 1165-1174. 91. Washio-Oikawa, K., Nakamura, T., Usui, M., Yoneda, M., Ezura, Y., Ishikawa, I., Nakashima, K., Noda, T., Yamamoto, T. and Noda, M. (2007) Cnot7-null mice exhibit high bone mass phenotype and modulation of BMP actions. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research, 22, 1217-1223. 92. Green, C.B., Douris, N., Kojima, S., Strayer, C.A., Fogerty, J., Lourim, D., Keller, S.R. and Besharse, J.C. (2007) Loss of Nocturnin, a circadian deadenylase, confers resistance to hepatic steatosis and diet-induced obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 9888-9893. 93. Bogdan, J.A., Adams-Burton, C., Pedicord, D.L., Sukovich, D.A., Benfield, P.A., Corjay, M.H., Stoltenborg, J.K. and Dicker, I.B. (1998) Human carbon catabolite repressor protein (CCR4)-associative factor 1: cloning, expression and characterization of its interaction with the B-cell translocation protein BTG1. The Biochemical journal, 336 ( Pt 2), 471-481. 94. Lejeune, F., Li, X. and Maquat, L.E. (2003) Nonsense-mediated mrna decay in mammalian cells involves decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities. Molecular cell, 12, 675-687. 95. Chen, C.Y. and Shyu, A.B. (2003) Rapid deadenylation triggered by a nonsense codon precedes decay of the RNA body in a mammalian cytoplasmic nonsense-mediated decay pathway. Molecular and cellular biology, 23, 4805-4813. 96. Green, C.B. and Besharse, J.C. (1996) Identification of a novel vertebrate circadian clock-regulated gene encoding the protein nocturnin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 14884-14888. 97. Prevot, D., Morel, A.P., Voeltzel, T., Rostan, M.C., Rimokh, R., Magaud, J.P. and Corbo, L. (2001) Relationships of the antiproliferative proteins BTG1 and BTG2 with CAF1, the human homolog of a component of the yeast CCR4 transcriptional complex: involvement in estrogen receptor alpha signaling pathway. The Journal of biological chemistry, 276, 9640-9648. 98. Balatsos, N.A., Vlachakis, D., Maragozidis, P., Manta, S., Anastasakis, D., Kyritsis, A., Vlassi, M., Komiotis, D. and Stathopoulos, C. (2009) Competitive inhibition of human poly(a)-specific ribonuclease (PARN) by synthetic fluoro-pyranosyl nucleosides. Biochemistry, 48, 6044-6051. 99. Balatsos, N.A., Anastasakis, D. and Stathopoulos, C. (2009) Inhibition of human poly(a)-specific ribonuclease (PARN) by purine nucleotides: kinetic analysis. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry, 24, 516-523. 100. Gowrishankar, G., Winzen, R., Dittrich-Breiholz, O., Redich, N., Kracht, M. and Holtmann, H. (2006) Inhibition of mrna deadenylation and degradation by different types of cell stress. Biological chemistry, 387, 323-327. 101. Stubblefield, J.J., Terrien, J. and Green, C.B. (2012) Nocturnin: at the crossroads of clocks and metabolism. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, 23, 326-333. 102. Zhang, X., Virtanen, A. and Kleiman, F.E. (2010) To polyadenylate or to deadenylate: that is the question. Cell cycle (Georgetown, Tex.), 9, 4437-4449. 103. Traven, A., Hammet, A., Tenis, N., Denis, C.L. and Heierhorst, J. (2005) Ccr4-not complex mrna deadenylase activity contributes to DNA damage responses in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 169, 65-75. 104. Traven, A., Beilharz, T.H., Lo, T.L., Lueder, F., Preiss, T. and Heierhorst, J. (2009) The Ccr4-Pop2-NOT mrna deadenylase contributes to septin organization in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 182, 955-966. 169

Βιβλιογραφία 105. Cevher, M.A., Zhang, X., Fernandez, S., Kim, S., Baquero, J., Nilsson, P., Lee, S., Virtanen, A. and Kleiman, F.E. (2010) Nuclear deadenylation/polyadenylation factors regulate 3' processing in response to DNA damage. The EMBO journal, 29, 1674-1687. 106. Maragozidis, P., Karangeli, M., Labrou, M., Dimoulou, G., Papaspyrou, K., Salataj, E., Pournaras, S., Matsouka, P., Gourgoulianis, K.I. and Balatsos, N.A. (2012) Alterations of deadenylase expression in acute leukemias: evidence for poly(a)-specific ribonuclease as a potential biomarker. Acta haematologica, 128, 39-46. 107. Zhang, L.N. and Yan, Y.B. (2015) Depletion of poly(a)-specific ribonuclease (PARN) inhibits proliferation of human gastric cancer cells by blocking cell cycle progression. Biochimica et biophysica acta, 1853, 522-534. 108. Nishimura, N., Kitahata, N., Seki, M., Narusaka, Y., Narusaka, M., Kuromori, T., Asami, T., Shinozaki, K. and Hirayama, T. (2005) Analysis of ABA hypersensitive germination2 revealed the pivotal functions of PARN in stress response in Arabidopsis. The Plant journal : for cell and molecular biology, 44, 972-984. 109. Chen, C., Ito, K., Takahashi, A., Wang, G., Suzuki, T., Nakazawa, T., Yamamoto, T. and Yokoyama, K. (2011) Distinct expression patterns of the subunits of the CCR4-NOT deadenylase complex during neural development. Biochemical and biophysical research communications, 411, 360-364. 110. Kojima, S., Gatfield, D., Esau, C.C. and Green, C.B. (2010) MicroRNA-122 modulates the rhythmic expression profile of the circadian deadenylase Nocturnin in mouse liver. PloS one, 5, e11264. 111. Zhou, W. and Thiery, J.P. (2013) Loss of Git2 induces epithelial-mesenchymal transition by mir146a-cnot6l-controlled expression of Zeb1. J Cell Sci, 126, 2740-2746. 112. Garneau, N.L., Wilusz, J. and Wilusz, C.J. (2007) The highways and byways of mrna decay. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 8, 113-126. 113. Conrad, N.K., Shu, M.D., Uyhazi, K.E. and Steitz, J.A. (2007) Mutational analysis of a viral RNA element that counteracts rapid RNA decay by interaction with the polyadenylate tail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 10412-10417. 114. Muhlrad, D. and Parker, R. (2005) The yeast EDC1 mrna undergoes deadenylationindependent decapping stimulated by Not2p, Not4p, and Not5p. The EMBO journal, 24, 1033-1045. 115. Berndt, H., Harnisch, C., Rammelt, C., Stohr, N., Zirkel, A., Dohm, J.C., Himmelbauer, H., Tavanez, J.P., Huttelmaier, S. and Wahle, E. (2012) Maturation of mammalian H/ACA box snornas: PAPD5-dependent adenylation and PARN-dependent trimming. RNA (New York, N.Y.), 18, 958-972. 116. Rorbach, J., Nicholls, T.J. and Minczuk, M. (2011) PDE12 removes mitochondrial RNA poly(a) tails and controls translation in human mitochondria. Nucleic acids research, 39, 7750-7763. 117. Copeland, P.R. and Wormington, M. (2001) The mechanism and regulation of deadenylation: identification and characterization of Xenopus PARN. RNA (New York, N.Y.), 7, 875-886. 118. Martinez, J., Ren, Y.G., Thuresson, A.C., Hellman, U., Astrom, J. and Virtanen, A. (2000) A 54-kDa fragment of the Poly(A)-specific ribonuclease is an oligomeric, processive, and cap-interacting Poly(A)-specific 3' exonuclease. The Journal of biological chemistry, 275, 24222-24230. 119. Balagopal, V. and Parker, R. (2009) Polysomes, P bodies and stress granules: states and fates of eukaryotic mrnas. Current opinion in cell biology, 21, 403-408. 170

