3. 2. 6. 4 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε µηχανική κατεργασία. 3. 2. 6. 5 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε πίεση

Άσκηση 3 Πρωτεΐνες 3. 1 Σκοπός της άσκησης 3. 2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος 3. 2. 1 Γενικά περί πρωτεϊνών 3. 2. 2 Ταξινόµηση των πρωτεϊνών 3. 2. 3 Δοµή των πρωτεϊνών 3. 2. 4 Ιδιότητες των πρωτεϊνών 3. 2. 5 Αποδιάταξη και µετουσίωση των πρωτεϊνών 3. 2. 6 Μηχανισµοί δράσης των διαφόρων αποδιατακτικών παραγόντων των πρωτεϊνών 3. 2. 6. 1 Αναγωγικοί παράγοντες 3. 2. 6. 2 Μηχανισµός χηµικής αποδιάταξης πρωτεϊνών σε ισχυρά όξινο περιβάλλον 3. 2. 6. 3 Μηχανισµός χηµικής αποδιάταξης πρωτεϊνών µε χαοτροπικούς παράγοντες 3. 2. 6. 4 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε µηχανική κατεργασία 3. 2. 6. 5 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε πίεση 3. 2. 6. 6 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε θερµική κατεργασία 3. 2. 6. 7 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών σε µεσοαφάσεις διαλυµάτων 3. 2. 6. 8 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε απορρυπαντικά 3. 2. 6. 9 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών σε οργανικούς διαλύτες 3. 2. 7 Καθαρισµός, αποµόνωση και χαρακτηρισµός πρωτεϊνών 1

3. 7 Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών 3. 7. 1 Μέθοδος Bradord 3. 7. 2 Παραγωγή της πρότυπης καµπύλης αναφοράς 3. 7. 3 Εκτέλεση 3. 7. 4 Προσδιορισµός απορρόφησης πρωτείνης και ποσοτικός προσδιορισµός σε µήκος κύµατος 280 nm 3. 7. 5 Παράδειγµα 3. 8 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης παρουσία SDS (αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση) 3. 8. 1 Κατασκευή πηκτώµατος 3. 8. 2 Προετοιµασία των δειγµάτων για ηλεκτροφόρηση 3. 8. 3 Χρώση των ηλεκτροφορηµάτων 3. 2 Εισαγωγή-Θεωρητικό Μέρος 3. 2. 1 Γενικά περί πρωτεϊνών Οι πρωτείνες είναι από τα πλέον βασικά συστατικά των κυττάρων αφού συµµετέχουν σε όλα τα φαινόµενα που χαρακτηρίζουν τη ζωή (αναπαραγωγή, θρέψη, αναπνοή, κίνηση, άµυνα του οργανισµού). Από χηµικής άποψης, οι πρωτείνες είναι οργανικά µακροµόρια που αποτελούνται από αµινοξέα ενωµένα µεταξύ τους µε πεπτιδικό δεσµό. Ο πεπτιδικός δεσµός σχηµατίζεται από την ένωση της καρβοξυλοµάδας ενός αµινοξέος µε την αµινοµάδα του επόµενου αµινοξέος µε σύγχρονη αποβολή ενός µορίου νερού, όπως φαίνεται παρακάτω. 2

Bιοχηµεία 2013-2014 Πεπτιδικός δεσµός Εικόνα 3.1 Σχηµατική παράσταση και γεωµετρικά στοιχεία των πεπτιδικών δεσµών σε πρωτείνες 3

Στάδια δηµιουργίας ενός πεπτιδικού δεσµού 3. 2. 2 Ταξινόµηση των πρωτεϊνών 1. Ανάλογα µε τη µορφή του µορίου τους, οι πρωτείνες διακρίνονται σε ινώδεις (ή σκληροπρωτείνες) και σφαιρικές. Ινώδεις είναι κυρίως πρωτείνες δοµικού χαρακτήρα. Οι ινώδεις πρωτείνες σχηµατίζουν επιµήκεις δέσµες (κολλαγόνο, κερατίνες, κλπ.) και είναι συνήθως σταθερές και αδιάλυτες. Σφαιρικές είναι κυρίως πρωτείνες λειτουργικού χαρακτήρα. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες είναι διπλωµένες κατά τέτοιο τρόπο ώστε να παίρνουν σφαιρικό σχήµα (τα ένζυµα, οι αιµοσφαιρίνες, οι γλοβουλίνες, κλπ.) και είναι κυρίως ευδιάλυτες. Ανάλογα µε το βιολογικό τους ρόλο διακρίνονται σε δοµικές και λειτουργικές. Οι δοµικές πρωτείνες συµβάλλουν στη διαµόρφωση και διατήρηση της µορφολογικής κατάστασης των ιστών καθώς ακόµα των κυττάρων και των υποκυτταρικών στοιχείων (π.χ. κολλαγόνο, κερατίνες, ορισµένες µεµβρανικές πρωτείνες). 4

Οι λειτουργικές πρωτείνες έχουν κοινό χαρακτηριστικό ότι µπορούν να δεσµεύσουν εκλεκτικά ορισµένα µόρια (από απλά ανόργανα ιόντα εώς και άλλες πρωτείνες). Στη κατηγορία αυτή ανήκουν οι καταλυτικές (όλα τα ένζυµα), οι ρυθµιστικές (π.χ. πεπτιδικές ορµόνες) και οι αποθηκευτικές (π.χ. καζείνη) πρωτείνες κλπ. 3. Ανάλογα µε το εαν έχουν προσθετική οµάδα ή όχι διακρίνονται σε σύνθετες και απλές. Οι προσθετικές οµάδες µπορεί να είναι: υδατάνθρακες οπότε οι πρωτείνες χαρακτηρίζονται ως γλυκοπρωτείνες λιπίδια οπότε οι πρωτείνες χαρακτηρίζονται ως λιποπρωτείνες φωσφορική οµάδα οπότε οι πρωτείνες χαρακτηρίζονται ως φωσφοπρωτείνες κλπ. 3. 2. 3 Δοµή των πρωτεϊνών Η τελική διαµόρφωση ενός πρωτεϊνικού µορίου χαρακτηρίζεται από πέντε δοµικά επίπεδα, την πρωτοταγή, δευτεροταγή, τριτοταγή, τεταρτοταγή και πεµπτοταγή δοµή. Με τον όρο πρωτοταγής δοµή εννοούµε την αλληλουχία των αµινοξέων στην κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η αλληλουχία αυτή, που είναι γενετικά προκαθορισµένη και χαρακτηριστική για κάθε πρωτείνη, εξασφαλίζεται µε το µηχανισµό της πρωτεϊνοσύνθεσης. Εικόνα 3.2 Πρωτοταγής δοµή πρωτεϊνών Η δευτεροταγής δοµή αναφέρεται στον τρόπο µε τον οποίο είναι συσπειρωµένη η πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η συγκεκριµένη αναδίπλωση δεν είναι τυχαία, αλλά συνέπεια δυνάµεων µεταξύ των διαφόρων τµηµάτων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Οι δυνάµεις αυτές οφείλονται στην ύπαρξη δεσµών υδρογόνου που αναπτύσσονται κοντά στον πεπτιδικό δεσµό µεταξύ του H της 5

οµάδας -NH και του O της οµάδας C=O. Διακρίνουµε δυο είδη δευτεροταγών δοµών: τη δοµή της α-έλικας και τη δοµή της β-πτυχωτής επιφάνειας. Στην α-έλικα οι δεσµοί υδρογόνου αναπτύσσονται µεταξύ -NH και C=O του πεπτιδικού δεσµού που ανήκουν στην ίδια πολυπεπτιδική αλυσίδα και απέχουν µεταξύ τους κατά 4 περίπου αµινοξέα. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται περιστροφή της αλυσίδας και σχηµατισµός ελικοειδούς διάταξης. Εικόνα 3.3 Δοµή α-έλικας Στη β-πτυχωτή επιφάνεια οι οµάδες -NH και C=O του πεπτιδικού δεσµού µεταξύ των οποίων αναπτύσσεται οι δεσµοί υδρογόνου, βρίσκονται σε διαφορετικές (παράλληλες ή αντιπαράλληλες) πεπτιδικές αλυσίδες. Με τον τρόπο αυτό οι παράλληλες αλυσίδες δεν σχηµατίζουν έλικα, αλλά πτυχώσεις και αναδιπλώνονται σαν ακορντεόν. 6

Bιοχηµεία 2013-2014 Εικόνα 3.4 Δοµή β-πτυχωτής επιφάνειας Η τριτοταγής δοµή αναφέρεται στον τρόπο µε τον οποίο η πολυπεπτιδική αλυσίδα αναδιπλώνεται στον τρισδιάστατο χώρο, ώστε να σχηµατίσει συµπαγή σφαιρικά µόρια ή επιµήκεις δέσµες. Στη διαµόρφωση της τριτοταγούς δοµής παίζουν σηµαντικό ρόλο και οι πλευρικές οµάδες R των αµινοξέων. Η σταθεροποίηση της δοµής αυτής γίνεται µε δεσµούς υδρογόνου, δισουλφιδικούς, ιονικούς δεσµούς και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. 7

Εικόνα 3.5 Τριτοταγής δοµής πρωτεϊνών Η τεταρτοταγής δοµή αναφέρεται σε πρωτείνες, που αποτελούνται από διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες (υποµονάδες) και αφορά τον τρόπο µε τον οποίο ενώνονται οι υποµονάδες για να συγκροτήσουν το πρωτεϊνικό µόριο. Εικόνα 3.6 Τεταρτοταγής δοµής πρωτεϊνών. Το τετραµερές της αιµογλοβίνης. 8

