Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης. 4 ο Κεφάλαιο - Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης. 4 ο Κεφάλαιο - Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA"

Πόντιος Δάβης
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης 4 ο Κεφάλαιο - Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

2 Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Αναπτύχθηκε λόγω της ανακάλυψης: i. Περιοριστικών ενδονουκλεασών ii. Ειδικών φορέων DNA Έδωσε τη δυνατότητα στον άνθρωπο: i. Να ερευνά ii. Να επεμβαίνει iii. Να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών

3 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Ένζυμα που κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων.

4 Ειδικοί φορείς Φορείς που μεταφέρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο

5 Ανασυνδυασμένο μόριο DNA Είναι ένα τεχνητό μόριο DNA, που περιέχει γονίδια από δύο ή και περισσότερους οργανισμούς Μπορεί να μπει σε ένα βακτήριο ή ένα ευκαρυωτικό κύτταρο Τα τροποποιημένα κύτταρα είναι ικανά να ζουν και να αναπαράγονται μεταφέροντας στους απογόνους τους τις καινούριες ιδιότητες

6 Γενετική Μηχανική Οι τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό Προσφέρουν: i. νέες, εξαιρετικά ενδιαφέρουσες ερευνητικές και παραγωγικές δυνατότητες ii. iii. βοηθούν στην κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης πάνω στη Γη βοηθούν στη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσης του ανθρώπου

7 Στάδια τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA (rdna recombinant DNA) 1 ο στάδιο Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA 2 ο στάδιο Εισαγωγή του rdna σε κύτταρο ξενιστή 3 ο στάδιο Επιλογή και απομόνωση κυττάρων ξενιστών που έχουν ενσωματώσει το rdna 4 ο στάδιο Επιλογή βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA

8 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Παράγονται από βακτήρια Φυσιολογικός τους ρόλος είναι η προστασία του βακτηρίου από την εισβολή «ξένου» DNA Αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA Χαρακτηριστικό παράδειγμα: EcoRI

9 Περίπτωση EcoRI Απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli Αναγνωρίζει την αλληλουχία 5 - G A A T T C C T T A A G -5 Διασπά το δεσμό G-A με κατεύθυνση 5 3 Αφήνει μονόκλωνα τμήματα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα Το γονιδίωμα ενός ανώτερου ευκαρυωτικού οργανισμού διαθέτει διάσπαρτα πολλές φορές αυτή την ακολουθία, άρα κόβεται σε πάρα πολλά κομμάτια Οι φορείς κλωνοποίησης (πλασμίδιο ή φάγος) έχουν την αλληλουχία μία φορά. Έτσι δημιουργείται ένα γραμμικό μόριο DNA με μονόκλωνα άκρα Τα δύο είδη DNA ενώνονται με τη βοήθεια ενός ενζύμου της DNA δεσμάσης

10 Άλλες περιοριστκές ενδονουκλεάσες Ένζυμο Οργανισμός Αλληλουχία αναγνώρισης EcoRI Escherichia coli GAATTC Μονόκλωνα BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC Μονόκλωνα PvuI Proteus vulgaris CGATCG Μονόκλωνα PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Δίκλωνα HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT Μονόκλωνα AluI Arthobacter luteus AGCT Μονόκλωνα NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC Μονόκλωνα SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC Μονόκλωνα Άκρα

11 Άλλες Περιοριστικές Ενδονουκλεάσες

12 Σημεία προσοχής Μερικά πλασμίδια ξαναγίνονται κυκλικά χωρίς την ενσωμάτωση DNA του οργανισμού Μερικά από τα βακτήρια-ξενιστές θα προσλάβουν τα πλασμίδια (ανασυνδυασμένα ή μη) Επιλέγονται ξενιστές χωρίς πλασμίδια, άρα και ευαίσθητα σε αντιβιοτικά Για να εισέλθει το πλασμίδιο στο ξενιστή, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια μετά από κατάλληλη επεξεργασία Για την επιλογή των κατάλληλα μετασχηματισμένων βακτηρίων στηριζόμαστε στην ικανότητά τους για ανάπτυξη παρουσία αντιβιοτικών Κάθε βακτήριο που αναπαράγεται δίνει ένα κλώνο. Η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων λέγεται κλωνοποίηση Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού δότη και αποτελεί μία γονιδιωματική βιβλιοθήκη Για την επιλογή του κλώνου με το επιθυμητό τμήμα DNA χρησιμοποιούνται ειδικοί ανιχνευτές.