Βιβλιογραφία 120. Ferraiuolo, M.A., Basak, S., Dostie, J., Murray, E.L., Schoenberg, D.R. and Sonenberg, N. (2005) A role for the eif4e-binding protein 4E-T in P-body formation and mrna decay. The Journal of cell biology, 170, 913-924. 121. Sheth, U. and Parker, R. (2003) Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies. Science (New York, N.Y.), 300, 805-808. 122. Sheth, U. and Parker, R. (2006) Targeting of aberrant mrnas to cytoplasmic processing bodies. Cell, 125, 1095-1109. 123. Morozov, I.Y., Jones, M.G., Spiller, D.G., Rigden, D.J., Dattenbock, C., Novotny, R., Strauss, J. and Caddick, M.X. (2010) Distinct roles for Caf1, Ccr4, Edc3 and CutA in the co-ordination of transcript deadenylation, decapping and P-body formation in Aspergillus nidulans. Molecular microbiology, 76, 503-516. 124. Zheng, D., Ezzeddine, N., Chen, C.Y., Zhu, W., He, X. and Shyu, A.B. (2008) Deadenylation is prerequisite for P-body formation and mrna decay in mammalian cells. The Journal of cell biology, 182, 89-101. 125. Teixeira, D. and Parker, R. (2007) Analysis of P-body assembly in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell, 18, 2274-2287. 126. Andrei, M.A., Ingelfinger, D., Heintzmann, R., Achsel, T., Rivera-Pomar, R. and Luhrmann, R. (2005) A role for eif4e and eif4e-transporter in targeting mrnps to mammalian processing bodies. RNA (New York, N.Y.), 11, 717-727. 127. Cougot, N., Babajko, S. and Seraphin, B. (2004) Cytoplasmic foci are sites of mrna decay in human cells. The Journal of cell biology, 165, 31-40. 128. Eulalio, A., Behm-Ansmant, I. and Izaurralde, E. (2007) P bodies: at the crossroads of post-transcriptional pathways. Nature reviews. Molecular cell biology, 8, 9-22. 129. Kim, J.H. and Richter, J.D. (2006) Opposing polymerase-deadenylase activities regulate cytoplasmic polyadenylation. Molecular cell, 24, 173-183. 130. Ezzeddine, N., Chang, T.C., Zhu, W., Yamashita, A., Chen, C.Y., Zhong, Z., Yamashita, Y., Zheng, D. and Shyu, A.B. (2007) Human TOB, an antiproliferative transcription factor, is a poly(a)-binding protein-dependent positive regulator of cytoplasmic mrna deadenylation. Molecular and cellular biology, 27, 7791-7801. 131. Hook, B.A., Goldstrohm, A.C., Seay, D.J. and Wickens, M. (2007) Two yeast PUF proteins negatively regulate a single mrna. The Journal of biological chemistry, 282, 15430-15438. 132. Kadyrova, L.Y., Habara, Y., Lee, T.H. and Wharton, R.P. (2007) Translational control of maternal Cyclin B mrna by Nanos in the Drosophila germline. Development, 134, 1519-1527. 133. Korner, C.G. and Wahle, E. (1997) Poly(A) tail shortening by a mammalian poly(a)- specific 3'-exoribonuclease. The Journal of biological chemistry, 272, 10448-10456. 134. Voeltz, G.K., Ongkasuwan, J., Standart, N. and Steitz, J.A. (2001) A novel embryonic poly(a) binding protein, epab, regulates mrna deadenylation in Xenopus egg extracts. Genes & development, 15, 774-788. 135. Yao, G., Chiang, Y.C., Zhang, C., Lee, D.J., Laue, T.M. and Denis, C.L. (2007) PAB1 selfassociation precludes its binding to poly(a), thereby accelerating CCR4 deadenylation in vivo. Molecular and cellular biology, 27, 6243-6253. 136. Simon, E. and Seraphin, B. (2007) A specific role for the C-terminal region of the Poly(A)-binding protein in mrna decay. Nucleic acids research, 35, 6017-6028. 137. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D. and Nagamine, Y. (2004) Facilitation of mrna deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Molecular cell, 13, 101-111. 138. Kim, J.H. and Richter, J.D. (2006) Opposing polymerase-deadenylase activities regulate cytoplasmic polyadenylation. Mol. Cell, 24, 173-183. 171

Βιβλιογραφία 139. Ogami, K., Hosoda, N., Funakoshi, Y. and Hoshino, S. (2014) Antiproliferative protein Tob directly regulates c-myc proto-oncogene expression through cytoplasmic polyadenylation element-binding protein CPEB. Oncogene, 33, 55-64. 140. Hosoda, N., Funakoshi, Y., Hirasawa, M., Yamagishi, R., Asano, Y., Miyagawa, R., Ogami, K., Tsujimoto, M. and Hoshino, S. (2011) Anti-proliferative protein Tob negatively regulates CPEB3 target by recruiting Caf1 deadenylase. The EMBO journal, 30, 1311-1323. 141. Cao, D. and Parker, R. (2001) Computational modeling of eukaryotic mrna turnover. RNA (New York, N.Y.), 7, 1192-1212. 142. Seal, R., Temperley, R., Wilusz, J., Lightowlers, R.N. and Chrzanowska-Lightowlers, Z.M. (2005) Serum-deprivation stimulates cap-binding by PARN at the expense of eif4e, consistent with the observed decrease in mrna stability. Nucleic acids research, 33, 376-387. 143. Denis, C.L. and Chen, J. (2003) The CCR4-NOT complex plays diverse roles in mrna metabolism. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 73, 221-250. 144. Ameres, S.L. and Zamore, P.D. (2013) Diversifying microrna sequence and function. Nature reviews. Molecular cell biology, 14, 475-488. 145. Friedman, R.C., Farh, K.K., Burge, C.B. and Bartel, D.P. (2009) Most mammalian mrnas are conserved targets of micrornas. Genome research, 19, 92-105. 146. Ipsaro, J.J. and Joshua-Tor, L. (2015) From guide to target: molecular insights into eukaryotic RNA-interference machinery. Nature structural & molecular biology, 22, 20-28. 147. Standart, N. and Jackson, R.J. (2007) MicroRNAs repress translation of m7gpppcapped target mrnas in vitro by inhibiting initiation and promoting deadenylation. Genes & development, 21, 1975-1982. 148. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Doerks, T., Stark, A., Bork, P. and Izaurralde, E. (2006) mrna degradation by mirnas and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes & development, 20, 1885-1898. 149. Ricci, E.P., Limousin, T., Soto-Rifo, R., Allison, R., Poyry, T., Decimo, D., Jackson, R.J. and Ohlmann, T. (2011) Activation of a microrna response in trans reveals a new role for poly(a) in translational repression. Nucleic acids research, 39, 5215-5231. 150. Zhang, X., Devany, E., Murphy, M.R., Glazman, G., Persaud, M. and Kleiman, F.E. (2015) PARN deadenylase is involved in mirna-dependent degradation of TP53 mrna in mammalian cells. Nucleic acids research. 151. Balatsos, N.A., Maragozidis, P., Anastasakis, D. and Stathopoulos, C. (2012) Modulation of poly(a)-specific ribonuclease (PARN): current knowledge and perspectives. Current medicinal chemistry, 19, 4838-4849. 152. Miyasaka, T., Morita, M., Ito, K., Suzuki, T., Fukuda, H., Takeda, S., Inoue, J., Semba, K. and Yamamoto, T. (2008) Interaction of antiproliferative protein Tob with the CCR4-NOT deadenylase complex. Cancer science, 99, 755-761. 153. Lai, W.S., Kennington, E.A. and Blackshear, P.J. (2003) Tristetraprolin and its family members can promote the cell-free deadenylation of AU-rich element-containing mrnas by poly(a) ribonuclease. Molecular and cellular biology, 23, 3798-3812. 154. Suswam, E., Li, Y., Zhang, X., Gillespie, G.Y., Li, X., Shacka, J.J., Lu, L., Zheng, L. and King, P.H. (2008) Tristetraprolin down-regulates interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in malignant glioma cells. Cancer research, 68, 674-682. 155. Chou, C.F., Mulky, A., Maitra, S., Lin, W.J., Gherzi, R., Kappes, J. and Chen, C.Y. (2006) Tethering KSRP, a decay-promoting AU-rich element-binding protein, to mrnas elicits mrna decay. Molecular and cellular biology, 26, 3695-3706. 172

Βιβλιογραφία 156. Tran, H., Maurer, F. and Nagamine, Y. (2003) Stabilization of urokinase and urokinase receptor mrnas by HuR is linked to its cytoplasmic accumulation induced by activated mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2. Molecular and cellular biology, 23, 7177-7188. 157. Moraes, K.C., Wilusz, C.J. and Wilusz, J. (2006) CUG-BP binds to RNA substrates and recruits PARN deadenylase. RNA (New York, N.Y.), 12, 1084-1091. 158. Vulliamy, T., Beswick, R., Kirwan, M., Marrone, A., Digweed, M., Walne, A. and Dokal, I. (2008) Mutations in the telomerase component NHP2 cause the premature ageing syndrome dyskeratosis congenita. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 8073-8078. 159. Tummala, H., Walne, A., Collopy, L., Cardoso, S., de la Fuente, J., Lawson, S., Powell, J., Cooper, N., Foster, A., Mohammed, S. et al. (2015) Poly(A)-specific ribonuclease deficiency impacts telomere biology and causes dyskeratosis congenita. The Journal of clinical investigation, 125, 2151-2160. 160. Dhanraj, S., Gunja, S.M., Deveau, A.P., Nissbeck, M., Boonyawat, B., Coombs, A.J., Renieri, A., Mucciolo, M., Marozza, A., Buoni, S. et al. (2015) Bone marrow failure and developmental delay caused by mutations in poly(a)-specific ribonuclease (PARN). Journal of medical genetics. 161. Radford, H.E., Meijer, H.A. and de Moor, C.H. (2008) Translational control by cytoplasmic polyadenylation in Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta, 1779, 217-229. 162. Zaessinger, S., Busseau, I. and Simonelig, M. (2006) Oskar allows nanos mrna translation in Drosophila embryos by preventing its deadenylation by Smaug/CCR4. Development, 133, 4573-4583. 163. Temme, C., Zaessinger, S., Meyer, S., Simonelig, M. and Wahle, E. (2004) A complex containing the CCR4 and CAF1 proteins is involved in mrna deadenylation in Drosophila. The EMBO journal, 23, 2862-2871. 164. Fiser, A. and Sali, A. (2003) Modeller: generation and refinement of homology-based protein structure models. Methods in enzymology, 374, 461-491. 165. Case, D.A., Cheatham, T.E., 3rd, Darden, T., Gohlke, H., Luo, R., Merz, K.M., Jr., Onufriev, A., Simmerling, C., Wang, B. and Woods, R.J. (2005) The Amber biomolecular simulation programs. Journal of computational chemistry, 26, 1668-1688. 166. Yellajoshyula, D., Patterson, E.S., Elitt, M.S. and Kroll, K.L. (2011) Geminin promotes neural fate acquisition of embryonic stem cells by maintaining chromatin in an accessible and hyperacetylated state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108, 3294-3299. 167. Ying, Q.L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M. and Smith, A. (2003) Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature biotechnology, 21, 183-186. 168. Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 162, 156-159. 169. Harrow, J., Nagy, A., Reymond, A., Alioto, T., Patthy, L., Antonarakis, S.E. and Guigo, R. (2009) Identifying protein-coding genes in genomic sequences. Genome biology, 10, 201. 170. Niedzwiecka, A., Lekka, M., Nilsson, P. and Virtanen, A. (2011) Global architecture of human poly(a)-specific ribonuclease by atomic force microscopy in liquid and dynamic light scattering. Biophysical chemistry, 158, 141-149. 171. Yan, Y.B. (2014) Deadenylation: enzymes, regulation, and functional implications. Wiley interdisciplinary reviews. RNA, 5, 421-443. 173

