ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΑΓΡΟΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ. Εργαστηριακές Ασκήσεις Φυσιολογίας Φυτών

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΑΓΡΟΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Εργαστηριακές Ασκήσεις Φυσιολογίας Φυτών Πέτρος Λόλας, Ευθυμία Λεβίζου, Μαριάντζελα Φωτέλλη, Δημοσθένης Κίζης Βόλος, Νοέμβριος 2010

Άσκηση 1 η : Φύτρωση σπερμάτων και επίδραση της φωτεινής ακτινοβολίας στην ανάπτυξη των αρτίβλαστων Άσκηση 2 η : Μελέτη διαπνευστικού ρεύματος στα φυτά Άσκηση 3 η : Μελέτη της επίδρασης φυτοορμονών Άσκηση 4 η : Φωτοσυνθετικές χρωστικές: απομόνωση και ποσοτικός προσδιορισμός Άσκηση 5 η : Φωτοσύνθεση: ροή ηλεκτρονίων και αντίδραση Hill Άσκηση 6 η : Μελέτη της υδρόλυσης του αμύλου από τα υδρολυτικά του ένζυμα in vitro Άσκηση 7 η : Μελέτη ανάπτυξης συμβίωσης με αζωτοδεσμευτικά βακτηρία Σημείωση: Οι ασκήσεις είναι επιλεγμένες από τα φυλλάδια των Εργαστηριακών Ασκήσεων Φυσιολογίας Φυτών (ακαδημαϊκά έτη 2007, 2008 και 2009), του Τμήματος Γεωπονίας Φυτικής Παραγωγής και Αγροτικού Περιβάλλοντος του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. 2

AΣΚΗΣΗ 1 η : Φύτρωση σπερμάτων και επίδραση της φωτεινής ακτινοβολίας στην ανάπτυξη των αρτίβλαστων Πειραματικό μέρος Σκοπός της άσκησης είναι η μελέτη της φύτρωσης και ανάπτυξης αρτίβλαστων ραπανιού (Raphanus sativus L.) κάτω από διαφορετικά φωτεινά περιβάλλοντα: παρουσία φυσικού φωτισμού απουσία φυσικού φωτισμού κάτω από πράσινο φως Υλικά: σπέρματα ραπανιού, έγχρωμα φίλτρα, διαφανής αυτοκόλλητη ταινία, διαφανή πλαστικά ποτήρια, αλουμινόχαρτο, περλίτης. Διαδικασία 1. Ξεπλένετε πολύ καλά τον περλίτη που θα χρησιμοποιήσετε. Σε 3 πλαστικά ποτήρια τοποθετείτε περλίτη έως το 1/4 του ύψους τους, ρίχνετε νερό και τοποθετείτε με προσοχή 6 σπέρματα ραπανιού σε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους. Τοποθετείτε σε κάθε ποτήρι ένα δεύτερο ανάστροφα και σφραγίζετε με την αυτοκόλλητη ταινία. Καλύπτετε κάθε ποτήρι ως εξής: Αριθμός ποτηριού Μεταχείριση 1 χωρίς φίλτρο 2 πράσινο φίλτρο 3 αλουμινόχαρτο 2. Τα ποτήρια 1 και 2 τοποθετούνται κάτω από φυσικό φωτισμό. Το ποτήρι 3 τοποθετείται σε σκοτεινό ντουλάπι για 7 περίπου ημέρες. 3

3. Περίπου μια εβδομάδα μετά την έναρξη του πειράματος παίρνετε όλα τα ποτήρια και αφαιρείτε τα φίλτρα και το πρόσθετο ποτήρι. Ελευθερώνετε με μεγάλη προσοχή τα αρτίβλαστα από τον περλίτη και ξεπλένετε. 4. Σχεδιάστε ένα τυπικό φυτό για κάθε περίπτωση. 5. Μετρήστε για όλα τα φυτά το μήκος του βλαστού, της ρίζας, και τον αριθμό των φύλλων. 4

ΆΣΚΗΣΗ 2 η : Μελέτη διαπνευστικού ρεύματος στα φυτά Είναι γνωστό ότι τα φυτά χάνουν μεγάλο μέρος του νερού που προσλαμβάνουν με το ριζικό τους σύστημα μέσω της διαπνοής των φύλλων. Κατά τη διεργασία αυτή το νερό εξατμίζεται από τα φύλλα (κυρίως μέσω των στοματίων, αλλά και από την επιφάνεια των φύλλων) με τη μορφή υδρατμών. Συνεπώς, η διαπνοή των φύλλων αποτελεί την κινητήριο δύναμη, βάσει της οποίας δημιουργείται ανοδικό ρεύμα κίνησης των φυτικών χυμών διαμέσω του βλαστού. Πιο συγκεκριμένα η κίνηση του νερού στο βλαστό πραγματοποιείται μέσω των ηθμαγγειωδών δεσμίδων. Τα αγγεία και οι τραχείδες (στα κωνοφόρα) αποτελούν το ξύλωμα και είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά του νερού και ανόργανων θρεπτικών συστατικών από τη ρίζα προς το υπέργειο τμήμα του φυτού. Η κίνηση αυτή είναι αποκλειστικά ανοδική. Οι ηθμοσωλήνες (φλοίωμα) είναι υπεύθυνοι για τη διακίνηση των προϊόντων της φωτοσύνθεσης (σάκχαρα) καθώς και άλλων προϊόντων μεταβολισμού (αμινοξέα κ.α) κυρίως μέσω καθοδικής κίνησης, δηλαδή από τα φύλλα προς τη ρίζα. Κατά τις περιόδους όμως νέας αύξησης του φυτού ή σε περιόδους έντονης καταπόνησης του φυτού, είναι δυνατή επίσης η ανοδική μετακίνηση διαμέσω του φλοιώματος, αποθηκευμένων προϊόντων από ιστούς αποθήκευσης (ρίζα, βλαστός) προς τα νεαρά αναπτυσσόμενα φύλλα. Το γεγονός ότι το νερό μπορεί να μετακινηθεί αντίθετα προς τη βαρύτητα από τις ρίζες διαμέσω του ξυλώματος προς τα φύλλα του δένδρου, συχνά ύψους πολλών μέτρων, είναι αξιοθαύμαστο. Ο μηχανισμός στον οποίο βασίζεται αυτή η μετακίνηση του νερού διατυπώθηκε πρώτη φορά το 1880 (θεωρία συνοχής επιφανειακής τάσης) και είναι ευρύτερα αποδεκτός. Συνοψίζεται στα εξής στάδια: 1. Η διαπνοή των φύλλων δημιουργεί μια διαφορά δυναμικού μεταξύ των κυττάρων του μεσόφυλλου και των νεύρων του φύλλου και τελικά προκαλεί την έξοδο του νερού από το ξύλωμα προς το μεσόφυλλο. 2. Το δυναμικό του νερού στο ξυλωμα των νεύρων του φύλλου μειώνεται και δημιουργείται δύναμη άντλησης (τάση) του νερού διαμέσω του ξυλώματος. 3. Η τάση στο ξύλωμα των φύλλων μεταδίδεται μέσω του ξυλώματος του βλαστού μέχρι τις ρίζες. Με τον τρόπο αυτό διατηρείται ένα συνεχές διαπνευστικό ρεύμα. 5

