Συνεστιακή απεικoνιστική μικροσκοπία

ΑΣΚΗΣΗ 8 Συνεστιακή απεικoνιστική μικροσκοπία 8.1. Εισαγωγή Η συμβατική θεώρηση του οπτικού μικροσκοπίου σαν ένα όργανο για τη μελέτη στερεωμένων δειγμάτων ιστού έχει μετασχηματιστεί τα τελευταία χρόνια. Σήμερα, το μικροσκόπιο, μπορεί δίκαια να θεωρηθεί ως ένα δυναμικό όργανο για τις μελέτες της βιολογικής δραστηριότητας σε πραγματικό χρόνο. Η ενδοκυττάρια απεικόνιση σε ζωντανά κύτταρα κατέστη δυνατή εξαιτίας της ταυτόχρονης ανάπτυξης ιχνηθετών, ικανών να επισημάνουν τη βιολογική δραστηριότητα, και οργάνων ελεγχομένων από υπολογιστή, για την ταχύτατη απόκτηση ακόμα και πολύ ασθενών σημάτων. Η ανάπτυξη φθοριζόντων ιχνηθετών οι οποίοι είναι ευαίσθητοι σε ιόντα όπως το ασβέστιο, το υδρογόνο και μεγέθη όπως το ηλεκτρικό δυναμικό επιτρέπουν την παρατήρηση συγκεκριμένων κυτταρικών λειτουργιών. Η ικανότητα σύνδεσης γρήγορων video cameras και της τεχνολογίας των υπολογιστών στα συμβατικά μικροσκόπια έκανε δυνατές όχι μόνο τις ποιοτικές παρατηρήσεις αλλά και την εξαγωγή ποσοτικών δεδομένων από μεμονωμένα κύτταρα. Οι ταχύτητες που

146 Άσκηση 8 επιτυγχάνονται είναι μεγαλύτερες από 30 video frames ανά δευτερόλεπτο, εάν χρησιμοποιηθεί video camera ή συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με laser ή πολλές εκατοντάδες δείγματα ανά δευτερόλεπτο, εάν χρησιμοποιηθούν ευαίσθητοι φωτοπολλαπλασιαστές. Διάφορες ανακαλύψεις έδωσαν στους επιστήμονες τη δυνατότητα να αυξήσουν την ικανότητα παρατήρησης και καταγραφής και να εφαρμόσουν τις τεχνικές αυτές σε προβλήματα τα οποία παλαιότερα θεωρούνταν δυσεπίλυτα. Ως αποτέλεσμα αναπτύχθηκαν μέθοδοι απεικόνισης κυτταρικών διεργασιών σε πραγματικό χρόνο. Στο κέντρο αυτής της νέας προσέγγισης βρίσκεται η ανάλυση και επεξεργασία εικόνας. Ένα τέτοιο σύστημα παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη συμβατική μικροσκοπία. Η επεξεργασία εικόνων μικροσκοπίου από τον υπολογιστή προσφέρει στην κυτταροπαθολογία και την ιστοπαθολογία δυνατότητα ποσοτικοποίησης και αντικειμενοποίησης στη λήψη αποφάσεων. Η εισαγωγή στις ποσοτικές διαδικασίες αρχίζει να έχει μια πιο ευρεία επίδραση, οδηγώντας στην εξερεύνηση των διαδικασιών οι οποίες υπόκεινται σε υποκειμενική ανθρώπινη κρίση για διαγνωστικούς σκοπούς. Οι αντλούμενες ποσοτικές πληροφορίες αναλύονται με τη βοήθεια πολυμεταβλητών στατιστικών μεθόδων. Μπορούν έτσι να εντοπιστούν μικρές αλλαγές στα χαρακτηριστικά πολυμεταβλητών στατιστικών κατανομών σε πληθυσμούς κυττάρων, ενώ με την οπτική παρατήρηση μεμονωμένων κυττάρων, αυτό δε μπορεί να επιτευχθεί. Οι ήδη υπάρχουσες μεθοδολογίες κυτταροπαθολογικών και ιστολογικών αναλύσεων σταδιακά δίνουν τη θέση τους στις νέες τεχνικές που παρέχει η ανάλυση και επεξεργασία εικόνας με την βοήθεια Η/Υ. Οι τελευταίες συνδυάζουν αντικειμενικότητα και ακριβή προσδιορισμό ποσοτικών μεγεθών της εικόνας, που δεν είναι δυνατό να καταγραφούν με τη χρήση μόνο οπτικού μικροσκοπίου. Ένα Απεικονιστικό Σύστημα Μικροσκοπίας αποτελείται από: μία απεικονιστική διάταξη, που μπορεί να είναι ένα μικροσκόπιο απλό ή φθορισμού για απεικόνιση σε δύο ή τρεις διαστάσεις, έναν ή περισσότερους ιχνηθέτες φθορισμού, για την επισήμανση και παρακολούθηση των αντίστοιχων κυτταρικών δομών και λειτουργιών. μία συσκευή ανίχνευσης του φθορισμού, όπως μία CCD camera ή ένας φωτοπολλαπλασιαστής και κατάλληλο λογισμικό για την καταγραφή, ανάλυση και επεξεργασία των παρατηρούμενων εικόνων. 8.2. Απεικονιστική διάταξη Από τις πρώτες παρατηρήσεις πρωτοζώων από τον Leenwenhock ως τις σημερινές εξειδικευμένες μελέτες, το μικροσκόπιο παραμένει το βασικό όργανο για την έρευνα του κυττάρου, που αποτελεί τη δομική βάση της ζωής. Στα πρώτα μικροσκόπια, τα θεωρούμενα απλά, χρησιμοποιήθηκε ένας φακός μεγέθυνσης (συγκλίνων φακός) μεταξύ του ματιού και του προς παρατήρηση αντικειμένου, έτσι ώστε το τελευταίο να βρίσκεται ενδιάμεσα του πρώτου εστιακού επιπέδου και του φακού. Υπό αυτές τις συνθήκες ο φακός δίνει το είδωλο του αντικειμένου φανταστικό ορθό και μεγεθυμένο.

Συνεστιακή απεικονιστική μικροσκοπία 147 Προσοφθάλμιος φακός Εστίαση Έλεγχος εστίασης Αντικειμενοφόρος πλάκα Αντικειμενικός φακός Δείγμα Πηγή Σχήμα 1: Βασική διάταξη μικροσκοπίου Πολύ μεγαλύτερες μεγεθύνσεις μπορούν να επιτευχθούν με σύστημα δύο φακών που αποτελούν το σύνθετο μικροσκόπιο, το οποίο σχηματικά συντίθεται από δύο τύπους φακών, τον αντικειμενικό και τον προσοφθάλμιο. Το σύστημα αυτό των δύο φακών, που αποτελούν το σύνθετο μικροσκόπιο, φαίνεται στο Σχήμα 1. Διακρίνονται ο προσοφθάλμιος (eyepiece) και ο αντικειμενικός (objective) φακός, το δείγμα (sample), το οποίο τοποθετείται επάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα (stage) και, τέλος, η πηγή φωτισμού (light source) που βρίσκεται κάτω από την πλάκα. 8.2.1 Σύνθετο μικροσκόπιο Ένα μικροσκόπιο αποτελείται από ένα σταθερό τμήμα, που ονομάζεται βάση, πάνω στην οποία είναι προσαρτημένο το οπτικό τμήμα καθώς και οι άλλες διατάξεις όπως η στήριξη των παρασκευασμάτων που θα μελετηθούν (αντικειμενοφόρος πλάκα), το σύνολο των μηχανισμών κίνησης για εστίαση και η συσκευή φωτισμού. Το φως διέρχεται από το σύστημα φωτισμού στο συναγωγό σύστημα, ένα σύστημα φακών που επιτρέπει τον ομοιόμορφο φωτισμό του παρασκευάσματος. Με τη βοήθεια διαφράγματος ρυθμίζεται κατάλληλα η ένταση της δέσμης. Tο σύστημα των δύο φακών που συμμετέχουν στη διαδικασία σχηματισμού του ειδώλου του αντικειμένου αποτελείται από τον αντικειμενικό φακό, που είναι κοντά στο προς παρατήρηση αντικείμενο και από τον προσοφθάλμιο που είναι κοντά στο μάτι του παρατηρητή. Ο αντικειμενικός δίνει το είδωλο πραγματικό αντεστραμμένο και μεγεθυμένο κοντά στο εστιακό επίπεδο του προσοφθάλμιου φακού. Ο προσοφθάλμιος φακός λειτουργεί κατά ανάλογο τρόπο με ένα φακό μεγεθύνσεως δίνοντας ένα φανταστικό μεγεθυμένο είδωλο που παραμένει αντεστραμμένο.