Βιβλιογραφία 172. Yoda, M., Cifuentes, D., Izumi, N., Sakaguchi, Y., Suzuki, T., Giraldez, A.J. and Tomari, Y. (2013) PARN mediates 3 -end trimming of Argonaute2-cleaved precursor micrornas. Cell reports, 5, 10.1016/j.celrep.2013.1009.1029. 173. Nagata, T., Suzuki, S., Endo, R., Shirouzu, M., Terada, T., Inoue, M., Kigawa, T., Kobayashi, N., Güntert, P., Tanaka, A. et al. (2008) The RRM domain of poly(a)- specific ribonuclease has a noncanonical binding site for mrna cap analog recognition. Nucleic acids research, 36, 4754-4767. 174. Martinez, J., Ren, Y.G., Nilsson, P., Ehrenberg, M. and Virtanen, A. (2001) The mrna cap structure stimulates rate of poly(a) removal and amplifies processivity of degradation. The Journal of biological chemistry, 276, 27923-27929. 175. Hlady, R.A., Novakova, S., Opavska, J., Klinkebiel, D., Peters, S.L., Bies, J., Hannah, J., Iqbal, J., Anderson, K.M., Siebler, H.M. et al. (2012) Loss of Dnmt3b function upregulates the tumor modifier Ment and accelerates mouse lymphomagenesis. The Journal of clinical investigation, 122, 163-177. 176. Polesskaya, A., Pinna, G., Sassi, Y., Vandamme, M., Bigot, A., Mouly, V., Morozova, N., Harel-Bellan, A. and Degerny, C. (2015) Post-transcriptional modulation of interleukin 8 by CNOT6L regulates skeletal muscle differentiation. Biochimica et biophysica acta, 1863, 263-270. 177. Ogawa, T., Ito, C., Nakamura, T., Tamura, Y., Yamamoto, T., Noda, T., Kubota, Y. and Toshimori, K. (2004) Abnormal sperm morphology caused by defects in Sertoli cells of Cnot7 knockout mice. Archives of histology and cytology, 67, 307-314. 178. Subtelny, A.O., Eichhorn, S.W., Chen, G.R., Sive, H. and Bartel, D.P. (2014) Poly(A)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature, 508, 66-71. 179. Niwa, H., Ogawa, K., Shimosato, D. and Adachi, K. (2009) A parallel circuit of LIF signalling pathways maintains pluripotency of mouse ES cells. Nature, 460, 118-122. 180. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M. and Bao, S. (2008) Krüppel-like transcription factors: A functional family. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 40, 1996-2001. 181. Costa, Y., Ding, J., Theunissen, T.W., Faiola, F., Hore, T.A., Shliaha, P.V., Fidalgo, M., Saunders, A., Lawrence, M., Dietmann, S. et al. (2013) NANOG-dependent function of TET1 and TET2 in establishment of pluripotency. Nature, 495, 370-374. 182. Närvä, E., Rahkonen, N., Emani, M.R., Lund, R., Pursiheimo, H.-P., Nästi, J., Autio, R., Rasool, O., Denessiouk, K., Lähdesmäki, H. et al. (2012) RNA-Binding Protein L1TD1 Interacts with LIN28 via RNA and is Required for Human Embryonic Stem Cell Self- Renewal and Cancer Cell Proliferation. Stem cells (Dayton, Ohio), 30, 452-460. 183. Zhang, H., Sheng, C., Yin, Y., Wen, S., Yang, G., Cheng, Z. and Zhu, Q. (2015) PABPC1 interacts with AGO2 and is responsible for the microrna mediated gene silencing in high grade hepatocellular carcinoma. Cancer letters, 367, 49-57. 184. Ozturk, S., Guzeloglu-Kayisli, O., Demir, N., Sozen, B., Ilbay, O., Lalioti, M.D. and Seli, E. (2012) Epab and Pabpc1 are differentially expressed during male germ cell development. Reproductive sciences (Thousand Oaks, Calif.), 19, 911-922. 185. Fan, J., Yang, X., Wang, W., Wood, W.H., 3rd, Becker, K.G. and Gorospe, M. (2002) Global analysis of stress-regulated mrna turnover by using cdna arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 10611-10616. 186. Korhonen, H., Koivusalo, T., Toivola, S. and Mikkola, S. (2013) There is no universal mechanism for the cleavage of RNA model compounds in the presence of metal ion catalysts. Organic & Biomolecular Chemistry, 11, 8324-8339. 187. Oakberg, E.F. (1957) Duration of Spermatogenesis in the Mouse. Nature, 180, 1137-1138. 174

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

Παράρτημα Ανάλυση με μικροσυστοιχίες DNA Οι μικροσυστοιχίες DNA που χρησιμοποίηθηκαν στην παρούσα διατριβή προέρχονταν από την εταιρεία One Array και καλύπτουν 32,679 γονίδια. Η προετοιμασία δειγμάτων για τον υβριδισμό στις μικροσυστοιχίες περιελάμαβανε τα εξής βήματα: Σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cdna με αντίστροφη μεταγραφή (1η ημέρα) Το πρωτόκολλο αναφέρεται σε 4 αντιδράσεις για 2 πλακάκια μικροσυστοιχιών, επιπλέον 5% σφάλματος και χρειάζονται θερμικός κυκλοποιητής (συστήνεται) στους 70 ο C, και υδατόλουτρο στους 42 ο C. Για τη μέγιστη απόδοση της διαδικασίας συστήνεται η χρησιμοποίηση 1000ng RNA/αντίδραση (ελάχιστη ποσότητα: 100ng, μέγιστη ποσότητα: 5000ng). Μέγιστος όγκος διαλύματος RNA που θα χρησιμοποιηθεί: 10μl. Σε κάθε αντίδραση (από τις τέσσερις) Τελικός όγκος (μl) RNA (1000ng) 10 T7 oligo(dt) Primer 1 Νερό ελεύθερο νουκλεασών Μέχρι τελικό όγκο μίγματος 12μl (προθερμασμένο) Το μίγμα επωάζεται για 10 min στους 70 ο C. Κάνουμε spin down και τοποθετούμε στον πάγο. Σε θερμοκρασία δωματίου προετοιμάζουμε το Reverse Transcription Master Mix: Reverse Transcription Master Mix Χ1 Χ4 +5% X3 +5% 10X First Strand Buffer 2 μl 8,4 μl 6,30 μl dntp Mix 4 μl 16,8 μl 12,60 μl RNase Inhibitor 1 μl 4,2 μl 3,15 μl ArrayScript 1 μl 4,2 μl 3,15 μl Προστίθενται 8 μl από αυτό το μίγμα σε κάθε αντίδραση από το βήμα 1 Συστατικά για την αντίστροφη μεταγραφή Όγκος (Vτελ.=20μl) Μίγμα από το 1ο βήμα 12μl Reverse Transcription Master Mix 8μl Επωάζουμε για 2h στους 42 o C. Σύνθεση δεύτερης αλυσίδας του cdna Χρειάζεται θερμικός κυκλοποιητής στους 16 o C. Στον πάγο προετοιμάζουμε το Second Strand Master Mix. 176