Εφαρμόζοντας μια σχετικά απλή τεχνική χρώσης (εμβάπτιση του βλαστού σε διάλυμα κυανού του μεθυλενίου (methylene blue) μπορούμε να παρατηρήσουμε την άνοδο των φυτικών χυμών. Πειραματικό μέρος Υλικά: Βλαστοί του φυτού Ligustrum sp. μήκους περίπου 20-30 εκατοστών Τέσσερα ποτήρια ζέσεως Αραιό διάλυμα 0,1% της χρωστικής Κυανούv του Μεθυλενίου Ξυραφάκι Νερό Διαδικασία 1. Διατηρούμε τους βλαστούς σε νερό. Αφαιρούμε τα φύλλα από τον ένα βλαστό ενώ ο άλλος παραμένει άθικτος. 2. Ενώ οι βλαστοί καλύπτονται από το νερό κόβουμε με το ξυραφάκι (ή με κλαδευτήρι) το τελευταίο εκατοστό του βλαστού. 3. Αμέσως τοποθετούμε τους δυο βλαστούς σε ποτήρι ζέσεως που περιέχει την παραπάνω χρωστική σε ύψος περίπου 2 εκατοστών. 4. Τοποθετούμε τα ποτήρια ζέσεως με τους βλαστούς σε επαρκές φως και τους αφήνουμε για περίπου 45 λεπτά. 5. Μετά το πέρας του χρόνου αυτού αφαιρούμε προσεκτικά με το ξυραφάκι τον φλοιό του βλαστού σε διαφορετικά ύψη και παρατηρούμε μέχρι που έχει φτάσει η χρωστική. Οι βλαστοί φωτογραφίζονται. Σχολιάστε τη διαφορετική άνοδο της χρωστικής στους δυο βλαστούς. Πως το εξηγείται; 6

ΆΣΚΗΣΗ 3 η : Μελέτη της επίδρασης φυτοορμονών GA 3 & C 2 H 4 Η μορφογένεση των φυτων ελέγχεται σε μεγάλο βαθμό από ενδογενεις χημικές ουσίες που ονομάζονται φυτοορμόνες. Οι ενώσεις αυτές συντίθενται σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις σε κάποιο τμήμα-όργανο του φυτού και συνήθως μεταφέρονται σε κάποιο άλλο σημείο (όργανοστόχος), όπου και προκαλούν συγκεκριμένες φυσιολογικές αντιδράσεις. Μέχρι πρόσφατα η φυτική ανάπτυξη θεωρούνταν ότι ρυθμίζεται μόνο από πέντε τύπους ορμονών: τις αυξίνες, κυτοκινίνες, γιββερελλίνες, αψιζινικό οξυ και αιθυλένιο. Υπάρχουν ωστόσο δεδομένα για μια οικογένεια στεροειδών φυτικών ορμονών που μετέχουν σε φωτοεπαγόμενες μορφολογικές μεταβολές καθώς και πολλά άλλα μόρια σηματοδότες όπως το γιασμονικό και το σαλικυλικό οξύ, η συστεμίνη κ.α. Οι αυξίνες και οι γιββερελλίνες θεωρούνται ως οι ρυθμιστές της κυτταρικής επιμήκυνσης, οι κυτοκινίνες της κυτταρικής διαίρεσης, το αψιζινικο οξύ έχει γενικότερες ανασταλτικές δράσεις στην ανάπτυξη και το αιθυλένιο συμμετέχει κυρίως στην ωρίμανση κάποιων φυτικών οργάνων. Το γιββερελλικό οξύ (GA 3 ) είναι η πιο ευρέως διαδεδομένη ενδογενής γιββερελλίνη. Στην άσκηση θα μελετηθεί η επίδραση της στην επιμήκυνση των μεσογονατίων διαστημάτων του μπιζελιού. Θα μελετηθεί επίσης η επίδραση του αιθυλενίου ( το οποίο θα εκλύεται από ώριμους καρπούς μήλου) σε αρτίβλαστα φασολιού. Πειραματικό μέρος Υλικά: Σπέρματα μπιζελιού και φασολιού Χώμα Περλίτης Γλάστρες διαμέτρου 12-15 εκατοστών Διάλυμα γιββερελίνης GA 3 100mg/l συνολικού όγκου 50ml (5 mg GA 3 σε 3 σταγόνες αιθανόλης, προστίθενται 2 σταγόνες Tween-20 και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 50ml). Διάλυμα μάρτυρα (όπως το διάλυμα γιββερελίνης χωρις GA 3 ) Δυο ώριμα μήλα Διαφανείς πλαστικές σακούλες Αυτόματη πιπέτα 7

Διαδικασία (α) Σπέρνουμε από 3-4 σπόρους μπιζελιού σε 4 γλάστρες. Μετά από 2 εβδομάδες γίνεται αραίωμα των φυτών ώστε να μείνουν 2 φυτά ανά γλάστρα τα οποία υποστυλώνονται. Μετράμε το ύψος των φυτών και τον αριθμό των μεσογονατίων διαστημάτων του κάθε φυτού. Κατόπιν εφαρμόζουμε στο ακραίο μερίστωμα των φυτών σε 2 γλάστρες από μια σταγόνα διαλύματος γιββερελίνης και στα φυτά των άλλων 2 γλαστρών από μια σταγόνα διαλύματος μάρτυρα. Η εφαρμογή γίνεται με αυτόματη πιπέτα. Τα φυτά αναπτύσσονται σε συνθήκες δωματίου για 2-3 εβδομάδες οπότε και επαναλαμβάνονται οι ίδιες μετρήσεις για κάθε φυτό. Υπολογίζονται, το μέσο μήκος των μεσογονατίων διαστημάτων για τις 2 ημέρες μετρήσεων, το ποσοστό (%) αύξησης του ύψους και ο ρυθμός απόλυτης αύξησης του ύψους για το χρονικό διάστημα από την εφαρμογή των διαλυμάτων έως την ημέρα της 2 ης μέτρησης. (β) Σπέρνουμε από 3-4 σπόρους φασολιού σε 4 γλάστρες. Μετά από 2 εβδομάδες γίνεται αραίωμα των φυτών ώστε να μείνουν 2 φυτά ανά γλάστρα τα οποία υποστυλώνονται. Σκεπάζουμε τα φυτά με τις σακούλες και σε δυο από τις γλάστρες βάζουμε μαζί και ένα ώριμο μήλο. Μετά από μία εβδομάδα παρατηρείται η αύξηση των φυτών μακροσκοπικά (τριπλή επίδραση αιθυλενίου) και καταγράφεται η επίδραση του αιθυλενίου στα φυτά σε σχέση με το μάρτυρα (φυτά χωρίς μήλο). 8

