ΑΣΚΗΣH ΣΩΜΑΤΙΟ BARR ΧΟΝΔΡΟΥ ΒΑΣΙΛΙΚΗ MSc, Υποψήφια διδάκτωρ Μάϊος, 2017
ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Σύγκριση των επιθηλιακών κυττάρων της παρειάς μεταξύ θηλυκών κι αρσενικών ατόμων ανθρώπου-μικροσκοπική παρατήρηση του σωματίου barr στα θηλυκά άτομα Κατανόηση του φαινομένου του μωσαϊκισμού 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Γενικά Τα φυσιολογικά θηλυκά άτομα των θηλαστικών έχουν 2 Χ χρωμοσώματα στον πυρήνα των κυττάρων τους ενώ τα αρσενικά άτομα έχουν ένα Χ και ένα Υ χρωμόσωμα. Προκειμένου και τα δύο φύλα να έχουν τον ίδιο αριθμό ενεργών αντιγράφων των φυλοσύνδετων γονιδίων τους, το ένα Χ χρωμόσωμα στα σωματικά κύτταρα των θηλυκών ατόμων απενεργοποιείται (αντιστάθμιση γονιδιακής δόσης). Στο χρωμόσωμα Υ υπάρχουν ελάχιστα γονίδια που στην πλειοψηφία τους είναι συνδεδεμένα με την εμφάνιση των αρσενικών χαρακτηριστικών. Εικόνα 1: Αντιστάθμιση γονιδιακής δόσης στον άνθρωπο http://genetics.thetech.org). (προσαρμογή από Η πρώτη κυτταρολογική ένδειξη για την απενεργοποίηση του ενός Χ χρωμοσώματος προήλθε από την ανακάλυψη του σωματίου barr. To 1949, οι Μ. Barr και Ε. G. Bertram παρατήρησαν ότι στο στάδιο της μεσόφασης, τα νευρικά κύτταρα της γάτας παρουσίαζαν μια φυλετική διαφορά.
Συγκεκριμένα, οι πυρήνες των κυττάρων των θηλυκών ατόμων, μετά από χρώση, εμφάνιζαν μια σκούρα, έντονα βαμμένη κηλίδα κοντά στην πυρηνική τους μεμβράνη, η οποία απουσίαζε από τους πυρήνες των αρσενικών ατόμων. Η κηλίδα αυτή ονομάστηκε σωμάτιο barr ή αλλιώς φυλετική χρωματίνη κι επρόκειτο για ένα συμπυκνωμένο ετεροχρωματινικό Χ χρωμόσωμα, γενετικά ανενεργό. Σύμφωνα με την υπόθεση της Lyon (1961) η απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος στα σωματικά κύτταρα των θηλυκών ατόμων: συμβαίνει νωρίς στην εμβρυϊκή ζωή Στον άνθρωπο εντοπίζεται περίπου τη 16η μέρα μετά τη γονιμοποίηση (στάδιο των 500 με 1000 κυττάρων). είναι τυχαία Το χρωμόσωμα Χ που απενεργοποιείται έχει την ίδια πιθανότητα να είναι τόσο πατρικής όσο και μητρικής προέλευσης. είναι σταθερή Όταν ένα πατρικής ή ένα μητρικής προέλευσης Χ χρωμόσωμα απενεργοποιηθεί σε ένα κύτταρο τότε σε όλους τους απογόνους αυτού του κυττάρου απενεργοποιείται το ίδιο Χ χρωμόσωμα. είναι πλήρης Ολόκληρο το Χ χρωμόσωμα απενεργοποιείται. Ωστόσο, υπάρχουν κι εξαιρέσεις από τα παραπάνω σημεία της υπόθεσης Lyon. Στα μαρσιποφόρα θηλαστικά αλλά και σε ορισμένες έξτρα-εμβρυονικές δομές των πλακουντοφόρων θηλαστικών πάντα