Παράρτημα Second Strand Master Mix (για αντίδραση των 100μl) Χ1 Χ4 +5% X3 +5% H 2 O 63 μl 264.6 μl 198.45 μl 10X Second Strand Buffer 10 μl 42 μl 31.50 μl dntp Mix 4 μl 16.8 μl 12.60 μl DNA Polymerase 2 μl 8.4 μl 6.30 μl RNase H 1 μl 4.2 μl 3.15 μl Μεταφέρουμε 80 μl από το μίγμα σε κάθε μία από τις αντιδράσεις του προηγούμενου βήματος. Συστατικά για την σύνθεση της 2ης αλυσίδας Μίγμα από το 2ο βήμα Second Strand Master Mix Όγκος ( Vτελ.= 100μl) 20 μl 80 μl Επωάζουμε για 2h στους 16 o C. Μετά το πέρας της επώασης, βάζουμε τα δείγματα στον πάγο. Μπορούμε να περιμένουμε μέχρι 24 ώρες στους -20οC. Καθαρισμός cdna Προθερμαίνουμε νερό ελεύθερο νουκλεασών στους 50-55 o C ενώ ολες οι φυγοκεντρήσεις γίνονται στις 10.000xg σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού ελέγξουμε το cdna binding buffer για παρουσία ιζήματος, προσθέτουμε 250 μl cdna binding buffer σε κάθε αντίδραση από το προηγούμενο βήμα. Μεταφέρουμε όλη την ποσότητα στο κέντρο μίας στήλης και φυγοκεντρούμε 10.000 x g σε RT για 1min. Απορρίπτουμε το διήθημα. Στην συνέχεια προσθέτονται 500 μl Wash Buffer και φυγοκεντρούμε 10.000 x g σε RT για 1min. Απορρίπτουμε το διήθημα. φυγοκεντρούμε 10.000 x g σε RT για 1min εκ νέου για την απομάκρυνση καταλοίπων του wash buffer. Μεταφέρουμε το cdna filter cartridge σε ένα cdna Elution tube. Τέλος προσθέτουμε 9 μl προθερμασμένο νερό ελεύθερο νουκλεασών στο κέντρο της στήλης. Αφήνουμε για 2 min σε RT. Φυγοκεντρούμε για 90sec. Επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία. Φυλάμε το έκλουσμα στους -20 o C. Μπορούμε να περιμένουμε για 24 ώρες. 177

Παράρτημα In Vitro μεταγραφή για τη σύνθεση τροποποιημένου Άμινο-άλλυλ-aRNA (το βράδυ της 1ης ημέρας) Σε θερμοκρασία δωματίου προετοιμάζουμε το ακόλουθο μίγμα: Κύριο μίγμα in vitro μεταγραφής (IVT) Χ1 Χ4 +5% X3 +5% aautp (50 mm) 3 μl 12.6 μl 9.45 μl ATP, CTP, GTP Mix (25 mm) 12 μl 50.4 μl 37.80 μl UTP Solution (50 mm) 3 μl 12.6 μl 9.45 μl T7 10X Reaction Buffer 4 μl 16.8 μl 12.60 μl T7 Enzyme Mix 4 μl 16.8 μl 12.60 μl Επωάζουμε για 14h (4-14h) στους 37 o C. Σταματάμε την αντίδραση με 60 μl νερό ελεύθερο νουκλεασών. Κάνουμε ήπιο vortex, spin down. Αποθηκεύουμε στους -20 o C ή προχωράμε στο επόμενο στάδιο. Καθαρισμός arna Προθερμαίνουμε νερό ελεύθερο νουκλεασών στους 50-55 o C. Προσθέτουμε 350 μl arna Binding Buffer σε κάθε αντίδραση από το προηγούμενο βήμα. Περνάμε στο επόμενο βήμα αμέσως.προσθέτουμε τα 250 μl της απόλυτης αιθανόλης και αναμιγνύουμε με την πιπέττα μόνο. Μόλις προσθέσουμε την ποσότητα σε μία αντίδραση, πριν προχωρήσουμε στο επόμενο σωληνάκι, μεταφέρουμε το σύνολο του μίγματος στη στήλη arna filter cartridge. Οι αντιδράσεις τοποθετούνται μία-μία μόλις ετοιμαστούν στη στήλη. Φυγοκεντρούμε για 1 min στις 10.000xg. Απορρίπτουμε το διήθημα. Στην συνέχεια προσθέτουμε 650 μl wash buffer και φυγοκεντρούμε για 1 min στις 10.000xg. Φυγοκεντρούμε για 1 min στις 10.000xg για την απομάκρυνση υπολειμμάτων του wash buffer. Μεταφέρουμε τη στήλη σε νέο arna collection tube. Τέλος προσθέτουμε 100 μl προθερμασμένο νερό ελεύθερο νουκλεασών στο κέντρο της στήλης. Αφήνουμε για 2min σε RT. Φυγοκεντρούμε για 1,5 min στις 10.000xg. Φωτομετρούμε στα 260nm και αποθηκεύουμε στους -20 ο C. Σύζευξη της χρωστικής (2η ημέρα) Υποχρεωτικά από το σημείο αυτό, οι αντιδράσεις θα είναι 4 (2 εξεταστέα δείγματα και 2 ελέγχου). Τοποθετούμε τις χρωστικές Cy3 και Cy5 και τις φέρουμε σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Αμέσως πριν την χρήση των χρωστικών, προσθέτουμε 11 μl DMSO σε κάθε ένα από τα τέσσερα φιαλίδια χρωστικής (2+2). Κάνουμε Vortex και φυλάμε στο σκοτάδι το πολύ μέχρι 1h. Υπολογίζουμε τον όγκο του διαλύματος που περιέχει 8 μg arna. Τοποθετούμε στο speedvac (οι οδηγίες χρήσης του είναι πάνω στη συσκευή) και αφυδατώνουμε-ξηραίνουμε. Ελέγχουμε τη διαδικασία κάθε 5 min (διαρκεί γύρω στα 15 min). Προσέχουμε να μην ξηραθεί υπερβολικά. Μπορούμε να επωφεληθούμε της 178

Παράρτημα αναμονής και να προχωρήσουμε στο βήμα, όπου απαιτείται προθέρμανση των αντιδραστηρίων και των πλακών των μικροσυστοιχίων. Επαναδιαλύουμε το ίζημα (ξηραμένο arna) σε 9 μl coupling buffer και κάνουμε ήπιο vortex. Προσθέτουμε 11 μl Cy3 σε κάθε δείγμα που εμείς βάζουμε ως δείγμα ελέγχου (control). Προσθέτουμε 11 μl Cy5 σε κάθε δείγμα που εμείς βάζουμε ως δείγμα προς εξέταση. Κάνουμε ήπιο vortex και spin down. Επωάζουμε για 30 min στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Για να σταματήσουμε την αντίδραση προσθέτουμε σε κάθε αντίδραση 4,5 μl Υδροξυλαμίνης 4Μ και αναμιγνύουμε και επωάζουμε για 15 min σε RT και στο σκοτάδι. Τέλος προσθέτουμε 5,5 μl νερό ελεύθερο νουκλεασών σε κάθε αντίδραση, ώστε ο τελικός όγκος να έρθει στα 30 μl. Καθαρισμός του σημασμένου arna Προθερμαίνουμε νερό ελεύθερο νουκλεασών στους 50-60 ο C. Όλες οι φυγοκεντρήσεις γίνονται στα 10.000x g. Προσθέτουμε 105 μl arna binding buffer σε κάθε δείγμα. Προχωράμε άμεσα στο επόμενο βήμα.προσθέτουμε 75 μl απόλυτης αιθανόλης. Ανακατεύουμε ΜΟΝΟ με πιπεττάρισμα (3 φορές). ΔΕΝ κάνουμε ταυτόχρονα όλα τα δείγματα. ΚΑΘΕ δείγμα που ετοιμάζεται πάει στο επόμενο στάδιο ΑΜΕΣΑ. Κάθε δείγμα που ετοιμάζεται από το προηγούμενο βήμα μεταφέρεται άμεσα στη στήλη Labeled arna Filter Cartridge. φυγοκεντρούμε όλες τις στήλες για 1 min στις 10.000 x g και πετάμε το διήθημα. Στην συνέχεια Προσθέτουμε 500 μl wash buffer και φυγοκεντρούμε για 1 min στις 10.000xg. Φυγοκεντρούμε για 1 min στις 10.000xg για την απομάκρυνση υπολειμμάτων του wash buffer. Μεταφέρουμε τη στήλη σε νέο Labeled arna Elution Tube. Τέλος κέντρο της στήλης προσθέτουμε 10 μl προθερμασμένο νερό ελεύθερο νουκλεασών. Αφήνουμε για 2min σε RT. Φυγοκεντρούμε για 1,5 min στις 10.000xg. Προσθέτουμε εκ νέου 10 μl προθερμασμένο νερό και επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία. Αποθηκεύουμε στους 20 C στο σκοτάδι και συνεχίζουμε με την φωτομέτρηση Φωτομετρική ανάλυση της ενσωμάτωσης των μορίων χρωστικής Φωτομετρούμε στα 260nm και υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του arna έτσι όπως έχει περιγραφεί [A260 X dilution factor X 40 = μg RNA/ml (ή ng/μl)].τα αποτελέσματα είναι ακριβή όταν η απορρόφηση κυμαίνεται μεταξύ 0,1-1,0. Αν χρειαστεί αλλάζουμε την αραίωση του φωτομετρούμενου δείγματος. Συστήνεται επίσης να γίνει φωτομέτρηση και στα μήκη κύματος 550nm για το Cy3 (ε=150.000) και 650 nm Cy5 (ε=250.000). Μπορούμε να υπολογίσουμε τα μόρια της χρωστικής που ενσωματώθηκαν στα 1000 nts είτε με online εργαλείο είτε με τον τύπο: # μορίων χρωστικής 1000 νουκλεοτίδια = ής Α χρωστικ Α 260 Χ 9010 cm -1 M -1 Χ 1000 Συντελεστής απόσβεσης χρωστικής (ε) 179