AΣΚΗΣΗ 4 η : Φωτοσυνθετικές χρωστικές: απομόνωση και ποσοτικός προσδιορισμός Ποσοτικός προσδιορισμός φωτοσυνθετικών χρωστικών Η απορρόφηση (Α) ή οπτική πυκνότητα (O.D., optical density) μιας ουσίας σε διάλυμα μετράται με ειδικά όργανα που λέγονται φασματοφωτόμετρα και δίδεται από τον νόμο των Lambert-Beer: I A λ = log 0 I = c b ελ όπου A λ, η απορρόφηση του διαλύματος της ουσίας σε μήκος κύματος λ I 0, η ένταση του φωτός που προσπίπτει στο διάλυμα της ουσίας I, η ένταση του φωτός που διαπερνά το διάλυμα της ουσίας c, η συγκέντρωση της ουσίας στο διάλυμα b, η απόσταση που διανύει το φως μέσα στο διάλυμα της ουσίας ε λ, ο συντελεστής απορρόφησης σε μήκος κύματος λ (εξαρτάται από την ουσία και το είδος του διαλύτη). Μέσω της παραπάνω εξίσωσης μπορούμε να υπολογίσουμε την συγκέντρωση μιας ουσίας σ' ένα διάλυμα, αφού οι υπόλοιποι παράγοντες είναι εύκολα μετρήσιμοι. Πρακτικώς, το Α είναι η μέτρηση, την οποία παίρνουμε στην οθόνη του φασματοφωτόμετρου, ο συντελεστής ε λ βρίσκεται από σχετικούς πίνακες και η απόσταση b προκύπτει από τις διαστάσεις της κυψελίδας του οργάνου. Το θέμα είναι περισσότερο πολύπλοκο εάν έχουμε μίγμα ουσιών, π.χ. το συνολικό εκχύλισμα των φωτοσυνθετικών χρωστικών, των οποίων τα φάσματα απορρόφησης αλληλοεπικαλύπτονται. Σε αυτή την περίπτωση η απορρόφηση σ ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος θ' αποτελεί το άθροισμα των απορροφήσεων των επί μέρους ουσιών και η επίλυση του τύπου των Lambert-Beer θα οδηγεί σε μία εξίσωση με περισσότερους του ενός αγνώστους. Έτσι, απαιτείται μέτρηση της O.D. σε περισσότερα μήκη κύματος, ώστε να δημιουργηθεί ένα σύστημα με τόσες εξισώσεις, όσες οι προς μέτρηση ουσίες του μίγματος. Τα μήκη κύματος που επιλέγουμε είναι αυτά, στα οποία η κάθε ουσία παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης. 9

Με βάση τέτοιους υπολογισμούς έχουν προκύψει οι εξισώσεις που ακολουθούν και οι οποίες θα χρησιμοποιηθούν στο πειραματικό μέρος για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της χλωροφύλλης a, της χλωροφύλλης b και των καροτενοειδών: c a = 12.21A 663-2.81A 646 c b = 20.13A 646-5.03A 663 c x+c = 1000A 470-3.27c 229 a -104c b όπου A λ, η απορρόφηση σε μήκος κύματος λ c a, η συγκέντρωση της χλωροφύλλης a, μg/ml διαλύματος c b, η συγκέντρωση της χλωροφύλλης b, μg/ml διαλύματος c x+c, η συγκέντρωση των συνολικών καροτενοειδών (ξανθοφύλλες + καροτένια), μg/ml διαλύματος. Οι παραπάνω εξισώσεις αφορούν διαλύματα 80% v/v ακετόνης. Είναι προφανές, ότι αναλόγως του διαλύτη θα μεταβάλλονται και οι εξισώσεις, αφού από την φύση του διαλύτη εξαρτάται ο συντελεστής απορρόφησης και η θέση των μεγίστων απορρόφησης. Πειραματικό μέρος Υλικά: Ηλεκτρονικός ζυγός Μικρή ποσότητα (5g x ) χλωρών φύλλων είδους που λειοτριβείται εύκολα (π.χ. σπανάκι, μαρούλι) Απεσταγμένο νερό Τρυβλία Νυστέρι Γουδιά Διάλυμα ακετόνης 80% v/v Γυάλινοι ογκομετρικοί σωλήνες των 100 ml Φυγόκεντρος CaCO 3 Φασματοφωτόμετρο Κυβέτες χαλαζία Όργανο μέτρησης ολικής χλωροφύλλης SPAD 10

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των φωτοσυνθετικών χρωστικών μπορεί κανείς να επιλέξει οποιονδήποτε φωτοσυνθετικό ιστό (φύλλα ανωτέρων φυτών, πράσινα φύκη, βρύα), στην πράξη όμως χρησιμοποιούνται μαλακά φύλλα ανωτέρων φυτών, τα οποία λειοτριβούνται εύκολα (π.χ. σπανάκι). Η χημική δομή των ουσιών που θέλουμε να εκχυλίσουμε, μας καθορίζει και το είδος του διαλύτη που θα χρησιμοποιήσουμε. Επειδή οι φωτοσυνθετικές χρωστικές είναι λιπιδικής φύσεως, το μέσον εκχύλισης πρέπει να είναι ένας οργανικός διαλύτης (π.χ. βενζόλιο, αιθέρας, μεθανόλη, αιθανόλη, ακετόνη). Επιλέγουμε την ακετόνη (διάλυμα 80% v/v) επειδή αναμιγνύεται καλά με το νερό των κυττάρων χωρίς να δημιουργεί γαλάκτωμα (σε αντίθεση με τον αιθέρα ή το βενζόλιο) και δεν είναι ιδιαίτερα επιβλαβής, όπως η μεθανόλη. Διαδικασία Επίδειξη λειτουργίας SPAD Μέτρηση της περιεχόμενης χλωροφύλλης των φύλλων με το SPAD. Καταγραφή των τιμών. Φύλλα βάρους 5g κόβονται σε μικρά κομματάκια και τοποθετούνται σε γουδί πορσελάνης μαζί με μικρή ποσότητα (0.5g) καθαρής άμμου και ανθρακικού ασβεστίου * (CaCO 3, 0.1g). Τα φύλλα εκχειλίζονται με 50 ml ακετόνης 80%, τα οποία προστίθενται σταδιακά (ανά 5 ml), ώστε να διευκολύνεται η ομογενοποίηση και να περιορίζονται οι απώλειες. Το εκχύλισμα μεταγγίζεται σε σωλήνα φυγοκέντρου. Το εκχύλισμα φυγοκεντρείται για 10 min στα 2500 g (4000 στροφές ανά λεπτό). Το διαυγές πράσινο υπερκείμενο χρησιμοποιείται ως δείγμα για την φασματοφωτομέτρηση, ενώ το ίζημα απορρίπτεται. Το υπερκείμενο μεταγγίζεται σε ογκομετρικό σωλήνα και ο όγκος του καταγράφεται. Το δείγμα φωτομετρείται στα 470, 646, 663 και 720 nm. Η απορρόφηση στα 720 nm οφείλεται σε πιθανό σκεδασμό και όχι στις φωτοσυνθετικές χρωστικές, οπότε η τιμή αυτή * Η προσθήκη CaCO 3 αποτρέπει την οξίνιση του διαλύματος από τυχόν οξέα που περιέχουν τα φύλλα. Οξίνιση του διαλύματος θα είχε σαν αποτέλεσμα την απομάκρυνση του Mg από τα μόρια της χλωροφύλλης και τη δημιουργία φαιοφυτίνης, η οποία παρουσιάζει διαφορετικό φάσμα απορρόφησης. 11

