ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» Ρύθµιση του η ατοειδικού υρηνικού υ οδοχέα ΗΝF-4α και των καθοδικών του στόχων α ό το mir-24 ΤΙΦΤΙΚΙ ΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Ε ιβλέ ουσα: Καθηγήτρια Χατζο ούλου-κλαδαρά Μαργαρίτα ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011
ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCE SCHOOL OF BIOLOGY MASTER S DEGREE PROGRAMME APPLIED GENETICS & BIOTECHNOLOGY Hepatospecific nuclear receptor HNF-4α and its downstream targets are regulated by mir-24 TIFTIKIDIS GEORGIOS Supervisor: Professor Hadzopoulou-Cladaras Margarita THESSALONIKI 2011-2 -
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Πρόλογος...5 2. Περίληψη...6 3. Abstract...8 4. Εισαγωγή...10 4.1. Ο ηπατοειδικός πυρηνικός παράγοντας 4α...10 4.1.1. Εισαγωγικές πληροφορίες για τον HNF-4α...10 4.1.2. Ισοµορφές του HNF-4α...10 4.1.3. Πρωτεϊνική δοµή του HNF-4α...13 4.1.4. Λειτουργία του HNF-4α...17 4.1.5. Ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη...18 4.1.6. Γονίδια-στόχοι του HNF-4α...20 4.2. Τα micrornas...21 4.2.1. Εισαγωγικές πληροφορίες για τα mirs...21 4.2.2. Βιογένεση των mirs...23 4.2.3. Λειτουργία των mirs...26 4.2.4. Το mir-24...29 4.2.4.1. Το γονίδιο και το γονιδιακό προϊόν...29 4.2.4.2. Οι λειτουργίες του mir-24...32 4.2.5. Το mir-122...35 4.3. Καρκίνος...40 4.3.1. Το ηπατοκαρκίνωµα...42 4.3.1.1. Η νόσος...42 4.3.1.2. Ο ρόλος του HNF-4α στο ηπατοκαρκίνωµα...45 5. Σκοπός...47 6. Υλικά και Μέθοδοι...48 6.1. Κυτταροκαλλιέργειες...48 6.2. ιαµόλυνση κυτταρικών σειρών...49 6.2.1. ιαµόλυνση µε φωσφορικό ασβέστιο...50 Αντίδραση β-γαλακτοσιδάσης...51 6.2.2. Παράγοντας διαµόλυνσης siport NeoFX...52 Μελέτη της λειτουργίας των micrornas...52 Ανάστροφη διαµόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2 µε Pre-miR mirna Precursor/miR-24 και Anti-miR mirna Inhibitor/miR-24 µε τη χρήση του siport NeoFX...53 6.3. Aποµόνωση RNA...54 6.3.1. Κύτταρα...54 6.3.2. Βιοψίες...56 6.3.3. Έλεγχος του RNA...56 6.4. Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων.....57 6.4.1. Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων για τη µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας (β-gal assay)...57 6.4.2. Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων για την ανάλυση κατά Western...57 6.5. Ποσοτικός προσδιορισµός συγκέντρωσης πρωτεϊνών...58-3 -
6.5.1. Κατασκευή Πρότυπης Καµπύλης...59 6.5.2. Προετοιµασία ειγµάτων...60 6.6. Ανάλυση κατά Western.......60 6.6.1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS-PAGE)...61 6.6.1.1. Προετοιµασία πηκτής...61 6.6.1.2. Προετοιµασία δειγµάτων...62 6.6.1.3. Ηλεκτροφόρηση...62 6.6.2. Μεταφορά σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης...62 6.6.3. Ανοσοανίχνευση...63 6.7. Σύνθεση cdna...66 6.7.1. Μέθοδος oligo-dt...68 6.7.2. Μέθοδος τυχαίων εξαµερών...69 6.7.3. Μέθοδος ειδικού εκκινητή...70 6.8. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR)...71 6.9. mirvana qrt-pcr mirna Detection Kit...77 6.10. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real-Time RT- PCR)..........78 6.10.1. SYBR Green...79 6.10.2. TaqMan... 82 6.10.3. Συλλογή και στατιστική ανάλυση δεδοµένων... 84 7. Αποτελέσµατα... 86 7.1. Επίδραση του mir-24 στον ΗΝF-4α... 86 7.1.1. Αύξηση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε µείωση του mrna και της πρωτεΐνης του HNF-4α...86 7.1.2. Μείωση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε αύξηση του mrna του HNF- 4α... 88 7.2. Επίδραση του mir-24 στην apoc-iii...89 7.2.1. Αύξηση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε µείωση του mrna και της πρωτεΐνης της apoc-iii... 89 7.2.2. Μείωση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε αύξηση του mrna και της πρωτεΐνης της apoc-iii... 90 7.3. Επίδραση του NF-κB στην έκφραση του mir-24... 91 7.4. Hπατίτιδες και δείκτες καρκίνου του ήπατος... 92 7.4.1. mir-24... 93 7.4.2. mir-122... 94 7.4.3. HNF-4α...94 7.4.4. HNF-3α... 95 7.5. mir-24 και HNF-4α στο ηπατοκαρκίνωµα... 96 8. Συζήτηση... 97 8.1. Η επίδραση του mir-24 στον HNF-4α...97 8.2. Η επίδραση του mir-24 στην apoc-iii...97 8.3. Η επίδραση του NF-κB στην έκφραση του mir-24... 98 8.4. Hπατίτιδες και δείκτες καρκίνου του ήπατος...99 8.5. mir-24 και HNF-4α στο ηπατοκαρκίνωµα... 100 9. Βιβλιογραφία...102-4 -
1. ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία διεξήχθη κατά τη διάρκεια του πανεπιστηµιακού έτους 2009-2010, στον Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του τµήµατος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ θερµά την Καθηγήτρια κ. Χατζοπούλου-Κλαδαρά Μαργαρίτα για την ανάθεση αυτού του τόσο ενδιαφέροντος θέµατος, καθώς και για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε σε όλη τη διάρκεια διεξαγωγής της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης τον Aναπληρωτή Καθηγητή κ. Μόσιαλο Γεώργιο για τη συµµετοχή του στην εξεταστική επιτροπή της εργασίας αυτής, καθώς και για την παραχώρηση απαραίτητου εργαστηριακού εξοπλισµού. Θα ήθελα ακόµη να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια κ. Λάζου Αντιγόνη για τη συµµετοχή της στην εξεταστική επιτροπή της παρούσας εργασίας και για την ενασχόλησή της µε αυτή. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω στους υποψήφιους διδάκτορες Βαλλιάνου Ιωάννα, Μαυροµατίδη Βασίλη, Χάντουε Παύλο, Αγγελίδου Έλενα και Κατσικάρη Αθανασία για τη βοήθειά τους στις διάφορες δυσκολίες αλλά και τη γενικότερη υποστήριξή τους. Επιπλέον, θα ήταν παράλειψη να µην ευχαριστήσω την απόφοιτο του Μεταπτυχιακού Μασµανίδου Ερµιόνη για την καθοδήγησή της κατά τη διεξαγωγή των πειραµάτων. Οφείλω βεβαίως να ευχαριστήσω και το Λέκτορα Γαστρεντερολογίας κ. Γερµανίδη Γεώργιο για τη συνεγασία και τη συµβολή του στην ολοκλήρωση της εργασίας αυτής µε την παροχή υλικού ηπατικών βιοψιών. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη συνάδερφο µεταπτυχιακή φοιτήτρια Τσιάµη Ιωάννα για την άρτια συνεργασία και την ευχάριστη συνύπαρξη στο χώρο του εργαστηρίου. Τιφτικίδης Γεώργιος Ιανουάριος 2011-5 -
2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο πυρηνικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων 4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4, ΗNF-4), ή NR2A1 σύµφωνα µε το ενιαίο σύστηµα ονοµατολογίας, αποτελεί µέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Θεωρείται ορφανός, καθώς µέχρι σήµερα δεν έχει αναγνωριστεί κάποιο µόριο ως προσδέτης του. Έχει εντοπιστεί σε µια µεγάλη ποικιλία ειδών, από έντοµα µέχρι τον άνθρωπο, ενώ είναι πολύ καλά συντηρηµένος. Ουσιαστικά, η αλληλουχία του είναι µια από τις πιο διατηρηµένες, ανάµεσα στους πυρηνικούς υποδοχείς. Προσδένεται στο DNA αποκλειστικά ως οµοδιµερές, ενώ παρουσιάζει έντονη τάση διµερισµού ακόµα και απουσία DNA. Ο ρόλος του ΗNF-4 είναι σηµαντικός, από τα αρχικά στάδια της ανάπτυξης ως την ενήλικη ζωή. Η σηµασία του στη γαστριδιοποίηση έχει αποδειχτεί σε έµβρυα ποντικών που δεν κωδικοποιούν λειτουργικό υποδοχέα, αφού σε αυτά δεν ολοκληρώνεται η συγκεκριµένη διαδικασία, οπότε τα έµβρυα δεν είναι βιώσιµα. Στην ενήλικη ζωή, ενεργοποιεί µεταγραφικά µια πληθώρα γονιδίων, µεταξύ των οποίων εκείνα που εµπλέκονται στον ενδιάµεσο µεταβολισµό, συµπεριλαµβανοµένου του µεταβολισµού της γλυκόζης, των λιπαρών οξέων, της χοληστερόλης, των ξενοβιοτικών και των φαρµάκων. Επιπλέον, ρυθµίζει µεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι ελέγχουν την έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, µε αποτέλεσµα να διατηρεί κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων. Τα micrornas είναι µικρά µόρια RNA, που κωδικοποιούνται από το γονιδίωµα των ιών, των φυτών και των ζώων. Παρουσιάζουν αρκετά υψηλή συντήρηση ανάµεσα στα είδη, ενώ το µήκος τους κυµαίνεται µεταξύ 20 και 22 νουκλεοτιδίων. Η ρύθµιση των γονιδίων στόχων τους γίνεται σε µετα- µεταγραφικό επίπεδο, κυρίως µέσω σύνδεσής τους σε συµπληρωµατικές τους θέσεις στην 3 αµετάφραστη περιοχή του mrna στόχου. Tα micrornas φαίνεται να συµµετέχουν σε µια µεγάλη ποικιλία διαδικασιών, όπως ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων, ο κυτταρικός θάνατος, η απόπτωση και η διαφοροποίηση των κυττάρων, ενώ η απορρύθµισή τους συνδέεται µε ασθένειες, όπως ο καρκίνος. Σκοπός της εργασίας ήταν η µελέτη της ρύθµισης του ΗΝF-4α από το mir-24. Επίσης, η ρύθµιση των καθοδικών στόχων του παράγοντα, όπως η - 6 -
apoc-iii, από το ίδιο microrna. Για την επίτευξη των στόχων αυτών έγιναν πειράµατα στην κυτταρική σειρά HepG2, η οποία εκφράζει ενδογενώς τον υποδοχέα. Συγκεκριµένα, τα κύτταρα διαµολύνθηκαν µε κατάλληλες ουσίες, που επάγουν ή αποσιωπούν την έκφραση του mir-24. Στη συνέχεια, βρέθηκε ότι οι ΗΝF-4α και apoc-iii µειώθηκαν κατά την υπερέκφραση του mir-24, σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης, µε Real-Time PCR και ανάλυση κατά Western αντίστοιχα. Αντίθετα, η αποσιώπηση του mir-24 αύξησε τα επίπεδα mrna και πρωτεΐνης, του ΗΝF-4α αλλά και της apoc-iii. Επιπλέον, µελετήθηκε ένα µονοπάτι ρύθµισης του mir-24 από τον NF-κB. Για το λόγο αυτό, κύτταρα HepG2 διαµολύνθηκαν µε κατάλληλο πλασµίδιο ενεργοποίησης του NF-κB και στη συνέχεια µετρήθηκαν τα επίπεδα του mir-24 µε Real-Time PCR και βρέθηκαν αυξηµένα. Επιπροσθέτως, µε στόχο τον προσδιορισµό της έκφρασης σηµαντικών παραγόντων, όπως ο ΗΝF-4α και το mir-24, στο ηπατοκαρκίνωµα, ή οι HNF- 3α, HNF-4α, mir-24 και mir-122 σε πρόδροµες καταστάσεις του, µετρήθηκε η έκφραση καθενός µε Real-Time PCR. Τα δείγµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν κατάλληλες βιοψίες και παρά τις δυσκολίες φάνηκε µια τάση αύξησης του mir-24, σε συνδυασµό µε τη µείωση του HNF-4α στους καρκινοπαθείς. Αντίθετα, δεν προέκυψε τίποτα σηµαντικό για τους ασθενείς µε ηπατίτιδα, την πρόδροµη κατάσταση του ηπατοκυτταρικού καρκίνου. - 7 -
3. ABSTRACT Hepatocyte Nuclear Factor 4 (Nuclear Receptor 2A1) is a member of the nuclear receptor superfamily. ΗNF-4 is considered to be orphan, since there has not been yet identified any ligand for this factor. ΗNF-4 has been identified in a great variety of species, from insects to human, and is highly conserved. Actually, the aminoacid sequence of this factor is one of the most highly conserved, between the nuclear receptors. HNF-4 binds DNA exclusively as a homodimer, while it also exhibits strong homodimerization activity in the absence of DNA. HNF-4 plays an important role from the early development till the adulthood. Mouse embryos lacking HNF-4 die before completing gastrulation, due to visceral endoderm dysfunction, showing how important this factor is. During adulthood, HNF-4 activates the expression of hundreds of genes, especially those involved in intermediary metabolism, including glucose, fatty acid, cholesterol and xenobiotic and drug metabolism. Furthermore, it regulates transcription factors, which induce the expression of hepatocyte specific genes. As a result, it fulfills an essential role in differentiation of hepatocytes. micrornas are short RNA molecules, encoded by the genome of viruses, plants and animals. They are highly conserved among species, consisting of 20 to 22 nucleotides. They suppress their target genes posttranscriptionally, mainly through base pairing to the complementary sequences in the 3 untranslated regions (3 UTRs) of targeted genes. They seem to participate in a variety of circumstances, like cell proliferation, cell death, apoptosis and cell differentiation, but their deregulation results in diseases, such as cancer. This project intended to study the regulation of ΗΝF-4α by mir-24 and its downstream target genes like apoc-iii. In order to investigate this, HepG2 cells were used, which express endogenously ΗΝF-4α. Thus, cells were transfected with pre-mir-24 or anti-mir-24, to overexpress or silence mir-24, respectively. Using Real-Time PCR and Western analysis, respectively, it was found that both mrna and protein levels of HNF-4α and apoc-iii were reduced upon pre-mir treatment. On the contrary, inhibition of mir-24, - 8 -
induced the expression of HNF-4α and apoc-iii, both in mrna and protein levels. In addition, we studied a regulatory pathway of mir-24 by NF-κB. For this, HepG2 cells were transfected with a plasmid that activates NF-κB and then, mir-24 levels were evaluated, and found upregulated, using Real-Time PCR. Finally, we determined the expression of some important factors, like ΗΝF-4α and mir-24 in hepatocellular carcinoma, or HNF-3α, HNF-4α, mir-24 and mir-122 in cancer-related situations, namely hepatitis B and C, using Real-Time PCR. We were provided with human biopsies and we observed a tremendous variation among the various samples. However, a trend of opposite expression between mir-24 and HNF-4α was observed in biopsies from patients with hepatocellular carcinoma. No changes were noted in biopsies from patients with hepatitis. - 9 -
4. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4.1. Ο ηπατοειδικός πυρηνικός παράγοντας 4α 4.1.1 Εισαγωγικές πληροφορίες για τον HNF-4α Ο HNF-4α κωδικοποιείται από το γονίδιο TCF14, που στον άνθρωπο εντοπίζεται στη θέση 20q13.1-20q13.2, µεταξύ των γονιδίων PLCG1 και G20S17 (Argyrokastritsis et al., 1997). Aποτελείται από 12 εξώνια και έχει µέγεθος 30 kb (Furuta et al., 1997). Υπάρχουν 9 διαφορετικές ισοµορφές του, α1-α9, οι οποίες προκύπτουν από τη χρήση διαφορετικού υποκινητή, Ρ1 ή Ρ2, σε συνδυασµό µε εναλλακτικό µάτισµα (Εικόνα 1). Tο εναλλακτικό µάτισµα του HNF4α φαίνεται πως είναι ένας καλά διατηρηµένος µηχανισµός κατά την εξέλιξη των ειδών, καθώς έχουν βρεθεί ήδη στο κουνούπι και στο µεταξοσκώληκα, διαφορετικές ισοµορφές (Eeckhoute et al., 2003). Επίσης, η ύπαρξη εναλλακτικών µεταγράφων είναι αρκετά συνηθισµένη, καθώς σχεδόν κάθε πυρηνικός υποδοχέας έχει αρκετά τέτοια, τα οποία προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή της 5 περιοχής του γονιδίου, κατά κύριο λόγο. Αντίθετα, εναλλακτική συρραφή στο 3 άκρο, παρατηρείται µόνο στον HNF- 4α. Εικόνα 1: Σχηµατική αναπαράσταση του γονιδίου HNF-4α. Σηµειώνονται οι δύο υποκινητές και τα εξώνια (Tanaka et al., 2006). 4.1.2 Ισοµορφές του HNF-4α Οι ισοµορφές του HNF-4α είναι πολύ καλά µελετηµένες. Έτσι, είναι δεδοµένο ότι οι α1-α6 µεταγράφονται από τον υποκινητή Ρ1, γι αυτό και περιέχουν το εξώνιο 1A, ενώ οι α7-α9 από τον Ρ2, οπότε ως πρώτο εξώνιο - 10 -
έχουν το 1D. Επειδή το τελευταίο είναι βραχύτερο από το 1Α, τα προϊόντα του υποκινητή Ρ2 φέρουν συντοµότερο αµινοτελικό άκρο (Thomas et al., 2001). Εικόνα 2: Οι ισοµορφές του HNF-4α. Σηµειώνονται τα εναλλακτικά εξώνια µε διαγραµµισµένα κουτάκια, ενώ η ένθεση των 10 αµινοξέων του εξωνίου 9 (ισοµορφές α2, α5, α8) µε γκρι χρώµα. Η ιντρονική αλληλουχία των ισοµορφών α3, α6 και α9 σηµειώνεται µε σκούρο γκρι. Για κάθε ισοµορφή του HNF-4α είναι γνωστά τα εξής (Εικόνα 2): ισοµορφή α1. Έχει µήκος 455 αµινοξέα. ισοµορφή α2. Έχει µήκος 465 αµινοξέα, επειδή περιέχει ένα µεγαλύτερο εξώνιο 9 και έχει εντοπιστεί στον αρουραίο, στο ποντίκι και στον άνθρωπο. ισοµορφή α3. Εντοπίζεται στο ανθρώπινο ήπαρ και έχει µήκος 408 αµινοξέα, καθώς δεν περιλαµβάνει τα εξώνια 9 και 10. ισοµορφή α4. Ανιχνεύεται στον άνθρωπο, στο ήπαρ και στο νεφρό. Επειδή φέρει στην αµινοτελική περιοχή δύο επιπλέον εξώνια, τα 1B και 1C, το µήκος της φτάνει τα 485 αµινοξέα. - 11 -
ισοµορφή α5. Συνδυάζει τα εξώνια 1B και 1C, της ισοµορφής α4, µε το µεγαλύτερο εξώνιο 9, της ισοµορφής α2. Για το λόγο αυτό είναι η µακροσκελέστερη ισοµορφή µε 495 αµινοξέα. ισοµορφή α6. Αποτελείται από 438 αµινοξέα και ενώ περιλαµβάνει τα εξώνια 1B και 1C, έχει το ελλιπές καρβοξυτελικό άκρο της ισοµορφής α3, δηλαδή της λείπουν τα εξώνια 9 και 10 (Nakhei et al., 1998). ισοµορφή α7. Το µήκος της είναι 442 αµινοξέα και η διαφορά της από την ισοµορφή α1 έγγειται µόνο στο πρώτο εξώνιο, καθώς αυτή προκύπτει από τον υποκινητή Ρ2. ισοµορφή α8. Το συνολικό της µήκος δεν ξεπερνά τα 452 αµινοξέα, πρώτο εξώνιό της είναι το 1D και σχηµατίζει µια ευµεγέθη καρβοξυτελική περιοχή, επειδή περιέχει το µεγαλύτερο εξώνιο 9. ισοµορφή α9. Η µικρότερη, µε µήκος που µόλις φτάνει τα 395 αµινοξέα, αφού δεν περιλαµβάνει τα εξώνια 9 και 10, όπως και η ισοµορφή α3, αλλά και το ιντρόνιο 8 είναι ελλιπές (Harries et al., 2008). Οι διάφορες ισοµορφές φαίνεται να έχουν ιστολογική κατανοµή, η οποία εξαρτάται από τον υποκινητή τους. Πιο συγκεκριµένα, οι ισοµορφές που προκύπτουν από τον Ρ1 υποκινητή, δηλαδή οι α1-α6, εκφράζονται στο ήπαρ, στους νεφρούς και στο έντερο, ενώ οι εκείνες που προκύπτουν από τον Ρ2, δηλαδή οι α7-α9, εντοπίζονται στο έντερο, στο στοµάχι και στα β-κύτταρα του παγκρέατος, όχι όµως στο ώριµο ήπαρ και στο νεφρό (Xie et al., 2009). Στα β-κύτταρα του παγκρέατος, βέβαια, τα πράγµατα περιπλέκονται, καθώς δύο µελέτες αναφέρουν απουσία των Ρ1 ισοµορφών στα κύτταρα αυτά (Hansen et al., 2002, Eeckhoute et al., 2003), αλλά µία υποστηρίζει το αντίθετο (Tanaka et al., 2006). Πάντως, η µοναδική έρευνα που εξέτασε την κατανοµή των ισοµορφών σε πρωτεϊνικό επίπεδο, ανίχνευσε µόνο Ρ2 ισοµορφές στο ώριµο πάγκρεας (Chen et al., 1997). Αξιοσηµείωτο για την ισοµορφή α7 είναι το γεγονός ότι, παρόλο που δηµιουργείται από τον Ρ2 υποκινητή, εµφανίζεται νωρίτερα κατά την ανάπτυξη, σε σχέση µε την ισοµορφή α1, στο εµβρυικό ήπαρ (Nakhei et al., 1998). Τέλος, διαφέρει και η ικανότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής, που έχει η κάθε ισοµορφή. Έτσι, για τις α1 και α2, που θεωρούνται οι κυριότερες - 12 -
ισοµορφές στους νεφρούς και στο ήπαρ των θηλαστικών, αποδεικνύεται πως έχουν µια µικρή διαφορά στην ενεργοποίηση της µεταγραφής, µεταξύ διαφορετικών κυτταρικών σειρών (Sladek et al.,1999). Απ την άλλη, η ισοµορφή α7, επειδή δεν περιέχει την περιοχή ενεργοποίησης AF-1, η οποία δρα συνεργιστικά µε την περιοχή ενεργοποίησης AF-2 (Hadzopoulou- Cladaras et al., 1997), παρουσιάζει πολύ µειωµένη ικανότητα διέγερσης της µεταγραφής (Torres-Padilla et al., 2002). 4.1.3 Πρωτεϊνική δοµή του HNF-4α Ο HNF-4α, καθώς αποτελεί µέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, παρουσιάζει την τυπική δοµή τους. ηλαδή, αποτελείται από τις έξι λειτουργικά διακριτές περιοχές A, B, C, D, E και F (Εικόνα 3) (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Εικόνα 3: Σχηµατική αναπαράσταση των λειτουργικών περιοχών του HNF-4α. Η περιοχή Α/Β, που περιλαµβάνει τη µη εξαρτώµενη από προσδέτη περιοχή ενεργοποίησης AF-1, η οποία πιστεύεται πως παίρνει τη µορφή α- αµφιπαθούς έλικας, καλύπτει τα αµινοξέα 1-24. Η περιοχή AF-1 περιέχει 5 αρνητικά φορτισµένα αµινοξέα, η θέση και το φορτίο των οποίων φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της µεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4α. Σύµφωνα µε έρευνες, µείωση του αρνητικού φορτίου ή αντικατάσταση των κρίσιµων αυτών αµινοξέων, οδηγεί σε έντονη πτώση της ενεργότητας του HNF-4α (Green et al.,1998). Επίσης, σηµαντικό ρόλο για την περιοχή AF-1 έχουν και κάποια ογκώδη υδρόφοβα αµινοξέα, όπως τα κατάλοιπα τυροσίνης στις θέσεις 6 και 14 και τα κατάλοιπα λευκίνης στις θέσεις 10 και 17 (Green et al.,1998, Laudet et al., 1992). Πλήρης έλλειψη της περιοχής AF-1 συνεπάγεται µειωµένη µεταγραφική ενεργοποίηση κατά 50% (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). - 13 -
