ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 05/02/1017 ΘΕΜΑ 1 ο Α1. Τα βακτήρια του γένους Mycobacterium: α. είναι προκαρυωτικοί οργανισμοί. Α2. Η προσαρμογή των μικροοργανισμών στις συνθήκες μιας κλειστής καλλιέργειας γίνεται κατά τη(ν): α. λανθάνουσα φάση Α3. Tα υβριδώματα παράγονται ύστερα από β. σύντηξη Β λεμφοκυττάρων ποντικού με καρκινικά κύτταρα. A4. Το γονίδιο της ινσουλίνης κωδικοποιεί: δ. τα μόριο της προϊνσουλίνης A5. Στους βιοαντιδραστήρες πραγματοποιούνται : α. μόνο ζυμώσεις. ΘΕΜΑ Β 1. Τα αντισώματα αποτελούν το πιο αποτελεσματικό φυσικό φάρμακο για την αντιμετώπιση πολλών νοσημάτων. Τι ονομάζουμε μονοκλωνικά αντισώματα και ποια η εφαρμογή τους στην θεραπεία του καρκίνου; Σε τι πλεονεκτεί σε σχέση με άλλες θεραπείες του καρκίνου; Κάθε είδος αντισώματος που αναγνωρίζει έναν αντιγονικό καθοριστή παράγεται από μια ομάδα όμοιων Β-λεμφοκυττάρων, που αποτελούν έναν κλώνο. Τα αντισώματα που παράγονται από έναν κλώνο Β-λεμφοκυπάρων ονομάζονται μονοκλωνικά.τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι πολύ σημαντικά στην Ιατρική και χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικά για την ανίχνευση ασθενειών ή ως εξειδικευμένα φάρμακα εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών ή ακόμη εναντίον καρκινικών κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν στην εξωτερική επιφάνεια τους μεγάλη ποικιλία αντιγόνων που δεν υπάρχουν στα φυσιολογικά κύτταρα του οργανισμού, και ονομάζονται καρκινικά αντιγόνα. Έτσι μπορούν να κατασκευαστούν μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον αυτών των αντιγόνων. Τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι πολύ ειδικά μόνο για τα καρκινικά κύτταρα και μπορούν να «γίνουν μεταφορείς» ισχυρών αντικαρκινικών φαρμάκων. Όταν εισαχθούν στον οργανισμό, βρίσκουν και προσβάλλουν τους καρκίνους-στόχους. Τα αντικαρκινικά φάρμακα, που είναι συνδεδεμένα με τα αντισώματα, δρουν κατευθείαν στα καρκινικά κύτταρα και τα Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 1 από 7
καταστρέφουν. Επιτρέπουν έτσι τη θεραπεία με αποφυγή της χειρουργικής επέμβασης και των δυσάρεστων επιπτώσεων της χημειοθεραπείας 2. Η ζύμωση χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια μικροβίων μεγάλης κλίμακας στην βιομηχανία. Τι ονομάζουμε ζύμωση, ποια τα προϊόντα της και σε ποιους τύπους διακρίνεται; Με τον όρο ζύμωση εννοούμε τη διαδικασία ανάπτυξης μικροοργανισμών σε υγρό θρεπτικό υλικό κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες. Ο όρος ζύμωση παλαιότερα χρησιμοποιείτο μόνο για αναερόβιες διεργασίες αλλά σήμερα χρησιμοποιείται με την ευρεία έννοια και περιλαμβάνει όλες τις διεργασίες, αερόβιες και αναερόβιες. Τα προϊόντα της ζύμωσης είναι είτε τα ίδια τα κύτταρα που ονομάζονται βιομάζα είτε προϊόντα των κυττάρων όπως πρωτεΐνες και αντιβιοτικά. Υπάρχουν διάφοροι τύποι ζυμώσεων, οι οποίοι μπορούν να εφαρμοστούν ανάλογα με το επιθυμητό προϊόν. Δύο ευρέως χρησιμοποιούμενοι τύποι είναι η κλειστή και η συνεχής καλλιέργεια. 