Διερεύνηση του ρόλου του microrna, mir-24, και του HNF-4α στην κυτταρική αύξηση και στον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων και στο ηπατοκαρκίνωμα

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Διερεύνηση του ρόλου του microrna, mir-24, και του HNF-4α στην κυτταρική αύξηση και στον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων και στο ηπατοκαρκίνωμα ΤΣΙΑΜΗ ΙΩΑΝΝΑ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Χατζοπούλου-Κλαδαρά Μαργαρίτα ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 The role of microrna, mir24, and HNF-4a in cellular growth and proliferation of hepatocytes and in hepatocellular carcinoma - 2 -

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης του τμήματος Βιολογίας, στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών της κατεύθυνσης Εφαρμοσμένη Γενετική και Βιοτεχνολογία, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Με την ολοκλήρωσή της θα ήθελα αρχικά να ευχαριστήσω πάρα πολύ την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κ. Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά, η οποία μου έδωσε την ευκαιρία να δουλέψω πάνω σε ένα τόσο ενδιαφέρον αντικείμενο. Της χρωστώ ένα μεγάλο ευχαριστώ τόσο για την βοήθειά της καθ όλη τη διάρκεια της χρονιάς, όσο και για τις πολύτιμες εμπειρίες που απέκτησα από τη συνεργασία μας. Επιπλέον ευχαριστώ ιδιαίτερα την καθηγήτρια κ. Λάζου Αντιγόνη και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Μόσιαλο Γεώργιο για τη συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή καθώς και για τη βοήθειά τους κατά την εκπόνηση αυτής της εργασίας. Ακόμη, χρωστώ ένα ευχαριστώ στον λέκτορα κ. Βλαχονάσιο Κωνσταντίνο για την πολύτιμη βοήθειά του κατά τη διάρκεια αυτής της χρονιάς. Ταυτόχρονα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον λέκτορα γαστρεντερολογίας κ. Γερμανίδη Γιώργο για την συνεργασία μας και την ευγενική προσφορά των βιοψιών που χρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα εργασία, καθώς και την καθηγήτρια κ. Μουστάκα Μαρία για την προσφορά του ανάστροφου μικροσκοπίου. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον πιο στενό μου συνεργάτη καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας, τον μεταπτυχιακό φοιτητή Γιώργο Τιφτικίδη, για την άρτια συνεργασία μας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους υποψήφιους διδάκτορες Ιωάννα Βαλλιάνου, Μαυροματίδη Βασίλη, Παύλο Χάντουε και Αθανασία Κατσικάρη, όχι μόνο για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας, αλλά και για τις ατελείωτες, όμορφες ώρες που περάσαμε μαζί στο εργαστήριο. Επίσης, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην ερευνήτρια Έλενα Αγγελίδου και στην απόφοιτο του μεταπτυχιακού Ερμίνα Μασμανίδου, για τις χρήσιμες συμβουλές και την βοήθειά τους. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον πιο στενό μου συνεργάτη καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας, τον μεταπτυχιακό φοιτητή Γιώργο Τιφτικίδη, για την άρτια συνεργασία μας. Τέλος, ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και στους φίλους μου για την αμέριστη συμπαράστασή τους σε κάθε μου προσπάθεια. Ειλικρινά τους ευχαριστώ ιδιαίτερα

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Περίληψη Summary Εισαγωγή Ο πυρηνικός υποδοχέας των ηπατοκυττάρων HNF-4α α. Δομή του HNF-4α β. Ισομορφές και ιστολογική κατανομή του HNF-4α γ. Τρόπος δράσης του HNF-4α δ. Ο ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη ε. Ο ρόλος των HNF-1 & HNF-3 στην ανάπτυξη του ήπατος στ. Ο ρόλος του HNF-4α στο ενήλικο ήπαρ ζ. HNF-4α: ενορχηστρωτής της επιθηλιακής μορφογένεσης του αναπτυσσόμενου ήπατος η. Ο ρόλος των γονιδίων του HNF-4α, της E-καδερίνης και του Snail στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ΜicroRNAs α. Ανακάλυψη των micrornas β. Εξελικτική συντήρηση των micrornas γ. Γονιδιωματική οργάνωση δ. Βιογένεση των micrornas ε. Μηχανισμός δράσης i) Αναγνώριση του στόχου. 40 ii) Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στ. Υποκυτταρική οργάνωση ζ. Έκφραση των micrornas η. Ρύθμιση της έκφρασης των micrornas

5 2.2.θ. Έκφραση των micrornas στους ιούς ι. Λειτουργία των micrornas κ. micrornas και καρκίνος λ. Συσχέτιση των micrornas με τα CSCs μ. Το microrna mir Σκοπός της εργασίας Υλικά και Μέθοδοι Κυτταροκαλλιέργειες Διαμόλυνση κυτταρικών σειρών Ανάλυση της έκφρασης στο επίπεδο του mrna Ανάλυση της έκφρασης στο επίπεδο της πρωτεΐνης Αποτελέσματα Κυτταρική σειρά HepG Στελεχιαία ηπατοκαρκινικά κύτταρα Βιοψίες ανθρώπινου ηπατοκαρκινώματος Συζήτηση Βιβλιογραφία

6 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο πυρηνικός υποδοχέας των ηπατοκυττάρων HNF-4α (NR2A1) είναι ένα ορφανό μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, που παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυϊκά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Στους ενήλικες, εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, όπου ρυθμίζει την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια. Παίζει ρόλο-κλειδί στην μεταγραφική ρύθμιση ηπατοειδικών γονιδίων και στη ρύθμιση της έκφρασης ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων, κατέχοντας κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων. Οι μορφογενετικοί παράγοντες που βρίσκονται υπό τον έλεγχό του είναι απαραίτητοι για την κατάλληλη μορφολογία του ήπατος και για την οργάνωση του ηπατικού επιθηλίου. Μεταξύ αυτών η Ε-καδερίνη (Ε-cadherin), μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που συμμετέχει στο σχηματισμό των κυτταρικών συνδέσεων. Ανάλυση της αλληλουχίας των υποκινητών των δύο γονιδίων, HNF-4α και Ε-καδερίνη, αποκάλυψαν την ύπαρξη στους υποκινητές τους, μίας θέσης σύνδεσης για το μεταγραφικό παράγοντα Snail, ο οποίος ασκεί κατασταλτική δράση στη μεταγραφή των γονιδίων της Ε-καδερίνης και του HNF-4α. Τα micrornas (mirnas) είναι μικρά μονόκλωνα RNAs, με μήκος νουκλεοτίδια τα οποία μεταγράφονται από DNA και δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνη αλλά ρυθμίζουν την έκφραση άλλων γονιδίων, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, είτε μέσω αλληλεπίδρασης με τη μηχανή της πρωτεϊνοσύνθεσης είτε μέσω αποικοδόμησης mrna-στόχων. Αυτά τα υψηλά συντηρημένα μόρια RNA κωδικοποιούνται από ζώα, φυτά και ιούς. Κατέχουν ρόλο-κλειδί στη ρύθμιση της ανάπτυξης, στην κυτταρική διαφοροποίηση, στην απόπτωση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην οργανογένεση. Το microrna mir-24 μπορεί να προκύψει στα θηλαστικά από δύο διαφορετικές γονιδιακές θέσεις. Έχει συσχετιστεί με την κυτταρική διαφοροποίηση καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στην διαφοροποίηση των κυττάρων του αίματος και επάγει την διαφοροποίηση των μυοβλαστών. Επίσης ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Επίσης, σύμφωνα με παλαιότερα δεδομένα του εργαστηρίου μας το mir- 24 προσδένεται στην περιοχή bp της 3 UTR του mrna του HNF-4α. Ο ηπατοκυτταρικός καρκίνος είναι μία από τις πιο επικρατείς κακοήθειες και αιτίες θανάτου στον κόσμο, με κυριότερους παράγοντες κινδύνου τις χρόνιες ηπατίτιδες Β και C, καθώς και την παρατεταμένη έκθεση σε ηπατοκαρκινογόνα. Αποτελείται από ετερογενείς - 6 -

7 κυτταρικούς πληθυσμούς με την ικανότητα σχηματισμού όγκων να αποδίδεται σε μία μόνο κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (cancer stem cells). Το ηπατοκαρκίνωμα εξελισσόμενο περνά από μία καλά διαφοροποιημένη κατάσταση σε μία λιγότερο διαφοροποιημένη κατάσταση, διαδικασία που χαρακτηρίζεται από μείωση της κυτταρικής διαφοροποίησης, απώλεια της έκφρασης ηπατοειδικών γονιδίων και ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων (HNFs), αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, απώλεια της επιθηλιακής μορφολογίας, αυξημένη διεισδυτικότητα και εν τέλει μετάσταση του όγκου (ΕΜΤ μετάβαση). Η έκφραση του γονιδίου του Snail αυξάνεται σημαντικά κατά την αποδιαφοροποίηση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και αυτή η υπερέκφραση συνδέεται με τη μείωση της έκφρασης της Ε-καδερίνης. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του ρόλου του mir-24 και του HNF-4α στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Για να επιτευχθεί αυτό, πραγματοποιήθηκε ανάστροφη διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2 με το pre-mir24, με σκοπό την αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mir-24. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης του mir-24 στην κυτταρική αύξηση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης των HepG2 κυττάρων. Διαπιστώθηκε πως η υπερέκφραση του mir-24 οδηγεί σε αυξημένο ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού, σε αλλαγή στην μορφολογία των κυττάρων, σε μείωση της έκφρασης του γονιδίου του HNF- 4α, σε μείωση της έκφρασης του γονιδίου της E-cadherin και σε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου του Snail, υποδεικνύοντας ογκογονική δράση του συγκεκριμένου microrna στα HepG2. Επίσης, διερευνήθηκε η έκφραση, με τη χρήση της real-time RT-PCR, του γονιδίου του HNF-4α και του γονιδίου του Snail, σε έναν υποπληθυσμό των HepG2, στα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (Cancer Stem Cells). Καθώς αυτά τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από έναν πιο επιθετικό φαινότυπο, παρατηρήθηκαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Snail, συγκριτικά με τα HepG2 κύτταρα. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση τριών ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων, των HNF1α, HNF3β & HNF4α, σε 27 δείγματα ανθρώπινων ηπατοκαρκινικών βιοψιών και 8 δείγματα παρακείμενου φυσιολογικού ηπατικού ιστού. Παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης και των τριών γονιδίων σε 17 εκ των 27 ηπατοκαρκινικών δειγμάτων σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν πιθανό ρόλο του mir-24 στην πρόοδο του ηπατοκυτταρικού καρκίνου, το οποίο πιθανώς ασκεί τη δράση του μέσω καταστολής της έκφρασης του καθοδικού του στόχου, HNF-4α

8 SUMMARY Hepatocyte nuclear factor 4α (NR2A1) is an orphan member of the nuclear receptor superfamily, which has an important role in activation of transcription from the early embryonic development till maturity. In adults, it is mainly expressed in the liver where it regulates the expression of a large number of genes which participate in diverse metabolic pathways. HNF-4α is essential for the transcriptional activation of many hepatocyte specific genes and for regulating the expression of hepatocyte transcription factors, thereby having an essential role in hepatocytes differentiation. Furthermore, HNF-4α is responsible for the generation of the hepatic epithelium, through regulation of the expression of various morphogenetic factors, such as E-cadherin a transmembrane protein which participates in the formation of cellular junctions. Both, HNF-4α & E-cadherin, have in their promoters, a binding site for the transcription factor, Snail. micrornas (mirnas) are small, monoclonal RNAs, nucleotides long, which are transcribed by DNA but instead of producing a protein, they regulate the expression of other protein encoding genes. This regulation is achieved either by translational repression or by mrna degradation. They are transcribed from the genome of plants, animals and viruses and they are highly conserved. MicroRNAs play important roles in regulating development, cellular differentiation, apoptosis, cellular proliferation and organogenesis. In mammals, microrna mir-24, can be transcribed from two different genes. It seems to have an essential role in haematopoetic differentiation and in myoblast differentiation. Moreover, it regulates the expression of genes involved in cell cycle regulation and cell proliferation. According to previous results of our lab, mir-24 has a binding site in the 3 -UTR of HNF-4α mrna. Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly malignant tumor and one of the most common death causes worldwide, with chronic hepatitis B & C infection and prolonged exposure to hepatocarcinogens, being the main risk factors. HCC is comprised of various cellular types, among which only cancer stem cells are capable of producing tumors. HCC progression from a well-differentiated to a less differentiated form, is accompanied by a decrease in differentiation, an extinction of tissue-specific gene expression (HNFs), acceleration of cell proliferation, loss of epithelial morphology, increased invasiveness and ultimately metastasis (EMT transition). Snail has been shown to be greatly upregulated - 8 -

9 during dedifferentiation of HCC, while this upregulation is inversely correlated with the expression of E-cadherin. This project intended to study the potential role of mir-24 and HNF-4α in hepatocellular carcinoma. In order to achieve that goal, the HepG2 cell line was transfected with pre-mir24 molecule, so as to upregulate the expression level of mir-24. Then, the effect of that upregulation on cell proliferation and cell migration, was assessed. It was shown that mir-24 upregulation induced cell proliferation, causing changes in cell morphology in addition to downregulating HNF-4α, E-cadherin, and upregulating Snail, suggesting that mir-24 might act as an oncomir in HepG2 cell line. Furthermore the expression levels of HNF-4α and Snail, in cancer stem cells (CSCs) derived from HepG2 cell line, was studied. CSCs are characterized by a more aggressive phenotype and as such CSCs from HepG2 showed lower HNF-4α expression levels and higher Snail expression levels. Finally, it was studied the expression of hepatocyte nuclear factors HNF1α, HNF3β & HNF4α, in 27 biopsies of human hepatocellular carcinoma and 8 biopsies of adjacent liver tissue. It was noticed a downregulation in 17 out of 27 samples. These results suggest a possible role of mir-24 in HCC pprogression, propably by repressing HNF-4α expression

10 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1. Ο πυρηνικός υποδοχέας των ηπατοκυττάρων HNF-4α Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι ενεργοποιούνται από συνδέτες και ρυθμίζουν μία πληθώρα διαφορετικών φυσιολογικών διαδικασιών, όπως η αναπαραγωγή, η ανάπτυξη και ο μεταβολισμός. Η πρόσδεση των συνδετών προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση των υποδοχέων, οι οποίοι διαχωρίζονται από τους συγκαταστολείς τους και στρατολογούν συνενεργοποιητές ώστε να ενισχύσουν τη μεταγραφική δραστηριότητά τους. Στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων περιλαμβάνονται οι υποδοχείς για τις στεροειδείς ορμόνες, τα ρετινοειδή, τη βιταμίνη D3, τη θυρεοειδή ορμόνη και τα λιπαρά οξέα (Lee et al., 1993b). Ο πυρηνικός υποδοχέας των ηπατοκυττάρων HNF-4α (NR2A1) αποτελεί μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, αλλά κατέχει ιδιότητες οι οποίες είναι αρκετά διαφορετικές από τις ιδιότητες των υπολοίπων πρωτεϊνών αυτής της υπεροικογένειας. Ο HNF-4α είναι ένας αυτόνομος ενεργοποιητής της μεταγραφής, καθώς μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή γονιδίων-στόχων απουσία κάποιου εξωτερικού συνδέτη και για αυτό το λόγο θεωρείται ένα ορφανό μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων (Ruse et al., 2002), δημιουργώντας μία μοναδική υποοικογένεια της ευρύτερης υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων (Gonzalez, 2008). Ο HNF-4α ανήκει στην υποοικογένεια 2Α, η οποία περιλαμβάνει επίσης άλλα δύο μέλη, τον υποδοχέα HNF4β, που έχει ταυτοποιηθεί στον βάτραχο Xenopus και τον υποδοχέα HNF4γ, που έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο (Ryffel, 2001). Αρχικά απομονώθηκε σε κυτταρικά εκχυλίσματα ήπατος ποντικού, ως μία πρωτεΐνη σύνδεσης στον προαγωγέα των γονιδίων της τρανσθυρετίνης και της απολιποπρωτεΐνης CIII (Gonzalez, 2008). Πρόκειται για έναν μεταγραφικό παράγοντα που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ καθώς επίσης και στους νεφρούς, στο πάγκρεας, στο έντερο, στο στομάχι και στο δέρμα. Ρυθμίζει την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της γλυκόζης, της χοληστερόλης και των λιπαρών οξέων, ενώ παράλληλα ελέγχει καθοριστικές λειτουργίες για την διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων και τη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου (Lee et al.,1993b, Aggelidou et al., 2004, Iordanidou et al., 2005)

11 2.1.α. Δομή του HNF-4α: Ως μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, ο HNF-4α παρουσιάζει την τυπική δομή των πυρηνικών υποδοχέων και αποτελείται από 6 λειτουργικά διακριτές περιοχές, τις A, B, C, D, E & F (Eικόνα 1) (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Εικόνα 1: Σχηματική απεικόνιση των λειτουργικών περιοχών του HNF-4. Δύο περιοχές ενεργοποίησης της μεταγραφής (AF-1 & AF-2) και μία αρνητική ρυθμιστική περιοχή (NRD), δηλώνονται πάνω από τον υποδοχέα. Οι δύο προτεινόμενες αμφιπαθείς α-έλικες στις περιοχές AF-1 & AF-2 απεικονίζονται ως ελικοειδή τιμόνια (ή τροχοί). Οι αριθμοί υποδηλώνουν τα αμινοξέα (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η Α/Β περιοχή εκτείνεται στα αμινοξέα 1-24 και περιλαμβάνει την, μη εξαρτώμενη από τον συνδέτη, περιοχή ενεργοποίησης AF-1, η οποία πιστεύεται πως υιοθετεί μία α- αμφιπαθή ελικοειδή δομή. Η AF-1 περιοχή έχει 5 αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα στην αλληλουχία της, των οποίων το φορτίο και η θέση στην αλληλουχία, φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της μεταγραφικής ενεργότητας του HNF- 4α. Μελέτες έχουν δείξει πως είτε μείωση του αρνητικού φορτίου, είτε μετάλλαξη των κρίσιμων αυτών αμινοξέων με άλλα, συνδέεται με σημαντική μείωση της ενεργοποίησης του HNF-4α (Kistanova et al., 2001). Αναγκαία επίσης για τη λειτουργία της AF-1 περιοχής είναι κάποια ογκώδη και υδροφοβικά αμινοξέα, όπως τα κατάλοιπα τυροσίνης στις θέσεις 6 & 14 και τα κατάλοιπα λευκίνης στις θέσεις 10 & 17 (Kistanova et al., 2001, Green et al., 1998). Η απουσία της περιοχής AF-1 έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της μεταγραφικής ενεργοποίησης κατά 50% (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997)

12 Η περιοχή C αποτελεί μία εξελικτικά συντηρημένη περιοχή μεταξύ των πυρηνικών υποδοχέων. Αντιστοιχεί στην περιοχή δέσμευσης στο DNA (DNA-binding domain, DBD) και ορίζεται μεταξύ των αμινοξέων Αυτή η περιοχή αποτελείται από 2 δακτύλιους ψευδαργύρου, ακολουθούμενη από μία καρβοξυτελική προέκταση 8 αμινοξέων (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Στη βάση του πρώτου δακτυλίου ψευδαργύρου εντοπίζεται το Ρ-πλαίσιο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση του στοιχείου απόκρισης στο DNA του HNF-4α. Σε αυτό το πλαίσιο εντοπίζεται μία αμινοξική ακολουθία, η DGCKG, η οποία είναι μοναδική σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων (Sladek et al., 1990). Η αλληλουχία σύνδεσης του HNF-4α στο DNA, η οποία είναι γνωστή με τον όρο στοιχείο απόκρισης στην ορμόνη (HRE/Hormone Response Element) (Mangelsdorf and Evans, 1995, Jiang and Sladek, 1997), αποτελείται από δύο ευθείες επαναλήψεις, με αλληλουχία {G/AGGT/CCA} ή {AGG/TT/CCA}, οι οποίες διαχωρίζονται συνήθως από ένα νουκλεοτίδιο (DR1= direct repeats 1) (Jiang and Sladek, 1997). Η περιοχή D είναι ένας ευέλικτος σύνδεσμος, μεταξύ των περιοχών πρόσδεσης στο DNA και πρόσδεσης του συνδέτη (Ε περιοχή), που δίνει τη δυνατότητα στις περιοχές C & E να περιστρέφονται ώστε να συνδεθούν στις ευθείες επαναλήψεις του DNA, κατά τον ομοδιμερισμό των υποδοχέων. Συμμετέχει όμως και αυτή στη μεταγραφική ενεργοποίηση, καθώς δείχθηκε πως είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ενεργότητας της περιοχής ενεργοποίησης AF-2. Προοδευτική εξάλειψη της D περιοχής έχει ως αποτέλεσμα τη σταδιακή μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4α, ενώ η πλήρης απαλοιφή της οδηγεί σε απώλεια της ικανότητας ενεργοποίησης του υποδοχέα (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η περιοχή Ε είναι μία περίπλοκη λειτουργικά περιοχή, καθώς περιλαμβάνει την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (LBD, Ligand Binding Domain), την επιφάνεια ομοδιμερισμού και την, εξαρτώμενη από τον συνδέτη, περιοχή ενεργοποίησης 2 ( AF-2, Activation Factor 2). Η AF-2 περιοχή περιλαμβάνει τα αμινοξέα (Aggelidou et al., 2004). Στο καρβοξυτελικό της άκρο εντοπίζεται μία περιοχή ενεργοποίησης, η AF-2 AD, η οποία περιέχει το εξελικτικά συντηρημένο μοτίβο ΦΦΧΕΦΦ, που διαμεσολαβεί στις αλληλεπιδράσεις του υποδοχέα με τους συνενεργοποιητές της μεταγραφής. Το φ αντιπροσωπεύει ένα υδρόφοβο αμινοξύ, το Χ ένα μη συντηρημένο αμινοξύ και το Ε το γλουταμινικό οξύ. Το γλουταμινικό οξύ εντοπίζεται στη θέση 363 και είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς η μετάλλαξή του σε λυσίνη, οδηγεί σε μεταγραφικά ανενεργό HNF-4α

13 Επίσης, παρόλο που ο HNF-4α είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής της μεταγραφής, στη θέση 366 έχει μία λευκίνη, όπως οι πυρηνικοί υποδοχείς ARP-1, EAR-2, και EAR-3, οι οποίοι είναι αρνητικοί ρυθμιστές της μεταγραφής. Αντίθετα, οι πυρηνικοί υποδοχείς RAR, RXR και TR στην αντίστοιχη θέση έχουν ένα γλουταμινικό οξύ το οποίο είναι σημαντικό για την ενεργοποίηση παρουσία συνενεργοποιητών. Μετάλλαξη της λευκίνης στη θέση 366 σε γλουταμινικό οξύ οδήγησε σε απαλοιφή της μεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4α, υποδηλώνοντας πως η AF-2 AD περιοχή του HNF-4α μπορεί να αλληλεπιδρά, με διαφορετικούς συνενεργοποιητές από τους πυρηνικούς υποδοχείς RAR, RXR και TR (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Όσον αφορά στην κρυσταλλική της δομή, η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη αποτελείται από 10 αντιπαράλληλες α-έλικες (α1-α12) και 2 β-ελάσματα (β1-β2) και έχει τη διαμόρφωση του «σάντουϊτς», δομή κοινή για τις LBDs των πυρηνικών υποδοχέων. Αντίθετα, με τους άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, η α2 έλικα απουσιάζει από την LBD του HNF-4α, ενώ η α-6 σχηματίζει μια ελικοειδή στροφή. Οι α-έλικες, α3, α5, α7 και α10, και τα 2 β-ελάσματα σχηματίζουν την υδρόφοβη θέση πρόσδεσης του συνδέτη (Dhe-Paganon et al., 2002). Η επιφάνεια ομοδιμερισμού περιλαμβάνει τα αμινοξέα και σχηματίζεται κυρίως από την α-έλικα Η10 και σε μικρότερο βαθμό από την H9 και από το βρόχο μεταξύ των α-ελικών Η7 & Η8 (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Ο HNF-4α είναι ένα ορφανό μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, για τον οποίο δεν έχει αναγνωριστεί κάποιος συνδέτης. Ωστόσο, δομικές μελέτες έχουν αποκαλύψει την ύπαρξη, στην περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη του υποδοχέα, λιπαρών οξέων. Όμως, προσπάθειες ανταλλαγής αυτών των ενδογενών λιπαρών οξέων με ραδιοσημασμένα λιπαρά οξέα, όπως το παλμιτικό οξύ, ήταν ανεπιτυχείς υποδεικνύοντας πως τα λιπαρά οξέα ενσωματώνονται στην περιοχή πρόσδεσης, κατά την αναδίπλωση της πρωτεΐνης, μετα-μεταφραστικά, δρώντας ως δομικοί συμπαράγοντες και βοηθώντας την πρωτεΐνη να αποκτήσει τη σωστή διαμόρφωση (Dhe-Paganon et al., 2002, Gonzalez, 2008). Άρα, φαίνεται πως ο HNF-4α ενεργοποιεί τη μεταγραφή με τρόπο που δεν εξαρτάται από την πρόσδεση ενός συνδέτη. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η α-έλικα Η12 (που αντιστοιχεί στην AF-2 περιοχή), η οποία στο ομοδιμερές του υποδοχέα, απουσία προσδέτη, προσλαμβάνει δύο διαμορφώσεις, την ανοικτή και την κλειστή. Στην ανοικτή η α-έλικα Η12, βρίσκεται μακριά από τον πυρήνα της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη, ενώ στην κλειστή βρίσκεται προς το σώμα του υποδοχέα, ασφαλίζοντας την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη. Τα λιπαρά οξέα προσδένονται τόσο στην ανοικτή όσο και στην

14 κλειστή διαμόρφωση και ο υποδοχέας ενεργοποιεί τη μεταγραφή (Dhe-Paganon et al., 2002). Δομικές μελέτες της διαμόρφωσης της LBD περιοχής παρουσία του συνενεργοποιητή SRC-1, έδειξαν ότι η παρουσία τόσο των λιπαρών οξέων, όσο και του συνενεργοποιητή είναι απαραίτητη ώστε και τα δύο μόρια του ομοδιμερούς του υποδοχέα να προσλάβουν την κλειστή διαμόρφωση και οδηγούν σε περαιτέρω αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας (Εικόνα 2) (Duda et al., 2004). Εικόνα 2: Δομή της περιοχής πρόσδεσης συνδέτη του HNF-4α, παρουσία και απουσία συνενεργοποιητή. Αριστερά: Δομή του ομοδιμερούς του υποδοχέα του HNF-4α, με τα μόρια των λιπαρών οξέων και στην ανοικτή και στην κλειστή διαμόρφωση. Δεξιά: Δομή του ομοδιμερούς του υποδοχέα HNF-4α παρουσία των λιπαρών οξέων και του συνενεργοποιητή, στην κλειστή /ενεργή διαμόρφωση (Duda et al., 2004). Η περιοχή F προσδίδει ένα μοναδικό χαρακτηριστικό στον μεταγραφικό παράγοντα HNF-4α μεταξύ των πυρηνικών υποδοχέων, καθώς ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποίησή του, μέσω καταστολής της δράσης της AF-2 AD περιοχής. Παρόμοια δράση δεν έχει περιγραφεί για κανέναν από τους πυρηνικούς υποδοχείς. Μάλιστα, αρχικά είχε προταθεί πως η περιοχή F θα μπορούσε να είναι ενεργοποιητής της μεταγραφής, λόγω της υψηλής συγκέντρωσής της σε κατάλοιπα προλίνης. Πιστεύεται πως η περιοχή F, είτε μόνη της είτε σε συνεργασία με άλλες πρωτεΐνες, καλύπτει κάποια κρίσιμα αμινοξέα της περιοχής AF-2 AD, ασκώντας έτσι την κατασταλτική της δράση. Κάτι τέτοιο είναι εφικτό λόγω της εγγύτητας των 2 περιοχών και λόγω της σημαντικότητας της περιοχής AF-2 AD για την λειτουργία της περιοχής AF-2. Ακόμη και μερική επικάλυψη της περιοχής είναι αρκετή για την απώλεια της μεταγραφικής ενεργότητας του HNF-4α. Εξάλειψη της F περιοχής, έχει σαν αποτέλεσμα την πλήρη συνεργασία των 2 περιοχών ενεργοποίησης του HNF-4α, AF-1 και AF-2, στην περίπτωση του προαγωγέα του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης Β. Η καταστολή

15 της κατασταλτικής δράσης της περιοχής F, είναι δυνατή με πρωτεόλυση, με καταστροφή της αλληλεπίδρασής της με άλλες πρωτεΐνες, με αλλαγές στη διαμόρφωση μέσω μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων, ή με πρόσδεση του συνδέτη (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). 2.1.β. Ισομορφές και ιστολογική κατανομή του HNF-4α: Το γονίδιο του HNF-4α συμβολίζεται ως TCF14 και στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 20 ου χρωμοσώματος και συγκεκριμένα στη θέση 20q q13.2, μεταξύ των γονιδίων PLCG1 & G20S17 (Argyrokastritsis et al., 1997). Aποτελείται από 12 εξώνια και έχει μέγεθος 30kb (Furuta et al., 1997). Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό που παρουσιάζει σε σχέση με άλλους πυρηνικούς υποδοχείς είναι ότι ο δεύτερος δακτύλιος ψευδαργύρου κωδικοποιείται από 2 εξώνια, ενώ συνήθως υπάρχει μόνο ένα εξώνιο για κάθε δακτύλιο (Taraviras et al., 1994). Το γονίδιο του HNF-4α κωδικοποιεί 9 διαφορετικές ισομορφές, οι οποίες προέρχονται είτε από τη χρήση διαφορετικού υποκινητή (Ρ1 & Ρ2), είτε από εναλλακτικό μάτισμα (Εικόνα 3). Ο υποκινητής Ρ1 κωδικοποιεί 6 διαφορετικές ισομορφές (α1-α6), οι οποίες περιέχουν το εξώνιο 1A ενώ ο υποκινητής Ρ2 κωδικοποιεί 3 διαφορετικές ισομορφές (α7-α9), οι οποίες περιέχουν ως πρώτο εξώνιο, το εναλλακτικό εξώνιο 1D, και ως αποτέλεσμα έχουν μία μικρότερη αμινοτελική ακολουθία (Eeckhoute et al., 2003). Εικόνα 3: Σχηματική αναπαράσταση του γονιδίου HNF-4α. Τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τους 2 υποκινητές Ρ1 & Ρ2, ενώ το 1D και το 1Α αντιπροσωπεύουν τα πρώτα αμινοξέα των 2 υποκινητών (Eeckhoute et al., 2003)

16 Η ισομορφή α2 περιέχει ένα μεγαλύτερο εξώνιο 9, οδηγώντας σε μία ένθεση 10 αμινοξέων στην πλούσια σε κατάλοιπα προλίνης καρβοξυτελική περιοχή, και έχει βρεθεί στον αρουραίο, στο ποντίκι και στον άνθρωπο. Η ισομορφή α3 που αρχικά αναφέρονταν ως HNF-4C, έχει βρεθεί στο ανθρώπινο ήπαρ και χαρακτηρίζεται από μία εντελώς διακριτή καρβοξυτελική περιοχή, καθώς δεν περιλαμβάνει τα εξώνια 9 & 10. Η ισομορφή α4 έχει αναγνωριστεί στο ανθρώπινο ήπαρ και στο ανθρώπινο νεφρό και περιέχει στην αμινοτελική περιοχή (Α/Β περιοχή) 2 επιπλέον εξώνια τα 1B and 1C. Το 5 ο εναλλακτικό μετάγραφο α5 περιέχει τα εξώνια 1B and 1C, που βρίσκονται στην ισομορφή α4, αλλά φέρει και το μεγαλύτερο εξώνιο 9 που βρίσκεται στην ισομορφή α2. Το μετάγραφο α6 περιέχει τα εξώνια 1B και 1C, μαζί με την ελλιπή καρβοξυτελική περιοχή που συναντάται στην ισομορφή α3 (Nakhei et al., 1997). Η πρωτεΐνη που προκύπτει από την ισομορφή α7, έχει ίδια αμινοξική ακολουθία με την ισομορφή α1, με εξαίρεση τα αμινοξέα που κωδικοποιούνται από το πρώτο εξώνιο, καθώς προκύπτει από τη χρήση διαφορετικού υποκινητή (Ρ2), με αποτέλεσμα να απουσιάζει από την πρωτεΐνη αυτή η περιοχή ενεργοποίησης AF-1. Το 2 ο μετάγραφο που προκύπτει από τον υποκινητή Ρ2, η ισομορφή α8, έχει πρώτο εξώνιο το 1D, αλλά περιέχει και το μεγαλύτερο εξώνιο 9, έχοντας κατ επέκταση μία μεγαλύτερη F περιοχή. Τέλος, η ισομορφή α9, όπως και η ισομορφή α3, περιέχει την ελλιπή καρβοξυτελική περιοχή (Harries et al., 2008) (Εικόνα 4). Εικόνα 4: Οι ισομορφές του HNF-4α γονιδίου. Τα εναλλακτικά εξώνια δίνονται με ανοιχτό γκρι χρώμα, ενώ η ένθεση 10 αμινοξέων του εξωνίου 9 που συναντάται στις ισομορφές α2, α5 και α8, απεικονίζεται με μαύρο χρώμα. Η ιντρονική αλληλουχία που περιλαμβάνεται στις ισομορφές α3, α6 και α9 απεικονίζεται με τα διαγραμμισμένα κουτάκια (Harries et al., 2008)