148 Άσκηση 8 Σχήμα 2: Διαδικασία σχηματισμού ειδώλου Οι αντικειμενικοί φακοί είναι τοποθετημένοι σε μια υποδοχή η οποία περιστρέφεται έτσι ώστε να γίνεται εύκολα η αντικατάσταση τους κατά τη διάρκεια της παρατήρησης και να μεταβάλλεται η μεγέθυνση. Η συνολική μεγέθυνση του τελικού ειδώλου σε σχέση με το αντικείμενο είναι το γινόμενο των μεγεθύνσεων του αντικειμενικού και του προσοφθάλμιου. Έτσι για αντικειμενικό με μεγέθυνση 40x και προσοφθάλμιο με 10x, η συνολική μεγέθυνση είναι 400x. Εκτός όμως από την μεγέθυνση το μικροσκόπιο προσφέρει τη δυνατότητα να αναδειχθούν τα δομικά στοιχεία που αποτελούν τα αντικείμενα. Στο παρακάτω σχήμα, φαίνονται τα οπτικά και μηχανικά χαρακτηριστικά ενός σύνθετου μικροσκοπίου. 12 1. Φωτισμός 2. Βίδες για εστίαση του φωτός 3. Φίλτρα 4. Διάφραγμα 5. Συμπυκνωτής δέσμης 6. Βάση 7. Αντικειμενικός φακός 8. Υψομετρική ρύθμιση του συμπυκνωτή δέσμης 9. Μηχανικός έλεγχος της βάσης 10. Κοινός έλεγχος εστίασης 11. Λεπτός έλεγχος εστίασης 12. Προσοφθάλμιοι φακοί. Διακριτική ικανότητα Σχήμα 3: Σύνθετο μικροσκόπιο Ένα βασικό χαρακτηριστικό του μικροσκοπίου είναι η διακριτική του ικανότητα. Ως όριο διακριτικής ικανότητας ορίζεται η ελάχιστη απόσταση μεταξύ δύο σημείων του παρατηρούμενου αντικειμένου που μπορούν να παρατηρηθούν ξεχωριστά. Το όριο

Συνεστιακή απεικονιστική μικροσκοπία 149 αυτό για το μάτι του ανθρώπου είναι περίπου 0.1mm ενώ για ένα καλής ποιότητας οπτικό μικροσκόπιο είναι περίπου 0.2 μm, δηλ. 500 φορές βελτιωμένη. Το όριο διακριτικής ικανότητας (l.r. : limit of resolution), δίνεται από τη σχέση (Abbe): 0.61 l.r. N.A. όπου: λ το μήκος κύματος του χρησιμοποιούμενου φωτός, Ν.Α. το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού (που καθορίζει τη γωνία εισόδου του φωτός σε αυτόν), Ν.Α. = n sinθ, n o δείκτης διάθλασης του μέσου που παρεμβάλλεται μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του δείγματος, και θ η γωνία που σχηματίζει μια φωτεινή ακτίνα που προέρχεται από το αντικείμενο και συλλέγεται από τον αντικειμενικό φακό, με τον άξονά του. Επειδή η διακριτική ικανότητα είναι περιορισμένη μια μεγέθυνση πέρα από κάποιο όριο (μέγιστη χρήσιμη μεγέθυνση), δεν παρέχει καμία επιπλέον πληροφορία. Μεγαλύτερη μεγέθυνση από το όριο αυτό θα έχει σαν αποτέλεσμα να ελαττωθεί η ποιότητα του ειδώλου. Έτσι στην πράξη δεν χρησιμοποιούνται μεγεθύνσεις μεγαλύτερες από 2500x. Η διακριτική ικανότητα μπορεί να βελτιωθεί και επομένως να χρησιμοποιηθούν και μεγαλύτερες μεγεθύνσεις ενεργώντας κατά τρεις τρόπους: 1. Ελαττώνοντας το λ, 2. Αυξάνοντας το θ, δηλαδή το άνοιγμα του αντικειμενικού φακού και 3. Αυξάνοντας το n με παρεμβολή μεταξύ αντικειμενικού και δείγματος ενός μέσου με δ.δ. > 1. Το μέσο που χρησιμοποιείται είναι συνήθως ένα ειδικό έλαιο. Στο τέλος του 19ου αιώνα χρησιμοποιώντας αντικειμενικούς φακούς με ειδικά έλαια, επιτεύχθηκε μία τιμή του N.A. 1.4, η οποία επιτρέπει στα οπτικά μικροσκόπια να ξεχωρίζουν δύο σημεία τα οποία απέχουν μεταξύ τους 0.2 μm. Με εξαίρεση ορισμένων ασυνήθιστων υγρών ως μέσα, ή με χρήση υπεριώδους πηγής φωτός, το όριο αυτό παραμένει μέχρι και σήμερα για τα οπτικά μικροσκόπια. Βάθος εστίασης Βάθος εστίασης (Depth of Field) ορίζουμε το μικρό πάχος του παρασκευάσματος στο οποίο μπορούμε να εστιάσουμε με το μικροσκόπιο. Το βάθος εστίασης εξαρτάται από τον αντικειμενικό φακό που χρησιμοποιούμε και καθώς το Ν.Α. αυξάνει, μειώνεται σημαντικά. D F N.A. Επίσης ένα άλλο χαρακτηριστικό είναι η διάμετρος του πεδίου, που είναι αντιστρόφως ανάλογη της ολικής μεγέθυνσης. 2