Η πεµπτοταγής δοµή αναφέρεται στη χωροταξική διευθέτηση µεταξύ πρωτεϊνών, που έχουν διαφορετικές επί µέρους λειτουργικότητες (πολυενζυµικά συστήµατα). Οι δυνάµεις που συµµετέχουν σχηµατισµό των πρωτεϊνικών δοµών είναι: Δεσµοί υδρογόνου: σχηµατίζονται µεταξύ ατόµων Ο ή Ν µε ένα Η πάντοτε στο ενδιάµεσο. Στο παρακάτω σχήµα φαίνονται οι δεσµοί-η µεταξύ των πλάγιων αλυσίδων αµινοξέων σε πολυπεπτιδική αλυσίδα. Εικόνα 3.7 Δεσµοί υδρογόνου που σχηµατίζονται µεταξύ των πλαγίων αλυσίδων των αµινοξέων σε πρωτείνες Υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις: σχηµατίζονται µεταξύ αρωµατικών αµινοξέων ή αλειφατικών πλάγιων αλυσίδων. Στο παρακάτω σχήµα φαίνονται οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πλάγιων αλυσίδων αµινοξέων σε πολυπεπτιδική αλυσίδα. Εικόνα 3.8 Υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις που σχηµατίζονται µεταξύ των πλαγίων αλυσίδων των αµινοξέων σε πρωτείνες Ιοντικές αλληλεπιδράσεις: σχηµατίζονται µεταξύ των πλαγίων αλυσίδων φορτισµένων αµινοξέων. Είναι αλληλεπιδράσεις Coulomb. Στο παρακάτω σχήµα φαίνονται οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πλάγιων αλυσίδων αµινοξέων σε πολυπεπτιδική αλυσίδα. Οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις είναι είτε ελκτικές είτε απωστικές δυνάµεις. 9

Εικόνα 3.9 Ιοντικές αλληλεπιδράσεις που σχηµατίζονται µεταξύ των πλαγίων αλυσίδων των αµινοξέων σε πρωτείνες Οι Van der Waals δυνάµεις είναι διαµοριακές δυνάµεις που υφίστανται µεταξύ µορίων που είναι ταυτόσηµα. Δυνάµεις διπόλου-διπόλου είναι ένα είδος από τα τρία είδη van der Waals δυνάµεις που υπάρχουν στα µόρια που φέρουν φορτίο. Οι δυνάµεις διασποράς van der Waal υπάρχουν µόνο µεταξύ µη πολικών µορίων. Το τρίτο είδος των δυνάµεων van der Waal είναι οι δεσµοί υδρογόνου που αναφέραµε παραπάνω. Εικόνα 3.10 Aλληλεπιδράσεις van der Waals που σχηµατίζονται µεταξύ των πλαγίων αλυσίδων των αµινοξέων κυρίως από διαφορετικές πρωτείνες Οι δυνάµεις van der Waals είναι πολύ ασθενείς δυνάµεις, για σύγκριση οι δεσµοί υδρογόνου είναι πολοπλώς ισχυροί δεσµοί συγκρινόµενοι µε τις άλλες δυνάµεις van der Waals. 3. 2. 4 Ιδιότητες των πρωτεϊνών Οι πρωτείνες, όπως και τα αµινοξέα είναι αµφολύτες. Για κάθε µια πρωτείνη υπάρχει µια συγκεκριµένη τιµή του ph στην οποία το καθαρό φορτίο της πρωτείνης είναι µηδέν (ισοηλεκτρικό σηµείο πρωτείνης = pi). Το ισοηλεκτρικό σηµείο είναι χαρακτηριστικό για κάθε πρωτείνη και εξαρτάται από την αµινοξική σύστασή της. 10

Οι περισσότερες πρωτείνες απορροφούν στην περιοχή της υπεριώδους ακτινοβολίας µε µέγιστο απορρόφησης στα 280nm. Η απορρόφηση αυτή οφείλεται κυρίως στα αρωµατικά αµινοξέα τρυπτοφάνη και τυροσίνη. Η διαλυτότητα των πρωτεϊνών σε υδατικά διαλύµατα καθώς και οι παράγοντες που την επηρεάζουν έχουν µεγάλη σηµασία, όσον αφορά το βιολογικό ρόλο τους και τις διαδικασίες καθαρισµού και αποµόνωσής τους. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαλυτότητα µιας πρωτείνης είναι: Οξύτητα του διαλύµατος. Σε ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σηµείο, κάθε πρωτείνη έχει τη µικρότερη διαλυτότητα. Ιονική ισχύς του διαλύµατος. Μικρές συγκεντρώσεις ανόργανων αλάτων (χαµηλή ιονική ισχύς) συνήθως αυξάνουν τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Μεγάλες συγκεντρώσεις (υψηλή ιονική ισχύς) συνήθως την ελαττώνουν. Ουδέτεροι υδατοδιαλυτοί οργανικοί διαλύτες όπως αιθανόλη, ακετόνη, κλπ. συνήθως ελαττώνουν τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Αλκαλοειδείς παράγοντες, όπως πικρικό οξύ, τριχλωροξικό οξύ κλπ. συνήθως ελαττώνουν τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Η δράση των παραγόντων αυτών οφείλεται στην ένωση τους µε τις αµινικές οµάδες του πρωτεϊνικού µορίου και τη δηµιουργία αδιάλυτων πρωτεϊνικών αλάτων (θα µελετηθούν στο πείραµα 4 της παρούσας άσκησης). Θερµοκρασία. Η θερµοκρασία συνήθως αυξάνει τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών µέχρι ενός ορισµένου ορίου (40-50 C). Από εκεί και πέρα συνήθως δρα αποδιατακτικά καταστρέφοντας τις ανώτερες δοµές των πρωτεϊνών µε αποτέλεσµα την ελάττωση της διαλυτότητάς τους και την καταβύθιση τους στο διάλυµα. 3. 2. 5 Αποδιάταξη και µετουσίωση των πρωτεϊνών Με τον όρο αποδιάταξη εννοούµε την αλλαγή της δοµής (δευτεροταγούς και τριτοταγούς δοµής) µιας πρωτείνης κατά την οποία µεταβάλλονται οι φυσικές και χηµικές της ιδιότητες, ελαττώνεται κατά πολύ η διαλυτότητα της και συνήθως χάνονται οι βιολογικές της ιδιότητες. Η αποδιάταξη (unfolding) µιας πρωτείνης γίνεται: Σε ακραίες τιµές του ph. Σε υψηλές θερµοκρασίες (θα µελετηθεί στο πείραµα 2 της παρούσας άσκησης). 11

Με επίδραση διαφόρων χηµικών ουσιών (αποδιατακτικοί παράγοντες) όπως πχ. Η ουρία ή το θειικό δωδεκυλικό νάτριο (SDS) (θα µελετηθεί στο πείραµα 3 της παρούσας άσκησης). Πρέπει να σηµειωθεί ότι η αποδιάταξη (unfolding) µιας πρωτείνης πολλές φορές είναι µια διαδικασία αντιστρεπτή. Υπο τον όρο µετουσίωση (denaturation) εννοούµε την µη αντιστρέψιµη αλλαγή της δοµής των πρωτεϊνών. Συνοπτικά, µια αποδιατεταγµένη πρωτείνη έχει αρκετές πιθανότητες να επανέλθει στην φυσική της µορφή µε την κατάλληλη διεργασία (renaturation) σε αντίθεση µε µια µετουσιωµένη πρωτείνη, που συνήθως είναι δύσκολο εως αδύνατο να επανέλθει στη φυσική της κατάσταση. Η αποδιάταξη και η µετουσίωση διαφόρων πρωτεϊνών µπορύν να µετρηθούν ποσοτικά µε διάφορες βιοχηµικές και βιοφυσικές παραµέτρους. Η παρακάτω εικόνα 3.11 παρουσιάζει απλουστευµένο σχήµα της µεταβολής της στερεοδοµής µια πρωτείνης κατά τη διαδικασία αποδιάταξής της. Εικόνα 3.11 Aπλουστευµένο σχήµα της µεταβολής της στερεοδοµής µια πρωτείνης κατά τη διαδικασία αποδιάταξης της 3. 2. 6 Μηχανισµοί δράσης των διαφόρων αποδιατακτικών παραγόντων των πρωτεϊνών 3. 2. 6. 1 Αναγωγικοί παράγοντες Ο πλέον σηµαντικός παράγοντας που µπορεί να ανάγει γέφυρες S-S- είναι η ένωση β-µερκαπτοαιθανόλη. Η αντίδραση αναγωγής κυστίνης σε κυστείνες φαίνεται παρακάτω. 12

Σχήµα 3.12 Αντίδραση οξείδωσης κυστείνης σε κυστίνη κατά το σχηµατισµό πρωτεϊνών Το εσωτερικό των κυττάρων είναι σε ανηγµένη µορφή και ο κύριος αναγωγικός παράγοντας είναι η γλουταθειόνη. Παρόλα αυτά λίγα είναι γνωστά για την ενδοκυτταρική κατάσταση σε επίπεδο ανηγµένων µορίων. 3. 2. 6. 2 Μηχανισµός χηµικής αποδιάταξης πρωτεϊνών σε ισχυρά όξινο περιβάλλον. Με την παρουσία ισχυρού οξέος ή ακραίου όξινου ph, το διάλυµα που βρίσκεται η πρωτείνη περίεχει περίσσεια πρωτονίων (Η+). Στην πρώτη φάση της αποδιάταξης η πρωτείνη αρχίζει και πρωτονιώνεται, οπότε χάνεται η ισορροπία θετικών και αρνητικών φορτίων στο µόριο, έτσι λοιπόν αρχίζει η αποδιάταξη. Στο µερικώς αποδιατεταγµένο πρωτεϊνικό µόριο η επιφάνεια της πρωτείνης αρχίζει και χάνει µόρια νερού που την κρατάνε στο διάλυµα µε αποτέλεσµα να επέλθει η πλήρης αποδιάταξη. Οι πολυπτιδικές αλυσίδες σε πλήρη αποδιάταξη έχουν κατά κανόνα τυχαία δοµή και σχηµατίζουν συσσωµατώµατα γιαυτό και κατακρηµνίζονται από το διάλυµα. Σχήµα 3.13 Απλουστευµένη σχηµατική παράσταση των σταδίων αποδιάταξης πρωτεϊνών σε ισχυρά όξινο περιβάλλον. 13

