Βιολογία Κατεύθυνσης Γ Λυκείου Απαντήσεις διαγωνίσματος στο Κεφάλαιο 4 ο ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. γ Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. Ο κλώνος είναι μια ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων, ή οργανισμών. B2. Η υβριδοποίηση είναι μια πολύ σημαντική ιδιότητα του DNA που μας δίνει τη δυνατότητα αν έχουμε ένα γνωστό μόριο μονόκλωνο DNA ή RNA, να το χρησιμοποιήσουμε ως ανιχνευτή για τον εντοπισμό του συμπληρωματικού του, όταν το τελευταίο βρίσκεται μαζί με χιλιάδες άλλα κομμάτια. Β3. Η τεχνική αυτή έχει αυξήσει την ευαισθησία των γενετικών αναλύσεων και έχει πολλές πρακτικές εφαρμογές. Για παράδειγμα χρησιμοποιείται στην Ιατρική για τη διάγνωση ασθενειών όπως του AIDS, στην εγκληματολογία για τη διαλεύκανση υποθέσεων και στη μελέτη DNA από απολιθώματα. Β4. Με την επίδραση της Ddel θα προκύπτουν -3- τμήματα DNA διαφορετικού μήκους. 5 GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG 3 3 CAC GTG GAC TGA GGA CTC CTC 5
5 GTG CAC CTG ACT CCT GΤG GAG 3 3 CAC GTG GAC TGA GGA CΑC CTC 5 ΘΕΜΑ Γ Γ1. Με τη δράση της περιοριστικής ενδονουκλεάσης Α, έχουμε: 2000 8000 Με τη δράση της περιοριστικής ενδονουκλεάσης Β, έχουμε: 7000 3000 Με τη δράση της περιοριστικής ενδονουκλεάσης Α και Β, έχουμε: 2000 5000 3000 Γ2. Τα βήματα που συμπληρώνουν τη διαδικασία είναι: ❷ Εφαρμογή μιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης για τη δημιουργία αζευγάρωτων βάσεων στα κομμένα άκρα τους. ❹ Συνένωση μορίων DNA, με τη δράση του ενζύμου DNA δεσμάσης. ❺ Μεταφορά του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου και μετασχηματισμός του βακτηρίου-ξενιστή. ❼ Προσδιορισμός και απομόνωση αποικιών βακτηρίων, ανθεκτικών σε αντιβιοτικό, που περιέχουν αντίγραφα χρωμοσωμικού DNA.
Γ3. Σε θρεπτικό υλικό καλλιέργειας που περιέχει το αντιβιοτικό καναμυκίνη, θα αναπτυχθούν οι αποικίες με τα μετασχηματισμένα βακτήρια, χωρίς ανασυνδυασμένο DNA πλασμιδίου. Σε θρεπτικό υλικό καλλιέργειας που περιέχει το αντιβιοτικό αμπικιλίνη, θα αναπτυχθούν οι αποικίες με τα μετασχηματισμένα βακτήρια, με ανασυνδυασμένο DNA πλασμιδίου. Για να μπει ένα πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια μετά από κατάλληλη κατεργασία (μετασχηματισμός). Βακτήρια-ξενιστές δέχονται σε μικρό ποσοστό πλασμίδια, μερικά από τα οποία είναι μετασχηματισμένα. Συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδιο και επομένως είναι ευαίσθητα σε κάποιο αντιβιοτικό. Η επιλογή των βακτηρίων που δέχθηκαν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξής τους παρουσία αντιβιοτικού στο θρεπτικό υλικό μιας καλλιέργειας, επειδή το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιέχει ένα γονίδιο που τους προσδίδει ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Κάθε βακτήριο που προσέλαβε ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (μετασχηματισμένο) πολλαπλασιάζεται και δίνει ένα κλώνο. ΘΕΜΑ Δ Δείγμα I: Αλυσίδα Ι: ΚΩΔΙΚΗ DNA 3 CTTAAGAATGTGGACCCCCTTGTACTTAAG 5 πρόδρομο mrna: 3 CUUAAGAAUGUGGACCCCCUUGUACUUAAG 5 αμετάφραστη κωδικόνιο κωδικόνιο εσώνιο κωδικόνιο κωδικόνιο αμετάφραστη περιοχή λήξης val phe έναρξης περιοχή met
ώριμο mrna: 3 CUUAAGAAUGUGCUUGUACUUAAG 5 αμετάφραστη κωδικόνιο κωδικόνιο κωδικόνιο κωδικόνιο αμετάφραστη περιοχή λήξης val phe έναρξης περιοχή met Αλυσίδα ΙΙ: ΜΗ ΚΩΔΙΚΗ DNA 5 GAATTCTTACACCTGGGGGAACATGAATTC 3 Δείγμα II: Αλυσίδα Ι: ΚΩΔΙΚΗ DNA 5 GAATTCATGTTTGTTTAAGAATTC 3 mrna: 5 GAAUUCAUGUUUGUUUAAGAAUUC 3 αμετάφραστη κωδικόνιο κωδικόνιο κωδικόνιο κωδικόνιο αμετάφραστη περιοχή έναρξης phe val λήξης περιοχή met Αλυσίδα ΙΙ: ΜΗ ΚΩΔΙΚΗ DNA 3 CTTAAGTACAAACAAATTCTTAAG 5 Δ1. Το δείγμα Ι προέρχεται από τον ευκαρυωτικό οργανισμό και το δείγμα ΙΙ από τον προκαρυωτικό οργανισμό. Τα περισσότερα γονίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών (και των ιών που τους προσβάλλουν) είναι ασυνεχή ή διακεκομμένα. Δηλαδή οι αλληλουχίες που μεταφράζονται σε αμινοξέα (εξώνια) διακόπτονται από ενδιάμεσες αλληλουχίες οι οποίες δεν μεταφράζονται σε αμινοξέα (εσώνια). Όταν ένα γονίδιο που περιέχει εσώνια μεταγράφεται, δημιουργείται το πρόδρομο mrna που περιέχει και εξώνια και εσώνια. Το πρόδρομο mrna μετατρέπεται σε ώριμο mrna με τη διαδικασία της ωρίμανσης, κατά την οποία τα εσώνια κόβονται από μικρά ριβονουκλεοπρωτεινικά σωματίδια (αποτελούνται από snrna και πρωτεΐνες και λειτουργούν ως ένζυμα) και απομακρύνονται και συρράπτονται τα εξώνια μεταξύ τους.