150 Άσκηση 8 Αντίθεση Η αντίθεση (contrast) του σχηματιζόμενου ειδώλου είναι ο αριθμός των αποχρώσεων στην εικόνα. Μία εικόνα υψηλής αντίθεσης έχει μόνο δύο αποχρώσεις, το άσπρο και το μαύρο. Ωστόσο περισσότερες αποχρώσεις, δηλαδή χαμηλότερη αντίθεση, δίνουν περισσότερη πληροφορία. Η αντίθεση ελέγχεται από το διάφραγμα του συναγωγού συστήματος (condenser iris). Αρκετές φορές είναι απαραίτητο να κλείνουμε λίγο το διάφραγμα, γεγονός που έχει σαν αποτέλεσμα να μειώνεται η διακριτική ικανότητα, αλλά να βελτιώνεται δραστικά η αντίθεση καθώς και το βάθος εστίασης. Η αντίθεση μπορεί να βελτιωθεί και με τη χρήση έγχρωμων φίλτρων. Συνήθως στην πράξη χρησιμοποιείται πράσινο φίλτρο (λ= 500-600nm). Η φωτεινότητα ρυθμίζεται από τη διάταξη μετασχηματιστή στη βάση του μικροσκοπίου, που ελαττώνει την ένταση του φωτός χωρίς να μεταβάλλεται όμως η χρωματική ποιότητα του φωτισμού. 8.2.2 Μικροσκόπιο φθορισμού Υπάρχουν δύο βασικοί τρόποι φωτισμού για τη μικροσκοπία φθορισμού: φωτισμός διέλευσης (transmitted light illumination) και προσπίπτων φωτισμός (incident illumination). Ο οπτικός δρόμος που ακολουθεί το φως της διέγερσης και για τους δύο τύπους φωτισμού φαίνεται στο Σχήμα 4. HL EF FD SF OC DS OBJ LL F P HC Σχήμα 4: Σχηματικό διάγραμμα ενός μικροσκοπίου φθορισμού με φωτισμό διέλευσης ( ) και προσπίπτων φωτισμό ( ). LL/HL = πηγές φωτός, EF/F = φίλτρο διέγερσης, FD = διάφραγμα πεδίου, DS = διχρωϊκό κάτοπτρο, SF = φίλτρο αποκοπής, HC = συγκεντρωτικός φακός, P = δείγμα, OBJ = αντικειμενικός φακός, OC = προσοφθάλμιοι. 8.2.2.1 Φωτισμός διέλευσης (transmitted light illumination) Στην περίπτωση του μικροσκοπίου με φωτισμό διέλευσης πλήρους πεδίου, η οπτική διάταξη είναι παρόμοια με αυτή ενός συμβατικού μικροσκοπίου φωτεινού πεδίου με την προσθήκη φίλτρων διέγερσης ανάμεσα στην φωτεινή πηγή και το συγκεντρωτικό φακό, καθώς και την προσθήκη φίλτρων εκπομπής ανάμεσα στον αντικειμενικό φακό και τη διάταξη καταγραφής (Σχήμα 5). Τα φίλτρα διέγερσης είναι φίλτρα ευρείας ζώνης επιλεγμένα κατάλληλα ώστε να επιτρέπουν τη διέλευση φωτός σε μήκη κύματος πολύ κοντά στο μέγιστο απορρόφησης του χρωμοφόρου φθορισμού, ενώ εμποδίζουν τη διέλευση μεγαλύτερων μηκών κύματος. Αντίθετα τα φίλτρα εκπομπής επιλέγονται έτσι ώστε να επιτρέπουν τη διέλευση του φωτός από το φάσμα εκπομπής και να εμποδίζουν τη διέλευση του φωτός διέγερσης.

Συνεστιακή απεικονιστική μικροσκοπία 151 Στα περισσότερα χρωμοφόρα φθορισμού, τα φάσματα διέγερσης και εκπομπής επικαλύπτονται και τα αντίστοιχα μέγιστα βρίσκονται πολύ κοντά. Καθώς το φως της διέγερσης είναι συνήθως πιο έντονο από τον εκπεμπόμενο φθορισμό, φίλτρα εύρους ζώνης με απότομα όρια αποκοπής πρέπει να χρησιμοποιηθούν ώστε να επιτευχθεί καλή αντίθεση στην εικόνα. Πρακτικά αυτό είναι δύσκολο να γίνει και για αυτό αναπτύχθηκαν άλλες τεχνικές για να εμποδίσουν το φως της διέγερσης να διέλθει στον αντικειμενικό φακό. προσοφθάλμιος φακός φίλτρο εκπομπής αντικειμενικός φακός δείγμα συγκεντρωτικός φακός φίλτρο διέγερσης κάτοπτρο Σχήμα 5: Διάγραμμα ενός μικροσκοπίου φθορισμού με φωτισμό διέλευσης πλήρους πεδίου. Η διάταξη αυτή επιτεύχθηκε με την προσθήκη ενός φίλτρου διέγερσης και ενός φίλτρου αποκοπής σε ένα συμβατικό οπτικό μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. Με την έντονη γραμμή απεικονίζεται το φως της διέγερσης και με τη λεπτή το εκπεμπόμενο φως του φθορισμού. Τα πλεονεκτήματα του φωτισμού διέλευσης πλήρους πεδίου είναι η απλή τροποποίηση ενός οπτικού μικροσκοπίου φωτεινού πεδίου με τη χρήση δύο φίλτρων και η δυνατότητα χρήσης αντικειμενικών φακών με μεγάλο αριθμητικό άνοιγμα. Σε αυτή τη διάταξη χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικοί φακοί: ένας συγκεντρωτικός ώστε να εστιάζει το φως της διέγερσης στο δείγμα και ένας αντικειμενικός για να συλλέγει τον εκπεμπόμενο φθορισμό. Για βέλτιστη παρατήρηση των φθοριζουσών εικόνων οι δύο αυτοί φακοί, που έχουν διαφορετικούς οπτικούς άξονες, πρέπει να είναι πολύ καλά ευθυγραμμισμένοι. Αυτό ωστόσο δεν είναι και τόσο εύκολο να ρυθμιστεί και να διατηρηθεί στη χρήση. Επίσης η εστίαση των ακτίνων διέγερσης από το συγκεντρωτικό φακό στο δείγμα και η εστίαση για την παρατήρηση του φθορισμού είναι δύο διαφορετικές διαδικασίες. Αυτά είναι και τα βασικότερα μειονέκτημα της μικροσκοπίας φθορισμού με φωτισμό διέλευσης πλήρους πεδίου. 8.2.2.2 Προσπίπτων φωτισμός (Incident Illumination or Epiillumination) Στα μικροσκόπια φθορισμού όπου η διέγερση γίνεται με προσπίπτων φωτισμό ένα σχηματικό διάγραμμα φαίνεται στο Σχήμα 6. Η εστίαση του φωτός στο δείγμα αλλά και η συλλογή του εκπεμπόμενου φθορισμού γίνεται μέσω του αντικειμενικού φακού του μικροσκοπίου. Το βασικότερο πλεονέκτημα αυτής της διάταξης είναι ότι ο αντικειμενικός φακός λειτουργεί τόσο ως συγκεντρωτικός αλλά και ως αντικειμενικός. Η εστίαση του αντικειμενικού στο δείγμα έχει ως αποτέλεσμα τη σωστή ευθυγράμμιση