Παράρτημα Το προσδοκώμενο αποτέλεσμα είναι 30-60 μόρια χρωστικής στα 1000 νουκλεοτίδια. Για τα επόμενα βήματα θα χρειαστεί 1-5 μg ποσότητα σημασμένου arna. Εμείς θα δουλέψουμε με 2 μg. Αυτή η ποσότητα θέλουμε να αντιστοιχεί το πολύ σε 9 μl όγκο διαλύματος σημασμένου arna. Αν χρειαστεί συμπυκνώνουμε το διάλυμα με αφαίρεση νερού στο speedvac. Σε αυτή την περίπτωση καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο τη διάφανη θύρα. Προ-υβριδοποίηση της μικροσυστοιχίας Χρησιμεύει στην βελτιστοποίηση της απόδοσης και στη μείωση του θορύβου. Θα χρειαστούν δύο υδατόλουτρα: ένα στους 42 ο C και ένα 60 o C. Προθερμαίνουμε το prehybridization solution (5X SSPE, 0,1%SDS, 1%BSA) στους 42 ο C. Προτιμάται να είναι φρέσκο. Προθερμαίνουμε τα πλακάκια για 10 min στους 60 o C στην πλαστική τους θήκη ως έχουν στο υδατόλουτρο (συστήνεται σε πλάκα υβριδισμού).τα μεταφέρουμε σε άλλη πλαστική θήκη, στις εξωτερικές θέσεις, που περιέχει απόλυτη αιθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αφήνουμε για 15 sec.τα ανακινούμε έντονα με το χέρι για 20 sec (το πρωτόκολλο αναφέρει 1-2min).Αφαιρούμε τα πλακάκια από τη θήκη και ξεπλένουμε την επιφάνεια προσεκτικά με ddh2o ώστε να απομακρυνθεί η αλκοόλη. Μεταφέρουμε αργά και προσεκτικά τα πλακάκια σε θήκη που περιέχει 35ml προθερμασμένου pre-hybridization solution (5X SSPE, 0,1%SDS, 1%BSA) και επωάζεται για 2h στους 42οC. Στη διάρκεια της επώασης συνεχίζουμε στα προηγούμενα βήματα που απομένουν. στο χρόνο που απομένει ετοιμάζουμε το επόμενο βήμα. Στο πέρας της επώασης, βγάζουμε τα πλακάκια από την θήκη και τα ξεπλένουμε προσεκτικά με ddh2o (σε RT) για 1-2min. Στεγνώνουμε τα πλακάκια με spin ή φυγοκέντρηση για 3-4 min στα 500-700 rpm. Τα πλακάκια πρέπει να χρησιμοποιηθούν μέσα σε μια ώρα.ξεκολλάμε τα chambers από τη ζελατίνα τους και τα κολλάμε προσεκτικά στα πλακάκια.τοποθετούμε τα πλακάκια στον υβριδοποιητή με την ετικέτα στην επάνω πλευρά και προς τα εμάς. Καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο και τα διατηρούμε στους 42 ο C. Προετοιμασία υβριδοποίησης Προετοιμάζουμε τα διαλύματα έτσι όπως περιγράφονται στο εγχειρίδιο της OneArray Προσθέτουμε 1 μl 10X Fragmentation Reagent στα 9 μl διαλύματος arna που περιέχουν 2 μg arna και το μίγμα επωάζεται για 15 min στους 70 o C. Προσθέτουμε 1 μl stop solution και αναμιγνύουμε με την πιπέττα. Προσθέτουμε 23 μl νερό ελεύθερο νουκλεασών ώστε ο τελικός όγκος να είναι 34μL. Προθερμαίνουμε το 1,5x hybridization buffer + formamide για 10min στους 42 o C. 180

Παράρτημα Προετοιμάζουμε το μίγμα υβριδισμού: Αντιδραστήριο Όγκος Labeled arna 34 μl 1,5x hybridization buffer + formamide 74 μl Sheared salmon sperm DNA (10 μg/μl) 2 μl Ενώνουμε τα μίγματα του δείγματος ελέγχου και το εξεταζόμενου (κάνουμε pool) για τελικό όγκο 220μl. Φυγοκεντρούμε για 3min στις 2000rpm και εταφέρουμε 200 μl σε σωληνάρια PCR. Το μίγμα επωάζεται στους 95 ο C για 5 min σε θερμικό κυκλοποιητή. Κατεβάζουμε τη θερμοκρασία στους 60 ο C και αφήνουμε για 2-3 min ή έως ότου πιπετάρουμε το μίγμα στο πλακάκι. Πλήρωση διαμερίσματος υβριδοποίησης της μικροσυστοιχίας Γεμίζουμε υπό κλίση το πλακάκι, από την πλευρά του γραμμωτού κώδικα. Μόλις γεμίσει ο διάμεσος χώρος, κλείνουμε την μία οπή με το αυτοκόλλητο και με τη βοήθεια λαβίδας. Προσπαθούμε να αφαιρέσουμε τυχόν φυσαλίδες ή να τις περιορίσουμε στην περιφέρεια. Μόλις το καταφέρουμε σφραγίζουμε και την δεύτερη οπή. Τοποθετούμε τις μικροσυστοιχίες στον υβριδοποιητή στους 42 ο C για 15 h. Πλύσιμο υβριδοποιημένης μικροσυστοιχίας Τοποθετούμε τα πλακάκια (ένα τη φορά) από τον υβριδοποιητή και τα τοποθετούμε σε ένα μεγάλο «μπανάκι» (γυάλινο τρυβλίο). Το γεμίζουμε με προθερμασμένο στους 42 ο C διάλυμα 2x SSPE, 0,1% SDS solution. Προσπαθούμε να ξεκολλήσουμε το chamber από την επιφάνεια. Ξεπλένουμε το πλακάκι πάρα πολύ καλά. Οι μετακινήσεις των πλακιδίων από υγρό σε υγρό, όπως περιγράφεται εν συνεχεία θα πρέπει να γίνονται γρήγορα. Τοποθετούμε το πλακάκι στην πλαστική θήκη που περιέχει το ίδιο προθερμασμένο διάλυμα. Το αναδεύουμε για 5 min με το χέρι σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 42 o C. Μεταφέρουμε το πλακάκι σε άλλη θήκη που περιέχει 0,1x SSPE, 0,1% SDS και το ανακινούμε για 5 min με το χέρι σε θερμοκρασία δωματίου. Ξεπλένουμε τα πλακάκια με ddh2o. Τα στεγνώνουμε με φυγοκέντρηση (ή με spin) όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως. Σάρωση πλακιδίων μικροσυστοιχιών Ανοίγουμε τον σαρωτή (Perkin Elmer, ScanArray Express) και τον υπολογιστή. Ανοίγουμε το λογισμικό ScanArray Express. Από το κουμπί configuration επιλέγουμε το Quantitation και ενεργοποιούμε την διεπαφή του λογισμικού (Scan layout) που εμφανίζει τη δυνατότητα (το κουμπί) σάρωσης (Scan). Πατάμε στα κουμπιά των laser 1 & 3 (635 & 532 nm 181