Η περιοχή C, που αντιστοιχεί στην επικράτεια δέσµευσης στο DNA (DNA-binding domain, DBD) και ορίζεται µεταξύ των αµινοξέων 48-128, αποτελεί µια εξελικτικά σταθερή περιοχή µεταξύ των διαφόρων πυρηνικών υποδοχέων. Αυτή, αποτελείται από δύο δακτύλους ψευδαργύρου, καθένας εκ των οποίων καλύπτει 60-70 αµινοξέα, καθώς και µια καρβοξυτελική επέκταση (Carboxy Terminal Extention, CTE), µήκους 8 αµινοξέων (Hadzopoulou- Cladaras et al., 1997). Στη βάση του πρώτου δακτύλου εντοπίζεται το Ρ- πλαίσιο, υπεύθυνο για την αναγνώριση του στοιχείου απόκρισης στο DNA. Μέσα σ αυτό έχει αναγνωριστεί η αµινοξική ακολουθία DGCKG, µοναδικό χαρακτηριστικό του HNF-4α σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα µέλη της υπεροικογένειάς του (Mangelsdorf & Evanst, 1995). Το στοιχείο απόκρισης στην ορµόνη (Hormone Response Element, HRE) (Mangelsdorf & Evanst, 1995), είναι ουσιαστικά η αλληλουχία σύνδεσης του συγκεκριµένου παράγοντα στο DNA-στόχο. Αποτελείται από δύο ευθείες επαναλήψεις, µε αλληλουχία G/AGGT/CCA ή AGG/TT/CCA, που διαχωρίζονται από ένα (DR1= direct repeats 1) ή σπανιότερα δύο (DR2= direct repeats 2) νουκλεοτίδια. Στις αλληλουχίες αυτές προσδένεται ως οµοδιµερές (Jiangand & Sladek, 1997) ο HNF-4α. Ένα ακόµα ξεχωριστό χαρακτηριστικό αυτού είναι ότι βρίσκεται συνεχώς στον πυρήνα, αντίθετα από άλλους, που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα και εισέρχονται στον πυρήνα µόνο όταν ενεργοποιηθούν από κάποιο µήνυµα (Jiang et al., 1995). Η περιοχή D αποτελεί τον ευέλικτο σύνδεσµο µεταξύ των περιοχών C και E, ο οποίος τους επιτρέπει να συστρέφονται και να δηµιουργούν εναλλακτικές διαµορφώσεις, που επιτρέπουν τη σύνδεση των διµερισµένων υποδοχέων στις επαναλήψεις του DNA. Επίσης, έχει δειχθεί πως είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ενεργότητας της περιοχής ενεργοποίησης AF-2. Προοδευτική εξάλειψη της περιοχής D οδηγεί σε σταδιακή µείωση της ενεργότητας του HNF-4α, ενώ πλήρης απαλοιφή της σε απώλεια της ικανότητας ενεργοποίησης του υποδοχέα (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η περιοχή Ε έχει επιφορτιστεί µε αρκετές λειτουργίες, αφού εδώ εντοπίζονται η περιοχή σύνδεσης του προσδέτη (Ligand Binding Domain, LBD), η επιφάνεια οµοδιµερισµού και η εξαρτώµενη από τον προσδέτη περιοχή ενεργοποίησης 2 (Activation Function 2, AF-2). - 14 -
Η επιφάνεια οµοδιµερισµού εκτείνεται µεταξύ των αµινοξέων 175-360 και αποτελείται από την α-έλικα Η10, αλλά και από την H9 και το βρόχο µεταξύ των Η7-Η8, σε µικρότερο όµως βαθµό. Η περιοχή AF-2 περιλαµβάνει τα αµινοξέα 128-366 (Iordanidou et al., 2005) και στο καρβοξυτελικό της άκρο την περιοχή ενεργοποίησης AF-2 AD, η οποία φέρει την εξελικτικά συντηρηµένη αλληλουχία ΦΦΧΕΦΦ, όπου Φ ένα υδρόφοβο αµινοξύ, Χ ένα οποιοδήποτε αµινοξύ και Ε το γλουταµινικό οξύ. Ο ρόλος του τµήµατος αυτού είναι πολύ σηµαντικός, καθώς διαµεσολαβεί στις αλληλεπιδράσεις του υποδοχέα µε συνενεργοποιητές της µεταγραφής. Το γλουταµινικό οξύ στη θέση 363 είναι ιδιαίτερα σηµαντικό για την περιοχή AF- 2, αφού µετάλλαξή του σε λυσίνη δηµιουργεί µεταγραφικά ανενεργό HNF-4α. Επίσης, παρότι ο συγκεκριµένος παράγοντας είναι ισχυρός ενεργοποιητής της µεταγραφής, φέρει λευκίνη στη θέση 366, όπως οι πυρηνικοί υποδοχείς ARP- 1, EAR-2 και EAR-3, που είναι όµως αρνητικοί ρυθµιστές της. Αντίθετα, οι πυρηνικοί υποδοχείς RAR, RXR και TR στην αντίστοιχη θέση έχουν γλουταµινικό οξύ, σηµαντικό για την ενεργοποίηση παρουσία συνενεργοποιητών. Αντικατάσταση της λευκίνης της θέσης 366 από γλουταµινικό οξύ, έδωσε ανενεργό HNF-4α, υποδηλώνοντας πως η περιοχή AF-2 AD του µάλλον αλληλεπιδρά µε συνενεργοποιητές διαφορετικούς από εκείνους των πυρηνικών υποδοχέων RAR, RXR και TR (Hadzopoulou- Cladaras et al., 1997). Η περιοχή σύνδεσης του προσδέτη περιλαµβάνει 10 αντιπαράλληλες α- έλικες (α1-α12) και 2 β-ελάσµατα (β1-β2), ενώ είναι γνωστή και ως «σάντουϊτς αντιπαράλληλων α-ελίκων», δοµή κοινή στις αντίστοιχες περιοχές των πυρηνικών υποδοχέων. Αντίθετα, όµως, µε τους υπόλοιπους πυρηνικούς υποδοχείς, η α2 έλικα απουσιάζει, ενώ η α-6 σχηµατίζει µια ελικοειδή στροφή. Οι α-έλικες που εντοπίζονται στο µέσο της διαµόρφωσης, δηλαδή οι α3, α5, α7 και α10, µαζί µε τα δύο β-ελάσµατα, σχηµατίζουν την υδρόφοβη θέση σύνδεσης του προσδέτη (Kistanova et al., 2001). Με βάση τη σύγκριση της δοµής της περιοχής, παρουσία και απουσία συνενεργοποιητή, έχει διατυπωθεί ένα µοντέλο. Σύµφωνα µε αυτό, ενώ απουσία του η α12 είναι προσανατολισµένη µακριά από τον πυρήνα της περιοχής σύνδεσης του προσδέτη, παρουσία του αυτή αναδιπλώνεται προς το σώµα του υποδοχέα, ασφαλίζοντας έτσι την περιοχή σύνδεσης του προσδέτη. Με τον τρόπο αυτό - 15 -
σχηµατίζεται µια επιφάνεια που διευκολύνει την αλληλεπίδραση µεταξύ της περιοχής AF-2 και των συνενεργοποιητών (Εικόνα 4) (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η περιοχή F, τέλος, παρέχει ένα ακόµα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό στον HNF-4α, που τον ξεχωρίζει από τους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Συγκεκριµένα, καταστέλλει την περιοχή AF-2 AD, οπότε τελικά ρυθµίζει αρνητικά την ενεργότητά του. Κάτι αντίστοιχο δεν έχει παρατηρηθεί για άλλο πυρηνικό υποδοχέα. Αντίθετα, µάλιστα, η περιοχή F είχε αρχικά προταθεί ως ενεργοποιητής της µεταγραφής, λόγω της υψηλής της περιεκτικότητας σε κατάλοιπα προλίνης. Θεωρείται πως η περιοχή F, µόνη της ή σε συνεργασία µε άλλες πρωτεΐνες, καλύπτει ορισµένα αµινοξέα της περιοχής AF-2 AD, κρίσιµα για την ενεργοποίηση του µορίου, όπως για παράδειγµα το συντηρηµένο εξανουκλεοτίδιο 360-366, εµποδίζοντας έτσι την πρόσβαση των συνενεργοποιητών. Ακόµη και µερική κάλυψη της περιοχής αυτής πιστεύεται πως είναι αρκετή για την απώλεια της µεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4α. Επιπλέον, φαίνεται πως η περιοχή F ρυθµίζει το βαθµό αλληλεπίδρασης των δύο περιοχών ενεργοποίησης του HNF-4α, AF-1 και AF-2, οπότε αποµάκρυνσή της επιτρέπει την πλήρη συνεργασία των περιοχών αυτών. Καταστολή της δράσης της περιοχής F είναι δυνατόν να προκύψει µε πρωτεόλυση, µε καταστροφή της αλληλεπίδρασης µε άλλες πρωτεΐνες, µε αλλαγές στη διαµόρφωση µέσω µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων ή µε σύνδεση του προσδέτη (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Εικόνα 4: Σχηµατική αναπαράσταση της περιοχής σύνδεσης του προσδέτη του HNF-4α, αριστερά απουσία συνενεργοποιητή και δεξιά παρουσία του. Οι κύλινδροι αντιπροσωπεύουν α-έλικες (Dhe-Paganon et al., 2002). - 16 -
4.1.4 Λειτουργία του HNF-4α Ο HNF-4α, σε αντίθεση µε τους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, δεν έχει προσδέτη, ο οποίος στην κλασική έννοια της σηµατοδότησης ενεργοποιεί τον υποδοχέα µέσω τροποποίησης της διαµόρφωσής του, επιτρέποντας την απελευθέρωση των συγκαταστολέων και την πρόσδεση συνενεργοποιητών. Έτσι, κατατάσσεται στους ορφανούς (orphan) υποδοχείς, αποτελώντας ξεχωριστή οικογένεια, µέσα στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Ωστόσο, δοµικές µελέτες µε κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ αποκάλυψαν την παρουσία ενός λιπαρού οξέος στην «τσέπη» της περιοχής σύνδεσης του προσδέτη. Η θέση αυτή φαίνεται να είναι οµόλογη µε τις αντίστοιχες περιοχές σύνδεσης προσδέτη στους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, οι οποίοι ενεργοποιούνται από προσδέτες (Wisely et al., 2002). Το λιπαρό αυτό οξύ δε φάνηκε να ανταλλάσσεται εύκολα µε ραδιοσηµασµένα λιπαρά οξέα, όπως για παράδειγµα παλµιτικό οξύ, γεγονός που δείχνει ότι το λιπαρό οξύ-προσδέτης εµβυθίζεται µέσα στην «τσέπη» σύνδεσης ήδη από την αναδίπλωση της πρωτεΐνης µετά τη µετάφρασή της. Μετά την πρόσδεσή του στο DNA, ο HNF-4α στρατολογεί µεταγραφικούς συνενεργοποιητές και άλλες συνοδευτικές πρωτεΐνες και ρυθµίζει θετικά την έκφραση των γονιδίων-στόχων. Στο ήπαρ, όπου εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα, ο HNF-4α ρυθµίζει την έκφραση ενός µεγάλου αριθµού γονιδίων-στόχων, τα οποία κωδικοποιούν ένζυµα, µεταφορείς, ακόµη και άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Ευθύνεται, δε, σε µεγάλο βαθµό, για την ηπατοειδική έκφραση αυτών των γονιδίων. Η απουσία του στο ενήλικο ήπαρ, ως αποτέλεσµα πειραµατικών διαδικασιών, οδηγεί σε αξιόλογη µεταβολική απορρύθµιση και αυξηµένη θνησιµότητα (Gonzalez, 2008). Ένας αριθµός µελετών έχει αποκαλύψει ότι ο HNF-4α µπορεί να φωσφορυλιωθεί από την πρωτεϊνική κινάση Α (protein kinase A) (Viollet et al., 1997), την κινάση που ρυθµίζεται από εξωκυτταρικά σήµατα (extracellular signal-regulated kinase) (Reddy et al., 1999), την πρωτεϊνική κινάση που ενεργοποιείται από ΑΜΡ (AMP-activated protein kinase) (Leclerc et al., 2001, Hong et al., 2003) και την αµινοτελική κινάση 1 του c-jun (c-jun NH 2 -terminal kinase 1) (Jahan & Chiang, 2005). Η φωσφορυλίωση µπορεί να τροποποιήσει την συγγένεια πρόσδεσης στο DNA και την ενεργοποιητική ικανότητα του - 17 -
HNF-4α, µπορεί να αλλάξει τον ενδοκυτταρικό του εντοπισµό - µετατοπίζοντάς τον από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα - ή να εκκινήσει την αποικοδόµησή του µέσω του µονοπατιού ουβικουιτίνης-πρωτεασώµατος 26S. Η φωσφορυλίωση στο κατάλοιπο Ser158 µπορεί να ενισχύσει την πρόσδεση συνενεργοποιητών, όπως ο PC4 και επιλεκτικά να ενεργοποιήσει ορισµένα γονίδια στόχους του HNF-4α (Guo et al., 2007). Μετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις θα µπορούσαν επίσης να έχουν ως αποτέλεσµα άλλες µη µεταγραφικές δραστηριότητες του HNF-4α. Η φωσφορυλίωση στο κατάλοιπο Ser78, ένα αµινοξικό κατάλοιπο συντηρηµένο και σε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, από την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) έδειξε να βοηθά στη µεταφορά του εκτός πυρήνα και στην αποικοδόµησή του, που οδηγεί σε µειωµένη ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων (Sun et al., 2007). 4.1.5 Ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη Ο ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη των οργανισµών είναι καίριος, καθώς ενέχεται στη µεταγραφική ενεργοποίηση, από τα πρώιµα ήδη εµβρυϊκά στάδια µέχρι και την ενηλικίωση. Έτσι, από την ηµέρα 4,5 κιόλας, αρχίζει να ανιχνεύεται το mrna του στο πρώιµο ενδόδερµα. Από αυτό προέρχεται το σπλαχνικό ενδόδερµα, ένας εξωεµβρυϊκός ιστός του λεκιθικού σάκου. Πολλά από τα γονίδια που εκφράζονται στο ήπαρ, κάνουν το ίδιο και στο λεκιθικό σάκο. Μεταξύ αυτών και ο HNF-1α, ένας ακόµα µεταγραφικός παράγοντας που έχει κεντρική θέση στην ηπατική διαφοροποίηση. Κατά την εµβρυϊκή ανάπτυξη, τις ηµέρες 5,5 έως 8,5, ο HNF-4α φαίνεται να εκφράζεται κατά κύριο λόγο στα κιονοειδή κοιλιακά ενδοδερµικά κύτταρα του λεκιθικού σάκου. Παρότι το mrna του εντοπίζεται στους εξωεµβρυϊκούς ιστούς από πολύ νωρίς, στους εµβρυϊκούς ιστούς παρουσιάζεται µόλις την 8,5 ηµέρα, στο ήπαρ και στο οπίσθιο µέρος του εντέρου. Η εµφάνισή του, µάλιστα, συµπίπτει µε πολλαπλασιασµό των ηπατοκυττάρων και έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, όπως για παράδειγµα η αλβουµίνη και η α-εµβρυϊκή πρωτεΐνη. Βέβαια, η ενεργοποίηση των γονιδίων αυτών εξαρτάται άµεσα από τον HNF- 1α, καθώς όµως αυτός ρυθµίζεται προηγουµένως απ τον HNF-4α, φαίνεται και τα γονίδια στόχοι του να ρυθµίζονται από τον τελευταίο, µε έµµεσο - 18 -
εποµένως τρόπο. Την 9,5 µέρα της εµβρυϊκής ανάπτυξης, η έκφραση του HNF-4α αυξάνεται σηµαντικά στο ήπαρ και στο µεσαίο τµήµα του εντέρου, από όπου προκύπτουν το πάγκρεας και η χοληδόχος κύστη. Τη 10,5 ηµέρα, το mrna του HNF-4α ανιχνεύεται στο στοµάχι και στα µεσονεφρικά σωληνάρια, από όπου προκύπτει ο φλοιός του νεφρού, ιστός στον οποίο ο HNF-4α εξακολουθεί να εκφράζεται και στον ενήλικο οργανισµό. Κατά την ηµέρα 13,5, η έκφραση του HNF-4α επεκτείνεται από το µεσαίο τµήµα του εντέρου σε όλο το µήκος του, µέχρι και το όριο ορθού-πρωκτού. Την εικοστή ηµέρα, τα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α µειώνονται και στη γέννηση είναι πλέον πολύ χαµηλά. Μάλιστα, αυτά υφίστανται περαιτέρω µείωση κατά τις πρώτες ηµέρες µετά τη γέννηση και παραµένουν σταθερά από εκεί και πέρα, µέχρι και τον ενήλικο οργανισµό (Duncan et al., 1994). Η σηµασία του HNF-4α στην επιβίωση των οργανισµών αποδείχτηκε πειραµατικά µε απαλοιφή του γονιδίου του σε ποντίκια, τα οποία πέθαναν σε εµβρυϊκό στάδιο, λόγω αδυναµίας τους να ολοκληρώσουν τη γαστριδιοποίηση, διαδικασία κατά την οποία από την πολυδύναµη επιβλάστη προκύπτουν οι τρεις βλαστικές στοιβάδες (Schaeffer et al., 1993). Παρότι ο HNF-4α δεν εκφράζεται στο έµβρυο του σταδίου αυτού, αποδείχθηκε πως είναι απαραίτητος για τη σύνθεση εκκρινόµενων ουσιών από το εξωεµβρυϊκό ενδόδερµα και τη δηµιουργία κατάλληλου περιβάλλοντος για την ολοκλήρωση της γαστριδιοποίησης. Αναπτύσσοντας τετραπλοειδή έµβρυα ποντικού αγρίου τύπου HNF-4α+/+, µαζί µε HNF-4α-/- εµβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα, προέκυψαν και οργανισµοί αποκλειστικά από τα HNF-4α-/- εµβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα. Αυτοί µπορούσαν να αναπτυχθούν πέρα από το στάδιο της γαστριδιοποίησης, καθώς η έλλειψη του HNF-4α αναπληρώθηκε από το σπλαχνικό ενδόδερµα, το οποίο προέκυψε από τα τετραπλοειδή HNF-4α+/+ έµβρυα. Το σπλαχνικό ενδόδερµα παρουσιάζει αρκετά κοινά χαρακτηριστικά µε τα ηπατοκύτταρα. Έτσι, εκτός του ότι και οι δύο ιστοί εκφράζουν τους ίδιους µεταγραφικούς παράγοντες, συµπεριλαµβανοµένων των HNFs, έχουν εξίσου επιθηλιακή µορφολογία, εκκρίνουν πρωτεΐνες του ορού, που εµπλέκονται στο µεταβολισµό της γλυκόζης και είναι παροδικές θέσεις αιµοποίησης. Παρόλο που οι οργανισµοί που προέκυψαν προχώρησαν κανονικά στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του ήπατος και απέκτησαν ηπατικούς ιστούς µορφολογικά όµοιους µε εκείνους του αγρίου τύπου, στερούνταν της - 19 -
έκφρασης πολλών γονιδίων, των οποίων τα προϊόντα είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του ώριµου ήπατος. Γίνεται έτσι κατανοητή η σηµασία του HNF-4α για τη δηµιουργία πλήρως διαφοροποιηµένων ηπατοκυττάρων στους αναπτυσσόµενους οργανισµούς (Watt et al., 2003). 4.1.6 Γονίδια-στόχοι του HNF-4α Ο HNF-4α κατέχει κεντρικό ρόλο στην έκφραση των ηπατοειδικών γονιδίων, επειδή ελέγχει την έκφραση πολλών τέτοιων άµεσα. Όµως, ρυθµίζει και αρκετά ηπατοειδικά γονίδια έµµεσα, µέσω της ρυθµιστικής δράσης που ασκεί στο ηπατικό µεταγραφικό δίκτυο, οι παράγοντες του οποίου στοχεύουν επίσης γονίδια µε ηπατοειδική έκφραση. Έτσι, έχει για παράδειγµα βρεθεί ότι επάγει τη µεταγραφή του HNF-1 (Ryffel, 2001). Όσον αφορά στους υπόλοιπους στόχους του, είναι πολυπληθείς. Ένας από τους σηµαντικότερους είναι το γονίδιο της απολιποπρωτεΐνης apoc-iii, για το οποίο είναι γνωστό ότι περιλαµβάνει δύο περιοχές πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του, τα στοιχεία BA1 και CIIIB (Ladias et al., 1992). Επίσης, ο HNF-4α µπορεί και επάγει σε µεγάλο βαθµό την έκφραση του γονιδίου apoc-iii χάρη στα στοιχεία H, I και J, που βρίσκονται στην περιοχή του ενισχυτή του, ο οποίος εντοπίζεται στη θέση -890/-490 (Zannis et al., 2001), υποδεικνύοντας ότι απαιτεί µια συνεργιστική αλληλεπίδραση µε τους παράγοντες που προσδένονται στα συγκεκριµένα στοιχεία (Ptashne & Gann, 1990) (Εικονα 5). Επίσης, ο HNF-4α ελέγχει την έκφραση αρκετών γονιδίων, που συµµετέχουν στο µεταβολισµό των λιπιδίων, των στεροειδών και διαφόρων τοξικών ουσιών, όπως τα µέλη της οικογένειας του κυτοχρώµατος Ρ450 (Jover et al., 2001). Ακόµα, επάγει τη µεταγραφή διαφόρων τέτοιων, τα οποία εµπλέκονται στο µεταβολισµό της γλυκόζης, για παράδειγµα το γονίδιο της γλυκοκινάσης, της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολ-πυροσταφυλικού οξέος (PEPCK), της κινάσης του L-πυροσταφυλικού οξέος (L-PK) και της αλδολάσης Β (ALDOB) (Miquerol et al., 1994). Τέλος, έχει βρεθεί πως λαµβάνει µέρος στο µεταγραφικό έλεγχο γονιδίων, που είναι υπεύθυνα για το µεταβολισµό των αµινοξέων, όπως αυτά της αµινοτρανσφεράσης της - 20 -
τυροσίνης (TAT), της τρανσκαρβαµυλάσης της ορνιθίνης (OTC) και της οξειδάσης της προλίνης (PDH) (Kamiya et al., 2004). Α Εικόνα 5: Η ρύθµιση του γονιδίου της apoc-iii. Α) Στην περιοχή ανοδικά του γονιδίου apoc-iii σηµειώνονται ο υποκινητής και ο ενισχυτής, µε τα ρυθµιστικά στοιχεία που αυτοί περιλαµβάνουν (Ladias et al., 1992). Β) Μοντέλο της επίδρασης των µεταγραφικών παραγόντων στη ρύθµιση του γονιδίου apoc-iii. Με (+) σηµειώνεται η ενεργοποίηση και µε (-) η καταστολή (Ladias et al., 1992). Β 4.2. Τα micrornas 4.2.1. Εισαγωγικές πληροφορίες για τα mirs Είναι φανερό ότι η γονιδιακή έκφραση στον άθρωπο ελέγχεται µε ακρίβεια και εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο, τον ιστό, τη χρονική στιγµή, αλλά και από κάποιες άλλες ειδικές συνθήκες. Μεγάλης κλίµακας δεδοµένα που προέρχονται από µικροσυστοιχίες προτείνουν ότι διαφορετικά κύτταρα, ιστοί και οργανικά συστήµατα µέσα σε έναν οργανισµό (συµπεριλαµβανοµένου και του ανθρώπου) έχουν διαφορετικό προφίλ γονιδιακής ρύθµισης, αν και έχουν το ίδιο γονιδίωµα. Επιπλέον, αυτοί οι διαφορετικοί τύποι γονιδιακής ρύθµισης είναι ευαίσθητοι σε αλλαγές συνθηκών όπως η ανάπτυξη, οι ασθένειες, οι περιβαλλοντικές αλλαγές και οι φαρµακευτικές αγωγές. Εποµένως, η πλήρης κατανόηση των ρυθµιστικών µηχανισµών της γονιδιακής έκφρασης αποτελεί ένα από τα πιο σηµαντικά θέµατα της γενωµικής. Κάθε καινούρια ανακάλυψη σε αυτό το ερευνητικό - 21 -
πεδίο θα έχει τη δυνατότητα να προκαλέσει αντίκτυπο στη σύγχρονη κλινική ιατρική, τόσο στη διάγνωση όσο και στη θεραπεία, επειδή οι περισσότερες ανθρώπινες ασθένειες είναι πολυγονιδιακές ή/και πολυπαραγοντικές, στις οποίες η έκφραση πολλών γονιδίων µεταβάλλεται άµεσα ή έµµεσα. Από την ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA από τους Watson και Crick το 1953, το κύριο µονοπάτι ροής της πληροφορίας στο κύτταρο είναι από το DNA στο αγγελιαφόρο RNA (mrna) και από εκεί στις πρωτεΐνες. Aυτό άλλωστε συνιστά το κεντρικό δόγµα της µοριακής βιολογίας. Ωστόσο, πρόσφατες αναλύσεις στο ανθρώπινο γονιδίωµα, αλλά και σε αυτό διαφόρων ζώων, αποδεικνύουν ότι η πλειοψηφία των RNA µεταγράφων δεν κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη. Αντιθέτως, πρόκειται για µη κωδικοποιά µόρια RNA (ncrnas). Πράγµατι, µεγάλης κλίµακας cdna αλληλουχήσεις και µελέτες γονιδιωµάτων µε συστοιχίες (arrays) έδειξαν ότι το 50% του γενωµικού DNA στον άνθρωπο µεταγράφεται σε RNA, από το οποίο µόλις 2% µεταφράζεται σε πρωτεΐνες και το υπόλοιπο 98% αντιστοιχεί σε µη κωδικοποιό RNA (ncrna) (Mattick & Makunin, 2006). Σε γενικές γραµµές, το µήκος της πλειοψηφίας των µη κωδικοποιών µορίων RNA ποικίλει από 18 έως 500 νουκλεοτίδια, αρκετά µικρότερα από την πλειοψηφία των µορίων mrna, γι αυτό και ονοµάζονται µικρά µη κωδικοποιά µόρια RNA (sncrnas). Ο όρος µη κωδικοποιό RNA χρησιµοποιείται συχνά για ένα µόριο RNA το οποίο δεν κωδικοποιεί κάποια πρωτεΐνη, αλλά αυτό δεν σηµαίνει ότι αυτά τα RNA δεν φέρουν πληροφορίες ή δεν επιτελούν κάποια λειτουργία. Για παράδειγµα, το ριβοσωµικό RNA (rrna) και το µεταφορικό RNA (trna), τα οποία αποτελούν µεγάλο ποσοστό του συνολικού RNA, είναι δύο γνωστά µικρά, µη κωδικοποιά µόρια RNA, τα οποία εµπλέκονται στην πρωτεϊνοσύνθεση. Σχετικά πρόσφατα, δύο νέες τάξεις µικρών µη κωδικοποιών RNA µορίων ανακαλύφθηκαν: τα micrornas (mirnas) και τα small interfering RNAs (sirnas). Και τα δύο έχουν ισχυρό ρυθµιστικό ρόλο στη µετάφραση του mrna και αποτελούν ένα νέο σηµαντικό επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Τα mirnas και sirnas έχουν παρόµοια µεγέθη (18-23 νουκλεοτίδια) και µοιράζονται παρόµοιους µηχανισµούς ρύθµισης της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, η βιογένεσή τους και η προέλευσή τους είναι διαφορετική. Τα mirnas συνιστούν µια καινούρια τάξη ενδογενών, µικρών, µη κωδικοποιών - 22 -
RNA µορίων, τα οποία ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση στοχεύοντας µόρια mrna και οδηγώντας τα στην αποικοδόµηση και/ή στη µεταφραστική αναστολή τους. Ένας ολοένα αυξανόµενος αριθµός mirnas έχει ταυτοποιηθεί στα θηλαστικά. Περισσότερα από 700 mirnas έχουν εντοπιστεί και αλληλουχηθεί στον άνθρωπο και ο εκτιµώµενος αριθµός των γονιδίων τους φτάνει τα 1000 στο ανθρώπινο γονιδίωµα. Συνολικά, τα mirnas µπορεί να ρυθµίζουν άµεσα τουλάχιστον το 30% των γονιδίων του ανθρώπου, σύµφωνα µε in silico προβλέψεις (Bentwich et al., 2005). Πρόσφατα, υπήρξε µια απότοµη αύξηση του ερευνητικού ενδιαφέροντος σχετικά µε τα mirnas εξαιτίας του σηµαντικού ρόλου που έχουν τα µη κωδικοποιά RNA µόρια σε διάφορες βιολογικές διεργασίες. Ένας αυξανόµενος αριθµός µελετών προτείνει ότι τα mirnas είναι σηµαντικοί ρυθµιστές της διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασµού, της αύξησης, της κινητικότητας και της απόπτωσης των κυττάρων. Εποµένως, αυτά τα mirnas παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, τη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία (Εικόνα 6). Συµπερασµατικά, απορρύθµιση της λειτουργίας των mirnas θα µπορούσε να οδηγήσει σε ανθρώπινες ασθένειες όπως ο καρκίνος, τα καρδιαγγειακά νοσήµατα, τα ηπατικά νοσήµατα, οι αυτοάνοσες ασθένειες και οι µεταβολικές διαταραχές (Zhang, 2008). Εικόνα 6: Οι βιολογικές λειτουργίες των micrornas και οι µηχανισµοί που αυτά ρυθµίζουν (Zhang, 2008). 4.2.2. Βιογένεση των mirs Τα ώριµα mirnas αποτελούνται από µόλις 20-22 νουκλεοτίδια. Ωστόσο, τα γονίδια που τα κωδικοποιούν είναι πολύ µεγαλύτερα, συνήθως περιέχουν αρκετές δεκάδες νουκλεοτίδια, κάποιες φορές και εκατοντάδες. Το µήκος των mirna γονιδίων ποικίλει από mirna σε mirna και από είδος σε - 23 -