152 Άσκηση 8 του μικροσκοπίου η οποία είναι ίδια τόσο για τη διέγερση όσο και για την παρατήρηση του φθορίζοντος φωτός. Το πεδίο του δείγματος το οποίο ακτινοβολείται είναι ίδιο με το παρατηρούμενο πεδίο. διχρωϊκό κάτοπτρο ακτινοβολία με μ.κ. μικρότερο της αποκοπής εκπομπή φθορισμού φίλτρο διέγερσης ακτινοβολία με μ.κ. μικρότερο της αποκοπής αντικειμενικός φακός δείγμα δείγμα (α) (β) Σχήμα 6: Διάγραμμα ενός μικροσκοπίου φθορισμού με προσπίπτον φωτισμό. α) Διέγερση του δείγματος χρησιμοποιώντας τον αντικειμενικό φακό σα συγκεντρωτικό. Ο χρωματικός διαχωριστής δέσμης ή διχρωϊκό κάτοπτρο έχει το χαρακτηριστικό ότι το φως κάτω από ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος κατώφλι, ανακλάται προς τον αντικειμενικό φακό και διεγείρει το δείγμα (έντονη μαύρη γραμμή). β) Η εκπομπή του φθορισμού από το δείγμα. Το εκπεμπόμενο φως (έντονη διακεκομμένη γραμμή) το οποίο εισέρχεται στον αντικειμενικό φακό με μήκος κύματος μεγαλύτερο από το επιλεγμένο κατώφλι δεν ανακλάται αλλά περνά προς τον ανιχνευτή. Τα μήκη κύματος κάτω από το επιλεγμένο κατώφλι σκεδάζονται και απομακρύνονται από τον ανιχνευτή Η οδήγηση του φωτός διέγερσης στο δείγμα γίνεται με τη βοήθεια ενός ειδικού κατόπτρου, του χρωματικού διαχωριστή δέσμης (chromatic beam splitter) ή διχρωϊκού κατόπτρου (dichroic mirror), το οποίο τοποθετείται ακριβώς πάνω από τον αντικειμενικό φακό. Οι καθρέπτες αυτοί έχουν μια επικάλυψη από ειδικό μείγμα, το οποίο έχει υψηλή ανάκλαση στις 45 στο φως με μήκος κύματος μικρότερο από ένα συγκεκριμένο ενώ επιτρέπει τη διάδοση των μεγαλύτερων μηκών κύματος. Συνεπώς το διχρωϊκό κάτοπτρο προκαλεί την ανάκλαση του διεγείροντος φωτός προς το δείγμα, αφού είναι μικρότερου μήκους κύματος, και επιτρέπει τη διέλευση του εκπεμπόμενου φθορισμού προς τους προσοφθάλμιους φακούς. Στη διάταξη του προσπίπτοντος φωτισμού ένα μικρό ποσό από το φως της διέγερσης μπορεί ανακλαστεί από το δείγμα ή τα διάφορα οπτικά μέρη στην κατεύθυνση των προσοφθάλμιων φακών. Το ανεπιθύμητο αυτό διεγείρον φως απομακρύνεται αποτελεσματικά από τον οπτικό δρόμο της παρατήρησης με τη βοήθεια του διχρωϊκού κατόπτρου, το οποίο το παρεμποδίζει να φθάσει τους προσοφθάλμιους φακούς. Καταρχήν λοιπόν το διχρωϊκό κάτοπτρο δρα τόσο ως φίλτρο διέγερσης όσο και ως φίλτρο αποκοπής (barrier). Στην πράξη όμως ένα επιπλέον φίλτρο αποκοπής χρησιμοποιείται ώστε να εξαλείψει έστω και μικρή ποσότητα ανεπιθύμητου διεγείροντος φωτός από το να φτάσει στους προσοφθάλμιους φακούς. Διχρωϊκά κάτοπτρα υπάρχουν για διαχωρισμό όλων των περιοχών του φάσματος από το UV (300nm) ως την περιοχή του υπερύθρου (700nm). Το διχρωϊκό κάτοπτρο σε συνδυασμό με φίλτρα συμβολής για τη διέγερση και την εκπομπή παρέχει πολύ καλή αντίθεση ακόμη και σε δείγματα με πολύ ασθενή φθορισμό

Συνεστιακή απεικονιστική μικροσκοπία 153 αφού αξιοποιείται όλο το άνοιγμα του αντικειμενικού φακού. Επιπλέον, ο φθορισμός από παχύτερα δείγματα είναι πιο φωτεινός συγκρινόμενος με τη μικροσκοπία φθορισμού διέλευσης, καθώς το φως της διέγερσης δεν πρέπει να περάσει μέσα από όλο το δείγμα. Ένα επίσης σημαντικό πλεονέκτημα του προσπίπτοντος φωτισμού είναι η δυνατότητα συνδυασμού του με συμβατικές διαδικασίες οπτικής μικροσκοπίας όπως η αντίθεση φάσης (phase contrast), η χρήση πολωμένου φωτός και η αντίθεση διαφορικής συμβολής (differential interference contrast). Μάλιστα πολλές φορές είναι χρήσιμο να συνδυάζεται η πληροφορία από τη μικροσκοπία φθορισμού ενός δείγματος με την πληροφορία για τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του που μας δίνουν οι προαναφερθείσες μέθοδοι οπτικής μικροσκοπίας. Η ευαισθησία αλλά και η συμβατότητα τους με τις άλλες μεθόδους διέλευσης έχουν καθιερώσει την τεχνική του προσπίπτοντος φωτισμού ως την επικρατέστερη διάταξη μικροσκοπίας φθορισμού. 8.2.3 Συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού Εξέλιξη της μικροσκοπίας φθορισμού αποτελεί η συνεστιακή μικροσκοπίας σάρωσης με laser (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM). Υπάρχουν πολλές πιθανές διατάξεις συνεστιακού μικροσκοπίου, ωστόσο η πιο αποτελεσματική είναι αυτή που χρησιμοποιεί προσπίπτοντα φωτισμό, καθώς χρησιμοποιεί τον ίδιο φακό σα συγκεντρωτικό και αντικειμενικό και δε χρειάζεται καμία επιπλέον ευθυγράμμιση των δύο αυτών φακών. Η βασική αρχή της μικροσκοπίας σάρωσης (Σχήμα 7) είναι η διέγερση φθορισμού κάθε φορά από ένα σημείο του δείγματος, με τη χρήση laser. Με την ακτινοβόληση ενός σημείου κάθε φορά, η ένταση της ακτινοβόλησης μειώνεται απότομα, πάνω και κάτω από το επίπεδο εστίασης, καθώς η δέσμη του φωτός συγκλίνει ή αποκλίνει. Έτσι μειώνεται η διέγερση του φθορισμού των «αντικειμένων» που βρίσκονται εκτός του εξεταζόμενου εστιακού επιπέδου. Εάν το σημείο αυτό είναι αρκετά μικρό, στα όρια τα οποία θέτονται από την περίθλαση, τότε η διακριτική ικανότητα του συνεστιακού μικροσκοπίου είναι σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή του συμβατικού μικροσκοπίου. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός περνά πίσω μέσω του διχρωικού κατόπτρου και στη συνέχεια μέσω μιας ίριδας η οποία βρίσκεται σε συζευγμένο εστιακό επίπεδο με το δείγμα. Οποιοδήποτε φως το οποίο προέρχεται από σημείο που δεν ανήκει στο εστιακό επίπεδο εμποδίζεται από την ίριδα προσφέροντας έτσι επιπλέον εξασθένηση της συνεισφοράς του μη εστιασμένου φωτός (οπτικός θόρυβος). Τελικά το φως το οποίο περνά από την ίριδα ανιχνεύεται από έναν φωτοανιχνευτή.

154 Άσκηση 8 Σχήμα 7: Βασική αρχή συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με laser. Συνοπτικά ένα απεικονιστικό σύστημα συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού επιτυγχάνει την απόρριψη του μη εστιασμένου φωτός με δύο τεχνικές: Με την ακτινοβόληση ενός σημείου του δείγματος κάθε φορά με μια εστιασμένη δέσμη και Με τη χρήση ίριδας η οποία εμποδίζει το φως που προέρχεται από μη εστιασμένα επίπεδα να φτάσει στο φωτοανιχνευτή. Το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με laser έρχεται να λύσει ένα από τα βασικότερα προβλήματα της συμβατικής μικροσκοπίας φθορισμού, όπου το δείγμα ακτινοβολείται ολόκληρο από τη δέσμη διέγερσης και έτσι όλο το δείγμα φθορίζει συγχρόνως. Φυσικά η μεγαλύτερη ένταση του διεγείροντος φωτός είναι στο εστιακό επίπεδο του φακού αλλά και τα υπόλοιπα μέρη του δείγματος δέχονται ένα μέρος από το φως αυτό και φθορίζουν. Αυτό συνεισφέρει σε ένα ασαφές υπόβαθρο στην τελική εικόνα (οπτικός θόρυβος). Προσθέτοντας την ίριδα το πρόβλημα αυτό λύνεται. Επειδή το εστιακό σημείο του αντικειμενικού φακού του μικροσκοπίου δημιουργεί την εικόνα εκεί όπου είναι η ίριδα τα δύο αυτά σημεία ονομάζονται συζευγμένα. Το βασικό χαρακτηριστικό εδώ είναι ότι η ίριδα ανίχνευσης απορρίπτει το φως πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο. Επομένως εάν η ίριδα μεγαλώσει, το βάθος πεδίου θα αυξηθεί. Στη συνεστιακή μικροσκοπία ωστόσο, το ζητούμενο είναι να μειωθεί το μέγεθος της ίριδας, ώστε να ελαχιστοποιηθεί το βάθος πεδίου, ενώ παράλληλα να συλλέγονται όλα τα εκπεμπόμενα φωτόνια.