17 Η ύπαρξη εναλλακτικών μεταγράφων δεν περιορίζεται στο γονίδιο του HNF-4α, καθώς σχεδόν κάθε πυρηνικός υποδοχέας υπόκειται σε φαινόμενα εναλλακτικής συρραφής, αλλά κυρίως στην 5 -περιοχή του γονιδίου του. Ωστόσο η εναλλακτική συρραφή στο 3 -άκρο, είναι ένα μοναδικό γεγονός που συναντάται μόνο στον HNF-4α. Tο φαινόμενο του εναλλακτικού ματίσματος στον HNF4α είναι διατηρημένο μεταξύ των ειδών, καθώς πολλές HNF4α ισομορφές, ως προς τις A/B & F περιοχές, έχουν βρεθεί στο κουνούπι και στο μεταξοσκώληκα (Sladek and Seidel, 2001). Όσον αφορά στην ιστολογική κατανομή των ισομορφών, οι α1-α6 εκφράζονται στο ήπαρ, στο νεφρό και στο έντερο, ενώ οι ισομορφές που προκύπτουν από τον Ρ2 υποκινητή, εκφράζονται στο έντερο, στο στομάχι και στα β-κύτταρα του παγκρέατος αλλά όχι στο ώριμο ήπαρ και στο νεφρό (Xie et al., 2003). Η κατάσταση είναι πιο περιπλεγμένη, όσον αφορά στα β-κύτταρα του παγκρέατος. Παρόλο που υπάρχουν 2 αναφορές που αναφέρουν απουσία των Ρ1 ισομορφών στα κύτταρα αυτά (Thomas et al., 2001, Hansen et al., 2002), υπάρχει μία αναφορά που υποστηρίζει το αντίθετο (Eeckhoute et al., 2003). Παρόλα αυτά η μοναδική μελέτη που εξέτασε την παρουσία των ισομορφών του HNF-4α σε πρωτεϊνικό επίπεδο, ανίχνευσε μόνο Ρ2 ισομορφές στο ώριμο πάγκρεας (Tanaka et al., 2006). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ισομορφή α7 για την οποία αρχικά πιστευόταν πως είναι η μόνη ισομορφή η οποία ανιχνεύται στο πάγκρεας, ως προιόν της εναλλακτικής χρήσης του υποκινητή Ρ2, ωστόσο βρέθηκε πως αυτή η ισομορφή εκφράζεται νωρίτερα κατά την ανάπτυξη, σε σχέση με την ισομορφή α1, στο εμβρυικό ήπαρ (Nakhei et al., 1998). Οι διάφορες ισομορφές διαφέρουν επίσης και ως προς την ικανότητά τους να ενεργοποιούν την μεταγραφή. Συγκεκριμένα, οι α1 και α2 που είναι οι κυριότερες ισομορφές στο νεφρό και στο ήπαρ όλων των θηλαστικών, φαίνεται να έχουν μία μικρή διαφοροποίηση ως προς την ικανότητα ενεργοποίησης, σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Sladek et al., 1999). Επίσης, η ισομορφή α7, χαρακτηρίζεται από πολύ μειωμένη μεταγραφική ενεργότητα, καθώς δεν περιέχει την περιοχή ενεργοποίησης AF-1 (Torres- Padilla et al., 2002), η οποία δρα συνεργειακά με την περιοχή ενεργοποίησης AF-2, για τη ρύθμιση της μεταγραφής από τον HNF-4α (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997)

18 2.1.γ. Τρόπος δράσης του HNF-4α: O HNF-4α συνδέεται σε ευθείες επαναλήψεις στο DNA των υποκινητών των γονιδίων-στόχων ως ομοδιμερές, ακόμη κι αν έχει έλλειψη εμφανούς δυαδικής συμμετρίας (Jiang and Sladek, 1997, Sladek et al., 1990). Η πλήρης ενεργοποίηση του HNF-4α επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασής του με το DNA και τους συνενεργοποιητές. Η γονιδιακή ενεργοποίηση συνδέεται με την ύπαρξη χαλαρούς δομής χρωματίνης, ώστε να καταστούν προσβάσιμες οι ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων στην μεταγραφική μηχανή, οδηγώντας σε επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης. Η χαλαρή δομή της χρωματίνης διευκολύνεται από την ακετυλίωση και μεθυλίωση των αμινοτελικών άκρων των ιστονών, μέσω στρατολόγησης των ακετυλοτρανσφερασών ή μεθυλοτρανσφερασών, αντίστοιχα. Ενζυμική δράση ακετυλοτρανσφερασών ή/και μεθυλοτρανσφερασών φαίνεται πως έχουν πολλοί συνενεργοποιητές, οι οποίοι αλληλεπιδρούν με τις AF-1 & AF-2 περιοχές ενεργοποίησης των πυρηνικών υποδοχέων και συντελούν έτσι στην ενίσχυση της μεταγραφικής ενεργοποίησης (Torres-Padilla et al., 2002). Αυτοί οι συνενεργοποιητές αλληλεπιδρούν με το μοτίβο ΦΦΧΕΦΦ της AF-2 περιοχής του πυρηνικού υποδοχέα, μέσω του μοτίβου αμινοξέων LXXLL (όπου L η λευκίνη και Χ οποιοδήποτε αμινοξύ) (Duda et al., 2004). Ο υποδοχέας HNF-4α αλληλεπιδρά με πολλούς συνενεργοποιητές, in vivo & in vitro, συμπεριλαμβανομένων των GRIP1, SRC-1, και CBP, τόσο σε κύτταρα θηλαστικών όσο και σε κύτταρα ζύμης (Russe et al., 2002, Dell and Hadzopoulou-Cladaras, 1999). Το p300 μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως συνενεργοποιητής του HNF4α, και η συνεργασία του με τον SRC-1, ενισχύει τη μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α (Wang et al., 1998). Ο HNF-4α ρυθμίζει την μεταγραφή του κυτοχρώματος P450, μέσω αλληλεπίδρασης με τους συμπαράγοντες PGC1α & SRC1 (Martinez-Jimenez et al. 2006, Duda et al., 2004). Πρόσφατα ανακαλύφθηκε πως ο HNF-4α απαιτεί, για την ρύθμιση γονιδίων τα οποία εμπλέκονται στο μεταβολισμό λιπιδίων και φαρμάκων, την υπομονάδα 25 του Mediator complex (Med25), αλληλεπίδραση η οποία είναι απαραίτητη για την συσχέτιση του με τον συμπαράγοντα Mediator, ο οποίος είναι απαραίτητος για την στρατολόγηση της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Η πρωτεΐνη Med25, ρυθμίζει τη μεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α, μέσω αλλαγής της ανενεργούς κατάστασης, του προσδεδεμένου στον HNF-4α μεταγραφικού συμπλόκου, στην ενεργό κατάσταση (Rana et al., 2010)

19 Αντίθετα, η γονιδιακή καταστολή συνδέεται με τη στρατολόγηση των αποακετυλασών των ιστονών, οι οποίες απομακρύνουν τις ακετυλο ομάδες από τις ιστόνες, οδηγώντας στην επανασυμπύκνωση της χρωματίνης. Η καταστολή επιτυγχάνεται με στρατολόγηση των συγκαταστολέων από τους πυρηνικούς υποδοχείς (Torres-Padilla et al., 2002). Ο HNF-4α αλληλεπιδρά in vitro με τον συγκαταστολέα SMRT, ο οποίος έχει δειχθεί πως καταστέλλει την μεταγραφική ενεργοποίηση από τον HNF-4α in vivo (Ruse et al., 2002). Η ρύθμιση της ενεργότητας των πυρηνικών υποδοχέων από συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς, εξηγεί την δυνατότητα ενεργοποίησης διαφορετικών μεταγραφικών διαδικασιών, δυνατότητα η οποία εξαρτάται από τα επίπεδα των ρυθμιστικών αυτών μορίων και την έκφρασή τους ή όχι σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους (Duda et al., 2004, Torres-Padilla et al., 2002). Ο HNF-4α πέραν της αλληλεπίδρασης με συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς για την αποτελεσματική ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής, συνεργάζεται και με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες. Ο HNF4α ρυθμίζει τα γονίδια-στόχους, αλληλεπιδρώντας με τις αλληλουχίες σύνδεσης στο DNA του υποκινητή τους. Ωστόσο, η ύπαρξη αυτών των θέσεων σύνδεσης δεν σημαίνει ότι τα γονίδια αυτά βρίσκονται υπό τον αποκλειστικό έλεγχο του HNF-4α, καθώς και άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο COUP-TF, ο PPAR, ο RXR, ο PXR, ο GATA4 & ο GATA6 μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αυτές τις αλληλουχίες (Gonzalez, 2008, Ryffel, 2001). 2.1.δ. Ο ρόλος του HNF-4α στην ανάπτυξη: Ο HNF-4α διαδραματίζει σημαντικό ρολό στην ανάπτυξη, καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώιμα εμβρυϊκά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Το mrna του ανιχνεύεται την ημέρα 4.5 στο πρώιμο ενδόδερμα, από το οποίο θα προκύψει το κοιλιακό ενδόδερμα. Το κοιλιακό ενδόδερμα είναι ένας εξωεμβρυϊκός ιστός που βρίσκεται στο λεκιθικό σάκο. Στο λεκιθικό σάκο, εκφράζονται πολλά από τα γονίδια που εκφράζονται και στο ήπαρ, συμπεριλαμβανομένου και του HNF-1α, ενός μεταγραφικού παράγοντα που επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση του ήπατος. Από την ημέρα 5.5 έως 8.5 της εμβρυικής ανάπτυξης, ο HNF-4α εκφράζεται κυρίως στα κιονοειδή κοιλιακά ενδοδερμικά κύτταρα του λεκιθικού σάκου. Παρόλο που το mrna

20 του HNF-4α ανιχνεύεται στους εξωεμβρυϊκούς ιστούς πολύ νωρίς, στους εμβρυϊκούς ιστούς δεν εμφανίζεται παρά την 8.5 ημέρα, στο ήπαρ και στο οπίσθιο μέρος του εντέρου. Η εμφάνισή του συμπίπτει με τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων και την έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, όπως η αλβουμίνη και η α-εμβρυϊκή πρωτεΐνη. Αυτά τα γονίδια δεν ενεργοποιούνται απευθείας από τον HNF-4α, αλλά η ενεργοποίηση της μεταγραφής τους εξαρτάται από τον HNF-1α, ο οποίος αποτελεί στόχο για τον HNF-4α. Την εμβρυϊκή μέρα 9.5, η έκφραση του HNF-4α αυξάνεται σημαντικά στο ήπαρ καθώς και στο μεσαίο τμήμα του εντέρου, από όπου θα προκύψουν το πάγκρεας και η χοληδόχος κύστη. Την 10.5 ημέρα το mrna του HNF-4α ανιχνεύεται στο στομάχι και στα μεσονεφρικά σωληνάρια, από όπου θα προκύψει ο φλοιός του νεφρού, ιστός στον οποίο ο HNF-4α εκφράζεται στον ενήλικο οργανισμό. Κατά την ημέρα 13.5, η έκφραση του HNF-4α επεκτείνεται από το μεσαίο τμήμα του εντέρου σε όλο το μήκος του, μέχρι και το όριο ορθού-πρωκτού. Την 20 η ημέρα τα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α μειώνονται, ενώ κατά τη γέννηση μόνο πολύ χαμηλά επίπεδα είναι ανιχνεύσιμα, τα οποία μειώνονται κι άλλο τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση και παραμένουν σταθερά και στο ήπαρ του ενήλικου οργανισμού (Duncan et al., 1994). Η σημασία αυτού του παράγοντα για την επιβίωση των οργανισμών αποδεικνύεται από τα πειράματα των Chen και των συνεργατών του (Chen et al., 1997), οι οποίοι έδειξαν πως η απαλοιφή του γονιδίου του HNF-4α σε ποντίκια, τα οδήγησε σε εμβρυϊκό θάνατο, λόγω αδυναμίας των HNF-4α -/- εμβρύων να ολοκληρώσουν τη γαστριδιοποίηση, διαδικασία κατά την οποία από την πολυδύναμη επιβλάστη θα προκύψουν οι 3 βλαστικές στοιβάδες. Παρόλο που ο HNF-4α δεν εκφράζεται στο έμβρυο σε αυτό το στάδιο, αποδείχθηκε πως είναι απαραίτητος για τη σύνθεση εκκρινόμενων ουσιών από το εξωεμβρυϊκό ενδόδερμα και συνεπώς τη δημιουργία κατάλληλου περιβάλλοντος για την ολοκλήρωση της γαστριδιοποίησης. Οι Li και συνεργάτες (Li et al., 2000), δημιουργώντας τετραπλοειδή έμβρυα ποντικού αγρίου τύπου HNF-4α+/+ τα οποία αναπτύσσονταν μαζί με HNF-4α-/- εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα, δημιούργησαν οργανισμούς οι οποίοι προέρχονταν αποκλειστικά από τα HNF-4α-/- εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα. Οι οργανισμοί αυτοί μπορούσαν να αναπτυχθούν πέρα από το στάδιο της γαστριδιοποίησης, αφού η έλλειψη του HNF-4α αναπληρωνόταν από το σπλαχνικό ενδόδερμα που προέχεται από τα τετραπλοειδή HNF-4α+/+ έμβρυα. Το σπλαχνικό ενδόδερμα έχει πολλά κοινά χαρακτηριστικά με τα ηπατοκύτταρα, γιατί εκτός του ότι και οι δύο ιστοί εκφράζουν τους ίδιους μεταγραφικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των HNFs (HNF-1, HNF-3, HNF- 4, HNF-6), έχουν επιθηλιακή μορφολογία και εκκρίνουν πρωτεΐνες του ορού, που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της γλυκόζης, και είναι παροδικές θέσεις αιμοποίησης

21 Παρόλο που οι οργανισμοί που προέκυψαν, μπορούσαν να προχωρήσουν κανονικά στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του ήπατος και να αποκτήσουν ηπατικούς ιστούς που είναι μορφολογικά ίδιοι με ηπατικούς ιστούς αγρίου τύπου, είχαν πολύ χαμηλά mrna επίπεδα δύο ιδιαίτερα σημαντικών, για την έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, μεταγραφικών παραγόντων, των HNF-1α και του PXR, γεγονός που καταδεικνύει την προγενέστερη δράση του HNF-4α σε σχέση με αυτούς τους δύο παράγοντες, στην ακολουθία μεταγραφικών συμβάντων στο αναπτυσσόμενο ήπαρ. Ως αποτέλεσμα αυτής της μείωσης, οι οργανισμοί στερούνταν της έκφρασης πολλών γονιδίων, των οποίων τα προϊόντα είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του ώριμου ήπατος (apoai, apoaii, apob, apocii, apociii, αλβουμίνη, αλδολάση Β) καθιστώντας φανερή τη σημασία του HNF-4α για τη δημιουργία πλήρως διαφοροποιημένων ηπατοκυττάρων στους αναπτυσσόμενους οργανισμούς (Li et al., 2000, Watt et al., 2003). 2.1.ε. Ο ρόλος των HNF1 & HNF3 στην ανάπτυξη του ήπατος: Ένα απλοποιημένο μοντέλο της πρώιμης ηπατικής ανάπτυξης φαίνεται στην εικόνα 5 και περιλαμβάνει 3 στάδια: 1) την επάρκεια, 2) την ειδικότητα & 3) τη διαφοροποίηση. Σε αυτό το μοντέλο, οι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν καθορισμένους ρόλους στη ρύθμιση των διάφορων σταδίων της ηπατικής ανάπτυξης. Στο πρώτο στάδιο, της επάρκειας, ολόκληρο το ενδόδερμα έχει τη δυνατότητα να εξελιχθεί σε ήπαρ, παρουσία των κατάλληλων αναπτυξιακών σημάτων (Li et al., 2000). Παρόλο που το ήπαρ προέρχεται από ένα συγκεκριμένο μέρος του κοιλιακού ενδοδέρματος, την ηπατική μοίρα, οι Gualdi και συνεργάτες (Gualdi et al., 1996) έδειξαν ότι και ραχιαίες περιοχές του ενδοδέρματος είναι ικανές να εισέλθουν σε ηπατικό αναπτυξιακό πρόγραμμα, αν καλλιεργηθούν ως μοσχεύματα. Έχει προταθεί ότι ο μεταγραφικός παράγοντας HNF-3 λειτουργεί ως παράγοντας επάρκειας στο ενδόδερμα, σημαδεύοντας τα ηπατικά γονίδια, τα οποία έχουν την δυνατότητα να εκφραστούν σε απόκριση κατάλληλων αναπτυξιακών σημάτων. Ο HNF-3 πιθανά να ασκεί αυτή του τη δράση, μέσω αναδιοργάνωσης της χρωματίνης, καθώς αυτός ο παράγοντας έχει την ικανότητα να επανατοποθετεί τα νουκλεοσώματα. Στο δεύτερο στάδιο της ηπατικής ανάπτυξης, ο παράγοντας FGF, απελευθερώνεται από τον καρδιακό ιστό και επάγει το γειτονικό, πολυδύναμο ενδόδερμα ώστε να αποκτήσει την ηπατική του

22 μοίρα. Η δράση του FGF είναι αποτέλεσμα της έκφρασης συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων, που εκκινούν το πρόγραμμα έκφρασης των ηπατικών γονιδίων, μέσω πρόσδεσης σε επαρκή γονίδια. Ο HNF-4α δεν συμμετέχει σε αυτό το στάδιο, καθώς η συμμετοχή του θα σήμαινε πλήρη απώλεια του ηπατικού χαρακτήρα. Όμως, όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη παράγραφο, η απώλειά του δεν επηρέασε τα αρχικά στάδια της ανάπτυξης, καταδεικνύοντας πως ο HNF-4α δρα καθοδικά αυτού του σταδίου ή πως υπάρχουν άλλοι παράγοντες οι οποίοι αντισταθμίζουν την απώλεια του HNF-4α κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου. Στο τελευταίο στάδιο λαμβάνει χώρα η διαφοροποίηση των πολυδύναμων ενδοδερμικών κυττάρων σε πλήρως διαφοροποιημένα και λειτουργικά ηπατοκύτταρα, μία διαδικασία η οποία συνοδεύεται από μεγάλες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο η ηπατική διαφοροποίηση ρυθμίζεται από τη σταδιακή συσσώρευση πολλών μεταγραφικών παραγόντων, καταδεικνύοντας την ύπαρξη ιεραρχίας στην έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων, με τον έναν παράγοντα να ρυθμίζει την έκφραση του άλλου. Σε αυτό το στάδιο εκφράζεται αρχικά ο HNF-4α, συμβάν απαραίτητο για την έκφραση ηπατοειδικών παραγόντων όπως ο HNF-1α και ο PXR, υπό τον έλεγχο των οποίων βρίσκεται η έκφραση πολλών ηπατοειδικών γονιδίων (Li et al., 2000). Εικόνα 5: Σχηματική αναπαράσταση των βασικών σταδίων κατά την ηπατική ανάπτυξη. Με κίτρινο απεικονίζεται το ενδόδερμα το οποίο έχει προέλθει από το πρώιμο εξώδερμα. Με μπλε απεικονίζεται το κοιλιακό μέρος του εμβρυϊκόυ ενδοδέρματος, το οποίο είναι κοντά στην αναπτυσσόμενη καρδιά, από το οποίο προκύπτουν οι ηπατοβλάστες, που συνεχίζουν να διαφοροποιούνται προς ώριμα ηπατοκύτταρα (Li et al., 2000)

23 2.1.στ. Ο ρόλος του HNF-4α στο ενήλικο ήπαρ: Ο ρόλος του HNF-4α στο ενήλικο ήπαρ είναι ιδιαίτερα σημαντικός, καθώς ρυθμίζει την έκφραση μίας πληθώρας γονιδίων, που κωδικοποιούν μεταφορείς, ένζυμα, ακόμη και άλλους ηπατικούς πυρηνικούς υποδοχείς (Gonzalez, 2008) (Εικόνα 6). Ο αριθμός των γονιδίων-στόχων στο ενήλικο ήπαρ, τα οποία ο HNF-4α ρυθμίζει ανοδικά, ανέρχεται σε περισσότερα από 60 και περιλαμβάνει γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε ένα μεγάλο εύρος φυσιολογικών διαδικασιών, όπως ο μεταβολισμός της γλυκόζης, των λιπαρών οξέων και της χοληστερόλης (Ruse et al., 2002). Εικόνα 6: Ο ρόλος του HNF-4α στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στο ήπαρ. Ένας σημαντικός αριθμός κρίσιμων μεταβολικών οδών βρίσκεται υπό τη συνεχή ρύθμιση του HNF-4α (Gonzalez, 2008). Ο παράγοντας HNF-4α παίζει ρόλο-κλειδί στην μεταγραφική ρύθμιση ηπατοειδικών γονιδίων, καθώς ρυθμίζει την έκφραση του ηπατοειδικού πυρηνικού υποδοχέα HNF-1α, έναν σημαντικό μεταγραφικό παράγοντα για την έκφραση πολλών ηπατικών γονιδίων (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Ο μεταγραφικός παράγοντας HNF-4α συμμετέχει στη ρύθμιση του μεταβολισμού της χοληστερόλης, των λιπαρών οξέων, των αμινοξέων και τοξικών ουσιών ρυθμίζοντας την έκφραση γονιδίων υπεύθυνων για τις προαναφερθείσες διαδικασίες. Η απαλοιφή του γονιδίου του HNF-4α στο ενήλικο ήπαρ ποντικών, οδήγησε σε δυσλειτουργία του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων και των ξενοβιοτικών, καθώς και σε αυξημένη θνησιμότητα. Συγκεκριμένα σε αυτά τα ποντίκια παρατηρήθηκαν χαμηλά επίπεδα των απολιποπρωτεινών apoai, apoaii, apob, apociii και υψηλά επίπεδα χολικών οξέων στον ορό, ως αποτέλεσμα της χαμηλότερης έκφρασης των μεταβολικών ενζύμων, CYP7A1, CYP8B1 και της λιγάσης του συνενζύμου Α του χολικού οξέος. Στα HNF-4α-/- ποντίκια παρατηρήθηκαν επίσης υψηλά επίπεδα αμμωνίας, λόγω μειωμένης έκφρασης της τρανσκαρβαμυλάσης της ορνιθίνης (Gonzalez, 2008, Hayhurst et al., 2001). Η συμμετοχή

24 του HNF-4α στο μεταβολισμό των αμινοξέων έχει αποδειχθεί και από άλλες μελέτες οι οποίες δείχνουν τη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων της αμινοτρανσφεράσης της τυροσίνης και της οξειδάσης της προλίνης από τον HNF-4α (Kamiya et al., 2002). Οι απολιποπρωτείνες apoai, apoaii, apoaiv, apob, apocii & apociii φέρουν στους υποκινητές τους DR1 στοιχεία, στα οποία προσδένεται ο μεταγραφικός παράγοντας HNF-4α και ασκεί τη δράση του. Μάλιστα έχει βρεθεί ότι το γονίδιο της apociii, ενεργοποιείται από τις πρωτεΐνες Smad, που είναι ενδοκυτταρικοί τελεστές του TGF-β, μέσω ενός HRE πάνω στο οποίο προσδένεται ο μεταγραφικός παράγοντας HNF-4α (Ladias, et al., 1992, Kardassis et al., 2000, Chou et al., 2003). Άλλες μελέτες με πειράματα διαμόλυνσης ανθρώπινων ηπατοκυττάρων, αποκάλυψαν την ύπαρξη θέσης σύνδεσης του HNF-4α στους προαγωγείς των γονιδίων CYP2D6, CYP2A612 και UGT1A913 (Gonzalez, 2008). Ο HNF-4α ελέγχει επίσης γονίδια μεταβολικών ενζύμων του ήπατος, όπως της γλυκοκινάσης, της αλδολάσης Β, της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος (PEPCK) και της κινάσης του L πυροσταφυλικού οξέος (LPK) (Miquerol et al., 1994), ένζυμα τα οποία παίζουν κρίσιμο ρόλο στις διαδικασίες της γλυκόλυσης και της γλυκονεογένεσης. Άλλο ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του HNF-4α είναι η ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που έχουν αντίθετες λειτουργίες, όπως τα γονίδια που κωδικοποιούν πηκτικούς και αντιπηκτικούς παράγοντες του αίματος. Ρυθμίζει τα υπεύθυνα γονίδια για την πήξη του αίματος, τα οποία εξαρτώνται από την βιταμίνη Κ, είτε άμεσα (παράγοντες VII-XII), είτε έμμεσα μέσω του HNF-1 (προθρομβίνη και ινωδογόνο). Επίσης, ρυθμίζοντας την έκφραση του γονιδίου της αντιθρομβίνης ΙΙΙ, συμμετέχει στην απομάκρυνση των θρόμβων (Stauffer et al., 1998). Μία άλλη κατηγορία γονιδίων που ρυθμίζει είναι το γονίδιο της τρανσφερίνης το οποίο είναι υπεύθυνο για τη μεταφορά του σιδήρου (Schaeffer et al., 1993) και το γονίδιο της τρανσθυρετίνης το οποίο είναι υπεύθυνο για τη μεταφορά της θυρεοειδούς ορμόνης Τ4 (Sladek et al., 1990). Βάσει των παραπάνω στοιχείων, είναι ξεκάθαρο πως ο HNF-4α κατέχει σημαντικό ρόλο σε διάφορες λειτουργίες του οργανισμού. Ιδιαίτερα αξιοσημείωτη είναι η περίπτωση των απολιποπρωτεϊνών, των οποίων η δυσλειτουργία μπορεί να οδηγήσει σε αθηροσκλήρωση καθώς και η περίπτωση των παραγόντων πήξης του αίματος VII & X, μεταλλάξεις των οποίων οδηγούν σε αιμοροφιλία (Duda et al., 2004). Μεταλλάξεις στο ίδιο το γονίδιο του HNF-4α οδηγούν σε μια άτυπη μορφή διαβήτη, γνωστή ως νεανικός διαβήτης MODY-1, καθώς τα συμπτώματα της νόσου εμφανίζονται πριν από το 25 ο έτος. Ακόμη, ενεργοποιεί τη μεταγραφή των ιϊκών γονιδίων του ιού του HBV ο οποίος ευθύνεται

25 για τη χρόνια ηπατίτιδα που είναι παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη ηπατοκαρκινώματος (Ruse et al., 2002). Τέλος, ο HNF-4α σχηματίζει σύμπλοκο με τον μεταγραφικό παράγοντα HIF-1, το οποίο προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης, τη μεταγραφή της οποίας ρυθμίζει για την αποφυγή υποξίας (Zhu et al., 2002). 2.1.ζ. HNF-4α: ενορχηστρωτής της επιθηλιακής μορφογένεσης του αναπτυσσόμενου ήπατος: Τα ηπατοκύτταρα, ο πρωταρχικός κυτταρικός τύπος στο παρέγχυμα του ήπατος, είναι πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα. Η κορυφαία επιφάνεια των ηπατοκυττάρων χαρακτηρίζεται ως η περιοχή του κυττάρου, που παράγει τα χολικά αγγεία, που λειτουργούν ως κανάλια μεταφοράς των χολικών οξέων, και έτσι διαμεσολαβούν τις εξωκρινείς λειτουργίες του ήπατος. Η μεμβράνη στη βασική επιφάνεια είναι στραμμένη προς το ημιτονοειδές ενδόδερμα και συμμετέχει στην ανταλλαγή θρεπτικών ουσιών, τοξινών και μεταβολιτών από και προς την κυκλοφορία του αίματος. Ο διαχωρισμός εξωκρινών και ενδοκρινών λειτουργιών από ξεχωριστές περιοχές της μεμβράνης των ηπατοκυττάρων, απαιτεί τη διατήρηση της κυτταρικής πολικότητας, που με τη σειρά της εξαρτάται από τον σχηματισμό των κυτταρικών συνδέσεων (Konopka et al., 2007). Στα θηλαστικά η προσκόλληση των επιθηλιακών κυττάρων διαμεσολαβείται από 3 τύπους κυτταρικών συνδέσεων : (1) τις στενές συνδέσεις, όπου σ αυτό τον τύπο έχουμε γνήσια συγχώνευση δύο γειτονικών κυτταρικών μεμβρανών, οι οποίες στη θέση της ένωσης αποκτούν μία ζώνη πάχος περίπου 15nm και διεθνώς ονομάζεται zonula occludens, (2) τις ενδιάμεσες συνδέσεις, που σχηματίζουν την zonula adherens που συνδέει δύο γειτονικά κύτταρα ή ένα κύτταρο με τη μεσοκυττάρια ουσία, περιλαμβάνοντας τέσσερις ομάδες μορίων σύνδεσης (την οικογένεια της καδερίνης, την ομάδα της ιντεγκρίνης & τη μεγάλη ομάδα των ανοσοσφαιρινών), (3) τα δεσμοσώματα, που όλα μαζί συνιστούν το ενδοκυτταρικό σύμπλοκο συνένωσης (Ιntercellular Juctional Complex) (Εικόνα 7) (Perez- Moreno et al., 2003)

26 Εικόνα 7: Οι τρεις τύποι κυτταρικών συνδέσεων στα επιθηλιακά κύτταρα (Perez-Moreno et al., 2003). Ο δομικός τους ρόλος έγκειται στην διευκόλυνση της εισόδου στο κύτταρο μικρών μορίων και ιόντων και στην παρεμπόδιση της εισόδου λιπιδίων. Πέραν όμως του δομικού τους ρόλου, οι κυτταρικές συνδέσεις συμμετέχουν στη ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών, που εκκινούν από την κορυφαία μεμβράνη και καταλήγουν στον πυρήνα, όπως και μονοπατιών που εκκινούν από το εσωτερικό του κυττάρου και καταλήγουν στην επιφάνεια (Konopka et al., 2007). Ο HNF-4α κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων και στη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου. Οι μορφογενετικοί παράγοντες που βρίσκονται υπό τον έλεγχό του είναι απαραίτητοι για την κατάλληλη μορφολογία του ήπατος και για την οργάνωση του ηπατικού επιθηλίου. Η αύξηση της έκφρασης του HNF-4α στη μέση της κυοφορίας, έχει σαν αποτέλεσμα τη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων και την έκφραση μορίων προσκόλλησης και συνδετικών πρωτεϊνών, που οδηγούν στη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου, το οποίο είναι απαραίτητο για τη φυσιολογική λειτουργία του ήπατος (Watt et al., 2003). Η λειτουργία του HNF-4α ως βασικού ρυθμιστή του επιθηλιακού φαινοτύπου, φαίνεται από το γεγονός ότι η εκτοπική έκφρασή του σε ινοβλάστες προκαλεί την μετάβαση από τον μεσεγχυματικό στον επιθηλιακό φαινότυπο. Επίσης, η έκφραση του HNF-4α σε αποδιαφοροποιημένα ηπατικά κύτταρα αρουραίου, είναι αρκετή για να προκαλέσει επανέκφραση μίας σειράς ηπατοειδικών γονιδίων και να επανεγκαθιδρύσει την επιθηλιακή κυτταρική μορφολογία και πολικότητα (Cicchini et al., 2006). Με τη χρήση HNF-4α -/- ποντικών, απεδείχθη ότι ο HNF-4α είναι απαραίτητος για την έκφραση μίας πληθώρας γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες κυτταρικής σύνδεσης και πρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης. Αυτά τα γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε όλους τους τύπους των κυτταρικών συνδέσεων,