3. Ποιες είναι οι πρωτεΐνες του ανθρώπου που παράγονται με επιτυχία με βιοτεχνολογικές μεθόδους από βακτήρια; Περιγράψτε τη διαδικασία παραγωγής μίας από αυτές. Σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί τα γονίδια του ανθρώπου για περισσότερες από 300 φαρμακευτικές πρωτεΐνες. Πολλές από αυτές έχουν παραχθεί με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και η χρήσιμοποιούνται απο τους ασθενείς. Μεταξύ των πρώτων μορίων που παρασκευάστηκαν είναι η ινσουλίνη, οι ιντερφερόνες και η αυξητική ορμόνη. Το γονίδιο της ινσουλίνης παράγει ένα πρόδρομο μόριο, την προϊνσουλίνη, το οποίο μετατρέπεται τελικά σε ινσουλίνη. Μια από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή της ανθρώπινης ινσουλίνης στα βακτήρια είναι η παραγωγή του πρόδρομου μορίου της σε μια βακτηριακή καλλιέργεια και η μετατροπή της σε ινσουλίνη με ενζυμική κατεργασία. Η μέθοδος περιλαμβάνει την κατασκευή cdna βιβλιοθήκης από τα κύτταρα του παγκρέατος στα οποία εκφράζεται το γονίδιο της ινσουλίνης και την επιλογή του κλώνου που περιέχει το γονίδιο. Συνοπτικά τα στάδια κλωνοποίησης και απομόνωσης του γονιδίου της ινσουλίνης είναι: Απομόνωση του συνολικού mrna, από κύτταρα του ανθρώπινου παγκρέατος. Κατασκευή δίκλωνων μορίων DNA και ενσωμάτωση τους σε πλασμίδια. Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 2 από 7
Μετασχηματισμός βακτηρίων με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια και πολλαπλασιασμός τους σε υγρό θρεπτικό υλικό. Επιλογή των βακτηρίων που περιέχουν το γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί το πρόδρομο μόριο της ινσουλίνης. Ανάπτυξη των βακτηρίων αυτών σε βιοαντιδραστήρα για παραγωγή του πρόδρομου μορίου της ινσουλίνης. Η προϊνσουλίνη συλλέγεται και με κατάλληλο ένζυμο, που αφαιρεί το ενδιάμεσο πεπτίδιο, μετατρέπεται σε ινσουλίνη. 4.Να αντιστοιχήσετε κάθε στοιχείο της Στήλης Ι με κάποιο στοιχείο της Στήλης ΙΙ: Στήλη Ι Στήλη ΙΙ 1. διαβήτης α. πηγή άνθρακα 2. ζύμωση β. στερεό θρεπτικό 3. Άγαρ γ. ινσουλίνη 4. ώριμο mrna δ. παραλαβή προϊόντων ζύμωσης 5. γλυκόζη ε. ιντερφερόνη 6. διήθηση η. υγρό θρεπτικό 7. αντικαρκινικό φάρμακο ζ. c-dna βιβλιοθήκη 1γ, 2η, 3β, 4ζ, 5α, 6δ, 7ε ΘΕΜΑ Γ Γ1. Ένα μόριο DNA κόβεται σε τμήματα από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες BamH I και ΕoRI. Ποια γραμμή του παρακάτω πίνακα απεικονίζει τον σωστό αριθμό των τμημάτων που δημιουργήθηκαν μετά την επίδραση των ενδονουκλεασών; Μονάδες 5 Επίδραση μόνο BamHI Επίδραση μόνο EcoRI Α 5 4 8 Β 4 5 8 Γ 5 4 9 Δ 4 5 9 Η γραμμή Α είναι η σωστη Επίδραση EcoRI και BamHI Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 3 από 7