είδος. Για παράδειγµα, τα mirna γονίδια των φυτικών ειδών έχουν συνήθως µεγαλύτερο µήκος από εκείνα των ζωικών οργανισµών. Γενικά, τα mirna γονίδια βρίσκονται σε διάφορες θέσεις του γονιδιώµατος. Ωστόσο, η πλειοψηφία τους εντοπίζεται στον ενδιάµεσο χώρο µεταξύ δύο γονιδίων, που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, έχοντας όµως διαφορετική κατεύθυνση µεταγραφής από εκείνα. Κάτι τέτοιο υποδεικνύει ότι τα mirna γονίδια συνιστούν ξεχωριστές µεταγραφικές µονάδες. Βέβαια, υπάρχουν και εκείνα τα οποία µεταγράφονται µαζί µε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (γονίδια ξενιστές - host genes), καθώς εδράζονται στο εσωτερικό των τελευταίων, για παράδειγµα σε κάποιο ιντρόνιο. Όπως τα mrnas που κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη, έτσι και τα primirnas που κωδικοποιούν mirnas µπορούν να υποστούν µάτισµα (splicing), να φέρουν καλύπτρα από 7-µεθυλ-γουανοσίνη στο 5 άκρο τους και πολυαδενυλιωµένη ουρά στο 3 άκρο τους (Cai et al., 2004), αν και δε θα περιέχουν ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF). Η διαδικασία δηµιουργίας ενός mirna από το αντίστοιχο γονίδιό του αποτελείται από πολυάριθµα ενδιάµεσα βήµατα και διάφορα ένζυµα παίζουν κρίσιµο ρόλο στη διαδικασία αυτή (Εικόνα 7). Αρχικά, το mirna γονίδιο µεταγράφεται σε ένα πρωταρχικό µόριο mirna, το οποίο ονοµάζεται primirna. Η διαδικασία αυτή πραγµατοποιείται από το ένζυµο RNA πολυµεράση ΙΙ (RNA polymerase II) και σε αρκετά mirna γονίδια έχει εντοπιστεί o εξαρτώµενος από RNA πολυµεράση ΙΙ υποκινητής τους (Lee et al., 2004). Αφού λοιπόν προκύψει το pri-mirna, µε την καλύπτρα στο 5 άκρο του και την πολυαδενυλίωση στο 3 άκρο του, αυτό σχηµατίζει µια ειδική δευτεροταγή δοµή µε στέλεχος (stem) και βρόχο (loop), που έχει τη µορφή φουρκέτας. Έτσι εισέρχεται σε ένα σύµπλοκο, το σύµπλοκο µικροεπεξεργασίας, που υπολογίζεται πως έχει µοριακό βάρος µεταξύ 500 650 kda. Το σύµπλοκο αυτό αποτελείται από την πρωτεΐνη Drosha - µια RΝΑση ΙΙΙ ενδονουκλεάση - και έναν σηµαντικό συµπαράγοντα που καλείται DGCR8/Pasha - µια πρωτεΐνη που περιέχει δύο περιοχές πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA (Denli et al., 2004). Σε αυτό το πρόσφατα αναγνωρισµένο σύµπλοκο, η DGCR8 αρχικά αναγνωρίζει τη δοµή στελέχους βρόχου και προσδένεται στο pri-mirnas (Gregory et al., 2004). Στη συνέχεια η Drosha, - 24 -
ασύµµετρα και εξειδικευµένα, κόβει και τους δύο κλώνους της φουρκέτας σε σηµεία κοντά στη βάση της δοµής. Με τον τρόπο αυτό απελευθερώνει το premirna, µήκους 60-70 νουκλεοτιδίων, το οποίο έχει ένα 5 φωσφορικό και ένα 3 προεξέχον άκρο κατά δύο νουκλεοτίδια µακρύτερο. Αυτός ο µηχανισµός έχει γίνει καλά κατανοητός στους ζωικούς οργανισµούς (Han et al., 2004, Landthaler et al., 2004). Το pre-mirna, στη συνέχεια, µεταφέρεται στο κυτταρόπλασµα από την πρωτεΐνη εξπορτίνη 5 (Exp5) - ένα µέλος της οικογένειας των µεταφορικών υποδοχέων Ran (Bohnsack et al., 2004). Αυτή η µεταφορική διαδικασία απαιτεί ενέργεια, µια ειδική δευτεροταγή δοµή φουρκέτας και ακόµη ένα σηµαντικό παράγοντα Ran (Lund et al., 2004). Μόλις φτάσει στο κυτταρόπλασµα, το pre-mirna υπόκειται σε περαιτέρω επεξεργασία από την πρωτεϊνη Dicer - µια δεύτερη RΝΑση ΙΙΙ ενδονουκλεάση (Grishok et al., 2001). Σε αυτό το στάδιο, η περιοχή PAZ της Dicer φαίνεται αρχικά να αναγνωρίζει το µήκους δύο νουκλεοτιδίων 3 προεξέχον άκρο και µετά η Dicer αποκόπτει το δίκλωνο τµήµα mirna:mirna*, µήκους περίπου 20-22 νουκλεοτιδίων, που εξακολουθεί να έχει ένα 5 φωσφορικό και ένα 3 προεξέχον άκρο κατά δύο νουκλεοτίδια µακρύτερο, από το τέλος της φουρκέτας (Zhang et al., 2004). Τελικά το δίκλωνο mirna:mirna* ξετυλίγεται από µια ελικάση σε δύο µονόκλωνα µόρια, το ώριµο mirna και το mirna*. Το mirna* αποικοδοµείται από µια άγνωστη νουκλεάση, ενώ το ώριµο mirna ενσωµατώνεται σε ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό τελεστικό σύµπλοκο, γνωστό ως RISC (RNA-induced silencing complex), το οποίο επάγει τη γονιδιακή αποσιώπηση σε µετα-µεταγραφικό επίπεδο (Hammond, 2005). Στο σύµπλοκο RISC, τα mirnas προσδένονται στους mrna στόχους τους και αναστέλλουν την γονιδιακή έκφραση είτε µέσω της άµεσης αποικοδόµησης των στόχων αυτών, είτε αναστέλλοντας τη µετάφραση µέσω τέλειας ή ατελούς συµπληρωµατικότητας µεταξύ mirna και mrna στόχου. - 25 -
Εικόνα 7: Η διαδικασία βιογένεσης των micrornas (Esquela-Kerscher & Slack, 2006). 4.2.3 Λειτουργία των mirs Τρεις µηχανισµοί έχουν περιγραφεί σχετικά µε το πώς τα mirnas εµπλέκονται στη γονιδιακή ρύθµιση. Εν συντοµία, αυτοί περιλαµβάνουν: αποικοδόµηση του mrna - αναστολή της µετάφρασης - αποσταθεροποίηση του mrna προκαλούµενη από τα mirnas. Ανεξάρτητα από το είδος του µηχανισµού, όλα τα µόρια mirna ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε µετα- µεταγραφικό επίπεδο. Πιο αναλυτικά, οι µηχανισµοί δράσης των mirnas έχουν ως εξής: i. αποικοδόµηση του mrna (Εικόνα 8Α). Μαζί µε την αναστολή της µετάφρασης, αποτελούν τους πιο κοινούς µηχανισµούς µέσω των οποίων τα mirnas επεµβαίνουν στη γονιδιακή ρύθµιση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, σηµαντικό ρόλο παίζει η συµπληρωµατικότητα µεταξύ των µορίων mirna και των mrnas στόχων. Όταν ένα µόριο mirna ζευγαρώσει απόλυτα ή σχεδόν απόλυτα µε τα mrnas στόχους, φαίνεται ότι η αποικοδόµηση του - 26 -
ii. iii. mrna αποτελεί τον πρωταρχικό µηχανισµό για την γονιδιακή ρύθµιση µέσω των µορίων mirna (Bartel, 2004). Από την άλλη, αν ένα µόριο mirna ζευγαρώσει ατελώς µε το mrna στόχο, τότε φαίνεται να συµβαίνει µεταφραστική αναστολή. Ο βαθµός της αναστολής αυτής σχετίζεται µε τον αριθµό των θέσεων πρόσδεσης του µορίου mirna πάνω στο mrna στόχο (Cuellar & McManus, 2005). Στην µεταφραστική αναστολή, η πλειοψηφία των µορίων mirna προσδένονται στα mrnas στόχους στην 3 αµετάφραστη περιοχή. Ωστόσο, κάποια µόρια mirna µπορούν επίσης να προσδεθούν στην 5 αµετάφραστη περιοχή και/ή στο ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο (Zeng et al., 2002, Doench & Sharp, 2004, Orom et al., 2008). αναστολή της µετάφρασης (Εικόνα 8Β). Αν και ο ακριβής µηχανισµός δράσης των µορίων mirna στην µεταφραστική αναστολή δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, µελέτες προτείνουν ότι τα µόρια mirna µπορεί να παρεµποδίζουν την µετακίνηση των ριβοσωµάτων κατά µήκος των µορίων mrna, παρεµποδίζοντας µε τον τρόπο αυτό τη µετάφρασή τους (Carrington & Ambros, 2003). αποσταθεροποίηση του mrna (Εικόνα 8Β). Πρόσφατες έρευνες προτείνουν ένα τρίτο µηχανισµό δράσης των µορίων mirna στη γονιδιακή έκφραση. Μετά τη µεταγραφή του mrna πάντοτε προστίθεται στο 3 άκρο του µια πολυ-(α) ουρά που το κάνει πιο σταθερό, ώστε να αποφεύγονται περιστατικά όπως η αποικοδόµησή του λόγω αποσταθεροποίησης του µορίου του (Coller & Parker, 2004). Σύµφωνα µε δηµοσιευµένη µελέτη, τα µόρια mirna εµπλέκονται στην αποσταθεροποίηση του mrna µέσω της άµεσης και γρήγορης αποαδενυλίωσης του µορίου του (Wu et al., 2006). Τα ευρήµατα αυτά υποδεικνύουν ότι τα mirnas αποσταθεροποιούν τα mrnas µέσω επιτάχυνσης της αφαίρεσης της πολυ-(α) ουράς τους, γεγονός που αποτελεί καίριο βήµα στην αποικοδόµηση του mrna. Αυτό το συµπέρασµα επιβεβαιώθηκε από αρκετές in vitro και in vivo µελέτες, στις οποίες οι κυτταρικές συγκεντρώσεις των mrna στόχων είχαν µειωθεί εξαιτίας των µορίων mirna που ήταν απολύτως ή σχεδόν απολύτως συµπληρωµατικά µε τα mrna στόχους. - 27 -
Α Εικόνα 8: Οι µηχανισµοί δράσης των micrornas. Α) Αποικοδόµηση του mrna στόχου (Kusenda et al., 2006). Β) Αναστολή της µετάφρασης (αριστερά) και αποσταθεροποίηση του mrna (δεξιά) (Chen, 2009). Β Μέχρι σήµερα, οι µελέτες σχετικά µε τα mirnas εστίαζαν κυρίως στο ρόλο τους στο κυτταρόπλασµα, ωστόσο πρόσφατες έρευνες αποκαλύπτουν και άλλες δράσεις τους στη ρύθµιση γονιδίων-στόχων, όπως: ρύθµιση της µεθυλίωσης του DNA (Kim et al., 2008, Sinkkonen et al., 2008) και έλεγχος της εισόδου των ώριµων µορίων mirna στον πυρήνα (Hwang et al., 2007), προτείνοντας επιπλέον ρυθµιστικές δυνατότητες. Είναι πάντως φανερό ότι τα mirναs όχι µόνο ρυθµίζουν την γονιδιακή έκφραση σε µετα-µεταγραφικό επίπεδο, αλλά είναι επίσης ικανά και να τροποποιούν τη χρωµατίνη (Εικόνα 9). Εικόνα 9: Η επίδραση του microrna στη ρύθµιση της έκφρασης ενός γονιδίου µπορεί να ασκηθεί σε πολλά επίπεδα (Chen, 2009). - 28 -
4.2.4. Το mir-24 4.2.4.1. Το γονίδιο και το γονιδιακό προϊόν Γονιδιακοί διπλασιασµοί που έχουν συµβεί στο παρελθόν δηµιούργησαν τα δύο παράλογα (paralogs) συσσωµατώµατα (clusters) του mir-23 στα θηλαστικά (Wang et al., 2008): το συσσωµάτωµα mir-23b~27b~24-1, το οποίο εδράζεται στο χρωµόσωµα 9q22 (Εικόνα 10) και βρίσκεται µέσα σε άλλο γονίδιο και το συσσωµάτωµα mir-23a~27a~24-2, το οποίο εδράζεται στο χρωµόσωµα 19p13 (Εικόνα 10) και βρίσκεται µεταξύ άλλων γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες. εν είναι ασύνηθες για τα mirna γονίδια που βρίσκονται πολύ κοντά µεταξύ τους, σε «συσσωµατώµατα», να έχουν οµόλογα και παράλογα (Yu et al., 2006). Εικόνα 10: ιάταξη των κυριότερων micrornas, που σχετίζονται µε καρκίνο, στο ανθρώπινο γονιδίωµα. Φαίνονται τα 24 χρωµοσώµατα, µε αστέρι σηµειώνονται οι τόποι που περιέχουν microrna γονίδια που σχετίζονται µε εκδήλωση καρκίνου (ένα αστέρι = ένα microrna γονίδιο), ενώ πολλά microrna γονίδια χαρτογραφούνται σε γονιδιωµατικές περιοχές στις οποίες σηµειώνονται αναδιατάξεις που οδηγούν σε καρκίνο. Με κόκκινα βέλη σηµειώνονται οι δύο γονιδιακοί τόποι στους οποίους συναντάται το γονίδιο του mir-24 (Croce, 2009). - 29 -
Το mir-24 έχει µια αξιοσηµείωτη διαφορά από τα δύο άλλα mirnas αυτού του συσσωµατώµατος. Αυτή έγκειται στο ότι το ώριµο µόριό του µπορεί να προέρχεται από οποιονδήποτε από τους δύο διαφορετικούς γενετικούς τόπους οι οποίοι το κωδικοποιούν, δίχως την παραµικρή διαφορά. Αντίθετα, η ώριµη αλληλουχία των mir-23a και mir-27a διαφέρει από την αντίστοιχη των mir-23b και mir-27b κατά ένα µόλις νουκλεοτίδιο. Έτσι, το γεγονός ότι τα ώριµα mir-24-1 και mir-24-2 έχουν την ίδια ακριβώς αλληλουχία αλλά διαφορετικά πρωταρχικά µετάγραφα σηµαίνει ότι έχουν παρόµοιες βιολογικές λειτουργίες αλλά καθένα από τα δύο εκφράζεται και ρυθµίζεται µε διαφορετικό τρόπο (Chhabra et al., 2010). Η - κοινή για τα δύο διαφορετικά µετάγραφα - αλληλουχία του ώριµου mir-24 είναι η εξής: UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG (Fu et al., 2005), ενώ αναλυτικότερα για το κάθε µετάγραφο ισχύει: mir-24-1: πρόκειται για ένα πρόδροµο µόριο mirna, µήκους 68 νουκλεοτιδίων, από το οποίο προκύπτουν δύο ώριµα mirnas (Eικόνα 11Α, Β). Συγκεκριµένα, από το 3 άκρο του προέρχεται το mir-24, που έχει µήκος 22 νουκλεοτίδια, ενώ από το 5 άκρο του προέρχεται το mir-189, που έχει µήκος 23 νουκλεοτίδια (Abelson et al., 2005). Σύµφωνα µε κάποια µελέτη, το mir-189 φαίνεται να ρυθµίζει την έκφραση του γονιδίου SLITRK1, το οποίο θεωρείται υπεύθυνο για την εκδήλωση του συνδρόµου Tourette (Abelson et al., 2005). Πολύ πρόσφατες έρευνες υποστηρίζουν πως το γονίδιο του mir-24-1 βρίσκεται µέσα σε ιντρονική περιοχή του γονιδίου C9orf3 (Eικόνα 11Γ), που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη ΑΜΡΟ (Aminopeptidase O) και για το λόγο αυτό φαίνεται να υπόκεινται σε κοινή ρύθµιση της έκφρασής τους, τουλάχιστον από ορισµένους παράγοντες (Chhabra et al., 2010, Zhou et al., 2009). mir-24-2: πρόκειται για ένα πρόδροµο µόριο mirna, µήκους 74 νουκλεοτιδίων, το οποίο ωριµάζει στο γνωστό mir-24 (Lagos- Quintana et al., 2001) (Eικόνα 11Α). Το mir-24, φυσιολογικά, εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στους πνεύµονες και την καρδιά, σε χαµηλότερα στους νεφρούς, το σπλήνα και το θύµο αδένα, ενώ δεν ανιχνεύεται στον εγκέφαλο και στο ήπαρ (Battle et al., 2006, Yamagata et al., 1996). - 30 -
B A Γ Εικόνα 11: Το mir-24. Α) Προβλεπόµενη δευτεροταγής δοµή των πρόδροµων µορίων του. Οι κόκκινες περιοχές αντιστοιχούν στο ώριµο µόριο (Mourelatos et al., 2002). Β) Η αλληλουχία της δοµής στελέχους-βρόχου που ωριµάζει στα ανθρώπινα mir-24 και mir-189 (Wang et al., 2008). Γ) Σχηµατική αναπαράσταση του γονιδιακού συσσωµατώµατος mir-23b~27b~24-1. Φαίνεται επίσης η θέση πρόσδεσης του NF-κB στην περιοχή του υποκινητή, καθώς και η αλληλουχία της (Zhou et al., 2009). ηµοσιευµένη µελέτη (Zhou et al., 2010), που έγινε σε καλλιεργηµένα κύτταρα του ανθρώπινου χολικού επιθηλίου - τα H69, δείχνει ότι η θετική ρύθµιση µιας υποοµάδας των pri-mirnas, µεταξύ των οποίων και το γονίδιο mir-23b~27b~24-1, µετά από διέγερση µε λιποπολυσακχαρίτες (LPS), εξαρτάται από τον NF-κB. Η δε µεταγραφική αναστολή, ορισµένων τουλάχιστον, από το SC-514, έναν IKK2 αναστολέα που αποτρέπει ουσιαστικά την ενεργοποίηση του NF-κB, προτείνει ότι στη µεταγραφική ρύθµιση συµµετέχουν συστατικά του NF-κB και κυρίως η p65 υποµονάδα του. Πιο συγκεκριµένα, αποδείχτηκε πως η trans ενεργοποίηση του γονιδίου mir- 23b~27b~24-1 γίνεται µέσω πρόσδεσης της υποµονάδας p65 του NF-κB στον υποκινητή του. Θέση κb εντοπίστηκε στην περιοχή -1263/-1254 του γονιδίου και η αλληλουχία της έχει ως εξής: GGGACTCTCC (Εικόνα 11Γ) (Zhou et al., 2009). Σύµφωνα µε άλλη έρευνα, έχουν αναγνωριστεί πιθανές θέσεις πρόσδεσης του NF-κB στον υποκινητή αρκετών mirnas, η έκφραση των οποίων επάγεται µετά από µόλυνση ανθρώπινων χολαγγειοκυττάρων µε Cryptosporidium parvum. Σ αυτά συµπεριλαµβάνεται και το γονίδιο mir- 23b~27b~24-1. Μάλιστα, αναστολή της ενεργοποίησης της p65 υποµονάδας του NF-κB, οδήγησε σε αναστολή της επαγωγής των περισσοτέρων mirna - 31 -
γονιδίων που επάγονται από το C. parvum (Zhou et al., 2009). Φαίνεται, λοιπόν, ξεκάθαρα ότι ο NF-κB εµπλέκεται στη ρύθµιση της έκφρασης του mir-24. 4.2.4.2. Οι λειτουργίες του mir-24 Ένας από τους πολλούς τρόπους δράσης των micrornas, µάλλον ο κυριότερος, στηρίζεται στη συµπληρωµατικότητα µεταξύ του mir και του mrna-στόχου, στην 3 αµετάφραστη περιοχή του δεύτερου. Σε αυτό στηρίχτηκε πρόσφατη µελέτη, µε σκοπό να εντοπιστούν τα mirnas που ρυθµίζουν τα επίπεδα του HNF-4α (Iliopoulos et al., 2009). Η πειραµατική προσέγγιση της µελέτης ήταν συνοπτικά η ακόλουθη. Κύτταρα 293 διαµολύνθηκαν µε τα 302 µέλη µιας micrornas-βιβλιοθήκης, σε συνδυασµό µε ένα φορέα λουσιφεράσης, ο οποίος έφερε και την 3 UTR του HNF-4α (Εικόνα 12A). Με µέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης, εκτιµήθηκε η επίδραση των micrornas στον HNF-4α. Επίσης, εντοπίστηκαν ορισµένα micrornas, τα οποία ρυθµίζουν άµεσα τον HNF-4α, καθώς προσδένονται στην 3 αµετάφραστη περιοχή του (Εικόνα 12Β). Τα τελευταία mirnas αποδείχτηκε πως επηρεάζουν περισσότερο από 20% τη δραστικότητα λουσιφεράσης και σε κύτταρα HepG2 (Εικόνα 13). Α Β Εικόνα 12: Η πειραµατική πορεία εντοπισµού των mirnas που ρυθµίζουν τον HNF- 4α. Α) Σχηµατική απόδοση της διαµόλυνσης των κυττάρων (Iliopoulos et al., 2009). Β) Μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης (Iliopoulos et al., 2009). - 32 -
Εικόνα 13: Η µείωση της δραστικότητας της λουσιφεράσης που επιφέρει κάθε επιλεγµένο micrornas (Iliopoulos et al., 2009). Μεταξύ των συγκεκριµένων micrornas, βρισκόταν και το mir-24, το οποίο µάλιστα ανέστειλε τη δραστικότητα της λουσιφεράσης κατά 71%, περισσότερο από κάθε άλλο mir που ελέγχθηκε. Με χρήση πληροφορικής ανάλυσης από εξειδικευµένα υπολογιστικά προγράµµατα, αποδείχτηκε τελικά ότι η 3 αµετάφραστη περιοχή του γονιδίου του HNF-4α εµπεριέχει µια εν δυνάµει θέση πρόσδεσης για το mir-24, που εντοπίζεται στην περιοχή 878-899bp της 3 UTR του γονιδίου (Εικόνα 14). Έτσι, αποφασίστηκε η περαιτέρω ενασχόληση µε το mir αυτό. Εικόνα 14: Σχηµατική αναπαράσταση της προβλεπόµενης θέσης πρόσδεσης του mir-24 στην 3 UTR του γονιδίου του HNF-4α (Iliopoulos et al., 2009). Το 2010, µια ακόµα δηµοσίευση ήρθε να επιβεβαιώσει τα παραπάνω αποτελέσµατα (Takagi et al., 2010). Βέβαια, σε αυτή τη µελέτη βρέθηκε ότι τα λειτουργικά MREs (mir responsive elements), για την εξαρτώµενη από το mir-24 ρύθµιση, εντοπίζονται στην κωδική περιοχή του mrna του HNF-4α. - 33 -
Αυτό όµως δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς έχει ήδη ξαναδειχθεί και για άλλους στόχους, ότι το mirna αναγνωρίζει θέσεις εντός της κωδικής περιοχής ή ακόµα της 5 αµετάφραστης περιοχής του mrna στόχου του (Forman et al., 2008, Tay et al., 2008, Lytle et al., 2008). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήµατα εκείνα σύµφωνα µε τα οποία η µείωση της έκφρασης του HNF-4α, που προκαλείται από το mir-24, οδηγεί σε µειωµένη έκφραση και των καθοδικών στόχων του πρώτου, µεταξύ των οποίων τα γονίδια των ενζύµων ALDOB, CYP1A2, G6P (Iliopoulos et al., 2009). Ένα ακόµα παράδειγµα, το ένζυµο CYP7A1, που καταλύει το πρώτο και κρίσιµο βήµα στο κλασικό µονοπάτι σύνθεσης του χολικού οξέος (Pikuleva, 2006). Αυτό, λοιπόν, ρυθµίζεται θετικά από τον HNF-4α, εποµένως επαγωγή του mir-24 θα οδηγήσει σε µείωση της έκφρασής του και κατά συνέπεια σε µειωµένη σύνθεση χολικού οξέος. Επίσης, λόγω του ίδιου µηχανισµού, και το ένζυµο PEPCK, που συµµετέχει στη γλυκονεογένεση, µειώθηκε µετά από επαγωγή του mir-24. Εποµένως, το mir-24 φαίνεται να επηρεάζει διάφορες ηπατικές λειτουργίες, µέσω της αρνητικής ρύθµισης που αυτό ασκεί στην έκφραση του HNF-4α. Είναι, λοιπόν, ήδη αποδεκτό ότι οι αλλαγές στη µορφολογία και τον αριθµό των κυττάρων, που βασίζονται στην επίδραση του mir-24, µπορεί εν µέρει να οφείλονται στη µείωση του HNF-4α. Ωστόσο, λεπτοµερής εξέταση της ρύθµισης του κυτταρικού πολλαπλασιασµού αποκάλυψε ότι αυτή θα µπορούσε να οφείλεται σε επιπρόσθετους ρόλους του mir-24, σε άλλους στόχους εκτός του HNF-4α. Για παράδειγµα, λοιπόν, το mir-24 αναφέρεται ότι προάγει τον πολλαπλασιασµό των HuH7 ηπατοκαρκινικών κυττάρων, τα οποία έχουν υποστεί επεξεργασία µε TGF-β (Huang et al., 2008), όπως επίσης και των Α549 κυττάρων πνευµονικού καρκινώµατος (Cheng et al., 2005). Αυτό φαίνεται να συµφωνεί µε µια άλλη µελέτη, που αναφέρει ότι το mir-24 αναστέλλει τη µετάφραση της p16, η οποία σταµατά τα κύτταρα στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου (Lal et al., 2008). Αντίθετα, οι Cheng et al., τo 2005, αναφέρουν ότι το mir-24 παρεµπόδισε τον πολλαπλασιασµό HeLa κυττάρων. Εποµένως, το mir-24 µπορεί να έχει διαφορετική λειτουργία σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Άρα, συνολικά από τα προηγούµενα, προκύπτει ότι το mir-24 θα µπορούσε να επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο - 34 -
µέσω της ρύθµισης πολλών γονιδίων-στόχων σε ολόκληρο το ρυθµιστικό δίκτυο της πολύπλοκης αυτής κυτταρικής λειτουργίας. Τέλος, το mir-24 φαίνεται να εµπλέκεται στην ανάπτυξη όγκων. Έτσι, για παράδειγµα, έχει προσδιοριστεί ως µέλος µιας οµάδας 23 mirs, τα οποία ρυθµίζονται ανοδικά στα ηπατοκαρκινώµατα, που αναπτύσσονται σε αρουραίους που σιτίζονται µε φολικό οξύ, µεθειονίνη και ελλειπή σε χολίνη διατροφή (Huang et al., 2008). 4.2.5. Το mir-122 Μια από τις πρώτες ενδείξεις για την ύπαρξη των micrornas στα θηλαστικά προέκυψε από µελέτες των γενετικών τροποποιήσεων σε ηπατικούς όγκους ποντικών. To 1989, περιγράφηκαν σε έναν από αυτούς τους όγκους, µια γονιδιακή αναδιάταξη του c-myc και ένα ασυνήθιστο µετάγραφο, ονοµαζόµενο hcr. Αυτό το µετάγραφο χαρακτηρίστηκε ως ηπατοειδικό, µη κωδικοποιό, πυρηνικό και η επεξεργασία του γινόταν από ενδονουκλεάσες (Moroy et al., 1989). Επιπλέον, το hcr προτάθηκε ως το πρόδροµο mir-122. Σήµερα είναι πλέον γνωστό ότι το τµήµα του hcr µεταγράφου που περιλαµβάνει το αποκαλούµενο pri-mirna υφίσταται επεξεργασία ώστε να σχηµατίσει ένα pre-mirna, µήκους 66 νουκλεοτιδίων (Εικόνα 15). Αυτό εµφανίζει δοµή φουρκέτας, µε ζευγάρωµα βάσεων σε ποσοστό 79%, ενώ η ενδονουκλεάση Dicer εµπλέκεται στην πέψη του, µετά από την οποία σχηµατίζεται το ώριµο mir-122 (Chang et al., 2003), µε αλληλουχία UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG (Gao et al., 2009). Το γονίδιο που κωδικοποιεί το ανθρώπινο mir-122, εντοπίζεται στη θέση 18q21.31. Εικόνα 15: Η αλληλουχία της δοµής στελέχους-βρόχου του mir-122 στον άνθρωπο (www.mirbase.org). - 35 -