Δ2. Το μόριο mrna που συντίθεται είναι συμπληρωματικό και αντιπαράλληλο προς τη μια αλυσίδα της διπλής έλικας του DNA του γονιδίου. Η αλυσίδα αυτή είναι η μεταγραφόμενη και ονομάζεται μη κωδική. Η συμπληρωματική και αντιπαράλληλη αλυσίδα του DNA του γονιδίου ονομάζεται κωδική. Συνεπώς κωδική και mrna έχουν τα ίδια άκρα, την ίδια αλληλουχία βάσεων με τη διαφορά ότι η κωδική έχει Θυμίνη (Τ) και το mrna έχει στις αντίστοιχες θέσεις Ουρακίλη (U). Επιπλέον πρέπει να υπάρχει κωδικόνιο έναρξης, με βήμα τριπλέτας χωρίς να παραλείπεται κάποιο νουκλεοτίδιο στη μεταφραζόμενη περιοχή ώστε κάθε νουκλεοτίδιο να ανήκει σ ένα μόνο κωδικόνιο, και κωδικόνιο λήξης. Δ3. Ο γενετικός κώδικας χαρακτηρίζεται ως εκφυλισμένος. Με εξαίρεση δύο αμινοξέα (μεθειονίνη και τρυπτοφάνη) τα υπόλοιπα 18 κωδικοποιούνται από δύο μέχρι και έξι διαφορετικά κωδικόνια. Και αυτό γιατί οι συνδυασμοί των τεσσάρων νουκλεοτιδίων ανά τρία (4 3 =64) είναι πολύ περισσότεροι από τα 20 διαφορετικά αμινοξέα που συγκροτούν τις πρωτεΐνες. Δ4. Αν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα τότε κατασκευάζουμε τις cdna βιβλιοθήκες. Οι cdna βιβλιοθήκες περιέχουν αντίγραφα των mrna όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά και έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης μόνο των αλληλουχιών των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δηλαδή των εξωνίων. Συνεπώς, η κατάλληλη αλληλουχία είναι του ώριμου mrna: 3 CUUAAGAAUGUGCUUGUACUUAAG 5 Για να κατασκευαστεί μια cdna βιβλιοθήκη, απομονώνεται το ολικό ώριμο mrna από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο. Το mrna χρησιμοποιείται σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cdna). H σύνθεση του cdna γίνεται με το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση. Παράγονται έτσι υβριδικά μόρια
cdna-mrna. Το mrna διασπάται με κατάλληλες χημικές ουσίες ή αποδιατάσσεται με θέρμανση και τα cdna χρησιμεύουν σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA. Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία δίκλωνων μορίων DNA. Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους και κλωνοποιούνται με τη διαδικασία της τεχνολογίας δημιουργίας ανασυνδυασμένου DNA και της κατασκευής μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης. Το κόψιμο του DNA θα γίνει με την περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI δεδομένου ότι υπάρχει η αλληλουχία 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 στο γονιδίωμα. Η EcoRI κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του Α, με κατεύθυνση 5 3, αφήνοντας μονόκλωνα άκρα με αζευγάρωτες βάσεις. Τα άκρα αυτά, κατόπιν ανάμιξης, μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις των μονόκλωνων άκρων του DNA πλασμιδίου που έχει κοπεί με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση, δημιουργώντας ανασυνδυασμένο DNA πλασμιδίου. Στη συνέχεια γίνεται μετασχηματισμός βακτηρίων, επιλογή βακτηρίων που δέχθηκαν το ανασυνδυαμένο πλασμίδιο λόγω ανάπτυξής τους σε καλλιέργεια που περιέχει κάποιο αντιβιοτικό, ιδιότητα που απέκτησαν λόγω του πλασμιδίου, με αποτέλεσμα τη δημιουργία κλώνων του μετασχηματισμένου βακτηρίου. Δ5. Με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Επιμέλεια: Δημήτρης Κοτρόπουλος Βιολόγος SCIENCE PRESS