απενεργοποιείται το πατρικής προέλευσης Χ χρωμόσωμα. Επίσης, σήμερα είναι γνωστό ότι το Χ χρωμόσωμα δεν απενεργοποιείται σε όλο το μήκος του αλλά κατά το μεγαλύτερο μέρος του, καθώς ορισμένα γονίδια «διαφεύγουν» από την απενεργοποίηση. Τα περισσότερα από αυτά εντοπίζονται στα άκρα των βραχιόνων του Χ χρωμοσώματος στις αποκαλούμενες «ψευδοαυτοσωμικές» περιοχές. Τα γονίδια στις περιοχές αυτές είτε είναι παρόντα και στα δύο φυλετικά χρωμοσώματα, με αποτέλεσμα και τα αρσενικά και τα θηλυκά άτομα να έχουν δύο λειτουργικά αντίγραφα αυτών είτε δεν έχουν ομόλογα στο Υ χρωμόσωμα ή το ομόλογό τους στο Υ είναι μη λειτουργικό αλλά η διαφορά δόσης μεταξύ των δύο φύλων για τα εν λόγω γονίδια είναι ανεκτή και δεν επηρεάζει την ανάπτυξη του οργανισμού. Πολλά γονίδια στις «ψευδοαυτοσωμικές» περιοχές είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική ανάπτυξη ενός οργανισμού π.χ. το γονίδιο για την ομάδα αίματος Xg το οποίο βρίσκεται στο άκρο του μικρού βραχίονα του Χ χρωμοσώματος.
Εικόνα 2: Απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τα κύτταρα στην κορυφή της εικόνας αντιστοιχούν σε μια μικρή μάζα κυττάρων η οποία αποτελεί το πολύ πρώιμο έμβρυο. Σε αυτά τα κύτταρα και τα δύο Χ χρωμοσώματα είναι ενεργά. Σε πρώιμο στάδιο της εμβρυονικής ανάπτυξης το ένα Χ χρωμόσωμα απενεργοποιείται τυχαία σε κάθε κύτταρο. Το αρχικό πρότυπο απενεργοποίησης διατηρείται στους απογόνους κάθε κυττάρου καθώς το έμβρυο αναπτύσσεται σε ενήλικο άτομο (προσαρμογή από http://biology-forums.com/index.php?action=gallery;sa=view;id=539). Οι κανόνες απενεργοποίησης του Χ χρωμοσώματος αναστρέφονται όταν πρόκειται για τα γεννητικά κύτταρα. 1.2 Το σωμάτιο barr στον άνθρωπο Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε επιθηλιακά κύτταρα από το βλεννογόνο του στόματος του ανθρώπου, έδειξαν ότι ο αριθμός των σωματίων barr που είναι ορατά κατά τη μεσόφαση ισούται με τον αριθμό των Χ χρωμοσωμάτων μείον 1 δηλαδή όλα τα Χ χρωμοσώματα απερνεργοποιούνται εκτός από 1. Για παράδειγμα, ένας άντρας με καρυότυπο 47, ΧΧΥ έχει ένα σωμάτιο barr και μια γυναίκα με καρυότυπο 47, ΧΧΧ έχει δύο σωμάτια barr. Εξαιτίας της απενεργοποίησης του Χ χρωμοσώματος τα θηλαστικά ανταπεξέρχονται αρκετά ικανοποιητικά σε ανωμαλίες του αριθμού των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Αντίθετα, με ελάχιστες εξαιρέσεις οι αριθμητικές ανωμαλίες των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων είναι θανατηφόρες.