27 συμπεριλαμβανομένων των ενδιάμεσων συνδέσεων (Ε-καδερίνη), των στενών συνδέσεων (Cldn1, Cldn2, Cldn12, Ocln, F11r, Cxadr, Crb3), των δεσμοσωμάτων (Dsc2, Pkp2, Krt2-8) και των χασμοσυνδέσεων (Gjb1 & Gjb2). Είναι επίσης υπεύθυνος για τη ρύθμιση γονιδίων, των οποίων τα προϊόντα εμπλέκονται στην επιθηλιακή πολικότητα, στην οργάνωση του κυτταροσκελετού (Eppk1 & gsn) και στη μεταγωγή σημάτων (Dusp16 & Rhpn2) (Battle et al., 2006). Πολλές μελέτες έχουν δείξει την εμπλοκή της Ε-καδερίνης (E-cadherin) στο σχηματισμό των κυτταρικών συνδέσεων. Πρόκειται για μία διαμεμβρανική ασβεστιοεξαρτώμενη πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια των Καδερινών (Cadherins="calcium-dependent adhesion") (Hulpiau P, and van Roy F, 2009). Παρεμπόδιση της έκφρασης της Ε- καδερίνης σε νεφρικά κύτταρα σκύλου, εμπόδισε το σχηματισμό όχι μόνο των ενδιάμεσων συνδέσεων αλλά και των στενών συνδέσεων και των δεσμοσωμάτων. Επίσης, η απαλοιφή του γονιδίου της Ε-καδερίνης οδηγεί σε πρώιμο θάνατο των εμβρύων, στην εμβρυϊκή μέρα, λόγω αδυναμίας σχηματισμού του επιθηλίου (Battle et al., 2006). τροφοεξωδερμικού Ένα κοινό δομικό χαρακτηριστικό της Ε-καδερίνης και του HNF-4α είναι η ύπαρξη στην αλληλουχία τους μίας θέσης σύνδεσης για τον μεταγραφικό παράγοντα Snail. Ανάλυση της αλληλουχίας των υποκινητών των δύο γονιδίων, Ε-καδερίνη και HNF-4α, αποκάλυψαν την ύπαρξη του ρυθμιστικού στοιχείου E-pal, στο 5 -άκρο του υποκινητή. Το ρυθμιστικό αυτό στοιχείο αποτελείται από 2 Ε-πλαίσια, με αλληλουχία 5 -CAGGTG-3. Η αλληλουχία αυτή είναι θέση σύνδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Snail, ο οποίος ασκεί κατασταλτική δράση στη μεταγραφή των γονιδίων της Ε-καδερίνης και του HNF-4α. Μέλη της οικογένειας Snail (Snail & Slug), εμπλέκονται στην διαδικασία της μετάβασης από τον επιθηλιακό στον μεσεγχυματικό φαινότυπο (ΕΜΤ transition), κατά την εμβρυική ανάπτυξη, των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας από τον νευρικό σωλήνα και των κυττάρων του πρώιμου μεσοδέρματος από την αρχική λωρίδα. Έμβρυα τα οποία δεν εκφράζουν το γονίδιο του Snail, ενώ διατηρούν την έκφραση της Ε-καδερίνης στα μεσοδερμικά κύτταρα, εμφανίζουν ανωμαλίες στη γαστριδιοποίηση, καθώς δεν μπορούν να ολοκληρώσουν την μετάβαση από τον επιθηλιακό στον μεσεγχυματικό φαινότυπο (Cicchini et al., 2006), διαδικασία κατά την οποία τα κύτταρα μετατρέπονται από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά ώστε να σχηματιστούν τα τρία εμβρυϊκά στρώματα (ενδόδερμα, μεσόδερμα, εξώδερμα) (Thiery and Sleeman, 2006). Το γονίδιο του HNF-4α είναι γονίδιο στόχος του Snail, ο οποίος καταστέλλει την έκφρασή του, καταδεικνύοντας την συμμετοχή του Snail στην ΕΜΤ

28 μετάβαση των ηπατοκυττάρων, μέσω άμεσης ρύθμισης της έκφρασης του γονιδιακού ρεπερτορίου της ηπατικής διαφοροποίησης (Cicchini et al., 2006, Rosivatz et al., 2006 ). 2.1.η Ο ρόλος των γονιδίων του HNF-4α, της Ε-καδερίνης & του Snail στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα: Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είναι ένα από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου στον κόσμο. Οι πιο κύριοι παράγοντες κινδύνου είναι οι χρόνιες ηπατίτιδες Β και C, καθώς και η παρατεταμένη έκθεση σε ηπατοκαρκινογόνα (Lazarevich et al., 2004). Η πρόσφατη πρόοδος στην θεραπεία αυτών των ηπατοπαθειών, όπως η απομάκρυνση του όγκου με ραδιοσυχνότητες ή η ηπατική μεταμόσχευση, έχει αυξήσει την επιβίωση των ασθενών που βρίσκονται στα πρώτα ή ενδιάμεσα στάδια ηπατοκαρκινώματος (Min et al., 2009). Ωστόσο, γεγονός παραμένει η κακή πρόγνωση των ασθενών που έχουν υποστεί ηπατεκτομή, λόγω της συχνής επανεμφάνισης του καρκίνου, σε διάστημα 5 χρόνων μετά από την αρχική θεραπεία σε ποσοστό % (Miyoshi et al., 2005). Οι κλινικοί παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση των ασθενών είναι διάφοροι, οι οποίοι περιλαμβάνουν την αγγειακή εισβολή, το μέγεθος του όγκου, την ύπαρξη περιφερικών οζιδίων και την μετάσταση (Min et al., 2009). Πιστεύεται ότι το ηπατοκαρκίνωμα, όπως και πολλοί άλλοι καρκίνοι, προέρχονται από τη συσσώρευση γενετικών μεταλλάξεων, που επηρεάζουν την ανανέωση των κυττάρων, την αύξηση και τον πολλαπλασιασμό τους. Θεωρείται ότι περίπου 3-6 γενετικά συμβάντα είναι ικανά για μεταμορφώσουν φυσιολογικά κύτταρα σε καρκινικά. Αν κάτι τέτοιο ισχύει στην πραγματικότητα τα ολοδύναμα κύτταρα του ήπατος, τα οποία έχουν δυνατότητα πολλαπλασιασμού και πολύ μεγαλύτερη διάρκεια ζωής σε σχέση με τους απογόνους τους, είναι πιθανόν τα μόνα κύτταρα τα οποία μπορούν να συσσωρεύσουν τον απαραίτητο αριθμό γενετικών μεταλλάξεων που απαιτείται ώστε να διαταραχθούν οι εσωτερικοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση, ενώ ταυτόχρονα παραμένουν ζωντανά. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μία πληθώρα δεδομένων που υποστηρίζουν πως οι όγκοι αποτελούνται από ετερογενείς κυτταρικούς πληθυσμούς με διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες, των οποίων η ικανότητα σχηματισμού όγκων οφείλεται αποκλειστικά και μόνο σε μία κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (cancer stem cells). Αυτά τα κύτταρα χαρακτηρίζονται επίσης από την ικανότητα τους να διαιωνίζονται μέσω αυτοανανέωσης και

29 να παράγουν ώριμα κύτταρα μέσω διαφοροποίησης. Η ύπαρξη αυτών των κυττάρων έχει αποδειχθεί σε διάφορες περιπτώσεις καρκίνου, όπως στη λευχαιμία, στον καρκίνο του μαστού, στο γλοιοβλάστωμα, στον καρκίνο του προστάτη, στο γαστρικό καρκίνο και στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Ο φαινότυπος αυτών των κυττάρων που μοιάζει με τον φαινότυπο των στελεχιαίων κυττάρων καθώς και ο μικρός αριθμός αυτών των κυττάρων στον όγκο, πιστεύεται πως ευθύνεται για την ικανότητα τους να ξεφεύγουν των παραδοσιακών θεραπειών καθώς και για την επανεμφάνιση της νόσου, ακόμα και όταν η πρωταρχική κάκωση αντιμετωπιστεί (Ma et al., 2007). Δείκτες των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων στο ήπαρ φαίνονται να είναι οι πρωτεΐνες CD133 & CD90, οι οποίες σχετίζονται με την έναρξη του όγκου και την αντίσταση στις χημειοθεραπείες (Sell and Leffert, 2008). Καρκινικά στελεχιαία κύτταρα τα οποία φέρουν τα αντιγόνα επιφανείας CD133 και CD90, έχουν βρεθεί σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ηπατοβλαστώματος συμπεριλαμβανομένης της κυτταρική σειράς HepG2 (Yang et al., 2008, Yin et al., 2007) και μάλιστα τα CD90+ κύτταρα ήταν ικανά να δημιουργήσουν οζίδια στους πνεύμονες ανοσοκατεσταλμένων ποντικών, υποδεικνύοντας μεταστατικές ιδιότητες των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (Yang et al., 2008). Το ηπατοκαρκίνωμα εξελισσόμενο περνά από μία καλά διαφοροποιημένη κατάσταση σε μία λιγότερο διαφοροποιημένη κατάσταση, εξέλιξη η οποία συνοδεύεται από γενετικές και μορφολογικές αλλαγές του κυττάρου και η οποία αποτελεί ένα από τα πιο κρίσιμα στάδια στην ηπατοκαρκινογένεση. Η πρόοδος του ηπατοκαρκινώματος χαρακτηρίζεται από μείωση της κυτταρικής διαφοροποίησης, απώλεια της έκφρασης ηπατοειδικών γονιδίων, αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, απώλεια της επιθηλιακής μορφολογίας, αυξημένη διεισδυτικότητα και εν τέλει μετάσταση του όγκου. Παρόλο που έχει περιγραφεί μία πληθώρα σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία συμμετέχουν στην λειτουργία και στον πολλαπλασιασμό του ήπατος, η μοριακή βάση του ηπατοκαρκινώματος παραμένει ασαφής (Lazarevich et al., 2004). Η απόδραση των καρκινικών κυττάρων από τους στερεούς όγκους μπορεί να οφείλεται στην αποδιαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων, που λαμβάνει χώρα μέσω απώλειας των κυτταρικών συνδέσεων και απόκτηση μετασταστικών και διεισδυτικών ικανοτήτων. Αυτή η φαινοτυπική αλλαγή των κυττάρων, ονομάζεται μετάβαση από τον επιθηλιακό στον μεσεγχυματικό φαινότυπο (ΕΜΤ) και πρόκειται για μία παροδική και αναστρέψιμη διαδικασία κατά την οποία τα κύτταρα που υπόκεινται ΕΜΤ, έχουν την ικανότητα να διαπερνούν μεμβράνες και ιστούς, καθώς και να διαπερνούν τα αγγεία του

30 αίματος και να εισέρχονται έτσι στην κυκλοφορία (Thierry and Sleeman, 2006, Grunert et al., 2003). Η διαδικασία της ΕΜΤ μετάβασης μπορεί να διευκολύνει την παραγωγή καρκινικών κυττάρων με μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά που είναι απαραίτητα για τη διασπορά και την κυτταρική ανανέωση και ως αποτέλεσμα την έναρξη νέων όγκων (Hollier et al., 2009), υποδεικνύοντας πως αυτά τα κύτταρα θα μπορούσαν να είναι πρόδρομα κύτταρα των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων ή ακόμα και των μεταστατικών στελεχιαίων καρκινικών κυττάρων (Visvader and Lindeman, 2008). Η ΕΜΤ μετάβαση έχει περιγραφεί σε διάφορους τύπους καρκίνου συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (Thierry and Sleeman, 2006, Polyak and Weinberg, 2009). Στο ηπατοκαρκίνωμα σχετίζεται με απώλεια της επιθηλιακής πολικότητας, μείωση της έκφρασης επιθηλιακών δεικτών, αύξηση της έκφρασης ή ενδοκυτταρική μετατόπιση μεσεγχυματικών δεικτών (33-67% των ηπατοκαρκινωμάτων χαρακτηρίζονται από συσσώρευση της β-κατενίνης στον πυρήνα) (Lee et al., 2006) και είναι άμεσα συνδεδεμένη με μείωση της έκφρασης του HNF-4α (Lazarevich et al., 2004). Η πρόοδος του HCC, σχετίζεται με μείωση της έκφρασης των ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων (HNFs) (Lazarevich et al., 2004). Συγκεκριμένα έχει βρεθεί πως η απώλεια της έκφρασης του HNF-4α είναι ένα καθοριστικό γεγονός για την πρόοδο του ηπατοκαρκινώματος (Yin et al., 2008). Μελέτες με κυτταρικές σειρές ηπατώματος (HepG2, Hep3B), έδειξαν πως υπερέκφραση του γονιδίου του HNF-4α, είναι ικανή να μειώσει τον πληθυσμό των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων καθώς επίσης και να ρυθμίσει καθοδικά την έκφραση γονιδίων που προσδίδουν ένα πιο ολοδύναμο χαρακτήρα στα κύτταρα, όπως τα γονίδια β-catenin,oct3/4, SMO, Bmi, Sox2, NANOG, c-myc, Klf4, LIN28. Για πολλά από αυτά τα γονίδια, έχει αποδειχθεί η εμπλοκή τους στην πρόοδο του ηπατοκυτταρικού καρκίνου, ενώ όλα τους είναι απαραίτητα για την ικανότητα πολλαπλασιασμού των στελεχιαίων κυττάρων. Επίσης, υπερέκφραση του HNF-4α, βρέθηκε πως μειώνει τον πολλαπλασιασμό και τον σχηματισμό αποικιών των κυτταρικών σειρών HepG2, Hep3Β, επάγοντας την απόπτωση και τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, όπως φάνηκε από την μείωση του αριθμού των κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Αυξημένα επίπεδα HNF-4α ήταν ικανά να μειώσουν σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού όγκων και των δύο κυτταρικών σειρών. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι ο εμβολιασμός ποντικών με κύτταρα Hep3B, οδήγησε σε σχηματισμό όγκων την 11 η ημέρα, ενώ ο εμβολιασμός με κύτταρα HepG2, οδήγησε σε σχηματισμό όγκων την 18 η ημέρα. Όμως η υπερέκφραση του γονιδίου του HNF- 4α και στις δύο ομάδες ποντικών (Hep3B & HepG2), δεν οδήγησε σε σχηματισμό όγκου σε

31 καμία από τις δύο ομάδες, ακόμα και 8 εβδομάδες μετά από τον εμβολιασμό. Επίσης σε ποντίκια τα οποία είχαν αναπτύξει όγκους με μεγέθη από mm 3, βρέθηκε πως η χορήγηση αδενοϊού που έφερε το γονίδιο του HNF-4α, οδήγησε σε μείωση του μεγέθους των όγκων και παράλληλα την αύξηση της έκφρασης ηπατοειδικών γονιδίων (ALDOB, apo- AI, PEPCK, CYP1Α2). Θα μπορούσε να ειπωθεί πως ο HNF-4α καταστέλλει την κακοήθεια, μέσω επαναδιαφοροποίησης των κυττάρων του ηπατώματος προς έναν ηπατοκυτταρικό φαινότυπο (Yin et al., 2008). Η έκφραση του γονιδίου του Snail αυξάνεται σημαντικά κατά την αποδιαφοροποίηση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, επιταχύνοντας την διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων και οδηγώντας σε άσχημη πρόγνωση για τους ασθενείς. Η υπερέκφραση του Snail συνδέεται με τη μείωση της έκφρασης της Ε-καδερίνης σε έναν μεγάλο αριθμό όγκων και συμβάλλει στην επικράτηση ενός πιο επιθετικού καρκινικού φαινότυπου (Cicchini et al., 2006). Επίσης, έχει δειχθεί σε ηπατοκαρκινικές κυτταρικές σειρές ότι ο Snail δεν καταστέλλει μόνο την έκφραση της Ε-καδερίνης, επιτρέποντας έτσι στα κύτταρα να αποκολληθούν από τα γειτονικά τους κύτταρα και να μεταναστεύσουν, αλλά αυξάνει και την έκφραση των ΜΜΡ (matrix metalloproteinase) πρωτεϊνών, που έχει αποδειχθεί ότι επιταχύνουν την εισβολή πολλών τύπων ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκαρκινώματος, οδηγώντας εν τέλει στη μετάσταση του καρκίνου σε άλλα όργανα (Min et al., 2009, Miyoshi et al., 2005). Υπάρχει λοιπόν μία αντίστροφη συσχέτιση στην έκφραση των δύο γονιδίων, με την Ε-καδερίνη να εκφράζεται περισσότερο σε διαφοροποιημένες ηπατοκαρκινικές κυτταρικές σειρές και το Snail να εκφράζεται περισσότερο σε αδιαφοροποίητες ηπατοκαρκινικές κυτταρικές σειρές. Με βάση αυτά τα δεδομένα ένα μοντέλο που θα μπορούσε να επικρατεί, περιλαμβάνει την καταστολή της έκφρασης της Ε-καδερίνης από το Snail, που μπορεί να οδηγήσει σε αποδιαφοροποίηση του ηπατοκαρκινώματος και κατ επέκταση εξέλιξη του όγκου (Miyoshi et al., 2005)

32 2.2 MicroRNAS 2.2.a. Ανακάλυψη των micrornas: Το 1993 ο Victor Ambros και οι συνεργάτες του Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum, ανακάλυψαν ότι το γονίδιο lin-4, που ήταν γνωστό ότι ρυθμίζει τον κύκλο ανάπτυξης της προνύμφης στον C.elegans, δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, αλλά παράγει ένα ζεύγος μικρών RNAs (Lee et al.,1993a). Το ένα εκ των δύο RNA είχε μήκος περίπου 22 νουκλεοτίδια και το άλλο περίπου 61 νουκλεοτίδια. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι αυτά τα δύο RNAs που προέκυπταν από το γονίδο lin-4, είχαν αντινοηματική συμπληρωματικότητα με πολλές περιοχές της 3 -αμετάφραστης περιοχής (3 -UTR) του γονιδίου lin-14 (Lee et al.,1993a). Μεταξύ αυτών των περιοχών ήταν και μία περιοχή της 3 - UTR, που παλαιότερα είχε προβλεφθεί να διαμεσολαβεί την καταστολή του γονιδίου lin-14, από το γονιδιακό προϊόν του lin-4 (Wightman et al.,1991). Στη συνέχεια, αποδείχθηκε η σημασία αυτών των συμπληρωματικών περιοχών μεταξύ των δύο γονιδίων, καθώς η ρύθμιση αυτή οδηγούσε σε μείωση της πρωτεΐνης LIN-14, χωρίς καμία αξιοσημείωτη αλλαγή στα επίπεδα του lin-14 mrna (Lee et al.,1993a, Wightman et al.,1993). Το μικρότερο εκ των δύο RNAs που ανακαλύφθηκαν το 1993, θεωρείται σήμερα το ιδρυτικό μέλος μίας μεγάλης οικογένειας μικρών, ρυθμιστικών RNAs, τα micrornas ή mirnas (Bartel, 2004). Τα micrornas (mirnas) είναι μικρά μονόκλωνα RNAs, με μήκος νουκλεοτίδια τα οποία μεταγράφονται από DNA και δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνη αλλά ρυθμίζουν την έκφραση άλλων γονιδίων, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, είτε μέσω αλληλεπίδρασης με τη μηχανή της πρωτεϊνοσύνθεσης είτε μέσω αποικοδόμησης mrna-στόχων. Πρόκειται για μη κωδικά γονίδια τα οποία ρυθμίζουν άλλα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτείνες (Davis and Hata, 2009). Τα micrornas εμπλέκονται στη ρύθμιση πολλών και διαφορετικών βιολογικών διαδικασιών (Kwak et al., 2010). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως έχουν ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της ανάπτυξης, στη διαφοροποίηση αιμοποιητικών κυττάρων, στην απόπτωση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην δημιουργία οργάνων. Τα mirnas και τα γονίδια-στόχοι τους φαίνεται πως δημιουργούν περίπλοκα ρυθμιστικά δίκτυα, με ένα μόνο mirna να προσδένεται και να ρυθμίζει πολλά διαφορετικά mrnas και αντιστρόφως ένα μόνο mrna να ρυθμίζεται από πολλά διαφορετικά mirnas (Kim, 2005)

33 2.2.β. Εξελικτική συντήρηση των micrornas: Αυτά τα ρυθμιστικά RNAs εκφράζονται σε πολυκύτταρους οργανισμούς και παρόλο που η αλληλουχία τους ποικίλλει, υπάρχουν κάποια κατάλοιπα ουρακίλης U, τα οποία παρουσιάζονται με μεγάλη συχνότητα στο 5 άκρο τους (Lau et al., 2001). Βάσει αυτής της ομολογίας στην αλληλουχία τους, τα mirnas μπορούν να ομαδοποιηθούν σε υποοικογένειες, με πολλά από αυτά να είναι συντηρημένα από εξελικτικής σκοπιάς. Για παράδειγμα περίπου το 1/3 των mirnas του C.elegans, έχουν ομόλογα mirnas στα θηλαστικά (Lim et al., 2003a). Μέχρι σήμερα, εκατοντάδες mirnas έχουν αναγνωριστεί ή προβλεφθεί με εργαλεία βιοπληροφορικής, στα γονιδιώματα φυτών, σκουληκιών, μυγών και θηλαστικών, υποδεικνύοντας πως τα micrornas έχουν προέλθει από ένα κοινό προγονικό γονίδιο που κωδικοποιεί για μικρά RNAs (Zeng, 2006, Ying et al., 2008). Για παράδειγμα, το ανθρώπινο γονιδίωμα, προβλέπεται ότι κωδικοποιεί περίπου 1000 mirnas, αριθμός που αντιστοιχεί περίπου στο 3% του συνολικού αριθμού γονιδίων (Bentwich et al., 2005, Berezikov et al., 2005). Περίπου 1-5% των γονιδίων των ζώων, κωδικοποιούν mirnas και 10 30% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες είναι πιθανοί στόχοι ρύθμισης από mirnas (Kusenda et al., 2006). Ένας πιθανός μηχανισμός εμφάνισης από εξελικτική σκοπιά των micrornas στο γονιδίωμα των προαναφερθέντων οργανισμών περιλαμβάνει τη χρήση τμημάτων τρανσποζονίων (μεταθετόνια) από τα micrornas, για την ενσωμάτωση τους στο γονιδίωμα με απώτερο σκοπό τη γονιδιακή ρύθμιση στα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων και των ανθρώπων (Ying et al., 2008). Σχεδόν όλα τα μέχρι σήμερα κλωνοποιημένα mirnas είναι συντηρημένα σε στενά συγγενικά είδη, όπως ο άνθρωπος και το ποντίκι, ή ο C.elegans και ο C.briggsae (Lagos-Quintana et al., 2003, Lim et al., 2003a, 2003b). Πολλά είναι πολύ πιο συντηρημένα σε είδη τα οποία δεν είναι συγγενικά, όπως για παράδειγμα στον C.elegans, στον οποίο πάνω από το 1/3 των mirnas του έχουν ομόλογα mirnas σε ένα μη συγγενικό του είδος, τον άνθρωπο (Ambros et al., 2003, Aravin et al., 2003, Lagos-Quintana et al., 2003, Lim et al.,2003a). Όταν συγκρίνονται απομακρυσμένοι εξελικτικά οργανισμοί, είναι εμφανής αξιοσημείωτη διασπορά μεταξύ των γονιδιακών οικογενειών, με το αντιπροσωπευτικότερο παράδειγμα να είναι αυτό της let-7 οικογένειας, η οποία έχει 4 μέλη στον C.elegans, τουλάχιστον 15 στον άνθρωπο και μόνο ένα στη Drosophila melanogaster (Pasquinelli et al., 2000, Aravin et al., 2003, Lai et al., 2003, Lim et al., 2003a)

34 2.2.γ. Γονιδιωματική οργάνωση: Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα mirnas βρίσκονται διασκορπισμένα σε όλα τα χρωμοσώματα του ανθρώπου, με εξαίρεση το Υ χρωμόσωμα. Περίπου το 50% των γνωστών mirnas εντοπίζεται σε συσσωματώματα και μεταγράφονται ως πολυκιστρονικά αρχικά μετάγραφα (Lagos-Quintana et al., 2001, Mourelatos et al., 2002, Lau et al., 2001). Τα mirnas ενός συγκεκριμένου συσσωματώματος, συχνά σχετίζονται το ένα με το άλλο, υποδεικνύοντας την πιθανή προέλευσή τους από γονιδιακό διπλασιασμό, ενώ ασαφές παραμένει το γεγονός αν τα mirnas του ίδιου συσσωματώματος έχουν παρόμοιες λειτουργίες, στοχεύοντας στον ίδιο στόχο ή σε διαφορετικούς στόχους του ίδιου μονοπατιού (Kim and Nam, 2006). Τα περισσότερα mirnas έχουν τα δικά τους ρυθμιστικά μεταγραφικά στοιχεία και αποτελούν ανεξάρτητες μεταγραφικές μονάδες, ενώ εντοπίζονται σε περιοχές μεταξύ γονιδίων (Lagos-Quintana et al., 2001, Lau et al., 2001, Lee and Ambros, 2001, Zeng, 2006). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι σε μία έρευνα των Rodriguez και των συνεργατών του (Rodriguez et al., 2004), 117 mirna-γονίδια βρέθηκαν σε ιντρόνια γονιδίων με τον ίδιο προσανατολισμό με αυτό της κωδικής αλυσίδας, αριθμός που είναι πολύ μεγαλύτερος από αυτόν που αναμενόταν αρχικά. Από αυτά τα 117 γονίδια, τα 90 βρίσκονται σε ιντρόνια γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, ενώ τα 27 σε ιντρόνια μη-κωδικών RNAs (ncrnas = non-coding RNAs). Άλλα 30 αλληλοεπικαλύπτονται με εξώνια των ncrnas, ενώ 4 αλληλοεπικαλύπτονται είτε με εξώνιο είτε με ιντρόνιο, αναλόγως του προτύπου εναλλακτικού ματίσματος. Έτσι, τα mirna-γονίδια μπορούν να ομαδοποιηθούν βάσει της γονιδιωματικής τους οργάνωσης : 1) στα ιντρονικά mirnas σε κωδικές μεταγραφικές μονάδες, 2) στα ιντρονικά mirnas σε μη κωδικές μεταγραφικές μονάδες, 3) στα εξωνικά mirnas σε μη κωδικές μεταγραφικές μονάδες, και 3) στα ανάμεικτα mirnas τα οποία μπορούν να περιληφθούν σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω κατηγορίες, αναλόγως του προτύπου εναλλακτικού ματίσματος (Kim, 2005, Kim and Nam, 2006). Μία μικρή μειοψηφία, περίπου το ¼ των ανθρώπινων γονιδίων που κωδικοποιούν για mirnas, βρίσκονται στα ιντρόνια γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, με προσανατολισμό όμοιο με αυτό των γονιδίων, υποδεικνύοντας πως τα περισσότερα από αυτά δεν μεταγράφονται από τους δικούς τους υποκινητές, αλλά χρησιμοποιούν τα ρυθμιστικά στοιχεία των γονιδίων μέσα στα οποία βρίσκονται (Aravin et al., 2003, Lagos- Quintana et al., 2003, Lai et al., 2003, Lim et al., 2003a). Αυτή η γονιδιωματική οργάνωση

35 υποδηλώνει ένα κοινό μηχανισμό έκφρασης του mirna και της πρωτεΐνης, δίνοντας μία πιθανή εξήγηση των συντηρημένων σχέσεων που παρατηρούνται μεταξύ των micrornas και των ξενιστών mrnas, όπως για παράδειγμα το mir-7 που εντοπίζεται σε ιντρόνιο του γονιδίου hnrnp K τόσο στα έντομα, όσο και στα θηλαστικά (Aravin et al., 2003). Σε μία προσπάθεια εξήγησης του τρόπου με τον οποίο και ένα mirna και ένα mrna προέρχονται από την ίδια DNA περιοχή, οι Shomron & Levy (Shomron and Levy, 2009), παρουσίασαν δύο πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους μπορεί να συμβαίνει κάτι τέτοιο (Εικόνα 8). Στον πρώτο μηχανισμό και το mirna και το mrna, προέρχονται από το ίδιο RNA μετάγραφο, ενώ στον δεύτερο τα δύο μόρια προέρχονται από δύο ξεχωριστά RNA μετάγραφα. Στην περίπτωση του πρώτου μηχανισμού, οι δύο διαδικασίες θα πρέπει να συμβαίνουν είτε συνεχόμενα, είτε ταυτόχρονα, μέσω συνεργασίας των δύο συμπλόκων (σύμπλοκο επεξεργασίας micrornas=microprocessor & μηχανή εναλλακτικού ματίσματος=spliceosome), αλληλεπίδραση η οποία είτε μπορεί να μην επηρεάζει καθόλου τα επίπεδα των mirna & mrna, είτε να αποτελεί ρυθμιστικό σημείο. Αν ισχύει ο δεύτερος μηχανισμός, η επεξεργασία των mirnas και η διαδικασία του εναλλακτικού ματίσματος, θα πρέπει να είναι δύο εντελώς ανεξάρτητες λειτουργικά διαδικασίες. Ωστόσο, καθώς υπάρχουν στοιχεία που υποστηρίζουν και τα δύο σενάρια, περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη ώστε να αποκαλυφθεί ο ακριβής μηχανισμός δράσης και το επίπεδο συνεργασίας των δύο διαδικασιών (Shomron and Levy, 2009). Εικόνα 8: Πιθανά μοντέλα για τη βιογένεση των ιντρονικών mirnas. Είτε και το mirna και το mrna προέρχονται από το ίδιο RNA μετάγραφο (αριστερά), είτε το καθένα δημιουγείται από ένα διαφορετικό μετάγραφο (δεξιά) (Shomron and Levy, 2009)

36 2.2.δ. Βιογένεση των micrornas: Η βιογένεση των micrornas είναι μία διαδικασία πολλών βημάτων η οποία περιλαμβάνει 1) την μεταγραφή των πρωταρχικών mirnas (pri- mirnas) από τα γονίδια που κωδικοποιούν για mirnas, 2) την παραγωγή των μερικώς επεξεργασμένων πρόδρομων mirnas (pre-mirnas) στον πυρήνα και 3) την παραγωγή των ώριμων mirnas στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 9). Εικόνα 9: Περίληψη της διαδικασίας βιογένεσης των micrornas (DeSano and Xu, 2009). Τα mirnas αρχικά μεταγράφονται ως μέρος ενός πολύ μεγαλύτερου πρωταρχικού μετάγραφου (pri-mirna). Το πρωταρχικό μόριο pri-mirna είναι τυπικά ένα μεγάλο μόριο RNA (> 1kb) (Zeng, 2006), προϊόν της RNA πολυμεράσης-ιι, το οποίο φέρει 5 -καλύπτρα και 3 -poly (A) ουρά (Lee et al., 2004, Cai et al., 2004, Yang and Mattes, 2008). Το pri-mirna, στην τεταρτοταγή δομή του, σχηματίζει δομές φουρκέτας με στέλεχος (stem) μήκους ~33bp και βρόχο (loop) (Kwak et al., 2010)