13 Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη Είναι το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν το συνολικό DNA του οργανισμού δότη Τα πλασμίδια λόγω της ευκολίας κλωνοποίησης αποτελούν το συνηθέστερο φορέα κλωνοποίησης για οργανισμούς με μικρό γονιδίωμα Ένας άλλος φορέας που μπορεί να ενσωματώσει μεγαλύτερα κομμάτια ξένου DNA είναι ο βακτηριοφάγος λ

14 Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης

15 Κατασκευή cdna βιβλιοθήκη Αν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα, τότε κατασκευάζουμε τις cdna βιβλιοθήκες Περιέχουν αντίγραφα των ώριμων mrna όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε αυτά τα κύτταρα Η διαδικασία περιλαμβάνει: 1. Απομόνωση ώριμου mrna από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο 2. Χρήση του mrna για τη δημιουργία μίας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (complementary DNA = cdna). Γίνεται με τη χρήση του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση 3. Το υβριδικό μόριο cdna-mrna αποδιατάσσεται με θέρμανση και τα cdna χρησιμεύουν ως καλούπι για τη σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας DNA. Έτσι δημιουργούνται δίκλωνα μόρια DNA 4. Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια ή φάγους και κλωνοποιούνται με την ίδια διαδικασία της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης 5. Έτσι το κύτταρο ξενιστής αποκτά την ικανότητα σύνθεσης ενός συγκεκριμένου γονιδίου

16 Υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων Είναι η διαδικασία σύνδεσης μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA ή συμπληρωματικών DNA-RNA Αν χρησιμοποιήσουμε ένα γνωστό μόριο DNA, τότε μπορούμε να το χρησιμοποιήσουμε ως ανιχνευτή για το συμπληρωματικό του που βρίσκεται ανάμεσα σε χιλιάδες άλλα κομμάτια Για να γίνει αυτό πρέπει πρώτα όμως να χωρίσουμε τις δύο αλυσίδες των δίκλωνων τμημάτων DNA σπάζοντας τους δεσμούς υδρογόνου ανάμεσά τους Αυτό ονομάζεται αποδιάταξη και μπορεί να γίνει είτε με κατάλληλες χημικές ουσίες είτε με θέρμανση Για να μπορέσουμε να εντοπίσουμε το γνωστό μόριο DNA ή RNA και κατά συνέπεια τη συμπληρωματική τους αλληλουχία, χρησιμοποιούμε ιχνηθετημένους ανιχνευτές SOS: Ιχνηθέτηση. Είναι η σήμανση χημικών μορίων με τη χρήση ραδιενεργών ισοτόπων, φθοριζουσών ουσιών, κτλ. Ένα τυπικό παράδειγμα είναι η χρήση ραδιενεργού φωσφόρου 32 Ρ στα νουκλεοτίδια για την ιχνηθέτηση του DNA. (Κεφάλαιο 1, σελίδα 14)

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης PCR (Polymerase Chain Reaction) Αν απομονώσουμε ένα βακτηριακό κλώνο που περιέχει ένα επιθυμητό γονίδιο και τον πολλαπλασιάσουμε, θα δημιουργήσουμε πολλά αντίγραφα του

17 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης PCR (Polymerase Chain Reaction) Αν απομονώσουμε ένα βακτηριακό κλώνο που περιέχει ένα επιθυμητό γονίδιο και τον πολλαπλασιάσουμε, θα δημιουργήσουμε πολλά αντίγραφα του γονιδίου που περιέχει Η δημιουργία πολλών αντιγράφων μας χρειάζεται για τη μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου αλλά και για την παραγωγή της πρωτεΐνης που αυτό κωδικοποιεί Ένας άλλος τρόπος που μας επιτρέπει να αναπαράγουμε μία συγκεκριμένη αλληλουχία DNA χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου είναι η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Άρχισε να χρησιμοποιείται ευρέως το 1985 και έχει πολλές εφαρμογές i. Ιατρική: Διάγνωση ασθενειών π.χ. AIDS ii. iii. Εγκληματολογία: Διαλεύκανση υποθέσεων Παλαιοντολογία: Μελέτη DNA από απολιθώματα

19 PCR Πριν Μετά

Σχετικά έγγραφα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της...

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της... ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της... Γενετική Μηχανική o Περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές με τις οποίες μπορούμε να επεμβαίνουμε στο γενετικό υλικό των οργανισμών.