αφαιρείται από τις υπόλοιπες μετρήσεις (*) Λαμβάνεται το συνολικό φάσμα απορρόφησης του δείγματος στην ορατή περιοχή (400-700 nm) με φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης. Υπενθυμίζεται ότι το δείγμα είναι μίγμα χλωροφύλλης a, χλωροφύλλης b και καροτενοειδών και επομένως το συνολικό φάσμα απορρόφησης προέρχεται από τη συνεισφορά της απορρόφησης κάθε μίας χρωστικής στο εκάστοτε μήκος κύματος). Με βάση τις εξισώσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω και τις τιμές απορρόφησης στα συγκεκριμένα μήκη κύματος υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις της χλωροφύλλης a, της χλωροφύλλης b και των συνολικών καροτενοειδών. Υπενθυμίζεται ότι οι εξισώσεις δίνουν τα ποσά της χρωστικής σε μg/ml διαλύματος. Για να εκφραστούν τα ποσά κάθε χρωστικής ανά g νωπού βάρους, θα πρέπει να γίνουν οι απαραίτητες αναγωγές με βάση το βάρος των φύλλων που χρησιμοποιήθηκαν, τον όγκο του εκχυλίσματος καθώς και τυχόν αραιώσεις που έχουν γίνει. Υπολογίστε την συγκέντρωση της χλωροφύλλης a, της χλωροφύλλης b και των συνολικών καροτενοειδών ανά g νωπού βάρους φύλλου. 12

AΣΚΗΣΗ 5 η : Φωτοσύνθεση: ροή ηλεκτρονίων και αντίδραση Hill Η φωτοσύνθεση είναι η διεργασία με την οποία τα φυτά καθιστούν την ηλιακή ενέργεια διαθέσιμη για όλους τους υπόλοιπους ζωντανούς οργανισμούς. Το πρωταρχικό βήμα της διεργασίας, όπως είδαμε στην προηγούμενη άσκηση, είναι η απορρόφηση του φωτός από τις φωτοσυνθετικές χρωστικές των φυτών, τις χλωροφύλλες και τα καροτενοειδή. Τα ειδικά μόρια χλωροφύλλης a που βρίσκονται στα κέντρα αντίδρασης των φωτοσυστημάτων Ι και ΙΙ μετατρέπουν, στη συνέχεια, την φωτεινή ενέργεια σε ηλεκτρική (διέγερση ηλεκτρονίων) και τελικά σε χημική, υπό τη μορφή χημικών δεσμών στα μόρια του ATP και NADPH. Ένα μέρος της ενέργειας αυτής χρησιμοποιείται ακολούθως, για την ενζυμική μετατροπή του διοξειδίου του άνθρακα σε σάκχαρα. Παρόλο που η φωτοσύνθεση περιορίζεται στους οργανισμούς που περιέχουν χλωροφύλλη (φυτά, φύκη και κυανοβακτήρια) και ορισμένα βακτήρια, τα σάκχαρα που παράγονται μπορούν να χρησιμοποιηθούν από όλους τους ζωντανούς οργανισμούς μέσω της γλυκόλυσης και της αναπνοής για την παροχή χημικής ενέργειας. Η συνολική αντίδραση της φωτοσύνθεσης μπορεί να αποδοθεί από την εξίσωση: CO + φως 2 + H 2O [CH 2O] O2 Chl Κατά τη δεκαετία του 1930, ο R. Hill και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι η έκλυση οξυγόνου μπορεί να διαχωριστεί από την αναγωγή του CO 2 προς υδατάνθρακα. Βρήκαν ότι θραύσματα χλωροπλαστών (θυλακοειδή) που είχαν απομονωθεί από φύλλα, μπορούσαν να προκαλέσουν την έκλυση οξυγόνου παρουσία φωτός, εάν χορηγούσαν μια οξειδωμένη ένωση ικανή να δεχτεί ηλεκτρόνια. Η αντίδραση ονομάσθηκε προς τιμήν του «αντίδραση Hill» και περιγράφεται από την εξίσωση: 2A + 2H + φως 2O 2AH2 O2 Chl όπου Α είναι ο δέκτης ηλεκτρονίων (οξειδωμένη μορφή) και ΑH 2 η ανηγμένη του μορφή. Ως δέκτες e - χρησιμοποιήθηκαν αρχικώς ενώσεις του τρισθενούς σιδήρου (που αναγόμενος γίνεται δισθενής), όπως το σιδηροκυανιούχο κάλιο, και στη συνέχεια διάφορες κινόνες και χρωστικές, που σήμερα είναι γνωστές ως «αντιδραστήρια Hill». Κατά την αντίδραση Hill δεν ήταν δυνατή η αναγωγή του CO 2 σε υδατάνθρακα, διότι, δεν χρησιμοποιήθηκαν άθικτοι χλωροπλάστες, αλλά τμήματα χλωροπλαστικών μεμβρανών. 13

Όπως γίνεται φανερό από τα παραπάνω, τα πειράματα του Hill απέδειξαν ότι η φωτοχημική έκλυση O 2 κατά τη φωτοσύνθεση δεν είναι άρρηκτα δεμένη με την αναγωγή του CO 2 (οι φωτεινές αντιδράσεις μπορούν να διαχωριστούν από τις σκοτεινές αντιδράσεις). Επιπροσθέτως, εισήγαγαν τη χρήση τεχνητών δεκτών e - στην έρευνα της φωτοσύνθεσης και αποδέσμευσαν τους ερευνητές από τη χρήση άθικτων φωτοσυνθετικών οργανισμών, αφού η έρευνα μπορούσε να γίνει και με συστήματα ελεύθερα κυττάρων. Τα ευρήματα αυτά, προώθησαν σημαντικά την έρευνα της φωτοσύνθεσης: τα επί μέρους στάδια των φωτεινών αντιδράσεων αποσαφηνίσθηκαν και τελικά προσδιορίσθηκε ο φυσιολογικός δέκτης ηλεκτρονίων, το NADP. Σήμερα είναι γνωστό ότι οι «φωτεινές» αντιδράσεις της φωτοσύνθεσης αποτελούν μια πορεία, η οποία απαιτεί φως και κατά την οποία ηλεκτρόνια μεταφέρονται από το Η 2 O (δότης e - ) στο NADP (φυσιολογικός δέκτης e - ). Η μεταφορά αυτή, η οποία σχηματικά παριστάνεται με το «σχήμα Ζ» της φωτοσύνθεσης, συμβαίνει από θετικότερο προς αρνητικότερο δυναμικό και επομένως είναι μία μη αυθόρμητη διαδικασία, η οποία απαιτεί ενέργεια. Την ενέργεια αυτή προμηθεύονται τα φυτά με την αποτελεσματική δέσμευση της ηλιακής ακτινοβολίας μέσω της χλωροφύλλης, η οποία οδηγεί σε ανύψωση των ηλεκτρονίων σε ανώτερο ενεργειακό επίπεδο. Για τη μεταφορά των ηλεκτρονίων από το Η 2 O στο NADP είναι απαραίτητες δύο φωτοχημικές αντιδράσεις (φωτοσύστημα ΙΙ και Ι αντίστοιχα). Τα δραστικά κέντρα των δύο φωτοσυστημάτων αποτελούνται από διαφορετικούς τύπους χλωροφύλλης a, οι οποίοι παρουσιάζουν μέγιστο απορρόφησης στα 680 nm (PS ΙΙ) και στα 700 nm (PS Ι). Το κάθε φωτοσύστημα είναι εφοδιασμένο με μια φωτοσυλλεκτική κεραία βοηθητικών χρωστικών. Η ροή των ηλεκτρονίων πραγματοποιείται μέσω μιας αλυσίδας ενώσεων-φορέων, οι οποίες διευθετούνται κατάλληλα στις χλωροπλαστικές μεμβράνες και λειτουργούν ως οξειδοαναγωγικά ζεύγη. Ο κατάλογος των ενώσεων αυτών συνεχώς εμπλουτίζεται με την ανακάλυψη νέων και περιλαμβάνει φαιοφυτίνες, κινόνες, κυτοχρώματα, σιδηροθειούχες και χαλκούχες πρωτεΐνες. Η μεταφορά των ηλεκτρονίων από το Η 2 O στο NADP μέσω των δύο φωτοσυστημάτων (μη κυκλική ροή), έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή της ηλιακής ενέργειας σε χημική υπό μορφή αναγωγικής δύναμης (NADPH) και τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP). Τα προϊόντα αυτά θα καταναλωθούν στη συνέχεια στη «σκοτεινή» φάση κατά την αναγωγή του CO 2. Σε 14