3. 2. 6. 3 Μηχανισµός χηµικής αποδιάταξης πρωτεϊνών µε χαοτροπικούς παράγοντες Τα διάφορα αλάτια επηρεάζουν τη σταθερότητα των πρωτεϊνών µε δύο διαφορετικούς τρόπους. Σε χαµηλές συγκεντρώσεις τα ιόντα αλληλεπιδρούν µε πρωτεϊνικά µόρια µέσω µη ειδικών ηλεκτροστατικών δυνάµεων. Η εξουδετέρωση ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνικών φορτίων συνήθως έχει σταθεροποιητική επίδραση στην πρωτεϊνική δοµή. Αντίθετα σε υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων (>1Μ) η επίδραση τους γίνεται πιο ειδική και τα ιόντα επηρεάζουν την δοµική ακεραιότητα των µορίων µε µεγαλύτερη ειδικότητα. Αλάτα, όπως Na, SO και NaF εµπλουτίζουν τη δοµική σταθερότητα µιας πρωτείνης ενώ NaSCN και NaClO την εξασθενούν. Οι πρωτεϊνικές δοµές επηρεάζονται περισσότερο από ανιόντα παρά από κατιόντα. Η σχετική ικανότητα διαφόρων ανιόντων εκφρασµένη σαν ισο-ιονική τάση στο να επηρεάζει τη δοµική σταθερότητα πρωτεϊνων (και DNA) σε γενικές γραµµές ακολουθεί την παρακάτω σειρά: F-< SO4 <Cl-<Br-<I-<ClO -< SCN-<Cl CCOO-. Η ακολουθία αυτή είναι γνωστή σαν Hofmeister σειρά ή χαοτροπική σειρά. Φθόριο, χλώριο και θειϊκά άλατα είναι συνήθως δοµικοί σταθεροποιητές ενώ τα άλατα των άλλων ανιόντων είναι δοµικοί αποσταθεροποιητές. Τα άλατα που σταθεροποιούν πρωτείνες εµπλουτίζουν την ενυδάτωση των πρωτεϊνών και αλληλεπιδρόυν ασθενώς µε τις πρωτείνες. Σε αντίθεση, άλατα που αποσταθεροποιούν πρωτείνες µειώνουν την ενυδάτωση των πρωτεϊνών και αλληλεπιδρούν ιδιαίτερα ισχυρά. Με άλλα λόγια, η αποδιατακτική δράση των χαοτροπικών αλάτων µπορεί να συσχετισθεί µε την αποσταθεροποίηση υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων σε πρωτείνες. Υψηλές συγκεντρώσεις (6-8Μ) συστατικών που τείνουν να σπάνε υδρογονικούς δεσµούς, όπως ουρία και άλατα γουανιδίνης, επίσης αποδιατάσσουν πρωτείνες. Οι ενώσεις αυτές εµφανώς αλλοιώνουν το πλέγµα των δεσµών-η που διατηρεί την πρωτείνη στη µοναδική της δοµή. Παρόλα αυτά υπάρχουν δεδοµένα που προτείνουν ότι η ουρία και η υδροχλωρική γουανιδίνη ίσως επηρεάζουν τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις βοηθώντας στη διαλυτότητα των υδροφοβικών αµινοξέων σε υδατικά διαλύµατα. Σε συγκεντρώσεις ουδετέρων αλάτων πάνω από 0.1 Μ σε πολλές περιπτώσεις η πρωτείνη κατακρηµνίζεται. Το φαινόµενο αυτό συµβαίνει διότι η περίσσεια αλάτων που δεν αλληλεπιδρούν µε την πρωτείνη, ανταγωνίζονται την πρωτείνη στην αλληλεπίδραση µε το διάλυµα. Μείωση της ενυδάτωσης και 14

εξουδετέρωση των repulsive δυνάµεων επιτρέπει στην πρωτείνη να δηµιουργεί συσσωµατώµατα και να καθιζάνει αποµακρυνόµενη από το διάλυµα. Το φαινόµενο αυτό ονοµάζεται «salting out». Οι διαδικασίες «salting out» από ανόργανα άλατα είναι ιδιαίτερα διαδεδοµένες και εφαρµόζονται σε διαδικασίες αποµόνωσης πρωτεϊνων τόσο το εργαστήριο όσο και σε βιοµηχανική κλίµακα. «Salting out» µε τη χρήση θειϊκού αµµωνίου είναι µια κλασσική µέθοδος διαχωρισµού πρωτεϊνών. 3. 2. 6. 4. Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε µηχανική κατεργασία Ισχυρές µηχανικές δυνάµεις που παράγονται µε τη ισχυρή ταλάντωση, το χτύπηµα κλπ µπορούν να προκαλέσουν αποδιάταξη σε πρωτεϊνικά διαλύµατα. Αρκετές πρωτεϊνες αποδιατάσσονται και κατακρηµνίζονται όταν αναδευθούν πολύ ισχυρά επειδή κατά τη διάρκεια της ισχυρής ανάδευσης µεγάλες ποσότητες φυσαλλίδων αέρος εγκλωβίζονται στο πρωτεϊνικό διάλυµα και προσροφούν τα πρωτεϊνικά µόρια στη µεσόφαση µεταξύ αέρα και διαλύµατος. Η δυνάµεις που επενεργούν πάνω στα πρωτεϊνικά µόρια στις µεσοφάσεις αυτές είναι πολύ µεγάλες έχουν σαν αποτέλεσµα την πρόκληση αλλαγών στη στερεοδοµή των πρωτεϊνών και την µερική ή ολική αποδιάταξη τους. Ο βαθµός αποδιάταξης εξαρτάται από τη ελαστικότητα των πρωτεϊνών και ως εκ τούτου πρωτείνες µε µεγάλη ελαστικότητα αποδιατάσσονται ευκολότερα από συµπαγείς και ανελλαστικές πρωτείνες. Στη διαδικασία της µεσοφασικής αποδιάταξης πρωτείνών, τα µη πολικά αµινοξικά κατάλοιπα προσανατολίζονται στη φάση του αέρα και τα πολικά κατάλοιπα στην υδάτινη φάση. Δηµιουργούνται λοιπόν µια σειρά µη επιτρεπτών, για τη στερεοδοµή, δυνάµεων µε αποτέλεσµα τη αποδιάταξη ή και τη µετουσίωση των πρωτεϊνικών µορίων. Η διαδικασία αυτή επιταχύνεται ιδιαίτερα εάν συνδιαστεί µε θερµική κατεργασία ή υπερήχους. Είναι λοιπόν σηµαντικό να διερευνηθούν και αυτοί οι παράµετροι όταν κάποιος µελετά ένα πρωτεϊνικό µόριο. 3. 2. 6. 5 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε πίεση Μια από τις θερµοδυναµικές παραµέτρους που επηρεάζουν τη στερεοδοµή των πρωτεϊνών είναι η υδροσταική πίεση. Σε αντίθεση µε τη θερµοκρασία που επάγει αποδιάταξη σε θερµοκρασίες συνήθως 40-80 ο C σε πίεση 1 ατµόσφαιρας, η πίεση µπορεί να επάγει αποδιάταξη ακόµη και σε θερµοκρασία 25 ο C, εάν είναι αρκετά µεγάλη. Οι περισσότερες πρωτείνες αποδιατάσσονται µέσω πίεσης σε επίπεδα πίεσης 1-12 kbar. Επαγώµενη µέσω πίεσης αποδιάταξη πρωτεϊνών συµβαίνει επειδή οι πρωτείνες είναι ελαστικές και συµπιέσιµες. Παρά το γεγονός ότι τα αµινοξέα είναι 15

καλά πακεταρισµένα ιδιαίτερα στο εσωτερικό των σφαιρικών πρωτεϊνών, κάποιος κενός χώρος πάντα υπάρχει και είναι αυτός που οδηγεί στην συµπιεσιµότητα. Ο µέσος ειδικός όγκος µιας σφαιρικής πρωτεϊνης σε ενυδατοµένη µορφή είναι περίπου 0.74 ml/mg. Οσο πιο µεγάλος είναι ο βαθµός ενυδάτωσης µια πρωτείνης τόσο µεγαλύτερη είναι η συµµετοχή του κενού χώρου στον ειδικό όγκος της και τόσο πιο ασταθής είναι η πρωτείνης όταν δέχεται υδροστατική πίεση. Οι ινώδεις πρωτείνες συνήθως είναι πολύ καλά πακεταρισµένες µε αποτέλεσµα να είναι πιο σταθερές σε υδροστατικές πιέσεις σε σχέση µε τις σφαιρικές. Η αποδιάταξη που προκαλείται από πίεση είναι συνήθως αναστρέψιµη. Τα περισσότερα ένζυµα, σε αραιές συγκεντρώσεις, επανακτούν την ενεργότητα τους όταν η πίεση που υπέστησαν επανέλθει στην ατµοσφαιρική τιµή, αλλά χρειάζονται συνήθως αρκετές ώρες. Η πίεση σε πρωτεϊνικά παρασκευάσµατα (γάλα, τυριά κλπ) είναι ένας από τους παράγοντες που εφαρµόζεται στη παραγωγική διαδικασία για την επίτευξη του επιθυµητού αποτελέσµατος. 3. 2. 6. 6 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε θερµική κατεργασία Αποδιάταξη, όπως αναφέρεται παραπάνω ορίζεται κάθε µετατροπή της δευτεροταγούς ή τριτοταγούς ή τεταρτοταγούς δοµής ενός πρωτεϊνικού µορίου αλλά όχι η αποικοδόµηση των οµοιοπολικών δεσµών στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η αποδιάταξη είναι λοιπόν µια διαδικασία κατά την οποία οι Η-δεσµοί, οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και οι ιονικές αλληλεπιδράσεις καταστρέφονται και το πρωτεϊνικό µόριο ξεδιπλώνεται αντιστρεπτά ή µη. Οταν λοιπόν ένα πρωτεϊνικό διάλυµα θερµαίνεται βαθµιαία πάνω από µια κρίσιµη θερµοκρασία µεταβαίνει πολύ απότοµα από τη φυσική στην αποδιατεταγµένη κατάσταση. Η θερµοκρασία που συµβαίνει η µεταβολή αυτή κατά 50%, τα µή αποδιατεταγµένα µόρια και τα αποδιατεταγµένα είναι ισάριθµα, έχει ορισθεί σαν θερµοκρασία τήξης της πρωτείνης (Tm) ή θερµοκρασία αποδιάταξης (Td). Ο µηχανισµός της θερµικής αποδιάταξης είναι ιδιαίτερα περίπλοκος και περιλαµβάνει πρωτογενή αποσταθεροποίηση των σηµαντικών µη οµοιοπολικών αλληλεπιδράσεων. Οι δεσµοί υδρογόνου, οι ηλεκτροστατικοί δεσµοί, οι αλληλεπιδράσεις Van der Waals είναι εξωθερµικές αλληλεπιδράσεις στη φύση. Ως εκ τούτου αποσταθεροποιούνται σε υψηλές θερµοκρασίες και σταθεροποιούνται 16