Συνεστιακή απεικονιστική μικροσκοπία 155 Σε ένα σύστημα συνεστιακής σάρωσης σημείου η εικόνα του αντικειμένου δεν παράγεται κατευθείαν. Η απεικόνιση μιας περιοχής στο δείγμα και όχι ενός μόνο σημείου πραγματοποιείται με τη σάρωση του δείγματος και τη συλλογή του φωτός από όλα τα σημεία του οπτικού πεδίου. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί είτε μετακινώντας το δείγμα και διατηρώντας σταθερή την ακτίνα του laser (stage scanning), είτε μετακινώντας τη δέσμη του laser κατά μήκος του δείγματος (beam scanning) με τη βοήθεια γαλβανομετρικών κατόπτρων. Υπάρχει ακόμη η δυνατότητα για ανίχνευση δύο διαφορετικών μηκών κύματος φθορισμού με τη χρήση κατάλληλου διχρωικού κατόπτρου το οποίο να τα διαχωρίζει και να τα οδηγεί σε δύο διαφορετικούς φωτοπολλαπλασιαστές (Σχήμα 8). Σχήμα 8: Ανίχνευση δύο διαφορετικών σημάτων φθορισμού ταυτόχρονα από το ίδιο δείγμα με τη χρήση του συνεστιακού μικροσκοπίου φθορισμού σάρωσης με laser. Το εστιακό επίπεδο επιλέγεται μέσω ενός κινητήρα υψηλής ακρίβειας, ελεγχόμενο από υπολογιστή, μετακινώντας την αντικειμενοφόρο πλάκα. Κατά αυτόν τον τρόπο, μπορούμε να πάρουμε μια ακολουθία από διδιάστατες εικόνες σε διαφορετικό βάθος στο δείγμα, οι οποίες μας δίνουν μια τρισδιάστατη απεικόνιση του αντικειμένου. Σημαντικό στοιχείο εδώ είναι ο μικροκινητήρας ο οποίος επιτρέπει την ακριβή γνώση του βάθους μέσα στο δείγμα στο οποίο βρίσκεται το απεικονιζόμενο επίπεδο. Ο μικροκινητήρας ελέγχει τα διαστήματα ανάμεσα στα διαδοχικά επίπεδα και ο υπολογιστής είναι υπεύθυνος για την καταγραφή τους. Στα σύγχρονα μικροσκόπια σάρωσης με laser η ευθυγράμμιση των οπτικών, η επιλογή του μήκους κύματος και της ισχύος του laser, η τοποθέτηση των φίλτρων, οι κινήσεις της αντικειμενοφόρου πλάκας και των γαλβανομετρικών κατόπτρων ελέγχονται όλα από υπολογιστή (Σχήμα 9).

156 Άσκηση 8 Κ εφαλή σάρωσης Υπολογιστής φωτοπολλαπλασιαστής ίριδα Αποθήκευση frames επίδειξη video εκτυπωτής φίλτρο αποκοπής SYNC 3-D ανακατασκευή Laser Διχρωϊκό κάτοπτρο αποθήκευση Μονάδα σάρωσης x-y SYNC έλεγχος σάρωσης αντικειμενικός φακός μεγάλου αριθμητικού ανοίγματος εστίαση μικροκινητήρας για κίνηση κατά τον z άξονα κίνηση αντικειμενοφόρου πλάκας στο xy επίπεδο διάφραγμα ίριδα ισχύς laser κέρδος φωτοπολλαπλασιαστή φίλτρα Σχήμα 9: Διάγραμμα ροής πληροφορίας σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με laser.

Συνεστιακή απεικονιστική μικροσκοπία 157 8.2.3.1 Τα πλεονεκτήματα της συνεστιακής μικροσκοπίας Ένα ψηφιακό απεικονιστικό σύστημα με τη χρήση CCD camera μπορεί να καταγράψει μεμονομένα κύτταρα, κυτταρικό πληθυσμό ή κύτταρα σε μία λεπτή τομή ενός ιστού. Υποκυττάριες περιοχές μπορούν να απεικονιστούν με διακριτική ικανότητα μέχρι 0.3-0.4 μm στο (x,y) επίπεδο ενώ κατά τον z άξονα η διακριτική ικανότητα είναι περιορισμένη. Ωστόσο είναι δυνατή η απόρριψη του μη εστιασμένου φωτός με τη χρήση αλγορίθμων deconvolution. Απεικόνιση χρωμοφόρων με διπλή διέγερση είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί με τη χρήση μίας camera ενώ καταγραφή διπλής εκπομπής απαιτεί τη χρήση δύο. Τέλος, επιτρέπει την απεικόνιση χωρικής κατανομής στο δείγμα καθώς και απότομων αλλαγών. Από τα βασικά μειονεκτήματα ενός τέτοιου συστήματος είναι ότι η λήψη εικόνων γίνεται κάθε 1-2 s και απαιτούνται ακριβότερα συστήματα ώστε η λήψη να μπορεί να γίνει σε ρυθμούς video. Ακόμη η δειγματοληψία πρέπει να γίνει πολύ γρήγορα ώστε να αποφευχθεί η φωτοκαταστροφή. Αντίθετα όμως απαιτείται ολοκλήρωση του σήματος για την συλλογή ενός καλού σήματος λόγου προς θόρυβο, αυξάνοντας έτσι το χρόνο της δειγματοληψίας. Τέλος σε ένα τέτοιο σύστημα η αφαίρεση του σήματος του αυτοφθορισμού είναι αρκετά δύσκολη. Αντίθετα ένα σύστημα συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με laser μπορεί εκτός από μεμονωμένα κύτταρα να καταγράψει και κύτταρα σε ιστό χωρίς αυτός να έχει κοπεί σε λεπτές τομές, διαδικασία η οποία είναι δύσκολη και όχι πάντα επιτυχής. Η διακριτική ικανότητα είναι παρόμοια στο (x,y) επίπεδο και κατά τον z άξονα (μέγιστη 0.2 x 0.2 x 0.6μm, τυπική 0.4 x 0.4 x 1.2 μm).η ταχύτερη χρονική διακριτική ικανότητα εξαρτάται από το όργανο που χρησιμοποιείται και φτάνει για σάρωση γραμμής τα ms, για σάρωση σε δύο διαστάσεις από ms μέχρι s και για σάρωση τριών διαστάσεων από s μέχρι min. Απεικόνιση χρωμοφόρων τόσο με διπλή διέγερση όσο και με διπλή εκπομπή είναι εύκολο να πραγματοποιηθεί. Αντίθετα περιορίζεται κυρίως ως προς τη διέγερση από τα μήκη κύματος των διαθέσιμων laser. Συνοπτικά, τα βασικότερα πλεονεκτήματα της συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης με laser σε σχέση με την συμβατική μικροσκοπία φθορισμού είναι τα εξής: Αύξηση της διακριτικής ικανότητας. Στη μικροσκοπία φθορισμού η πληροφορία συλλέγεται από μια ευρεία περιοχή και για αυτό το φως είναι απεστιασμένο, μειώνοντας έτσι τη διακριτική ικανότητα. Αντίθετα στη συνεστιακή μικροσκοπία τα φωτόνια συλλέγονται μόνο από μια μικρή περιοχή ενδιαφέροντος, αυξάνοντας έτσι τη διακριτική ικανότητα. Η ασάφεια που οφείλεται στον προσδιορισμό της θέσης στον z-άξονα βελτιώνεται. Επειδή το συνεστιακό μικροσκόπιο απορρίπτει το μη εστιασμένο φως, ένας μεγάλος αριθμός γεωμετρικών τεχνουργημάτων (artifacts) εξαλείφονται. Ο οπτικός θόρυβος λόγω του απευθείας φωτισμού εξαλείφεται. Η συνεστιακή μικροσκοπία είναι ενδογενώς μη ευαίσθητη στο απευθείας φως. Τα πειράματα μπορούν να πραγματοποιηθούν σε κανονικά φωτισμένο δωμάτιο. Στη συμβατική μικροσκοπία ειδική μέριμνα πρέπει να ληφθεί ώστε ο απευθείας φωτισμός να μη φτάσει στους αντικειμενικούς φακούς, δεδομένου και του ασθενούς σήματος των χρωμοφόρων φθορισμού που χρησιμοποιούνται. Ο οπτικός θόρυβος λόγω του μέσου μειώνεται. Η συνεστιακή μικροσκοπία δεν επηρεάζεται από το φθορισμό του μέσου που προέρχεται για παράδειγμα από την παραμένουσα συγκέντρωση χρωμοφόρου στο μέσο κατά τη διαδικασία επώασης των κυττάρων, ή βγήκε με παθητική διάχυση από τα κύτταρα ή/και