Τα mirnas είναι γνωστό ότι έχουν συντηρηθεί εξελικτικά ανάµεσα στα είδη (Bartel & Chen, 2004). Από µια έρευνα, στην οποία συγκρίθηκαν 10 ζωικά είδη, προκειµένου να µελετηθεί ο βαθµός διατήρησης του mir-122 µεταξύ των ειδών, προέκυψε ότι η συντήρησή του είναι αξιοσηµείωτη (Girard et al., 2008). Τα είδη που ελέγχθηκαν ήταν τα: Homo sapiens, Sus scrofa, Bos taurus, Gallus gallus, Monodelphis domestica, Tetraodon nigroviridis, Fugu rubripes, Xenopus tropicalis, Rattus norvegicus, Danio rerio, Mus musculus. Μέχρι στιγµής, ο ρόλος και η εξειδίκευση του mir-122 στο ήπαρ παρουσιάζονται αρκετά συντηρηµένα, αν και είναι γνωστό ότι ένα συντηρηµένο mirna µπορεί, σε διάφορους οργανισµούς, να ρυθµίζει διαφορετικά γενετικά µονοπάτια και αναπτυξιακές διαδικασίες (Pasquinelli et al., 2008). Το mir-122 είναι το πιο άφθονο mirna στο ενήλικο ήπαρ, αποτελώντας περίπου το 70% του συνολικού πληθυσµού των mirnas του συγκεκριµένου οργάνου (Lagos-Quintana et al., 2002, Chang et al., 2004). Αντίθετα, άλλα mirnas, όπως το mir-92a και το mir-483, εκφράζονται σε αφθονία στο εµβρυϊκό ήπαρ (Girard et al., 2008). Το mir-122 µπορεί να ανιχνευτεί ήδη από τις 12,5 ηµέρες µετά την εµφύτευση του ζυγωτού, αλλά φτάνει σε πλατό ακριβώς πριν τη γέννηση (Chang et al., 2004). Το επίπεδό του αυξάνεται µετά τη γέννηση, µε πολύ χαµηλότερο ρυθµό όµως. Παρόλο που το συγκεκριµένο microrna έχει περιγραφεί ως ηπατοειδικό, µικρή έκφραση έχει επίσης ανιχνευτεί στην καρδιά (Tang et al., 2007). Αν και η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου του δεν έχει ακόµα αναγνωριστεί, µια θέση πρόσδεσης του HNF-3β έχει εντοπιστεί στα 5kb ανοδικά του γονιδίου αυτού. Έτσι, αν και αρχικά δινόταν µεγαλύτερη βαρύτητα στον HNF-4α, ως το συνδετικό κρίκο µεταξύ σταδίου διαφοροποίησης και µεταγραφής του γονιδίου mir-122, τώρα πλέον προτείνεται πως πιο σηµαντικό ρόλο παίζουν άλλοι ηπατοειδικοί µεταγραφικοί παράγοντες, όπως οι HNF-1α, HNF-3α και HNF-3β (Coulouarn et al., 2009). Το mir-122 φαίνεται πως συµβάλλει στη διατήρηση της ηπατικής διαφοροποίησης καταστέλλοντας αρκετά γονίδια, που φυσιολογικά δεν εκφράζονται στα ηπατοκύτταρα (Girard et al., 2008). Σύµφωνα µε σύγχρονες αναφορές, οι κυριότερες ηπατικές λειτουργίες, στις οποίες εµπλέκεται ως ρυθµιστής, είναι ο µεταβολισµός των λιπιδίων και της χοληστερόλης. Σε - 36 -
συµφωνία µε τα προηγούµενα, λοιπόν, έχει βρεθεί ότι η έκφραση αρκετών γονιδίων απολιποπρωτεϊνών σχετίζεται µε τα επίπεδα του mir-122 (Esau et al., 2006, Elmen et al., 2008). Καθώς το microrna αυτό θεωρείται ηπατοειδικό, είναι λογικό η συγκέντρωσή του να είναι πολύ υψηλή στα ηπατοκύτταρα του ποντικού και του ανθρώπου, αλλά εµφανίζεται µηδενική ή πολύ χαµηλή στα περισσότερα ηπατοκαρκινώµατα και τις µετασχηµατισµένες κυτταρικές σειρές (Baskerville & Bartel, 2005). Επίσης, έχει αναφερθεί πως ρυθµίζεται αρνητικά στα προνεοπλαστικά οζίδια, στα ηπατοκαρκινώµατα που εµφανίζονται σε ποντικούς οι οποίοι τρέφονται µε δίαιτα ελλιπή σε χολίνη, όπως και σε πρωταρχικά ηπατοκαρκινώµατα στον άνθρωπο (Chen, 2009). Εκτοπική έκφραση του mir-122 σε κυτταρικές σειρές που δε το εκφράζουν, όπως οι HepG2, Hep3B και SK-Hep-1, ανέστρεψε τις ογκογονικές ιδιότητές τους, µεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται η ανάπτυξη, η ικανότητα διπλασιασµού, η δηµιουργία κλώνων, η ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, η µετανάστευση, η εισβολή και η δηµιουργία όγκων σε αθυµικά ποντίκια. Ακόµη, ηπατοκαρκινικά κύτταρα στα οποία εκφράστηκε, διατήρησαν έναν επιθηλιακό φαινότυπο, ο οποίος σχετιζόταν µε τη µειωµένη έκφραση βιµεντίνης. Εποµένως, αυτή φαίνεται να αποτελεί στόχο του, όπως άλλωστε και τα γονίδια ADAM10 (a distintegrin and metalloprotease family 10), SRF (serum response factor) και Igf1R (insulin-like growth factor 1 receptor), που προωθούν την καρκινογένεση. Συγκεκριµένα, δηµοσιευµένη µελέτη έδειξε ότι η ταυτόχρονη αναστολή των τριών προαναφερθέντων γονιδίων-στόχων από το mir-122, αναστέλλει άµεσα την αγγειογένεση in vitro (Bai et al., 2009). Γενικώς, πάντως, φαίνεται ότι η απώλεια του πολυλειτουργικού αυτού microrna, συµβάλλει στον κακοήθη φαινότυπο των ηπατοκαρκινικών κυττάρων. Μια άλλη µελέτη αναφέρει ότι το mir-122 έχει ογκοκατασταλτική λειτουργία µέσω στόχευσης της ADAM17 (Tsai et al., 2009). Η οικογένεια πρωτεϊνών ADAM και πιο συγκεκριµένα οι πρωτεΐνες-µέλη ADAM10 και ADAM17, εµπλέκονται στη µεταγωγή σήµατος µέσω των µονοπατιών των παραγόντων ανάπτυξης, των κυτοκινών και του Notch, καθώς και στην προσκόλληση των κυττάρων µεταξύ τους (Duffy et al., 2009, Maretzky et al., 2005). Η ανασταλτική ρύθµιση των πρωτεϊνών ADAM, από το mir-122, - 37 -
µπορεί να µειώσει τις ογκογονικές ιδιότητες των ηπατοκαρκινωµάτων, επειδή οι συγκεκριµένες πρωτεΐνες αποτελούν ρυθµιστές κλειδιά της µετανάστευσης και της εισβολής, που επάγονται απ τον υποδοχέα του EGF (epidermal growth factor receptor) και τον υποδοχέα που συνδέεται µε G πρωτεΐνη (G protein-coupled receptor), σε διάφορους όγκους. Το mir-122 εµπλέκεται και στην απόπτωση µέσω του παρακάτω µονοπατιού. Έχει εξακριβωθεί ότι υπάρχει θέση πρόσδεσής του στην 3 αµετάφραστη περιοχή του γονιδίου Bcl-w, ενός µέλους της οικογένειας των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2. Έτσι, το mir-122 οδηγεί σε µείωση της κυτταρικής βιωσιµότητας και σε ενεργοποίηση της κασπάσης-3, µέσω του µηχανισµού αυτού. Εποµένως, η Bcl-w αποτελεί άµεσο στόχο του mir-122 και δρα ως ενδογενής αποπτωτικός ρυθµιστής στις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ηπατοκαρκινώµατα (Lin et al., 2008). Τέλος, η τροποποίηση της έκφρασης του mir-122 επηρεάζει σηµαντικά την κλίση των καρκινικών κυττάρων στη µετανάστευση και την εισβολή. Συγκεκριµένα, η απώλειά του έχει ως αποτέλεσµα την απόκτηση µεταναστευτικών και εισβολικών ιδιοτήτων, ενώ αντίθετα η αποκατάστασή του αποδείχτηκε ικανή να αναστρέψει το φαινότυπο αυτό. Μια εξελικτικά συντηρηµένη θέση πρόσδεσης για το mir-122 έχει ανιχνευτεί στην 3 αµετάφραστη περιοχή του γονιδίου RHOA (Ras homolog gene family member A). Το γονίδιο αυτό υπερεκφράζεται στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο και αρκετοί ερευνητές συσχετίζουν την αυξηµένη έκφρασή του µε την εξέλιξη του όγκου, αλλά και µε την κυτταρική διαφοροποίηση και τη µετάσταση (Grise et al., 2009). Η µείωση της έκφρασης του mir-122 έχει καταγραφεί κυρίως στα ηπατοκαρκινώµατα που δηµιουργούνται σε άτοµα µολυσµένα από τον ιό HBV. Αντίθετα, στους ηπατοκυτταρικούς καρκίνους που αναπτύσσονται µετά από µόλυνση µε τον ιό HCV, η έκφρασή του παραµένει σταθερή ή αυξάνεται, σύµφωνα µε πρόσφατες παρατηρήσεις (Varnholt et al., 2008). Ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι η ικανότητα αντιγραφής του HCV βρέθηκε να σχετίζεται στενά µε τα επίπεδα έκφρασης του mir-122 (Jopling et al., 2005, Chang et al., 2008), ενώ επιπλέον έρευνες το εµπλέκουν και µε την έκφραση των γονιδίων του ιού. Οι παρατηρήσεις αυτές προτείνουν τη συµµετοχή του mir-122 στον τροπισµό του ιού HCV στο ήπαρ (Henke et al., 2008). - 38 -
Εποµένως, φαίνεται πως ο HCV όχι µόνο απαιτεί την ύπαρξη του ενδογενούς mir-122 στο κύτταρο-ξενιστή για την αντιγραφή του, αλλά επίσης µπορεί άµεσα να επάγει την έκφραση ή έµµεσα να αναστείλει τη µείωση του mir αυτού. Ανάλυση της υποθετικής θέσης πρόσδεσης του mir-122, στο 5 άκρο του γονιδιώµατος του HCV, απέδειξε την άµεση συµµετοχή του συγκεκριµένου mir στην αντιγραφή του ιού (Jopling et al., 2005). Επιπρόσθετα, έχει χαρακτηριστεί και ένα έµµεσο αποτέλεσµα της αναστολής του mir-122 στη ρύθµιση του ίδιου ιού, που εµπλέκει δύο κυτταρικά γονίδια. Συγκεκριµένα, αυξάνεται η έκφραση του κυτταροπροστατευτικού ενζύµου HO- 1 (heme-oxygenase 1), ενώ ταυτόχρονα µειώνεται εκείνη του γονιδίου Bach1, που δρα ως καταστολέας του πρώτου (Meng et al., 2007). Συνολικά, λοιπόν, το mir-122 είναι τόσο σηµαντικό για τον ιό HCV, που θα µπορούσε να αποτελέσει µέχρι και υποψήφιο φαρµακευτικό στόχο για την αντιµετώπιση του ιού. Λόγω της εκλέπτυνσης των πειραµατικών τεχνικών, αλλά και της συµβολής των προγραµµάτων βιοπληροφορικής, εντοπίζονται ολοένα και περισσότεροι πιθανοί στόχοι για κάθε microrna. Το ίδιο ισχύει και για το mir-122. Παρατείθενται, λοιπόν, δύο ακόµη νεοανακαλυφθείσες θέσεις πρόσδεσης του mir-122 σε ανθρώπινα γονίδια. Η πρώτη από αυτές έχει ταυτοποιηθεί στην 3 αµετάφραστη περιοχή του γονιδίου CAT-1 (cationic amino acid transporter) (Chang et al., 2004). Παράλληλα, σε όλα τα στάδια της ηπατικής ανάπτυξης, η συσχέτιση της έκφρασης των CAT-1 και mir-122 έχει αποδειχτεί αντίστροφη, γεγονός που ενισχύει την πιθανότητα ύπαρξης της θέσης. Η δεύτερη εντοπίζεται στην 3 αµετάφραστη περιοχή του γονιδίου της κυκλίνης G1 (CCNG1). Η αντίστροφη συσχέτιση µεταξύ του mir-122 και της CCNG1 δίνει έµφαση στη σηµασία του mir-122 στην παθογένεση του ηπατικού καρκινώµατος (Gramantieri et al., 2007), ενώ έρχεται και σε συµφωνία µε την προβλεπόµενη θέση. Τέλος, οι µοριακές λειτουργίες των γονιδίων-στόχων του mir-122, σύµφωνα µε πρόσφατη έρευνα, σχετίζονται µε τη ρύθµιση της µεταγραφής, τη µεταφορά των αµινοξέων, τη διακίνηση των πρωτεϊνών και τη µεταγωγή σήµατος (Tsai et al., 2009). - 39 -
4.3. Καρκίνος Ο καρκίνος είναι µια από τις πιο σοβαρές ασθένειες σε ολόκληρο τον κόσµο. Υπάρχουν πέντε κύρια στάδια στην ανάπτυξη του καρκίνου (Εικόνα 16) (Zhang et al., 2007): έναρξη (initiation), προώθηση (promotion), δηµιουργία κακοήθειας (malignant conversion), ανάπτυξη (progression), µετάσταση (metastasis). Εικόνα 16: Σχηµατική αναπαράσταση των πέντε σταδίων ανάπτυξης του καρκίνου (Οlson et al., 2009). Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν τη δηµιουργία του καρκίνου: κάποιοι αναστέλλουν την ανάπυξη των όγκων (ογκο-καταστολείς) και κάποιοι άλλοι επάγουν την ανάπτυξή τους (καρκινικοί επαγωγείς). Η πρόκληση του καρκίνου είναι αποτέλεσµα της συνδυασµένης αλληλεπίδρασης µεταξύ τόσο των ογκοκαταστολέων όσο και των καρκινικών επαγωγέων. Οι επιστήµονες προσπαθούν να διαλευκάνουν τους µοριακούς µηχανισµούς που προκαλούν την ανάπτυξη καρκίνου, αλλά και να αναπτύξουν την πρόληψη εναντίον του. Παρότι αρκετά γονίδια, συµπεριλαµβανοµένων ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων, έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο και σε άλλα ζωικά γονιδιώµατα, ο µηχανισµός της καρκινογένεσης δεν έχει εξακριβωθεί ακόµη πλήρως. Τα micrornas, όµως, παρέχουν νέες προοπτικές στην έρευνα για τη συγκεκριµένη ασθένεια. Μια πρόσφατη µελέτη έδειξε ότι περισσότερα από το 50% των mirna γονιδίων εδράζονται σε γονιδιωµατικές περιοχές που φαίνεται να σχετίζονται µε τον καρκίνο ή σε εύθραυστα σηµεία του γονιδιώµατος (Calin et al., 2004) (Εικόνα 10), προτείνοντας έτσι ότι τα - 40 -
mirnas παίζουν σηµαντικό ρόλο στην παθογένεση ορισµένων καρκίνων στον άνθρωπο. Η δράση των mirnas στον καρκίνο αρχικά αναγνωρίστηκε από δύο ευρήµατα: πρώτον, η πλειονότητα των mirnas εδράζεται σε γονιδιωµατικές περιοχές που σχετίζονται µε τον καρκίνο ή σε εύθραυστα σηµεία του γονιδιώµατος (Calin et al., 2004) και δεύτερον, τα mirnas εµφανίζουν διαφορετική έκφραση µεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων του ίδιου ιστού (Lu et al., 2005). Μετά από πολυάριθµα πειράµατα και κλινικές αναλύσεις έχει προταθεί πως τα mirnas λειτουργούν ως: ογκογονίδια. Εκείνα τα mirnas των οποίων η έκφραση είναι αυξηµένη στους όγκος µπορούν να θεωρηθούν ως ογκογονίδια. Αυτά τα ογκογόνα mirnas, τα ονοµαζόµενα και «oncomirs», συνήθως επάγουν την ανάπτυξη όγκων µέσω αρνητικής ρύθµισης ογκοκατασταλτικών γονιδίων και γονιδίων που ελέγχουν την κυτταρική διαφοροποίηση και απόπτωση. Πολλά mirna γονίδια έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζονται σηµαντικά σε διάφορους τύπους καρκίνου. Όλα αυτά φαίνεται να λειτουργούν ως ογκογονίδια, ωστόσο µόνο λίγα έχουν χαρακτηριστεί καλά µέχρι στιγµής. ογκοκατασταλτικά γονίδια. Στην κατηγορία αυτή κατατάσσονται τα mirnas εκείνα που παρουσιάζουν µειωµένη έκφραση στους καρκινικούς όγκους. Εκτεταµένες µελέτες πολυπληθών ανθρώπινων καρκινικών ιστών έδειξε ότι τα mirnas τείνουν να εµφανίζουν διαφορετικό πρότυπο έκφρασης στα καρκινικά και στα φυσιολογικά κύτταρα του ίδιου ιστού. Επιπλέον, ο τρόπος έκφρασής τους - κάποια υπερεκφράζονται, άλλα υποεκφράζονται - σχετίζονται µε τη διάγνωση της ασθένειας, σύµφωνα µε εκτεταµένες µελέτες σε ασθενείς µε καρκίνο. Αυτό συµβαίνει επειδή κάθε τύπος καρκίνου φαίνεται να συνδέεται µε συγκεκριµένο πρότυπο έκφρασης των mirnas (mir υπογραφή - mir signature). Πολλοί ερευνητές, λοιπόν, αναγνωρίζουν ότι κάθε καρκινικός ιστός έχει ξεχωριστή microrna υπογραφή και η χρησιµότητα της - 41 -
εξειδικευµένης κατηγοριοποίησης των καρκίνων µε βάση την έκφραση των mirnas, έχει µεγάλη προγνωστική και θεραπευτική αξία (Lu et al., 2005). 4.3.1. Το ηπατοκαρκίνωµα 4.3.1.1. Η νόσος Το ήπαρ είναι ένα όργανο ζωτικής σηµασίας µε πολλαπλές και σύνθετες λειτουργίες για τον οργανισµό. Μεταξύ αυτών, η αποτοξίνωση του οργανισµού, το φιλτράρισµα και η αποθήκευση αίµατος, καθώς και η µετατροπή των λαµβανόµενων τροφών σε ενέργεια για την κάλυψη των αναγκών του σώµατος. Αξιοσηµείωτη είναι η ικανότητά του να αναγεννάται. Έτσι, περισσότερο απ το 80% του οργάνου µπορεί να αφαιρεθεί χειρουργικά και εντός λίγων µόνο εβδοµάδων αυτό θα έχει ολοκληρωτικά αναγεννηθεί. Επίσης, εάν ο ένας λοβός του αφαιρεθεί, µαζί µε τα αιµοφόρα αγγεία αυτής της περιοχής, ο άλλος αντισταθµίζει την απώλεια. Ο καρκίνος του ήπατος είναι ο έβδοµος πιο κοινός τύπος καρκίνου στον κόσµο και ο τρίτος σε συχνότητα θανάτων παγκοσµίως (Ferlay et al., 2010, Forner et al., 2006). Aπό απόψεως συχνότητας, παρουσιάζει σηµαντικές αποκλίσεις µεταξύ των διαφόρων γεωγραφικών περιοχών του πλανήτη. Η υψηλότερη συχνότητα εµφάνισης και θνησιµότητας παρουσιάζεται στην Ανατολική Ασία, ενώ αντίθετα η χαµηλότερη στην Ωκεανία (Εικόνα 17). Στην Ελλάδα, εµφανίζεται σε συχνότητα µεγαλύτερη από αυτή των υπολοίπων χωρών της υτικής και Βόρειας Ευρώπης. Για τον ελληνικό πληθυσµό, µάλιστα, αυτός ο τύπος καρκίνου φαίνεται πως είναι ο πέµπτος σε αριθµό περιστατικών - µε 2.267 ασθενείς το 2008 - και ο τέταρτος σε θανάτους - σηµειώθηκαν 1.615 το 2008 (Εικόνα 18). Παγκοσµίως, οι κυριότεροι κίνδυνοι για την εµφάνιση καρκίνου του ήπατος είναι (Parkin et al., 1999): η µόλυνση από ηπατοϊούς, συγκεκριµένα αυτούς της ηπατίτιδας B (HBV) και C (HCV), η κατανάλωση τροφών µολυσµένων µε αφλατοξίνη Β1 (AFB), η κίρρωση, που µπορεί να έχει πολλές αιτίες εκδήλωσης, η αλκοολική στεατοηπατίτιδα (ASH), - 42 -
ορισµένες µεταβολικές διαταραχές, όπως η µη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH), η κληρονοµική αιµοχρωµάτωση και κάποιες ανοσοσχετιζόµενες ασθένειες, όπως η αυτοάνοση ηπατίτιδα (Thorgeirsson & Grisham, 2002). Εικόνα 17: Συχνότητα εµφάνισης και θνησιµότητα του ηπατοκαρκινώµατος στις διάφορες περιοχές του πλανήτη (http://globocan.iarc.fr). Εικόνα 18: Αριθµός περιστατικών και αριθµός θανάτων από διάφορους τύπους καρκίνου στην Ελλάδα (http://globocan.iarc.fr). Στο σύνολό τους οι δύο ιοί αυξάνουν τον κίνδυνο πρόκλησης ηπατικού καρκίνου κατά είκοσι φορές (Donato et al., 1998). Λόγω του ότι ο ιός της ηπατίτιδας Β είναι πιο διαδεδοµένος, η κατανοµή των µολύνσεων σε - 43 -
παγκόσµια κλίµακα εξηγεί σε µεγάλο βαθµό τα πρότυπα εµφάνισης του ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Βέβαια, απαντάται τελικά πολύ πιο συχνά στην περιοχή της Ασίας και του Ειρηνικού, µε εξαίρεση την Ιαπωνία, αλλά και στην Αφρική, λόγω των δυσκολιών στη φαρµακευτική αντιµετώπισή του στα µέρη αυτά. Υπολογίζεται, πάντως, ότι το 10-20% των ασθενών µε λοίµωξη από HBV θα αναπτύξουν στη ζωή τους καρκίνο του ήπατος. Από την άλλη, ο ιός της ηπατίτιδας C αποτελεί έναν από τους κυριότερους παράγοντες κινδύνου εµφάνισης ηπατοκαρκινώµατος στις ΗΠΑ, στην Ευρώπη και στην Ιαπωνία, όπου χρόνιες µολύνσεις είναι µεν σπάνιες αλλά συνδέονται στενά µε την εµφάνιση καρκίνου του ήπατος (Lodato et al., 2006). Πολλά είναι γνωστά σχετικά µε τις αιτίες ανάπτυξης του ηπατοκαρκινώµατος. Σχεδόν πάντοτε αναπτύσσεται µετά από χρόνια ηπατίτιδα ή κίρρωση, συνθήκες κάτω από τις οποίες πολλά ηπατοκύτταρα σκοτώνονται, φλεγµονώδη κύτταρα εισβάλλουν στο ήπαρ και ο συνδετικός ιστός αυξάνεται. Αυτές οι αλλαγές τροποποιούν δραστικά το υπόβαθρο και το µικροπεριβάλλον του ήπατος. Οι αρχικές ηπατοκυτταρικές τροποποιήσεις που προηγούνται της εµφάνισης του ηπατοκαρκινώµατος συµπεριλαµβάνουν εστίες φαινοτυπικά τροποποιηµένων ηπατοκυττάρων και συνακόλουθα, δυσπλαστικά ηπατικά κύτταρα τα οποία δηµιουργούν εστίες και οζίδια (Buendia, 2000). Έχουν αναγνωριστεί ορισµένοι παράγοντες που εκκινούν το ηπατοκαρκίνωµα και έχει µετρηθεί ο αντίκτυπός τους. Επίσης, έχουν γίνει καλύτερα κατανοητοί οι κύριοι λόγοι που οδηγούν σε ηπατικό καρκίνο, παρά σε άλλες περιπτώσεις ανθρώπινων καρκίνων. Επιπλέον, οι κύριες αιτίες δηµιουργίας αυτού του καρκινικού τύπου - ο ιός της ηπατίτιδας Β, ο ιός της ηπατίτιδας C και η αφλατοξίνη Β1 - οι οποίες αθροιστικά ευθύνονται για το 80% του συνόλου των ηπατοκυτταρικών καρκίνων στον άνθρωπο (Bosch et al., 1999), αφήνουν «µοριακούς δείκτες» στα ηπατοκύτταρα. Οι δείκτες αυτοί επιτρέπουν την ακριβή και ταυτόχρονα πλήρη διαλεύκανση των αιτίων που προκάλεσαν το ηπατοκαρκίνωµα, σε µεγάλο πλήθος ξεχωριστών περιπτώσεων (Bréchot et al., 1998). Γενωµικές ανακατατάξεις έχουν περιγραφεί σε χιλιάδες ηπατοκαρκινώµατα του ανθρώπου, γεγονός που οδήγησε στη δηµιουργία µιας µεγάλης βάσης δεδοµένων, η οποία συνεχώς και συµπληρώνεται. Σήµερα, έχουν πλέον διαλευκανθεί αρκετά οι διάφορες µοριακές - 44 -
αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ηπατοκυττάρων και των εξειδικευµένων εκείνων παραγόντων που συνιστούν την αιτία του κακοήθους ηπατώµατος. Ακόµα, έχει ξεκαθαρίσει σε µεγάλο βαθµό και το πώς αυτές οι αλληλεπιδράσεις διαταράσσουν τα ηπατοκυτταρικά γονίδια αλλά και τα γονιδιακά προϊόντα εκείνα που οδηγούν στην εµφάνιση ηπατοκαρκινώµατος (Diao et al., 2001, Smela et al., 2001). Οι αναλύσεις καταδεικνύουν την ανάπτυξη µιας γενικής αλληλουχίας γενωµικών αλλαγών κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της ηπατοκαρκινογένεσης και υποδεικνύουν µοριακά µονοπάτια, τα οποία πιθανότατα οδηγούν τα ηπατοκύτταρα στην ανάπτυξη κακοήθους φαινοτύπου. Σε όλες τις προνεοπλασµατικές καταστάσεις και τους τροποποιηµένους κυτταρικούς πληθυσµούς παρατηρείται επιταχυνόµενος πολλαπλασιασµός των ηπατοκυττάρων, καθώς και ανάπτυξη µονοκλωνικών ηπατοκυτταρικών πληθυσµών, αλλαγές που συνεχίζονται µέχρι να προκληθεί ηπατοκαρκίνωµα. Απ την άλλη, γενωµικές αλλαγές φαίνεται να εµφανίζονται τυχαία, ξεκινώντας βέβαια στα σηµεία προνεοπλασµατικών αλλοιώσεων και η ανάπτυξή τους δηµιουργεί τελικά δυσπλαστικά ηπατοκύτταρα και ηπατοκαρκίνωµα. Η εκτεταµένη ετερογένεια των γενωµικών αλλοιώσεων που παρουσιάζουν τα ηπατοκαρκινώµατα προτείνει ότι ο συγκεκριµένος τύπος της νόσου πιθανότατα προκαλείται από συνδυασµό τόσο γενωµικών όσο και επιγενετικών τροποποιήσεων, οι οποίες απαιτούν τη συνύπαρξη περισσοτέρων του ενός ρυθµιστικών µονοπατιών. Ο ηπατικός καρκίνος είναι µια σύνθετη ασθένεια µε εξαιρετική ετερογένεια, τόσο σχετικά µε τα αίτία της, όσο και µε τα συµπτώµατά της. Ενέχει επιγενετική και χρωµοσωµική αστάθεια (El-Serag & Rudolph, 2007), αλλά και ανωµαλίες στην έκφραση κωδικοποιών και µη κωδικοποιών γονιδίων, συµπεριλαµβανοµένων βεβαίως και των mirnas (Liang et al., 2007, Varnholt, 2008). 4.3.1.2. Ο ρόλος του HNF-4α στο ηπατοκαρκίνωµα Έχει αποδειχτεί ότι η µείωση της έκφρασης των ηπατοειδικών µεταγραφικών παραγόντων σχετίζεται µε την πρόοδο του ηπατοκαρκινώµατος (Lazarevich et al., 2004). Μάλιστα, καθοριστικό ρόλο κατέχει η απώλεια της έκφρασης του HNF-4α (Yin et al., 2008). Μελέτες που - 45 -