αντίστοιχα σε χαµηλές. Η θεωρητική καµπύλη θερµικής αποδιάταξης µιας πρωτείνης περιγράφεται στο σχήµα 3.14. Σχήµα 3.14 Θεωρητικό διάγραµµα που παρουσιάζει το % ποσοστό µια πρωτείνης που παραµένει µη αποδιατεταγµένη µετά από 10 λεπτά επώαση στις θερµοκρασίες που παρουσιάζονται στο διάγραµµα. 3. 2. 6. 7 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών σε µεσοφάσεις διαλυµάτων Συνήθως, η διεπιφάνεια µεταξύ υγρής και αέριας φάσης ορίζεται σαν επιφάνεια, ενώ σε όλους τους άλλους συνδιασµούς φάσεων παραµένει ο όρος διεπιφάνεια. Η παρουσία µιας πρωτείνης πάνω σε µια διεπιφάνεια µπορεί να προκαλέσει την αποδιάταξη της. Αυτό συµβαίνει διότι τα υδρόφιλα αµινοξέα προσανατολίζονται στην υδάτινη φάση ενω τα υδρόφοβα αποµακρύνται από αυτή. Δηµιουργείται λοιπόν ένα ισχυρά πολωµένο πλέγµα δυνάµεων που έχουν σαν αποτέλεσµα την αποδιάταξη ή µετουσίωση των πρωτεϊνικών µορίων. Είναι λοιπόν σηµαντικό να αποφεύγουµε τη δηµιουργία πιθανών µεσοφάσεων σε πρωτεϊνικά διαλύµατα που εργαζόµαστε. 17

Σχήµα 3.15 Απλουστευµένη παρουσίαση των ελκτικών δυνάµεων µεταξύ των πρωτεϊνικών µορίων στην επιφάνεια, στη µεσόφαση ή διεπιφάνεια και στο εσωτερικό της υγρής φάσης ενός πολυφασικού διαλύµατος 3. 2. 6. 8 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών µε απορρυπαντικά Τα διάφορα απορρυπαντικά, όπως το SDS (sodium dodecyl sulfate) είναι ισχυροί πρωτεϊνικοί αποδιατακτικοί παράγοντες. Ο µηχανισµός δράσης τους περιλαµβάνει επιλεκτική πρόσδεση του απορρυπαντικού στην αποδιατεταγµένη πρωτείνη. Η αποδιάταξη που προκαλείται απο απορρυπαντικά είναι συνήθως µη αντιστρεπτή. Τα συνθετικά απορρυπαντικά είναι µεταξύ των πλέον ισχυρών γνωστών αποδιατακτικών παραγόντων. Οι ενώσεις αυτές έχουν την δυνατότητα να σχηµατίζουν χηµικές γέφυρες µεταξύ υδροφοβικών και υδροφιλικών περιβάλλοντων και να εξουδετερώνουν τις υδρόφοβες δυνάµεις που απαιτούνται για τη διατήρηση της φυσικής δοµής της πρωτείνης. Ηλεκτροφόρηση πηκτώµατος πολυακρυλαµίδης παρουσία του ανιονικού απορρυπαντικού SDS είναι ένα είδος αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης που χρησιµοποιείται για τον διαχωρισµό πρωτεϊνικών υποµονάδων βάσει του µεγέθους τους. Οι πρωτείνες διαλυτοποιούνται σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει SDS και τον αναγωγικό παράγοντα µερκαπτοαιθανόλη ή διθειοθρεϊτόλη (DTT) που σκοπό έχουν να να αποδιατάσσουν ιτς πρωτεϊνικές υποµονάδες και να ανάγουν τους δισουλφιδικούς δεσµούς. Οι πρωτείνες λοιπόν δένουν SDS, φέρουν πλήρες αρνητικό φορτίο και διαχωρίζονται βάσει του µεγέθους τους σε ηλεκτρικό πεδίο (ηλεκτορφόρηση), όπως φαίνεται στη παρακάτω εικόνα. 18

Εικόνα 3.16 Παράδειγµα ανάλυσης πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS και β- µερκαπτοαιθανόλης. Η κάθε ζώνη αντιστοιχεί σε µια πρωτεϊνική αλυσίδα και όχι σε µια πρωτείνη, απλώς διότι µια πρωτείνη µπορεί να αποτελείται από παραπάνω της µιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας. 3. 2. 6. 9 Μηχανισµός αποδιάταξης πρωτεϊνών σε οργανικούς διαλύτες Οι µη πολικές πλευρικές αλυσίδες των αµινοξέων είναι περισσότερο διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες παρά σε νερό και ως εκ τούτου η παρουσία οργανικού διαλύτη σε πρωτεϊνικό διάλυµα έχει σαν αποτέλεσµα την εξασθένιση των υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων µιας πρωτεΐνης. Από την άλλη πλευρά, είναι γνωστό ότι ο σχηµατισµός και η σταθερότητα υδρογονικών δεσµών στη πολυπετιδική αλυσίδα εµπλουτίζονται σε περιβάλλοντα low-permitivity. Συγκεκριµένοι οργανικοί διαλύτες ενισχύουν η προάγουν τη δηµιουργία πεπτιδικών υδρογονικών δεσµών, όπως π.χ. η 2-χλωροαιθανόλη που προκαλεί αύξηση του ποσοστού α-ελίκων σε σφαιρικές πρωτεΐνες. Οργανικοί διαλύτες, όπως ακετόνη και αλκοόλη, δυνητικά προκαλούν αποδιάταξη σε πρωτεΐνες και η δράση τους εξασθενίζει σε χαµηλές θερµοκρασίες. Το τελικό αποτέλεσµα της δράσης ενός οργανικού διαλύτη σε µια πρωτεΐνη συνήθως εξαρτάται από το βαθµό επίδρασής τους σε διάφορες πολικές και µη πολικές αλληλεπιδράσεις εντός της πρωτεϊνικής δοµής. 19

Αρκετοί οργανικοί διαλύτες σε χαµηλές συγκεντρώσεις µπορούν να σταθεροποιήσουν αρκετές πρωτεΐνες-ένζυµα από αποδιάταξη. Αντίθετα, σε υψηλές συγκεντρώσεις όλοι οι οργανικοί διαλύτες προκαλούν αποδιάταξη των πρωτεϊνών διότι ουσιαστικά διαλυτοποιούν όλες τις µη πολικές πλάγιες αλυσίδες και διαλύουν τις πρωτεΐνες. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγµα της επίδρασης διαφόρων αλκοολών στην ενζυµική ενεργότητα της µιας δεϋδρογενάσης της φωσφορικής γλυκεραλδεύδης. Χρησιµοποιώντας διάφορες αλκοόλες, βρέθηκε ότι όσο πιο µακριά είναι η αλειφατική αλυσίδα της αλκοόλης τόσο πιο ισχυρότερη αποδιατακτική δράση (σχήµα 3. 17). Συγκεκριµένα, το ποσοστό της αλκοόλης που απαιτείται για να προκαλέσει 50% αποδιάταξη εντός 30 λεπτών σε θερµοκρασία 30 ο C, µειώνεται κατά 2 φορές για κάθε µεθυλεν-οµάδα που προστίθεται στη αλειφατική αλυσίδα της αλκοόλης, που δρά σαν αποδιατακτικός παράγοντας, Εικόνα 3.17 Υπολειπόµενη ενζυµική ενεργότητα σε σχέση µε το ποσοστό αλκοόλης αλλά και το µήκος της αλειφατικής αλυσίδας της αλκοόλης 3. 2. 7 Καθαρισµός, αποµόνωση και χαρακτηρισµός πρωτεϊνών Προκειµένου να µελετηθεί µια πρωτεΐνη και να διερευνηθεί ο βιολογικός της ρόλος, είναι συνήθως απαραίτητο να καθαριστεί από τις υπόλοιπες πρωτεΐνες και τα άλλα συστατικά του κυττάρου. Δηλαδή να αποµονωθεί σε όσο το δυνατόν πιο καθαρή µορφή και να χαρακτηριστεί µε βάση τις βιοχηµικές της ιδιότητες, όπως πρωτοταγής δοµή, ισοηλεκτρικό σηµείο, µοριακό βάρος κλπ. Οι µέθοδοι διαχωρισµού των πρωτεϊνών βασίζονται σε δυο κυρίως αρχές: 20