Γ2. Αν σας ζήταγαν να φτιάξετε μια σειρά μονοκλωνικών αντισωμάτων για τον εύκολο και γρήγορο προσδιορισμό των ομάδων αίματος στο σύστημα ΑΒΟ: Α. πόσα διαφορετικά μονοκλωνικά αντισώματα θα κατασκευάζατε και γιατί; Επειδή οι ομάδες αίματος χαρακτηρίζονται από τα αντιγόνα τυπου Α και τυπου Β της επιφανειας των ερυθρων αιμοσφαιρίων, θα κατασκευάσουμε δυο διαφορετικές ομάδες μονοκλωνικών αντισωμάτων, η μια θα αναγνωρίζει ειδικά το αντιγόνο τυπου Α και η αλλη ομαδα μονοκλωνικών θα αναγνωρίζει το αντιγόνο τυπου Β. Β. Περιγράψτε αναλυτικά τη διαδικασία παραγωγής ενός τύπου από τα παραπάνω μονοκλωνικά αντισώματα. Το επιλεγμένο αντιγόνο π.χ αντιγόνο τυπου Α της επιφάνειας των ανθρώπινων ερυθροκυττάρων, χορηγείται με ένεση σε ποντίκι και προκαλεί ανοσολογική αντίδραση με αποτέλεσμα να αρχίσει η παραγωγή αντισωμάτων από εξειδικευμένα Β-λεμφοκύτταρα. Ύστερα από δύο εβδομάδες αφαιρείται ο σπλήνας και απομονώνονται τα Β-λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά συντήκονται με καρκινικά κύτταρα και παράγονται τα υβριδώματα που παράγουν μονοκλωνικά αντισώματα, ειδικά για την αναγνωριση του αντιγόνου τυπου Α. Τα υβριδώματα μπορούν να φυλάσσονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα στην κατάψυξη (-80 C) και να παράγουν οποιαδήποτε στιγμή το συγκεκριμένο μονοκλωνικά αντίσωμα σε μεγάλες ποσότητες. Γ. περιγράψτε τη διαδικασία εντοπισμού της ομάδας αίματος σε ένα δείγμα αίματος με τη χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων που κατασκευάσατε. Εαν σημανουμε με ιχνηθετηση η αλλο τροπο τα μονοκλωνικά αντισώματα ώστε να διαπιστώνουμε τη δέσμευσή τους με ειδικό τρόπο πάνω στην επιφανεια των ερυθροκυττάρων, θα κάνουμε δυο διαδοχικούς ελέγχους και τους αντιστοιχους αποκλεισμούς. Για παραδειγμα με επιδραση του ΜΑ (Α) στο δειγμα μας αν δεσμευτεί, τοτε το ατομο ανηκει στηις ομαδες Α ή ΑΒ αν δεν δεσμευτεί ανήκει στις ομαδες Β ή 0. Εάν είχε δεμευτει το ΜΑ (Α) στην πρώτη επίδραση με το ΜΑ (Α) και σε δευτερη επίδραση με το ΜΑ (Β) δεν δεσμευεται το δευτερο ΜΑ (Β) τοτε το άτομο είναι ομαδας αιματος Α, αν δεσμευτεί και το ΜΑ (Β) είναι ΑΒ. Εάν δεν είχε δεμευτει το ΜΑ (Α) στην πρώτη επίδραση με το ΜΑ (Α) και σε δεύτερη επίδραση με το ΜΑ (Β) δεν δεσμευεται ούτε το δευτερο ΜΑ (Β) τοτε το άτομο είναι ομαδας αιματος 0, αν δεσμευτεί το ΜΑ (Β) είναι Β. ΘΕΜΑ Δ Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 4 από 7