Παράρτημα αντίστοιχα) προκειμένου να ξεκινήσει η προθέρμανση η οποία διαρκεί δέκα έως είκοσι λεπτά της ώρας. Κάνουμε τις εξής ρυθμίσεις: PMT στα 630 και 590 V, minimum diameter 80%, max diameter 150%, CPI threshold 100. Όταν η συσκευή είναι έτοιμη, βάζουμε το πλακάκι με την ετικέτα του γραμμωτού κώδικα να είναι προς τα πάνω και προς τα έξω. Το πλακάκι δεν μπαίνει όλο μες στην πτυχή της συσκευής που είναι πάνω από το μεταλλικό έλασμα. Το επόμενο βήμα είναι να πατήσουμε το κουμπί Scan (το οποίο πριν την είσοδο του πλακιδίου της μικροσυστοιχίας ήταν ανενεργό και μη διαθέσιμο προς επιλογή). Η συσκευή αμέσως μετά έλκει το πλακάκι εσωτερικά εντελώς και αρχίζει να το σαρώνει. Επί της οθόνης φαίνονται στιγμιότυπα της σαρωμένης επιφάνειας για το κάθε μήκος κύματος (της κάθε φθορίζουσας χρωστικής). Με την ολοκλήρωσης της σάρωσης πατάμε File, Save all, επιλέγουμε φάκελο προορισμού και κατόπιν επιλέγουμε all files και save. Ποσοτικοποίηση του σήματος (Quantitation) Κατά την ποσοτικοποίηση του σήματος η ένταση του φθοριοχρώματος σε κάθε κηλίδα μετατρέπεται σε αριθμό. Επίσης γίνεται αντιστοίχηση της κάθε κηλίδας σε συγκεκριμένο γονίδιο ή νουκλεοτιδική αλληλουχία ελέγχου ή σημείο οριοθέτησης. Για να συμβεί αυτό χρησιμοποιείται ένα αρχείο (ΗΟΑ5) με επέκταση.gal (www.onearray.com) που έχει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες σε μορφή csv. Επιλέγουμε το Easy Quantitation και ρυθμίζουμε το πλέγμα των γονιδίων να συμπίπτει με τα όρια της μικροσυστοιχίας. Πραγματοποιούμε τις απαραίτητες ρυθμίσεις στο πλέγμα: διάταση, συρρίκνωση, περιστροφή καθώς και προσαρμογή στις κηλίδες όπου χρειάζεται. Η μετακίνηση των κηλίδων είναι μάλλον απαραίτητη γιατί οι μικροσυστοιχίες της OneArray που χρησιμοποιήσαμε έχουν κατασκευασθεί με τη μέθοδο της εκτύπωσης των ολιγονουκλεοτιδίων (50-60 νουκλεοτίδια). Αυτό συνεπάγεται, όπως διαπιστώθηκε εξάλλου, μικρές αποκλίσεις των κηλίδων από τις συντεταγμένες που κανονικά θα έπρεπε να βρίσκονται οι κηλίδες αυτές στην πλάκα της μικροσυστοιχίας. Όταν είμαστε έτοιμοι από την τακτοποίηση του πλέγματος, πατάμε το κουμπί quantitate να ξεκινήσει η διαδικασία. Αποτέλεσμα είναι να πάρουμε ένα αρχείο csv ή gpr που περιέχει πλήθος πληροφορίες για την ένταση του κάθε φθοριοχρώματος, την ένταση του σήματος θορύβου, τις αναλογίες εκπομπής κάθε φθοριοχρώματος και πλήθος στατιστικών παραμέτρων. 182

Παράρτημα Νext Generation Sequencing σε πλατφόρμα Ion Torrent Σε ένα δείγμα ολικού RNA από κύτταρα όπως περιγράφθηκε παραπάνω το μεγαλύτερο ποσοστό των μορίων είναι ριβοσωμικό RNA. H απομόνωση mrna από ένα δείγμα ολικού RNA μπορεί να γίνει με δύο τρόπους. Είτε απομονώνοντας τα poly(a)+ RNA με σφαιρίδια που φέρουν oligo(dt) νουκλεοτίδια, είτε από το δείγμα αυτό να εξαχθούν και να αποριφθούν όλα τα ριβοσωμικά. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με σφαιρίδια φέρουν ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά των ριβοσωματικών RNA. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το kit Ribominus (AMBION). Αφαίρεση ριβοσωμικών RNA από ολικό δείγμα RNA με το kit Ribominus Κάθε αντίδραση χρειάζεται 1 5 µg υψηλής ποιότητας ολικού RNA σε 10 µl νερού ελεύθερου νουκλεασών. Ένα υδατόλουτρο ρυθμίζεται στους 37 o C και ένα στους 70 o C, ενώ προθερμένεται το 2X Hybridization Buffer στους 50 o C heat ώστε να διαλυτοποιηθούν τα άλατα. Προετοιμάζεται το μίγμα σε ένα αποστειρωμένο 1.5-mL Eppendorf ελευθερο νουκλεασών: Αντιδραστήριο Όγκος 2X Hybridization Buffer 50 µl RiboMinus Eukaryote Probe Mix v2 4 µl Ολικό RNA, 1 5 µg X µl Nuclease-free Water to 100 µl Το μίγμα αναμιγνύεται απαλά και επωάζεται στους 70 75 o C για 5 min. Αμέσως μετά το δείγμα μεταφέρεται σε υδατόλουτρο 37 o C για να μειωθεί η θερμοκρασία στους 37oC σε χρονικό διάστημα των 30 min. Κατά την διάρκεια αυτή προετοιμάζονται τα μαγνητικά σφαιρίδια Για κάθε δείγμα προετοιμάζονται 200 μl 1X Hybridization Buffer αναμιγνύοντας 100 μl 2X Hybridization με 100 μl Η 2 Ο ελεύθερο νουκλεασών: Τα μαγνητικά σφαιρίδια αναδεύονται με vortex καθώς είναι μέσα στο δοχείο τους 500 µl εναιωρήματος των σφαιριδίων μεταφέρονται σε 1.5-mL Eppendorf ελεύθερο νουκλεασών Τοποθετούνται σε μαγνητική βάση διαχωρισμού για 1 min. Τα μαγνητικά σφαιρίδια καθιζάνουν από την μεριά του μαγνήτη. Απομακρύνεται και απορρίπτεται το υπερκείμενο Προστίθενται 500 µl νερού ελεύθερου νουκλεασών και αναδιαλύονται τα σφαιρίδια. Τοποθετούνται σε μαγνητική βάση διαχωρισμού για 1 min. Τα μαγνητικά σφαιρίδια καθιζάνουν από την μεριά του μαγνήτη. Απομακρίνεται και απορίπτεται το υπερκείμενο. Η διαδικασία της πλύσης επαναλαμβάνεται για άλλη μία φορά. Το epperdorf με τα 500 µl τοποθετείτε στην μαγνητική βάση για 1 min. Τα μαγνητικά σφαιρίδια καθιζάνουν από την μεριά του μαγνήτη. Απομακρύνεται και απορρίπτεται 183

Παράρτημα το υπερκείμενο. Τα σφαιρίδια αναδυαλύονται με 200 µl 1x Hybridization Buffer και διατηρούνται στους 37 o C για το μετέπειτα βήμα. Δεύσμευση και απομάκρηνση rrna. Μετά από την 20 min επώαση του RNA/probe mix στους 37 C έχει ολοκληρωθεί φυγοκεντρείται σύντομα για να μαζευτεί το μίγμα στον πυθμένα του πηγαδιού και μεταφέρεται στο eppendorf με τα μαγνητικά σφαιρίδια. Αναμιγνύεται καλά με πιπέτα και επωάζεται στους 37 C για 5 min. Το δείγμα φυγοκεντρείται σύντομα και τοποθετείται στην μαγνητική βάση για 1 min Το υπερκείμενο που περιέχει το RNA χωρίς rrna μεταφέρεται σε νέο eppendorf Συμπύκνωση και καθαρισμός του RNA χωρίς rrna Προετοιμάζεται το Wash Solution προστίθενται 8 ml από 100% αιθανόλη στο δοχείο με συμπυκνωμένο Wash Solution και αναμιγνύεται καλά. Τουλάχιστον 12 μl για κάθε δείγμα ζεσταίνονται στους 70 C. Προετοιμάζεται το μίγμα σε ένα αποστειρωμένο 1.5-mL Eppendorf ελεύθερο νουκλεασών: Αντιδραστήριο Όγκος Nucleic Acid Binding Beads (white cap) 10 µl Binding Solution Concentrate 400 µl Αναμιγνύεται με πιπέτα rrna-depleted RNA 300 µl Aνάμιξη 100% Ethanol 1000 µl Αναμιγνύεται με αναστροφή του eppendorf μερικές φορές Το μίγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min. Εάν έχουνε παραμείνει σταγονίδια στο καπάκι το δείγμα φυγοκεντρείται σύντομα για να συγκεντρωθεί όλο το περιεχόμενο στον πυθμένα. Το epperdorf τοποθετείτε στην μαγνητική βάση για 3 min. Τα μαγνητικά σφαιρίδια καθιζάνουν από την μεριά του μαγνήτη. Απομακρύνεται και απορρίπτεται το υπερκείμενο. Το epperdorf αφαιρείται από την βάση και τα σφαιρίδια αναδυαλύονται με 300 µl Wash Solution Το epperdorf τοποθετείτε στην μαγνητική βάση για 3 min. Τα μαγνητικά σφαιρίδια καθιζάνουν από την μεριά του μαγνήτη. Απομακρύνεται και απορρίπτεται το υπερκείμενο Προσεκτικά με 20 μl πιπέτα απομακρύνεται τυχόν εναπομείναντα σταγονίδια και παραμένει για 2 min για να στεγνώσουν τα σφαιρίδια. 184