Τα πρωτεϊνικά µόρια σε διαλύµατα µε διαφορετικές τιµές ph έχουν διαφορετικά φορτία. Τα διάφορα πρωτεϊνικά µόρια λόγω διαφορετικού αριθµού αµινοξέων και αµινοξικής σύστασης έχουν διαφορετικό µοριακό βάρος και διαφορετική µοριακή στερεοµορφία. Στην πρώτη αρχή στηρίζονται η χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής και η ηλεκτροεστίαση ενώ στη δεύτερη στηρίζονται η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης, υπερφυγοκέντρηση, διαπίδυση µέσω ηµιδιαπερατών µεµβρανών και SDS-ηλεκτροφόρηση πηκτώµατος πολυακρυλαµίδης. Οι πρωτείνες µπορούν επίσης να διαχωριστούν µε βάση: τη διαφορετική διαλυτότητα τους τον διαφορετικό βαθµό προσρόφησης από διάφορα υλικά (χρωµατογραφία προσρόφησης) τον διαφορετικό βαθµό εκλεκτικής σύνδεσης µε ουσίες µε τις οποίες παρουσιάζουν συγγένεια (χρωµατογραφία συγγένειας). 3. 7 Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών σε ένα διάλυµα είναι απαραίτητος σε όλα τα στάδια της πορείας καθαρισµού, χαρακτηρισµού και γενικότερα µελέτης µιας πρωτεΐνης. Οι περισσότερες µέθοδοι που χρησιµοποιούνται σήµερα απαιτούν τη χρήση φασµατοφωτοµέτρου. Η επιλογή της µεθόδου που θα χρησιµοποιηθεί σε κάθε περίπτωση εξαρτάται από διάφορα κριτήρια όπως (α) η διαθέσιµη ποσότητα πρωτεΐνης (β) η συµβατότητα της µεθόδου µε την πρωτεΐνη (γ) η ευαισθησία και αξιοπιστία της µεθόδου (δ) η παρουσία ουσιών που µπορεί να επιδράσουν στη µέτρηση και (ε) η ευκολία εφαρµογής της µεθόδου. Οι κυριότερες µέθοδοι προσδιορισµού πρωτεϊνών που χρησιµοποιούνται στα περισσότερα βιοχηµικά εργαστήρια είναι οι εξής : Μέθοδος Bradford Μέθοδος Lowry Προσδιορισµός απορρόφησης σε µήκος κύµατος 280nm Μεταξύ αυτών των κριτηρίων τον σηµαντικότερο ρόλο παίζουν το είδος της πρωτεΐνης και ο όγκος που χρησιµοποιείται για την µέτρηση. Οι παράγοντες αυτοί είναι καθοριστικοί για την ευαισθησία της µεθόδου. 21

3. 7. 1 Μέθοδος Bradford Η µέθοδος βασίζεται στο γεγονός πως η µέγιστη απορρόφηση όξινου διαλύµατος της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 µεταβάλλεται από τα 465nm στα 595nm όταν παρατηρηθεί αλληλεπίδραση µε πρωτεΐνες. Η χρωστική προσδένεται κυρίως σε βασικά και αρωµατικά αµινοξικά κατάλοιπα, και ιδιαίτερα στην αργινίνη, σχηµατίζοντας σύµπλοκο χρώµατος µπλε. Το σύµπλοκο εµφανίζεται µέσα σε 5min, παραµένει σταθερό για περίπου 1 ώρα και δεν επηρεάζεται από ουσίες που συνήθως απαντώνται σε πρωτεϊνικά διαλύµατα όπως ιόντα Κ +, Μg 2+, υδατάνθρακες, β-µερκαπτοαιθανόλη κ.α. Η µέθοδος Bradford είναι η πλέον διαδεδοµένη για τον προσδιορισµό της απόλυτης συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στο δείγµα. 3. 7. 2 Παραγωγή της πρότυπης καµπύλης αναφοράς Για την εκτέλεση του πειράµατος θα χρησιµοποιηθεί το Coomassie Protein Assay Reagent Kit της εταιρείας BioRad. που αποτελείται από την χρωστική Coomasie Brilliant Blue G-250, µεθανόλη, φωσφορικό οξύ και διαλυτικούς παράγοντες, και αλβουµίνη από ορό βοδιού, γνωστής συγκέντρωσης (200µg/ml). Για την πραγµατοποίηση της αντίδρασης Bradford προστίθενται σε καθαρή κυψελίδα 200µl συµπυκνωµένου αντιδραστηρίου Coomassie reagent, ορισµένη ποσότητα διαλύµατος πρωτεΐνης (αλβουµίνης γνωστής συγκέντρωσης για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης ή αγνώστου δείγµατος για προσδιορισµό) και συµπληρώνεται ο όγκος µέχρι 1ml µε d.dh 2 O. Αναδεύεται το µίγµα µε πιπετάρισµα και αφήνεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 5min ώστε να σχηµατισθεί το έγχρωµο σύµπλοκο. Στη συνέχεια φωτοµετρείται το περιεχόµενο κάθε κυψελίδας στα 595nm, αφού µηδενιστεί το φωτόµετρο µε 200µl συµπυκνωµένης χρωστικής σε 1ml d.dh 2 O. Για την παραγωγή της πρότυπης καµπύλης αναφοράς χρησιµοποιείται η µικροµέθοδος Bradford που προβλέπει τον φωτοµετρικό προσδιορισµό γνωστών συγκεντρώσεων αλβουµίνης σε περιοχή συγκεντρώσεων 2-20µg/ml. 3. 7. 3 Εκτέλεση Σε κυψελίδες 1 ml προσθέτουµε 200 µl συγκεντρωµένο διάλυµα Bradford και συµπληρώνω µέχρι το 1ml µε διάφορες συγκεντρώσεις αλβουµίνης σε dh 2 O. Μετά από τουλάχιστον 5 λεπτά φωτοµετρώ το περιεχόµενο κάθε κυψελίδας στα 595nm µε τυφλό 200 µl συγκεντρωµένο διάλυµα Bradford και 800 µl dh 2 O. 22

Ο παρακάτω πίνακας παρουσιάζει τα διαλύµατα και τις ποσότητες που απαιτούνται και τα αποτελέσµατα των φωτοµετρήσεων για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης. Πίνακας 3.7 αλβουµίνη Bradford µl αλβουµίνη Η 2 0 Απορρόφηση στα 595 nm µg/ml διάλυµα 0.2 mg/ml 0 200 0 800 2 200 10 790 4 200 20 780 6 200 30 770 8 200 40 760 10 200 50 750 12 200 60 740 14 200 70 730 16 200 80 720 18 200 90 710 20 200 100 700 Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε ένα άγνωστο δείγµα εργαζόµαστε όπως στη διαδικασία της παραγωγής της καµπύλης αναφοράς. Συγκεκριµένα ο παρακάτω πίνακας 3.7.1 παρέχει την πλέον ακριβή διαδικασία µέτρησης συνολικής πρωτεΐνης ενός αγνώστου δείγµατος. 23

Εικόνα 3.7.1 Όγκος δείγµατος (µl) Bradford διάλυµα Η 2 0 Απορρόφηση στα 595 nm X 200 800-x 2x 200 800-2x 4x 200 800-4x Οι τιµές της απορρόφησης για να είναι χρήσιµες πρέπει να βρίσκονται στην κεντρική περιοχή τιµών απορρόφησης της καµπύλης αναφοράς. Εάν όχι επαναλαµβάνουµε την ίδια διαδικασία µε µικρότερο ή µεγαλύτερο όγκο Χ. Για την πλέον ακριβή µέτρηση είναι πάντα σωστό τα δείγµατά µας να είναι τουλάχιστον διπλά. Ένας επίσης σηµαντικός παράγοντας είναι η γραµµικότητα των τιµών των µετρήσεων Χ, 2Χ, 4Χ. Μέσα από τον έλεγχο γραµµικότητας µπορούµε να ελέγξουµε και την ακρίβεια προσθήκης των διαλυµάτων. 3. 7. 4 Προσδιορισµός απορρόφησης πρωτεΐνης και ποσοτικός προσδιορισµός σε µήκος κύµατος 280 nm Η µέθοδος αυτή βασίζεται στο γεγονός πως η απορρόφηση µιας πρωτεΐνης σε µήκος κύµατος 276-282nm εξαρτάται σχεδόν αποκλειστικά από το ποσοστό των καταλοίπων τυροσίνης, τρυπτοφάνης και κυστεϊνης στο πρωτεϊνικό µόριο. Έτσι µπορεί να υπολογιστεί ο µοριακός συντελεστής απορρόφησης (ε) µιας πρωτεΐνης από την αµινοξική της ακολουθία σύµφωνα µε τον τύπο: ε(280)(μ -1 cm -1 ) = 5,500(#Trp)+1,490(#Tyr)+125(#cystine) (όπου #Trp : αριθµός καταλοίπων τρυπτοφάνης,#tyr : αριθµός καταλοίπων τυροσίνης, #cystine: αριθµός δισουλφιδικών δεσµών). Στη συνέχεια µπορεί να υπολογιστεί η συγκέντρωση της πρωτεΐνης µε χρήση του νόµου Lambert-Beer: A=ε l C (όπου l: το µήκος διαδροµής της φωτεινής δέσµης, C:συγκέντρωση). 3. 7. 5 Παράδειγµα Οι υπολογισµοί έγιναν βάσει της απορρόφησης του τελικού διαλύµατος, στο οποίο υπήρχε σε καθαρή µορφή η Chi40. Η πρωτοδιάταξη της chi40 είναι η παρακάτω: 24

ATDHSPTVET RAAADNGTVK LGYFTEWGTY DRNFNVKNLD TSTAAKITH INYAFGNVTG GKCAIGDSYA DYDKAFTADQ SVSGQADTWD QPLRGNFNQL RQLKAKYPHI KVLWSFGGWT WSGGFADAAK DPQAFAQSCY NLVHDPRWDG VFDGIDIDWE YPNACGLTCD SSGPDAFRNL MAAVRSTFGD ELVTAAVTAD GTPGGKIEAT DYAGAAQYVD WYNVMTYDFF GAWDAQGPTA PESPLTSYDG IPKQGFTSAD AIAAFKAQGV PADKLLLGIG FYGRGWTGVT QDAPGGTATG PAAGTWEQGI EDYKVLKNTC PVTGTVAGTA YAHCGSNWWS YDTPDTIASK MAWANDQGLR GAFAWDFSGD TADGELIAAL SNGLA ( Trp~W, Tyr~Y, Cys~C ) Aπό την πρωτοδιάταξη της πρωτεΐνης υπολογίστηκαν 15 µόρια Τρυπτοφάνης, 17 Τυροσίνης και 6 µόρια κυστεϊνης, άρα 3 δισουλφιδικοί δεσµοί ή κυστίνες. Χρησιµοποιώντας τοn τύπο: Trp*5500+Tyr*1490+Cys*125 Υπολογίζουµε 15*5500+17*1490+3*125=108205 Aυτό σηµαίνει ότι διάλυµα Chi40 µε συγκέντρωση 41*10 6 mg/lt απορροφά 108205 στα 280nm. (Μοριακό βάρος Chi40=41000 Da) Πιό πρακτικά 41.000 mg/ml απορροφά 108205 Άρα 1 mg/ml απορροφά 2.64 ή 1 µονάδα απορρόφησης στα 280 nm περιέχει 0.38 mg chi40. 25