Εικόνα 3: Αναμενόμενος αριθμός σωματίων barr σε διάφορες αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες Χ και Υ στον άνθρωπο. Ο πρώτος αριθμός αντιστοιχεί στο συνολικό αριθμό των χρωμοσωμάτων στον πυρήνα, τα Χ και Υ συμβολίζουν το πλήθος των φυλετικών χρωμοσωμάτων και το Ν τον αριθμό των Χ χρωμοσωμάτων (προσαρμογή από http://bio3400.nicerweb.net/locked/media/ch07/barr_body-karyotypes.htm). 1.3 Γενετικά μωσαϊκά Λόγω της απενεργοποίησης του ενός Χ χρωμοσώματος τα ετερόζυγα για τα φυλοσύνδετα γονίδια θηλυκά άτομα είναι γενετικά μωσαϊκά. Δηλαδή εμφανίζουν κυτταρικούς κλώνους στους οποίους είτε το ένα αλληλόμορφο είναι ενεργό και παρουσιάζουν το φαινότυπο αυτού, είτε το άλλο αλληλόμορφο είναι ενεργό εμφανίζοντας το φαινότυπο του άλλου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα μωσαϊκισμού αποτελούν οι γάτες ταρταρούγα το τρίχωμα των οποίων αποτελείται από πορτοκαλί και μαύρες κηλίδες. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το πορτοκαλί χρώμα του τριχώματος (Orange, Ο) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα Χ, ενώ το γονίδιο για το μαύρο χρώμα (Black, Β) είναι αυτοσωμικό. Οι γάτες ταρταρούγα είναι ετερόζυγες για το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το πορτοκαλί χρώμα και φέρουν το επικρατές αλληλόμορφο για το μαύρο χρώμα (ΟοΒ-). Πορτοκαλί περιοχές εντοπίζονται εκεί όπου παραμένει ενεργό το Χ χρωμόσωμα που φέρει το Ο αλληλόμορφο καθώς υπερκαλύπτει την έκφραση του Β, ενώ μαύρες κηλίδες εμφανίζονται εκεί όπου αυτό απενεργοποιείται, δηλαδή εκεί που είναι ενεργό το Χ χρωμόσωμα που φέρει το αλληλόμορφο ο το οποίο επιτρέπει την έκφραση του γονιδίου για το μαύρο χρώμα.
Ένα πιο σύνθετο παράδειγμα μωσαϊκισμού αποτελούν οι γάτες calico οι οποίες έχουν πορτοκαλί, μαύρες και λευκές κηλίδες. Εικόνα 3: Το φαινόμενο του μωσαϊκισμού στις γάτες. (Α) Γάτες calico και ταρταρούγα. (Β) Χρώμα τριχώματος σε αρσενικά και θηλυκά άτομα. Tα αρσενικά άτομα έχουν ένα μόνο Χ χρωμόσωμα οπότε έχουν μόνο ένα αλληλόμορφο για το πορτοκαλί χρώμα. Αν έχουν το αλληλόμορφο Ο έχουν πορτοκαλί τρίχωμα ενώ αν έχουν το αλληλόμορφο ο μαύρο. Τα θηλυκά άτομα έχουν δύο αλληλόμορφα αυτού αφού έχουν δύο Χ χρωμοσώματα. Τα άτομα τα οποία είναι ομόζυγα για το αλληλόμορφο Ο (ΟΟ) έχουν πορτοκαλί τρίχωμα, τα ομόζυγα για το αλληλόμορφο ο (οο) έχουν μαύρο και τα ετερόζυγα Οο είναι ταρταρούγα δηλαδή φέρουν περιοχές πορτοκαλί αλλά και μαύρες καθώς το ένα Χ χρωμόσωμα απενεργοποιείται τυχαία. Όλα τα άτομα της εικόνας φέρουν το επικρατές αυτοσωμικό γονίδιο για το μαύρο χρώμα (προσαρμογή από http://www.bio.miami.edu/dana/dox/calico.html)..
Ανάλογο παράδειγμα στον άνθρωπο αποτελούν γυναίκες ετερόζυγες για μια μεταλλαγή που είναι συνδεδεμένη με το X χρωμόσωμα κι είναι υπεύθυνη για την απουσία των ιδρωτοποιών αδενών (υποϊδρωτική εξωδερματική δυσπλασία). Στα άτομα αυτά παρατηρείται ένα μωσαϊκό δέρμα με περιοχές όπου δεν υπάρχουν ιδρωτοποιοί αδένες.