πραγµατοποιήθηκαν σε κυτταρικές σειρές ηπατώµατος, HepG2 και Hep3B, υπέδειξαν πως η υπερέκφραση του HNF-4α αρκεί για να µειωθεί ο πληθυσµός των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων, αλλά και για να ανασταλεί η έκφραση αρκετών γονιδίων, όπως τα β-catenin, Oct3/4, SMO, Bmi, Sox2, NANOG, c-myc, Klf4 και LIN28, τα οποία προσδίδουν στα κύτταρα πιο ολοδύναµο χαρακτήρα. Μάλιστα, για πολλά από αυτά είναι ήδη γνωστό ότι εµπλέκονται στην πρόοδο του ηπατοκυτταρικού καρκίνου, ενώ όλα τους είναι απαραίτητα για τον πολλαπλασιασµό των προγονικών κυττάρων. Ακόµα, η υπερέκφραση του HNF-4α, βρέθηκε να µειώνει τόσο τον πολλαπλασιασµό, όσο και το σχηµατισµό αποικιών, στις κυτταρικές σειρές HepG2 και Hep3Β, επάγοντας απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Επίσης, τα αυξηµένα ποσοστά του HNF-4α ήταν ικανά να µειώσουν σηµαντικά την ικανότητα σχηµατισµού όγκων και των δύο κυτταρικών σειρών. Συγκεκριµένα, βρέθηκε ότι εµβολιασµός ποντικών µε κύτταρα Hep3B οδήγησε σε σχηµατισµό όγκων την 11 η ηµέρα, ενώ µε HepG2 τη 18 η ηµέρα. Η υπερέκφραση του HNF-4α, όµως, απέτρεψε τη δηµιουργία όγκου και από τις δύο κυτταρικές σειρές, ακόµα και 8 εβδοµάδες µετά τον εµβολιασµό. Τέλος, σε ποντίκια µε όγκους µεγέθους 50-500 mm 3, µειώθηκε το µέγεθός τους και παράλληλα αυξήθηκε η έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, όπως τα ALDOB, apo-ai, PEPCK και CYP1Α2, µετά από χορήγηση αδενοϊού που έφερε το γονίδιο του HNF-4α. Συνολικά, λοιπόν, φαίνεται πως ο HNF-4α καταστέλλει την κακοήθεια, επαναδιαφοροποιώντας τα καρκινικά κύτταρα προς πιο φυσιολογικό ηπατικό φαινότυπο (Yin et al., 2008). - 46 -
5. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η µελέτη της ρύθµισης του ηπατοειδικού πυρηνικού υποδοχέα ΗΝF-4α από τα micrornas. Ειδικότερα, διερευνήθηκε η ρύθµιση του ΗΝF-4α από το mir-24. Ο ΗΝF-4α εµπλέκεται στη ρύθµιση των επιπέδων έκφρασης µιας πληθώρας γονιδίων. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο µελετήθηκε η επίδραση του mir-24 στην έκφραση και των γονιδίων-στόχων του συγκεκριµένου µεταγραφικού παράγοντα. Ακόµη, προσεγγίστηκε ένας πιθανός τρόπος ρύθµισης της έκφρασης του ίδιου του mir-24, καθώς µπορεί µεν να αποτελεί ρυθµιστικό µόριο, αυτό όµως δε σηµαίνει ότι δεν επιδέχεται έλεγχο και το ίδιο. Έναν επιπλέον στόχο αποτέλεσε η προσπάθεια να προσδιοριστεί η τροποποίηση της έκφρασης µιας οµάδας παραγόντων, από την προσβολή του οργανισµού από τους ιούς της ηπατίτιδας Β ή C, κατάσταση που θεωρείται ότι οδηγεί στη δηµιουργία ηπατοκαρκινώµατος. Οι παράγοντες αυτοί περιλαµβάνουν µόρια του ηπατικού µεταγραφικού δικτύου, τους HNF- 3α και HNF-4α, καθώς επίσης και mirs, τα mir-24 και mir-122. Τέλος, τέθηκε ο στόχος της εξακρίβωσης της σχέσης µεταξύ mir-24 και ΗΝF-4α, σε ασθενείς µε καλά χαρακτηρισµένο ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα, ώστε να επιβεβαιωθούν τα όσα παρατηρήθηκαν στην πρώτη σειρά πειραµάτων και in vivo. - 47 -
6. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 6.1. Κυτταροκαλλιέργειες Για τη διεξαγωγή των πειραµάτων της παρούσας εργασίας χρησιµοποιήθηκε η κυτταρική σειρά HepG2 (Εικόνα 19), που αντιπροσωπεύει ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ήπατος. Πρόκειται για µια αθανατοποιηµένη κυτταρική σειρά, η οποία έχει αποµονωθεί από ηπατικό ιστό ενός 15χρονου Καυκάσιου άνδρα, Αµερικανικής εθνικότητας, µε καλά χαρακτηρισµένο ηπατοκαρκίνωµα. Τα HepG2 είναι κύτταρα, τα οποία προσκολούνται στο υπόστρωµα, αναπτύσσονται σε µονοστοιβάδες και µερικές φορές σχηµατίζουν µικρά συσσωµατώµατα, εµφανίζοντας κατακόρυφη ανάπτυξη. Τα κύτταρα αυτά µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως ένα in vitro σύστηµα µελέτης των ανθρώπινων ηπατοκυττάρων, καθώς είναι επιθηλιακά στη µορφολογία και εκκρίνουν πολλές βασικές πρωτεϊνες του πλάσµατος, όπως η αλβουµίνη, η α2-µακρογλουβίνη, η τρανσφερίνη, το πλασµινογόνο, το ινωδογόνο. Έχουν χρησιµοποιηθεί σε µελέτες του ηπατικού µεταβολισµού και της τοξικότητας των ξενοβιοτικών, καθώς και για την κατανόηση της ηπατοκαρκινογένεσης, αλλά και σε µελέτες που στοχεύουν στην ανάπτυξη νέων φαρµάκων για διάφορες ασθένειες του ήπατος στον άνθρωπο. Εικόνα 19: Η κυτταρική σειρά HepG2. Η κυτταρική σειρά HepG2 διατηρείται σε πλήρες θρεπτικό µέσο DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s medium), το οποίο εµπλουτίστηκε µε: 1. 10% εµβρυϊκό ορό µοσχαριού (fetal bovine serum, FBS) 2. 100 U/ml πενικιλίνη - 48 -
3. 100 µg/ml στρεπτοµυκίνη 4. 1% L-γλουταµίνη Τα κύτταρα συντηρούνται σε φλάσκες 75 cm 2, σε επωαστικό κλίβανο θερµοκρασίας 37 ο C και σε ατµόσφαιρα 5% CO 2 και µεταφέρονται σε νέα φλάσκα, σε αραίωση 1:10, περίπου µία φορά την εβδοµάδα, όταν φτάσουν σε πυκνότητα 80%-90%, ενώ κάθε 3 ηµέρες γίνεται ανανέωση του θρεπτικού µέσου µε φρέσκο. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: 1. Αφαίρεση του παλιού θρεπτικού µέσου. 2. Προσθήκη 10ml 1x PBS ph:7,2, ισοτονικό διάλυµα φωσφορικών αλάτων, για να ξεπλυθούν τα κύτταρα και άµεση αφαίρεσή του. 3. Προσθήκη 3ml διαλύµατος 0,05% τρυψίνης-edta, για την αποκόλληση των κυττάρων, και επώαση στους 37 ο C για 2-3 λεπτά. 4. Απενεργοποίηση του διαλύµατος τρυψίνης-edta, µε την προσθήκη 7ml πλήρους θρεπτικού µέσου και σάρωµα όλης της επιφάνειας της φλάσκας, ώστε να αποκολληθούν όλα τα κύτταρα, καθώς και προσεκτικό πιπετάρισµα ώστε να διαλυθούν τυχόν συσσωµατώµατα και να µεταφερθούν στην καινούρια φλάσκα µεµονωµένα κύτταρα. Όλα τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται στις κυτταροκαλλιέργειες είναι αποστειρωµένα και προθερµασµένα στους 37 ο C. Επίσης, ο αριθµός των κυττάρων που πρόκειται να χρησιµοποιηθεί στα πειράµατα προσδιορίζεται µε τη βοήθεια του αιµοκυτταροµέτρου και της χρωστικής trypan blue, η οποία χρωµατίζει τα νεκρά κύτταρα µπλε, ενώ τα ζωντανά κύτταρα παραµένουν διαφανή. 6.2. ιαµόλυνση κυτταρικών σειρών Με τον όρο διαµόλυνση αναφερόµαστε στη διαδικασία εισαγωγής ξένων νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA) στα κύτταρα των θηλαστικών. Η διαµόλυνση αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο µελέτης της γονιδιακής λειτουργίας και ρύθµισης, καθώς και της πρωτεϊνικής λειτουργίας. Ο κύριος στόχος της είναι η µελέτη της λειτουργίας γονιδίων ή γονιδιακών προϊόντων, αλλά και η παραγωγή ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών σε κύτταρα θηλαστικών. Η εισαγωγή ξένου γενετικού υλικού στα κύτταρα µπορεί να είναι είτε σταθερή - 49 -
είτε παροδική. Στη σταθερή διαµόλυνση, το ξένο γενετικό υλικό ενσωµατώνεται στο γονιδίωµα του ξενιστή και εκφράζεται συνεχώς, ενώ στην παροδική εκφράζεται για περιορισµένο µόνο χρονικό διάστηµα και δεν ενσωµατώνεται στο γονιδίωµα του ξενιστή. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές διαµόλυνσης, οι οποίες διακρίνονται κυρίως βάσει του αν στηρίζονται σε χηµικές µεθόδους ή όχι. Στις χηµικές µεθόδους περιλαµβάνονται: i) η διαµόλυνση µε φωσφορικό ασβέστιο (calcium phosphate), ii) η διαµεσολαβούµενη από λιποσώµατα διαµόλυνση, iii) η διαµόλυνση µε κατιονικά πολυµερή, όπως η DEAE-δεξτράνη. Στις µη χηµικές µεθόδους περιλαµβάνεται: i) η ηλεκτροδιάτρηση (electroporation), ii) η µικροένεση, iii) η ακτινοβόληση µε laser κ.ά. (Kim & Eberwine, 2010). 6.2.1. ιαµόλυνση µε φωσφορικό ασβέστιο Για την εισαγωγή του πλασµιδίου CMV-LMP1, σε HepG2 κύτταρα, χρησιµοποιήθηκε η διαµόλυνση µε φωσφορικό ασβέστιο, που περιγράφηκε αρχικά το 1973 από τους Graham & van der Eb (Graham & van der Eb, 1973). Σε αυτή την τεχνική, το DNA που θα εισαχθεί στα κύτταρα προστίθεται στο διάλυµα χλωριούχου ασβεστίου και στη συνέχεια αυτό αναµειγνύεται µε HBS (HEPES-buffered saline solution), ρυθµιστικό διάλυµα το οποίο περιέχει φωσφορικά ιόντα. Με την ανάµειξη σχηµατίζεται ένα λεπτό ίζηµα του θετικά φορτισµένου ασβεστίου και του αρνητικά φορτισµένου φωσφόρου, προσδένοντας στην επιφάνειά του το προς διαµόλυνση νουκλεϊκό οξύ, σχηµατίζοντας το σύµπλοκο DNA-Ca 3 (PO 4 ) 2, που συνδέεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Ο ακριβής µηχανισµός µε τον οποίο τα σύµπλοκα νουκλεϊκού οξέος και χηµικών διαπερνούν τη µεµβράνη δεν είναι γνωστός, αλλά πιστεύεται πως στη διαδικασία συµµετέχουν η ενδοκύτωση και η φαγοκύτωση, ώστε τελικά στο κύτταρο να εισαχθεί κάποια ποσότητα ξένου νουκλεϊκού οξέος. Χαρακτηριστικό της επιτυχίας της διαµόλυνσης είναι η αλλαγή του σχήµατος των κυττάρων (Graham & van der Eb, 1973). Τα πειράµατα παροδικής διαµόλυνσης µε φωσφορικό ασβέστιο πραγµατοποιήθηκαν σε πιάτα 6 οπών και συγκέκριµενα το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε είναι το εξής: - 50 -
1. Την 1 η ηµέρα ετοιµάζονται τα πιάτα, µε τοποθέτηση 2,5x10 5 κυττάρων/οπή και µεγαλώνουν για 24 ώρες. 2. Σχηµατίζεται το µείγµα όγκου 189µl που περιέχει: 8µl (µε 8µg) DNA, 18,9µl 2Μ CaCl 2 και 162,1µl φιλτραρισµένου ddh 2 O (DNA mix), το οποίο στη συνέχεια προστίθεται, σταγόνα-σταγόνα, σε ίσο όγκο παγωµένου διαλύµατος 2x HBS ph:7,1 (Πίνακας 1), υπό συνεχή ανάδευση. 3. Το µείγµα αφήνεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 12 λεπτά, προκειµένου να δηµιουργηθεί το σύµπλοκο DNA-Ca 3 (PO 4 ) 2. 4. Ακολούθως, το µείγµα προστίθεται σταγόνα-σταγόνα στα κύτταρα, µε ελικοειδή τρόπο, από το κέντρο προς την περιφέρεια της οπής. 5. Τα κύτταρα επωάζονται για 8 ώρες στους 37 ο C, οπότε και γίνεται αλλαγή του θρεπτικού µέσου µε νέο. 6. Τα κύτταρα επωάζονται για επιπλέον ~40 ώρες και ακολουθεί η συλλογή των κυτταρικών εκχυλισµάτων. Πίνακας 1: Σύσταση φωσφορικού διαλύµατος HBS (Hepes buffer saline). 2x HBS (Hepes buffer saline) 1lt NaCl 16,4gr Hepes acid 11,9gr Na 2 HPO 4 0,21gr ddh 2 O* 800ml ddh 2 O ως το 1lt *ρύθµιση στο ph:7,1 Αντίδραση β-γαλακτοσιδάσης Μετά τη συλλογή των κυτταρικών εκχυλισµάτων, ακολουθεί ο προσδιορισµός της δράσης του ενζύµου της β-γαλακτοσιδάσης στα εκχυλίσµατα. Το γονίδιο του ενζύµου συνήθως συνυπάρχει στα πλασµίδια που χρησιµοποιούνται σε τέτοιου είδους διαµολύνσεις και χρησιµεύει ως δείκτης επιτυχίας της διαδικασίας. Η µέτρηση στηρίζεται στη χρωµοφόρο αντίδραση, που χρησιµοποιεί ως υπόστρωµα το ONPG (O-nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside), το οποίο διασπάται από το ένζυµο της β-γαλακτοσιδάσης, δίνοντας ένα υποκίτρινο χρώµα στο µείγµα. Η ένταση του χρώµατος προσδιορίζει την ποσότητα του - 51 -
ενζύµου στο κυτταρικό εκχύλισµα (Edlund et al., 1985), εποµένως και την επιτυχία της διαµόλυνσης. Η ενζυµική αντίδραση πραγµατοποιείται σε όγκο 100µl και περιλαµβάνει 22µl ONPG (4mg/ml), 1µl Mg-buffer (1M KCl, 10mM MgCl 2, 5M β-mercaptoethanol), 57µl 0,1M Na-PO 3 (Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 ph:7,3), 10µl 0,25M Tris-Cl ph:7,8 και 10µl κυτταρικού εκχυλίσµατος. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 12 λεπτά και στη συνέχεια προστίθενται 40µl Na 2 CO 3 για να διακοπεί η αντίδραση. Τα 100µl µεταφέρονται σε πιάτο 96 οπών και γίνεται η µέτρηση σε φασµατοφωτόµετρο τύπου ELISA (Microplate Autoreader EL311, Bio-Tek instruments), σε µήκος κύµατος 405 nm. Ως τυφλό χρησιµοποιείται µείγµα στο οποίο προστίθενται 10 µl 0,25M Tris-Cl αντί των 10 µl του κυτταρικού εκχυλίσµατος. 6.2.2. Παράγοντας διαµόλυνσης siport NeoFX Ο παράγοντας διαµόλυνσης siport NeoFX (Ambion) είναι ένα αντιδραστήριο που βασίζεται στα λιπίδια και παρέχει υψηλά επίπεδα διαµόλυνσης, χωρίς να προκαλεί καταπόνηση στα κύτταρα, η οποία πιθανά θα οδηγήσει σε κυτταροτοξικότητα. Χρησιµοποιείται κυρίως για την εισαγωγή µικρών µορίων RNA (sirna, mirna) σε κύτταρα θηλαστικών, µέσω µιας διαδικασίας που αναφέρεται ως ανάστροφη διαµόλυνση. Αυτή περιλαµβάνει το στρώσιµο των πιάτων µε κύτταρα και την ταυτόχρονη διαµόλυνσή τους. Εν συντοµία, siport NeoFX και mirna αναµειγνύονται, επωάζονται για να σχηµατίσουν σύµπλοκο κι έπειτα προστίθενται στα κύτταρα. Μελέτη της λειτουργίας των micrornas Η λειτουργική ανάλυση των micrornas µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε τη χρήση πρωτοκόλλων παρόµοιων µε αυτά που χρησιµοποιούνται για άλλα γονίδια. Η υπερέκφραση των mirnas µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση µικρών πρόδροµων µορίων RNA, τα Pre-miR mirna Precursors (Applied Biosystems), τα οποία είναι διαθέσιµα στο εµπόριο για µεγάλη ποικιλία mirnas. Πρόκειται για µικρά δίκλωνα RNA τα οποία µιµούνται τα ενδογενή πρόδροµα µόρια των mirnas. Κάθε Pre-miR mirna Precursor είναι ένα δίκλωνο RNA, µε τον ένα κλώνο πανοµοιότυπο µε το αντίστοιχο ώριµο υπό - 52 -
µελέτη mirna, ενώ όλα τους είναι έτσι σχεδιασµένα και χηµικά τροποποιηµένα, ώστε να είναι σίγουρη η επιλογή του σωστού κλώνου, από κάθε Pre-miR mirna Precursor µόριο, από το µονοπάτι επεξεργασίας των mirnas. Με τα µόρια αυτά µπορεί να επιτευχθεί: α) ο έλεγχος της δραστηριότητας συγκεκριµένων mirnas, β) η ελαφρά ρύθµιση των κυτταρικών επιπέδων των mirnas και γ) η επίτευξη βέλτιστης διαµόλυνσης µε ελάχιστη κυτταροτοξικότητα. Αντίστοιχα, η υποέκφραση των mirnas, µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση χηµικά τροποποιηµένων ολιγονουκλεοτιδίων, τα οποία αναγνωρίστηκαν πρώτα από τον Krutzfeldt και συνεργάτες και ονοµάστηκαν antagomirs. Πρόκειται για µονόκλωνα RNAs συζευγµένα µε µόρια χοληστερόλης, τα οποία έχουν µήκος 21-23 νουκλεοτίδια και είναι συµπληρωµατικά µε αλληλουχίες ώριµων mirnas. Έτσι, αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια µπορούν να σχεδιαστούν για να προσδένονται εξειδικευµένα στο microrna-risc σύµπλοκο και να εµποδίζουν τη δράση του, καθώς είναι πολύ σταθερά in vivo και έχει βρεθεί πως αρκεί µόνο µία ενδοφλέβια ένεσή τους στα ποντίκια, για να αποσιωπήσουν micrornasστόχους στο ήπαρ, στους πνεύµονες, στο έντερο, στην καρδιά, στο δέρµα και στο µυελό των οστών, για περισσότερο από µία εβδοµάδα (Krutzfeld et al., 2005). Στο εµπόριο, είναι διαθέσιµα από την εταιρεία Applied Biosystems, µε την ονοµασία Anti-miR mirna Inhibitors και είναι χηµικά τροποποιηµένα, έτσι ώστε να έχουν αυξηµένη σταθερότητα και βελτιωµένη δράση. Το προϊόν Pre-miR mirna Precursor για το microrna mir-24 είναι διαθέσιµο µε το γενικό κωδικό ΡΜ17001 και Product ID: ΡM10737, ενώ το προϊόν Anti-miR mirna Inhibitor για το microrna mir-24 είναι διαθέσιµο µε το γενικό κωδικό ΑΜ17001 και Product ID: AM10737. Ανάστροφη διαµόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2 µε Pre-miR mirna Precursor/miR-24 και Anti-miR mirna Inhibitor/miR-24 µε τη χρήση του siport NeoFX Μετά από µια σειρά πειραµάτων, µε σκοπό την εύρεση της κατάλληλης συγκέντρωσης Pre-miR mirna Precursor/miR-24 και Anti-miR mirna Inhibitor/miR-24, καθώς και του κατάλληλου όγκου του παράγοντα - 53 -
διαµόλυνσης siport που θα έπρεπε να χρησιµοποιήσουµε για να έχουµε τα βέλτιστα αποτελέσµατα, καταλήξαµε στη συγκέντρωση των 50nM/οπή για τα µόρια Pre-miR-24 και Αnti-miR-24, στον όγκο των 2µl/οπή για τον παράγοντα siport, αλλά και στον αριθµό των 230.000 κυττάρων/οπή. O τελικός όγκος συµπλόκων και κυττάρων είναι 2,5ml/οπή. 1. Σε πιάτα 6 οπών, αναµειγνύονται 2µl siport µε 98µl DMEM θρεπτικό µέσο χωρίς ορό/οπή, τόσο στους µάρτυρες, όσο και σε αυτά τα οποία θα υποστούν διαµόλυνση και επωάζονται για 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. 2. Προσθήκη κατάλληλης ποσότητας Pre-miR-24 ή Αnti-miR-24 σε DMEM θρεπτικό µέσο χωρίς ορό, ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 50nM/οπή, για τις οπές στις οποίες θα συµβεί διαµόλυνση, αλλά και 100µl DMEM θρεπτικό µέσο χωρίς ορό/οπή, για τους µάρτυρες. Ελαφρά ανάµειξη. 3. Επώαση για 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. 4. Προσθήκη 2,3ml πλήρους θρεπτικού µέσου µε 230.000 κύτταρα/οπή και ελαφρά ανάµιξη. 5. Επώαση των κυττάρων σε κλίβανο CO 2 για 24 ώρες, οπότε και αντικαθίσταται το θρεπτικό µέσο µε φρέσκο. 6. Ακολουθεί αποµόνωση του RNA των κυττάρων ή συλλογή και λύση τους για την παρασκευή κυτταρικών εκχυλισµάτων, ανάλογα µε τις ανάγκες του πειράµατος. Επίσης, η επώαση είναι δυνατόν να συνεχιστεί για ακόµα ένα ή δύο 24ωρα, οπότε συλλέγονται RNA και κυτταρικά εκχυλίσµατα στις 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, προκειµένου να µελετηθούν τα επίπεδα των υπό µελέτη γονιδίων και πρωτεϊνών. 6.3. Aποµόνωση RNA 6.3.1. Κύτταρα Για την αποµόνωση του RNA από HepG2 κύτταρα ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο: 1. Αφαίρεση του παλιού θρεπτικού µέσου και πλύση των κυττάρων µε νέο, το οποίο δεν περιέχει εµβρυϊκό ορό µοσχαριού. - 54 -
2. Προσθήκη 500µl αντιδραστηρίου TRI Reagent (Ambion) (σύµφωνα µε τον κατασκευαστή, ο όγκος που θα χρησιµοποιηθεί εξαρτάται από τον αριθµό των κυττάρων καθώς και από την επιφάνεια της καλλιέργειας. Στην παρούσα εργασία, πρόκειται για 230.000 κύτταρα στην περίπτωση της διαµόλυνσης µε siport και 250.00 κύτταρα στην περίπτωση της διαµόλυνσης µε ασβέστιο-φωσφορικά, σε πιάτα 6 οπών. Το αντιδραστήριο TRI είναι ένα µείγµα φαινόλης και θειοκυανιούχου γουανιδινίου, που βοηθά στην άµεση προστασία του δείγµατος από τη δράση των RNασών και χρησιµοποιείται σε διαδικασίες διαχωρισµού. 3. Επώαση του οµογενοποιήµατος σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. 4. Φυγοκέντρηση στις 12.000g για 10 λεπτά στους 4 ο C. 5. Συλλογή του υπερκείµενου και προσθήκη 100µl χλωροφορµίου. 6. Ανάδευση σε χαµηλή ταχύτητα και επώαση του δείγµατος σε θερµοκρασία δωµατίου για 8 λεπτά. 7. Φυγοκέντρηση στις 12.000g για 15 λεπτά στους 4 ο C (σε αυτή τη φάση γίνεται διαχωρισµός του δείγµατος σε υδατική και οργανική φάση. Το RNA συγκεντρώνεται στην υδατική, το DNA στη µεσαία και οι πρωτεΐνες στην οργανική φάση). 8. Συλλογή της υπερκείµενης υδατικής φάσης, προσεκτικά ώστε να µην διαταραχθεί το ίζηµα και προσθήκη 250µl ισοπροπανόλης. 9. Ανάδευση σε χαµηλή ταχύτητα για 5-10 δευτερόλεπτα 10. Επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. 11. Σταδιακό πάγωµα του δείγµατος στους -80 ο C για ~1 ώρα (κατακρήµνιση του RNA από την υδατική φάση). 12. Φυγοκέντρηση στις 12.000g για 8 λεπτά στους 20 ο C. 13. Προσθήκη στο ίζηµα 500µl 75% αιθανόλης (διάλυµα απόλυτης αιθανόλης σε DEPC-H 2 O). 14. Ανάδευση του δείγµατος σε χαµηλή ταχύτητα, ώστε να αποκολληθεί το ίζηµα. 15. Φυγοκέντρηση στις 7.500g για 5 λεπτά στους 20 ο C (καθαρισµός του RNA). 16. Αφαίρεση του υπερκείµενου και στέγνωµα του ιζήµατος για ~15 λεπτά. - 55 -
17. Επαναδιάλυση του ιζήµατος σε 30-100µl DEPC-H 2 O, αναλόγως του µεγέθους του ιζήµατος και αποθήκευση στους -80 ο C για περαιτέρω χρήση. 6.3.2. Βιοψίες Στην περίπτωση των βιοψιών ηπατικών ιστών, προστίθεται απευθείας στον ιστό 1ml αντιδραστήριο TRI Reagent και όλο το περιεχόµενο µεταφέρεται σε αποστειρωµένο τριβλίο. Ακολουθεί τεµαχισµός του ιστού µε αποστειρωµένο νυστέρι και το µείγµα που προκύπτει µεταφέρεται σε σωληνάκι, ώστε να οµογενοποιηθεί µε τη βοήθεια ειδικών οµογενοποιητών (Eppendorf Micropestles, Eppendorf). Η διαδικασία για την αποµόνωση του RNA είναι η ίδια µε αυτή που περιγράφηκε προηγουµένως, µε την αλλαγή ότι επειδή χρησιµοποιείται διπλάσιος όγκος TRI Reagent, λόγω του µεγαλύτερου µεγέθους του ιστού, χρησιµοποιούνται διπλάσιοι όγκοι και στα υπόλοιπα αντιδραστήρια - χλωροφόρµιο, ισοπροπανόλη, αιθανόλη. 6.3.3. Έλεγχος του RNA Ακολουθεί ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισµός του RNA που προκύπτει. Η πιο κοινή µέθοδος που χρησιµοποιείται για την αξιολόγηση της ακεραιότητας του RNA, είναι η ηλεκτροφόρησή του σε πηκτή αγαρόζης πυκνότητας 1%. Ένα ακέραιο RNA θα πρέπει να έχει δύο ξεκάθαρες ζώνες που θα αντιπροσωπεύουν το 28S rrna και το 18S rrna, µε αναλογία της έντασης των δύο ζωνών 2:1. Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης αλλά και της καθαρότητας του RNA πραγµατοποιήθηκε µε µέτρηση της οπτικής απορρόφησης του δείγµατος στα 260nm και 280nm, µε τη χρήση του φωτοµέτρου Nanodrop (Nanodrop 2000/Thermoscientific). Το φωτόµετρο Nanodrop είναι σχεδιασµένο να υπολογίζει συγκεντρώσεις νουκλεϊκών οξέων, απαιτώντας όγκους δειγµάτων της τάξης του 1µl. Το δείγµα πιπετάρεται επάνω στην επιφάνεια ανίχνευσης, όπου βρίσκεται η οπτική ίνα «δέκτης» και µε το κλείσιµο της υποδοχής έρχεται σε επαφή µε το δείγµα µία δεύτερη οπτική ίνα, δηµιουργώντας έτσι ένα οπτικό µονοπάτι, στο οποίο θα γίνει η µέτρηση (Εικόνα 20). Με τον τρόπο αυτό, ο ερευνητής απαλλάσσεται από τη - 56 -