37 Μέσα στον πυρήνα, το pri-mirna επεξεργάζεται από τη μηχανή επεξεργασίας των πρωταρχικών μεταγράφων των micrornas (microprocessor machinery) με τη βοήθεια της Drosha πρωτεΐνης, μία ενδονουκλεάση της οικογένειας των RNAασών ΙΙΙ (Bartel, 2004). Η Drosha αλληλεπιδρά με τον συμπαράγοντά της, την DGCR8 πρωτεΐνη (DiGeorge syndrome critical region gene 8), πρωτεΐνη Pasha στη D.melanogaster, η οποία περιέχει δύο περιοχές πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA και μία WW περιοχή η οποία είναι πιθανόν υπεύθυνη για την αλληλεπίδρασή της με την Drosha πρωτεΐνη (Kim, 2005). Το σύμπλοκο αυτών των δύο πρωτεϊνών είναι υπεύθυνο για το σχηματισμό ενός μορίου μήκους νουκλεοτιδίων, το pre-mirna, το οποίο έχει σχήμα φουρκέτας (Bartel, 2004). Η Drosha κόβει και τους δύο κλώνους του στελέχους του pri-mirna, δημιουργώντας ένα 5 -φωσφορικό άκρο και αφήνοντας περίπου δύο προεξέχοντα νουκλεοτίδια στο 3 - υδροξυλικό άκρο, στη βάση του στελέχους του pre-mirna (Bartel, 2004). Παρόλο που η Drosha καταλύει την διαδικασία επεξεργασίας του pri-mirna, εξαρτάται από τον πρωτεϊνικό συμπαράγοντά της για να της προσδώσει αποτελεσματικότητα και ακρίβεια. Στηρίζεται στην DGCR8, ώστε να τοποθετήσει σωστά τις καταλυτικές της υπομονάδες επάνω στο pri-mirna, στη σωστή θέση (Carthew, and Sontheimer, 2009), καθώς πραγματοποιεί ένα πολύ συγκεκριμένο κόψιμο σε απόσταση περίπου 11 νουκλεοτιδίων από το σημείο ένωσης του δίκλωνου στελέχους με το μονόκλωνο RNA (Han et al., 2006). Αυτό το πρώτο κόψιμο από τη Drosha, αντιστοιχεί στο ένα άκρο του ώριμου mirna (Bartel, 2004). Η Drosha αναγνωρίζει τη δομή φουρκέτας αλλά δεν χρησιμοποιεί για τη δράση της την 5 -καλύπτρα και την 3 -ουρά poly(a), υποδηλώνοντας πως ίσως η διαδικασία επεξεργασίας του pri-mirna, μπορεί να ξεκινά πριν την ολοκλήρωση της διαδικασίας δημιουργίας του (Zeng, 2006). Δύο άλλες πρωτεΐνες οι οποίες ενισχύουν τη δράση της Drosha, είναι οι RNA ελικάσες p68 και p72 (Shiohama et al., 2007, Gregory et al., 2004). Στη συνέχεια το pre-mirna μεταφέρεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, με τη βοήθεια της πρωτεΐνης Exportin-5 (Exp5) και του συμπαράγοντά της RAN-GTP. Η Exp5 είναι μέλος μιας οικογένειας πρωτεϊνών που εξειδικεύονται στη μεταφορά μακρομορίων από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Η Exp5 προσδένεται ειδικά σε μικρά ελικοειδή RNAs που έχουν ένα 3 -προεξέχον άκρο. Το σύμπλοκο Exp5/Ran-GTP εμφανίζει μεγάλη συγγένεια για τα pre-mirnas, καθώς η αλληλεπίδρασή τους μπορεί εύκολα να αποδειχτεί in vitro. Μάλιστα, όταν σε καλλιέργειες κυττάρων έγινε απαλοιφή του γονιδίου που κωδικοποιεί για την Exp5, παρόλο που και τα επίπεδα του pre-mirna και του ώριμου mirna μειώθηκαν, το pre-mirna δεν συσσωρεύονταν στον πυρήνα των κυττάρων (Lund et al., 2004, Yi et al., 2003). Αυτή η παρατήρηση μπορεί να προσδώσει ένα δεύτερο χαρακτηριστικό στην Exp5,

38 υποδηλώνοντας την προστασία των pre-mirnas από τη στιγμή του σχηματισμού τους μέχρι τη στιγμή του επόμενου σταδίου επεξεργασίας που λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Εκεί, το GTP υδρολύεται σε GDP, και το σύμπλοκο Exp5/Ran-GDΡ απελευθερώνει το φορτίο του (Zeng, 2006). Μετά την εξαγωγή τους από τον πυρήνα, τα pre-mirnas υποβάλλονται σε περαιτέρω επεξεργασία, από την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Dicer, ώστε να παραχθούν τα δίκλωνα mirnas μήκους ~22 νουκλεοτιδίων. Η Dicer έχει 5 διακρτιτές περιοχές, 2 περιοχές με δραστικότητα ενδονουκλεάσης ΙΙΙ, μία περιοχή πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA, μία περιοχή RNA ελικάσης (dead-box RNA helicase domain), μία DUF283 περιοχή και μία PAZ περιοχή (Kim, 2005). Η περιοχή ΡΑΖ, μήκους περίπου 130 αμινοξέων, προσδένεται σε 3 μονόκλωνα άκρα δίκλωνων RNAs. Καθώς το pre-mirna, το οποίο έχει δημιουργηθεί από τη Drosha περιέχει ήδη 2 προεξέχοντα νουκλεοτίδια στο 3 -άκρο του, αναγνωρίζεται εύκολα από την Dicer σαν υπόστρωμα, η οποία κόβει το μόριο σε απόσταση 20 νουκλεοτιδίων από το 3 -άκρο, παράγοντας ένα δίκλωνο mirna, το οποίο φέρει 2 προεξέχοντα νουκλεοτίδια στο 3 -άκρο και των δύο κλώνων του (Zeng, 2006). Αποτέλεσμα αυτού του σταδίου είναι η δημιουργία του συμπλόκου του δίκλωνου mirna, μήκους 22 νουκλεοτιδίων (mirna: mirna*) (Bartel, 2004). Όπως και στην περίπτωση της Drosha, έτσι και η Dicer απαιτεί για την πρόσδεσή της στο RNA έναν συμπαράγοντα, που στον άνθρωπο αντιστοιχεί στις πρωτεΐνες TRBP (TAR RNA binding protein) και PACT. Αυτοί οι συμπαράγοντες ενδυναμώνουν την συγγένεια της Dicer για τα δίκλωνα RNAs και συμμετέχουν στην επιλογή του ώριμου κλώνου mirna και ίσως βοηθούν στη μεταφορά τους στο τελικό σταθμό επεξεργασίας, στις πρωτεΐνες Argonaute (Zeng, 2006). Στο επόμενο στάδιο της βιογένεσης, τα σύμπλοκα mirna: mirna* μεταφέρονται στο πρωτεϊνικό σύμπλοκο επεξεργασίας RISC (RNA-induced silencing complex), ώστε να πραγματοποιηθεί το ξεδίπλωμα του δίκλωνου RNA και τελικά η επιλογή και η ενσωμάτωση της ενεργούς mirna αλυσίδας στο σύμπλοκο RISC (Εικόνα 10) (Llave and Tuschl, 2004, Schwarz et al., 2004). Το ενεργό πλέον σύμπλοκο RISC, που κουβαλά το mirna, απαντάται στη βιβλιογραφία με διάφορους όρους όπως RISC*, mirisc, mirgonaute, mirnp (mirnacontaining ribonucleoprotein complex) (Kim, 2005)

39 Εικόνα 10: Στάδια βιογένεσης των micrornas. Η παραλαβή του mirna:mirna* συμπλόκου από το σύμπλοκο επεξεργασίας RISC (Kusenda et al., 2006). Το κύριο συστατικό του RISC συμπλόκου είναι οι πρωτεΐνες Argonautes, όπου στον άνθρωπο εντοπίζονται 4 παράλογα μέλη (Ago 1-4). Οι Argonaute πρωτεΐνες συχνά αποκαλούνται ΡPD πρωτεΐνες, καθώς περιέχουν τις PAZ και PIWI περιοχές (Cerutti et al., 2000). Η PAZ περιοχή έχει τη δυνατότητα χαλαρούς πρόσδεσης σε μονόκλωνο RΝΑ, μήκους τουλάχιστον 5 νουκλεοτιδίων, καθώς και σε δίκλωνο RNA, υποδεικνύοντας πιθανή συσχέτιση των Αgo πρωτεϊνών με το mirna, πριν και μετά την αναγνώριση του mrnaστόχου (Bartel, 2004). Η PIWI περιοχή έχει ενεργότητα ενδονουκλεάσης-η. Πρωταρχικό βήμα λοιπόν στη συναρμολόγηση του RISC συμπλόκου είναι η ενσωμάτωση του mirna: mirna* συμπλόκου στις Ago πρωτεΐνες, διαδικασία η οποία απαιτεί την κατανάλωση ενέργειας, καθώς το mirna: mirna* σύμπλοκο είναι πολύ ογκώδες και για αυτό το λόγο οι Ago πρωτεΐνες πρέπει να υποστούν δομική αναδιαμόρφωση, η οποία λαμβάνει χώρα μέσω της υδρόλυσης του ΑΤΡ (Kawamata and Tomari, 2010). Έχει αποδειχθεί, πως σημαντικό ρόλο σε αυτή την αναδιαμόρφωση παίζουν οι μοριακές συνοδοί Hsc70 Hsp90 (Iki et al., 2010, Iwasaki et al., 2010). Μετά το φόρτωμα του mirna: mirna* συμπλόκου στο RISC, ακολουθεί το ξετύλιγμά του, μία διαδικασία που δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως (Matranga et al., 2005). Θεωρείται πως αυτή η διαδικασία πραγματοποιείται από ένα ένζυμο με δραστικότητα ελικάσης, το οποίο αλληλεπιδρά και απελευθερώνει το άκρο του κλώνου προς επιλογή (Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003). Παραδόξως αυτή η διαδικασία δεν απαιτεί ΑΤΡ, πιθανόν λόγω σύνδεσής της με τη διαδικασία δομικής αναδιαμόρφωσης των Ago πρωτεινών (Yoda et al., 2010, Kawamata and Tomari, 2010)

40 Στη συνέχεια ακολουθεί η επιλογή της ενεργούς αλυσίδας του δίκλωνου RNA συμπλόκου από το mirisc. Το ανθρώπινο mirisc αποτελείται από τις πρωτεΐνες Ago, με κύρια την πρωτεΐνη Ago2 ή αλλιώς elf2c2 καθώς και από τις ελικάσες Gemin 3 & Gemin4 (Mourelatos et al., 2002). Η επιλογή του κλώνου βασίζεται κυρίως στις θερμοδυναμικές ιδιότητες του συμπλόκου RNA. Ο κλώνος με τη μικρότερη θερμοδυναμική σταθερότητα στο 5 -άκρο είναι συνήθως αυτός που επιλέγεται. Για παράδειγμα ένας κλώνος ο οποίος έχει στο 5 -άκρο του ένα ζεύγος βάσεων G:U, είναι λιγότερο σταθερός από έναν που έχει ένα ζεύγος βάσεων Α:U ή G:C. Αυτή η αρχή επιλογής ίσως εξηγεί γιατί υπάρχουν τόσα πολλά mirnas με κατάλοιπα U στο 5 -άκρο τους. Ο κλώνος που θα συσχετιστεί με τις Ago πρωτεΐνες, ονομάζεται mirna κλώνος, ενώ ο άλλος ονομάζεται mirna* κλώνος. O mirna* κλώνος αποικοδομείται, ενώ ο mirna κλώνος κατευθύνει το mirisc σύμπλοκο στους mrna-στόχους (Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003). 2.2.ε. Μηχανισμός δράσης: i) Αναγνώριση του στόχου: Πρωταρχικό βήμα για την άσκηση της κατασταλτικής δράσης του mirna αποτελεί η αναγνώριση του mrna-στόχου του. Υπάρχουν αρκετά δεδομένα που υποστηρίζουν ότι η ειδικότητα της δράσης του mirna, στα ζώα, καθορίζεται από την συμπληρωματικότητα των βάσεων 2-8 του 5 -άκρου του mirna, αλληλουχία η οποία ονομάζεται seed αλληλουχία, με την 3 -αμετάφραστη περιοχή (3 -UTR) του mrna-στόχου (Pusch et al., 2003, Stark et al., 2003). Μία πρόσφατη έρευνα, βέβαια, αντικρούει την αναγκαιότητα ύπαρξης συμπληρωματικότητας μεταξύ του 5 -άκρου του mirna και της 3 -αμετάφραστης περιοχής του mrna-στόχου, αναγνωρίζοντας πρόσδεση και καταστολή του mrna-στόχου από το mirna σε αλληλουχία της 3 -UTR που δεν είναι συμπληρωματική με την seed αλληλουχία (Lal et al., 2009). Επίσης, πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα mirnas των ζώων στοχεύουν και σε άλλες περιοχές των mrnas-στόχων, πέραν της 3 -αμετάφραστης περιοχής, όπως η κωδική αλληλουχία (CDS), αλληλεπίδραση μέσω της οποίας είναι γνωστό ότι ασκούν την κατασταλτική τους δράση τα mirnas των φυτών. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν το mir-24 το οποίο καταστέλλει το p16, μέσω πρόσδεσης στην CDS του στόχου (Lal et al., 2008) και το let-7 το οποίο έχει 3 συντηρημένες λειτουργικές θέσεις πρόσδεσης στην κωδική αλληλουχία της Dicer (Forman et al., 2008). Η σημασία της συμπληρωματικότητας για το 5 -άκρο των mirnas, διαφάνηκε από την αρχική παρατήρηση ότι η αμετάφραστη περιοχή του γονιδίου lin-14, παρουσιάζει

41 συμπληρωματικότητα με την 5 -περιοχή του lin-4 mirna. Πιο πρόσφατες παρατηρήσεις που υποστηρίζουν την αναγκαιότητα ύπαρξης της συμπληρωματικότητας αυτής περιλαμβάνουν τα κάτωθι στοιχεία: 1) τα κατάλοιπα 2-8 αρκετών mirnas ασπόνδυλων, έχουν τέλεια συμπληρωματικότητα με στοιχεία στην 3 -αμετάφραστη περιοχή mrna στόχων, τα οποία έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβούν στην μετα-μεταγραφική καταστολή του στόχου, 2) τα κατάλοιπα των mrnas που ζευγαρώνουν με τα κατάλοιπα 2-8 των mirnas είναι απόλυτα συντηρημένα μεταξύ των ασπόνδυλων, 3) τα κατάλοιπα 2-8 είναι τα πιο συντηρημένα μεταξύ ομόλογων mirnas στα μετάζωα, 4) όταν χρησιμοποιούνται εργαλεία βιοπληροφορικής για την πρόβλεψη νέων mrna-στόχων, η απαίτηση για απόλυτη συμπληρωματικότητα αυτών με το επταμερές που σχηματίζεται από τα κατάλοιπα 2-8 του mirna υπό μελέτη, είναι πολύ πιο αποτελεσματική σε σχέση με απαίτηση για οποιοδήποτε άλλο επταμερές του υπό μελέτη mirna και 5) αυτός ο μηχανισμός χρησιμοποιείται και από την διαμεσολαβούμενη από sirnas καταστολή του mrna καθώς και από κάποια mirnas στα φυτά, υποδεικνύοντας έναν καθολικό μηχανισμό δράσης (Bartel, 2004). ii) Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από τα micrornas: Βασική λειτουργία των micrornas είναι η μείωση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων-στόχων. Αυτό επιτυγχάνεται σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο, μέσω κυρίως τριών μηχανισμών: 1) της πέψης του mrna, 2) της αποσιώπησης της μεταγραφής και 3) της καταστολής της μετάφρασης. Η επιλογή του μηχανισμού εξαρτάται από την ταυτότητα του στόχου καθώς επίσης και από τη σύσταση του πρωτεϊνικού συμπλόκου RISC, καθώς ενώ όλα τα μέλη της οικογένειας Ago φαίνεται να είναι ικανά να καταστείλουν την μετάφραση των στόχων, όμως μόνο κάποια μέλη έχουν την ικανότητα πέψης του mrna, όπως για παράδειγμα η Ago2 στον άνθρωπο (Liu et al., 2004, Okamura et al., 2004, Meister et al., 2004, Pillai et al., 2004). Σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας του mrna με το microrna, επιλέγεται ο 1 ος μηχανισμός, ενώ σε περίπτωση μερικής συμπληρωματικότητας, επιλέγεται ο 2 ος ή ο 3 ος (Hutvagner and Zamore, 2002, Zeng et al., 2003, Doench et al., 2003). Κατά την πέψη του mrna, διασπάται ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός μεταξύ των νουκλεοτιδίων που σχηματίζουν ζεύγη βάσεων με τα νουκλεοτίδια 10&11 του mirna, από την Ago πρωτεΐνη η οποία βρίσκεται συνδεδεμένη με το mirna και η οποία φέρει δραστικότητα ενδονουκλεάσης, λόγω της PIWI περιοχής της (Liu et al., 2004, Meister et al.,2004). Μετά την πέψη του mrna, τα mirnas παραμένουν άθικτα και μπορούν να καθοδηγήσουν την αναγνώριση και καταστροφή και άλλων

42 μεταγράφων (Hutvagner and Zamore, 2002, Tang et al., 2003). Αυτός ο μηχανισμός επιλέγεται κατά κύριο λόγο από τα mirnas των φυτών για την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ενώ ένας ακόμη μηχανισμός στα φυτά περιλαμβάνει τη μεθυλίωση της χρωματίνης (Grewal and Rice, 2004). Τα mirnas των ζώων, λόγω της ατελούς συμπληρωματικότητας του ώριμου mirna με το mrna-στόχο, επιλέγουν είτε το μηχανισμό της αποσιώπησης της μεταγραφής είτε το μηχανισμό της καταστολής της μετάφρασης (Olsen and Ambros, 1999, Doench et al., 2003) (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης από τα micrornas των ζώων, μέσω μεταγραφικής καταστολής (a) και μέσω μεταφραστικής καταστολής (πιθανά μοντέλα δράσης 1-6) (Kwak et al., 2010). Μελέτες των mirnas των ζώων, απέδειξαν πως η μεταγραφική καταστολή δεν συνοδεύεται από πέψη του mrna, παρόλο που σε κάποιες περιπτώσεις παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των επιπέδων των mrna-στόχων, λόγω αύξησης της αποδόμησης του mrna (Bagga et al., 2005, Lim et al., 2005, Behm-Ansmant et al., 2006, Giraldez et al., 2006, Wu et al., 2006). Αυτή η αυξημένη αποικοδόμηση δεν οφείλονταν σε, καταλυόμενη από τις Ago πρωτεΐνες, πέψη του mrna, αλλά σε μηχανισμούς από-αδενυλίωσης, αφαίρεσης της 5 -καλύπτρας και εξωνουκλεολυτικής διάσπασης του mrna (Behm-Ansmant et al.,2006,

43 Giraldez et al., 2006, Wu et al., 2006). Πρώτο βήμα στη διαδικασία της αποικοδόμησης του mrna στα ζώα, αποτελεί η αφαίρεση της ουράς poly-a από αποαδενυλάσες και στη συνέχεια το mrna είτε μπορεί να καταστραφεί από το 3 -άκρο του από το εξώσωμα, ένα σύμπλοκο 3-5 εξωνουκλεασών, είτε μπορεί να επεξεργαστεί περαιτέρω με αφαίρεση της 5 -καλύπτρας από το DCP1:DCP2 σύμπλοκο και επακόλουθη αποικοδόμηση του mrna από την 5-3 εξωνουκλεάση XRN1. Οι πρωτεΐνες οι οποίες είναι απαραίτητες για την 5-3 αποικοδόμηση του mrna, βρίσκονται σε θέσεις αποσύνθεσης του mrna, τα Ρ-σωμάτια ή τα GW-σωμάτια, λόγω της συσσώρευσης σε αυτά της πρωτεΐνης GW182 (Rehwinkel et al., 2005), την οποία στρατολογεί η Ago πρωτεΐνη για την καταστολή της μεταγραφής (Behm- Ansmant et al., 2006). Όσον αφορά στην ρύθμιση, από τα mirnas των ζώων, της γονιδιακής έκφρασης μέσω καταστολής της μετάφρασης, παρά την τεράστια πρόοδο που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια σε αυτόν τον ερευνητικό τομέα, δεν είναι ακόμα ξεκάθαρος ο ακριβής μηχανισμός. Ωστόσο, έχουν αναπτυχθεί διάφορα μοντέλα μεταφραστικής καταστολής τα οποία περιλαμβάνουν 1) την καταστολή από το RISC κάποιου βήματος της πρωτεϊνοσύνθεσης μετά την έναρξή της, όπως καταστολή της ανάκτησης της 60S ριβοσωμικής υπομονάδας, 2) την καταστολή σε κάποιο μετέπειτα στάδιο της πρωτεϊνοσύνθεσης, όπως η επιμήκυνση του νεοσυντιθέμενου πεπτιδίου ή η αποβολή των ριβοσωμάτων, 3) την επαγώμενη από το RISC πρωτεόλυση των νεοσυντιθέμενων πεπτιδίων ή 4) την αποικοδόμηση ή αποθήκευση σε ανενεργή μορφή των mrna-στόχων στα Ρ-σωμάτια (Kwak et al., 2010). Αυτά τα σενάρια δεν αποκλείουν το ένα το άλλο, ενώ περαιτέρω έρευνα θα αποκαλύψει τον ακριβή τρόπο καταστολής της μετάφρασης από τα mirnas των ζώων. Ένα σημαντικό ερώτημα που τίθεται αφορά στο αν η αποικοδόμηση του mrna που παρατηρείται στα ζώα, είναι αποτέλεσμα μιας πρωταρχικής επίπτωσης στην μετάφραση. Υπάρχουν αρκετά δεδομένα τα οποία υποστηρίζουν ότι οι δύο διαδικασίες είναι ανεξάρτητες (Wu et al., 2006, Wakiyama et al., 2007), αν και δεν είναι γνωστό γιατί κάποιοι στόχοι αποικοδομούνται και κάποιοι άλλοι όχι. Έχει προταθεί πως ο αριθμός, ο τύπος και η θέση των λανθασμένα ζευγαρωμένων βάσεων στο σύμπλοκο mirna/mrna, πιθανόν να παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιλογή της αποικοδόμησης ή της καταστολής της μετάφρασης (Aleman et al., 2007)

44 2.2.στ. Υποκυτταρική οργάνωση: Ο τρόπος με τον οποίο οργανώνονται ενδοκυτταρικά τα συστατικά του μηχανισμού γονιδιακής ρύθμισης των mirnas είναι ένα ιδιαίτερα σημαντικό ζήτημα. Οι πρωτεΐνες Ago βρίσκονται συχνά συνδεδεμένες με ενδοκυτταρικά οργανίδια, όπως το σύστημα Golgi και το ενδοπλασματικό δίκτυο (Cikaluk et al., 1999), προτείνοντας πιθανώς πως κι άλλοι παράγοντες του mirisc συμπλόκου μπορεί να βρίσκονται προσδεδεμένοι σε συγκεκριμένα υποκυτταρικά διαμερίσματα. Μεταξύ αυτών των διαμερισμάτων είναι τα σωμάτια Ρ ή τα GW σωμάτια, κυτταροπλασματικές περιοχές στις οποίες συχνά συσσωρεύονται ανενεργά mrnas. Σημαντικό στοιχείο αποτελεί επίσης η παρατήρηση ότι υπομονάδες του mirisc συμπλόκου (mirnas, Ago, and GW182), καθώς και κατεσταλμένοι στόχοι τους, βρίσκονται επίσης σε μεγάλες ποσότητες στα σωματίδια GW (Jakymiw et al., 2005, Liu et al., 2005, Pillai et al., 2005). Βέβαια τα ίδια τα GW σωμάτια δεν είναι απαραίτητα για την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης από τα mirnas, αλλά αντίθετα για να ολοκληρωθεί ο σχηματισμός αυτών των σωματιδίων είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός άθικτου mirna μονοπατιού. Αυτές οι παρατηρήσεις, υποδηλώνουν ότι η διαδικασία της αποσιώπησης εκκινεί σε κάποια άλλη θέση στο κυτταρόπλασμα με τον μετέπειτα εντοπισμό στα σωμάτια αυτά να προκύπτει ως συνέπεια της αποσιώπησης. Το αν τα P & GW σωμάτια είναι ο τελευταίος σταθμός της mirisc μηχανής και των στόχων της, δεν είναι γνωστό (Carthew and Sontheimer, 2009). Είναι πιθανό να υπάρχουν τρόποι ώστε το σύμπλοκο mirisc να ανακυκλώνεται και να επαναχρησιμοποιείται για να αλληλεπιδράσει και με άλλους στόχους. Υπάρχουν στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτό το μηχανισμό. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη Imp8 (importin8) εντοπίζεται μαζί με τις Ago πρωτεΐνες στα Ρ σωμάτια και είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική πρόσδεση των Ago πρωτεϊνών σε διάφορους mrna στόχους. Είναι πιθανό η Imp8 να κατευθύνει τις Ago πρωτεΐνες, συνδεδεμένες με τα mirnas, πίσω στον πυρήνα των ανθρώπινων κυττάρων για ρύθμιση της έκφρασης και άλλων mrna στόχων (Εικόνα 12) (Weinmann et al., 2009)

45 Eικόνα 12: Πιθανός μηχανισμός ανακύκλωσης του mirisc συμπλόκου μέσω συμμετοχής της Imp8. Η Imp8 είτε οδηγεί την, προσδεδεμένη στο mirna, Ago πρωτεΐνη στον πυρήνα είτε τη βοηθά στην επανάκτηση του mrnaστόχου, διαδικασία που ακολουθείται από αποσυναρμολόγηση του συμπλόκου και συσσώρευση των mrnps (Weinmann et al., 2009). 2.2.ζ. Έκφραση των mirnas: Τα micrornas αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι του γονιδιώματος αντιστοιχώντας σε ένα ποσοστό 1-5% του συνόλου των γονιδίων στα φυτά, στα σκουλήκια και στα θηλαστικά (Yang and Mattes, 2008). Ο αριθμός των αντιγράφων, ισχυρά εκφραζόμενων mirnas, μπορεί να ξεπεράσει τα 104 ανά κύτταρο, αριθμός όμοιος με αυτόν πολλών μικρών πυρηνικών RNAs και πολύ μεγαλύτερος από αυτόν ενός τυπικού mrna (Lim et al.,2003b). Πολλά mirnas, όπως το lin-4, έχουν ιστοειδική έκφραση ή έκφραση εξαρτώμενη από το αναπτυξιακό στάδιο (Feinbaum and Ambros, 1999, Reinhart et al., 2000, Lagos-Quintana et al., 2001, Lau et al., 2001, Lee and Ambros, 2001). Σαν αποτέλεσμα, η έκφραση ενός συγκεκριμένου mirna μπορεί να ποικίλλει σημαντικά, εξαρτώμενη από τον κυτταρικό τύπο. Ένα μόνο mirna μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση χιλιάδων γονιδίων, υπογραμμίζοντας την εμπλοκή τους σε πάρα πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια (Yang and Mattes, 2008). Ωστόσο η πρόσδεση ενός μόνο mirna μπορεί να μην είναι αρκετή και να απαιτούνται πολλά mirnas ώστε να δράσουν συνεργιστικά για την αποτελεσματική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (Yang and Mattes, 2008)

46 2.2.η. Ρύθμιση της έκφρασης των micrornas: Ολοένα και περισσότερα δεδομένα υποστηρίζουν πως τα micrornαs έχουν διάφορα, ξεχωριστά προφίλ έκφρασης τα οποία βρίσκονται υπό τον έλεγχο αναπτυξιακών ή/και ιστοειδικών σηματοδοτικών μονοπατιών (Tsuchiya et al., 2006). Παρά την συνεχώς αυξανομένη γνώση στον τομέα των mirnas, ο μοριακός μηχανισμός ρύθμισης της έκφρασής τους είναι άγνωστος (Deiters, 2010). Η έκφραση των mirnas πιθανόν να ελέγχεται σε πολλά στάδια της βιογένεσή τους, με τη ρύθμιση στο μεταγραφικό επίπεδο να αποτελεί πιθανότατα τον κύριο μηχανισμό. Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε ένας μικρός αριθμός μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση κάποιων γονιδίων που κωδικοποιούν mirnas, μέσω πρόσδεσης σε ρυθμιστικά στοιχεία που βρίσκονται ανοδικά των γονιδίων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ρύθμιση του mir συσσωματώματος από το μεταγραφικό παράγοντα Myc (O'Donnell et al., 2005, Shah et al., 2007). Ακόμη υπάρχουν πολλά παραδείγματα ρύθμισης μεταγραφικών παραγόντων από mirnas, οι οποίοι με τη σειρά τους ρυθμίζουν την έκφραση των ίδιων των mirnas, αναδεικνύοντας έναν μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης (double negative feedback loop). Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα αποτελεί το mirna let-7, στο C. elegans, που καταστέλλει την μετάφραση του γονιδίου Lin28, το γονιδιακό προϊόν του οποίου ρυθμίζει τα επίπεδα του let-7 (Seggerson et al., 2002). Επίσης, ρύθμιση φαίνεται να επιτελείται και σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση του mir-38 του C.elegans, το οποίο εκφράζεται μόνο στο έμβρυο, υποδεικνύοντας ρύθμιση της έκφρασης από κάποιο αναπτυξιακό σήμα (Ambros et al., 2003). Τέλος, η έκφραση των mirnas πιθανόν ρυθμίζεται και σε ένα επίπεδο πριν τη μεταγραφή τους, με την έκφρασή τους να επηρεάζεται είτε από διπλασιασμούς γονιδίων, είτε από γονιδιακές μεταλλάξεις, είτε από υπερμεθυλίωση των υποκινητών των γονιδίων τους, όπως στην περίπτωση του mir-127, το οποίο στην Τ24 καρκινική κυτταρική σειρά εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα λόγω υπερμεθυλίωσης του υποκινητή του, έκφραση η οποία μπορεί να αυξηθεί μετά από χειρισμό των κυττάρων με μέσα απομεθυλίωσης (5-aza- 2 -deoxycytidine) (Saito et al., 2006)

47 2.2.θ. Έκφραση των micrornas στους ιούς: Πρόσφατα ανακαλύφθηκαν πολλά mirnas τα οποία κωδικοποιούνται από ιϊκά γονίδια, οι λειτουργίες των οποίων παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, με εξαίρεση τα ιϊκά mirnas, τα οποία προέρχονται από 3 διαφορετικές οικογένειες ιών- τους ερπητοϊούς, τους ρετροϊούς και τους polyoma ιούς (Sullivan and Ganem, 2005). Μεταξύ των ιών που κωδικοποιούν mirnas είναι ο ανθρώπινος ιός Epstein-Barr (EBV), ο ανθρώπινος κυτομεγαλοϊός (HCMV), ο ιός του HIV καθώς και ο SV-40 (Christopher et al., 2005, Pfeffer et al., 2004, Grey et al., 2005). Φαίνεται πως τα ιϊκά mirnas, τα οποία εξελίσσονται με ιδιαίτερα γρήγορους ρυθμούς, ρυθμίζουν τόσο την έκφραση των ιϊκών γονιδίων, όσο και την έκφραση των γονιδίων των ξενιστών, τα οποία εμπλέκονται στην αντιϊκή άμυνα, τόσο στα ζώα όσο και στα φυτά (Sullivan et al., 2005). Τα micrornas που κωδικοποιούνται από τους ξενιστές, συμμετέχουν στην ενίσχυση της αντιϊκής άμυνας, μέσω διπλασιασμού των επιπέδων τους, στοχεύοντας στην καταστροφή ξένου γενετικού υλικού (Scaria et al., 2006). Σε αντίθεση με αυτή την παρατήρηση υπάρχει μία έρευνα που υποστηρίζει πως το ηπατοειδικό microrna mir-122, είναι απαραίτητο για την αυτόνομη αντιγραφή του ιού της ηπατίτιδας C, για τη ρύθμιση της μετάφρασης καθώς και για την πέψη του RNA (Jopling et al., 2005), αναδεικνύοντας μία περίπτωση χρήσης των micrornas ως θετικών ρυθμιστών της έκφρασης των ιών. Η ανακάλυψη ιών που κωδικοποιούν micrornas παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην κατανόηση της παθογένεσης της νόσου που προκαλούν οι ιοί, αναδεικνύοντας ένα νέο επίπεδο αλληλεπίδρασης των ξενιστών με τα παθογόνα και συμβάλλοντας στον σχεδιασμό νέων προληπτικών και θεραπευτικών στρατηγικών. 2.2.ι. Λειτουργία των micrornas: Τα mirnas εμπλέκονται στη ρύθμιση μίας πληθώρας κυτταρικών διαδικασιών. Έχει βρεθεί πως τα mirnas είναι ικανά να ρυθμίσουν την διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων (Monticelli et al., 2005, Garzon et al., 2006), να συνεισφέρουν στην καθιέρωση μυϊκών φαινοτύπων (Naguibneva et al., 2006), να ρυθμίσουν την μορφογένεση επιθηλιακών ιστών (Yi et al., 2006), να ρυθμίσουν την οργανογένεση (Lu et al., 2005a), να ρυθμίσουν μεταβολικές διαδικασίες (Krtzufdelt et al., 2005), να συμμετέχουν στην έμφυτη ανοσοαπόκριση μέσω καταστολής της σύνθεσης των ιϊκών πρωτεϊνών (Αppel and Bartenschlager, 2006) και να ρυθμίσουν τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση (Carleton et al., 2007)