περιπτώσεις που οι απαιτήσεις του κυττάρου σε ATP είναι αυξημένες, τα ηλεκτρόνια μπορούν να ακολουθήσουν κυκλική ροή γύρω από το φωτοσύστημα Ι - αντί της συνήθους μη κυκλικής ροής - με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός επί πλέον μορίου ATP αντί του NADPH. Όπως ήδη αναφέραμε, τα πειράματα του Hill άνοιξαν το δρόμο για τη χρήση ενώσεων, που συμπεριφέρονται είτε ως τεχνητοί δότες ή δέκτες ηλεκτρονίων, είτε ως αναστολείς της ροής των ηλεκτρονίων. Τέτοιες ουσίες χρησιμοποιήθηκαν ευρύτατα σε απομονωμένους χλωροπλάστες για τη διευκρίνηση της πορείας των e - καθώς και των φυσιολογικών ουσιών που εμπλέκονται σ' αυτήν. Η δυνατότητα χρήσεως μιας ουσίας με αυτές τις ιδιότητες καθορίζεται από το οξειδοαναγωγικό δυναμικό της και από το αν μπορεί να συνδεθεί σε συγκεκριμένη θέση της ηλεκτρονιακής αλυσίδας. Η παρούσα άσκηση αποτελεί πειραματική εφαρμογή της «αντίδρασης Hill» και αποσκοπεί στην εξοικείωση με τις φωτεινές αντιδράσεις και την απομόνωση χλωροπλαστών. Η αναγωγική δραστηριότητα των χλωροπλαστών θα δειχθεί ποιοτικά ως αναγωγή ενός τεχνητού δέκτη e -, της διχλωροφαινόλης-ινδοφαινόλης (DCIP). Πειραματικό μέρος Υλικά: Ηλεκτρονικός ζυγός Μικρή ποσότητα χλωρών φύλλων είδους που λειοτριβείται εύκολα (π.χ. σπανάκι) Γουδιά Φαρμακευτική γάζα Πάγος Αλουμινοχαρτο Γυάλινοι δοκιμαστικοί σωλήνες Γυάλινοι ογκομετρικοί σωλήνες Διηθητικό χωνί Φυγόκεντρος Φασματοφωτόμετρο Κυβέτες χαλαζία Διάλυμα Tris-HCl (Tris 50 mm), ph 7.5 διχλωροφαινόλη-ινδοφαινόλη (DCIP) (0.11 mm) διχλωρο-φαινυλ-διμεθυλουρία (DCMU), (3 mm) 15

Διαδικασία Cl H 2 O O 2 Cl N C O N(CH 3 ) 2 P680* P680 H DCMU Q A Η χημική δομή της διχλωροφαινυλ-διμεθυλουρίας (DCMU), και το σημείο στο οποίο αναστέλει την φωτοσυνθετική ροή ηλεκτρονίων. Q B P700* P700 NADPH NADP + Η απομόνωση των χλωροπλαστικών μεμβρανών γίνεται με μια διαδικασία ήπιας λειοτρίβισης σε γουδί πορσελάνης. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε φυτό, κατά προτίμηση με μαλακά φύλλα, ώστε η λειοτρίβιση να είναι εύκολη και ταχεία. Συνήθως χρησιμοποιούνται φύλλα σπανακιού, για τα οποία έχει δειχθεί ότι η μέθοδος έχει καλές αποδόσεις. Η όλη εργασί α απομόνωσης-διατήρησης των χλωροπλαστικών μεμβρανών γίνεται με παγωμένα διαλύματα και γυαλικά. Όπως προαναφέρθηκε στην εισαγωγή, η αναγωγική δραστηριότητα των χλωροπλαστικών μεμβρανών οι οποίες φωτίζονται, θα προσδιορισθεί ποιοτικά ως αναγωγή ενός τεχνητού δέκτη e -, της διχλωροφαινόλης-ινδοφαινόλης (DCIP). Η διχλωροφαινόλη-ινδοφαινόλη είναι μια χρωστική, η οποία στην οξειδωμένη της μορφή απορροφά στο ορατό με μέγιστο στην ερυθρά περιοχή (605 nm), ενώ στην ανηγμένη της μορφή δεν απορροφά ορατό φως. Η οξειδωμένη μορφή του DCIP λειτουργεί ως δέκτης ηλεκτρονίων από το φωτοσύστημα ΙΙ, προσλαμβά-νοντας e - και Η + από την πλαστοκινόνη, οπότε ανάγεται. Πρακτικώς, η αναγωγή του DCIP μετράται σε φασματοφωτόμετρο ως πτώση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 605 nm. Θεωρητικά, θα μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε και το φυσιολογικό δέκτη e -, το NADP. Στην πράξη όμως προτιμώνται έγχρωμες ουσίες, ο ι οποίες αναγόμενε ς αλλάζουν χρώμα. Επί πλέον, η διαδικασία απομόνωσης των χλωροπλαστικών μεμβρανών που θα ακολουθήσουμε, προκαλεί αποχωρισμό διαφόρων φορέων της αλυσίδας ηλεκτρονίων. Μεταξύ των πρώτων ενώσεων που απομακρύνονται είναι η φερρεδοξίνη, με άμεση συνέπεια να μην υπάρχει τρόπος διοχέτευσης των ηλεκτρονίων στο NADP. Στην πειραματική διαδικασία θα χρησιμοποιηθεί και μια δεύτερη ένωση, η διχλωρο-φαινυλ-διμεθυλουρία (DCMU), η οποία δρα αναστολέας της φωτοσυνθετικής ροής e -. ως 16

5 gr φύλλων σπανακιού, από τα οποία αφαιρούνται τα χοντρά νεύρα, κόβονται σε μικρά κομμάτια και ομογενοποιούνται σε γουδί πορσελάνης (χωρίς άμμο), παρουσία 30 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris-HCl (Tris 50 mm), ph 7.5. Το ρυθμιστικό διάλυμα είναι απαραίτητο, για να διατηρείται το ph σταθερό σε τιμές που θεωρούνται φυσιολογικές για τις λειτουργίες του κυττάρου. Το ομογενοποίημα που προκύπτει, διηθείται μέσα από διπλό στρώμα φαρμακευτικής γάζας και το διήθημα τοποθετείται σε πλαστικό φυγοκεντρικό σωλήνα και φυγοκεντρείται 2 φορές κατά το ακόλουθο σχήμα: διήθημα φυγοκέντρηση 90 sec στα 500 g (2150 rpm) ίζημα απορρίπτεται υπερκείμενο φυγοκέντρηση 10 min στα 3000 g (5250rpm) ίζημα υπερκείμενο επαναδιαλύεται σε 4 ml ρυθμιστικού απορρίπτεται Το επαναδιαλυμένο ίζημα φυλάσσεται σε πάγο και σε χαμηλό φωτισμό (φωτισμός δωματίου) και αποτελεί το δείγμα των χλωροπλαστικών μεμβρανών. Σε 6 αριθμημένους γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται τα διαλύματα σύμφωνα με τον Πίνακα που ακολουθεί: ΣΩΛΗΝΑΣ ΔΙΑΛΥΜΑ 1 2 3 4 5 6 Tris HCl 9.5 5.0 4.5 4.5 4.5 4.4 DCIP (0.11 mm) - 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Χλωροπλάστες 0.5-0.5 0.5 0.5 0.5 DCMU (3 mm) - - - - - 0.1 Φως NAI NAI ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ Φωτομέτρηση στα 605 nm Πριν και μετά το φωτισμό Αμέσως Μετά το φωτισμό Το DCMU διαλύεται σε απόλυτη αιθανόλη 17