χρήση κυψελίδων και τη σπατάλη πολύτιµου δείγµατος. Η κάθε µέτρηση διαρκεί περίπου 10 δευτερόλεπτα και τα αποτελέσµατα απεικονίζονται σε έναν, συνδεδεµένο µε το φωτόµετρο, υπολογιστή. Εικόνα 20: Απεικόνιση µιας µέτρησης µε χρήση του φωτοµέτρου Nanodrop. 6.4. Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων 6.4.1. Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων για τη µέτρηση της ενζυµικής δραστικότητας (β-gal assay) 1. Πλύση των κυττάρων µε 1Χ PBS (Phosphate Buffer Saline) (Πίνακας 2). 2. Συλλογή των κυττάρων µε ξύστη (scraper) και αιώρησή τους σε 1ml 1X PBS. 3. Φυγοκέντρηση στις 5.000rpm για 2 λεπτά στους 4 ο C. 4. Αφαίρεση υπερκείµενου και επαναιώρηση ιζήµατος σε 100µl 0,25M Tris-HCL ph:7,8. 5. Ψύξη για 5 λεπτά στους -70 ο C και επώαση για 5 λεπτά στους 37 ο C (Χ3). 6. Φυγοκέντρηση στις 13.000rpm για 5 λεπτά στους 4 ο C. 7. Συλλογή του υπερκείµενου και φύλαξη στους -80 ο C. 6.4.2. Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων για την ανάλυση κατά Western 1. Πλύση των κυττάρων µε 1Χ PBS (Phosphate Buffer Saline). 2. Συλλογή των κυττάρων µε ξύστη (scraper) και αιώρησή τους σε 1ml 1X PBS. - 57 -
3. Φυγοκέντρηση στις 3.000rpm 5 λεπτά στους 4 ο C. 4. Αποµάκρυνση υπερκείµενου. 5. Αιώρηση του ιζήµατος σε 30-100µl διαλύµατος λύσης, αναλόγως του µεγέθους του ιζήµατος (Πίνακας 3). 6. Επώαση στους 37 ο C για 30 λεπτά. 7. Φυγοκέντρηση στις 12.000rpm για 10 λεπτά στους 4 ο C. 8. Συλλογή του υπερκείµενου και αποθήκευση στους -80 ο C. Πίνακας 2: Παρασκευή διαλύµατος PBS 1X. PBS (Phosphate buffered saline) 1X NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 ddh 2 O* ddh 2 O *ρύθµιση στο ph:7,4 1lt 8gr 0,2gr 1,44gr 0,24gr 800ml ως το 1lt Πίνακας 3: ιάλυµα λύσης για την παρασκευή κυτταρικών εκχυλισµάτων. ιάλυµα λύσης (Lysis buffer) 50mM imidazole ph:7,4 250mM NaCl 2mM EGTA 1mM EDTA 5mM DTT (dithiothreitol) 50µM leupeptine 0,25% Brij-97 6.5. Ποσοτικός προσδιορισµός συγκέντρωσης πρωτεϊνών Ο ποσοτικός προσδιορισµός της ολικής πρωτεΐνης των δειγµάτων γίνεται µε τη µέθοδο Bradford, η οποία χρησιµοποιείται στην ανίχνευση πρωτεϊνών της τάξης των µg. Η BIO-RAD Protein Assay είναι µια µέθοδος σύνδεσης χρωστικής, η οποία στηρίζεται στην αλλαγή του χρώµατος της χρωστικής, ως απόκριση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης. Πιο αναλυτικά, στηρίζεται στην παρατήρηση ότι η µέγιστη απορρόφηση για ένα όξινο διάλυµα του Coomassie - 58 -
Brilliant Blue G-250 αλλάζει από τα 465 nm στα 595 nm, όταν πραγµατοποιείται σύνδεση µε πρωτεΐνες. Ο Bradford παρατήρησε πρώτος τη χρησιµότητα αυτής της αρχής στη µελέτη των πρωτεϊνών (Bradford, 1976). Ο Spector παρατήρησε ότι η εξαφάνιση του συντελεστή του συµπλόκου χρωστικής-αλβουµίνης ήταν σταθερή σε ένα εύρος συγκέντρωσης δέκα επιπέδων (Spector, 1978). Έτσι, ο νόµος του Beer είναι δυνατόν να εφαρµοστεί για ακριβή ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης, µε την επιλογή µιας κατάλληλης αναλογίας όγκου της χρωστικής και συγκέντρωσης του δείγµατος. Για ένα µεγάλο εύρος συγκεντρώσεων πρωτεϊνών, η µέθοδος σύνδεσης της χρωστικής παρέχει ακριβή, αλλά όχι πλήρως γραµµική απόκριση. Για την κατασκευή πρότυπης καµπύλης, υπάρχει διαθέσιµη λυοφιλιωµένη αλβουµίνη πλάσµατος µοσχαριού (Bovine Serum Albumin, BSA). Εναλλακτικά, κάθε καθαρή πρωτεΐνη θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί σαν πρότυπο, αρκεί να είναι επιθυµητές οι σχετικές τιµές της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης. Το αντιδραστήριο της χρωστικής είναι πέντε φορές συγκεντρωµένο. Έτσι, προκειµένου να χρησιµοποιηθεί, είναι απαραίτητο να αραιωθεί µε απιονισµένο νερό. 6.5.1. Κατασκευή Πρότυπης Καµπύλης Για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης, χρησιµοποιείται ως πρότυπο διάλυµα η αλβουµίνη πλάσµατος µοσχαριού (BSA) συγκέντρωσης 0,2mg/ml (Πίνακας 4). Πίνακας 4: Κατασκευή πρότυπης καµπύλης. α/α δοκιµαστικού σωλήνα Ποσότητα BSA V BSA (0,2 mg/ml) V colour reagent 1 1µg 5µl 995µl 2 2µg 10µl 990µl 3 3µg 15µl 985µl 4 5µg 25µl 975µl 5 10µg 50µl 950µl 6 15µg 75µl 925µl - 59 -
6.5.2. Προετοιµασία ειγµάτων 1. Αραίωση των δειγµάτων δύο φορές (1:1) µε απιονισµένο νερό, έτσι ώστε οι τιµές να βρίσκονται µέσα στα όρια της πρότυπης καµπύλης. 2. Για κάθε δείγµα χρησιµοποιούνται 998µl χρωστικής και 2µl από το αραιωµένο δείγµα. Ως τυφλό, στη φωτοµέτρηση, χρησιµοποιείται σκέτη χρωστική (1000µl), δίχως δείγµα πρωτεΐνης. 3. Ακολουθεί vortex των δειγµάτων. 4. Επώαση για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. 5. Φωτοµέτρηση στα 595 nm. 6. Οι τιµές της οπτικής πυκνότητας καταχωρούνται σε ειδικό πρόγραµµα, το οποίο παρέχει τις τιµές της ποσότητας της ολικής πρωτεΐνης σε µg. 6.6. Ανάλυση κατά Western Ηλεκτροφόρηση είναι η διαδικασία κατά την οποία φορτισµένα µόρια µετακινούνται και διαχωρίζονται µέσω ενός πορώδους υλικού, όπως η πηκτή πολυακρυλαµίδης ή αγαρόζης, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, µε βάση το φορτίο τους, το σχήµα ή το µέγεθός τους. Είναι µια πολύ απλή και σχετικά γρήγορη µέθοδος, η οποία χρησιµοποιείται για την ανάλυση και τον καθαρισµό µεγάλων µορίων, όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα, αλλά και απλούστερων µορίων, όπως σάκχαρα, αµινοξέα, πεπτίδια και νουκλεοτίδια. Οι πηκτές είναι διαφόρων µεγεθών, ανάλογα µε τα δείγµατα, ενώ η ηλεκτροφόρηση µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε οριζόντια ή σε κατακόρυφη θέση. Στο τέλος του διαχωρισµού, τα διαφορετικά είδη µορίων ανιχνεύονται µε ποικίλους τρόπους, ως ζώνες σε συγκεκριµένες θέσεις πάνω στην πηκτή. Στην ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαµίδης, τα µόρια µετακινούνται µε βάση το µοριακό τους βάρος. Αυτό επιτυγχάνεται χάρη στο SDS (Sodium Dodecylsulfate), ένα ανιονικό απορρυπαντικό, το οποίο προσδίδει σε όλες τις πρωτεΐνες αρνητικό φορτίο και έτσι τις διατηρεί σε ευθύγραµµη διαµόρφωση. Υπάρχουν δύο είδη ηλεκτροφόρησης: 1) η συνεχής, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε ένα µόνο είδος πηκτής, την πηκτή διαχωρισµού (separating - 60 -
gel) και 2) η ασυνεχής, στην οποία στο κάτω µέρος της συσκευής υπάρχει η πηκτή διαχωρισµού (separating gel) και στο επάνω µέρος υπάρχει η πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel). Η πηκτή επιστοίβαξης έχει µικρότερη πυκνότητα, άρα και µεγαλύτερους πόρους, έτσι ώστε όλα τα δείγµατα να κινούνται µαζί και να τοποθετούνται κατά µήκος µιας λεπτής ζώνης, έως ότου φθάσουν στα όρια µε την πηκτή διαχωρισµού. Από εκεί, τα δείγµατα ξεκινούν να διαχωρίζονται ταυτόχρονα, µε βάση το µοριακό τους βάρος. Παράλληλα µε τα άγνωστα δείγµατα, χρησιµοποιούντα και µείγµατα πρωτεϊνών διαφόρων µοριακών βαρών ως µάρτυρες (markers). Σήµερα, υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα για ασυνεχή ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, αυτό που όµως έχει επικρατήσει είναι του Laemmli (Laemmli, 1970). 6.6.1. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS-PAGE) 6.6.1.1. Προετοιµασία πηκτής 1. Συναρµολόγηση της συσκευής προετοιµασίας της πηκτής. 2. Προσθήκη του διαλύµατος της πηκτής διαχωρισµού αργά (Πίνακας 5), ώστε να αποφευχθεί η δηµιουργία φυσαλίδων. 3. Στη συνέχεια, η επιφάνεια της πηκτής διαχωρισµού καλύπτεται µε µια λεπτή στοιβάδα δις απεσταγµένου νερού, ώστε να αποµακρυνθούν τυχόν φυσαλίδες που δηµιουργήθηκαν. 4. Πολυµερισµός της πηκτής διαχωρισµού για περίπου 40 λεπτά. 5. Ακολουθεί αποµάκρυνση του νερού από την επιφάνεια της πηκτής και µε τη χρήση διηθητικού χαρτιού αποµακρύνονται και οι τελευταίες σταγόνες. 6. Τοποθέτηση των χτενών και προσθήκη του διαλύµατος της πηκτής επιστοίβαξης (Πίνακας 6). 7. Πολυµερισµός της πηκτής επιστοίβαξης για περίπου 30 λεπτά. 8. Αφαίρεση της έτοιµης πηκτής από τη βάση προετοιµασίας και τοποθέτησή της στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 9. Προσθήκη του ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης (running buffer) (Πίνακας 7). - 61 -
10. Αποµάκρυνση της χτένας. Ξέπλυµα των πηγαδιών µε το διάλυµα ηλεκτροφόρησης. Στο στάδιο αυτό, η πηκτή είναι έτοιµη για τη φόρτωση των δειγµάτων. 6.6.1.2. Προετοιµασία δειγµάτων 1. Υπολογισµός του όγκου του δείγµατος, σε µl, στον οποίο περιέχονται 25µg πρωτεΐνης και συµπλήρωση µε χρωστική φόρτωσης (loading buffer) 5x Laemnli (Πίνακας 8) των δειγµάτων µέχρι τα 20 µl. 2. Βρασµός των δειγµάτων για 5 λεπτά, ώστε να αποδιαταχθούν οι πρωτεΐνες. 3. Στη συνέχεια, φυγοκέντρησή τους για µερικά δευτερόλεπτα, ώστε να συγκεντρωθούν τα δείγµατα. 4. Τέλος, ακολουθεί η φόρτωση των δειγµάτων στην πηκτή πολυακρυλαµίδης µε Hamilton πιπέτα. 6.6.1.3. Ηλεκτροφόρηση Αφού συνδεθεί η συσκευή µε το τροφοδοτικό, ρυθµίζεται η τάση του ρεύµατος στα 50V, όσο τα δείγµατα βρίσκονται στην πηκτή επιστοίβαξης, αλλά αυξάνεται στα 150V, µόλις περάσουν στην πηκτή διαχωρισµού. Τα δείγµατα αφήνονται να διαχωριστούν, µέχρι η χρωστική να φθάσει στο κάτω µέρος της πηκτής. 6.6.2. Μεταφορά σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, στην οποία αποτυπώνονται όπως ακριβώς διαχωρίστηκαν και στην πηκτή. Στη συνέχεια, γίνεται ανοσοανίχνευση των επιθυµητών πρωτεϊνών µε ανάλυση κατά Western. 1. Για κάθε πηκτή ετοιµάζονται δύο σφουγγαράκια, δύο χαρτιά Whatmann και η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, κοµµένα στο µέγεθος της πηκτής και - 62 -
βυθίζονται σε διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς (transfer buffer) (Πίνακας 9) για 15 λεπτά, για εξισορρόπηση. 2. Το πέρας της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί η αποµάκρυνση της πηκτής από τη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 3. Σε µια λεκάνη µε αρκετό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς, τοποθετείται η ειδική θήκη-υποδοχής της πηκτής µε την άνοδο προς τα κάτω. Ακολουθεί η τοποθέτηση ενός σφουγγαριού, ενός χαρτιού Whatmann, η πηκτή, η µεµβράνη, ακόµη ένα χαρτί Whatmann και τέλος, ένα ακόµα σφουγγαράκι. 4. Αποµάκρυνση των φυσαλίδων µε τη χρήση πιπέτας Pasteur. 5. Κλείδωµα της θήκης-υποδοχής και τοποθέτησή της στη συσκευή ηλεκτροµεταφοράς, µε τη µαύρη πλευρά προς τον αντίστοιχο πόλο. 6. Τοποθέτηση παγοκύστης και ρύθµιση του τροφοδοτικού στα 350mA, για περίπου µια ώρα. 7. Με το πέρας της ηλεκτροµεταφοράς, η µεµβράνη στεγνώνεται σε διηθητικό χαρτί, τοποθετείται σε διαφανή ζελατίνα και αποθηκεύεται στους 4 C. 6.6.3. Ανοσοανίχνευση Οι πρωτεΐνες που έχουν µεταφερθεί στη µεµβράνη ανιχνεύονται µε τη χρήση ειδικών αντισωµάτων, τα οποία προσδένονται στη ζώνη που σχηµατίζει η πρωτεΐνη. Η ανίχνευση πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια ενός δεύτερου αντισώµατος, το οποίο πέραν του ότι στοχεύει το πρώτο και προσδένεται σε αυτό, είναι συζευγµένο και µε ένα ένζυµο, στην παρούσα εργασία την υπεροξειδάση, που καταλύει τη φωτογόνο αντίδραση οξείδωσης της λουµινόλης. Συγκεκριµένα, το αντιδραστήριο ECL είναι µείγµα Η 2 Ο 2 και λουµινόλης, οπότε καθώς η υπεροξειδάση του δεύτερου αντισώµατος διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου απελευθερώνονται ρίζες Ο 2, οι οποίες αντιδρούν µε τη λουµινόλη και απελευθερώνουν φωτόνια, που προσβάλλουν το φωτογραφικό φιλµ. Αυτή η µέθοδος ανίχνευσης των πρωτεϊνών στηρίζεται στην ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια (Enhanced Chemiluminescence, ECL). - 63 -
1. Επώαση για µια ώρα, µε ανάδευση, σε διάλυµα Blocking solution (Πίνακας 10), σε θερµοκρασία δωµατίου, για να καλυφθούν οι κενές θέσεις επάνω στη µεµβράνη. 2. Επώαση για µια ώρα, µε ανάδευση, στο πρώτο αντίσωµα, σε θερµοκρασία δωµατίου. Η αραίωση του αντισώµατος γίνεται µε Blocking solution. 3. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, από 10 λεπτά η καθεµιά, σε PBS/Tween- 20, 0,1%. 4. Επώαση για µια ώρα, µε ανάδευση, στο δεύτερο αντίσωµα, σε θερµοκρασία δωµατίου. Η αραίωση του αντισώµατος γίνεται µε Blocking solution. 5. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, από 10 λεπτά η καθεµιά, σε PBS/Tween- 20, 0,1%. 6. Ακολουθεί µια πλύση, για 10 λεπτά, µε PBS, υπό συνεχή ανάδευση. 7. Τοποθέτηση της µεµβράνης σε ζελατίνα και προσθήκη 1ml του διαλύµατος ECL plus (Amersham). Προσοχή, η πλευρά της µεµβράνης που είναι σε επαφή µε την πηκτή να είναι από πάνω. 8. Επώαση για 5 λεπτά. 9. Αποµάκρυνση της περίσσειας του διαλύµατος ECL plus. 10. Τοποθέτηση της µεµβράνης ανάµεσα σε ζελατίνες. 11. Τοποθέτηση φιλµ (Kodak) και έκθεση για κατάλληλο χρόνο (apoc-iii: 15 λεπτά, HNF-4α: 5 λεπτά, β-actin και p65: 3 λεπτά). 12. Τέλος, τοποθέτηση στα ακόλουθα διαλύµατα µε την αναγραφόµενη σειρά: i. Developer (Kodak), µέχρι να εµφανιστούν οι επιθυµητές ζώνες. ii. Νερό βρύσης. iii. Fixer (Kodak). iv. Νερό βρύσης Τα αντισώµατα και οι αντίστοιχες αραιώσεις τους, που χρησιµοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας, ανάλογα µε την προς ανίχνευση πρωτεΐνη, ήταν τα ακόλουθα: - 64 -
Α) 1:1000 goat anti-human HNF-4α (Santa cruz). Β) 1:500 goat anti-human apoc-iii (Abcam). Γ) 1:10000 anti-goat IgG αντίσωµα (Santa cruz), συζευγµένο µε υπεροξειδάση. ) 1:200 rabbit anti-p65 (Santa cruz). Ε) 1:2000 mouse anti-β-actin (Santa cruz). Στ) 1:3000 anti-rabbit IgG αντίσωµα (Santa cruz), συζευγµένο µε υπεροξειδάση. Ζ) 1:1000 anti-mouse IgG αντίσωµα (Santa cruz), συζευγµένο µε υπεροξειδάση. Πίνακας 5: Παρασκευή πηκτής διαχωρισµού µε συγκέντρωση ακρυλαµίδης 10%, όπως χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Πηκτή διαχωρισµού (10%) 10 ml ddh 2 O 4,15ml 1,5M Tris-HCl ph:8,8 2,5ml 10% SDS 0,1ml 30% ακρυλαµίδη 3,3ml 10% APS 50µl TEMED 5µl Πίνακας 6: Παρασκευή πηκτής επιστοίβαξης. Πηκτή επιστοίβαξης (4%) 10ml ddh 2 O 6,1ml 0,5M Tris-HCl ph:6,8 2,5ml 10% SDS (w/v) 100µl 30% ακρυλαµίδη 1,33ml 10% APS 50µl TEMED 10µl Πίνακας 7: Παρασκευή διαλύµατος ηλεκτροφόρησης. 5x ιάλυµα Ηλεκτροφόρησης (Running buffer) Tris-base Γλυκίνη SDS ddh 2 O 600ml 9gr 43,2gr 3gr ως τα 600ml - 65 -
Πίνακας 8: Παρασκευή χρωστικής φόρτωσης δειγµάτων. Xρωστική φόρτωσης δειγµάτων (Reducing Loading Buffer) 8ml ddh 2 O 3,8ml 0,5M Tris-HCl ph:6,8 1ml Γλυκερόλη 0,8ml 10% SDS (w/v) 1,6ml 2-µερκαπτοαιθανόλη 0,4ml 1% (w/v) µπλε της βρωµοφαινόλης 0,4ml Πίνακας 9: Παρασκευή διαλύµατος ηλεκτροµεταφοράς 1x. ιάλυµα ηλεκτροµεταφοράς 1x (Transfer buffer 1x) Tris-base Γλυκίνη Μεθανόλη ddh 2 O 1lt 3,03gr 14,4gr 200ml ως το 1lt Πίνακας 10: Παρασκευή blocking solution. Blocking solution 100ml Tween-20 0,1ml Γάλα 5gr BSA fraction V (χωρίς λιπαρά) 0,5gr PBS ως τα 100ml 6.7. Σύνθεση cdna Αφού ελεγχθεί η ποιότητα και µετρηθεί η ποσότητα του RNA που αποµονώθηκε από τα κύτταρα, αυτό θα πρέπει να µετατραπεί σε cdna, ώστε να χρησιµοποιηθεί για την µελέτη των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που µας ενδιαφέρουν. Αυτό επιτυγχάνεται µε την αντίδραση της ανάστροφης µεταγραφής, οπότε µε εκµαγείο RNA συντίθεται το cdna. Οι τρεις βασικές µέθοδοι προσέγγισης διαφέρουν ως προς το είδος του εκκινητή που χρησιµοποιούν. Έτσι, υπάρχει η µέθοδος που χρησιµοποιεί oligo-dt εκκινητή, ο οποίος αποτελείται από πολλές συνεχόµενες βάσεις θυµίνης (T). Αυτό σηµαίνει πως είναι συµπληρωµατικός για την πολυ-α ουρά που υπάρχει στο τέλος κάθε µορίου mrna, οπότε εντοπίζει όλα τα γονίδια του κυττάρου που εκφράζονταν τη στιγµή της αποµόνωσης του RNA. - 66 -
εύτερον, υπάρχει η µέθοδος που χρησιµοποιεί ως εκκινητές τυχαία εξαµερή (random hexamers), δηλαδή εξανουκλεοτίδια τυχαίας αλληλουχίας. Οι συνδυασµοί αυτών των εξαµερών είναι τόσο πολλοί, που είναι ουσιαστικά απίθανο να υπάρξει στο κύτταρο κάποιο µόριο RNA το οποίο δε θα εµφανίσει συµπληρωµατικότητα, για ένα έστω από αυτά. Εποµένως, η µέθοδος αυτή εντοπίζει και οποιοδήποτε άλλο µόριο RNA αποµονωθεί από το κύτταρο, πέραν των mrnas. Τέλος, υπάρχει και η µέθοδος που χρησιµοποιεί εκκινητή για συγκεκριµένο γονίδιο, οπότε εδώ εντοπίζεται µόνο το γονίδιο που θα µελετηθεί, ανάµεσα στο ολικό RNA που αποµονώθηκε από το κύτταρο. Το πρώτο στάδιο της πειραµατικής διαδικασίας είναι κοινό για όλες τις µεθόδους και περιλαµβάνει την κανονικοποίηση της ποσότητας RNA για κάθε δείγµα. Πιο συγκεκριµένα, από την οπτική πυκνότητα υπολογίζεται η συγκέντρωση RNA κάθε δείγµατος και στη συνέχεια λαµβάνεται κατάλληλος όγκος ώστε να χρησιµοποιείται η ίδια ποσότητα RNA σε κάθε ένα από τα δείγµατα του πειράµατος. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα οι όποιες διαφορές παρατηρούνται στα επίπεδα έκφρασης των δειγµάτων να οφείλονται καθαρά σε διαφορές της έκφρασης των γονιδίων και όχι σε πειραµατικά σφάλµατα, όπως για παράδειγµα το να έχει φορτωθεί περισσότερο RNA στο δείγµα που δείχνει υψηλότερη έκφραση. Στην παρούσα εργασία, οι δύο πρώτες µέθοδοι εφαρµόστηκαν στην πράξη µε τη βοήθεια του RevertAid kit της Fermentas (#Κ1652), οπότε προέκυπτε ολικό cdna για προσδιορισµό οποιουδήποτε γονιδίου. Αντίθετα, για την τρίτη χρησιµοποιήθηκε το TaqMan microrna Reverse Transcription kit της Applied Biosystems (4366596), σε συνδυασµό µε τον ειδικό, για κάθε γονίδιο, εκκινητή. Κάθε τέτοιος εκκινητής παρέχονταν από την Applied Biosystems µε το αντίστοιχο ζεύγος των ειδικών, για το ίδιο γονίδιο, PCR εκκινητών. Οι αλληλουχίες όλων των εκκινητών ήταν άγνωστες, αφού είναι πατέντα της Applied Biosystems, αλλά στον Πίνακα 11 δίνονται οι κωδικοί τους. Αυτό που είναι γνωστό για τον εκκινητή της ανάστροφης µεταγραφής είναι το ότι έχει µορφή βρόχου, ο οποίος λόγω της υψηλής θερµοκρασίας που αναπτύσσεται κατά την σύνθεση του cdna ανοίγει και έτσι δηµιουργούνται επιπλέον βάσεις στο cdna, ώστε να είναι δυνατός ο υβριδισµός των PCR εκκινητών, στο επόµενο στάδιο (Εικόνα 21). Στη συγκεκριµένη εργασία, η µέθοδος αυτή χρησιµοποιήθηκε για τα mir-24, mir-122 και U6. Τέλος, - 67 -
αξιοσηµείωτη είναι η ευαισθησία της µεθόδου αυτής, αφού οι οδηγίες των αντιδραστηρίων επιτρέπουν τη χρήση µόλις 10ng RNA, σε όγκο ίσο µε 3µl, ανά αντίδραση. Πίνακας 11: Οι κωδικοί των εκκινητών κάθε γονιδίου. Γονίδιο Κωδικός mir-24 4427975 (assay ID 000402) mir-122 4427975 (assay ID 000445) U6 4427975 (assay ID 001093) Εικόνα 21: Η µορφή και η δράση του εκκινητή της ανάστροφης µεταγραφής (εκκινητής µε βρόχο). 6.7.1. Μέθοδος oligo-dt Αφού τα δείγµατα κανονικοποιηθούν, ώστε να περιέχουν ίδια ποσότητα RNA, δηµιουργείται το µείγµα αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 12 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 13. - 68 -
Πίνακας 12: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Αντιδραστήριο Όγκος RNA µl* 5x Reaction Buffer 4,0µl oligo-dt εκκινητής (0,5µg/µl) 1,0µl dntps (10mM) 2,0µl RiboLock RNase Inhibitor (40U/µl) 0,5µl RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200U/µl) 1,0µl Nuclease-free Η 2 Ο ως τα 20µl Τελικός όγκος 20µl *προκύπτει από την κανονικοποίηση Πίνακας 13: Οι συνθήκες αντίδρασης. Σύνθεση cdna Απενεργοποίηση ενζύµου 42 C - 60 min 70 C - 10 min 6.7.2. Μέθοδος τυχαίων εξαµερών Μετά την κανονικοποίηση, κάθε δείγµα φέρει την ίδια ποσότητα RNA µε οποιοδήποτε άλλο. Ακολουθεί η δηµιουργία του µείγµατος αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 14 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 15. Πίνακας 14: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Αντιδραστήριο Όγκος RNA µl* 5x Reaction Buffer 4,0µl random hexamer εκκινητής (0,2 µg/µl) 1,0µl dntps (10mM) 2,0µl RiboLock RNase Inhibitor (40U/µl) 0,5µl RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200U/µl) 1,0µl Nuclease-free Η 2 Ο ως τα 20µl Τελικός όγκος 20µl *προκύπτει από την κανονικοποίηση - 69 -