3. 8 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης παρουσία SDS (αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση) Η πλέον ευρέως διαδεδοµένη µέθοδος ανάλυσης πρωτεϊνών είναι η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης παρουσία του αποδιατακτικού παράγοντα SDS (sodium dodecyl sulfate). H αναλυτική αυτή µέθοδος χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό και το χαρακτηρισµό µιγµάτων πρωτεϊνών και πεπτιδίων, καθώς και για την εκτίµηση του σχετικού µοριακού βάρους (Mr) µιας πρωτεΐνης. Βασίζεται στην ιδιότητα των φορτισµένων µορίων να µετακινούνται κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Γενικά oι πρωτεΐνες φορτίζονται όταν βρίσκονται σε διαφορετικό ph από αυτό που αντιστοιχεί στο ισοηλεκτρικό τους σηµείο. Έτσι, σε ένα µίγµα πρωτεϊνών οι διάφορες πρωτεΐνες θα παρουσιάζουν και διαφορετική κινητικότητα, αφού η διαφορετική τους σύσταση σε αµινοξέα θα τους προσδίδει και διαφορετικό φορτίο. Η ιδιότητα αυτή έχει ως αποτέλεσµα τον διαχωρισµό των πρωτεϊνών και την εµφάνιση κάθε µιας από τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες σαν διαφορετική ζώνη. Στην ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης παρουσία SDS, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται κυρίως βάσει της µάζας τους. Το µίγµα των πρωτεϊνών διαλύεται πρώτα σε διάλυµα SDS ένα ανιονικό απορρυπαντικό που καταστρέφει σχεδόν όλες τις µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις µιας φυσικής πρωτεΐνης. Προστίθεται, επίσης, 2-µερκαπταιθανόλη που ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσµούς. Τα ανιόντα του SDS δεσµεύονται στις κύριες αλυσίδες σε αναλογία ενός µορίου SDS ανά 2 αµινοξέα (ή 1.4 g SDS/g πρωτεΐνης), που δίνει στο σύµπλοκο του SDS µε αποδιαταγµένη πρωτεΐνη αρνητικό φορτίο, περίπου ανάλογο µε τη µάζα της πρωτεΐνης. Το αρνητικό φορτίο που αποκτάται µε τη δέσµευση του SDS είναι συνήθως πολύ µεγαλύτερο από το αρχικό φορτίο της φυσικής πρωτεΐνης, εποµένως αυτό το αρχικό φορτίο καθίσταται αµελητέο. Τα σύµπλοκα SDS-αποδιαταγµένης πρωτεΐνης ηλεκτροφορούνται σε πολυακρυλαµίδη, συνήθως µε τη µορφή κάθετης λεπτής στοιβάδας. Η κατεύθυνση είναι από πάνω προς τα κάτω (από την κάθοδο στην άνοδο). Τα πηκτώµατα της πολυακρυλαµίδης δηµιουργούνται από τον πολυµερισµό του µονοµερούς της ακρυλαµίδης (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του συνδετικού παράγοντα N,N -µεθυλεν-δις-ακρυλαµίδη (Δις-ακρυλαµίδη), µε µια αντίδραση πολυµερισµού που επάγεται από την Ν,Ν,Ν,Ν -τετραµεθυλαιθυλενδιαµίνη (TEMED, Ν,Ν,Ν,Ν - tetramethylethylene-diamine) και το θειοθειϊκό αµµώνιο (APS, ammonium persulfate). Το TEMED καταλύει το σχηµατισµό των ελεύθερων θειοθειϊκών ριζών, οι οποίες στη συνέχεια επάγουν τον πολυµερισµό. Εφόσον η 26

ελεύθερη βάση του TEMED απαιτείται, ο πολυµερισµός µπορεί να καθυστερήσει ή και να εµποδιστεί σε χαµηλές τιµές ph. Σε χαµηλές τιµές ph αντί για TEMED χρησιµοποιείται η βιταµίνη ριβοφλαβίνη. Η ταχύτητα πολυµερισµού είναι δυνατόν να αυξηθεί ανεβάζοντας τη συγκέντρωση είτε του TEMED, είτε του APS. Τα πηκτώµατα πολυακρυλαµίδης είναι προτιµητέα για ηλεκτροφόρηση σε σχέση µε άλλα (π.χ πηκτώµατα αµύλου), γιατί αποτελούνται από χηµικά ουδέτερες ενώσεις, είναι σταθερά σε ένα µεγάλο εύρος ph, θερµοκρασιών και διαλυµάτων διαφορετικής ιονικής ισχύος, είναι διάφανα και πολυµερίζονται εύκολα. Επίσης, το µέγεθος των πόρων µπορεί να ρυθµιστεί µε την επιλογή διαφορετικών συγκεντρώσεων και σχέσεων ακρυλαµίδης και δις-ακρυλαµίδης στον πολυµερισµό για το σχηµατισµό του πηκτώµατος. Έχει παρατηρηθεί ότι µείωση της συγκέντρωσης της ακρυλαµίδης έχει ως αποτέλεσµα τον σχηµατισµό µεγαλύτερων πόρων. Aύξηση της αναλογίας δις- ακρυλαµίδης/ ακρυλαµίδης, όπως και αύξηση της ολικής συγκέντρωσης, οδηγεί σε µείωση του µεγέθους των πόρων και το αντίστροφο. H αναλογία που χρησιµοποιείται συνήθως είναι 1/29 µε την οποία είναι δυνατός ο διαχωρισµός πεπτιδίων µε διαφορά µεγέθους τουλάχιστον 3%. Μπορούν επίσης να παρασκευασθούν πηκτώµατα µε διαβαθµιζόµενη συγκέντρωση πολυακρυλαµίδης (gradient), για τον καλύτερο διαχωρισµό πρωτεϊνών µε παραπλήσια µοριακά βάρη. Yπάρχουν επίσης πηκτώµατα ακρυλαµίδης µε γραµµική µεταβολή της συγκέντρωσης της. Στις περιπτώσεις αυτές το µέγεθος των πόρων µειώνεται όσο αυξάνει η συγκέντρωση της πολυακρυλαµίδης. Με τον τρόπο αυτόν µπορούν να διαχωριστούν πρωτεΐνες µε πολύ διαφορετικά µοριακά βάρη. Η συγκέντρωση ακρυλαµίδης που θα χρησιµοποιηθεί τελικά, εξαρτάται από το µοριακό βάρος των πρωτεϊνών που επιθυµούµε να διαχωρίσουµε, όπως προκύπτει από τον παρακάτω πίνακα: Συγκέντρωση ακρυλαµίδης (%) Εύρος διαχωρισµού (kd) 15 12-43 10 16-68 7,5 36-94 5 57-212 27

Ο πολυµερισµός επάγεται από την παρουσία των ενώσεων TEMED ( N,N,N,Ν -τετραµεθυλαιθυλενοδιαµίνη), και APS (ammonium persulfate). Συγκεκριµένα το TΕMED καταλύει το σχηµατισµό ελεύθερων ριζών από το APS, οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν τον πολυµερισµό. Σε χαµηλές τιµές ph αναστέλλεται η δράση του ΤΕΜΕD, οπότε χρησιµοποιείται η βιταµίνη ριβοφλαβίνη.αύξηση της συγκέντρωσης του TEMED ή του APS οδηγεί σε αύξηση της ταχύτητας πολυµερισµού. Γενικά τα πηκτώµατα ακρυλαµίδης προτιµούνται σε σχέση µε άλλου είδους πηκτώµατα γιατί αποτελούνται από χηµικά ουδέτερες ενώσεις, είναι διάφανα και σταθερά σε µεγάλο εύρος ph, θερµοκρασιών και ιονικής ισχύος. Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών γίνεται κάτω από συνθήκες που εξασφαλίζουν την πλήρη αποδιάταξη τους στις µονοµερείς υποµονάδες τους και την ελαχιστοποίηση της συσσωµάτωσης. Για το σκοπό αυτό τα πρωτεϊνικά δείγµατα υφίστανται την επίδραση του ανιονικού απορρυπαντικού SDS, το οποίο καταστρέφει όλες τις µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις µιας φυσικής πρωτεΐνης, της µερκαπτοαιθανόλης, ένωση η οποία ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσµούς, και τη θέρµανση στους 100 ο C ώστε να επιτευχθεί η πλήρης αποδιάταξη και µετουσίωση των πρωτεϊνών. Τα ανιόντα του SDS δεσµεύονται στις αποδιαταγµένες πολυπεπτιδικές αλυσίδες σε αναλογία ενός µορίου SDS ανα δυο αµινοξέα ή 1,4 g SDS/g πρωτεΐνης. Έτσι κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα αποκτά αρνητικό φορτίο ανάλογο µε τη µάζα της, καθώς το αρχικό της φορτίο είναι αµελητέο µετά την πλήρη κάλυψη της µε SDS, και διαχωρίζεται τελικά µε βάση το µοριακό της βάρος. Πρέπει να αναφερθεί όµως πως τροποποιήσεις της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, όπως η γλυκοζυλίωση ή η µεθυλίωση καταλοίπων, επηρεάζουν σηµαντικά το φαινόµενο µοριακό βάρος, έτσι ώστε να µην αντιστοιχεί στην πραγµατική µάζα της πρωτεΐνης. Τα σύµπλοκα SDS-αποδιαταγµένων πρωτεϊνών µετακινούνται διαµέσου των πόρων του πηκτώµατος µε κατεύθυνση προς την άνοδο, λόγω της εφαρµογής διαφοράς δυναµικού. Ο ρυθµός µετακίνησης είναι αντιστρόφως ανάλογος του λογαρίθµου της µάζας τους. Οι µικρές πρωτεΐνες µετακινούνται γρηγορότερα, ενώ οι µεγαλύτερες µένουν στην κορυφή κοντά στο σηµείο εκκίνησης. Οι ζώνες των πρωτεϊνών διακρίνονται στο τέλος της ηλεκτροφόρησης µετά από χρώση µε βαφή αργύρου ή µε Coomasie brilliant blue R250. Στο τέλος, οι πρωτεΐνες στο πήκτωµα εµφανίζονται µε βαφή αργύρου ή χρώση κυανού του Coomassie, που αποκαλύπτει µια σειρά από ζώνες. Κάθε µια αντιστοιχεί σε µια πολυπεπτιδική αλυσίδα. Οι µικρές πρωτεΐνες µετακινούνται εύκολα διαµέσου του πηκτώµατος, ενώ οι µεγάλες µένουν στην κορυφή κοντά στο 28