158 Άσκηση 8 από τις φθορίζουσες ουσίες που περιέχει το ίδιο το θρεπτικό υλικό των κυττάρων. Στη συμβατική μικροσκοπία, απαιτείται ιδιαίτερη προσπάθεια ώστε να μειωθούν τα σήματα από τον οπτικό θόρυβο. Μείωση της άλω. Στη συμβατική μικροσκοπία οι εικόνες εμφανίζουν άλω και έτσι τα όρια των κυττάρων είναι δύσκολο να διακριθούν εξαιτίας του μη εστιασμένου φωτός πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο. 8.3. Ιχνηθέτες φθορισμού (Fluorescent probes) Ένα χρωμοφόρο ή ιχνηθέτης φθορισμού για ένα βιολογικό σύστημα, είναι ένα μικρό μόριο το οποίο παρέχει πληροφορίες για την περιορισμένη περιοχή στην οποία βρίσκεται. Έτσι οι μετρήσεις του φθορισμού σχετίζονται είτε με τη δομή του συστήματος το οποίο μελετάται, είτε με την απόκριση του σε αλλαγές που οφείλονται στην αλληλεπίδραση του με το περιβάλλον. Τα χρωμοφόρα φθορισμού είναι οργανικά μόρια τα οποία παρουσιάζουν είτε επιλεκτικότητα σε συστατικά του κυττάρου είτε είναι ευαίσθητα σε ενδοκυττάριες περιβαλλοντικές αλλαγές (Πίνακας 1). Οι ουσίες αυτές εισέρχονται στο κύτταρο είτε με μικροέγχυση, είτε με μια χημική μορφή τους η οποία να μπορεί να διαπερνά τη κυτταρική μεμβράνη. Η μικροέγχυση, από χημικής πλευράς, μπορεί να θεωρηθεί πιο εύκολη αλλά απαιτεί λεπτούς χειρισμούς και ακριβή υποδομή. Έτσι η συνήθης μέθοδος είναι η εισαγωγή του χρωμοφόρου με τη μορφή του ακετοξυμεθυλεστέρα του (ΑΜ), ο οποίος μπορεί να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη. Όταν ο εστέρας βρεθεί στο εσωτερικό του κυττάρου, υδρολύεται από τις εστεράσες και το χρωμοφόρο μετατρέπεται στην ελεύθερη μορφή του, η οποία είναι ικανή να δεσμευθεί από τις αντίστοιχες δομές ή τα ιόντα ανάλογα με την επιλεκτικότητα του. Τα χρωμοφόρα φθορισμού χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τα σταθερού μήκους κύματος και τα μεταβλητού μήκους κύματος. Τα πρώτα κατά τη δέσμευση των ιόντων μεταβάλλουν την ένταση του φθορισμού τους ενώ τα δεύτερα μπορούν να μεταβάλλουν τόσο την ένταση του φθορισμού τους όσο και το μήκος κύματος στο οποίο εμφανίζουν τη μέγιστη εκπομπή ή απορρόφηση. 8.3.1 Διέγερση και εκπομπή Τα χρωμοφόρα φθορισμού έχουν χαρακτηριστικά φάσματα διέγερσης και φθορισμού. Το χρωμοφόρο βρίσκεται αρχικά στη βασική ηλεκτρονική κατάσταση. Όταν προσπέσει σε αυτό φως το απορροφά και μεταβαίνει στη διεγερμένη κατάσταση σαν αποτέλεσμα της ηλεκτρονιακής μετάβασης σε υψηλότερη ενεργειακά τροχιά. Αποδιεγειρόμενο το μόριο επανέρχεται στη βασική του κατάσταση εκπέμποντας ένα τμήμα της ενέργειας που πλέον διαθέτει με τη μορφή φωτός το οποίο ονομάζεται φθορισμός. Ένα μέρος της αρχικής ενέργειας χάνεται πριν την εκπομπή του φθορισμού και για αυτό το εκπεμπόμενο φως είναι σε μεγαλύτερο μήκος κύματος από το μήκος κύματος διέγερσης. Το φάσμα εκπομπής του χρωμοφόρου είναι πάντα μετατοπισμένο προς τα μεγαλύτερα μήκη κύματος σχετικά με το φάσμα απορρόφησης. Η μετατόπιση αυτή κάνει δυνατό το διαχωρισμό του διεγείροντος από το εκπεμπόμενο φως με τη χρήση οπτικών φίλτρων. Το εκπεμπόμενο φως μπορεί στη συνέχεια να μετρηθεί. Η διαφορά ανάμεσα στα μέγιστα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής του χρωμοφόρου καλείται μετατόπιση Stokes (Πίνακας 1). Ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για την απορρόφηση είναι περίπου 10-15 s, ενώ ο χρόνος ζωής του φθορισμού είναι περίπου 10-8 s.