48 Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ρύθμιση της λειτουργίας των στελεχιαίων κυττάρων από τα micrornas. Τα mirnas φαίνεται να είναι σημαντικοί ρυθμιστές της λειτουργίας των στελεχιαίων κυττάρων, καθώς η έκφρασή τους σε αυτά τα κύτταρα διαφοροποιείται σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς (Suh et al., 2004) και υπάρχουν αρκετά δεδομένα τα οποία αποδεικνύουν τον μοναδικό ρόλο που έχουν τα micrornas στη διαφοροποίηση των στελεχιαίων κυττάρων. Χρησιμοποιώντας dcr-1-/- μεταλλαγμένα ποντίκια, οι Berstein και συνεργάτες (Berstein et al., 2003) απέδειξαν τη σημασία των micrornas στη διαφοροποίηση των στελεχιαίων κυττάρων και στην επιβίωση των οργανισμών, καθώς τα ποντίκια αυτά πέθαναν σε πολύ αρχικό στάδιο της ανάπτυξης και τα επίπεδα των στελεχιαίων κυττάρων στα έμβρυα των ποντικών ήταν ιδιαίτερα μειωμένα (Berstein et al., 2003). Με χρήση της ίδιας μεθοδολογίας, αλλά στη Drosophila, οι Hatfield και συνεργάτες (Hatfield et al., 2005) απέδειξαν τη σημασία των micrornas για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και τη διαφοροποίηση των στελεχιαίων κυττάρων της σπερματογραμμής. 2.2.κ. micrornas και καρκίνος: Δεδομένου του μεγάλου εύρους φυσιολογικών διαδικασιών στις οποίες εμπλέκονται τα micrornas, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι σε μία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων έχουν καταγραφεί ασυνήθιστα επίπεδα έκφρασής τους, καθιστώντας τα ρυθμιστικά αυτά μόρια ιδανικούς υποψήφιους για χρήση ως προγνωστικούς και/ή ως διαγνωστικούς δείκτες. Πολλά micrornas βρίσκονται σε χρωμοσωμικές περιοχές ευάλωτες σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες, που μπορούν να επάγουν την έκφραση κάποιου microrna σε λάθος κυτταρικό τύπο ή τη λάθος χρονική στιγμή. Πάνω από το 50% των γονιδίων που κωδικοποιούν micrornas εντοπίζονται σε γενωμικές θέσεις οι οποίες σχετίζονται με τον καρκίνο ή σε εύθραυστες θέσεις του γονιδιώματος (Calin et al., 2004). Υπάρχει διαθέσιμη πληθώρα δεδομένων που υποστηρίζει πως η μη φυσιολογική έκφραση των micrornas συνδέεται με πολλούς τύπους καρκίνου. Στον πίνακα 1 παρατίθεται μία λίστα διαφόρων τύπων καρκίνου και της συσχέτισής τους με την ανοδική ή καθοδική ρύθμιση διαφόρων micrornas (Zhang et al., 2007). Τα micrornas έχουν πολύ διαφορετικά προφίλ έκφρασης στου καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς, προφίλ τα οποία μπορεί να διαφέρουν κατά πολύ μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου

49 και τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη κατάταξη καρκινικών ιστών, τόσο με βάση την προέλευσή τους όσο και με το στάδιο διαφοροποίησής τους (Lu et al., 2005b). Πίνακας 1: Αύξηση ή μείωση της έκφραση διαφόρων micrornas σε 9 διαφορετικούς τύπους καρκίνου και τα πιθανά γονίδια στόχοι τους (Zhang et al., 2007). Τα micrornas μπορούν να λειτουργήσουν είτε ως ογκογονίδια είτε ως ογκοκατασταλτικά γονίδια. Αυτά τα micrornas των οποίων η έκφραση αυξάνεται στους όγκους, θεωρούνται ογκογονίδια, τα επονομαζόμενα oncomirs, τα οποία προάγουν την εξέλιξη του όγκου μέσω καταστολής της έκφρασης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων ή γονιδίων που ελέγχουν την κυτταρική διαφοροποίηση και την απόπτωση. Αντίθετα, η έκφραση κάποιων micrornas μειώνεται στους όγκους και κατά συνέπεια αυτά τα micrornas θεωρούνται ογκοκατασταλτικά, καταστέλλοντας την εξέλιξη του όγκου, μέσω καταστολής της έκφρασης ογκογονιδίων ή γονιδίων που ελέγχουν την κυτταρική διαφοροποίηση και την απόπτωση (Zhang et al., 2007, Hwang and Mendell, 2006). Η απορρύθμιση της έκφρασης των micrornas μπορεί να προκύψει: 1) από επιγενετικές αλλαγές, όπως για παράδειγμα μεθυλίωση των υποδοχέων τους (Calin et al., 2006), 2) από αλλαγές του αριθμού των αντιγράφων των γονιδιακών τόπων που τα κωδικοποιούν, 3) από

50 σημειακές μεταλλάξεις και 4) από απορρύθμιση του μονοπατιού βιογένεσής τους (Callin et al., 2004, Zhang et al., 2006) (Εικόνα 13). Εικόνα 13: Συσχέτιση του μονοπατιού βιογένεσης των micrornas και του καρκίνου. Γενετικές ανωμαλίες, όπως χρωμοσωμικές μετατοπίσεις και σημειακές μεταλλάξεις μπορούν να επάγουν ή να καταστείλλουν το μονοπάτι (a). Σημειακές μεταλλάξεις νουκλεοτιδίων, τα οποία σχετίζονται με την θερμοδυναμική ασυμμετρία των δύο κλώνων στο σύμπλοκο mirna/mirna* ή με την seed αλληλουχία του ώριμου mirna, μπορούν να οδηγήσουν σε αλλαγές στη γονιδιακή ρύθμιση (b & c). Γενετικές μεταλλάξεις των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες του μονοπατιού βιογένεσης μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε καταστολή ή επαγωγή των επιπέδων έκφρασης των micrornas, οδηγώντας εν τέλει το κύτταρο σε παθολογικές καταστάσεις (d) (Kwak et al., 2010). Τα ογκοκατασταλτικά micrornas είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της ακεραιότητας των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, καθώς και για τη ρύθμιση της απόπτωσης, και για αυτό οποιαδήποτε αλλαγή στον αριθμό των γονιδιακών αντιγράφων τους, μπορεί να προάγει την καρκινογένεση. Η διαγραφή συγκεκριμένων θέσεων micrornas σε διάφορους τύπους καρκίνου, συνδέεται με κακή πρόγνωση της νόσου (Esquela-Kerscher and Slack, 2006). Σημειακές μεταλλάξεις μπορεί να επηρεάσουν την θερμοδυναμική σταθερότητα των mirnas, οδηγώντας στην επιλογή του άλλου mirna κλώνου, από το RISC ή να αλλάξουν την νουκλεοτιδική αλληλουχία της seed αλληλουχίας, οδηγώντας στην αναγνώριση διαφορετικών mrna-στόχων. Τέλος, όσον αφορά στην απορρύθμιση του

51 μονοπατιού βιογένεσης των micrornas, ενδεικτικά αναφέρεται ότι μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 επηρεάζουν την αλληλεπίδρασή του με τους συμπαράγοντες της Drosha, p68 & p72, καθώς και με την ίδια τη Drosha, οδηγώντας σε μείωση της μετατροπής των pri-mirna σε pre- mirna και εν τέλει σε μείωση των επιπέδων των ώριμων mirna (Suzuki et al., 2009). Επίσης, κατά την βιογένεση κάποιων micrornas, η μετατροπή από την pri- στην pre-mirna μορφή ενισχύεται μέσω αλληλεπίδρασης του συμπαράγοντα p68, με τους ενδοκυτταρικούς τελεστές του TGF-β, τις R-Smads. Οποιαδήποτε διατάραξη αυτής της αλληλεπίδρασης μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένα επίπεδα ώριμου mirna (Davis et al., 2008). Τέλος, έχει βρεθεί πως ο συμπαράγοντας TRBP της Dicer φωσφορυλιώνεται από κινάσες σερίνης/θρεονίνης του μονοπατιού MAPK/Erk, φωσφορυλίωση η οποία επάγει την μετατροπή των pre-mirna σε mirna/mirna* για τα περισσότερα micrornas, αλλά μειώνει την μετατροπή αυτή στην περίπτωση του ογκοκατασταλτικού mir let-7, οδηγώντας σε χαμηλότερα επίπεδα έκφρασής του και κατ επέκταση αύξηση των επιπέδων έκφρασης των ογκογονιδίων, τα οποία βρίσκονται υπό τον έλεγχό του (Paroo et al., 2009). Ο καρκίνος μπορεί να επηρεάσει το μονοπάτι των micrornas σχεδόν σε όλα του τα βήματα, οπότε έχει μεγάλη σημασία να διαλευκανθεί ποια από αυτές τις επιδράσεις είναι αιτία και ποια συνέπεια της νόσου. 2.2.λ. Συσχέτιση των micrornas με τα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα: Όπως προαναφέρθηκε η μη φυσιολογική έκφραση των micrornas σχετίζεται με τον καρκίνο. Δεδομένου ότι η μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση και λειτουργία είναι στοιχεία-κλειδιά στον καρκίνο, πιστεύεται ότι οι επιγενετικές αλλαγές που οδηγούν σε απορρύθμιση της γονιδιακής λειτουργίας, προκαλούν την δυσλειτουργία των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (Zhao et al., 2008). Αυτή η δυσλειτουργία επιτρέπει στα κύτταρα να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα. Είναι γενικά αποδεκτό ότι διάφοροι παράγοντες και σήματα του μικροπεριβάλλοντος του κυττάρου είναι υπεύθυνοι για αυτές τις επιγενετικές αλλαγές που οδηγούν στην αντικανονική λειτουργία των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων. Ολοένα και περισσότερα δεδομένα δείχνουν ότι η μη φυσιολογική έκφραση των micrornas, είναι ικανή να προκαλέσει αυτή τη δυσλειτουργία των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (DeSano and Xu, 2009)

52 Για παράδειγμα το συσσωμάτωμα mir-17-92, εκφράζεται σε πολύ υψηλά επίπεδα στον καρκίνο του πνεύμονα. Η εισαγωγή του γονιδίου που κωδικοποιεί το συγκεκριμένο microrna συσσωμάτωμα σε στελεχιαία κύτταρα του αίματος, επιτάχυνε τη διαδικασία δημιουργίας ανωμαλιών της λέμφου (Hayashita et al., 2005). Επίσης ως πιθανοί στόχοι του mir έχουν χαρακτηριστεί το γονίδιο του Ε2F1 (το οποίο επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό) και το ογκοκατασταλτικό γονίδιο PTEN (το οποίο επάγει την απόπτωση) (Lu et al., 2007). Άλλο παράδειγμα αποτελεί το mir-135, το οποίο έχει βρεθεί να ρυθμίζεται ανοδικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου καθώς και σε αδενοκαρκινώματα. Το APC είναι ένα γονίδιο του οποίου η έκφραση οδηγεί στη δημιουργία πρωτεϊνών που δεν έχουν θέσεις πρόσδεσης για τη β-κατενίνη. Η έκφραση αυτού του γονιδίου φάνηκε να είναι μειωμένη σε καρκίνους στους οποίους υπερεκφραζόταν το mir-135 (Nagel et al., 2008). Αν το APC δεν εκφράζεται στα φυσιολογικά επίπεδα τότε θα σημειωθεί συσσώρευση της β-κατενίνης, οδηγώντας σε ενεργοποίηση, των υπεύθυνων γονιδίων για την κυτταρική αυτό-ανανέωση, υποδεικνύοντας πως το mir-135 μπορεί να έχει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (DeSano and Xu, 2009). Αντίθετα, η έκφραση του microrna let-7, φάνηκε να είναι μειωμένη σε καρκινικά στελεχιαία κύτταρα μαστού σε σχέση με διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα μαστού. Η διαμόλυνση καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων μαστού με let-7, μείωσε τον πολλαπλασιασμό τους in vitro αλλά και το σχηματισμό και τη μετάσταση όγκων, in vivo, μετά από υπερέκφρασή του σε ποντίκια (Yu et al., 2007). Τέλος, σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο παρατηρήθηκε απώλεια της έκφρασης του mir-199b-5p. Υπερέκφραση του mir-199b-5p σε μυελοβλάστωμα κύτταρα διέκοψε το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch, μέσω μείωσης της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα HES1, και επίσης μείωσε τον πληθυσμό των μυελοβλάστωμα καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (CD133+) (Garzia et al., 2009). Τα παραπάνω παραδείγματα παρέχουν σαφή συσχέτιση της έκφρασης των mirnas με τις διαδικασίες της αυτοανανέωσης και απόπτωσης των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων, η διερεύνηση της οποίας θα οδηγήσει στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων και της διαδικασίας έναρξης και προόδου του καρκίνου

53 2.2.μ. Το microrna mir 24: Το ώριμο μόριο του mir-24 μπορεί να προκύψει στα θηλαστικά από δύο διαφορετικές γονιδιακές θέσεις, που αντιστοιχούν στα συσσωματώματα mir23a-27a-24-2 (ή αλλιώς mir-23a συσσωμάτωμα) και mir23b-27b-24-1 (ή αλλιώς mir-23b συσσωμάτωμα). Ένας γονιδιακός διπλασιασμός της γενετικής θέσης που κωδικοποιεί το mir-23, είχε σαν αποτέλεσμα την εμφάνιση των δύο ανωτέρω παράλογων συσσωματωμάτων (Yu et al., 2006). Το συσσωμάτωμα mir-23a εντοπίζεται στον μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 9 και συγκεκριμένα στη θέση 9q22, στο χώρο μεταξύ γονιδίων, ενώ το συσσωμάτωμα mir-23b εντοπίζεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 19, στη θέση 19p13, μέσα στα όρια ενός ιντρονίου γονιδίου που κωδικοποιεί για πρωτεΐνη. Το συσσωμάτωμα mir-23a κωδικοποιεί ένα pri-mirna μετάγραφο το οποίο αποτελείται από 3 mirnas, τα mir-23a, mir-27a & mir-24-2 (Εικόνα 14), ενώ το συσσωμάτωμα mir-23b κωδικοποιεί ένα pri-mirna μετάγραφο το οποίο αποτελείται από τα mirnas: mir-23b, mir27b & mir24-1, με τα μέλη των δύο συσσωματωμάτων να μην εκφράζονται ισότιμα στους διάφορους ιστούς (Chhabra et al., 2010). Οι ώριμες μορφές των mir-23a και mir-27a διαφέρουν μόνο κατά ένα νουκλεοτίδιο από τις ώριμες μορφές των mir-23b mir-27b, ενώ η αλληλουχία της ώριμης μορφής των mir-24-1 & mir-24-2, το mir-24, είναι ακριβώς η ίδια και είναι η εξής: UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG (Yu et al., 2006 & Lagos-Quintana et al., 2001). Εικόνα 14: Δομή του πρωταρχικού μεταγράφου του συσσωματώματος mir-23a. Στην εικόνα περιλαμβάνεται η θέση του υποκινητή, με την πλούσια σε κατάλοιπα G & C περιοχή, η θέση έναρξης της μεταγραφής (ΤSS=transcription start site) καθώς και το σήμα για την ουρά poly (A) (Chhabra et al., 2010)

54 Το mir-24-1 είναι ένα πρόδρομο μόριο mirna (Εικόνα 15α), μήκους 68 νουκλεοτιδίων, το οποίο επεξεργάζεται σε δύο ώριμα mirnas, το mir-24 και το mir-189 (Lagos-Quintana et al., 2001). Συγκεκριμένα, από το 3 άκρο του προέρχεται το mir-24, που έχει μήκος 22 νουκλεοτίδια, ενώ από το 5 άκρο του προέρχεται το mir-189, που έχει μήκος 23 νουκλεοτίδια, το οποίο φαίνεται να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου SLITRK1, το οποίο θεωρείται υπεύθυνο για την εκδήλωση του συνδρόμου Tourette (Abelson et al., 2005). Το mir-24-2 είναι ένα πρόδρομο μόριο mirna (Εικόνα 15β), μήκους 74 νουκλεοτιδίων που κωδικοποιεί επίσης για το ώριμο mir-24 (Mourelatos et al., 2002, Lagos- Quintana et al., 2001), το οποίο mir-24 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στους πνεύμονες, στην καρδιά και στους μύες και σε χαμηλότερα επίπεδα στους νεφρούς, στο σπλήνα και στο θύμο αδένα, ενώ σχεδόν δεν ανιχνεύεται στον εγκέφαλο και στο ήπαρ (Huang et al., 2008, Fu et al., 2005). Εικόνα 15: Η δευτεροταγής δομή των pre-mir-24-1 (α) και pre-mir-24-2 (β) (Mourelatos et al., 2002). Υπάρχουν αρκετές μελέτες οι οποίες αποδεικνύουν τη συσχέτιση του mir-24 με τις διαδικασίες της κυτταρικής διαφοροποίησης, του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Το mir-24 είναι μεταξύ εκείνων των micrornas τα οποία παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην διαφοροποίηση των κυττάρων του αίματος, μέσω ρύθμισης της έκφρασης του ανθρώπινου υποδοχέα τύπου Ι της ακτιβίνης (halk4). Η υπερέκφραση του mir-24 ανταγωνίζεται τη συσσώρευση της ακτιβίνης, η οποία μεσολαβείται από την αιμογλοβίνη, σε Κ562 κύτταρα και προκαλεί περίπου 30% μείωση στο σχηματισμό αποικιών τόσο στα CFU-E (erythroid colony-forming units) όσο και στα BFU-E (erythroid burst-forming units) των στελεχιαίων κυττάρων του αίματος (Wang et al., 2008). Ακόμη, έχει βρεθεί πως το mir-24 επάγει την διαφοροποίηση των μυοβλαστών. Μετά από επεξεργασία όμως των κυττάρων με TGF-β, η διαφοροποίηση των μυοβλαστών σε σκελετικά μυοκύτταρα

55 παρεμποδίζεται, ενώ τα επίπεδα του mir-24, μειώνονται. Ο TGF-β φαίνεται πως ασκεί τη δράση του στο mir-24, μέσω μίας θέσης πρόσδεσης για τις πρωτεΐνες Smad 3&4, του mir- 24 (Sun et al., 2008). Την παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνουν και παλαιότερα δεδομένα του δικού μας εργαστηρίου, όπου η καταστολή της έκφρασης της Smad3, σε HepG2 κύτταρα, οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mir-24. Το mir-24 συμπεριλαμβάνεται σε μία ομάδα micrornas, τα οποία ρυθμίζονται ανοδικά σε ποντίκια με καρδιακή υπερτροφία. Με ανάλυση κατά Western, φάνηκε η αυξημένη έκφραση του mir-24 σε ανθρώπινες καρδιές τελικού σταδίου κατάρρευσης. Επίσης, υπερέκφραση του mir-24 σε καλλιεργούμενα καρδιομυοκύτταρα αρουραίων είχε σαν αποτέλεσμα την υπερτροφική αύξηση, ενώ η καρδιακή υπερέκφραση του mir-24 σε διαγονιδιακούς ποντικούς, οδήγησε σε θάνατο των ποντικών σε εμβρυϊκό στάδιο (Van Rooij et al., 2006). Στην βιβλιογραφία υπάρχουν διάφορες μελέτες οι οποίες δείχνουν τον διαφορετικό τρόπο δράσης του mir-24 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Η καταστολή της έκφρασης του mir-24 προάγει τον πολλαπλασιασμό των HeLa κυττάρων αλλά αναστέλλει την κυτταρική αύξηση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα A549 καθώς και των ηπατοκυτταρικών καρκινικών κυττάρων (Huh7), τα οποία έχουν υποστεί επεξεργασία με TGF-β, (Cheng et al., 2005, Gu et al., 2007). Επίσης, έχει αποδειχθεί πως το mir-24 είναι ικανό να μειώσει τα επίπεδα έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16ink4a, μέσω καταστολής της μετάφρασής του, σε ανθρώπινους διπλοειδείς ινοβλάστες και αυχενικά καρκινικά κύτταρα (Lal et al., 2008). Επίσης βρέθηκε πως η μείωση των επιπέδων έκφρασης του mir-24 οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα FAF-1 (ο οποίος προάγει την απόπτωση) και κατ επέκταση σε επαγωγή της απόπτωσης, σε DU-145, HGC-27, MGC-803 και HeLA κύτταρα (Qin et al., 2010). Αντίθετα, η υπερέκφραση του mir-24 μειώνει τα επίπεδα έκφρασης πολλών γονιδίων τα οποία σχετίζονται με την επιδιόρθωση του DNA και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (MYC, E2F2), σε HepG2 &K562 κύτταρα. Μάλιστα η ρύθμιση αυτή επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπίδρασης με αλληλουχίες της 3 -αμετάφραστης περιοχής των γονιδίων, οι οποίες δεν είναι συμπληρωματικές με την seed αλληλουχία του mir-24 (Lal et al., 2010). Η διαφορετική αυτή δράση του mir-24 που παρατηρείται, μπορεί να οφείλεται στην ιστοειδικά ελεγχόμενη έκφραση του mir-24, στη διαφορετική λειτουργία των γονιδίων στόχων του ή ακόμα και στη διαφορετική ικανότητα διαμόλυνσης των διαφόρων κυτταρικών τύπων (Hwang and Mendell, 2006, Cheng et al., 2005)

56 Σύμφωνα με παλαιότερα δεδομένα του εργαστηρίου μας, το mir-24 προσδένεται στην περιοχή bp της 3 UTR του mrna του HNF-4α (Εικόνα 16) (Iliopoulos, D., Masmanidou, E., Hadzopoulou-Cladara, M., 2009). Αυτή η πρόσδεση έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου του HNF-4α. Πρόσφατα, τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώθηκαν και από μία άλλη ερευνητική ομάδα, οι οποίοι μάλιστα έδειξαν πως πέραν της πρόσδεσης του mir-24 στην 3 -UTR του HNF-4α, υπάρχει και μία άλλη θέση πρόσδεσης στην κωδική περιοχή του HNF-4α (Takagi et al., 2009). Υπερέκφραση του mir-24 οδηγεί σε μείωση των επιπέδων έκφρασης του HNF-4α, καθώς και καθοδικών του στόχων, όπως το ένζυμο CYP7A1, που καταλύει το πρώτο και κρίσιμο βήμα στο κλασικό μονοπάτι σύνθεσης του χολικού οξέος και το ένζυμο PEPCK, που συμμετέχει στη γλυκονεογένεση. Επομένως, το mir-24 φαίνεται να επηρεάζει διάφορες ηπατικές λειτουργίες, μέσω της αρνητικής ρύθμισης που αυτό ασκεί στην έκφραση του HNF-4α (Takagi et al., 2009). Εικόνα 16: Θέση πρόσδεσης του mir-24 στην 3 -αμετάφραστη περιοχή του mrna του HNF-4 (Iliopoulos, D., Masmanidou, E., Hadzopoulou-Cladara, M., 2009). Και οι δύο γονιδιακές περιοχές του mir-24 (9q &19p) συνδέονται με τον καρκίνο του στόματος, ενώ το mir-24 έχει βρεθεί πως υπερεκφράζεται σε καρκινικούς επιθηλιακούς ιστούς του στόματος και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του στόματος (Wang et al., 2008). Επίσης, έχει βρεθεί ότι το mir-24 ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου DHFR (dihydrofolate reductase). Ένας πολυμορφισμός ενός νουκλεοτίδιου (SNP=single nucleotide polymorphism), ο 829C/T, στην 3 -UTR του mrna του DHFR, κοντά στην θέση σύνδεσης του mir-24, έχει σαν αποτέλεσμα υπερέκφραση του DHFR και κατά συνέπεια αντίσταση στο χημειοθεραπευτικό μέσο, μεθοτρεξάτη, που χρησιμοποιείται ευρέως στην αντιμετώπιση πολλών κακοηθειών (Mishra et al., 2007). Επιπλέον το mir-24 είναι μεταξύ μίας ομάδας 23 micrornas τα οποία ρυθμίζονται ανοδικά στο ηπατοκαρκίνωμα αρουραίων, οι οποίοι αναπτύσσονταν με φολικό οξύ, μεθειονίνη και ελλιπή σε χολίνη διατροφή (Huang et al.,

57 2008). Το mir-24 ίσως να εμπλέκεται και στην ανάπτυξη όγκων της υπόφυσης (Bottoni et al., 2007), ενώ υπάρχουν και αρκετά δεδομένα που υποστηρίζουν ότι ρυθμίζεται καθοδικά σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα (Wu et al., 2010). Επίσης, το mir-24 μπορεί να λειτουργήσει ως βιομάρτυρας στο Kaposi Sarcoma (O Hara et al., 2009) και φαίνεται να είναι ειδικό microrna για το λέμφωμα του Hodgkin (Gibcus et al., 2009), ενώ πρόσφατα αναγνωρίστηκε ότι εμπλέκεται στην είσοδο, στην αντιγραφή και στον πολλαπλασιασμό του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) (Liu et al., 2010)

58 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της πιθανής επίδρασης του microrna mir-24 στην κυτταρική αύξηση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό καθώς και στην μεταναστευτική ικανότητα των ανθρώπινων ηπατοκαρκινικών κυττάρων HepG2. Για να επιτευχθεί αυτό μελετήθηκε η έκφραση του επιθηλιακού δείκτη, E-καδερίνη, και του μεταγραφικού παράγοντα που ελέγχει την έκφραση αυτού του δείκτη, Snail. Επίσης, αντικείμενο μελέτης αποτέλεσε η διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης του ηπατοειδικού μεταγραφικού παράγοντα HNF-4α, της E-καδερίνης & του Snail σε έναν υποπληθυσμό των HepG2 κυττάρων, στα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (CSCs= Cancer Stem Cells), έτσι ώστε να διερευνηθεί η συσχέτιση της έκφρασης αυτών των μορίων με την αποδιαφοροποίηση και την πρόοδο του ανθρώπινου ηπατοκαρκινώματος. Η ανάλυση της έκφρασης όλων των γονιδίων καθώς και του mir-24, έγινε με την τεχνική της real-time RT- PCR, και στην περίπτωση του HNF-4α χρησιμοποιήθηκε επίσης και η ανοσοαποτύπωση κατά Western. Στο τελευταίο κομμάτι αυτής της εργασίας αναλύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης, με real-time RT-PCR, των ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων HNF-1α, HNF-3β, & HNF- 4α, σε 27 δείγματα βιοψιών ανθρώπινου ηπατοκαρκινώματος και σε 8 δείγματα παρακείμενου φυσιολογικού ιστού, έτσι ώστε να διερευνηθεί η συσχέτιση του ηπατικού δικτύου με το ανθρώπινο ηπατοκαρκίνωμα

59 4. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Κυτταροκαλλιέργειες i) HepG2 κυτταρική σειρά Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων της παρούσας εργασίας χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά HepG2, που αντιπροσωπεύει ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ήπατος. Πρόκειται για μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά, η οποία έχει απομονωθεί από ηπατικό ιστό ενός 15χρονου Καυκάσιου άνδρα, Αμερικανικής εθνικότητας, με καλά χαρακτηρισμένο ηπατοκαρκίνωμα. Τα HepG2 είναι κύτταρα, τα οποία προσκολλούνται στο υπόστρωμα, αναπτύσσονται σε μονοστοιβάδες και μερικές φορές σχηματίζουν μικρά συσσωματώματα, εμφανίζοντας κατακόρυφη ανάπτυξη (Εικόνα 17). Τα κύτταρα αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ένα in vitro σύστημα μελέτης των ανθρώπινων ηπατοκυττάρων, καθώς είναι επιθηλιακά στη μορφολογία και εκκρίνουν πολλές βασικές πρωτεϊνες του πλάσματος, όπως η αλβουμίνη, η α2-μακρογλουβίνη, η τρανσφερίνη, το πλασμινογόνο, το ινωδογόνο. Έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες του ηπατικού μεταβολισμού και της τοξικότητας των ξενοβιοτικών, καθώς και για την κατανόηση της ηπατοκαρκινογένεσης, αλλά και σε μελέτες που στοχεύουν στην ανάπτυξη νέων φαρμάκων για διάφορες ασθένειες του ήπατος στον άνθρωπο. Εικόνα 17: Η κυτταρική σειρά HepG

60 Η κυτταρική σειρά HepG2 διατηρείται σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s medium), το οποίο εμπλουτίστηκε με: 1. 10% εμβρυϊκό ορό μοσχαριού (fetal bovine serum, FBS) U/ml πενικιλίνη μg/ml στρεπτομυκίνη 4. 1% L-γλουταμίνη Τα κύτταρα συντηρούνται σε φλάσκες 75 cm 2, σε επωαστικό κλίβανο θερμοκρασίας 37 ο C και σε ατμόσφαιρα 5% CO 2 και μεταφέρονται σε νέα φλάσκα, σε αραίωση 1:10, περίπου 1 φορά την εβδομάδα, όταν φτάσουν σε πυκνότητα 80%-90%, ενώ κάθε 3 ημέρες γίνεται ανανέωση του θρεπτικού μέσου με φρέσκο. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: 1. Αφαίρεση του παλιού θρεπτικού μέσου. 2. Προσθήκη 10ml 1x PBS ph:7.2, ισοτονικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων, για να ξεπλυθούν τα κύτταρα και άμεση αφαίρεσή του. 3. Προσθήκη 3ml διαλύματος 0.05% τρυψίνης-edta, για την αποκόλληση των κυττάρων, και επώαση στους 37 ο C για 2-3 λεπτά. 4. Απενεργοποίηση του διαλύματος τρυψίνης-edta, με την προσθήκη 7ml πλήρους θρεπτικού μέσου και σάρωμα όλης της επιφάνειας της φλάσκας, ώστε να αποκολληθούν όλα τα κύτταρα, καθώς και προσεκτικό πιπετάρισμα ώστε να διαλυθούν τυχόν συσσωματώματα και να μεταφερθούν στην καινούρια φλάσκα μεμονωμένα κύτταρα. Όλα τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στις κυτταροκαλλιέργειες είναι αποστειρωμένα και προθερμασμένα στους 37 ο C. Επίσης, ο αριθμός των κυττάρων που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί στα πειράματα προσδιορίζεται με τη βοήθεια του αιμοκυτταρομέτρου και της χρωστικής trypan blue, η οποία χρωματίζει τα νεκρά κύτταρα μπλε, ενώ τα ζωντανά κύτταρα παραμένουν διαφανή

61 ii) Καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (cancer stem cells) Για την καλλιέργεια του υποπληθυσμού των καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων της κυτταρικής σειράς HepG2, χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω συνθήκες καλλιέργειας: Δέκα χιλιάδες HepG2 κύτταρα μεταφέρονται σε φλάσκες εμβαδού 25 cm 2 σε 5ml θρεπτικό μέσο DMEM (Dulbecco s modified Eagle s medium), το οποίο εμπλουτίστηκε με: 1. 10% εμβρυϊκό ορό μοσχαριού (fetal bovine serum, FBS) units/ml πενικιλίνη, 100 μg/ml στρεπτομυκίνη 3. 1% L-γλουταμίνη 4. 2% συμπλήρωμα Β-27 (Invitrogen/κωδικός προϊόντος: SA) Τα κύτταρα επωάζονται σε όρθιες φλάσκες για 3 ημέρες και την τρίτη ημέρα προστίθεται επιπλέον 1ml θρεπτικού μέσου DMEM ενισχυμένο με B-27. Τα κύτταρα αφήνονται να μεγαλώσουν για ακόμα 4 ημέρες. Την 7 η ημέρα γίνεται η συλλογή των κυττάρων του υπερκείμενου, τα οποία είναι σφαιροειδή κύτταρα και αντιπροσωπεύονται από καρκινικά κύτταρα με ολοδύναμο χαρακτήρα, ώστε να γίνει η απομόνωση RNA ή η λήψη κυτταρικού εκχυλίσματος ώστε να διερευνηθούν τα επίπεδα έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων Διαμόλυνση κυτταρικών σειρών Με τον όρο διαμόλυνση αναφερόμαστε στη διαδικασία εισαγωγής ξένων νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA) στα κύτταρα των θηλαστικών. Η διαμόλυνση αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο μελέτης της γονιδιακής λειτουργίας και ρύθμισης, καθώς και της πρωτεϊνικής λειτουργίας. Ο κύριος στόχος της είναι η μελέτη της λειτουργίας γονιδίων ή γονιδιακών προϊόντων, αλλά και η παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα θηλαστικών. Η εισαγωγή ξένου γενετικού υλικού στα κύτταρα μπορεί να είναι είτε σταθερή είτε παροδική. Στη σταθερή διαμόλυνση, το ξένο γενετικό υλικό ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή και εκφράζεται συνεχώς, ενώ στην παροδική εκφράζεται για περιορισμένο μόνο χρονικό διάστημα και δεν ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές διαμόλυνσης, οι οποίες διακρίνονται κυρίως βάσει του αν στηρίζονται σε χημικές μεθόδους ή όχι. Στις χημικές μεθόδους περιλαμβάνονται: i) η διαμόλυνση με φωσφορικό ασβέστιο (calcium phosphate), ii) η διαμεσολαβούμενη από λιποσώματα διαμόλυνση, iii) η διαμόλυνση με κατιονικά