σηµείο εκκίνησης. Η µετακίνηση των περισσοτέρων πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, είναι απολύτως ανάλογη µε το λογάριθµο της µάζας τους. Αυτή η εµπειρική σχέση δεν ακολουθείται από κάποιες πρωτεΐνες, όπως εκείνες που είναι πλούσιες σε υδατάνθρακες και οι µεµβρανικές πρωτεϊνες, που µετακινούνται ανώµαλα. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης είναι γρήγορη, ευαίσθητη και έχει µεγάλη διαχωριστική ικανότητα. Οι ιδιότητες αυτές καθώς και το γεγονός ότι απαιτούνται µικρές ποσότητες από τα δείγµατα, έχουν καταστήσει τη µέθοδο αυτή ως την πλέον χρησιµοποιούµενη για τον καθαρισµό της πολυπλοκότητας και του µοριακού βάρους των πολυπεπτιδίων που περιέχονται σε ένα πρωτεϊνικό δείγµα. Οι ποσότητες πρωτεϊνών που απαιτούνται για ανίχνευση είναι εξαιρετικά µικρές: περίπου 0,1µg (~2pmol) για χρώση µε Coomasie, και ακόµη λιγότερο (0,02µg ) µε χρώση αργύρου. 3. 8. 1 Κατασκευή πηκτώµατος Τα πηκτώµατα 0.1% SDS-20% PAGE σε πλάκες πολυακρυλαµίδης (slab gels), που χρησιµοποιούνται, έχουν µέγεθος 10x12x0.1 cm και κατασκευάζονται µε βάση το σύστηµα που ανέπτυξε ο Laemmli ως εξής : Οι δύο υάλινες πλάκες, µεταξύ των οποίων διαβιβάζεται το διάλυµα του πηκτώµατος, τοποθετούνται κάθετα και στεγανοποιούνται τα άκρα τους, ώστε να µην υπάρχει διαρροή του µη πολυµερισµένου µείγµατος ακρυλαµίδης-bis ακρυλαµίδης µέχρι να πολυµεριστεί. Σε δύο κωνικές φιάλες των 50 ml προσθέτονται τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για την παρασκευή του διαλύµατος διαχωρισµού (Running gel) και του διαλύµατος συµπύκνωσης (Stacking gel), σε κατάλληλες ποσότητες βάση του αριθµού των πηκτωµάτων που παρασκευάζονται (περίπου 7.5 ml Running gel/πήκτωµα και 2.5 ml Stacking gel/πήκτωµα). Οι δύο αυτές φάσεις διαφέρουν µεταξύ τους στο ph και στην συγκέντρωση ακρυλαµίδης, γεγονός που βοηθά στο πακετάρισµα όλων των πρωτεϊνών στην ίδια ζώνη λίγο πριν την έναρξη του διαχωρισµού τους. Το running gel παρασκευάζεται πρώτο και µεταφέρεται στο χώρο µεταξύ των πλακών γεµίζοντας το 75% του χώρου. Προστίθεται λίγο απιονισµένο νερό και αναµένεται να γίνει ο πολυµερισµός και να διαχωριστούν οι φάσεις. Στη συνέχεια αφαιρείται το νερό, παρασκευάζεται το stacking gel και διαβιβάζεται στο χώρο µεταξύ των πλακών σχηµατίζοντας µια στοιβάδα πάνω από το running gel µέχρι την επιφάνεια. Αµέσως τοποθετείται και το κατάλληλο πλαστικό χτενάκι για το σχηµατισµό καθορισµένου αριθµού πηγαδιών. Τα πηκτώµατα παραµένουν σε θερµοκρασία δωµατίου για 30min περίπου, µέχρι να πολυµεριστούν πλήρως. 29

Μπορούν να αποθηκευθούν στους 4 ο C, σε σακούλα µε νερό ώστε να διαβρέχονται. Ο ρόλος του πηκτώµατος συµπύκνωσης (stacking gel), που περιέχει µικρή συγκέντρωση ακρυλαµίδης, είναι η επιβράδυνση των δειγµάτων κατά τη µετακίνηση τους προς την άνοδο ώστε να εισέλθουν ταυτόχρονα στο πήκτωµα διαχωρισµού. Εικόνα 3.8 Συνήθως στην SDS ηλεκτροφόρηση χρησιµοποιείται ασυνεχές σύστηµα ρυθµιστικών διαλυµάτων όπου το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης που τοποθετείται στη συσκευή έχει διαφορετικό ph και ιονική ισχύ από αυτό που χρησιµοποιείται για την κατασκευή του πηκτώµατος. H σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης είναι: Πήκτωµα συµπύκνωσης (5%) dh 2 Ο 3,475 ml 1M Tris-CI ph 6.8 0.625 ml 10% (w/v) SDS 50 µl 30% (w/v) Ακρυλαµίδη- 0,8% (w/v) µεθυλενο-δις-ακρυλαµίδη 0.833 ml 10% (w/v) APS 20 µl TEMED 7 µl 30

Πήκτωµα διαχωρισµού (15%) dh 2 Ο 2,366 ml 1.5 M Tris-CI ph 8.8 2,5 ml 10% (w/v) SDS 100 µl 30% (w/v) Ακρυλαµίδη- 0,8% (w/v) µεθυλενο-δις-ακρυλαµίδη 5 ml 10% (w/v) APS 40 µl TEMED 14 µl SDS running buffer: 0.29% κ.β. Tris Base 0.1% κ.β SDS 1.44% κ.β γλυκίνη (glycine) Έτσι λοιπόν τα δείγµατα και το πήκτωµα συµπύκνωσης περιέχουν Tris/Cl ph 6.8, το running gel περιέχει Tris/Cl ph 8.8, ενώ το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης περιέχει Tris-glycine ph 8.3. Πριν την ηλεκτροφόρηση αφαιρείται το χτενάκι και η ταινία από teflon στην κάτω επιφάνεια του πηκτώµατος και το πήκτωµα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης κατακόρυφα. Στη συσκευή έχει ήδη τοποθετηθεί ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης (SDS Running buffer) έτσι ώστε να διαβρέχονται οι ελεύθερες επιφάνειες του πηκτώµατος µεταξύ των πλακών και να σχηµατιστεί κλειστό κύκλωµα µε την τοποθέτηση των ηλεκτροδίων. Στη συνέχεια φορτώνονται τα κατάλληλα επεξεργασµένα δείγµατα στα πηγαδάκια, συνδέονται τα ηλεκτρόδια µε την άνοδο προς την πλευρά που θα κινηθούν οι πρωτεΐνες, και εφαρµόζεται διαφορά δυναµικού 15V/cm. Οι ποσότητες των διαλυµάτων που προστίθενται εξαρτώνται από τον αριθµό των πηκτωµάτων που κατασκευάζουµε. Γενικά απαιτούνται περίπου 7,5ml running gel και 2,5ml stacking gel ανα πήκτωµα. Τα αντιδραστήρια APS και TEMED προστίθενται στο τέλος ακριβώς πριν µεταφερθούν τα διαλύµατα µεταξύ των πλακών ώστε να µην αρχίσει ο πολυµερισµός πολύ νωρίς. Tο ΑPS (ammonium persulfate) και το TEMED προσθέτονται στο τέλος λίγο πριν µεταφέρουµε τα διαλύµατα στις υάλινες πλάκες. Το διάλυµα διαχωρισµού διαβιβάζεται πρώτο µέχρι να γεµίσει περίπου το 75% της συσκευής (υπολογίζω 7.5ml). Το διάλυµα συµπύκνωσης διαβιβάζεται ακολούθως µέχρι την επιφάνεια των πλακών και αµέσως τοποθετείται το χτενάκι που έχει επιλεγεί για τον σχηµατισµό κατάλληλου αριθµού πηγαδιών. Τα πηκτώµατα παραµένουν σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι να ολοκληρωθεί ο πολυµερισµός τους. Συνήθως ο χρόνος που απαιτείται είναι 30 λεπτά. 31