2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Υλικά και όργανα Αντικειμενοφόροι πλάκες Καλυπτρίδες Οδοντογλυφίδες Γυάλινα Δοχεία Χρώσης Χρονόμετρο Γάντια Οπτικό Μικροσκόπιο Κεδρέλαιο 2.2 Διαλύματα Κάθε ομάδα φοιτητών θα χρειαστεί: 100 ml 95% αιθανόλη 100 ml διάλυμα χρώσης 10% Giemsa διαλυμένο σε 3d-H 2 O H 2 O 2.3 Ετοιμασία επιχρίσματος και χρώση για την παρατήρηση των επιθηλιακών κυττάρων των δύο φύλων- παρατήρηση του σωματίου barr στα θηλυκά άτομα Κάθε φοιτητής με τη βοήθεια οδοντογλυφίδας αφαιρεί επιθηλιακά κύτταρα από την εσωτερική επιφάνεια της παρειάς. Πραγματοποιούμε επίστρωση των κυττάρων σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα προσπαθώντας να δημιουργήσουμε μονόστιβο επίχρισμα. Αφήνουμε τα παρασκευάσματα να στεγνώσουν στον αέρα. Στη συνέχεια τα τοποθετούμε σε ειδικό γυάλινο δοχείο το οποίο περιέχει 95% αιθανόλη για 10 λεπτά. Απομακρύνουμε τα παρασκευάσματα από το γυάλινο δοχείο και τα αφήνουμε να στεγνώσουν στον αέρα. Ακολουθεί χρώση αυτών με 10% Giemsa για 15 λεπτά.
Ξεπλένουμε σε νερό για 3-5 λεπτά, τα αφήνουμε να στεγνώσουν τελείως στον αέρα και τοποθετούμε την καλυπτρίδα. Τέλος πραγματοποιείται μικροσκοπική παρατήρηση των παρασκευασμάτων. Αρχικά ση μεγέθυνση 10Χ εντοπίζουμε την περιοχή με το λεπτότερο επίχρισμα και εστιάζουμε σε αυτή. Προχωράμε στη μεγέθυνση 40Χ για καλύτερη παρατήρηση. Τοποθετούμε μια μικρή σταγόνα κεδρέλαιου στην περιοχή που θέλουμε να μελετήσουμε κι εστιάζουμε με τον καταδυτικό φακό (100Χ) προκειμένου να διακρίνουμε στα θηλυκά άτομα το σωμάτιο barr το οποίο εντοπίζεται ως μια σκούρα κηλίδα στην εσωτερική πλευρά της μεμβράνης του πυρήνα και στα αρσενικά άτομα την απουσία αυτού. (Α) (Β) Εικόνα 5: (A) Πυρήνες επιθηλιακών κυττάρων θηλυκού ατόμου ανθρώπου με καρυότυπο 46, ΧΧ, στο στάδιο της μεσόφασης, οι οποίοι εμφανίζουν μια σκούρα κηλίδα στην εσωτερική πλευρά της πυρηνικής τους μεμβράνης, το σωμάτιο barr. (Β) Πυρήνας επιθηλιακού κυττάρου αρσενικού ατόμου ανθρώπου με καρυότυπο 46, ΧΥ, στο στάδιο της μεσόφασης ο οποίος όπως είναι αναμενόμενο χαρακτηρίζεται από την απουσία του σωματίου barr (προσαρμογή από http://bio3400.nicerweb.net/locked/media/ch07/barr_body.html).