Συνεστιακή απεικόνιση κυττάρων 159 Πίνακας 1: Μέγιστα Διέγερσης και Εκπομπής Ιχνηθετών Φθορισμού και οι Αντίστοιχες Κυτταρικές Λειτουργίες που καταγράφουν Ιχνηθέτες Abs (nm) Em Κυτταρική λειτουργία BCECF-AM 488 535 phi JC-1 475 510 Δυναμικό μιτοχονδρίων Fluo-3 488 530 Ca 2+ Acridine Orange 500 526 Βαθμίδωση πρωτονίων H2DCFDA 488 520 Ενεργές ρίζες (ROS) Propidium Iodide 493 637 Κυτταρική βιωσιμότητα Υπάρχουν χρωμοφόρα τα οποία απαιτούν διέγερση στην περιοχή του UV ώστε να παράγουν φθορισμού στην ορατή περιοχή του φάσματος. Αυτό απαιτεί λάμπες που εκπέμπουν στο UV και ιδιαίτερη προσοχή από το προσωπικό. Επίσης στην περιοχή αυτή θα υπάρχει και πρόβλημα αυτοφθορισμού από φλαβίνες, φλαβοπρωτεΐνες και το NADPH. Για τους λόγους αυτούς προτιμούνται χρωμοφόρα φθορισμού με διέγερση στην περιοχή του ορατού και του υπέρυθρου. 8.3.2 Γραμμικότητα Η ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του χρωμοφόρου στο συγκεκριμένο σημείο όταν το φως της διέγερσης έχει σταθερό μήκος κύματος και ένταση. Το σήμα του φθορισμού γίνεται μη γραμμικό σε πολύ μεγάλες συγκεντρώσεις χρωμοφόρου. 8.3.3 Φωτεινότητα Τα διάφορα χρωμοφόρα διαφέρουν τόσο ως προς την επιλεκτικότητα τους στις διάφορες κυτταρικές δομές και λειτουργίες αλλά και στη φωτεινότητα τους. Η ιδιότητα αυτή των χρωμοφόρων είναι σημαντική επειδή ένα χρωμοφόρο με μικρή φωτεινότητα είναι λιγότερο ευαίσθητο από ένα φωτεινό χρωμοφόρο. Η φωτεινότητα ενός χρωμοφόρου εξαρτάται από δύο χαρακτηριστικά του χρωμοφόρου: - Το συντελεστή απορρόφησης (extinction coefficient), ε που εκφράζει την πιθανότητα της απορρόφησης και - Τη κβαντική του απόδοση (quantum yield), φ, δηλαδή το λόγο των κβάντα που εκπέμφθηκαν προς αυτά τα οποία απορροφήθηκαν, που εκφράζει την ικανότητα του χρωμοφόρου να μετατρέπει το φως που απορροφά σε φθορισμό. Η ένταση του φθορισμού δηλαδή η φωτεινότητα καθορίζεται από το γινόμενο των ε και φ.

160 Άσκηση 8 8.3.4 Επιδράσεις περιβάλλοντος Η βασικότερη από τις επιδράσεις του περιβάλλοντος είναι η φωτοκαταστροφή, η οποία προκαλείται από παρατεταμένο φωτισμό του χρωμοφόρου με το μήκος κύματος διέγερσης του. Αποτέλεσμα της φωτοκαταστροφής είναι η πτώση στην ένταση του φθορισμού του χρωμοφόρου. Η φωτοκαταστροφή οφείλεται στο γεγονός ότι η διεγερμένη κατάσταση ενός μορίου είναι γενικά πολύ πιο ενεργή χημικά από τη βασική του κατάσταση. Η πτώση αυτή μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένα συμπεράσματα κατά την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. Κατά τη φωτοκαταστροφή του μορίου παράγονται και διάφορα τοξικά προϊόντα τα οποία μπορούν να επηρεάσουν τη λειτουργία των ζωντανών βιολογικών συστημάτων.h φωτοκαταστροφή του ιχνηθέτη μπορεί να αποφευχθεί, χαμηλώνοντας την ένταση του φωτισμού κατά τη διέγερση του ιχνηθέτη και χρησιμοποιώντας ευαίσθητους ανιχνευτές για τον εκπεμπόμενου φθορισμού. Ωστόσο ειδικά για ζωντανά κύτταρα, απαιτείται, όχι μόνο να μην αλλοιώνονται τα χαρακτηριστικά των χρωμοφόρων φθορισμού αλλά και να μην προκαλούνται προβλήματα επιβίωσης ή αλλοίωσης των χαρακτηριστικών των υπό μελέτη κυττάρων από αυτούς. 8.4. Aνίχνευση εικόνας 8.4.1 Φωτοπολλαπλασιαστής Ο φωτοπολλαπλασιαστής είναι ένας φυσικός ενισχυτής ο οποίος μετατρέπει την φωτεινή ακτινοβολία σε παλμούς ρεύματος. Αποτελείται από την κάθοδο, την άνοδο και ανάμεσα τους ηλεκτρόδια τα οποία ονομάζονται δύνοδοι και η μία επιφάνεια τους είναι φωτοευαίσθητη με επικάλυψη από φώσφορο. Η κάθοδος συνήθως έχει αρνητικό δυναμικό ενώ οι δύνοδοι εμφανίζουν συνεχώς αυξανόμενο δυναμικό και τελικά η άνοδος έχει δυναμικό μηδέν. Το ηλεκτρικό αυτό πεδίο εστιάζει τη δέσμη των e από τη μία δύνοδο στη άλλη. Σχήμα 10: Σχηματική παράσταση φωτοπολλαπλασιαστή. Όταν ένα φωτόνιο προσπέσει στην φωτοευαίσθητη φωτοκάθοδο ηλεκτρόνια ξεπηδούν από το φώσφορο. Στη συνέχεια τα φωτοηλεκτρόνια αυτά επιταχύνονται λόγω της διαφοράς δυναμικού και προσκρούουν στην πρώτη δύνοδο. Εκεί προκαλούν εκπομπή δευτερογενών ηλεκτρονίων τα οποία με τη σειρά τους εστιάζονται στη δεύτερη δύνοδο

Συνεστιακή απεικόνιση κυττάρων 161 όπου και εκεί παράγουν επιπλέον δευτερογενή ηλεκτρόνια. Αυτό συμβαίνει μέχρι να φτάσουν στην άνοδο ως ένα μετρήσιμο πλέον ρεύμα. Ο φωτοπολλαπλασιαστής παράγει έναν παλμό εξόδου για κάθε φωτόνιο το οποίο προσπίπτει στην φωτοκάθοδο. Εάν για κάθε ηλεκτρόνιο που προσπίπτει στη δύνοδο μ εκπέμπονται gμ ηλεκτρόνια, τότε για n δυνόδους η συνολική ενίσχυση θα είναι: και εάν g1=g2= =gn τότε: G g1 g2 g3 G g n Η τιμή της απολαβής g εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού που εφαρμόζεται μεταξύ δύο διαδοχικών δυνόδων και αυξάνεται με την αύξηση της διαφοράς αυτής. g n 8.4.2 Τα χαρακτηριστικά του φωτοπολλαπλασιαστή Τα βασικά χαρακτηριστικά ενός φωτοπολλαπλασιαστή είναι τα εξής: 1. Η σταθερότητα του συντελεστή ενίσχυσης g που ισοδυναμεί με σταθερότητα στην ολική ενίσχυση. Εάν υπάρχει μία διακύμανση στην απολαβή της κάθε βαθμίδας Δg, τότε η διακύμανση στην ολική απολαβή είναι ΔG Δg n G g Η σταθερότητα αυτή είναι πολύ σημαντική καθώς ισοδυναμεί με σταθερότητα του ύψους του παλμού εξόδου ανά φωτόνιο ορισμένης ενέργειας που πέφτει στη φωτοκάθοδο. Η διακύμανση αυτή μπορεί να ελαττωθεί με την αύξηση της διαφοράς δυναμικού μεταξύ δύο διαδοχικών δυνόδων. 2. Η κβαντική απόδοση (quantum efficiency) της φωτοκαθόδου, η οποία εκφράζει το μέσο αριθμό ηλεκτρονίων τα οποία εκπέμπονται φωτοηλεκτρικά από τη φωτοκάθοδο, ανά φωτόνιο που προσπίπτει σε αυτή. Η κβαντική απόδοση του φωτοπολλαπλασιαστή εξαρτάται από το μήκος κύματος του προσπίπτοντος φωτονίου. 3. Το transit time spread (TTS) το οποίο εκφράζει τη διακύμανση στον παλμό εξόδου του φωτοπολλαπλασιαστή όταν φωτίζεται από συνάρτηση δέλτα. Το TTS είναι ένας σημαντικός παράγοντας ειδικά όταν θέλουμε καλή χρονική διακριτική ικανότητα. Εξαρτάται από τη γεωμετρία των δυνόδων και από την εφαρμοσμένη τάση. 4. Η τάση η οποία εφαρμόζεται είναι πολύ σημαντική καθώς καθορίζει τόσο τη σταθερότητα στην ενίσχυση όσο και στη χρονική απόκριση του φωτοπολλαπλασιαστή. Η τάση αυτή φτάνει συνήθως μέχρι τα 1000 V. O χρήστης πρέπει να εξασφαλίσει ότι η τάση στα άκρα του είναι αρκετή για να τον διατηρήσει σε γραμμική περιοχή. Αυτή η τιμή εξαρτάται από τον πολλαπλασιαστή αλλά είναι συνήθως 400-500 V. Σε πολλά όργανα ο χρήστης δεν χειρίζεται άμεσα την τάση, οπότε αυτό δεν δημιουργεί σημαντικό πρόβλημα. Όσο η τάση στον φωτοπολλαπλασιαστή αυξάνει, το ίδιο συμβαίνει με το σήμα, όπως και με το θόρυβο (η αύξηση δεν είναι γραμμική). Σε υψηλές τάσεις, ο θόρυβος από ένα φωτοπολλαπλασιαστή μπορεί να γίνει σημαντικός.