Για την επιτυχή έκβαση του πειράματος προσοχή πρέπει να δοθεί στα εξής: Οι σωλήνες 1 και 2 φωτομετρούνται πριν και μετά το φωτισμό. Ο σωλήνας 3 αντιστοιχεί στο σημείο εκκίνησης της αντίδρασης και φωτομετράται αμέσως. Το φως στον περιβάλλοντα χώρο πρέπει να είναι λιγότερο από 3-4 μmol m -2 s -1. Εργαστηριακός χώρος με κουρτίνες και σβηστά φώτα καλύπτει αυτή την προϋπόθεση. Ο σωλήνας 4 καλύπτεται εξ αρχής με αλουμινόχαρτο ώστε να μην δέχεται καθόλου φως. Στο σωλήνα 6 οι χλωροπλαστικές μεμβράνες προστίθενται τελευταίες (μετά το DCMU). Ο φωτισμός διαρκεί 2 min και η απόσταση από την πηγή θα πρέπει να είναι ίδια για όλους τους σωλήνες. Για να αποφύγουμε τυχόν υπερθέρμανση των δειγμάτων, τοποθετούμε πλησίον των σωλήνων έναν ανεμιστήρα. Εκφράστε την αναγωγική δραστηριότητα των χλωροπλαστικών μεμβρανών ως ΔO.D. στο φως, στο σκοτάδι και παρουσία αναστολέα της ροής των ηλεκτρονίων. Πόσοι μάρτυρες υπάρχουν στο πείραμα και τι εκφράζει ο καθένας; 18

ΑΣΚΗΣΗ 6 η : Μελέτη της υδρόλυσης του αμύλου από τα υδρολυτικά του ένζυμα in vitro Το άμυλο Το άμυλο είναι αποθησαυριστική ένωση των φυτών και συναντάται σε μεγάλες συγκεντρώσεις σε αποθηκευτικούς ιστούς οργάνων (όπως οι κοτύλες και το ενδοσπέρμιο των σπερμάτων, οι κόνδυλοι και τα ριζώματα), στο ξυλώδες και το φλοιώδες παρέγχυμα καθώς και στην εντεριώνη στο βλαστό. Τα μεγαλομόρια του αμύλου βιοσυντίθενται στα ίδια τα αποθησαυριστικά όργανα (από δομικές μονάδες σακχάρων που συνήθως προέρχονται από τα φύλλα) και συνήθως οργανώνονται σε ειδικής μορφής κυτταρικά οργανίδια τους αμυλόκοκκους. Η ενέργεια και τα δομικά συστατικά του αμύλου είναι διαθέσιμα μόνο μετά από την διάσπαση των μόριων του αμύλου με ειδικά υδρολυτικά ένζυμα, τις αμυλάσες. Στο φυτό τα υδρολυτικά ένζυμα δρουν στα κύτταρα που είναι πλούσια σε άμυλο. Τα συστατικά του αμύλου Το άμυλο αποτελείται από την αμυλόζη και την αμυλοπηκτίνη, δύο συστατικά τα οποία είναι πολυμερή της α-d-γλυκόζης. Η αμυλόζη είναι γραμμικό πολυμερές, oι δομικές μονάδες του οποίου ενώνονται με γλυκοζιδικούς δεσμούς τύπου 1-4 και σχηματίζουν μακρομόριο χωρίς διακλαδώσεις με βαθμό πολυμερισμού 100-2000. Η αμυλοπηκτίνη είναι διακλαδισμένο πολυμερές. Σχηματίζεται από γραμμικά πολυμερή με μικρό βαθμό πολυμερισμού (μέχρι 20), τα οποία αποτελούνται από μονάδες α-d-γλυκόζης ενωμένες με γλυκοζιδικούς δεσμούς τύπου 1-4. Τα μικρά αυτά γραμμικά πολυμερή ενώνονται με γλυκοζιδικούς δεσμούς τύπου 1-6 και έτσι το μόριο της αμυλοπηκτίνης αποτελείται από διακλαδισμένες αλυσίδες. Ο μεγαλύτερος αριθμός γλυκοζιδικών δεσμών είναι του τύπου 1-4 και μόνο ένας περιορισμένος αριθμός είναι του τύπου 1-6, στα σημεία των διακλαδώσεων και μόνο. Το μοριακό βάρος της αμυλοπηκτίνης κυμαίνεται από 50.000-1.000.000 με βαθμό πολυμερισμού 250-10.000. Οι αμυλάσες Τα συστατικά του αμύλου υδρολύονται από ειδικά ένζυμα, τις αμυλάσες. Τα ένζυμα αυτά κατατάσσονται στις υδρολάσες. Οι αμυλάσες διακρίνονται ανάλογα με τον τρόπο δράσης 19

τους στους δεσμούς των συστατικών του αμύλου σε α-αμυλάση, β-αμυλάση και ισοαμυλάση ή R-ένζυμο. Η β-αμυλάση διασπά τους 1-4,α-γλυκοζιδικούς δεσμούς των πολυσακχαριτών της α-dγλυκόζης προοδευτικά από το μη-αναγωγικό άκρο των αλυσίδων, με την απόσπαση διαδοχικών μορίων του δισακχαρίτη μαλτόζη μέχρι την πλήρη αποδόμηση των αλυσίδων. Η αμυλόζη με την δράση της β-αμυλάσης υδρολύεται σε ποσοστό 70% λόγω της παρουσίας αραιών διακλαδώσεων στο μόριό της. Η αμυλοπηκτίνη υδρολύεται μερικά με την προοδευτική απόσπαση μορίων μαλτόζης από τις πλάγιες αλυσίδες μέχρι τις διακλαδώσεις. Στα σημεία διακλάδωσης υπάρχουν γλυκοζιδικοί δεσμοί τύπου 1-6, τους οποιους η β- αμυλάση αδυνατεί να διασπάσει. Κατά συνέπεια, τα προϊόντα που λαμβάνονται απο τη δράση της β-αμυλάσης πάνω στα συστατικά του αμύλου είναι μαλτόζη και δεξτρίνες (Σχήμα 1). β-αμυλάση αμυλόζη μαλτόζη β-αμυλάση αμυλοπηκτίνη μαλτόζη + δεξτρίνες Σχήμα 2.1 Τα προϊόντα που λαμβάνονται απο τη δράση της β-αμυλάσης πάνω στα συστατικά του αμύλου. Η δραστηριότητα της β-αμυλάσης φαίνεται από το ρυθμό της μεταβολής του σκούρου-μπλε χρώματος που δίνει η αμυλόζη με διάλυμα ιωδίου. Το χρώμα εξασθενεί αργά (σε αντίθεση προς την α-αμυλάση) γιατί το ένζυμο αποδομεί προοδευτικά το μόριο της αμυλόζης. Η α-αμυλάση διασπά τους γλυκοζιδικούς δεσμούς πολυμερών της α-d-γλυκόζης σε θέσεις 1-4 όπως και η β-αμυλάση, με τη διαφορά ότι δρα τυχαία. Με τη δράση της α-αμυλάσης η αμυλόζη διασπάται γρήγορα σε μόρια μικρότερου μεγέθους, τις δεξτρίνες. Από την παραπέρα δράση του ενζύμου πάνω στα μόρια αυτά λαμβάνονται ως προϊόντα κυρίως η μαλτόζη και η μαλτοτριόζη και δευτερευόντως η γλυκόζη. Το ένζυμο αυτό δεν δρα πάνω σε δεσμούς 1-6. 20