3. Ερωτήσεις αυτοαξιολόγησης 3.1. Πόσα σωμάτια barr υπάρχουν στον πυρήνα κάθε σωματικού κυττάρου ενός ατόμου με σύνδρομο Klinefelter (47, ΧΧΥ): α. 1 β. 2 γ. 3 δ. κανένα γιατί είναι αρσενικό άτομο 3.2. Πόσα ενεργά Χ χρωμοσώματα έχει ένα άτομο με τρισωμία ΧΧΧ: α. 1 β. 2 γ. 3 δ. κανένα 3.3. Επιλέξτε τη σωστή πρόταση: α. Το σωμάτιο barr εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των σωματικών κυττάρων των θηλυκών ατόμων κοντά στην πλασματική μεμβράνη. β. Το συμπυκνωμένο Χ χρωμόσωμα που βρίσκεται στα κύτταρα των θηλυκών θηλαστικών είναι γενετικά ενεργό. γ. Η απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος συμβαίνει πολύ νωρίς κατά την ανάπτυξη του εμβρύου. δ. Οι πιθανότητες να απενεργοποιηθεί το μητρικό Χ χρωμόσωμα είναι περισσότερες σε σχέση με το πατρικό. ε. Το φαινόμενο του μωσαϊκισμού εμφανίζεται στα αρσενικά άτομα. 3.4. Το σωμάτιο barr τυπικά εντοπίζεται στον πυρήνα: α. μόνο των θηλυκών γαμετών β. μόνο των αρσενικών γαμετών γ. μόνο των θηλυκών σωματικών κυττάρων δ. μόνο των αρσενικών σωματικών κυττάρων
ε. και των αρσενικών και των θηλυκών σωματικών κυττάρων 3.5. Όταν ένα κύτταρο υφίσταται απενεργοποίηση του ενός Χ χρωμοσώματός του, τότε οι μισοί απόγονοι αυτού θα έχουν το ίδιο Χ χρωμόσωμα απενεργοποιημένο. α. Σωστό β. Λάθος 3.6. Η απενεργοποίηση του ενός Χ χρωμοσώματος ισοσταθμίζει τη γονιδιακή δόση μεταξύ θηλυκών κι αρσενικών ατόμων σε όλους τους οργανισμούς. α. Σωστό β. Λάθος 3.7. Οι γάτες calico είναι αρσενικές, ετερόζυγες γάτες ως προς το γονίδιο που καθορίζει το χρώμα του τριχώματος. α. Σωστό β. Λάθος 3.8. Υπάρχουν γονίδια τα οποία «διαφεύγουν» από την απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος κι έτσι τα φυσιολογικά θηλυκά κι αρσενικά άτομα έχουν δύο λειτουργικά αντίγραφα αυτών. α. Σωστό β. Λάθος 3.9. Δύο διαφορετικές γάτες ταρταρούγα έχουν: α. Μαύρες και πορτοκαλί κηλίδες στα ίδια ακριβώς σημεία του σώματός τους β. Μαύρες και λευκές κηλίδες στα ίδια ακριβώς σημεία του σώματός τους γ. Μαύρες και πορτοκαλί κηλίδες σε διαφορετικά σημεία του σώματός τους δ. Μαύρες και λευκές κηλίδες σε διαφορετικά σημεία του σώματός τους 3.10. Στα μαρσιποφόρα θηλαστικά κάθε μεμονωμένο θηλυκό άτομο έχει ομοιόμορφο χρώμα τριχώματος χωρίς κηλίδες διαφορετικού χρώματος. α. Σωστό β. Λάθος
Βιβλιογραφία Σημειώσεις Εργαστηρίων Γενετικής Πανεπιστημίου Πατρών, Τμήμα Βιολογίας, Εργαστηριακές ασκήσεις Γενετικής, Επιμέλεια Έκδοσης Χριστοπούλου, Πάτρα 2002. Gelehrter TD and Collins FS., Αρχές Ιατρικής Γενετικής, Εκδόσεις Πασχαλίδη, Αθήνα, 1996 Hartwell LH, Hood L., Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM, Γενετική. Από τα γονίδια στα γονιδιώματα, 4η Αμερικανική-1η Ελληνική έκδοση, Εκδόσεις Utopia, Αθήνα, 2014 Russell PJ, igenetics. Μια Μεντελική Προσέγγιση, Ακαδημαϊκές εκδόσεις Ι.Μπάσδρα και ΣΙΑ Ο.Ε., Αλεξανδρούπολη, 2009 Ιστότοποι http://www.slideshare.net/gurya87/barr-body-staining http://www.nature.com/scitable/topicpage/x-chromosome-x-inactivation-323 https://www.assignmentexpert.com/blog/are calicos always female/ https://ghr.nlm.nih.gov/chromosome/x#conditions