Παράρτημα Το eppendorf αφαιρείται από την βάση και προστίθενται 12 µl προθερμασμένο στους 70 C νερού ελεύθερο νουκλεασών. Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min και τοποθετείται στην μαγνητική βάση. Το υπερκέιμενο το υπερκείμενο το οποίο αποτελεί το RNA απαλλαγμένο από το ριβοσωμικό RNA μεταφέρεται προσεκτικά σε καθαρό eppendorf Κατασκευή βιβλιοθήκης για αλληλούχιση με το Ion Total RNA-Seq Kit v2 Η τεχνολογία μαζικής αλληλούχησης πολλών μορίων με την τεχνολογία ION Torrent αλλά και άλλων αντίστοιχων τεχνολογιών έχει τον περιορισμό ότι δεν μπορεί να αλληλουχίσει κομμάτια μεγαλύτερα των 200 βάσεων. Γι το λόγο αυτό όταν πρόκειται να αλληλουχιθούν μεγαλύτερα μόρια όπως τα mrna θα πρέπει να κατακερματιστούν σε μήκη των 150 βάσεων περίπου. Κατακερματισμός του RNA με RNase ΙΙΙ: Αντιδραστήριο Ποσότητα rrna-depleted total RNA 100 ng 10X RNase III Reaction Buffer 1 µl RNase III 1 µl Συνολικός όγκος 12 µl Η αντίδραση επωάζεται στους 37 o C για 3min. Αμέσως μετά την επώαση προστίθενται 20 μl H 2 O και τοποθετούνται αμέσως στον πάγο. Καθαρισμός κατακερματισμένου RNA: Προετοιμασία αντιδραστηρίων καθαρισμού: Προστίθενται 44 ml από 100% αιθανόλη στο συμπυκνωμένο Solution Concentrate και ανακινείται καλά. Το δοχείο σημαδεύεται ότι περιέχει αιθανόλη και διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου. (15 C - 30 C). Εάν στο δοχείο με το Binding Solution Concentrate, έχει σχηματιστεί ένα λευκό ίζημα ζεσταίνεται στους 37 C και ανακινείται έντονα για να διαφοροποιηθεί το ίζημα. Προετοιμασία σφαιριδίων: Τα μαγνητικά σφαιρίδια αναμιγνύονται και 5 μl εναιωρήματος αυτών μεταφέρονται σε eppendorf. Προστίθενται 90 μl Binding Solution Concentrate και αναμιγνύονται με αυτό τα σφαιρίδια 10 φορές με πιπέτα. Στο μίγμα αυτό προστίθενται τα 30 μl από το κατακερματισμένο RNA. Μια πιπέτα 200 ρυθμίζεται στα 150μL. Ένα νέο τιπ κουμπώνει και βρέχεται με 100% αιθανόλη με πιπέτα 3 φορές. Χωρίς να αλλάζει το τιπ μεταφέρονται 150 μl 100% αιθανόλης σε κάθε πηγάδι. Δεν αφήνεται η τελευταία σταγόνα της αιθανόλης και η πιπέτα πιέζεται μόνο μέχρι την πρώτη σκάλα ενώ η αιθανόλη αφήνεται στο πλάγιο του σωλήνα για να μην μολυνθεί το τιπ από το μίγμα σφαιριδίων. Με το ίδιο τιπ χωρίς να 185

Παράρτημα αφήνεται το έμβολο πριν την αναρρόφηση μεταφέρονται και στα άλλα δείγματα το ίδιο ακριβώς ποσό αιθανόλης με τον ίδιο τρόπο. Τα δείγματα αναμιγνύονται με πιπέτα 10 φορές μέχρι να γίνει ομοιογενές το χρώμα και με καινούργιο τιπ για κάθε δείγμα αυτή την φορά. Τα δείγματα τοποθετούνται στην μαγνητική βάση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου Το υπερκείμενο απομακρύνεται χωρίς να πειράζονται τα σφαιρίδια. Προστίθενται 150 μl Wash Solution με αιθανόλη και αφήνονται για 30 sec χωρίς να μετακινηθούν την βάση και χωρίς να αναμιγνύονται τα σφαιρίδια. Απομακρύνεται το διάλυμα πλύσης και με μικρότερη πιπέτα απομακρύνονται και τα τελευταία σταγονίδια. Τα σφαιρίδια αφήνονται για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθούν όλα τα ίχνη της αιθανόλης. Τα σφαιρίδια δεν πρέπει να παραστεγνώσουν Το eppendorf αφαιρείται από την βάση και προστίθενται 12 µl προθερμασμένο στους 37 C νερού ελεύθερο νουκλεασών με το οποία τα σφαιρίδια αναμιγνύονται με πιπέτα. Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min και τοποθετείται στην μαγνητική βάση. Το υπερκείμενο το υπερκείμενο το οποίο αποτελεί το καθαρό κατακερματισμένο RNA μεταφέρεται προσεκτικά σε καθαρό eppendorf Η διακύμανση των μηκών των RNA κομματιών αλλά και η ποσότητα αναλύεται με Bioanalyzer με το κιτ RNA 6000 Pico. Τα μήκη πρέπει να κυμαίνονται μεταξύ 100 και 200 nt Κατασκευή βιβλιοθήκης Υβριδοποίηση και σύνδεση RNA Στον πάγο ετοιμάζουμε το μίγμα υβριδοποίησης: Συστατικό Όγκος Ion Adaptor Mix v2 2 µl Hybridization Solution 3 µl Συνολικός όγκος 5 µl Το μίγμα υβριδοποίησης (5 μl ) προστίθεται σε 3 μl από το κατακερματισμένο RNA (μέχρι 100 ng rrna-depleted total RNA). Το μίγμα αναμιγνύεται με πιπέτα 10 φορές απαλά και με μία σύντομη φυγοκέντρηση συγκεντρώνεται στον πυθμένα του. Σε θερμικό κυκλοποιητή γίνεται η υβριδοποίηση ως εξής: Θερμοκρασία Χρόνος 65 C 10min 30 C 5min Στον πάγο Προστίθενται τα υλικά σύνδεσης στην αντίδραση των 8 μl υβριδοποίησης 186

Παράρτημα Συστατικό Όγκος Hybridization reaction 8 µl 2X Ligation Buffer 10 µl Ligation Enzyme Mix 2 µl Συνολικός όγκος 20 µl Το μίγμα αναμιγνύεται με πιπέτα απαλά και επωάζεται για 1 h στους 30 C. Στον πάγο ετοιμάζουμε το μίγμα αντίστροφης μεταγραφής. Συστατικό Όγκος Nuclease-Free Water 2 µl 10X RT Buffer 4 µl 2.5 mm dntp Mix 2 µl Ion RT Primer v2 8 µl Συνολικός όγκος 16μL Το μίγμα αντίστροφης μεταγραφής (16 µl) προστίθεται στην αντίδραση σύνδεσης(ligation reaction), αναμιγνύεται με πιπέτα και φυγοκεντρείται σύντομα για να συσσωρευτεί το μίγμα στον πυθμένα. Αντίστροφη μεταγραφή: Στο μίγμα προστίθενται 4 μl 10X SuperScript III Enzyme Mix και αναμιγνύεται με vortex και φυγοκεντρείται σύντομα για να συσσωρευτεί το μίγμα στον πυθμένα. Το μίγμα επωάζεται σε θερμικό κυκλοποιητή (με το θερμαινόμενο καπάκι αναμμένο) για 30 min στους 42 C Στο στάδιο αυτό η διαδικασία μπορεί να σταματήσει και να αποθηκευτεί στους -20 C για μερικές ημέρες Καθαρισμός cdna: Προετοιμασία αντιδραστηρίων καθαρισμού: Προστίθενται 44 ml από 100% αιθανόλη στο συμπυκνωμένο Wash Solution Concentrate και ανακινείται καλά. Το δοχείο σημαδεύεται ότι περιέχει αιθανόλη και διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου. (15 C - 30 C). Εάν στο δοχείο με το Binding Solution Concentrate, έχει σχηματιστεί ένα λευκό ίζημα ζεσταίνεται στους 37 C και ανακινείται έντονα για να διαλυτοποιηθεί το ίζημα. Τα μαγνητικά σφαιρίδια αναμιγνύονται και 5 μl εναιωρήματος αυτών μεταφέρονται σε eppendorf. Προστίθενται 120 μl Binding Solution Concentrate και αναμιγνύονται με αυτό τα σφαιρίδια με 10 φορές πιπέτα. Προστίθενται 60 μl Η 2 Ο σε κάθε 40 μl αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής και το μίγμα αυτό αναμιγνύεται με πιπέτα. Τα 100- μl το μίγματος αυτού μεταφέρονται στο εναιώρημα των σφαιριδίων 187