Στα ακόλουθα σχήματα παριστάνονται: Α) τμήμα DNA προκαρυωτικού κυττάρου, στο οποίο περιέχεται ένα γονίδιο και τον κατάλληλο υποκινητής για την έκφρασή του μέσα σε βακτήριο (α) Β) πλασμίδιο που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως φορέας κλωνοποίησης του εν λόγω γονιδίου για την παραγωγή της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί στο κυτταρόπλασμα βακτηρίου ξενιστή (β). Το σημείο Ε υποδηλώνει τη θέση αναγνώρισης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης EcoRI. Στο τμήμα DNA απεικονίζονται τα μονόκλωνα άκρα που αναγνωρίζει και κόβει η EcoRI. Τα σημεία Β, Ν και Η υποδεικνύουν επιπλέον τις θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενδονουκλεασών BamHI, Noti και HindIII αντίστοιχα, οι οποίες και αυτές σχηματίζουν μονόκλωνα άκρα αν επιδράσουν σε δίκλωνο DNA. Να απαντήσετε στα ερωτήματα: 1. Ποια από τις δύο αλυσίδες του γονιδίου είναι μη κωδική; Να δικαιολογήσετε την απάντησή σας. (Μονάδες 10) 2. Ποιο από τα τέσσερα ένζυμα είναι καταλληλότερο για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA, το οποίο θα μετασχηματίσει βακτήρια τα οποία θα απομονώσουμε και θα χρησιμοποιήσουμε για εκφράσουμε στο κυτταρόπλασμά τους τη πρωτεΐνη που κωδικοποιεί το γονίδιο; Να δικαιολογήσετε την απάντησή σας, καθώς και γιατί απορρίψατε κάθε πιθανή επιλογή. (Μονάδες 15). 1. Από τον τρόπο δράσης της EcoRI ξέρουμε οτι αναγνωρίζει την αλληλουχία 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' και κόβει μεταξυ G -A και στις 2 αλυσιδες Από το σχήμα φαινεται οτι η περιοριστικη ενδονουκλεάση συναντα τα G-A και κόβει μεταξύ τους όπως φαινεται στο σχημα : 5' G AATTC 3' 3' CTTAA G 5' οπότε το 5 άκρο βρίσκεται αριστερά στην πάνω αλυσίδα και το 3' άκρο δεξια στην πάνω αλυσίδα όπως φαινεται στο σχημα Οι δυο αλυσίδες ειναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες και γι ατο λόγο αυτό η κάτω αλυσιδα έχει αριστερά το 3' άκρο της και δεξιά το 5' άκρο της. Επειδη σημειωνεται και η θεση του υποκινητή αριστερά του γονιδίου, η κατεύθυνση της μεταγραφής θα είναι από αριστερά προς τα δεξιά. Επειδή η RNA πολυμεράση συνθέτει την Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 5 από 7
πολυνουκλεοτιδικη αλυσίδα του mrna στην κατεύθυνση 5'- 3' και είναι συμπηρωματική και αντιπαράλληλη με την μη κωδική αλυσίδα, η μη κωδική πρέπει να είναι η κάτω και η κωδική η πάνω αλυσίδα του γονιδίου όπως εικονίζεται στο σχήμα. 2. Η περιοριστική ενδονουκλεάση HindIII αναγνωρίζει 2 αλληλουχίες του πλασμιδίου και αρα θα το κόβει σε 2 τμηματα. Αυτό κάνει δυσκολο το σχηματισμό ανασυνδυασμένου μορίου γιατί θα πρέπει να δημιουργηθεί ανασυνδυασμένο μόριο στο οποίο να ενωθούν μεταξύ τους 3 τμήματα, πράγμα που δεν ειναι πιθανό να συμβεί. Η περιοριστική ενδονουκλεάση BamH1, αναγνωρίζει μια αλληλουχία που βρίσκεται στη θεση εναρξης της αντιγραφής, αν ενσωματωθεί εκεί το γονίδιο μπορεί να επηρεάσει τη δυνατότητα αυτοδιπλασιασμού του πλασμιδίου και άρα τη δημιουργία του επιθυμητού βακτηριακού κλώνου, οπότε δεν την επιλέγουμε. Η περιοριστική ενδονουκλεάση