Κατά συνέπεια η α-αμυλάση με την αμυλοπηκτίνη παράγει οριακές δεξτρίνες και τα προϊόντα αποδόμησης της αμυλόζης. Οι οριακές δεξτρίνες είναι μικρά πολυμερή, τα οποία διαθέτουν τουλάχιστον ένα γλυκοζιδικό δεσμό τύπου 1-6. α-αμυλάση αμυλόζη δεξτρίνες μαλτόζη + μαλτοτριόζη + γλυκόζη α-αμυλάση αμυλοπηκτίνη μαλτόζη + μαλτοτριόζη + γλυκόζη + οριακές δεξτρίνες Σχήμα 2.2 Τα προϊόντα που λαμβάνονται από τη δράση της α-αμυλάσης πάνω στα συστατικά του αμύλου. Απομένει όμως ανέπαφος ο κεντρικός κορμός του μορίου της αμυλοπηκτίνης με διακλαδώσεις 1-6. Η α-αμυλάση προκαλεί γρήγορη μετατροπή του μπλε χρώματος που δίνει το ιώδιο με την αμυλόζη (σε αντίθεση προς την β-αμυλάση), οπότε λαμβάνεται το ερυθρό χρώμα της αντίδρασης των δεξτρινών με το ιώδιο, ενώ στη συνέχεια δεν παρατηρείται αντίδραση. Από τα προηγούμενα προκύπτει ότι κανένα από τα ένζυμα α-αμυλάση και β-αμυλάση δεν μπορεί να προσβάλλει τους δεσμούς 1-6 των διακλαδώσεων του μορίου της αμυλοπηκτίνης. Οι δεσμοί αυτοί διασπώνται επιλεκτικά από ένα άλλο ένζυμο το οποίο καλείται ισοαμυλάση. Με συνδυασμό του ενζύμου αυτού και της α-αμυλάσης ή και της β-αμυλάσης επιτυγχάνεται η πλήρης αποδόμηση και του κεντρικού κορμού του μορίου της αμυλοπηκτίνης, που περιλαμβάνει τις περιοχές με διακλαδώσεις. Χαρακτηριστικό της δράσης της ισοαμυλάσης πάνω στο μόριο της αμυλοπηκτίνης είναι ότι το ερυθρό χρώμα της αμυλοπηκτίνης μετατρέπεται με την δράση αυτού του ενζύμου σε μπλε. Αυτό οφείλεται στο ότι το διακλαδισμένο μόριο της αμυλοπηκτίνης διασπάται σε μικρότερου μεγέθους αλυσίδες χωρίς διακλαδώσεις (αμυλόζη). 21

Σκοπός της άσκησης είναι η ανίχνευση της δράσης των υδρολυτικών ενζύμων του αμύλου με τη βοήθεια χρωματικής αντίδρασης που βασίζεται στη δράση του ιωδίου με τα συστατικά του αμύλου, όσο και με τα προϊόντα της υδρόλυσης του αμύλου από τα σχετικά ένζυμα. Εργαστηριακό μέρος Η παραλαβή ενζυμικού παρασκευάσματος των αμυλασών Τις αμυλάσες τις παραλάβαμε με λειοτρίβιση και ομογενοποίηση σπερμάτων σιταριού που τοποθετήθηκαν για βλάστηση σε κατάλληλο περιβάλλον επί 7-10 ημέρες. Ο πολτός διηθήθηκε και διατηρήθηκε στο ψυγείο. Είναι εκχύλισμα που εκτός από τις αμυλάσες περιέχει και πολλά άλλα κυτταρικά συστατικά. Το άμυλο προέρχεται επίσης από καρπούς αγροστώδους (καλαμπόκι) έχει όμως καθαριστεί προηγουμένως έτσι ώστε να είναι εύκολη η διαπίστωση της αντίδρασης του ιωδίου. Εικόνα 2.1 Βλαστημένο σιτάρι με νεαρά φυτάρια ηλικίας 10 ημερών. Ανίχνευση της δραστηριότητας των αμυλασών Υλικά: Δοκιμαστικοί σωλήνες (σωλήνας α, β, γ, δ) 4 ύαλοι ωρολογίου Διάλυμα αμύλου 1% 22

Απεσταγμένο νερό Ενζυμικό παρασκεύασμα Διάλυμα ιωδίου 3 πιπέτες: α) μία για προσθήκη του διαλύματος αμύλου στους δοκιμαστικούς σωλήνες, β) μία για προσθήκη του απεσταγμένου νερού στους σωλήνες και γ) μια για προσθήκη του ενζυμικού παρασκεύασματος στους σωλήνες. Διαδικασία 1. Στο δοκιμαστικό σωλήνα α προσθέτουμε 1 ml διαλύματος αμύλου (με την πιπέτα του διαλύματος αμύλου) και 1,5 ml απεσταγμένου νερού (με την πιπέτα του απεσταγμένου νερού. Προσοχή να μη μπερδέψουμε τις πιπέτες γιατί θα αποτύχει το πείραμα). Ανακινούμε ελαφρά το σωλήνα για να ομοιογενοποιηθεί το περιεχόμενό του. 2. Μεταγγίζουμε ελάχιστη ποσότητα του περιεχομένου του σωλήνα α σε μία ύαλο ωρολογίου. Προσθέτουμε 1-2 σταγόνες από το διάλυμα ιωδίου στην ύαλο ωρολογίου, ανακινούμε την ύαλο περιστροφικά και προσεκτικά για να μη χυθεί το περιεχόμενο της απέξω, τοποθετούμε την ύαλο πάνω σε λευκό χαρτί και παρατηρούμε το χρώμα που παίρνει το διάλυμα. Αυτή η ύαλος ωρολογίου που αντιστοιχεί στο σωλήνα α διατηρείται για μάρτυρας. Υπόψη ότι ο σωλήνας α δεν περιέχει ένζυμο. 3. Στο δοκιμαστικό σωλήνα δ, προσθέτουμε 1 ml διαλύματος αμύλου (με την πιπέτα του διαλύματος αμύλου) και 1,5 ml ενζυμικού παρασκευάσματος (με την πιπέτα του ενζυμικού παρασκευάσματος) και με αυτή τη σειρά. Προσοχή να μη μπερδέψουμε τις πιπέτες. Σημειώνουμε ΑΜΕΣΩΣ το χρόνο μηδέν και ανακινούμε ελαφρά το σωλήνα για να ομοιογενοποιηθεί το περιεχόμενό του. 4. Μεταγγίζουμε ελάχιστη ποσότητα του περιεχομένου του σωλήνα δ σε μία ύαλο ωρολογίου. Προσθέτουμε 1-2 σταγόνες από το διάλυμα ιωδίου στην ύαλο ωρολογίου και εργαζόμαστε όπως στο βήμα 2. Παρατηρούμε το χρώμα που παίρνει το διάλυμα. 5. Κάθε 0.5 min επαναλαμβάνουμε το βήμα 4. Όταν διαπιστώσουμε αλλαγή του χρωματισμού καταγράφουμε το χρόνο που πέρασε από το χρόνο μηδέν και 23