62 πολυμερή, όπως η DEAE-δεξτράνη. Στις μη χημικές μεθόδους περιλαμβάνεται: i) η ηλεκτροδιάτρηση (electroporation), ii) η μικροένεση, iii) η ακτινοβόληση με laser κ.ά. (Kim & Eberwine, 2010). v Παράγοντας διαμόλυνσης siport NeoFX Ο παράγοντας διαμόλυνσης siport NeoFX (Ambion) είναι ένα αντιδραστήριο που βασίζεται στα λιπίδια και παρέχει υψηλά επίπεδα διαμόλυνσης, χωρίς να προκαλεί καταπόνηση στα κύτταρα, η οποία πιθανά θα οδηγήσει σε κυτταροτοξικότητα. Χρησιμοποιείται κυρίως για την εισαγωγή μικρών μορίων RNA (sirna, mirna) σε κύτταρα θηλαστικών, μέσω μιας διαδικασίας που αναφέρεται ως ανάστροφη διαμόλυνση. Αυτή περιλαμβάνει το στρώσιμο των πιάτων με κύτταρα και την ταυτόχρονη διαμόλυνσή τους. Εν συντομία, siport NeoFX και mirna αναμειγνύονται, επωάζονται για να σχηματίσουν σύμπλοκο κι έπειτα προστίθενται στα κύτταρα. v Μελέτη της λειτουργίας των micrornas Η λειτουργική ανάλυση των micrornas μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη χρήση πρωτοκόλλων παρόμοιων με αυτά που χρησιμοποιούνται για άλλα γονίδια. Η υπερέκφραση των mirnas μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση μικρών πρόδρομων μορίων RNA, τα Pre-miR mirna Precursors (Applied Biosystems), τα οποία είναι διαθέσιμα στο εμπόριο για μεγάλη ποικιλία mirnas. Πρόκειται για μικρά δίκλωνα RNA τα οποία μιμούνται τα ενδογενή πρόδρομα μόρια των mirnas. Κάθε Pre-miR mirna Precursor είναι ένα δίκλωνο RNA, με τον ένα κλώνο πανομοιότυπο με το αντίστοιχο ώριμο υπό μελέτη mirna, ενώ όλα τους είναι έτσι σχεδιασμένα και χημικά τροποποιημένα, ώστε να είναι σίγουρη η επιλογή του σωστού κλώνου, από κάθε Pre-miR mirna Precursor μόριο, από το μονοπάτι επεξεργασίας των mirnas. Με τα μόρια αυτά μπορεί να επιτευχθεί: α) ο έλεγχος της δραστηριότητας συγκεκριμένων mirnas, β) η ελαφρά ρύθμιση των κυτταρικών επιπέδων των mirnas και γ) η επίτευξη βέλτιστης διαμόλυνσης με ελάχιστη κυτταροτοξικότητα. Αντίστοιχα, η υποέκφραση των mirnas, μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση χημικά τροποποιημένων ολιγονουκλεοτιδίων, τα οποία αναγνωρίστηκαν πρώτα από τον Krutzfeldt και συνεργάτες και ονομάστηκαν antagomirs. Πρόκειται για μονόκλωνα RNAs συζευγμένα με μόρια χοληστερόλης, τα οποία έχουν μήκος νουκλεοτίδια και είναι

63 συμπληρωματικά με αλληλουχίες ώριμων mirnas. Έτσι, αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να σχεδιαστούν για να προσδένονται εξειδικευμένα στο microrna-risc σύμπλοκο και να εμποδίζουν τη δράση του, καθώς είναι πολύ σταθερά in vivo και έχει βρεθεί πως αρκεί μόνο μία ενδοφλέβια ένεσή τους στα ποντίκια, για να αποσιωπήσουν micrornasστόχους στο ήπαρ, στους πνεύμονες, στο έντερο, στην καρδιά, στο δέρμα και στο μυελό των οστών, για περισσότερο από μία εβδομάδα (Krutzfeld et al., 2005). Στο εμπόριο, είναι διαθέσιμα από την εταιρεία Applied Biosystems, με την ονομασία Anti-miR mirna Inhibitors και είναι χημικά τροποποιημένα, έτσι ώστε να έχουν αυξημένη σταθερότητα και βελτιωμένη δράση. Το προϊόν Pre-miR mirna Precursor για το microrna mir-24 είναι διαθέσιμο με το γενικό κωδικό ΡΜ17001 και Product ID: ΡM10737, ενώ το προϊόν AntimiR mirna Inhibitor για το microrna mir-24 είναι διαθέσιμο με το γενικό κωδικό ΑΜ17001 και Product ID: AM Στην περίπτωση της διαμόλυνσης με τα antagomirs, χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικό control το Anti-miR microrna Negative control που διατίθεται από την Applied Biosystems με κωδικό προϊόντος: AM v Ανάστροφη διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2 με Pre-miR mirna Precursor/miR-24 και Anti-miR mirna Inhibitor/miR-24 με τη χρήση του siport NeoFX Μετά από μια σειρά πειραμάτων, με σκοπό την εύρεση της κατάλληλης συγκέντρωσης Pre-miR mirna Precursor/miR-24 και Anti-miR mirna Inhibitor/miR-24, καθώς και του κατάλληλου όγκου του παράγοντα διαμόλυνσης siport που θα έπρεπε να χρησιμοποιήσουμε για να έχουμε τα βέλτιστα αποτελέσματα, καταλήξαμε στη συγκέντρωση των 50nM/οπή για τα μόρια PremiR-24 και ΑntagomiR-24, στον όγκο των 2μl/οπή για τον παράγοντα siport, αλλά και στον αριθμό των κυττάρων/οπή. O τελικός όγκος συμπλόκων και κυττάρων είναι 2.5ml/οπή. 1. Σε πιάτα 6 οπών, αναμειγνύονται 2μl siport με 98μl DMEM θρεπτικό μέσο χωρίς ορό/οπή, τόσο στους μάρτυρες, όσο και σε αυτά τα οποία θα υποστούν διαμόλυνση και επωάζονται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Προσθήκη κατάλληλης ποσότητας PremiR-24 ή ΑntagomiR-24 σε DMEM θρεπτικό μέσο χωρίς ορό, ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 50nM/οπή, για τις οπές στις

64 οποίες θα συμβεί διαμόλυνση, αλλά και 100μl DMEM θρεπτικό μέσο χωρίς ορό/οπή, για τους μάρτυρες. Ελαφρά ανάμειξη. 3. Επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Προσθήκη 2.3ml πλήρους θρεπτικού μέσου με κύτταρα/οπή και ελαφρά ανάμιξη. 5. Επώαση των κυττάρων σε κλίβανο CO 2 για 24 ώρες, οπότε και αντικαθίσταται το θρεπτικό μέσο με φρέσκο. 6. Ακολουθεί απομόνωση του RNA των κυττάρων ή συλλογή και λύση τους για την παρασκευή κυτταρικών εκχυλισμάτων, ανάλογα με τις ανάγκες του πειράματος. Επίσης, η επώαση είναι δυνατόν να συνεχιστεί για ακόμα ένα ή δύο 24ωρα, οπότε συλλέγονται RNA και κυτταρικά εκχυλίσματα στις 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, προκειμένου να μελετηθούν τα επίπεδα των υπό μελέτη γονιδίων και πρωτεϊνών. 4.3 Ανάλυση της έκφρασης στο επίπεδο του mrna v Aπομόνωση RNA i) Κύτταρα Για την απομόνωση του RNA από HepG2 κύτταρα, με σκοπό τη μελέτη των γονιδίων και των micrornas, ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο: 1. Αφαίρεση του παλιού θρεπτικού μέσου και πλύση των κυττάρων με νέο, το οποίο δεν περιέχει εμβρυϊκό ορό μοσχαριού. 2. Προσθήκη 500μl αντιδραστηρίου TRI Reagent (Ambion) (σύμφωνα με τον κατασκευαστή, ο όγκος που θα χρησιμοποιηθεί εξαρτάται από τον αριθμό των κυττάρων καθώς και από την επιφάνεια της καλλιέργειας). Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα, σε πιάτα 6 οπών. Το αντιδραστήριο TRI είναι ένα μείγμα φαινόλης και θειοκυανιούχου γουανιδινίου, που βοηθά στην άμεση προστασία του δείγματος από τη δράση των RNασών και χρησιμοποιείται σε διαδικασίες διαχωρισμού. 3. Επώαση του ομογενοποιήματος σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. 4. Φυγοκέντρηση στις g για 10 λεπτά στους 4 ο C. 5. Συλλογή του υπερκείμενου και προσθήκη 100μl χλωροφορμίου

65 6. Ανάδευση σε χαμηλή ταχύτητα και επώαση του δείγματος σε θερμοκρασία δωματίου για 8 λεπτά. 7. Φυγοκέντρηση στις g για 15 λεπτά στους 4 ο C (σε αυτή τη φάση γίνεται διαχωρισμός του δείγματος σε υδατική και οργανική φάση. Το RNA συγκεντρώνεται στην υδατική, το DNA στη μεσαία και οι πρωτεΐνες στην οργανική φάση). 8. Συλλογή της υπερκείμενης υδατικής φάσης, προσεκτικά ώστε να μην διαταραχθεί το ίζημα και προσθήκη 250μl ισοπροπανόλης. 9. Ανάδευση σε χαμηλή ταχύτητα για 5-10 δευτερόλεπτα 10. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. 11. Σταδιακό πάγωμα του δείγματος στους -80 ο C για ~1 ώρα (κατακρήμνιση του RNA από την υδατική φάση). 12. Φυγοκέντρηση στις g για 8 λεπτά στους 20 ο C. 13. Προσθήκη στο ίζημα 500μl 75% αιθανόλης (διάλυμα απόλυτης αιθανόλης σε DEPC- H 2 O). 14. Ανάδευση του δείγματος σε χαμηλή ταχύτητα, ώστε να αποκολληθεί το ίζημα. 15. Φυγοκέντρηση στις 7.500g για 5 λεπτά στους 20 ο C (καθαρισμός του RNA). 16. Αφαίρεση του υπερκείμενου και στέγνωμα του ιζήματος για ~15 λεπτά. 17. Επαναδιάλυση του ιζήματος σε μl DEPC-H 2 O, αναλόγως του μεγέθους του ιζήματος και αποθήκευση στους -80 ο C για περαιτέρω χρήση. ii) Βιοψίες Στην περίπτωση των βιοψιών ηπατικών ιστών, προστίθεται απευθείας στον ιστό 1ml αντιδραστήριο TRI Reagent και όλο το περιεχόμενο μεταφέρεται σε αποστειρωμένο τριβλίο. Ακολουθεί τεμαχισμός του ιστού με αποστειρωμένο νυστέρι και το μείγμα που προκύπτει μεταφέρεται σε σωληνάκι, ώστε να ομογενοποιηθεί με τη βοήθεια ειδικών ομογενοποιητών (Eppendorf Micropestles, Eppendorf). Η διαδικασία για την απομόνωση του RNA είναι η ίδια με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως, με την αλλαγή ότι επειδή χρησιμοποιείται διπλάσιος όγκος TRI Reagent, λόγω του μεγαλύτερου μεγέθους του ιστού, χρησιμοποιούνται διπλάσιοι όγκοι και στα υπόλοιπα αντιδραστήρια - χλωροφόρμιο, ισοπροπανόλη, αιθανόλη

66 v Έλεγχος του RNA Ακολουθεί ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του RNA που προκύπτει. Η πιο κοινή μέθοδος που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της ακεραιότητας του RNA, είναι η ηλεκτροφόρησή του σε πηκτή αγαρόζης πυκνότητας 1%. Ένα ακέραιο RNA θα πρέπει να έχει δύο ξεκάθαρες ζώνες που θα αντιπροσωπεύουν το 28S rrna και το 18S rrna, με αναλογία της έντασης των δύο ζωνών 2:1. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης αλλά και της καθαρότητας του RNA πραγματοποιήθηκε με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης του δείγματος στα 260nm και 280nm, με τη χρήση του φωτομέτρου Nanodrop (Nanodrop 2000/Thermoscientific). Το φωτόμετρο Nanodrop είναι σχεδιασμένο να υπολογίζει συγκεντρώσεις νουκλεϊκών οξέων, απαιτώντας όγκους δειγμάτων της τάξης του 1μl. Το δείγμα πιπετάρεται επάνω στην επιφάνεια ανίχνευσης, όπου βρίσκεται η οπτική ίνα «δέκτης» και με το κλείσιμο της υποδοχής έρχεται σε επαφή με το δείγμα μία δεύτερη οπτική ίνα, δημιουργώντας έτσι ένα οπτικό μονοπάτι, στο οποίο θα γίνει η μέτρηση (Εικόνα 18). Με τον τρόπο αυτό, ο ερευνητής απαλλάσσεται από τη χρήση κυψελίδων και τη σπατάλη πολύτιμου δείγματος. Η κάθε μέτρηση διαρκεί περίπου 10 δευτερόλεπτα και τα αποτελέσματα απεικονίζονται σε έναν, συνδεδεμένο με το φωτόμετρο, υπολογιστή. Εικόνα 18: Απεικόνιση μιας μέτρησης με χρήση του φωτομέτρου Nanodrop v Σύνθεση cdna Αφού ελεγχθεί η ποιότητα και μετρηθεί η ποσότητα του RNA που απομονώθηκε από τα κύτταρα, αυτό θα πρέπει να μετατραπεί σε cdna, ώστε να χρησιμοποιηθεί για την μελέτη των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν. Αυτό επιτυγχάνεται με την αντίδραση της ανάστροφης μεταγραφής, οπότε με εκμαγείο RNA συντίθεται το cdna. Οι τρεις βασικές μέθοδοι προσέγγισης διαφέρουν ως προς το είδος του εκκινητή που χρησιμοποιούν. Έτσι, υπάρχει η μέθοδος που χρησιμοποιεί oligo-dt εκκινητή, ο οποίος αποτελείται από πολλές συνεχόμενες βάσεις θυμίνης (T). Αυτό σημαίνει πως είναι

67 συμπληρωματικός για την πολυ-α ουρά που υπάρχει στο τέλος κάθε μορίου mrna, οπότε εντοπίζει όλα τα γονίδια του κυττάρου που εκφράζονταν τη στιγμή της απομόνωσης του RNA. Δεύτερον, υπάρχει η μέθοδος που χρησιμοποιεί ως εκκινητές τυχαία εξαμερή (random hexamers), δηλαδή εξανουκλεοτίδια τυχαίας αλληλουχίας. Οι συνδυασμοί αυτών των εξαμερών είναι τόσο πολλοί, που είναι ουσιαστικά απίθανο να υπάρξει στο κύτταρο κάποιο μόριο RNA το οποίο δε θα εμφανίσει συμπληρωματικότητα, για ένα έστω από αυτά. Επομένως, η μέθοδος αυτή εντοπίζει και οποιοδήποτε άλλο μόριο RNA απομονωθεί από το κύτταρο, πέραν των mrnas. Τέλος, υπάρχει και η μέθοδος που χρησιμοποιεί εκκινητή για συγκεκριμένο γονίδιο, οπότε εδώ εντοπίζεται μόνο το γονίδιο που θα μελετηθεί, ανάμεσα στο ολικό RNA που απομονώθηκε από το κύτταρο. Το πρώτο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας είναι κοινό για όλες τις μεθόδους και περιλαμβάνει την κανονικοποίηση της ποσότητας RNA για κάθε δείγμα. Πιο συγκεκριμένα, από την οπτική πυκνότητα υπολογίζεται η συγκέντρωση RNA κάθε δείγματος και στη συνέχεια λαμβάνεται κατάλληλος όγκος ώστε να χρησιμοποιείται η ίδια ποσότητα RNA σε κάθε ένα από τα δείγματα του πειράματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα οι όποιες διαφορές παρατηρούνται στα επίπεδα έκφρασης των δειγμάτων να οφείλονται καθαρά σε διαφορές της έκφρασης των γονιδίων και όχι σε πειραματικά σφάλματα, όπως για παράδειγμα το να έχει φορτωθεί περισσότερο RNA στο δείγμα που δείχνει υψηλότερη έκφραση. Στην παρούσα εργασία, οι δύο πρώτες μέθοδοι εφαρμόστηκαν στην πράξη με τη βοήθεια του RevertAid kit της Fermentas (#Κ1652), οπότε προέκυπτε ολικό cdna για τον προσδιορισμό της έκφρασης οποιουδήποτε γονιδίου. Αντίθετα, για την τρίτη χρησιμοποιήθηκε το TaqMan microrna Reverse Transcription kit της Applied Biosystems ( ), σε συνδυασμό με τον ειδικό, για κάθε γονίδιο, εκκινητή. Κάθε τέτοιος εκκινητής παρέχονταν από την Applied Biosystems με το αντίστοιχο ζεύγος των ειδικών, για το ίδιο γονίδιο, PCR εκκινητών. Οι αλληλουχίες όλων των εκκινητών ήταν άγνωστες, αφού είναι πατέντα της Applied Biosystems, αλλά στον Πίνακα 2 δίνονται οι κωδικοί τους. Αυτό που είναι γνωστό για τον εκκινητή της ανάστροφης μεταγραφής είναι το ότι έχει μορφή βρόχου, ο οποίος λόγω της υψηλής θερμοκρασίας που αναπτύσσεται κατά την σύνθεση του cdna ανοίγει και έτσι δημιουργούνται επιπλέον βάσεις στο cdna, ώστε να είναι δυνατός ο υβριδισμός των PCR εκκινητών, στο επόμενο στάδιο (Εικόνα 19). Στη συγκεκριμένη εργασία, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τα mir-24 και U6. Τέλος, αξιοσημείωτη είναι η ευαισθησία της μεθόδου αυτής, αφού οι οδηγίες των αντιδραστηρίων επιτρέπουν τη χρήση μόλις 10ng RNA, σε όγκο ίσο με 3μl, ανά αντίδραση

68 Γονίδιο Κωδικός mir (assay ID ) U (assay ID ) Πίνακας 2: Οι κωδικοί των εκκινητών κάθε microrna. Εικόνα 19: Η μορφή και η δράση του εκκινητή της ανάστροφης μεταγραφής (εκκινητής με βρόχο)

69 Μέθοδος oligo-dt Αφού τα δείγματα κανονικοποιηθούν, ώστε να περιέχουν ίδια ποσότητα RNA, δημιουργείται το μείγμα αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 3 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 4. Αντιδραστήριο RNA 5x Reaction Buffer oligo-dt εκκινητής (0.5 μg/μl) dntps (10mM) RiboLock RNase Inhibitor (40U/μl) RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200U/μl) Nuclease-free Η 2 Ο Όγκος μl 4μl 1μl 2μl 0.5μl 1μl έως τα 20μl Πίνακας 3: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Σύνθεση cdna Απενεργοποίηση ενζύμου 42 C - 60 min 70 C - 10 min Πίνακας 4: Οι συνθήκες της αντίδρασης

70 Μέθοδος τυχαίων εξαμερών Μετά την κανονικοποίηση, κάθε δείγμα φέρει την ίδια ποσότητα RNA με οποιοδήποτε άλλο. Ακολουθεί η δημιουργία του μείγματος αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 5 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 6. Αντιδραστήριο * RNA 5x Reaction Buffer random hexamer εκκινητής (0.2μg/μl) dntps (10mM) RiboLock RNase Inhibitor (40U/μl) RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200U/μl) Nuclease-free Η 2 Ο Όγκος μl 4μl 1μl 2μl 0.5μl 1μl έως τα 20μl Πίνακας 5: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Αρχική επώαση Σύνθεση cdna Απενεργοποίηση ενζύμου 25 C - 10 min 42 C - 60 min 70 C - 10 min Πίνακας 6: Οι συνθήκες της αντίδρασης

71 Μέθοδος ειδικού εκκινητή Έχοντας ρυθμιστεί κάθε δείγμα να περιέχει 10ng RNA σε 3μl, αυτή η ποσότητα χρησιμοποιείται στη δημιουργία του μείγματος αντίδρασης του Πίνακα 7. Ακολουθεί επώαση στον πάγο για 5 λεπτά και στη συνέχεια εφαρμόζεται το πρωτόκολλο του Πίνακα 8. Αντιδραστήριο RNA Nuclease-free Η 2 Ο RT εκκινητής 10x Reverse Transcription Buffer dntps (100mM) RNase Inhibitor (20U/μl) MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μl) Όγκος 3μl 2.95μl 2μl 1.1μl 0.11μl 0.14μl 0.7μl Πίνακας 7: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Υβριδισμός εκκινητών Σύνθεση cdna Απενεργοποίηση ενζύμου 16 C - 30 min 42 C - 30 min 85 C - 5 min Πίνακας 8: Οι συνθήκες της αντίδρασης. Τέλος, στη διεξαγωγή κάθε πειράματος, περιλαμβάνεται και ένας μάρτυρας ελέγχου (τυφλό), που αποτελείται από όλα τα υλικά του μείγματος αντίδρασης, εκτός από το RNA, προκειμένου να διαπιστωθεί τυχόν επιμόλυνση κάποιου από αυτά. Ο ρόλος του είναι αρκετά σημαντικός, μιας και δεν είναι καθόλου σπάνιες οι επιμολύνσεις στο χώρο ενός εργαστηρίου

72 v Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Απ όλες τις τεχνικές που υπάρχουν για την ανάλυση του DNA, καμιά δεν είχε τέτοιον αντίκτυπο και τόσες δυνατότητες όσο μια μέθοδος που αναπτύχθηκε το 1985, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR) (Saiki et al., 1985). Η ικανότητα της PCR να πολλαπλασιάζει επιλεκτικά ένα μόριο DNA κατά μερικά εκατομμύρια φορές μέσα σε λίγες ώρες έχει φέρει επανάσταση στη μοριακή διάγνωση και στην ανάλυση των γενετικών νοσημάτων. Επιτρέπει την ανίχνευση και την ανάλυση συγκεκριμένων γονιδιακών αλληλουχιών σε ένα δείγμα ασθενούς. Αναλύσεις μπορούν να γίνουν ακόμα και με ένα κύτταρο από τη ρίζα μιας τρίχας, με τα λίγα κύτταρα που υπάρχουν στο στοματικό επίχρισμα, ή σε μια αποξηραμένη σταγόνα αίματος, με αποτέλεσμα να μην υπάρχει πια ανάγκη εξαγωγής μεγάλων ποσοτήτων DNA από δείγματα ιστών. Οι μέθοδοι που βασίζονται στην τεχνική της PCR αναπτύσσονται ταχύτατα εξαιτίας της ευκολίας της λήψης δειγμάτων, της ελάχιστης απαίτησης σε ποσότητες ιστού και της εφαρμογής τους σε μεγάλο εύρος αναλύσεων. Επίσης, η τεχνική της PCR επιτρέπει τη χρησιμοποίηση ιστών που δεν έχουν διατηρηθεί σε καλή κατάσταση. Τέλος, σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους, η ανάλυση με την PCR είναι πολύ πιο γρήγορη. Η PCR είναι ταχύτερη, οικονομικότερη, περισσότερο ευαίσθητη και λιγότερο απαιτητική σε δείγματα ασθενών από οποιαδήποτε άλλη μέθοδο ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Απαραίτητη είναι η μελέτη της αλληλουχίας, ώστε να σχεδιαστούν κατάλληλοι εκκινητές, οι οποίοι θα προσδένονται αποτελεσματικά στο εκμαγείο και θα δίνουν ένα σωστό και μοναδικό προϊόν. Επίσης, το μέγεθος της εξεταζόμενης αλληλουχίας δε μπορεί να υπερβαίνει συνήθως τις λίγες χιλιάδες βάσεις (αν και το πρόβλημα αυτό τείνει να αντιμετωπιστεί). Τέλος, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να αποδίδεται στην προστασία του εξεταζόμενου DNA από την «επιμόλυνσή» του με ξένο DNA. Η όλη διαδικασία περιλαμβάνει μια σειρά επαναλαμβανόμενων κύκλων (Εικόνα 20): Α. Θερμικής αποδιάταξης (Denaturation) του δίκλωνου DNA-εκμαγείου. Β. Υβριδισμού (Annealing) των κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών στις συμπληρωματικές ακολουθίες του DNA-εκμαγείου. Γ. Σύνθεσης - Επιμήκυνσης (Extension) των συμπληρωματικών ακολουθιών

73 Εικόνα 20: Τα στάδια της PCR. Αρχικά, στο πρώτο στάδιο κάθε κύκλου πραγματοποιείται αποδιάταξη του δίκλωνου μορίου DNA με θέρμανση σε υψηλή θερμοκρασία (94-95 ο C), με αποτέλεσμα τη διάσπαση των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών βάσεων της δίκλωνης έλικας και την παραγωγή μονόκλωνων αλυσίδων που θα χρησιμεύσουν ως εκμαγεία για τη σύνθεση νέων μορίων DNA. Κατά το δεύτερο στάδιο, κατάλληλοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές υβριδίζονται με τις συμπληρωματικές προς αυτούς αλληλουχίες που βρίσκονται στα δύο άκρα του προς ενίσχυση τμήματος του DNA. Η θερμοκρασία του σταδίου αυτού (45-65 ο C) εξαρτάται από την αλληλουχία των χρησιμοποιούμενων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Στο τρίτο στάδιο, το οποίο πραγματοποιείται σε θερμοκρασία 72 ο C, η θερμοανθεκτική Taq DNA πολυμεράση οδηγεί τη σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας DNA, χρησιμοποιώντας τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps). Το σύνολο των τριών παραπάνω σταδίων αποτελεί ένα κύκλο της αντίδρασης PCR. Στο τέλος του κύκλου από μια δίκλωνη μητρική έλικα DNA δημιουργούνται δύο θυγατρικές δίκλωνες έλικες DNA, στον αμέσως επόμενο κύκλο οι δίκλωνες έλικες γίνονται τέσσερις κ.ο.κ.. Ο πολλαπλασιασμός της συγκεκριμένης περιοχής DNA είναι, δηλαδή, εκθετικός. Συνήθως ο πολλαπλασιασμός συνεχίζεται για κύκλους. Το τελικό αποτέλεσμα της PCR μετά από n κύκλους είναι η παραγωγή 2 n δίκλωνων μορίων DNA, πιστών αντιγράφων της ακολουθίας που περικλείεται μεταξύ των εκκινητών. Έτσι, αν υποθέσουμε ότι η απόδοση

74 του συστήματος είναι 100% για κάθε κύκλο μετά από 30 κύκλους έχουμε την παραγωγή 2 30 ( ) αντιγράφων DNA στόχου. Ο άριστος αριθμός κύκλων εξαρτάται από την αρχική συγκέντρωση του DNA στόχου και την απόδοση της PCR σε κάθε κύκλο. Μεγαλύτερος αριθμός κύκλων από τον ιδανικό οδηγεί σε παραγωγή μη ειδικών προϊόντων, ενώ μικρότερος αριθμός κύκλων συνεπάγεται την αχνή ενίσχυση και συνεπώς ανίχνευση του DNA στόχου. Έτσι, όταν ο αρχικός αριθμός των μορίων στόχου είναι 10 5 απαιτούνται 30 κύκλοι, όταν είναι 10 4 απαιτούνται 35 κύκλοι ενώ όταν είναι 10 3 ή μικρότερος απαιτούνται περισσότεροι από 40 κύκλοι. Στο τέλος των επαναλαμβανόμενων κύκλων, αποδιάταξης - υβριδισμού - επιμήκυνσης, ακολουθεί ένα χρονικό διάστημα 5-7 λεπτών σε θερμοκρασία 72 ο C, στο οποίο η Taq DNA πολυμεράση ολοκληρώνει τη σύνθεση των θυγατρικών αλυσίδων που ενδεχομένως έμειναν ημιτελείς. Οι εναλλαγές της θερμοκρασίας επιτυγχάνονται με τη χρήση ειδικών αυτοματοποιημένων συσκευών, των θερμοκυκλοποιητών και είναι ταχύτατες, ώστε αυξομειώσεις της τάξεως των 40 ο C λαμβάνουν χώρα σε λιγότερο από ένα λεπτό. Για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης απαιτούνται: 1. Νερό: Κατάλληλη ποσότητα δις-απεσταγμένου και απιονισμένου νερού. 2. Taq πολυμεράση: Η ανακάλυψη της θερμοανθεκτικής Taq πολυμεράσης επέτρεψε την αυτοματοποίηση της PCR με τη χρήση των θερμικών κυκλοποιητών. Η Taq πολυμεράση είναι μια θερμοανθεκτική πολυμεράση που απομονώθηκε από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus YT1, το οποίο ζει στο νερό σε θερμοκρασία 75 ο C. Το ένζυμο αποτελείται από μία πεπτιδική αλυσίδα με μοριακό βάρος 94 kda περίπου, έχει δράση πολυμεράσης 5 3 και πολυμερίζει περίπου 1000 βάσεις ανά λεπτό. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της πολυμεράσης είναι 72 ο C, αλλά παραμένει σταθερή ακόμα και στους 94 ο C. 3. Ρυθμιστικό διάλυμα (PCR Buffer): Χρησιμοποιείται για να ρυθμίσει το ph στο οποίο η δράση της πολυμεράσης είναι άριστη. Διατηρείται ως διάλυμα συγκέντρωσης 10Χ. Η τελική συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος στο μίγμα αντίδρασης είναι 1Χ. 4. Ιόντα Mg 2+ : Προστίθενται συνήθως με τη μορφή διαλύματος MgCl 2 και χρησιμοποιούνται από την πολυμεράση ως «μεταλλικός συμπαράγοντας». Η συγκέντρωσή τους στο μίγμα αντίδρασης είναι σημαντική, αφού περίσσεια ιόντων

75 Mg 2+ προκαλεί αύξηση των μη ειδικών προϊόντων της αντίδρασης, ενώ έλλειψη Mg 2+ ελαττώνει την ποσότητα των προϊόντων. 5. Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps): Χρησιμοποιούνται από την Taq πολυμεράση για τη σύνθεση των συμπληρωματικών αλυσίδων DNA. Στο μίγμα αντίδρασης προστίθεται καθορισμένη ποσότητα ισομοριακού μίγματος και των τεσσάρων τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων. Πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις μειώνουν το ρυθμό σύνθεσης DNA (παρεμπόδιση από το υπόστρωμα) και μπορεί να προκαλέσουν την παραγωγή παραπροϊόντων. 6. Εκκινητές (Primers): Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτιδικές ακολουθίες, συμπληρωματικές προς τα άκρα του τμήματος DNA που θέλουμε να ενισχύσουμε. Ο σχεδιασμός και η επιλογή τους γίνεται δηλαδή με βάση τις σταθερές περιοχές του DNA στόχου. Κάποια από τα χαρακτηριστικά που αποδίδονται στους ιδανικούς εκκινητές είναι: μήκος βάσεις. Ωστόσο, μεγαλύτερου ή μικρότερου μήκους εκκινητές είναι δυνατόν να είναι εξίσου αποτελεσματικοί. περιεχόμενο σε GC αντίστοιχο με εκείνο του DNA-στόχου (50-60% GC). απουσία συμπληρωματικότητας μεταξύ των δύο εκκινητών, καθώς και μεταξύ διαφορετικών περιοχών του ίδιου εκκινητή, ώστε να αποφεύγεται η δημιουργία δευτεροταγών δομών. όχι τρεις ή περισσότερες γουανίνες (G) ή κυτοσίνες (C) στη σειρά, στο 3 άκρο του εκκινητή. απουσία αλληλοεπικάλυψης των δύο εκκινητών στο 3 άκρο, προς αποφυγή δημιουργίας διμερών εκκινητών. παραπλήσια θερμοκρασία τήξης (Tm). Η τιμή της σταθεράς Tm, καθορίζεται από τη σύσταση των εκκινητών σε αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C). Επιθυμητές Tm κυμαίνονται μεταξύ ο C. Προσεγγιστικά ισχύει ότι: Tm = 2 Χ (Α + Τ) + 4 Χ (G + C). Υπολογίζεται, λοιπόν, η θερμοκρασία Tm για καθέναν από τους δύο εκκινητές και αφαιρούμε 5 ο C από την κατώτερη Tm. Η τελική τιμή που προκύπτει είναι περίπου η τιμή της θερμοκρασίας σύνδεσης των εκκινητών. Κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για να αποφευχθεί τυχόν επιμόλυνση του μείγματος αντίδρασης με εξωγενές DNA, πιθανές πηγές του οποίου είναι το εργαστηριακό περιβάλλον, οι πιπέτες, τα μικρορύγχη, τα χημικά