Noti, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί εφόσον αναγνωρίζει μια αλληλουχία του πλασμιδίου, όμως κόβει το γονίδιο στη θεση του υποκινητη οπότε δεν θα γινει η μεταγραφή του γονιδίου. Άρα καταλληλότερη είναι η Περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI που ακόμη κι αν κόβει το γονίδιο ανθεκτικότητας στη στρεπτομυκίνη, υπάρχει άλλο διαθέσιμο γονίδιο ανθεκτικότητας στο πλασμίδιο (γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εντοπιστεί το πλασμίδιο που θα εχει εισέλθει στο βακτήριο - ξενιστή. 1. Από τον τρόπο δράσης της EcoRI ξέρουμε οτι αναγνωρίζει την αλληλουχία 5' GAATTC 3' Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 6 από 7
3' CTTAAG 5' και κόβει μεταξυ G -A και στις 2 αλυσιδες Από το σχήμα φαινεται οτι η περιοριστικη ενδονουκλεάση συναντα τα G-A και κόβει μεταξύ τους όπως φαινεται στο σχημα : 5' G AATTC 3' 3' CTTAA G 5' οπότε το 5 άκρο βρίσκεται αριστερά στην πάνω αλυσίδα και το 3' άκρο δεξια στην πάνω αλυσίδα όπως φαινεται στο σχημα Οι δυο αλυσίδες ειναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες και γι ατο λόγο αυτό η κάτω αλυσιδα έχει αριστερά το 3' άκρο της και δεξιά το 5' άκρο της. Επειδη σημειωνεται και η θεση του υποκινητή αριστερά του γονιδίου, η κατεύθυνση της μεταγραφής θα είναι από αριστερά προς τα δεξιά. Επειδή η RNA πολυμεράση συνθέτει την πολυνουκλεοτιδικη αλυσίδα του mrna στην κατεύθυνση 5'- 3' και είναι συμπηρωματική και αντιπαράλληλη με την μη κωδική αλυσίδα, η μη κωδική πρέπει να είναι η κάτω και η κωδική η πάνω αλυσίδα του γονιδίου όπως εικονίζεται στο σχήμα. 2. Η περιοριστική ενδονουκλεάση HindIII αναγνωρίζει 2 αλληλουχίες του πλασμιδίου και αρα θα το κόβει σε 2 τμηματα. Αυτό κάνει δυσκολο το σχηματισμό ανασυνδυασμένου μορίου γιατί θα πρέπει να δημιουργηθεί ανασυνδυασμένο μόριο στο οποίο να ενωθούν μεταξύ τους 3 τμήματα, πράγμα που δεν ειναι πιθανό να συμβεί. Η περιοριστική ενδονουκλεάση BamH1, αναγνωρίζει μια αλληλουχία που βρίσκεται στη θεση εναρξης της αντιγραφής, αν ενσωματωθεί εκεί το γονίδιο μπορεί να επηρεάσει τη δυνατότητα αυτοδιπλασιασμού του πλασμιδίου και άρα τη δημιουργία του επιθυμητού βακτηριακού κλώνου, οπότε δεν την επιλέγουμε. Η περιοριστική ενδονουκλεάση Noti, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί εφόσον αναγνωρίζει μια αλληλουχία του πλασμιδίου, όμως κόβει το γονίδιο στη θεση του υποκινητη οπότε δεν θα γινει η μεταγραφή του γονιδίου. Άρα καταλληλότερη είναι η Περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI που ακόμη κι αν κόβει το γονίδιο ανθεκτικότητας στη στρεπτομυκίνη, υπάρχει άλλο διαθέσιμο γονίδιο ανθεκτικότητας στο πλασμίδιο (γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εντοπιστεί το πλασμίδιο που θα εχει εισέλθει στο βακτήριο - ξενιστή. Φροντιστήρια Εν-τάξη Σελίδα 7 από 7