επαναλαμβάνουμε το βήμα 4 μέχρι να μην παρατηρούμε παραπέρα αλλαγή του χρωματισμού. Ο χρόνος εμφάνισης του σταθερού χρωματισμού καταγράφεται ως πειραματικός χρόνος στον Πίνακα 1. Η ύαλος ωρολογίου που αντιστοιχεί στο σωλήνα δ με το τελικό χρώμα διατηρείται επίσης για μάρτυρας. Υπόψη ότι ο σωλήνας δ περιέχει την περισσότερη ποσότητα ενζύμου. 6. Πάμε τώρα στο δοκιμαστικό σωλήνα β, όπου προσθέτουμε 1 ml διαλύματος αμύλου, 1 ml νερού και 0,5 ml ενζυμικού παρασκευάσματος (με την κατάλληλη πιπέτα σε κάθε περίπτωση και με αυτή τη σειρά). Σημειώνουμε ΑΜΕΣΩΣ το χρόνο μηδέν, ανακινούμε ελαφρά το σωλήνα για να ομοιογενοποιηθεί το περιεχόμενό του και μεταγγίζουμε ελάχιστη ποσότητα του περιεχομένου του σωλήνα β σε μία ύαλο ωρολογίου. Προσθέτουμε 1-2 σταγόνες από το διάλυμα ιωδίου στην ύαλο ωρολογίου και εργαζόμαστε όπως το βήμα 2. Παρατηρούμε το χρώμα που παίρνει το διάλυμα. Εργαζόμαστε όπως στο βήμα 5 και καταγράφουμε τον πειραματικό χρόνο στον Πίνακα 1. 7. Επαναλαμβάνουμε το βήμα 6, προσθέτοντας στον δοκιμαστικό σωλήνα γ 1 ml διαλύματος αμύλου, 0,5 ml νερού και 1 ml ενζυμικού παρασκευάσματος. Καταγράφουμε το χρόνο στον Πίνακα 1. 8. Η κάθε περίπτωση επαναλαμβάνεται τρεις φορές και οι αντίστοιχοι χρόνοι (1 η, 2 η και 3 η επανάληψη) καταγράφονται στον Πίνακα 1. Επεξεργαζόμαστε τα δεδομένα αυτά υπολογίζοντας τον μέσο όρο και την τυπική απόκλιση και κατασκευάζουμε διάγραμμα, όπου απεικονίζεται η καμπύλη υδρόλυσης του αμύλου. Πίνακας 2.1 Ανίχνευση της δραστηριότητας των αμυλασών άμυλο νερό ένζυμο τελικός Χρόνος υδρόλυσης (min) όγκος Σωλήν ml ml ml ml 1 η 2 η 3 η ΜΟ ΤΑ ας Α 1 1,5-2,5 Β 1 1 0,5 2,5 Γ 1 0,5 1 2,5 Δ 1-1,5 2,5 24

Άσκηση 7 η : Μελέτη ανάπτυξης συμβίωσης με αζωτοδεσμευτικά βακτηρία Η διαρκώς εντατικοποιημένη παραγωγή των αγροτικών προϊόντων απαιτεί τη χρήση όλο και μεγαλύτερων ποσοτήτων λιπασμάτων, αυξάνοντας το οικονομικό και περιβαλλοντικό κόστος. Τα συμβιωτικά αζωτοδεσμευτικά φυμάτια των ψυχανθών μειώνουν τις ανάγκες των φυτών σε άζωτο. Συνεπώς, τα οφέλη από την εκτεταμένη χρήση αζωτοδεσμευτικών βακτηριών σε συμβιώσεις με ψυχανθή (κατά κύριο λόγο) μπορεί να έχει άμεσα οφέλη, τόσο οικονομικά (μειωμένη ανάγκη για εφαρμογή αζωτούχων λιπασμάτων), όσο και περιβαλλοντικά (μείωση της επιβάρυνσης του περιβάλλοντος με αζωτούχα λιπάσματα). Η αλληλεπίδραση ριζόβιου ψυχανθούς έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός φυτικού οργάνου, του φυματίου, εντός του οποίου οι συμβιωτικές μορφές των ριζοβίων βρίσκουν το κατάλληλο περιβάλλον για να φέρουν σε πέρας τη βιοχημική μετατροπή του μοριακού αζώτου σε αμμωνία. Η παραπάνω σχέση αποβαίνει αμοιβαία επωφελής και για τους δυο συμβιώτες, αφού το φυτό παρέχει στα ριζόβια ένα περιβάλλον πλούσιο σε φωτοσυνθετικό οργανικό άνθρακα και απαλλαγμένο από τον ανταγωνισμό άλλων μικροοργανισμών, ενώ με τη σειρά τους τα ριζόβια καλύπτουν το μεγαλύτερο μέρος των αναγκών του φυτού σε αφομοιώσιμο άζωτο. Η διαδικασία σχηματισμού του φυματίου ξεκινά κάτω από συνθήκες έλλειψης αφομοιώσιμου εδαφικού αζώτου, όταν βακτηρία του εδάφους, τα οποία ανήκουν στα γένη Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizoium, Bradyrizhobium και Azorizhobium και ονομάζονται ριζόβια, αλληλεπιδρούν με φυτά της ομάδας των ψυχανθών. Η αλληλεπίδραση παρουσιάζει εξειδίκευση μεταξύ του ριζοβιου και του είδους του ψυχανθούς και βασίζεται στη μοριακή αναγνώριση και ανταλλαγή μοριακών μηνυμάτων μεταξύ των δυο συμβιωτών. Στην παρούσα άσκηση γίνεται εξοικείωση των φοιτητών με την αζωτοδεσμευτική συμβίωση ψυχανθών - βακτηρίων και ειδικότερα με τα φυμάτια που αναπτύσσονται λόγω της συμβίωσης αυτής. 25

Πειραματικό μέρος Υλικά: Φυτά Vicia faba (κουκιά) σε γλάστρες με χώμα ή περλίτη. Τρυβλία Ξυραφάκια Λαβίδες Ζυγός ακριβείας Κλίβανος Διαδικασία Γίνεται σπορά κουκιών σε γλάστρες (5 σπόροι ανά γλάστρα) (α) με χώμα ή (β) με περλίτη. Μετά τη φύτρωση αραιώνουμε τα φυτά (2-3) ανά γλάστρα και ποτίζουμε όποτε χρειάζεται (ανα2-3 ημέρες). Μετά από 4-6 εβδομάδες από τη σπορά γίνεται παρατήρηση του ριζικού συστήματος και των ενεργών φυματίων με χρήση στερεοσκόπιου. Ακολουθούν μετρήσεις (ύψος, νωπό βάρος) της αύξησης των φυτών (βλαστοί, ρίζες, φύλλα) και της περιεκτικότητας σε χλωροφύλλη με το SPAD. Κατόπιν τα φυτά παραμένουν σε κλίβανο στους 70 C για 2-3 ημέρες και μετά ζυγίζονται εκ νέου. Ερμηνεύεται η διάφορα στο σχηματισμό φυματίων και στην αύξηση των φυτών 26