76 αντιδραστήρια, αλλά ακόμη και η ομιλία ή ο βήχας. Για το λόγο αυτό, στο πείραμα πάντοτε συμπεριλαμβάνεται ένας μάρτυρας ελέγχου (τυφλό), ο οποίος αποτελείται από όλα τα υλικά του μείγματος αντίδρασης, εκτός από το DNA, για να διαπιστωθεί τυχόν επιμόλυνση. Στον Πίνακα 9 φαίνονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε γονίδιο το οποίο μελετήθηκε με PCR. Για το σχεδιασμό τους στο εργαστήριο χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Ρrimer 3 Web-based PCR primer prediction. Η σύσταση του μείγματος αντίδρασης φαίνεται στον Πίνακα 10. Τα δείγματα τοποθετούνται στο θερμικό κυκλοποιητή (MyCycler thermal cycler Biorad) (Εικόνα 21), που ρυθμίζεται στο επιθυμητό πρόγραμμα. Οι συνθήκες του προγράμματος που χρησιμοποιήθηκε για κάθε γονίδιο φαίνονται στον Πίνακα 11. Τέλος, τα προϊόντα της κάθε αντίδρασης ανιχνεύονταν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, συγκέντρωσης 2%. Γονίδιο Εκκινητές Μήκoς προϊόντος Βιβλιογραφία HNF-1α For: 5 -GTGTCTACAACTGGTTTGCC-3 Rev: 5 -TGTAGACACTGTCACTAAGG-3 HNF-4α For: 5 -GCCTACCTCAAAGCCATCAT-3 Rev: 5 -GACCCTCCCAGCAGCATCTC-3 GAPDH For: 5 -TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 Rev: 5 -CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3 E-cadherin For: 5 -CAGTCAAAAGGCCTCTACGG -3 Rev: 5 -GTGTATGTGGCAATGCGTTC -3 Snail For: 5 -CCAATCGGAAGCCTAACTACAG-3 Rev: 5 -CAGGTGGGCCTGGTCGTA-3 251bp Inada et al., bp Talens-Visconti et al., bp Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο 436bp Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο 84bp Jethwa et al., 2008 Πίνακας 9: Οι αλληλουχίες, το μήκος προϊόντος και η βιβλιογραφία των εκκινητών κάθε γονιδίου

77 Αντιδραστήριο cdna (1:100) PCR Buffer 10X MgCl2 (25 mm) dntps (έκαστο 2 mm) Μείγμα εκκινητών (10 pmol/μl) Αποστειρωμένο ddη 2 Ο Taq πολυμεράση 5U/μl Τελικός όγκος Όγκος 5μl 2.5μl 1.5μl 2.5μl 2μl 11.4μl 0.1μl 25μl Πίνακας 10: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Γονίδιο E-cadherin Snail HNF-1α HNF-4α GAPDH 1.Αρχική αποδιάταξη 95 C - 2 min 95 ο C - 2 min 95 C - 2 min 95 ο C - 2 min 95 C - 2 min 2.Αποδιάταξη 95 C - 45 sec 95 C - 45 sec 95 C - 45 sec 95 C - 45 sec 95 C - 45 sec 3.Υβριδισμός εκκινητών 53 C - 45 sec 52 C - 45 sec 53 C - 45 sec 62 C - 45 sec 60 C - 45 sec 4.Σύνθεση DNA 72 C - 30 sec 72 C - 1 min 72 C - 30 sec 72 C - 30 sec 72 C - 45 sec Αριθμός κύκλων (βήματα 2-4) 5. Ολοκλήρωση σύνθεσης θυγατρικών αλυσίδων C - 10 min 72 C 10min 72 C - 10 min 72 C - 10 min 72 C - 10 min Πίνακας 11: Οι συνθήκες αντίδρασης για κάθε γονίδιο. Εικόνα 21: Ο θερμικός κυκλοποιητής MyCycler thermal cycler της Biorad

78 v mirvana qrt-pcr mirna Detection Kit Στο διάστημα κατά το οποίο τα πειράματα διεξάγονταν στην παραδοσιακή PCR, για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των micrornas, από δείγματα ολικού RNA, χρησιμοποιήθηκε το mirvana kit. Πρόκειται για ένα ολοκληρωμένο σετ αντιδραστηρίων, που επιτρέπει την ακριβή και ταυτόχρονα ταχύτατη εξαγωγή αποτελεσμάτων. Η μέθοδος στην οποία στηρίζεται είναι η ποσοτική ανάστροφη PCR (quantitative reverse transcription-pcr, qrt-pcr). Αυτό σημαίνει πως δουλεύει σε δύο βήματα. Στο πρώτο, από το ολικό RNA του δείγματος μετατρέπεται σε cdna μόνο το mir που μελετάται, ενώ στο δεύτερο ενισχύεται με PCR το cdna αυτό. Μετά από μια σειρά πιλοτικών πειραμάτων με σκοπό την εύρεση της κατάλληλης ποσότητας RNA και του κατάλληλου PCR πρωτοκόλλου που θα έπρεπε να χρησιμοποιήσουμε για να έχουμε τα βέλτιστα αποτελέσματα, καταλήξαμε στα 40 ng RNA/αντίδραση και στους 35 κύκλους (Πίνακας 15). Πιο αναλυτικά, στο πρώτο βήμα δημιουργείται το μείγμα αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 12 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 13. Έτσι, προκύπτει το cdna του εξεταζόμενου mir. Στο δεύτερο βήμα, δημιουργείται το μείγμα αντίδρασης που φαίνεται στον Πίνακα 14 και ακολουθείται το πρωτόκολλο του Πίνακα 15. Με τον τρόπο αυτό, το προαναφερθέν cdna ενισχύεται και μπορεί να ανιχνευτεί σε πηκτή αγαρόζης. Αντιδραστήριο RNA mirvana 5X RT Buffer 1X mirvana RT Primer Nuclease-free Η 2 Ο ArrayScript Enzyme Mix Τελικός όγκος Όγκος 2μl 2μl 1μl 4.6μl 0.4μl 10μl Πίνακας 12: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Σύνθεση cdna Απενεργοποίηση ενζύμου 37 C - 30 min 95 C - 10 min Πίνακας 13: Οι συνθήκες αντίδρασης

79 Αντιδραστήριο cdna mirvana 5X PCR Buffer mirvana PCR Primers Nuclease-free Η 2 Ο Taq πολυμεράση 5U/μl Τελικός όγκος Όγκος 10μl 5μl 0.5μl 9.3μl 0.2μl 25μl Πίνακας 14: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Υβριδισμός εκκινητών Σύνθεση DNA 95 C - 3 min 95 C - 15 sec 60 C - 30 sec 72 C - 30 sec Αριθμός κύκλων 35 Ολοκλήρωση σύνθεσης θυγατρικών αλυσίδων 72 C - 10 min Πίνακας 15: Οι συνθήκες της αντίδρασης

80 v Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time RT- PCR) Εκτός από τα παραπάνω πρωτόκολλα, που αφορούν στην παραδοσιακή PCR, τα οποία δοκιμάστηκαν και δούλεψαν επιτυχώς, στη συνέχεια στραφήκαμε στη νεότερη και ακριβέστερη μέθοδο της Real-Time PCR. Αυτό συνέβη επειδή στον Τομέα ΓΑΜΒ εγκαταστάθηκε η απαραίτητη συσκευή, Step One Real Time PCR System της Applied Biosystems (Εικόνα 22), οπότε έγινε δυνατή η πραγματοποίηση τέτοιου είδους πειραμάτων. Η Real-Time RT-PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε με χρήση της χρωστικής SYBR Green, είτε με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκαν και οι δύο χημείες, αναλόγως του υπό μελέτη γονιδίου. Όπως και στην παραδοσιακή PCR, έτσι και εδώ χρησιμοποιείται ένας μάρτυρας ελέγχου (τυφλό) σε κάθε πείραμα, ο οποίος αποτελείται από όλα τα υλικά του μείγματος αντίδρασης, εκτός από το DNA, για να διαπιστωθεί τυχόν επιμόλυνση. Εικόνα 22: Η συσκευή Step One Real Time PCR System της Applied Biosystems

81 SYBR Green χημεία Η χρωστική SYBR Green I (SG) είναι μια ασύμμετρη κυανική χρωστική, που προσδένεται σε δίκλωνα τμήματα DNA και τότε φθορίζει (Εικόνα 23). Εξαιτίας αυτού, είναι πολύ χρήσιμη για την επισήμανση των νουκλεϊκών οξέων. Το σύμπλοκο DNA-χρωστικής απορροφά μπλε φως, έως λ=488 nm, εκπέμποντας πράσινο, έως λ=522 nm. Μεγάλο μειονέκτημα της συγκεκριμένης τεχνικής αποτελεί το γεγονός ότι η SYBR Green ανιχνεύει και υβριδίζεται με οποιοδήποτε δίκλωνο τμήμα DNA, χωρίς καμία ειδικότητα. Έτσι, η αντίδραση θα πρέπει να περιέχει ένα συνδυασμό εκκινητών και βασικού μίγματος, που θα ενισχύει αποκλειστικά το ειδικό προϊόν και όχι άλλα δευτερεύοντα παραπροϊόντα (Zipper et al., 2004, Heid et al., 1996). Το δεύτερο σημείο ελέγχου της ειδικότητας του συντιθέμενου προϊόντος είναι η καμπύλη τήξης (melting curve), στην οποία διακρίνονται όλα τα τμήματα του cdna που ενισχύθηκαν, ως ξεχωριστές κορυφές. Συγκεκριμένα, μετά από την ενίσχυση του προϊόντος, το μηχάνημα προγραμματίζεται να πραγματοποιήσει την αντίδραση της καμπύλης τήξης, στην οποία η θερμοκρασία αυξάνεται σε ένα εύρος 60 ο C-95 ο C, ανά 0.3 ο C, και καταγράφεται έτσι η διαφορά στον εκπεμπόμενο φθορισμό από την SYBR Green. Στο σημείο τήξης, οι δύο κλώνοι του DNA θα διαχωριστούν και ο εκπεμπόμενος φθορισμός θα μειωθεί απότομα. Το πρόγραμμα καταγράφει τα στοιχεία και κάνει ένα γράφημα του σχετικού εκπεμπόμενου φθορισμού (άξονας Υ) σε σχέση με τη θερμοκρασία (άξονα Χ), το οποίο οδηγεί στο σχηματισμό κορυφών (στην περίπτωση περισσοτέρων του ενός επιθυμητού προϊόντος, ή στην περίπτωση διμερισμού των εκκινητών) ή στο σχηματισμό μίας και μοναδικής κορυφής, που είναι και το βέλτιστο. Έτσι, ξεχωρίζουν τα ειδικά προϊόντα της αντίδρασης, τα οποία αντιστοιχούν σε μια καμπύλη με μία μόνο έντονη κορυφή σε αναμενόμενη θερμοκρασία τήξης βάσει του μεγέθους τους. Εικόνα 23: Η SYBR Green, μια χρωστική που φθορίζει μόνο όταν προσδένεται σε δίκλωνα τμήματα DNA

82 Με τη συγκεκριμένη τεχνική ελέγχθηκε η έκφραση των γονιδίων HNF-1α, HNF-3β, HNF-4α, E-καδερίνης (E-cadherin), Snail, καθώς και του γονιδίου αναφοράς GAPDH. Η σύσταση του μείγματος αντίδρασης που χρησιμοποιήθηκε φαίνεται στον Πίνακα 16, ενώ οι αλληλουχίες των εκκινητών στον Πίνακα 17. Στον Πίνακα 18 φαίνονται οι συνθήκες της αντίδρασης, που ήταν κοινές για όλα τα γονίδια, καθώς οι εκκινητές σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να έχουν ίδια θερμοκρασία τήξης (και άρα ίδια θερμοκρασία υβριδισμού στο υπό μελέτη εκμαγείο) και επίσης το μέγεθος του ενισχυμένου προϊόντος δεν ήταν σε καμία περίπτωση μεγαλύτερο των 150bp. Ο σχεδιασμός έγινε έτσι ώστε να είναι δυνατή η ταυτόχρονη μελέτη διαφορετικών γονιδίων του ίδιου δείγματος. Τέλος, πριν η πειραματική διαδικασία τυποποιηθεί, προηγείται μια σειρά πιλοτικών πειραμάτων για τον προσδιορισμό των ποσοτήτων εκμαγείου και εκκινητών που θα χρησιμοποιούνται. Συγκεκριμένα, σε ένα κοινό εκμαγείο μέσης αραίωσης1:100, δοκιμάζονται διαδοχικά αυξανόμενες ποσότητες εκκινητών, σε ένα εύρος τιμών pmol. Αφού προσδιοριστεί η βέλτιστη ποσότητα εκκινητών για κάθε γονίδιο, χρησιμοποιείται αυτή με διαδοχικές αραιώσεις εκμαγείου, από πυκνό έως 1:1000, ώστε να προκύψει και η καταλληλότερη αραίωση. Στη συγκεκριμένη εργασία, παντού χρησιμοποιήθηκε η αραίωση 1:100, ενώ οι ποσότητες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 16. Πίνακας 16: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης (ανά δείγμα). Γονίδιο HNF-1α HNF-3β HNF-4α Ε-cadherin Snail GAPDH cdna (1:100) 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2x SYBR Green master mix* 5μl 5μl 5μl 5μl 5μl 5μl Μείγμα εκκινητών (1 pmol/μl) 3μl 3μl 1.5μl 3μl 2μl 3μl Αποστειρωμένο ddη 2 Ο μl - 1μl - Τελικός όγκος 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl *KAPA SYBR FAST (#KM4103), περιλαμβάνει DNA πολυμεράση, PCR buffer, dntps, Mg 2+, ROX (παθητική χρωστική κανονικοποίησης, ώστε να διορθώνονται τυχόν λάθη πιπεταρίσματος, καθώς η τελική απορρόφηση που δίνεται είναι κανονικοποιημένη με την απορρόφηση της ROX χρωστικής, η οποία φυσικά απορροφά σε άλλο μήκος κύματος από την SYBR Green χρωστική)

83 Γονίδιο HNF-1α Εκκινητές For: 5 -CCATCCTCAAAGAGCTGGAG-3 Rev: 5 -GCTGCAGGTAGGACTTGACC-3 HNF-3β For: 5 - CCCGGTTTTATCCCTTGAAT -3 Rev: 5 - CCTGCAACCAGACAGGGTAT-3 HNF-4α Ε-cadherin Snail For: 5 -CGAGCAGATCCAGTTCATCA-3 Rev: 5 -CGTTGGTTCCCATATGTTCC-3 For: 5 -GGTCTGTCATGGAAGGTGCT-3 Rev: 5 -TTTGTCAGGGAGCTCAGGAT-3 For: 5 -CCAATCGGAAGCCTAACTACAG-3 Rev: 5 -CAGGTGGGCCTGGTCGTA-3 Μήκος προϊόντος 123bp 120 bp 149bp 137bp 84bp Βιβλιογραφία Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο Jethwa et al., 2008 GAPDH For: 5 - CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3 Rev: 5 - TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3 106bp Σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο Πίνακας 17: Οι αλληλουχίες, το μήκος προϊόντος και η βιβλιογραφία των εκκινητών κάθε γονιδίου. Για το σχεδιασμό εκκινητών στο εργαστήριο χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα Ρrimer 3 Web-based PCR primer prediction και Universal ProbeLibrary Assay Design Center της Roche ( Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Υβριδισμός εκκινητών/ Σύνθεση DNA 95 C - 20 sec 95 C - 3 sec 60 C - 30 sec Αριθμός κύκλων 40 Καμπύλη τήξης 95 C - 15 sec 60 C - 1 min 95 C - 15 sec (Æ +0.3 C) Πίνακας 18: Οι συνθήκες αντίδρασης

84 TaqMan χημεία Στη συγκεκριμένη προσέγγιση, η ακρίβεια είναι πολύ μεγαλύτερη, καθώς χρησιμοποιείται το ζεύγος των εκκινητών, αλλά και ένας ανιχνευτής (probe), επομένως το όποιο προϊόν γίνει ορατό, έχει περάσει από τρία στάδια «ελέγχου». Πιο αναλυτικά, ο ανιχνευτής φέρει τη χρωστική αναφοράς στο 5 άκρο του, FAM στη συγκεκριμένη περίπτωση, και στο 3 άκρο του μια πρωτεΐνη πρόσδεσης στη μικρή αύλακα (minor groove binder, MGB), που βελτιώνει τις ιδιότητές του, καθώς και το μη φθορίζοντα σιγαστήρα (nonfluorescent quencher, NFQ), που επιτρέπει στη χρωστική αναφοράς να φθορίσει μόνο όταν ο ανιχνευτής υβριδιστεί στο DNA. Η διαδικασία εξελίσσεται σε κάθε κύκλο της αντίδρασης, οπότε σε κάθε στόχο υβριδίζεται το ζεύγος των εκκινητών και ανάμεσά τους ο ανιχνευτής (Εικόνα 24 Α). Στον άθικτο ελεύθερο ανιχνευτή, η χρωστική αναφοράς και ο σιγαστήρας είναι κοντά και ο δεύτερος δεν επιτρέπει στην πρώτη να φθορίσει (Εικόνα 24 Α, Β). Η DNA πολυμεράση, λόγω της 5 εξωνουκλεολυτικής δράσης της, αποικοδομεί όσους ανιχνευτές συναντά υβριδισμένους στο στόχο (Εικόνα 24Γ), απελευθερώνοντας τη χρωστική από το σιγαστήρα. Τότε, η πρώτη μπορεί να φθορίσει ελεύθερα και να μετρηθεί η ποσότητα του ενισχυμένου προϊόντος (Εικόνα 24Δ). Η παρούσα τεχνική, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της έκφρασης του mir-24 και του γονιδίου αναφοράς U6. Η σύσταση του μείγματος αντίδρασης που χρησιμοποιήθηκε δίνεται στον Πίνακα 19, ενώ οι συνθήκες της αντίδρασης, κοινές για όλα τα γονίδια, στον Πίνακα 20. Οι κωδικοί των εκκινητών έχουν δοθεί στον Πίνακα 2. Εικόνα 24: Η αρχή λειτουργίας της τεχνικής TaqMan. Α) Πολυμερισμός. Β) Εκτόπιση κλώνου. Γ) Αποικοδόμηση. Δ) Τέλος πολυμερισμού

85 Πίνακας 19: Σύσταση του μείγματος αντίδρασης(ανά δείγμα). Γονίδιο mir-24 U6 cdna 0.7μl 0.7μl 2x TaqMan master mix* Μείγμα εκκινητώνανιχνευτή Αποστειρωμένο ddη 2 Ο 5.0μl 0.5μl 3.8μl 5.0μl 0.5μl 3.8μl Mg 2+, ROX. Τελικός όγκος 10μl 10μl * TaqMan fast universal PCR master mix ( ), περιλαμβάνει DNA πολυμεράση, PCR buffer, dntps, Αρχική αποδιάταξη 95 C - 10 min Αποδιάταξη 95 C - 15 sec Υβριδισμός εκκινητών/ Σύνθεση DNA 60 C - 1 min Αριθμός κύκλων 40 Πίνακας 20: Οι συνθήκες αντίδρασης. Συλλογή και στατιστική ανάλυση δεδομένων Με το πέρας της αντίδρασης, το λογισμικό της συσκευής της Real-Time RT-PCR, σχηματίζει τα γραφήματα ενίσχυσης, τα οποία δείχνουν τη συσσώρευση του ενισχυμένου προϊόντος με την πάροδο του χρόνου. Συγκεκριμένα, στα γραφήματα εμφανίζεται στον άξονα των Υ ο σχετικός εκπεμπόμενος φθορισμός, κανονικοποιημένος ως προς τον φθορισμό της ROX χρωστικής και στον άξονα των Χ εμφανίζεται ο κύκλος της αντίδρασης. Αυτό που μελετάμε στη Real-Time RT-PCR, είναι ο κύκλος στον οποίο η αύξηση στον φθορισμό είναι εκθετική. Αυτό αντιπροσωπεύεται από την τιμή του threshold, τιμή η οποία τίθεται από το χρήστη. Το σημείο τομής της οριζόντιας γραμμής του threshold με την καμπύλη ενίσχυσης αντιστοιχεί στην τιμή του Ct, τιμή η οποία είναι μοναδική για κάθε

86 δείγμα και εξαρτάται από την ποσότητα του υπό μελέτη γονιδίου που υπάρχει στο εκάστοτε δείγμα. Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν για κάθε δείγμα, δηλαδή τα Ct γονιδίου στόχου και γονιδίου αναφοράς, αναλύθηκαν σε ηλεκτρονικό υπολογιστή, με τη βοήθεια των προγραμμάτων StepOne Software v2.1 και Microsoft Office Excel. Ως πειραματική προσέγγιση, αποφασίστηκε η Σχετική Ποσοτικοποίηση, με την οποία υπολογίζεται η διαφορά της γονιδιακής έκφρασης κάθε δείγματος από εκείνη ενός δείγματος «κανονικοποιητή» (calibrator), δεδομένου ότι η αποτελεσματικότητα ενίσχυσης των εκκινητών του κάθε υπό μελέτη γονιδίου και του γονιδίου αναφοράς είναι ίδια (Livak & Schmittgen, 2001). Συγκεκριμένα, τόσο για τα μελετούμενα δείγματα όσο και για τα δείγματα ελέγχου και το δείγμα κανονικοποιητή, υπολογίζονται τα εξής (Pfaffl, 2001): ΔCt,goi=Ct,goi-Ct,ref (1) ΔCt,calib=Ct,cgoi-Ct,cref (2) ΔΔCt= ΔCt,goi-ΔCt,calib (3) 2 -ΔΔCt (4) (όπου goi=gene of interest/γονίδιο στόχος, ref=reference gene/γονίδιο αναφοράς, cgoi= calibrator gene of interest/κανονικοποιητής στο γονίδιο στόχο, cref= calibrator reference gene/ κανονικοποιητής στο γονίδιο αναφοράς) Οι δύο πρώτοι τύποι (1 και 2) κανονικοποιούν ως προς το γονίδιο αναφοράς. Ο τρίτος (3) υπολογίζει τη διαφορά της γονιδιακής έκφρασης του δείγματος από εκείνη του κανονικοποιητή, η οποία υψώνεται στην αρνητική δύναμη του 2, στον τέταρτο τύπο (4), για να εκφραστεί η διαφορά αυτή σε φορές (fold). Στη συνέχεια, με διαίρεση της τιμής που προκύπτει από τον τύπο (4), για το υπό μελέτη δείγμα προς εκείνη του δείγματος ελέγχου, προκύπτει η διαφορά της γονιδιακής έκφρασης του δείγματος υπό μελέτη από το δείγμα ελέγχου. Προφανώς, η διαδικασία αυτή για το δείγμα ελέγχου έχει ως αποτέλεσμα τη μονάδα. Έτσι, είναι δυνατόν να συγκριθούν διαφορετικά δείγματα μεταξύ τους, για το ίδιο βέβαια γονίδιο, αφού η έκφρασή του σε όλα τα δείγματα προκύπτει ως διαφορά από τη μονάδα

87 4.4 Ανάλυση της έκφρασης στο επίπεδο της πρωτεΐνης v Συλλογή κυττάρων και παρασκευή κυτταρικών εκχυλισμάτων 1. Πλύση των κυττάρων με 1Χ PBS (Phosphate Buffer Saline). 2. Συλλογή των κυττάρων με ξύστη (scraper) και αιώρησή τους σε 1ml 1X PBS/ ph=7.4 (Πίνακας 21). 3. Φυγοκέντρηση στις 3.000rpm 5 λεπτά στους 4 ο C. 4. Απομάκρυνση υπερκείμενου. 5. Αιώρηση του ιζήματος σε μl διαλύματος λύσης, αναλόγως του μεγέθους του ιζήματος (Πίνακας 22). 6. Επώαση στους 37 ο C για 30 λεπτά. 7. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 λεπτά στους 4 ο C. 8. Συλλογή του υπερκείμενου και αποθήκευση στους -80 ο C PBS (Phosphate buffered saline) 1X NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 ddh 2 O 8gr 0.2gr 1.44gr 0.24gr ως το 1lt Πίνακας 21: Παρασκευή διαλύματος PBS 1X. Διάλυμα λύσης (Lysis buffer) 50mM imidazole/ ph:7,4 250mM NaCl 2mM EGTA 1mM EDTA 5mM DTT (dithiothreitol) 50μM leupeptine 0.25% Brij-97 Πίνακας 22: Διάλυμα λύσης για την παρασκευή κυτταρικών εκχυλισμάτων

88 v Ποσοτικός προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ολικής πρωτεΐνης των δειγμάτων γίνεται με τη μέθοδο Bradford, η οποία χρησιμοποιείται στην ανίχνευση πρωτεϊνών της τάξης των μg. Η BIO-RAD Protein Assay είναι μια μέθοδος σύνδεσης χρωστικής, η οποία στηρίζεται στην αλλαγή του χρώματος της χρωστικής, ως απόκριση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης. Πιο αναλυτικά, στηρίζεται στην παρατήρηση ότι η μέγιστη απορρόφηση για ένα όξινο διάλυμα του Coomassie Brilliant Blue G-250 αλλάζει από τα 465 nm στα 595 nm, όταν πραγματοποιείται σύνδεση με πρωτεΐνες. Ο Bradford παρατήρησε πρώτος τη χρησιμότητα αυτής της αρχής στη μελέτη των πρωτεϊνών (Bradford, 1976). Ο Spector παρατήρησε ότι η εξαφάνιση του συντελεστή του συμπλόκου χρωστικής-αλβουμίνης ήταν σταθερή σε ένα εύρος συγκέντρωσης δέκα επιπέδων (Spector, 1978). Έτσι, ο νόμος του Beer είναι δυνατόν να εφαρμοστεί για ακριβή ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης, με την επιλογή μιας κατάλληλης αναλογίας όγκου της χρωστικής και συγκέντρωσης του δείγματος. Για ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων πρωτεϊνών, η μέθοδος σύνδεσης της χρωστικής παρέχει ακριβή, αλλά όχι πλήρως γραμμική απόκριση. Για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης, υπάρχει διαθέσιμη λυοφιλιωμένη αλβουμίνη πλάσματος μοσχαριού (Bovine Serum Albumin, BSA). Εναλλακτικά, κάθε καθαρή πρωτεΐνη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν πρότυπο, αρκεί να είναι επιθυμητές οι σχετικές τιμές της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης. Το αντιδραστήριο της χρωστικής είναι πέντε φορές συγκεντρωμένο. Έτσι, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί, είναι απαραίτητο να αραιωθεί με απιονισμένο νερό

89 v Κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιείται ως πρότυπο διάλυμα η αλβουμίνη πλάσματος μοσχαριού (BSA) συγκέντρωσης 0,2mg/ml (Πίνακας 23). α/α δοκιμαστικού σωλήνα Ποσότητα BSA V BSA (0,2 mg/ml) V colour reagent 1 1μg 5μl 995μl 2 2μg 10μl 990μl 3 3μg 15μl 985μl 4 5μg 25μl 975μl 5 10μg 50μl 950μl 6 15μg 75μl 925μl Πίνακας 23: Κατασκευή πρότυπης καμπύλης v Προετοιμασία Δειγμάτων 1. Αραίωση των δειγμάτων δύο φορές (1:1) με απιονισμένο νερό, έτσι ώστε οι τιμές να βρίσκονται μέσα στα όρια της πρότυπης καμπύλης. 2. Για κάθε δείγμα χρησιμοποιούνται 998μl χρωστικής και 2μl από το αραιωμένο δείγμα. Ως τυφλό, στη φωτομέτρηση, χρησιμοποιείται σκέτη χρωστική (1000μl), δίχως δείγμα πρωτεΐνης. 3. Ακολουθεί vortex των δειγμάτων. 4. Επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Φωτομέτρηση στα 595 nm. 6. Οι τιμές της οπτικής πυκνότητας καταχωρούνται σε ειδικό πρόγραμμα, το οποίο παρέχει τις τιμές της ποσότητας της ολικής πρωτεΐνης σε μg

90 v Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (SDS-PAGE) Ηλεκτροφόρηση είναι η διαδικασία κατά την οποία φορτισμένα μόρια μετακινούνται και διαχωρίζονται μέσω ενός πορώδους υλικού, όπως η πηκτή πολυακρυλαμίδης ή αγαρόζης, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, με βάση το φορτίο τους, το σχήμα ή το μέγεθός τους. Είναι μια πολύ απλή και σχετικά γρήγορη μέθοδος, η οποία χρησιμοποιείται για την ανάλυση και τον καθαρισμό μεγάλων μορίων, όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα, αλλά και απλούστερων μορίων, όπως σάκχαρα, αμινοξέα, πεπτίδια και νουκλεοτίδια. Οι πηκτές είναι διαφόρων μεγεθών, ανάλογα με τα δείγματα, ενώ η ηλεκτροφόρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε οριζόντια ή σε κατακόρυφη θέση. Στο τέλος του διαχωρισμού, τα διαφορετικά είδη μορίων ανιχνεύονται με ποικίλους τρόπους, ως ζώνες σε συγκεκριμένες θέσεις πάνω στην πηκτή. Στην ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμίδης, τα μόρια μετακινούνται με βάση το μοριακό τους βάρος. Αυτό επιτυγχάνεται χάρη στο SDS (Sodium Dodecylsulfate), ένα ανιονικό απορρυπαντικό, το οποίο προσδίδει σε όλες τις πρωτεΐνες αρνητικό φορτίο και έτσι τις διατηρεί σε ευθύγραμμη διαμόρφωση. Υπάρχουν δύο είδη ηλεκτροφόρησης: 1) η συνεχής, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε ένα μόνο είδος πηκτής, την πηκτή διαχωρισμού (separating gel) και 2) η ασυνεχής, στην οποία στο κάτω μέρος της συσκευής υπάρχει η πηκτή διαχωρισμού (separating gel) και στο επάνω μέρος υπάρχει η πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel). Η πηκτή επιστοίβαξης έχει μικρότερη πυκνότητα, άρα και μεγαλύτερους πόρους, έτσι ώστε όλα τα δείγματα να κινούνται μαζί και να τοποθετούνται κατά μήκος μιας λεπτής ζώνης, έως ότου φθάσουν στα όρια με την πηκτή διαχωρισμού. Από εκεί, τα δείγματα ξεκινούν να διαχωρίζονται ταυτόχρονα, με βάση το μοριακό τους βάρος. Παράλληλα με τα άγνωστα δείγματα, χρησιμοποιούντα και μείγματα πρωτεϊνών διαφόρων μοριακών βαρών ως μάρτυρες (markers). Σήμερα, υπάρχουν διάφορα πρωτόκολλα για ασυνεχή ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, αυτό που όμως έχει επικρατήσει είναι του Laemnli (Laemnli, 1970)

91 v Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών SDS-PAGE i. Προετοιμασία πηκτής 1. Συναρμολόγηση της συσκευής προετοιμασίας της πηκτής. 2. Προσθήκη του διαλύματος της πηκτής διαχωρισμού αργά (Πίνακας 24), ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία φυσαλίδων. 3. Στη συνέχεια, η επιφάνεια της πηκτής διαχωρισμού καλύπτεται με μια λεπτή στοιβάδα δις απεσταγμένου νερού, ώστε να απομακρυνθούν τυχόν φυσαλίδες που δημιουργήθηκαν. 4. Πολυμερισμός της πηκτής διαχωρισμού για περίπου 40 λεπτά. 5. Ακολουθεί απομάκρυνση του νερού από την επιφάνεια της πηκτής και με τη χρήση διηθητικού χαρτιού απομακρύνονται και οι τελευταίες σταγόνες. 6. Τοποθέτηση των χτενών και προσθήκη του διαλύματος της πηκτής επιστοίβαξης (Πίνακας 25). 7. Πολυμερισμός της πηκτής επιστοίβαξης για περίπου 30 λεπτά. 8. Αφαίρεση της έτοιμης πηκτής από τη βάση προετοιμασίας και τοποθέτησή της στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 9. Προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης (running buffer) (Πίνακας 26). 10. Απομάκρυνση της χτένας. Ξέπλυμα των πηγαδιών με το διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Στο στάδιο αυτό, η πηκτή είναι έτοιμη για τη φόρτωση των δειγμάτων. Πηκτή διαχωρισμού (10%) ddh 2 O 4.15ml 1,5M Tris-HCl ph:8,8 2.5ml 10% SDS 0.1ml 30% ακρυλαμίδη 3.3ml 10% APS 50μl TEMED 5μl Τελικός όγκος 10 ml Πηκτή επιστοίβαξης (4%) ddh 2 O 6.1ml 0,5M Tris-HCl ph:6,8 2.5ml 10% SDS (w/v) 100μl 30% ακρυλαμίδη 1.33ml 10% APS 50μl TEMED 10μl Τελικός όγκος 10ml Πίνακας 24: Πηκτή διαχωρισμού Πίνακας 25: Πηκτή επιστοίβαξης με συγκέντρωση ακρυλαμίδης 10%. με συγκέντρωση ακρυλαμίδης 4% 91