Παράρτημα Μια πιπέτα 200 ρυθμίζεται στα 125μL. Ένα νέο τιπ κουμπώνει και βρέχεται με 100% αιθανόλη με πιπέτα πάνω κάτω 3 φορές. Χωρίς να αλλάζει το τιπ μεταφέρονται 125 μl 100% αιθανόλης σε κάθε πηγάδι. Δεν αφήνεται η τελευταία σταγόνα της αιθανόλης και η πιπέτα πιέζεται μόνο μέχρι την πρώτη σκάλα ενώ η αιθανόλη αφήνεται στο πλάγιο του σωλήνα για να μην μολυνθεί το τιπ από το μίγμα σφαιριδίων. Με το ίδιο τιπ χωρίς να αφήνεται το έμβολο πριν την αναρρόφηση μεταφέρονται και στα άλλα δείγματα το ίδιο ακριβώς ποσό αιθανόλης με τον ίδιο τρόπο. Τα δείγματα αναμιγνύονται με πιπέτα ρυθμισμένη στα 150 μl 10 φορές μέχρι να γίνει ομοιογενές το χρώμα και με καινούργιο τιπ για κάθε δείγμα αυτή την φορά. Τα δείγματα επωάζονται για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου εκτός βάσης. Τα δείγματα τοποθετούνται στην μαγνητική βάση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου Το υπερκείμενο απομακρύνεται χωρίς να πειράζονται τα σφαιρίδια. Προστίθενται 150 μl Wash Solution με αιθανόλη και αφήνονται για 30 sec χωρίς να μετακινηθούν την βάση και χωρίς να αναμιγνύονται τα σφαιρίδια. Απομακρύνεται το διάλυμα πλύσης και με μικρότερη πιπέτα απομακρύνονται και τα τελευταία σταγονίδια. Τα σφαιρίδια αφήνονται για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθούν όλα τα ίχνη της αιθανόλης. Τα σφαιρίδια δεν πρέπει να παραστεγνώσουν Το eppendorf αφαιρείται από την βάση και προστίθενται 12 µl προθερμενόμενο στους 37 C νερού ελεύθερο νουκλεασών με το οποία τα σφαιρίδια αναμιγνύονται με πιπέτα. Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min και τοποθετείται στην μαγνητική βάση. Το υπερκείμενο το υπερκείμενο το οποίο αποτελεί το cdna μεταφέρεται προσεκτικά σε καθαρό eppendorf. Ενίσχηση cdna Προετοιμασία μίγματος PCR: Συστατικό Όγκος Platinum PCR SuperMix High Fidelity 45 µl Ion Xpress RNA 3 Barcode Primer 1 µl Total volume 46 µl 6 μl από κάθε cdna μεταφέρονται σε καινούργιο δοκιμαστικό σωλήνα PCR Από το μίγμα PCR μεταφέρονται 46 μl στα 6 μl cdna. Στο μίγμα προστίθεται 1 μl από ένα Ion Xpress RNA-Seq Barcode (BC01-BC16) Το μίγμα ανακατέυεται με πιπέτα. 188

Παράρτημα Στάδιο θερμοκρασία Χρόνος Hold 94 C 2 min 94 C 30 sec Cycle (2 cycles) 50 C 30 sec 68 C 30 sec 94 C 30 sec Cycle (2 cycles) 62 C 30 sec 68 C 30 sec Hold 68 C 5 min Καθαρισμός ενισχυμένου cdna: Προετοιμασία αντιδραστηρίων καθαρισμού: όπως αναφέρεται παραπάνω. Τα μαγνητικά σφαιρίδια αναμιγνύονται και 5 μl εναιωρήματος αυτών μεταφέρονται σε eppendorf. Προστίθενται 180 μl Binding Solution Concentrate και αναμιγνύονται με αυτό τα σφαιρίδια με 10 φορές πιπέτα. Προστίθενται τα 53 μl της αντίδρασης PCR στο εναιώρημα των σφαιριδίων Μια πιπέτα 200 ρυθμίζεται στα 130μL. Ένα νέο τιπ κουμπώνει και βρέχεται με 100% αιθανόλη με πιπέτα πάνω κάτω 3 φορές. Χωρίς να αλλάζει το τιπ μεταφέρονται 130 μl 100% αιθανόλης σε κάθε πηγάδι. Δεν αφήνεται η τελευταία σταγόνα της αιθανόλης και η πιπέτα πιέζεται μόνο μέχρι την πρώτη σκάλα ενώ η αιθανόλη αφήνεται στο πλάγιο του σωλήνα για να μην μολυνθεί το τιπ από το μίγμα σφαιριδίων. Με το ίδιο τιπ χωρίς να αφήνεται το έμβολο πριν την αναρρόφηση μεταφέρονται και στα άλλα δείγματα το ίδιο ακριβώς ποσό αιθανόλης με τον ίδιο τρόπο. Τα δείγματα αναμιγνύονται με πιπέτα ρυθμισμένη στα 150 μl 10 φορές μέχρι να γίνει ομοιογενές το χρώμα και με καινούργιο τιπ για κάθε δείγμα αυτή την φορά. Τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min Τα δείγματα τοποθετούνται στην μαγνητική βάση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου Το υπερκείμενο απομακρύνεται χωρίς να πειράζονται τα σφαιρίδια. Προστίθενται 150 μl Wash Solution με αιθανόλη και αφήνονται για 30 sec χωρίς να μετακινηθούν την βάση και χωρίς να αναμιγνύονται τα σφαιρίδια. Απομακρύνεται το διάλυμα πλύσης και με μικρότερη πιπέτα απομακρύνονται και τα τελευταία σταγονίδια. Τα σφαιρίδια αφήνονται για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθούν όλα τα ίχνη της αιθανόλης. Τα σφαιρίδια δεν πρέπει να παραστεγνώσουν Το eppendorf αφαιρείται από την βάση και προστίθενται 15 µl προθερμενόμενο στους 37 C νερού ελεύθερο νουκλεασών με το οποία τα σφαιρίδια αναμιγνύονται με πιπέτα. 189

Παράρτημα Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min και τοποθετείται στην μαγνητική βάση. Το υπερκείμενο το υπερκείμενο το οποίο αποτελεί το ενισχυμένο cdna μεταφέρεται προσεκτικά σε καθαρό eppendorf. 1 μικρόλιτρο από κάθε δείγμα αναλύεται σε Bioanalyzer με το Agilent DNA 1000 Kit η αραιωμένο 1/10 με το Agilent High Sensitivity DNA Kit Με το λογισμικό του Bioanalyzer υπολογίζεται η συγκέντρωση των μορίων στο έυρος 50-160 nt. PCR Γαλακτώματος: Η cdna βιβλιοθήκη στην συνέχεια υπόκειται σε ενίσχυση πάνω στα σφαιρίδια. Αφού αναμιχθούν βιβλιοθήκη και σφαιρίδια έτσι ώστε τα μόρια cdna να είναι πολύ λιγότερα από τα σφαιρίδια υβριδοποιείται ένα μόριο cdna ανά σφαιρίδιο ενώ πολλά σφαιρίδια παραμένουν χωρίς cdna. Στην συνέχεια κατά την PCR σε γαλάκτωμα τα μόρια cdna πολλαπλασιάζονται πάνω στα σφαιρίδια και έτσι κάθε σφαιρίδιο αποκτά πολλούς κλώνους του ίδιου cdna μορίου. Για την διαδικασία χρησιμοποιήθηκε το μηχάνημα Ion OneTouch 2 System και τα αντιδραστήρια του κιτ Ion PGM Template OT2 400 Kit (Catalog Number 4479878). Για την προετοιμασία του μηχανήματος και του μίγματος αντίδρασης ακολουθείται πιστά και με λεπτομέρεια ο οδηγός του ίδιου κιτ (Ion PGM Template OT2 400 Kit User Guide). Στο τέλος της PCR απομονώνονται τα θετικά σφαιρίδια (template-positive ISPs) όπως περιγράφεται αναλυτικά στο ίδιο κιτ, ενώ χρησημοποιήται το μηχάνημα Ion OneTouch ES. Τελός τα template-positive ISPs ελέγχονται με το Qubit 2.0 Fluorometer ακλουθώντας την υποενότητα του παραπάνω οδηγού (Quality Control of Ion OneTouch 200 Ion Sphere Particles). Αλληλούχιση με πλατφόρμα ION TORREN PGM Τα θετικά σφαιρίδια τα οποία καλύπτουν τις προδιαγραφές φορτώνονται σε 318 chip ακλουθώντας τις οδηγίες Ion PGM Sequencing 400 Kit v2 ενώ το μηχάνημα ΙΟΝ PGM προγραμματίζεται ως εξής (Εικόνα 101): 190

Παράρτημα Εικόνα 102 Ρυθμίσεις για την πραγματοποίηση ενός πειράματος αλληλούχισης με ION TORRENT Ανάλυση αποτελεσμάτων και εύρεση διαφορικής έκφρασης: Τα δεδομένα από την αλληλούχιση σε μορφή fastq αναλύθηκαν περαιτέρω στον διαδικτυακό τόπο https://galaxyproject.org με τον αλγόριθμο TopHat 1. Η ανάλυση περιλαμβάνει βήματα που τελικό σκοπό έχουν την μέτρηση των μετάγραφων κάθε γονιδίου (Εικόνα 102). Πριν την ανάλυση θα πρέπει να μετατρέψουμε το αχρείο FastQ σε συμβατή μορφή κωδικοποίησης της ποιότητας. Αυτό γίνεται με την επιλογή FastQ groomer της σουίτας galaxy ενώ επιλέγεται η κωδικοποίηση SOLEXA ως αρχική μορφή αρχείο η οποία έχει την ίδια κωδικοποίηση. 1 Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R. and Salzberg, S.L. (2013) TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology, 14, 1-13. 191