Πίνακας 15: Οι συνθήκες αντίδρασης. Αρχική επώαση 25 C - 10 min Σύνθεση cdna 42 C - 60 min Απενεργοποίηση ενζύµου 70 C - 10 min 6.7.3. Μέθοδος ειδικού εκκινητή Έχοντας ρυθµιστεί κάθε δείγµα να περιέχει 10ng RNA σε 3µl, αυτή η ποσότητα χρησιµοποιείται στη δηµιουργία του µείγµατος αντίδρασης του Πίνακα 16. Ακολουθεί επώαση στον πάγο για 5 λεπτά και στη συνέχεια εφαρµόζεται το πρωτόκολλο του Πίνακα 17. Πίνακας 16: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Αντιδραστήριο Όγκος RNA 3,0µl Nuclease-free Η 2 Ο 2,95µl RT εκκινητής 2,0µl 10x Reverse Transcription Buffer 1,1µl dntps (100mM) 0,11µl RNase Inhibitor (20U/µl) 0,14µl MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/µl) 0,7µl Τελικός όγκος 10µl Πίνακας 17: Οι συνθήκες αντίδρασης. Υβριδισµός εκκινητών Σύνθεση cdna Απενεργοποίηση ενζύµου 16 C - 30 min 42 C - 30 min 85 C - 5 min Τέλος, στη διεξαγωγή κάθε πειράµατος, περιλαµβάνεται και ένας µάρτυρας ελέγχου (τυφλό), που αποτελείται από όλα τα υλικά του µείγµατος αντίδρασης, εκτός από το RNA, προκειµένου να διαπιστωθεί τυχόν επιµόλυνση κάποιου από αυτά. Ο ρόλος του είναι αρκετά σηµαντικός, µιας και δεν είναι καθόλου σπάνιες οι επιµολύνσεις στο χώρο ενός εργαστηρίου. - 70 -
6.8. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Απ όλες τις τεχνικές που υπάρχουν για την ανάλυση του DNA, καµιά δεν είχε τέτοιον αντίκτυπο και τόσες δυνατότητες όσο µια µέθοδος που αναπτύχθηκε το 1985, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR) (Saiki et al., 1985). Η ικανότητα της PCR να πολλαπλασιάζει επιλεκτικά ένα µόριο DNA κατά µερικά εκατοµµύρια φορές µέσα σε λίγες ώρες έχει φέρει επανάσταση στη µοριακή διάγνωση και στην ανάλυση των γενετικών νοσηµάτων. Επιτρέπει την ανίχνευση και την ανάλυση συγκεκριµένων γονιδιακών αλληλουχιών σε ένα δείγµα ασθενούς. Αναλύσεις µπορούν να γίνουν ακόµα και µε ένα κύτταρο από τη ρίζα µιας τρίχας, µε τα λίγα κύτταρα που υπάρχουν στο στοµατικό επίχρισµα, ή σε µια αποξηραµένη σταγόνα αίµατος, µε αποτέλεσµα να µην υπάρχει πια ανάγκη εξαγωγής µεγάλων ποσοτήτων DNA από δείγµατα ιστών. Οι µέθοδοι που βασίζονται στην τεχνική της PCR αναπτύσσονται ταχύτατα εξαιτίας της ευκολίας της λήψης δειγµάτων, της ελάχιστης απαίτησης σε ποσότητες ιστού και της εφαρµογής τους σε µεγάλο εύρος αναλύσεων. Επίσης, η τεχνική της PCR επιτρέπει τη χρησιµοποίηση ιστών που δεν έχουν διατηρηθεί σε καλή κατάσταση. Τέλος, σε σύγκριση µε τις παραδοσιακές µεθόδους, η ανάλυση µε την PCR είναι πολύ πιο γρήγορη. Η PCR είναι ταχύτερη, οικονοµικότερη, περισσότερο ευαίσθητη και λιγότερο απαιτητική σε δείγµατα ασθενών από οποιαδήποτε άλλη µέθοδο ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Απαραίτητη είναι η µελέτη της αλληλουχίας, ώστε να σχεδιαστούν κατάλληλοι εκκινητές, οι οποίοι θα προσδένονται αποτελεσµατικά στο εκµαγείο και θα δίνουν ένα σωστό και µοναδικό προϊόν. Επίσης, το µέγεθος της εξεταζόµενης αλληλουχίας δε µπορεί να υπερβαίνει συνήθως τις λίγες χιλιάδες βάσεις (αν και το πρόβληµα αυτό τείνει να αντιµετωπιστεί). Τέλος, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να αποδίδεται στην προστασία του εξεταζόµενου DNA από την «επιµόλυνσή» του µε ξένο DNA. Η όλη διαδικασία περιλαµβάνει µια σειρά επαναλαµβανόµενων κύκλων (Εικόνα 22): - Θερµικής αποδιάταξης (Denaturation) του δίκλωνου DNA-εκµαγείου. - 71 -
- Υβριδισµού (Annealing) των κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών στις συµπληρωµατικές ακολουθίες του DNA-εκµαγείου. - Σύνθεσης - Επιµήκυνσης (Extension) των συµπληρωµατικών ακολουθιών. Εικόνα 22: Τα στάδια της PCR. Αρχικά, στο πρώτο στάδιο κάθε κύκλου πραγµατοποιείται αποδιάταξη του δίκλωνου µορίου DNA µε θέρµανση σε υψηλή θερµοκρασία (94-95 ο C), µε αποτέλεσµα τη διάσπαση των δεσµών υδρογόνου µεταξύ των συµπληρωµατικών βάσεων της δίκλωνης έλικας και την παραγωγή µονόκλωνων αλυσίδων που θα χρησιµεύσουν ως εκµαγεία για τη σύνθεση νέων µορίων DNA. Κατά το δεύτερο στάδιο, κατάλληλοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές υβριδίζονται µε τις συµπληρωµατικές προς αυτούς αλληλουχίες που βρίσκονται στα δύο άκρα του προς ενίσχυση τµήµατος του DNA. Η θερµοκρασία του σταδίου αυτού (45-65 ο C) εξαρτάται από την αλληλουχία των χρησιµοποιούµενων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Στο τρίτο στάδιο, το οποίο πραγµατοποιείται σε θερµοκρασία 72 ο C, η θερµοανθεκτική Taq DNA πολυµεράση οδηγεί τη σύνθεση της - 72 -
συµπληρωµατικής αλυσίδας DNA, χρησιµοποιώντας τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps). Το σύνολο των τριών παραπάνω σταδίων αποτελεί ένα κύκλο της αντίδρασης PCR. Στο τέλος του κύκλου από µια δίκλωνη µητρική έλικα DNA δηµιουργούνται δύο θυγατρικές δίκλωνες έλικες DNA, στον αµέσως επόµενο κύκλο οι δίκλωνες έλικες γίνονται τέσσερις κ.ο.κ.. Ο πολλαπλασιασµός της συγκεκριµένης περιοχής DNA είναι, δηλαδή, εκθετικός. Συνήθως ο πολλαπλασιασµός συνεχίζεται για 25-40 κύκλους. Το τελικό αποτέλεσµα της PCR µετά από n κύκλους είναι η παραγωγή 2 n δίκλωνων µορίων DNA, πιστών αντιγράφων της ακολουθίας που περικλείεται µεταξύ των εκκινητών. Έτσι, αν υποθέσουµε ότι η απόδοση του συστήµατος είναι 100% για κάθε κύκλο µετά από 30 κύκλους έχουµε την παραγωγή 2 30 (1.073.741.824) αντιγράφων DNA στόχου. Ο άριστος αριθµός κύκλων εξαρτάται από την αρχική συγκέντρωση του DNA στόχου και την απόδοση της PCR σε κάθε κύκλο. Μεγαλύτερος αριθµός κύκλων από τον ιδανικό οδηγεί σε παραγωγή µη ειδικών προϊόντων, ενώ µικρότερος αριθµός κύκλων συνεπάγεται την αχνή ενίσχυση και συνεπώς ανίχνευση του DNA στόχου. Έτσι, όταν ο αρχικός αριθµός των µορίων στόχου είναι 10 5 απαιτούνται 30 κύκλοι, όταν είναι 10 4 απαιτούνται 35 κύκλοι ενώ όταν είναι 10 3 ή µικρότερος απαιτούνται περισσότεροι από 40 κύκλοι. Στο τέλος των επαναλαµβανόµενων κύκλων, αποδιάταξης - υβριδισµού - επιµήκυνσης, ακολουθεί ένα χρονικό διάστηµα 5-7 λεπτών σε θερµοκρασία 72 ο C, στο οποίο η Taq DNA πολυµεράση ολοκληρώνει τη σύνθεση των θυγατρικών αλυσίδων που ενδεχοµένως έµειναν ηµιτελείς. Οι εναλλαγές της θερµοκρασίας επιτυγχάνονται µε τη χρήση ειδικών αυτοµατοποιηµένων συσκευών, των θερµοκυκλοποιητών και είναι ταχύτατες, ώστε αυξοµειώσεις της τάξεως των 40 ο C λαµβάνουν χώρα σε λιγότερο από ένα λεπτό. Για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης απαιτούνται: Νερό Κατάλληλη ποσότητα δις-απεσταγµένου και απιονισµένου νερού. Taq πολυµεράση Η ανακάλυψη της θερµοανθεκτικής Taq πολυµεράσης επέτρεψε την αυτοµατοποίηση της PCR µε τη χρήση των θερµικών κυκλοποιητών. Η Taq - 73 -
πολυµεράση είναι µια θερµοανθεκτική πολυµεράση που αποµονώθηκε από το θερµόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus YT1, το οποίο ζει στο νερό σε θερµοκρασία 75 ο C. Το ένζυµο αποτελείται από µία πεπτιδική αλυσίδα µε µοριακό βάρος 94 kda περίπου, έχει δράση πολυµεράσης 5 3 και πολυµερίζει περίπου 1000 βάσεις ανά λεπτό. Η βέλτιστη θερµοκρασία δράσης της πολυµεράσης είναι 72 ο C, αλλά παραµένει σταθερή ακόµα και στους 94 ο C. Ρυθµιστικό διάλυµα (PCR Buffer) Χρησιµοποιείται για να ρυθµίσει το ph στο οποίο η δράση της πολυµεράσης είναι άριστη. ιατηρείται ως διάλυµα συγκέντρωσης 10Χ. Η τελική συγκέντρωση του ρυθµιστικού διαλύµατος στο µείγµα αντίδρασης είναι 1Χ. Ιόντα Mg 2+ Προστίθενται συνήθως µε τη µορφή διαλύµατος MgCl 2 και χρησιµοποιούνται από την πολυµεράση ως «µεταλλικός συµπαράγοντας». Η συγκέντρωσή τους στο µείγµα αντίδρασης είναι σηµαντική, αφού περίσσεια ιόντων Mg 2+ προκαλεί αύξηση των µη ειδικών προϊόντων της αντίδρασης, ενώ έλλειψη Mg 2+ ελαττώνει την ποσότητα των προϊόντων. Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps) Χρησιµοποιούνται από την Taq πολυµεράση για τη σύνθεση των συµπληρωµατικών αλυσίδων DNA. Στο µείγµα αντίδρασης προστίθεται καθορισµένη ποσότητα ισοµοριακού µείγµατος και των τεσσάρων τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων. Πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις µειώνουν το ρυθµό σύνθεσης DNA (παρεµπόδιση από το υπόστρωµα) και µπορεί να προκαλέσουν την παραγωγή παραπροϊόντων. Εκκινητές (Primers) Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτιδικές ακολουθίες, συµπληρωµατικές προς τα άκρα του τµήµατος DNA που θέλουµε να ενισχύσουµε. Ο σχεδιασµός και η επιλογή τους γίνεται δηλαδή µε βάση τις σταθερές περιοχές του DNA στόχου. Κάποια από τα χαρακτηριστικά που αποδίδονται στους ιδανικούς εκκινητές είναι: µήκος 18-30 βάσεις. Ωστόσο, µεγαλύτερου ή µικρότερου µήκους εκκινητές είναι δυνατόν να είναι εξίσου αποτελεσµατικοί. περιεχόµενο σε GC αντίστοιχο µε εκείνο του DNA-στόχου (50-60% - 74 -
GC). απουσία συµπληρωµατικότητας µεταξύ των δύο εκκινητών, καθώς και µεταξύ διαφορετικών περιοχών του ίδιου εκκινητή, ώστε να αποφεύγεται η δηµιουργία δευτεροταγών δοµών. όχι τρεις ή περισσότερες γουανίνες (G) ή κυτοσίνες (C) στη σειρά, στο 3 άκρο του εκκινητή. απουσία αλληλοεπικάλυψης των δύο εκκινητών στο 3 άκρο, προς αποφυγή δηµιουργίας διµερών εκκινητών. παραπλήσια θερµοκρασία τήξης (Tm). Η τιµή της σταθεράς Tm, καθορίζεται από τη σύσταση των εκκινητών σε αδενίνη (Α), θυµίνη (Τ), γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C). Επιθυµητές Tm κυµαίνονται µεταξύ 55-65 ο C. Προσεγγιστικά ισχύει ότι: Tm = 2 Χ (Α + Τ) + 4 Χ (G + C). Υπολογίζεται, λοιπόν, η θερµοκρασία Tm για καθέναν από τους δύο εκκινητές και αφαιρούµε 5 ο C από την κατώτερη Tm. Η τελική τιµή που προκύπτει είναι περίπου η τιµή της θερµοκρασίας σύνδεσης των εκκινητών. Κατά τη διεξαγωγή της πειραµατικής διαδικασίας απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για να αποφευχθεί τυχόν επιµόλυνση του µείγµατος αντίδρασης µε εξωγενές DNA, πιθανές πηγές του οποίου είναι το εργαστηριακό περιβάλλον, οι πιπέτες, τα µικρορύγχη, τα χηµικά αντιδραστήρια, αλλά ακόµη και η οµιλία ή ο βήχας. Για το λόγο αυτό, στο πείραµα πάντοτε συµπεριλαµβάνεται ένας µάρτυρας ελέγχου (τυφλό), ο οποίος αποτελείται από όλα τα υλικά του µείγµατος αντίδρασης, εκτός από το DNA, για να διαπιστωθεί τυχόν επιµόλυνση. Στον Πίνακα 18 φαίνονται οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν για κάθε γονίδιο το οποίο µελετήθηκε µε PCR. Για το σχεδιασµό τους στο εργαστήριο χρησιµοποιήθηκε το πρόγραµµα Ρrimer 3 Web-based PCR primer prediction. Η σύσταση του µείγµατος αντίδρασης φαίνεται στον Πίνακα 19. Τα δείγµατα τοποθετούνται στο θερµικό κυκλοποιητή (MyCycler thermal cycler Biorad) (Εικόνα 23), που ρυθµίζεται στο επιθυµητό πρόγραµµα. Οι συνθήκες του προγράµµατος που χρησιµοποιήθηκε για κάθε γονίδιο φαίνονται στον Πίνακα 20. Τέλος, τα προϊόντα της κάθε αντίδρασης ανιχνεύονταν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, συγκέντρωσης 2%. - 75 -
Πίνακας 18: Οι αλληλουχίες, το µήκος προϊόντος και η βιβλιογραφία των εκκινητών κάθε γονιδίου. Γονίδιο Εκκινητές Μήκος Βιβλιογραφία προϊόντος For: 5 -GCCTACCTCAAAGCCATCAT-3 Talens- HNF-4α 275bp Visconti et al., Rev: 5 -GACCCTCCCAGCAGCATCTC-3 2008 For: 5 -TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 Σχεδιάστηκαν GAPDH 550bp στο Rev: 5 -CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3 εργαστήριο Πίνακας 19: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Αντιδραστήριο Όγκος cdna (1:100) 5,0µl PCR Buffer 10X 2,5µl MgCl2 (25 mm) 1,5µl dntps (έκαστο 2 mm) 2,5µl Μείγµα εκκινητών (10 pmol/µl) 2,0µl Αποστειρωµένο Η 2 Ο 11,4µl Taq πολυµεράση (5U/µl) 0,1µl Τελικός όγκος 25µl Πίνακας 20: Οι συνθήκες αντίδρασης για κάθε γονίδιο. Γονίδιο HNF-4α GAPDH Αρχική αποδιάταξη 95 C - 2 min 95 C - 2 min Αποδιάταξη Σύνδεση εκκινητών Σύνθεση DNA 95 C - 45 sec 62 C - 45 sec 72 C - 30 sec 95 C - 45 sec 60 C - 45 sec 72 C - 45 sec Αριθµός κύκλων 35 25 Ολοκλήρωση σύνθεσης 72 C - 10 min 72 C - 10 min θυγατρικών αλυσίδων Εκτός από τα παραπάνω πρωτόκολλα, που αφορούν στην παραδοσιακή PCR, τα οποία δοκιµάστηκαν και δούλεψαν επιτυχώς, στη συνέχεια στραφήκαµε στη νεότερη και ακριβέστερη µέθοδο της Real-Time PCR. Αυτό συνέβη επειδή στον Τοµέα ΓΑΜΒ εγκαταστάθηκε η απαραίτητη συσκευή, οπότε έγινε δυνατή η πραγµατοποίηση τέτοιου είδους πειραµάτων. Εικόνα 23: Ο θερµικός κυκλοποιητής MyCycler thermal cycler της Biorad. - 76 -
6.9. mirvana qrt-pcr mirna Detection Kit Στο διάστηµα κατά το οποίο τα πειράµατα διεξάγονταν στην παραδοσιακή PCR, για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των micrornas, από δείγµατα ολικού RNA, χρησιµοποιήθηκε το mirvana kit. Πρόκειται για ένα ολοκληρωµένο σετ αντιδραστηρίων, που επιτρέπει την ακριβή και ταυτόχρονα ταχύτατη εξαγωγή αποτελεσµάτων. Η µέθοδος στην οποία στηρίζεται είναι η ποσοτική ανάστροφη PCR (quantitative reverse transcription-pcr, qrt-pcr). Αυτό σηµαίνει πως δουλεύει σε δύο βήµατα. Στο πρώτο, από το ολικό RNA του δείγµατος µετατρέπεται σε cdna µόνο το mir που µελετάται, ενώ στο δεύτερο ενισχύεται µε PCR το cdna αυτό. Μετά από µια σειρά πιλοτικών πειραµάτων µε σκοπό την εύρεση της κατάλληλης ποσότητας RNA και του κατάλληλου PCR πρωτοκόλλου που θα έπρεπε να χρησιµοποιήσουµε για να έχουµε τα βέλτιστα αποτελέσµατα, καταλήξαµε στα 40 ng RNA/αντίδραση και στους 35 κύκλους (Πίνακας 24). Πιο αναλυτικά, στο πρώτο βήµα δηµιουργείται το µείγµα αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 21 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 22. Έτσι, προκύπτει το cdna του εξεταζόµενου mir. Πίνακας 21: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Αντιδραστήριο Όγκος RNA 2,0µl mirvana 5X RT Buffer 2,0µl 1X mirvana RT Primer 1,0µl Nuclease-free Η 2 Ο 4,6µl ArrayScript Enzyme Mix 0,4µl Τελικός όγκος 10µl Πίνακας 22: Οι συνθήκες αντίδρασης. Σύνθεση cdna 37 C - 30 min Απενεργοποίηση ενζύµου 95 C - 10 min Στο δεύτερο βήµα, δηµιουργείται το µείγµα αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 23 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 24. Με τον - 77 -
τρόπο αυτό, το προαναφερθέν cdna ενισχύεται και µπορεί να ανιχνευτεί σε πηκτή αγαρόζης. Πίνακας 23: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Αντιδραστήριο Όγκος cdna 10,0µl mirvana 5X PCR Buffer 5,0µl mirvana PCR Primers 0,5µl Nuclease-free Η 2 Ο 9,3µl Taq πολυµεράση 5U/µl 0,2µl Τελικός όγκος 25µl Πίνακας 24: Οι συνθήκες αντίδρασης. Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Σύνδεση εκκινητών Σύνθεση DNA Αριθµός κύκλων 35 Ολοκλήρωση σύνθεσης θυγατρικών αλυσίδων 95 C - 3 min 95 C - 15 sec 60 C - 30 sec 72 C - 30 sec 72 C - 10 min 6.10. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real-Time RT-PCR) Για να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση των υπό µελέτη γονιδίων, µε µεγάλη ακρίβεια, πραγµατοποιήθηκε Real Time PCR, στη συσκευή Step One Real Time PCR System της Applied Biosystems (Εικόνα 24). Η Real-Time RT-PCR µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε µε χρήση της χρωστικής SYBR Green, είτε µε τη χρήση ειδικών ανιχνευτών. Στην παρούσα εργασία, χρησιµοποιήθηκαν και οι δύο χηµείες, αναλόγως του υπό µελέτη γονιδίου. Όπως και στην παραδοσιακή PCR, έτσι και εδώ χρησιµοποιείται ένας µάρτυρας ελέγχου (τυφλό) σε κάθε πείραµα, ο οποίος αποτελείται από όλα τα υλικά του µείγµατος αντίδρασης, εκτός από το DNA, για να διαπιστωθεί τυχόν επιµόλυνση. - 78 -
Εικόνα 24: Η συσκευή Step One Real Time PCR System της Applied Biosystems. 6.10.1. SYBR Green Η χρωστική SYBR Green I (SG) είναι µια ασύµµετρη κυανική χρωστική, που προσδένεται σε δίκλωνα τµήµατα DNA και τότε φθορίζει (Εικόνα 25). Εξαιτίας αυτού, είναι πολύ χρήσιµη για την επισήµανση των νουκλεϊκών οξέων. Το σύµπλοκο DNA-χρωστικής απορροφά µπλε φως, έως λ=488 nm, εκπέµποντας πράσινο, έως λ=522 nm. Μεγάλο µειονέκτηµα της συγκεκριµένης τεχνικής αποτελεί το γεγονός ότι η SYBR Green ανιχνεύει και υβριδίζεται µε οποιοδήποτε δίκλωνο τµήµα DNA, χωρίς καµία ειδικότητα. Έτσι, η αντίδραση θα πρέπει να περιέχει ένα συνδυασµό εκκινητών και βασικού µείγµατος, που θα ενισχύει αποκλειστικά το ειδικό προϊόν και όχι άλλα δευτερεύοντα παραπροϊόντα (Zipper et al., 2004, Heid et al., 1996). Το δεύτερο σηµείο ελέγχου της ειδικότητας του συντιθέµενου προϊόντος είναι η καµπύλη τήξης (melting curve), στην οποία διακρίνονται όλα τα τµήµατα του cdna που ενισχύθηκαν, ως ξεχωριστές κορυφές. Συγκεκριµένα, µετά από την ενίσχυση του προϊόντος, το µηχάνηµα προγραµµατίζεται να πραγµατοποιήσει την αντίδραση της καµπύλης τήξης, στην οποία η θερµοκρασία αυξάνεται σε ένα εύρος 60 ο C-95 ο C, ανά 0.3 ο C, και καταγράφεται έτσι η διαφορά στον εκπεµπόµενο φθορισµό από την SYBR Green. Στο σηµείο τήξης, οι δύο κλώνοι του DNA θα διαχωριστούν και ο εκπεµπόµενος φθορισµός θα µειωθεί απότοµα. Το πρόγραµµα καταγράφει τα στοιχεία και κάνει ένα γράφηµα του σχετικού εκπεµπόµενου φθορισµού (άξονας Υ) σε σχέση µε τη θερµοκρασία (άξονα Χ), το οποίο οδηγεί στο σχηµατισµό κορυφών (στην περίπτωση περισσοτέρων του ενός επιθυµητού προϊόντος, ή στην περίπτωση διµερισµού - 79 -
των εκκινητών) ή στο σχηµατισµό µίας και µοναδικής κορυφής, που είναι και το βέλτιστο. Έτσι, ξεχωρίζουν τα ειδικά προϊόντα της αντίδρασης, τα οποία αντιστοιχούν σε µια καµπύλη µε µία µόνο έντονη κορυφή σε αναµενόµενη θερµοκρασία τήξης βάσει του µεγέθους τους. Εικόνα 25: Η SYBR Green, µια χρωστική που φθορίζει µόνο όταν προσδένεται σε δίκλωνα τµήµατα DNA. Με τη συγκεκριµένη τεχνική ελέγχθηκε η έκφραση των γονιδίων HNF- 3α, HNF-4α, apoc-iii, καθώς και το γονίδιο αναφοράς GAPDH. Η σύσταση του µείγµατος αντίδρασης που χρησιµοποιήθηκε φαίνεται στον Πίνακα 25, ενώ οι αλληλουχίες των εκκινητών στον Πίνακα 26. Στον Πίνακα 27 φαίνονται οι συνθήκες της αντίδρασης, που ήταν κοινές για όλα τα γονίδια, καθώς οι εκκινητές σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να έχουν ίδια θερµοκρασία τήξης (και άρα ίδια θερµοκρασία υβριδισµού στο υπό µελέτη εκµαγείο) και επίσης το µέγεθος του ενισχυµένου προϊόντος δεν ήταν σε καµία περίπτωση µεγαλύτερο των 150bp. Ο σχεδιασµός έγινε έτσι ώστε να είναι δυνατή η ταυτόχρονη µελέτη διαφορετικών γονιδίων του ίδιου δείγµατος. Τέλος, πριν η πειραµατική διαδικασία τυποποιηθεί, προηγείται µια σειρά πιλοτικών πειραµάτων για τον προσδιορισµό των ποσοτήτων εκµαγείου και εκκινητών που θα χρησιµοποιούνται. Συγκεκριµένα, σε ένα κοινό εκµαγείο µέσης αραίωσης1:100, δοκιµάζονται διαδοχικά αυξανόµενες ποσότητες εκκινητών, σε ένα εύρος τιµών 0,5-3 pmol. Αφού προσδιοριστεί η βέλτιστη ποσότητα εκκινητών για κάθε γονίδιο, χρησιµοποιείται αυτή µε διαδοχικές αραιώσεις εκµαγείου, από πυκνό έως 1:1000, ώστε να προκύψει και η - 80 -
καταλληλότερη αραίωση. Στη συγκεκριµένη εργασία, παντού χρησιµοποιήθηκε η αραίωση 1:100, ενώ οι ποσότητες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 25. Πίνακας 25: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης (ανά δείγµα). Γονίδιο HNF-3α HNF-4α ApoC-III GAPDH cdna (1:100) 2,0µl 2,0µl 2,0µl 2,0µl 2x SYBR Green master mix* 5,0µl 5,0µl 5,0µl 5,0µl Μείγµα εκκινητών (1 pmol/µl) 1,3µl 1,5µl 3,0µl 3,0µl Αποστειρωµένο Η 2 Ο 1,7µl 1,5µl - - Τελικός όγκος 10µl 10µl 10µl 10µl *KAPA SYBR FAST (KM4103), περιλαµβάνει DNA πολυµεράση, PCR buffer, dntps, Mg 2+, ROX (παθητική χρωστική κανονικοποίησης, ώστε να διορθώνονται τυχόν λάθη πιπεταρίσµατος, καθώς η τελική απορρόφηση που δίνεται είναι κανονικοποιηµένη µε την απορρόφηση της ROX χρωστικής, η οποία φυσικά απορροφά σε άλλο µήκος κύµατος από την SYBR Green χρωστική). Πίνακας 26: Οι αλληλουχίες και το µήκος προϊόντος των εκκινητών κάθε γονιδίου. Γονίδιο HNF-3α HNF-4α ApoC-III GAPDH Εκκινητές For: 5 -GAAGATGGAAGGGCATGAAA-3 Rev: 5 -GCCTGAGTTCATGTTGCTGA-3 For: 5 -CGAGCAGATCCAGTTCATCA-3 Rev: 5 -CGTTGGTTCCCATATGTTCC-3 For: 5 -GTGCAGGAGTCCCAGGTG -3 Rev: 5 -AGTAGTCTTTCAGGGAACTGAAGC-3 For: 5 - CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3 Rev: 5 - TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3 Μήκος προϊόντος 97bp 149bp 73 bp 106bp *Για το σχεδιασµό εκκινητών στο εργαστήριο χρησιµοποιήθηκαν τα προγράµµατα Ρrimer 3 Web-based PCR primer prediction και Universal ProbeLibrary Assay Design Center της Roche (http://www.roche-appliedscience.com/sis/rtpcr/upl/ezhome.html). - 81 -