Στην περίπτωση που η χρήση του πηκτώµατος δεν είναι άµεση αυτό τοποθετείται στο ψυγείο, προστατευόµενο σε σακουλάκι µε νερό, ώστε να διατηρηθεί νωπό. Η διαδικασία που ακολουθείται για ηλεκτροφόρηση του δείγµατος των πρωτεϊνών είναι η ακόλουθη: Αφού αφαιρέσουµε τα χτενάκια, τοποθετούµε το πήκτωµα στην συσκευή ηλεκτροφόρησης στην οποία έχει ήδη διαβιβασθεί ρυθµιστικό διάλυµα ανόδου και καθόδου (SDS Running Buffer). Προσέχουµε την ποσότητα του ρυθµιστικού διαλύµατος να είναι αρκετή για να σχηµατισθεί κλειστό κύκλωµα αποφεύγοντας την υπερχείλιση. Στη συνέχεια, φορτώνουµε τα δείγµατα που έχουν προετοιµαστεί κατάλληλα και τρέχουµε το πήκτωµα. 3. 8. 2 Προετοιµασία των δειγµάτων για ηλεκτροφόρηση Για την προετοιµασία των πρωτεϊνικών δειγµάτων αναµιγνύουµε ίσους όγκους από τα δείγµατα µας και το Laemmli buffer (2x), η σύσταση του οποίου είναι η ακόλουθη: Laemmli buffer (2xSDS gel-loading buffer) 0,125 Μ Tris-CI 4% (κ.β) SDS 23% (κ.ο) Γλυκερόλη 5% (κ.ο) β-μερκαπταιθανόλη 0.01% (κ.β) Μπλε της Βρωµοφαινόλης Στη συνέχεια, τα δείγµατα βράζονται για 5 λεπτά στους 100 0 C και φορτώνονται στα πηγαδάκια. Η ηλεκτροφόρηση αναπτύσσεται σε πεδίο 15 V/cm ή σε σταθερό πεδίο 30-35 Α. Μεγάλη προσοχή πρέπει να δώσουµε στη θερµοκρασία που αναπτύσσεται κατά την ηλεκτροφόρηση. Θα πρέπει οι υάλινες πλάκες να µην υπερθερµανθούν και σπάσουν. 32

Εικόνα 3.8.2 Σχηµατική παράσταση των σταδίων εκτέλεσης αποδιατακτικής ηλεκτροφόρησης παρουσία SDS. 33

3. 8. 3 Χρώση των ηλεκτροφορηµάτων Μετά το τέλος της ηλεκροφόρησης, ακολουθεί η χρώση του πηκτώµατος σε διάλυµα (Staining solution),για 45 λεπτά υπο συνεχή ανάδευση. SDS-PAGE Staining solution 25% (κ.ο) ισοπροπανόλη 10% (κ.ο) οξικό οξύ 0.25% (κ.β) Coomassie Brilliant blue G-250 Μετά τη χρώση ακολουθεί αποχρωµατισµός του πηκτώµατος σε διάλυµα αποχρωµατισµού (Destaining solution) για τουλάχιστον 2 ώρες υπο συνεχή ανάδευση. SDS-PAGE Destaining solution 10% (κ.ο) οξικό οξύ 10% (κ.ο) ισοπροπανόλη Τα χρωµατισµένα πηκτώµατα διατηρούνται για αρκετές εβδοµάδες στο σκοτάδι σε νερό. 34

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚO ΤΜHΜΑ Πείραµα 1ον 3. 3 Αντίδραση διουρίας 3. 3. 1 Σκοπός πειράµατος Οι ουσίες που περιέχουν στο µόριο τους τουλάχιστον δυο πεπτιδικούς δεσµούς σχηµατίζουν µε ιόντα Cu 2+ και σε αλκαλικό περιβάλλον σύµπλοκα που έχουν µωβ χρώµα. Η αντίδραση αυτή ονοµάζεται αντίδραση διουρίας γιατί η απλούστερη ουσία που τη δίνει θετική είναι η διουρία. Η αντίδραση αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισµό πρωτεΐνων. 3. 3. 2 Εκτέλεση Αναµείξατε τα διαλύµατα όπως φαίνεται στους παρακάτω πίνακες 3.1 και 3.2. H προσθήκη CuSO4 γίνεται σταγόνα-σταγόνα µέχρι το διάλυµα να γίνει µωβ. Πίνακας αντιδράσεων 3.1 Αριθµός σωλήνα Διαλύµατα Αντιδραστήριο Παρατηρήσεις 1 2 3 ml 0.5% γλυκίνη 3 ml 0.5% ωβαλβουµίνη 3 σταγόνες 40% NaOH και µετά 3 σταγόνες 1% CuSO4 3 σταγόνες 40% NaOH και µετά 3 σταγόνες 1% CuSO4 35

Παρατηρήσεις Πίνακας αντιδράσεων 3.2 Αριθµός σωλήνα Διαλύµατα Αντιδραστήρια Παρατηρήσεις 1 2 3 ml 0.5% ωβαλβουµίνη + 0.5 ml θειικό αµµώνιο 3 ml 0.5% ωβαλβουµίνη + 0.5 ml θειικό αµµώνιο 3 σταγόνες 40% NaOH και µετά 1% CuSO4 7 ml 40% NaOH και µετά 1% CuSO4 36

Παρατηρήσεις 37

Πείραµα 2ον 3. 4 Αποδιάταξη πρωτεϊνών µε θέρµανση. 3. 4. 1 Σκοπός πειράµατος Είναι γνωστό ότι η αποδιάταξη µιας πρωτεΐνης γίνεται είτε µε την επίδραση διαφόρων ουσιών όπως οξέα, αλκάλεα, ουρία, γουανιδίνη, απορρυπαντικά κλπ., είτε µε φυσικούς παράγοντες όπως η θερµότητα και η ακτινοβολία. Με την αποδιάταξη αλλάζει η δοµή της πρωτεΐνης και ελαττώνεται πολύ η διαλυτότητά της. Σε τιµές ph που βρίσκονται πολύ κοντά στο ισοηλεκτρικό της σηµείο παρατηρείται συσσωµάτωση και καθίζηση. 3. 4. 2 Εκτέλεση Αναµείξατε τα διαλύµατα όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα 3.3 και τοποθετείστε σε υδατόλουτρο 100 C για 5 λεπτά. Πίνακας αντιδράσεων 3.3 Αριθµός σωλήνα Διαλύµατα Αντιδραστήρια Παρατηρήσεις 1 2 3 5 ml 0.5% ωβαλβουµίνη 5 ml 0.5% ωβαλβουµίνη 5 ml 0.5% ωβαλβουµίνη 2 ml 0.1 Ν HCl 1 ml 2Μ οξικό ρυθµιστικό ph 4.7 (acetate) 2 ml 0.1 Ν NaOH Στη συνέχεια ψήξτε τους σωλήνες µε τρεχούµενο νερό βρύσης και καταγράψτε τα αποτελέσµατα. Στους σωλήνες 1 και 3 προσθέστε από 2 ml 2Μ οξικού ρυθµιστικού διαλύµατος ph 4.7, τοποθετείστε πάλι τους σωλήνες στο υδατόλουτρο των 100 C για 5 λεπτά. Ερµηνεύστε τα αποτελέσµατά σας. 38

Στους σωλήνες 1 και 3 προσθέστε από 2 ml 2Μ οξικού ρυθµιστικού διαλύµατος ph 4.7 και έχουµε το παρακάτω αποτέλεσµα Παρατηρήσεις 39

Πείραµα 3ον 3. 5 Σουλφυδρυλικές οµάδες στην φυσική και αποδιατεταγµένη ωαλβουµίνη 3. 5. 1 Σκοπός πειράµατος Η ωαλβουµίνη είναι µια πρωτεΐνη που περιέχει κυστείνες. Οι σουλφυδρυλικές οµάδες των κυστεινών στη φυσική πρωτεΐνη είναι καλυµµένες. Μετά την αποδιάταξη του πρωτεϊνικού µορίου οι σουλφυδρυλικές οµάδες των κυστεινών είναι προσβάσιµες. Στο πείραµα αυτό θα ανιχνεύσουµε τις ελεύθερες -SH της ωαλβουµίνης. Η αντίδραση γίνεται µε την οξείδωση των ελευθέρων -SH σε -S-S- και ταυτόχρονη αναγωγή του σιδηρικυανιούχου καλίου, σύµφωνα µε την παρακάτω αντίδραση. Η έκταση της αντίδρασης παρακολουθείται από το µπλε χρώµα που σχηµατίζει το σιδηρικυανιούχο κάλιο µε την προσθήκη FeCl3. Ένα πείραµα ελέγχου που γίνεται στην αντίδραση αυτή, είναι η δέσµευση των σουλφυδρυλικών οµάδων, που απελευθερώνονται µε την αποδιάταξη της ωαλβουµίνης από το παρα-χλωρο-µερκουρι-βενζοικό οξύ. Το παρα-χλωρο-µερκουρι-βενζοικό οξύ σχηµατίζει ένα πάρα πολύ σταθερό µερκαπτίδιο µε τη σουλφυδρυλική οµάδα παρεµποδίζοντας έτσι την οξείδωση της τελευταίας από τα σιδηροκυανιούχα ιόντα. 3. 5. 2 Εκτέλεση Αναµείξατε τα διαλύµατα όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα 3.4 µε απόλυτη προσοχή στη σειρά που δίνεται και καταγράψετε τις παρατηρήσεις σας. 40

Πίνακας αντιδράσεων 3.4 Σωλήνας 1 2 3 H20 5 ml 1 ml - Φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα 2 ml 2 ml 2 ml 5% ωβαλβουµίνη 2 ml 2 ml 2 ml 0.35% SDS - 4 ml * 4 ml * 5 mm παρα-χλώρο-µερκουρι-βενζοικό - - 1 ml 4 mm σιδηρικυανιούχο κάλιο 1 ml 1 ml 1 ml * Πριν από τη προσθήκη SDS αλλάξτε πιπέτα. Αφού τελειώσετε την ανάµειξη των διαλυµάτων των σωλήνων 1, 2, και 3, µεταφέρετε από κάθε σωλήνα 2 ml, σε καινούργιο δοκιµαστικό σωλήνα µετά από 10, 20, και 30 λεπτά, και εκτελέστε τις αντιδράσεις όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα 3.5. Πίνακας αντιδράσεων 3.5 Σωλήνας 1 2 3 2 ml δείγµα 2 ml δείγµα 2 ml δείγµα 10 λεπτά + 2 σταγ. + 2 σταγ. + 2 σταγ. FeCl3 FeCl3 FeCl3 2 ml δείγµα 2 ml δείγµα 2 ml δείγµα 20 λεπτά + 2 σταγ. + 2 σταγ. + 2 σταγ. FeCl3 FeCl3 FeCl3 2 ml δείγµα 2 ml δείγµα 2 ml δείγµα 30 λεπτά + 2 σταγ. + 2 σταγ. + 2 σταγ. FeCl3 FeCl3 FeCl3 Παρατηρήσεις 41