162 Άσκηση 8 8.4.3 Μέθοδοι «ανάγνωσης» του σήματος του φωτοπολλαπλασιαστή Οι περισσότερες διατάξεις μετατροπής που συνήθως χρησιμοποιούνται παράγουν αναλογικά σήματα τάσης τα οποία είναι ανάλογα με την μετρούμενη ποσότητα (π.χ. τάση, θερμοκρασία). Αντίθετα ο φωτοπολλαπλασιαστής παράγει μία σειρά τυχαίων και μικρής διάρκειας παλμών ρεύματος (50-100 ns) των οποίων η μέση συχνότητα, παρά το πλάτος τους, αποτελεί μέτρο του προσπίπτοντος φωτός. Άμεσο αποτέλεσμα αυτού είναι ότι ο φωτοπολλαπλασιαστής δεν μπορεί να δώσει στιγμιαίες μετρήσεις για το επίπεδο του φωτός αλλά οι παλμοί των φωτονίων θα πρέπει να συσσωρευτούν για μία συγκεκριμένη χρονική περίοδο. Υπάρχουν δύο προσεγγίσεις για τη μετατροπή των παλμών του φωτοπολλαπλασιαστή σε ένα σταθερό σήμα που να αντιπροσωπεύει το επίπεδο του φωτός. Στη μέθοδο μέτρησης φωτονίων (photon counting), οι παλμοί του ρεύματος της ανόδου οδηγούνται αρχικά σε έναν προενισχυτή ο οποίος μετατρέπει το σήμα σε παλμό τάσης. Ο παλμός αυτός με τη σειρά του οδηγείται σε έναν διευκρινιστή και μας δίνει έναν τετραγωνικό ψηφιακό παλμό, εάν ο παλμός εισόδου ξεπερνά ένα κατώφλι τάσης. Η ύπαρξη του διευκρινιστή είναι απαραίτητη ώστε να μπορούν να ξεχωριστούν οι παλμοί που οφείλονται σε φωτόνια από αυτούς που προέρχονται από θόρυβο. Στη συνέχεια ο τετραγωνικός παλμός εφαρμόζεται σε έναν ψηφιακό μετρητή και κάθε φορά τον αυξάνει κατά μία μονάδα. Ο μετρητής συσσωρεύει μετρήσεις για ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα και το μέσο ποσό του φωτός εκφράζεται ως ο αριθμός των μετρήσεων μέσα στο διάστημα αυτό. Στη μέθοδο ολοκλήρωσης του παλμού εξόδου του φωτοπολλαπλασιαστή σκοπός είναι να επιτευχθεί η μετατροπή της συχνότητας των παλμών σε τάση. Οι παλμοί ρεύματος από την έξοδο του φωτοπολλαπλασιαστή φορτίζουν τον πυκνωτή του ολοκληρωτή. Καθώς το φορτίο από κάθε παλμό αθροίζεται, ο παλμός εξόδου του ολοκληρωτή αυξάνει. Η αντίσταση R, παράλληλα με τον πυκνωτή, προκαλεί τη διαφυγή του φορτίου με μια σταθερά χρόνου τ=rc. Επομένως ο ολοκληρωτής παράγει μια μέση τάση εξόδου η οποία είναι ανάλογη με τη διακύμανση ανάμεσα στο ρυθμό με τον οποίο ο φωτοπολλαπλασιαστής παράγει τους παλμούς και με τη σταθερά χρόνου του ολοκληρωτή. Γενικότερα η σταθερά χρόνου είναι ισοδύναμη με τα χρονικά διαστήματα του μετρητή στην μέθοδο μέτρησης φωτονίων. Σχήμα 11: Μέθοδοι μέτρησης του φωτός με έναν φωτοπολλαπλασιαστή. Α) Μέθοδος μέτρησης φωτονίων (photon counting). B) Μέθοδος ολοκλήρωσης του παλμού εξόδου του φωτοπολλαπλασιαστή (analogue integrator)

Συνεστιακή απεικόνιση κυττάρων 163 Η μέθοδος μέτρησης φωτονίων έχει έναν αριθμό τεχνικών πλεονεκτημάτων τόσο ως προς την ευαισθησία αλλά και ως προς το δυναμικό εύρος αλλά και την ελάττωση του θορύβου. Εκτός από του διακριτούς παλμούς ρεύματος που παράγουν τα φωτόνια, ο φωτοπολλαπλασιαστής παράγει ένα ρεύμα θορύβου το οποίο είναι ανεξάρτητο από την είσοδο του φωτός σε αυτόν και καλείται dark current. Αυτό το ρεύμα συνεισφέρει στο μετρούμενο σήμα με τη μέθοδο της ολοκλήρωσης. Σε πολύ χαμηλά επίπεδα φωτός, όπου μόνο λίγα φωτόνια συλλέγονται, η ολοκλήρωση του ρεύματος αυτού υπερνικά το σήμα του φωτός. Αντίθετα η μέθοδος μέτρησης των φωτονίων είναι σχεδόν ανεπηρέαστη από το dark current καθώς με το διευκρινιστή μπορεί να απορρίπτει παλμούς που οφείλονται στο θόρυβο. Η μέθοδος μέτρησης φωτονίων έχει επίσης πολύ μεγαλύτερο δυναμικό εύρος σε σχέση με τη μέθοδο ολοκλήρωσης. Ένας μετρητής ο οποίος χρησιμοποιεί 24 bit για παράδειγμα, μπορεί να χειριστεί ένα δυναμικό εύρος από 0-16777216 φωτόνια ανά περίοδο μέτρησης. Από την άλλη μεριά η έξοδος του ολοκληρωτή είναι ένα αναλογικό σήμα τάσης με εύρος από 0-10V. Κατά την ψηφιοποίηση αυτού του σήματος, για μέτρηση σε έναν υπολογιστή, με χρήση μετατροπέα αναλογικού σε ψηφιακό με 12 bit η διακριτική ικανότητα είναι από 0-4095 σημεία. Ωστόσο, η απόδοση του ολοκληρωτή είναι ικανοποιητική για πολλές εφαρμογές όπου δεν απαιτείται το πλήρες δυναμικό εύρος του μετρητή φωτονίων. Προς το παρόν τόσο η μέθοδος μέτρησης φωτονίων όσο και η μέθοδος ολοκλήρωσης του παλμού εξόδου χρησιμοποιούνται ευρέως σε συστήματα μέτρησης του φθορισμού.