Πίνακας 27: Οι συνθήκες αντίδρασης. Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Σύνδεση εκκινητών/ Σύνθεση DNA 95 C - 20 sec 95 C - 3 sec 60 C - 30 sec Αριθµός κύκλων 40 Καµπύλη τήξης 95 C - 15 sec 60 C - 1 min 95 C - 15 sec ( +0,3 C) 6.10.2. TaqMan Στη συγκεκριµένη προσέγγιση, η ακρίβεια είναι πολύ µεγαλύτερη, καθώς χρησιµοποιείται το ζεύγος των εκκινητών, αλλά και ένας ανιχνευτής (probe), εποµένως το όποιο προϊόν γίνει ορατό, έχει περάσει από τρία στάδια «ελέγχου». Πιο αναλυτικά, ο ανιχνευτής φέρει τη χρωστική αναφοράς στο 5 άκρο του, FAM στη συγκεκριµένη περίπτωση, και στο 3 άκρο του µια πρωτεΐνη πρόσδεσης στη µικρή αύλακα (minor groove binder, MGB), που βελτιώνει τις ιδιότητές του, καθώς και το µη φθορίζοντα σιγαστήρα (nonfluorescent quencher, NFQ), που επιτρέπει στη χρωστική αναφοράς να φθορίσει µόνο όταν ο ανιχνευτής υβριδιστεί στο DNA. Η διαδικασία εξελίσσεται σε κάθε κύκλο της αντίδρασης, οπότε σε κάθε στόχο υβριδίζεται το ζεύγος των εκκινητών και ανάµεσά τους ο ανιχνευτής (Εικόνα 26Α). Στον άθικτο ελεύθερο ανιχνευτή, η χρωστική αναφοράς και ο σιγαστήρας είναι κοντά και ο δεύτερος δεν επιτρέπει στην πρώτη να φθορίσει (Εικόνα 26Α, Β). Η DNA πολυµεράση, λόγω της 5 εξωνουκλεολυτικής δράσης της, αποικοδοµεί όσους ανιχνευτές συναντά υβριδισµένους στο στόχο (Εικόνα 26Γ), απελευθερώνοντας τη χρωστική από το σιγαστήρα. Τότε, η πρώτη µπορεί να φθορίσει ελεύθερα και να µετρηθεί η ποσότητα του ενισχυµένου προϊόντος (Εικόνα 26 ). Η παρούσα τεχνική, όπως αναφέρθηκε και προηγουµένως, χρησιµοποιήθηκε για τη µελέτη της έκφρασης των mir-24, mir-122 και του γονιδίου αναφοράς U6. Η σύσταση του µείγµατος αντίδρασης που - 82 -
χρησιµοποιήθηκε δίνεται στον Πίνακα 28, ενώ οι συνθήκες της αντίδρασης, κοινές για όλα τα γονίδια, στον Πίνακα 29. Οι κωδικοί των εκκινητών έχουν δοθεί στον Πίνακα 11. A B Γ Εικόνα 26: Η αρχή λειτουργίας της τεχνικής TaqMan. Α) Πολυµερισµός. Β) Εκτόπιση κλώνου. Γ) Αποικοδόµηση. ) Τέλος πολυµερισµού. Πίνακας 28: Σύσταση του µείγµατος αντίδρασης(ανά δείγµα). Γονίδιο mir- 24 mir- 122 U6 cdna 0,7µl 0,7µl 0,7µl 2x TaqMan master mix* 5,0µl 5,0µl 5,0µl Μείγµα εκκινητώνανιχνευτή 0,5µl 0,5µl 0,5µl Αποστειρωµέ νο Η 2 Ο 3,8µl 3,8µl 3,8µl Τελικός όγκος 10µl 10µl 10µl * TaqMan fast universal PCR master mix (4366072), περιλαµβάνει DNA πολυµεράση, PCR buffer, dntps, Mg 2+, ROX. - 83 -
Πίνακας 29: Οι συνθήκες αντίδρασης. Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη 95 C - 10 min 95 C - 15 sec Σύνδεση εκκινητών/ Σύνθεση DNA 60 C - 1 min Αριθµός κύκλων 40 6.10.3. Συλλογή και στατιστική ανάλυση δεδοµένων Με το πέρας της αντίδρασης, το λογισµικό της συσκευής της Real-Time RT-PCR, σχηµατίζει τα γραφήµατα ενίσχυσης, τα οποία δείχνουν τη συσσώρευση του ενισχυµένου προϊόντος µε την πάροδο του χρόνου. Συγκεκριµένα, στα γραφήµατα εµφανίζεται στον άξονα των Υ ο σχετικός εκπεµπόµενος φθορισµός, κανονικοποιηµένος ως προς τον φθορισµό της ROX χρωστικής και στον άξονα των Χ εµφανίζεται ο κύκλος της αντίδρασης. Αυτό που µελετάµε στη Real-Time RT-PCR, είναι ο κύκλος στον οποίο η αύξηση στον φθορισµό είναι εκθετική. Αυτό αντιπροσωπεύεται από την τιµή του threshold, τιµή η οποία τίθεται από το χρήστη. Το σηµείο τοµής της οριζόντιας γραµµής του threshold µε την καµπύλη ενίσχυσης αντιστοιχεί στην τιµή του Ct, τιµή η οποία είναι µοναδική για κάθε δείγµα και εξαρτάται από την ποσότητα του υπό µελέτη γονιδίου που υπάρχει στο εκάστοτε δείγµα. Τα δεδοµένα που συλλέχθηκαν για κάθε δείγµα, δηλαδή τα Ct γονιδίου στόχου και γονιδίου αναφοράς, αναλύθηκαν σε ηλεκτρονικό υπολογιστή, µε τη βοήθεια των προγραµµάτων StepOne Software v2.1 και Microsoft Office Excel. Ως πειραµατική προσέγγιση, αποφασίστηκε η Σχετική Ποσοτικοποίηση, µε την οποία υπολογίζεται η διαφορά της γονιδιακής έκφρασης κάθε δείγµατος από εκείνη ενός δείγµατος «κανονικοποιητή» (calibrator), δεδοµένου ότι η αποτελεσµατικότητα ενίσχυσης των εκκινητών του κάθε υπό µελέτη γονιδίου και του γονιδίου αναφοράς είναι ίδια (Livak & Schmittgen, 2001). Συγκεκριµένα, τόσο για τα µελετούµενα δείγµατα όσο και για τα δείγµατα ελέγχου και το δείγµα κανονικοποιητή, υπολογίζονται τα εξής (Pfaffl, 2001): - 84 -
Ct,goi=Ct,goi-Ct,ref (1) Ct,calib=Ct,cgoi-Ct,cref (2) Ct= Ct,goi- Ct,calib (3) 2 - Ct (4) (όπου goi=gene of interest/γονίδιο στόχος, ref=reference gene/γονίδιο αναφοράς, cgoi=calibrator gene of interest/κανονικοποιητής στο γονίδιο στόχο, cref=calibrator reference gene/κανονικοποιητής στο γονίδιο αναφοράς) Οι δύο πρώτοι τύποι (1 και 2) κανονικοποιούν ως προς το γονίδιο αναφοράς. Ο τρίτος (3) υπολογίζει τη διαφορά της γονιδιακής έκφρασης του δείγµατος από εκείνη του κανονικοποιητή, η οποία υψώνεται στην αρνητική δύναµη του 2, στον τέταρτο τύπο (4), για να εκφραστεί η διαφορά αυτή σε φορές (fold). Στη συνέχεια, µε διαίρεση της τιµής που προκύπτει από τον τύπο (4), για το υπό µελέτη δείγµα προς εκείνη του δείγµατος ελέγχου, προκύπτει η διαφορά της γονιδιακής έκφρασης του δείγµατος υπό µελέτη από το δείγµα ελέγχου. Προφανώς, η διαδικασία αυτή για το δείγµα ελέγχου έχει ως αποτέλεσµα τη µονάδα. Έτσι, είναι δυνατόν να συγκριθούν διαφορετικά δείγµατα µεταξύ τους, για το ίδιο βέβαια γονίδιο, αφού η έκφρασή του σε όλα τα δείγµατα προκύπτει ως διαφορά από τη µονάδα. - 85 -
7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 7.1. Επίδραση του mir-24 στον ΗΝF-4α 7.1.1. Αύξηση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε µείωση του mrna και της πρωτεΐνης του HNF-4α Για τη µελέτη της επίδρασης του mir-24 στην έκφραση του HNF-4α έγινε υπερέκφραση του mir-24 σε κύτταρα ΗepG2. Αυτό πραγµατοποιήθηκε µε ανάστροφη διαµόλυνση των κυττάρων µε το συνθετικό pre-mir-24, ενώ ως µάρτυρας χρησιµοποιήθηκαν «ψευδοδιαµολυσµένα» κύτταρα (mock transfected cells), τα οποία συµµετείχαν κανονικά στην όλη διαδικασία της διαµόλυνσης µε τη µόνη διαφορά ότι τη θέση του pre-mir-24 στο µείγµα διαµόλυνσής τους έπαιρνε το θρεπτικό µέσο. Στη συνέχεια, µετρήθηκαν τα επίπεδα του mir-24 στα κύτταρα, στις 24, 48 και 72 ώρες µετά τη διαµόλυνση, µε τη βοήθεια της Real-Time PCR. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 27, παρατηρείται αύξηση της έκφρασης του mir-24, στις 24 ώρες, η οποία µειώνεται σταδιακά µέχρι τις 72 ώρες. Συγκεκριµένα, στις 24 ώρες παρατηρείται 125 φορές αύξηση στην έκφραση του mir-24, σε σχέση µε τον µάρτυρα, που µειώνεται στις 33 φορές στις 48ώρες, και περαιτέρω στις 14 φορές στις 72 ώρες.μέχρι και τις 72 ώρες µετά τη διαµόλυνση, τα κύτταρα συνέχισαν να εµφανίζουν αυξηµένα επίπεδα του mir-24, σε σχέση µε το µάρτυρα. Εικόνα 27: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν την υπερέκφραση του mir-24, σε κύτταρα HepG2 που διαµολύνθηκαν µε το pre-mir-24, στις 24, 48 και 72 ώρες µετά τη διαµόλυνση (ΜΟ τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ±SE). - 86 -
Στη συνέχεια µελετήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης του mir-24, στην έκφραση του HNF-4α. Αρχικά, ελέγχθηκαν τα επίπεδα του mrna του HNF-4α µε Real-Time PCR. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 28, διαµόλυνση κυττάρων ΗepG2 µε pre-mir-24, οδήγησε σε µείωση των επιπέδων του HNF- 4α mrna κατά 55% ήδη από τις 24 ώρες, µε περαιτέρω µείωση στις 48 και στις 72 ώρες, κατά 65% και 70% αντίστοιχα. Εικόνα 28: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν ότι υπερέκφραση του mir-24, σε κύτταρα HepG2, ανέστειλε την έκφραση του mrna του HNF-4α (ΜΟ τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ±SE). Στη συνέχεια, µετρήθηκε η επίδραση του mir-24 στην έκφραση της πρωτεΐνης του HNF-4α. Έγινε συλλογή κυτταρικών εκχυλισµάτων τόσο από κύτταρα διαµολυσµένα µε pre-mir-24, όσο και από «ψευδοδιαµολυσµένα», αλλά και από HepG2 κύτταρα χωρίς καµία επίδραση. Τα δύο τελευταία χρησίµευσαν ως µάρτυρες. Σε κάθε οµάδα εκχυλισµάτων, προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα σε HNF-4α, καθώς και σε p65 ως πρωτεΐνη αναφοράς, µε την τεχνική Western blot. Τα αποτελέσµατα, που φαίνονται στην Εικόνα 29, δείχνουν αισθητή µείωση της πρωτεΐνης του HNF-4α, στα διαµολυσµένα µε το mir-24 κύτταρα. Η «ψευδοδιαµόλυνση» δεν άλλαξε την έκφραση της µελετούµενης πρωτεΐνης, όπως προκύπτει από τη σύγκριση της αντίστοιχης ζώνης µε εκείνη των κυττάρων τα οποία δεν είχαν υποστεί καµία διαµόλυνση, εποµένως η µείωση οφείλεται στην υπερέκφραση του mir-24. - 87 -
Εικόνα 29: Αποτελέσµατα από Western blot, που δείχνουν ότι υπερέκφραση του mir-24 σε κύτταρα HepG2, ανέστειλε την έκφραση της πρωτεΐνης του HNF-4α, ενώ δεν την επηρέασε η «ψευδοδιαµόλυνση» (mock), που την άφησε στα επίπεδα των µη διαµολυσµένων κυττάρων (non treated, NT). 7.1.2. Μείωση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε αύξηση του mrna του HNF-4α Σε µια, αντίστροφη από την προαναφερθείσα, προσπάθεια να προσδιοριστεί ο ρόλος του mir-24 στη ρύθµιση του HNF-4α, κύτταρα ΗepG2 διαµολύνθηκαν µε το συνθετικό anti-mir-24, ενώ ως µάρτυρας χρησιµοποιήθηκαν «ψευδοδιαµολυσµένα» κύτταρα. Έτσι, έγινε δυνατός ο προσδιορισµός των επιπέδων του mrna του HNF-4α, µε τη µέθοδο της Real-Time PCR, σε κύτταρα µε µειωµένο mir-24. Αυτό που παρατηρήθηκε ήταν αύξηση στο υπό µελέτη mrna. Έτσι, ήδη από τις 24 ώρες αυξήθηκε κατά 2,5 φορές, ενώ στις 48 έφτασε τις 4,5 φορές, παραµένοντας περίπου εκεί και στις 72 ώρες (Εικόνα 30). Εικόνα 30: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν ότι αναστολή της έκφρασης του mir-24, σε κύτταρα HepG2, µε χρήση anti-mir-24, αύξησε την έκφραση του mrna του HNF-4α (ΜΟ τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ±SE). - 88 -
7.2. Επίδραση του mir-24 στην apoc-iii Η apoc-iii αποτελεί γνωστό καθοδικό στόχο του HNF-4α, δηλαδή η έκφραση του γονιδίου της υφίσταται ρύθµιση από τον παράγοντα αυτό. Έτσι, θελήσαµε να εξετάσουµε τον αντίκτυπο που θα είχε η υπερέκφραση του mir- 24 στην έκφραση της apoc-iii. 7.2.1. Αύξηση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε µείωση του mrna και της πρωτεΐνης της apoc-iii Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mrna της apoc-iii, σε κύτταρα ΗepG2 ανάστροφα διαµολυσµένα µε pre-mir-24, έγινε µε τη Real-Time PCR. Από την Εικόνα 31 προκύπτει ότι το συγκεκριµένο mrna αρχίζει ουσιαστικά να µειώνεται 48 ώρες µετά τη διαµόλυνση, οπότε και υποδιπλασιάστηκε, ενώ στις 72 είχε τη µέγιστη µείωση, που άγγιξε το 60%. Εικόνα 31: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν ότι υπερέκφραση του mir-24, σε κύτταρα HepG2, ανέστειλε την έκφραση του mrna της apoc-iii (ΜΟ τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ±SE). Μείωση παρατηρείται και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, µε Western blot. Όπως δείχνει η Εικόνα 32, τα κύτταρα που διαµολύνθηκαν µε pre-mir-24 εκφράζουν σαφώς λιγότερη apoc-iii, σε σχέση µε τα κύτταρα ελέγχου, τα οποία - 89 -
υπέστησαν «ψευδοδιαµόλυνση». Η β-ακτίνη χρησίµευσε ως πρωτεΐνη αναφοράς. Εικόνα 32: Αποτελέσµατα από Western blot, που δείχνουν ότι υπερέκφραση του mir-24 σε κύτταρα HepG2, ανέστειλε την έκφραση της apoc-iii, σε σχέση µε το µάρτυρα (mock). 7.2.2. Μείωση της έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε αύξηση του mrna και της πρωτεΐνης της apoc-iii Ακολουθώντας την αντίστοφη λογική, σε σχέση µε προηγουµένως, ελέγχθηκαν τα επίπεδα του mrna της apoc-iii, µε Real-Time PCR, σε κύτταρα ΗepG2 στα οποία αποσιωπήθηκε η έκφραση του mir-24, µε τη βοήθεια του anti-mir-24. Η ανοδική πορεία του µελετούµενου mrna είναι βαθµιδωτή και φαίνεται στην Εικόνα 33. Έτσι, σε 24 ώρες από τη διαµόλυνση, το mrna της σχεδόν διπλασιάστηκε και σε 48 ώρες τετραπλασιάστηκε, φθάνοντας σε 72 ώρες τη µέγιστη αύξηση, κατά περίπου 5,5 φορές, σε σχέση µε το µάρτυρα. Εικόνα 33: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν ότι αναστολή της έκφρασης του mir-24 σε κύτταρα HepG2, µε χρήση anti-mir-24, αύξησε την έκφραση του mrna της apoc-iii (ΜΟ τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ±SE). - 90 -
Σε συµφωνία µε την αύξηση του mrna βρίσκεται και αυτή της πρωτεΐνης, συµπέρασµα που συνάγεται από το Western blot της Εικόνας 34. Αναλυτικότερα, στα κύτταρα δίχως mir-24, η apoc-iii φαίνεται αρκετά περισσότερη, παρά στα κύτταρα του µάρτυρα, µε πρωτεΐνη αναφοράς τη β- ακτίνη. Εικόνα 34: Αποτελέσµατα από Western blot, που δείχνουν ότι αναστολή της έκφρασης του mir-24 σε κύτταρα HepG2, µε χρήση anti-mir-24, αύξησε την έκφραση της apoc-iii, σε σχέση µε το µάρτυρα. 7.3. Επίδραση του NF-κB στην έκφραση του mir-24 Όπως αναφέρθηκε στην Εισαγωγή, µελέτες έχουν δείξει θέσεις πρόσδεσης του NF-κΒ στον υποκινητή του mir-24 (Zhou et al., 2009, Zhou et al., 2010). Προκειµένου να µελετηθεί εάν ο NF-κΒ δρα σαν ενεργοποιητής στην έκφραση του γονιδίου του mir-24, έγινε διαµόλυνση κυττάρων ΗepG2, µε το γονίδιο της LMP-1, µία πρωτεΐνη που οδηγεί στην ενεργοποίηση του ΝF-κΒ (Herrero et al., 1995). Ακολούθως, 48 ώρες µετά τη διαµόλυνση, αποµονώθηκε το RNA των κυττάρων, και µε Real-Time PCR προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του mir-24, τόσο σε διαµολυσµένα κύτταρα, όσο και σε «ψευδοδιαµολυσµένα» κύτταρα µάρτυρες. Η Εικόνα 35 παρουσιάζει το µέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, από τα οποία προκύπτει ότι το mir-24 αυξήθηκε κατά 47% στα διαµολυσµένα µε LMP-1 κύτταρα. Τα αποτελέσµατα αυτά υποδεικνύουν ότι ο ΝF-κΒ παίζει σηµαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του υποκινητή του mir-24. - 91 -
Εικόνα 35: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν ότι υπερέκφραση της LMP-1 σε κύτταρα HepG2, αύξησε την έκφραση του mir-24, σε σχέση µε τα «ψευδοδιαµολυσµένα» κύτταρα (mock) (ΜΟ τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ±SE, Ρ=0,05). 7.4. Hπατίτιδες και δείκτες καρκίνου του ήπατος Οι ιοί της ηπατίτιδας Β και C αποτελούν τους σηµαντικότερους παράγοντες κινδύνου για εµφάνιση ηπατικών κακοηθειών, γι αυτό και θα είχε ενδιαφέρον να µελετηθεί το πώς επηρεάζουν την έκφραση ορισµένων γονιδίων στα µολυσµένα άτοµα. Η συγκεκριµένη µελέτη κατέστη δυνατή µετά την εξασφάλιση δειγµάτων από βιοψίες, ευγενική προσφορά του Λέκτορα Γαστρεντερολογίας της Α Παθολογικής Κλινικής ΑΠΘ κυρίου Γερµανίδη Γεωργίου. Οι βιοψίες προέρχονταν τόσο από άτοµα µε ηπατίτιδα, που ακόµη δεν έχουν εµφανίσει καρκίνο, όσο και από άτοµα µε αυτοάνοσα νοσήµατα, τα οποία δεν καταλήγουν σε καρκίνο και χρησίµευσαν ως οµάδα ελέγχου (control). Συνολικά παραλάβαµε 13 βιοψίες, 7 εκ των οποίων από άτοµα µολυσµένα µε τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV), 1 από ασθενή µε τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV), ενώ οι υπόλοιπες 5 από ασθενείς µε αυτοάνοσα νοσήµατα. Η παθολογία κάθε βιοψίας, καθώς και ο αύξων αριθµός που τη συνοδεύει στα παρακάτω γραφήµατα, φαίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 30. Τα γονίδια που εξετάστηκαν παρατίθενται αναλυτικά αµέσως παρακάτω. - 92 -
Πίνακας 30: Οι βιοψίες και τα στοιχεία που τις συνόδευαν. Αύξων αριθµός Κωδική ονοµασία Παθολογία 1 THKY 2 TSMI 3 TSAN 4 SUG HBV 5 KIEY 6 ELG 7 MATS 8 ZYSN HCV 9 TSC 10 TSEL 11 KOAN 12 AKAI 13 MPER αυτοάνοσο νόσηµα 7.4.1. mir-24 Το mir-24, είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία, ότι εµφανίζεται αυξηµένο στα ηπατοκαρκινικά κύτταρα, σε σχέση µε τα φυσιολογικά (Huang et al., 2008, Mott, 2009). Έτσι, µελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασής του σε ασθενείς µε ηπατίτιδα και στην Εικόνα 36 παρουσιάζεται η σχετική έκφρασή του, όπως προέκυψε για τα 13 δείγµατα των βιοψιών. Το 9 ο δείγµα, από την οµάδα των αυτοάνοσων, παρουσιάζει ιδιαιτέρως αυξηµένη έκφραση, ενώ αρκετά υψηλά είναι τα επίπεδα και των δειγµάτων 1 και 10, που προέρχονται από ασθενή µε HBV και αυτοάνοσο αντίστοιχα. Τα υπόλοιπα δείγµατα κυµαίνονται σε παρόµοια επίπεδα έκφρασης, παρά τη διαφορετική παθολογία τους. Εικόνα 36: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν τα σχετικά, ως προς HepG2, επίπεδα έκφρασης του mir-24, σε βιοψίες ποικίλης παθολογίας (1-7: HBV, 8: HCV, 9-13: αυτοάνοσο νόσηµα) (ΜΟ δύο τεχνικών επαναλήψεων, ±SE). - 93 -
7.4.2. mir-122 Το mir-122 είναι το κυρίαρχο microrna του φυσιολογικού ήπατος, ενώ έχει δειχτεί ότι µειώνεται πολύ στο ηπατοκαρκίνωµα (Lagos-Quintana et al., 2002, Kutay et al., 2006, Gramantieri et al., 2007). Η έκφρασή του στις µελετούµενες βιοψίες, είναι αυτή που φαίνεται στην Εικόνα 37. Συγκεκριµένα, τα δείγµατα 9 και 10 παρουσιάζουν µια ασυνήθιστα υψηλή έκφραση, όπως και τα 1, 8, 13, σε πολύ µικρότερο βαθµό βέβαια. Τα υπόλοιπα 8 δείγµατα έχουν πιο οµοιόµορφη έκφραση. Εικόνα 37: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν τα σχετικά, ως προς HepG2, επίπεδα έκφρασης του mir-122, σε βιοψίες ποικίλης παθολογίας (1-7: HBV, 8: HCV, 9-13: αυτοάνοσο νόσηµα) (ΜΟ δύο τεχνικών επαναλήψεων, ±SE). 7.4.3. HNF-4α Ο HNF-4α είναι ένας πολύ σηµαντικός µεταγραφικός παράγοντας για τα ηπατοκύτταρα, ο οποίος έχει βρεθεί πως αναστέλλεται από το mir-24 (Iliopoulos et al., 2009). H έκφρασή του για τις 13 βιοψίες, παρατίθεται στην Εικόνα 38. Πιο αναλυτικά, παρατηρείται ότι στα περισσότερα δείγµατα (1, 2, 4, 6, 10, 12) παρουσιάζει παρόµοια έκφραση, ενώ στα 5, 7, 8, 9, 11 και 13 είναι πιο χαµηλή και µόνο στο δείγµα 3 είναι σε αρκετά υψηλότερα επίπεδα. υστυχώς, δε στάθηκε δυνατό να συνδεθεί µια συγκεκριµένη παθολογία µε κάποιο πρότυπο έκφρασής του. - 94 -
Εικόνα 38: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν τα σχετικά, ως προς HepG2, επίπεδα έκφρασης του HNF-4α, σε βιοψίες ποικίλης παθολογίας (1-7: HBV, 8: HCV, 9-13: αυτοάνοσο νόσηµα) (ΜΟ δύο τεχνικών επαναλήψεων, ±SE). 7.4.4. HNF-3α Τέλος, µελετήθηκε ο HNF-3α, ο οποίος είναι µέλος του ηπατικού µεταγραφικού δικτύου, που φαίνεται να καταστέλλεται στο σύνολό του κατά το ηπατοκαρκίνωµα (Lazarevich et al., 2004). Η Εικόνα 39 δείχνει τη σχετική έκφρασή του, όπως αυτή υπολογίστηκε για καθεµιά από τις 13 διαθέσιµες βιοψίες, µε εξαίρεση το 9 ο δείγµα, για το οποίο δεν ήταν δυνατό να προσδιοριστεί. Αυτό που προκύπτει είναι µια έντονη ετερογένεια, µε τα δείγµατα 1, 4, 6, 8, 10 να εµφανίζουν λίγο υψηλότερη έκφραση από τα 2, 3, 5, 7, 11, 12, 13. Η διαφορά όµως αυτή δε συµβαδίζει µε κάποια διαφορά και στην παθολογία των δειγµάτων, οπότε δε µπορεί να συνδεθεί ένα συγκεκριµένο πρότυπο έκφρασης µε µια ορισµένη παθολογία. Εικόνα 39: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν τα σχετικά, ως προς HepG2, επίπεδα έκφρασης του HNF-3α, σε βιοψίες ποικίλης παθολογίας (1-7: HBV, 8: HCV, 10-13: αυτοάνοσο νόσηµα) (ΜΟ δύο τεχνικών επαναλήψεων, ±SE). - 95 -
7.5. mir-24 και HNF-4α στο ηπατοκαρκίνωµα Τέλος, έγινε µια προσπάθεια να προσδιοριστούν τα σχετικά επίπεδα του mir-24 και του mrna του HNF-4α, σε 28 δείγµατα βιοψιών από ασθενείς µε ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα, χρησιµοποιώντας Real-Time PCR. Απώτερος στόχος ήταν να µελετηθεί το αν υπάρχει συσχέτιση της έκφρασης των δύο αυτών παραγόντων στα ηπατοκαρκινικά κύτταρα in vivo, καθώς έχει ήδη παρατηρηθεί πως το mir-24 αναστέλλει την έκφραση του ΗΝF-4α σε κυτταροκαλλιέργειες (Iliopoulos et al., 2009). Από κάθε ασθενή είχε ληφθεί βιοψία τόσο από καρκινικό ιστό, όσο και από παρακείµενο φυσιολογικό, που χρησίµευσε ως µάρτυρας (control). Η Εικόνα 40 αποτυπώνει τη σχετική έκφραση κάθε παράγοντα, ως προς την αντίστοιχη φυσιολογική. Η ετερογένεια που παρατηρείται είναι έντονη. Έτσι, στα δείγµατα 1-19 και οι δύο παράγοντες είναι αυξηµένοι σε σχέση µε τα φυσιολογικά τους επίπεδα, ενώ στα δείγµατα 20, 24, 25 είναι αµφότεροι µειωµένοι. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι περιπτώσεις 21-23 και 26-28, στις οποίες φαίνεται να παρουσιάζουν αντίστροφη συσχέτιση, µε το mir- 24 να αυξάνεται και ταυτόχρονα τον HNF-4α να µειώνεται. Εικόνα 40: Αποτελέσµατα από Real-Time PCR, που δείχνουν τα σχετικά, ως προς τα φυσιολογικά, επίπεδα έκφρασης του mir-24 και του HNF-4α, σε βιοψίες ηπατοκαρκινώµατος. Με * οι περιπτώσεις ιδιαίτερου ενδιαφέροντος (ΜΟ δύο τεχνικών επαναλήψεων, ±SE). - 96 -