92 5x Διάλυμα Ηλεκτροφόρησης (Running buffer) Tris-base Γλυκίνη SDS ddh 2 O 9gr 43.2gr 3gr έως τα 600ml Πίνακας 26: Παρασκευή διαλύματος ηλεκτροφόρησης. ii. Προετοιμασία δειγμάτων 1. Υπολογισμός του όγκου του δείγματος, σε μl, στον οποίο περιέχονται 25μg πρωτεΐνης και συμπλήρωση με χρωστική φόρτωσης (loading buffer) 5x Laemnli (Πίνακας 27) των δειγμάτων μέχρι τα 20 μl. 2. Βρασμός των δειγμάτων για 5 λεπτά, ώστε να αποδιαταχθούν οι πρωτεΐνες. 3. Στη συνέχεια, φυγοκέντρησή τους για μερικά δευτερόλεπτα, ώστε να συγκεντρωθούν τα δείγματα. 4. Τέλος, ακολουθεί η φόρτωση των δειγμάτων στην πηκτή πολυακρυλαμίδης με Hamilton πιπέτα. Xρωστική φόρτωσης δειγμάτων (Reducing Loading Buffer) ddh 2 O 3.8ml 0,5M Tris-HCl ph:6,8 1ml Γλυκερόλη 0.8ml 10% SDS (w/v) 1.6ml 2-μερκαπτοαιθανόλη 0.4ml 1% (w/v) μπλε της βρωμοφαινόλης 0.4ml Τελικός όγκος Πίνακας 27: Παρασκευή χρωστικής φόρτωσης δειγμάτων. 8ml 92

93 iii. Ηλεκτροφόρηση Αφού συνδεθεί η συσκευή με το τροφοδοτικό, ρυθμίζεται η τάση του ρεύματος στα 50V, όσο τα δείγματα βρίσκονται στην πηκτή επιστοίβαξης, αλλά αυξάνεται στα 150V, μόλις περάσουν στην πηκτή διαχωρισμού. Τα δείγματα αφήνονται να διαχωριστούν, μέχρι η χρωστική να φθάσει στο κάτω μέρος της πηκτής. v Μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, στην οποία αποτυπώνονται όπως ακριβώς διαχωρίστηκαν και στην πηκτή. Στη συνέχεια, γίνεται ανοσοανίχνευση των επιθυμητών πρωτεϊνών με ανάλυση κατά Western. 1. Για κάθε πηκτή ετοιμάζονται δύο σφουγγαράκια, δύο χαρτιά Whatmann και η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, κομμένα στο μέγεθος της πηκτής και βυθίζονται σε διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς (transfer buffer) (Πίνακας 28) για 15 λεπτά, για εξισορρόπηση. 2. Το πέρας της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί η απομάκρυνση της πηκτής από τη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 3. Σε μια λεκάνη με αρκετό διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς, τοποθετείται η ειδική θήκηυποδοχής της πηκτής με την άνοδο προς τα κάτω. Ακολουθεί η τοποθέτηση ενός σφουγγαριού, ενός χαρτιού Whatmann, η πηκτή, η μεμβράνη, ακόμη ένα χαρτί Whatmann και τέλος, ένα ακόμα σφουγγαράκι. 4. Απομάκρυνση των φυσαλίδων με τη χρήση πιπέτας Pasteur. 5. Κλείδωμα της θήκης-υποδοχής και τοποθέτησή της στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς, με τη μαύρη πλευρά προς τον αντίστοιχο πόλο. 6. Τοποθέτηση παγοκύστης και ρύθμιση του τροφοδοτικού στα 350mA, για περίπου μια ώρα. 7. Με το πέρας της ηλεκτρομεταφοράς, η μεμβράνη στεγνώνεται σε διηθητικό χαρτί, τοποθετείται σε διαφανή ζελατίνα και αποθηκεύεται στους 4 C. 93

94 Διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς 1x (Transfer buffer 1x) Tris-base Γλυκίνη Μεθανόλη 3.03gr 14.4gr 200ml ddh 2 O έως το 1lt Πίνακας 28: Παρασκευή διαλύματος ηλεκτρομεταφοράς 1x. v Ανάλυση κατά Western Οι πρωτεΐνες που έχουν μεταφερθεί στη μεμβράνη ανιχνεύονται με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων, τα οποία προσδένονται στη ζώνη που σχηματίζει η πρωτεΐνη. Η ανίχνευση πραγματοποιείται με τη βοήθεια ενός δεύτερου αντισώματος, το οποίο πέραν του ότι στοχεύει το πρώτο και προσδένεται σε αυτό, είναι συζευγμένο και με ένα ένζυμο, στην παρούσα εργασία την υπεροξειδάση, που καταλύει τη φωτογόνο αντίδραση οξείδωσης της λουμινόλης. Συγκεκριμένα, το αντιδραστήριο ECL είναι μίγμα Η 2 Ο 2 και λουμινόλης, οπότε καθώς η υπεροξειδάση του δεύτερου αντισώματος διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου απελευθερώνονται ρίζες Ο 2, οι οποίες αντιδρούν με τη λουμινόλη και απελευθερώνουν φωτόνια, που προσβάλλουν το φωτογραφικό φιλμ. Αυτή η μέθοδος ανίχνευσης των πρωτεϊνών στηρίζεται στην ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Enhanced Chemiluminescence, ECL). 1. Επώαση για μια ώρα, με ανάδευση, σε διάλυμα Blocking solution (Πίνακας 29), σε θερμοκρασία δωματίου, για να καλυφθούν οι κενές θέσεις επάνω στη μεμβράνη. 2. Επώαση για μια ώρα, με ανάδευση, στο πρώτο αντίσωμα, σε θερμοκρασία δωματίου. Η αραίωση του αντισώματος γίνεται με Blocking solution. 3. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, από 10 λεπτά η καθεμιά, σε PBS/Tween-20, 0.1%. 4. Επώαση για μια ώρα, με ανάδευση, στο δεύτερο αντίσωμα, σε θερμοκρασία δωματίου. Η αραίωση του αντισώματος γίνεται με Blocking solution. 5. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, από 10 λεπτά η καθεμιά, σε PBS/Tween-20, 0.1%. 6. Ακολουθεί μια πλύση, για 10 λεπτά, με PBS, υπό συνεχή ανάδευση. 94

95 7. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε ζελατίνα και προσθήκη 1ml του διαλύματος ECL plus (Amersham). Προσοχή, η πλευρά της μεμβράνης που είναι σε επαφή με την πηκτή να είναι από πάνω. 8. Επώαση για 5 λεπτά. 9. Απομάκρυνση της περίσσειας του διαλύματος ECL plus. 10. Τοποθέτηση της μεμβράνης ανάμεσα σε ζελατίνες. 11. Τοποθέτηση φιλμ (Kodak) και έκθεση για κατάλληλο χρόνο (HNF-4α: 5 λεπτά και p65: 3 λεπτά). 12. Τέλος, τοποθέτηση στα ακόλουθα διαλύματα με την αναγραφόμενη σειρά: i. Developer (Kodak), μέχρι να εμφανιστούν οι επιθυμητές ζώνες. ii. Νερό βρύσης. iii. Fixer (Kodak). iv. Νερό βρύσης Blocking solution Tween-20 Γάλα BSA fraction V (χωρίς λιπαρά) PBS 0.1ml 5gr 0.5gr έως τα 100ml Πίνακας 29: Παρασκευή blocking solution. Τα αντισώματα και οι αντίστοιχες αραιώσεις τους, που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας, ανάλογα με την προς ανίχνευση πρωτεΐνη, ήταν τα ακόλουθα: Α) 1:1000 goat anti-human HNF-4α (Santa cruz). Β) 1:10000 anti-goat IgG αντίσωμα (Santa cruz), συζευγμένο με υπεροξειδάση. Γ) 1:200 rabbit anti-p65 (Santa cruz). Δ) 1:3000 anti-rabbit IgG αντίσωμα (Santa cruz), συζευγμένο με υπεροξειδάση. 95

96 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1. Κυτταρική σειρά HepG2 i. Μελέτη της επίδρασης του mir-24 στην αύξηση και στον πολλαπλασιασμό των HepG2 κυττάρων. Με σκοπό την διερεύνηση του ρόλου του microrna mir-24 στις διαδικασίες της αύξησης και του πολλαπλασιασμού των ηπατοκαρκινικών κυττάρων HepG2, πραγματοποιήθηκε ανάστροφη διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2 με το συνθετικό μόριο Pre-miR precursor molecule for hsa-mir 24, έτσι ώστε να αυξηθούν τα επίπεδα του ώριμου mir-24 στο κύτταρο. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα στα οποία είχε γίνει επίδραση μόνο με τον παράγοντα διαμόλυνσης siport. Ο αρχικός αριθμός κυττάρων, και στα πιάτα- μάρτυρες και στα πιάτα τα οποία υπέστησαν διαμόλυνση ήταν κύτταρα. Μετά την ανάστροφη διαμόλυνση των κυττάρων, ακολούθησε ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του microrna mir-24 με real-time RT-PCR, έτσι ώστε να επιβεβαιωθεί η επιτυχία της διαμόλυνσης και η επακόλυθη αύξηση της έκφρασης του mir-24 και να ακολουθήσουν τα επόμενα στάδια του πειράματος. Στην εικόνα 25 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα τα οποία προέκυψαν από την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του mir-24, κανονικοποιημένη ως προς την έκφραση του γονιδίου αναφοράς U6, σε πιάτα τα οποία έχουν διαμολυνθεί (mir- treated) και σε πιάτα στα οποία έχει γίνει επίδραση μόνο με τον παράγοντα διαμόλυνσης siport (control), σε 48 ώρες και σε 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Οι τιμές που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± s. error 3 ανεξάρτητων βιολογικών επαναλήψεων. Η τιμή κάθε βιολογικής επανάληψης αντιπροσωπεύει το μέσο όρο δύο τεχνικών επαναλήψεων. 96

97 HepG2 κύτταρα Σχετικά επίπεδα έκφρασης mir *** * 48h 72h control 48h 72h control Εικόνα 25: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του mir-24 σε κύτταρα HepG2, σε 48h & 72h μετά από διαμόλυνση με το pre-mir 24. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HepG2, στα οποία έγινε επίδραση μόνο με siport, ενώ ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο του U6 rrna. Το σύμβολο *** αντιστοιχεί σε P < και το σύμβολο * αντιστοιχεί σε P < 0.05 (Student t test). Παρατηρείται αύξηση της έκφρασης του mir-24, κατά 30 φορές, και στις 48 ώρες και στις 72 ώρες μετά την διαμόλυνση, σε σχέση με τα δείγματα μάρτυρες (control). Μετά τον έλεγχο της επιτυχίας της διαδικασίας της ανάστροφης διαμόλυνσης των κυττάρων με το pre-mir 24, και συνεπώς της υπερέκφρασης του mir-24, ακολούθησε η παρακολούθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε ανάστροφο μικροσκόπιο και ελήφθησαν φωτογραφίες, και των δύο πιάτων (mir-treated & control) σε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές, στις 24 ώρες και στις 72 ώρες. Συγκεκριμένα στην εικόνα 26 φαίνεται η εικόνα των κυττάρων στα 2 πιάτα, 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, ενώ στην εικόνα 27 παρουσιάζονται τα δύο πιάτα μετά την πάροδο 3 ημερών σε καλλιέργεια (72h). Καθώς η ανάστροφη διαμόλυνση είναι μια διαδικασία κατά την οποία η επίστρωση και η επίδραση στα κύτταρα γίνεται ταυτόχρονα, δεν ήταν να δυνατόν να ληφθούν φωτογραφίες στην ώρα 0h. Για αυτό το λόγο η σύγκριση γίνεται με την 24 η ώρα μετά την επίδραση. 97

98 mir-treated κύτταρα (24h) Control κύτταρα (24h) Εικόνα 26: Απεικόνιση του πιάτου που έχει υποστεί διαμόλυνση με το pre-mir 24 (αριστερά) και του πιάτου ελέγχου (δεξιά) 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση. mir-treated κύτταρα (72h) Control κύτταρα (72h) Εικόνα 27: Απεικόνιση του πιάτου που έχει υποστεί διαμόλυνση με το pre-mir 24 (αριστερά) και του πιάτου ελέγχου (δεξιά) 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Όπως φαίνεται από τις εικόνες 26 & 27, τα κύτταρα στα οποία υπερεκφράζεται το mir-24, έχουν πολλαπλασιαστεί σαφώς εντονότερα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, φτάνοντας σε 100% πυκνότητα μετά την πάροδο 3 ημερών σε καλλιέργεια και εμφανίζουν έντονη κατακόρυφη ανάπτυξη. Αντίθετα τα κύτταρα ελέγχου, έχουν φτάσει σε περίπου 80% πυκνότητα μετά από 3 ημέρες, όπως φαίνεται στο δεξιό μέρος της εικόνας

99 Επόμενο βήμα ήταν η καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων στα δύο πιάτα (mir-treated & control) μετά τη λήψη των φωτογραφιών, σε οπτικό μικροσκόπιο με τη χρήση της χρωστικής trypan blue, για να διαπιστωθεί αν όντως ο αριθμός των κυττάρων που υπερεκφράζουν το mir-24 είναι μεγαλύτερος από τον αριθμό των κυττάρων στην ομάδα ελέγχου. Δεδομένου ότι κατά την αρχή του πειράματος επιστρώθηκε στα 2 πιάτα ο ίδιος αριθμός κυττάρων ( κύτταρα) και ότι τα HepG2 κύτταρα πραγματοποιούν ένα διπλασιασμό κάθε 24 ώρες, θα αναμενόταν μετά την πάροδο 72 ωρών τα κύτταρα να έχουν υποστεί 3 διπλασιασμούς και να έχουν φτάσει σε έναν τελικό αριθμό περί του κύτταρα, σε ιδανικές συνθήκες. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του Πίνακα 30, τα κύτταρα τα οποία τα οποία υπερεκφράζουν το mir-24, έχουν πολλαπλασιαστεί με σαφώς πιο αυξημένο ρυθμό σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Συγκεκριμένα από ένα αρχικό πληθυσμό κυττάρων, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν το mir-24 (mir-treated), έφτασαν μετά από 72 ώρες, σε έναν πληθυσμό 2,3 εκατομμυρίων κυττάρων περίπου, ενώ τα κύτταρα της ομάδας ελέγχου έφτασαν σε ένα πληθυσμό 1,5 εκατομμυρίου κυττάρων περίπου, αριθμός που συμβαδίζει με τον αναμενόμενο αριθμό κυττάρων ενός αρχικού πληθυσμού HepG2 κυττάρων μετά από 3 διπλασιασμούς. mir-treated κύτταρα (72h) Control κύτταρα (72h) Αριθμός κυττάρων κύτταρα κύτταρα Πίνακας 30: Ο τελικός αριθμός κυττάρων που προέκυψε μετά την πάροδο 72 ωρών από τη διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Συγκεντρωτικά, στην εικόνα 28 παρουσιάζεται η επίδραση της υπερέκφρασης του mir-24 στην σχετική κυτταρική αύξηση των HepG2, μετά από 72 ώρες από την διαμόλυνση των κυττάρων. Οι τιμές που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± s. error 3 ανεξάρτητων βιολογικών επαναλήψεων. Φαίνεται λοιπόν πως τα κύτταρα που υπερεκφράζουν το mir-24 (mir-treated), μετά από 72 ώρες, αυξήθηκαν 3 φορές περισσότερο (300%) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (control). 99

100 Σχετική κυτταρική αύξηση (%) HepG2 κύτταρα 0 ώρες 72 ώρες control mir-treated Εικόνα 28: Μελέτη της επίδρασης της υπερέκφρασης του mir-24 στη σχετική αύξηση των HepG2 κυττάρων, μετά από παροδική διαμόλυνση με το pre-mir 24. Τα κύτταρα που υπερκφράζουν το mir- 24 (mir-treated), μετά από την πάροδο 72 ωρών, έχουν ένα τελικό πληθυσμό 3 φορές μεγαλύτερο από τον τελικό πληθυσμό των κυττάρων ελέγχου (control). Επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης της αποσιώπησης της έκφρασης του mir-24 στην αύξηση των HepG2 κυττάρων. Πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση ενός αρχικού πληθυσμού κυττάρων με το μόριο Anti-miR mirna Inhibitor για το mir-24, ενώ ως αρνητικό control χρησιμοποιήθηκε το Anti-miR mirna Inhibitor Negative Control. Για να διαπιστωθεί αν όντως το Anti-miR mirna Inhibitor Negative Control, δεν έχει καμία επίδραση στην κυτταρική αύξηση, η επίδρασή του συγκρίθηκε με κύτταρα τα οποία δεν είχαν υποστεί καμία επίδραση (untreated). Μετά τη διαμόλυνση ακολούθησε μέτρηση των κυττάρων σε οπτικό μικροσκόπιο με χρήση της χρωστικής trypan blue, σε 3 διαφορετικές χρονικές στιγμές, στις 24 ώρες, στις 48 ώρες και στις 72 ώρες, μετά την υποέκφραση του mir-24. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο διάγραμμα της εικόνας 29 και αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± s. error 3 ανεξάρτητων βιολογικών επαναλήψεων. 100

101 HepG2 κύτταρα Σχετική κυτταρική αύξηση (%) ώρες 48 ώρες 72 ώρες untreated Neg control mir As-miR 24 Εικόνα 29: Μελέτη της επίδρασης της αποσιώπησης της έκφρασης του mir-24 στη σχετική αύξηση των HepG2 κυττάρων, μετά από παροδική διαμόλυνση με Αs-miR 24. Στις 48 ώρες μετά την αποσιώπηση της έκφρασης του mir-24, ο πληθυσμός των κυττάρων μειώθηκε κατά 14%, μείωση η οποία αυξάνεται στις 72 ώρες, όπου ο πληθυσμός των κυττάρων μειώνεται κατά 45%, σε σχέση με τον πληθυσμό των κυττάρων που έχουν διαμολυνθεί με το anti-mir mirna Inhibitor Negative Control. ii. Μελέτη της επίδρασης του mir-24 στην αύξηση, στον πολλαπλασιασμό και στην μεταναστευτική ικανότητα των HepG2 κυττάρων. Στη συνέχεια ακολούθησε ένα πείραμα ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής μετανάστευσης των HepG2, με σκοπό να διερευνηθεί κατά πόσο και με ποιο τρόπο, η υπερέκφραση του mir-24 επηρεάζει αυτές τις διαδικασίες του κυττάρου. Μετά την ανάστροφη διαμόλυνση των κυττάρων με το pre-mir24, τα κύτταρα αφήνονται να μεγαλώσουν για 24 ώρες. Σε αυτή τη χρονική στιγμή, πραγματοποιείται μία πληγή, με τη βοήθεια ενός ρύγχους, στα κύτταρα τα οποία υπερεκφράζουν το mir-24 (mir-treated) και στα κύτταρα τα οποία έχουν υποστεί επίδραση μόνο με τον παράγοντα διαμόλυνσης siport (control κύτταρα), και αυτή η χρονική στιγμή ορίζεται ως η ώρα 0h του πειράματος. Ο ρυθμός αύξησης και πολλαπλασιασμού των κυττάρων καθώς και η ικανότητα τους να μεταναστεύσουν προς τον κενό χώρο που έχει αφήσει η πληγή στο πιάτο, παρακολουθούνται σε ανάστροφο μικροσκόπιο και λαμβάνονται φωτογραφίες. Η εικόνα των κυττάρων ακριβώς μετά την πρόκληση της πληγής στα πιάτα (0 ώρες), παρουσιάζεται στην εικόνα 30. Τα κύτταρα αφήνονται να μεγαλώσουν για ακόμη 8 ώρες, οπότε 101

102 λαμβάνεται και η δεύτερη φωτογραφία (Εικόνα 31). Τέλος, λαμβάνονται άλλες δύο φωτογραφίες μετά την πάροδο 24 ωρών (Εικόνα 32) και 48 ωρών (Εικόνα 33), από την πρόκληση της πληγής. mir-treated κύτταρα (0h) Control κύτταρα (0h) Εικόνα 30: Πρόκληση πληγής σε HepG2 κύτταρα στα οποία υπερεκφράζεται το mir24 (αριστερά) και σε κύτταρα ελέγχου (δεξιά). mir-treated κύτταρα (8h) Control κύτταρα (8h) Εικόνα 31: Πολλαπλασιασμός και μετανάστευση των HepG2 κυττάρων που υπερεκφράζουν το mir-24 (αριστερά), σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (δεξιά), μετά την πάροδο 8 ωρών από την πρόκληση της πληγής. 102

103 mir-treated κύτταρα (24h) Control κύτταρα (24h) Εικόνα 32: Πολλαπλασιασμός και μετανάστευση των HepG2 κυττάρων που υπερεκφράζουν το mir-24 (αριστερά), σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (δεξιά), μετά την πάροδο 24 ωρών από την πρόκληση της πληγής. mir-treated κύτταρα (48h) Control κύτταρα (48h) Εικόνα 33: Πολλαπλασιασμός και μετανάστευση των HepG2 κυττάρων που υπερεκφράζουν το mir-24 (αριστερά), σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (δεξιά), μετά την πάροδο 48 ωρών από την πρόκληση της πληγής. Όπως φαίνεται, από τις εικόνες 31,32 & 33, στις 8, 24 & 48 ώρες αντίστοιχα από την πρόκληση της πληγής, παρατηρείται σαφής αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των HepG2 κυττάρων που υπερεκφράζουν το mir-24, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, από την 8 η κιόλας ώρα μετά την πρόκληση της πληγής, με την μεγαλύτερη πυκνότητα να παρατηρείται στις 48 ώρες. Στις 24 και στις 48 ώρες στα πιάτα όπου τα κύτταρα 103

104 υπερεκφράζουν το mir-24 (αριστερό μέρος εικόνας 32 & 33), παρατηρείται μία μείωση στο πλάτος της πληγής σε σχέση με την αρχική πληγή που είχε προκληθεί στα πιάτα (αριστερό μέρος εικόνας 30), καθώς τα κύτταρα μεταναστεύουν προς τον κενό χώρο που έχει αφήσει η πληγή, προσπαθώντας να τον καλύψουν. Στο επόμενο στάδιο της διερεύνησης του ρόλου του ανθρώπινου microrna mir-24 στην αύξηση, στον πολλαπλασιασμό και στη μετανάστευση των HepG2 κυττάρων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της επίδρασης της υπερέκφρασης του mir-24 στην έκφραση του ηπατοειδικού μεταγραφικού παράγοντα HNF-4α, καθώς και στον επιθηλιακό δείκτη, Ε- καδερίνη (E-cadherin) και στον μεταγραφικό παράγοντα Snail. Τα επίπεδα έκφρασης και των τριών γονιδίων αναλύθηκαν με τη μέθοδο της real-time RT-PCR, χρησιμοποιώντας ως γονίδιο αναφοράς το γονίδιο της GAPDH. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν για το γονίδιο του HNF-4α φαίνονται στην εικόνα 34, για το γονίδιο της Ε-καδερίνης στην εικόνα 35 και για το γονίδιο του Snail στην εικόνα 36. Οι τιμές που παρουσιάζονται στα διαγράμματα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± s. error 3 ανεξάρτητων βιολογικών επαναλήψεων. Η τιμή κάθε βιολογικής επανάληψης αντιπροσωπεύει το μέσο όρο δύο τεχνικών επαναλήψεων. 1,2 HepG2 κύτταρα διαμολυσμένα με pre-mir24 1 Σχετικά επίπεδα mrna HNF-4α 0,8 0,6 0,4 0,2 0 *** ** 48 ώρες 72 ώρες control 48 ώρες 72 ώρες control Εικόνα 34: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου του HNF-4α σε κύτταρα HepG2, 48h & 72h μετά από την υπερέκφραση του mir 24. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HepG2, στα οποία έγινε επίδραση μόνο με siport, ενώ ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της GAPDH. Το σύμβολο ** αντιστοιχεί σε P < 0.01 και το σύμβολο *** αντιστοιχεί σε P < (Student t test). Παρατηρείται 57% μείωση της έκφρασης του HNF-4α, 48 ώρες μετά την υπερέκφραση του mir-24 και 58% μείωση στις 72 ώρες μετά την υπερέκφραση του mir-24, σε σχέση με τα δείγματα μάρτυρες (control). 104

105 Σχετικά επίπεδα mrna E-καδερίνης HepG2 κύτταρα διαμολυσμένα με pre-mir24 1,2 1 * 0,8 * 0,6 0,4 0,2 0 48h 72h control 48h 72h control Εικόνα 35: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου της Ε-καδερίνης, σε HepG2 κύτταρα, 48 και 72 ώρες μετά από την υπερέκφραση του mir24. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HepG2, στα οποία έγινε επίδραση με siport, ενώ ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της GAPDH. Το σύμβολο * αντιστοιχεί σε P < 0.05 (Student t test). Παρατηρείται 43% μείωση της έκφρασης του γονιδίου της E-καδερίνης, 48 ώρες μετά την υπερέκφραση του mir-24 και 17% μείωση 72 ώρες μετά την υπερέκφραση του mir-24, σε σχέση με τα δείγματα μάρτυρες (control). HepG2 κύτταρα διαμολυσμένα με pre-mir 24 Σχετικά επίπεδα mrna Snail 3 2,5 2 1,5 1 0,5 * 48h 72h control 0 48h 72h control Εικόνα 36: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου του Snail, σε HepG2 κύτταρα, 48 και 72 ώρες μετά από την υπερέκφραση του mir24. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HepG2, στα οποία έγινε επίδραση με siport, ενώ ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της GAPDH. Η τιμή P value είναι ίση με 0,2 για τις 72 ώρες (Student t test). Παρατηρείται 116% αύξηση της έκφρασης του Snail, 48 ώρες μετά την υπερέκφραση του mir- 24 και 23% αύξηση στις 72 ώρες μετά την υπερέκφραση του mir-24, σε σχέση με τα δείγματα μάρτυρες (control). 105

106 5.2 Ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (Cancer Stem Cells) i) Μελέτη των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του HNF-4α, της E-καδερίνης & του Snail σε ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα. Ο κυτταρικός πληθυσμός HepG2 αποτελείται από μία ετερογενή ομάδα κυττάρων στην οποία περιλαμβάνονται και κύτταρα τα οποία εμφανίζουν χαρακτήρα αρχέγονων καρκινικών κυττάρων. Μετά την καλλιέργεια και συλλογή των κυττάρων αυτών (spheroids), έγινε ανάλυση, με τη μέθοδο της real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου του HNF-4α, σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α στα HepG2 κύτταρα (Εικόνα 37). Τα επίπεδα έκφρασης του ηπατοειδικού μεταγραφικού παράγοντα HNF-4α των στελεχιαίων καρκινικών κυττάρων (spheroids), αναλύθηκαν και με ανοσοαποτύπωση κατά Western, όπου και πάλι ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε κυτταρικό εκχύλισμα HepG2 κυττάρων (Εικόνα 38). Στην εικόνα 39 παρουσιάζεται το γράφημα που προκύπτει, όσον αφορά στην έκφραση του HNF-4α, μετά την ανάλυση των αποτελεσμάτων της ανοσοαποτύπωσης κατά Western με το πρόγραμμα Prism 5. Τέλος, στις εικόνες 40 & 41 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της real-time RT-PCR, όσον αφορά στην έκφραση του γονιδίου της E-καδερίνης & του γονιδίου του Snail, σε ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids) σε σχέση με την έκφραση των δύο γονιδίων στα HepG2 κύτταρα. Οι τιμές που παρουσιάζονται στα διαγράμματα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± s. error 2 ανεξάρτητων βιολογικών επαναλήψεων. Η κάθε βιολογική επανάληψη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο δύο τεχνικών επαναλήψεων. Σχετικά επίπεδα mrna HNF-4α 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ** * Spheroids Spheroids/HepG2 HepG2 Spheroids HepG2 Εικόνα 37: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του HNF-4α σε καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids). Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιούνται τα HepG2 κύτταρα. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται το γονίδιο της GAPDH. Το σύμβολο *** αντιστοιχεί σε P < (Student t test). Παρατηρείται 28% μείωση της έκφρασης του γονιδίου του HNF-4α στα ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (HepG2 κύτταρα). 106

107 Επίπεδα έκφρασης HNF-4α Spheroids HepG2 Επίπεδα έκφρασης p-65 Spheroids HepG2 Εικόνα 38: Ανάλυση κατά Western των επιπέδων έκφρασης του HNF-4α σε κυτταρικά εκχυλίσματα καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (spheroids), σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α σε κυτταρικά εκχυλίσματα HepG2. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται το γονίδιο της υπομονάδας p- 65 του NF-kB. Παρατηρείται μείωση της έκφρασης του HNF-4α στα ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου(hepg2 κύτταρα). Έκφραση HNF-4α/ p-65 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 spheroids Spheroids /HepG2 HepG2 spheroids HepG2 Εικόνα 39: Ανάλυση κατά Western των επιπέδων έκφρασης του HNF-4α σε κυτταρικά εκχυλίσματα καρκινικών στελεχιαίων κυττάρων (spheroids), σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α σε κυτταρικά εκχυλίσματα HepG2. Οι τιμές απεικονίζουν το μέσο όρο δύο ανεξάρτητων βιολογικών επαναλήψεων ± s.error, μετά από επεξεργασία με το πρόγραμμα Prism 5. Η τιμή Ρ value είναι ίση με 0,08 (Student t test). Παρατηρείται 43% μείωση της έκφρασης του HNF-4α στα ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου(hepg2 κύτταρα). 107

108 Spheroids/HepG2 2,5 Σχετικά επίπεδα mrna E-καδερίνης 2 1,5 1 0,5 *** Spheroids HepG2 0 Spheroids HepG2 Εικόνα 40: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου της E-καδερίνης σε καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids). Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιούνται τα HepG2 κύτταρα. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται το γονίδιο της GAPDH. Το σύμβολο *** αντιστοιχεί σε P < (Student t test). Παρατηρείται 96% αύξηση της έκφρασης της E-καδερίνης στα ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου(hepg2 κύτταρα). Spheroids/HepG2 Σχετικά επίπεδα mrna Snail 2,5 2 1,5 1 0,5 * spheroids HepG2 0 spheroids HepG2 Εικόνα 41: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου του Snail σε καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids). Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιούνται τα HepG2 κύτταρα. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται το γονίδιο της GAPDH. Το σύμβολο * αντιστοιχεί σε P < 0.05 (Student t test). Παρατηρείται 100% αύξηση της έκφρασης του Snail στα ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα (spheroids), σε σχέση με την ομάδα ελέγχου(hepg2 κύτταρα). 108

109 5.3 Βιοψίες ανθρώπινου ηπατοκαρκινώματος Οι ηπατοειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες (HNFs) συνιστούν ένα καλά ρυθμιζόμενο δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων του οποίου η συνδυαστική δράση συμμετέχει στην ρύθμιση της έκφρασης ηπατοειδικών γονιδίων, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ήπατος, στην διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων καθώς και στην φυσιολογική λειτουργία του ώριμου ήπατος. Οποιαδήποτε διατάραξη της λειτουργίας αυτού του δικτύου μπορεί να συμβάλλει στην ανάπτυξη παθολογικών καταστάσεων στο ήπαρ. Έτσι, στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων τριών ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων, σε βιοψίες ανθρώπινου ηπατοκαρκινώματος. Συγκεκριμένα, αναλύθηκαν με τη μέθοδο της real-time RT-PCR τα επίπεδα έκφρασης 3 γονιδίων, των HNF-1α, HNF-3β & HNF-4α, σε 27 δείγματα βιοψιών ανθρώπινων ηπατοκαρκινικών ιστών και σε 8 δείγματα βιοψιών παρακείμενου ιστού, που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν ως προς την έκφραση του γονιδίου αναφοράς, GAPDH, και είναι εκφρασμένα ως προς την έκφραση του δείγματος-κανονικοποιητή (calibrator), η οποία ισούται με τη μονάδα (εικόνα 42). 109

110 Εικόνα 42: Ανάλυση, με real-time RT-PCR, των επιπέδων έκφρασης των ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων, HNF-1α, HNF-3β, HNF-4α, σε 27 δείγματα ανθρώπινων βιοψιών ηπατοκαρκινώματος και 8 δείγματα παρακείμενου ιστού. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της GAPDH και τα αποτελέσματα είναι εκφρασμένα ως προς τον κανονικοποιητή (calibrator). Γενικά παρατηρείται μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των δειγμάτων. Τα δείγματα στο κόκκινο πλαίσιο αντιπροσωπεύουν εκείνες τις βιοψίες στις οποίες η έκφραση και των τριών ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων είναι μειωμένη, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. 110