ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΜΑΘΗΜΑ IV Μαρία Αλεξίου Χατζάκη Αναπλ. Καθηγήτρια ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ - ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΔΡΟΣΟΦΙΛΑΣ Αλεξανδρούπολη ΤΜΒΓ, Δημοκρίτειο Παν/μιο Θράκης Μαρία Αλεξίου Χατζάκη Αναπλ. Καθηγήτρια Αλεξανδρούπολη ΤΜΒΓ, Δημοκρίτειο Παν/μιο Θράκης 1
Α. Η δροσόφιλα ως οργανισμός - μοντέλο Η δροσόφιλα (Drosophila melanogaster) ή μύγα του κρασιού, των φρούτων ή του ξιδιού αποτελεί βασικό οργανισμό μοντέλο στη βιολογική έρευνα, ιδιαίτερα όσον αφορά στη γενετική και την αναπτυξιακή βιολογία, όπου χρησιμοποιείται εδώ και περισσότερο από έναν αιώνα. Για πρώτη φορά αναγνωρίστηκε από τον Thomas Hunt Morgan το 1908, ο οποίος στη συνέχεια, μαζί με τους Sturtevant, Bridges, και Muller, ανέπτυξαν περαιτέρω τη θεωρία της κληρονομικότητας, με την ιδέα ότι τα χρωμοσώματα είναι οι φορείς της γενετικής πληροφορίας. Κατά τη δεκαετία του 50, ο Ed Lewis χρησιμοποίησε τη δροσόφιλα ως μοντέλο για τη διερεύνηση της δομής των γονιδίων και των γενετικών τόπων, εισάγοντας τους όρους ιντρόνιο και εσόνιο για να τα περιγράψει. Επίσης αναγνώρισε μια σειρά από ομοιοτικά γονίδια βάσει της γενετικής ανάλυσης της δροσόφιλας. Κατά τις επόμενες δεκαετίες η δροσόφιλα χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο από τον Seymour Benzer για να μελετηθεί η γενετική βάση πολλών σύνθετων συμπεριφορών και από τους Eric Weischaus and Christiane Nusslein- Volhard για να αναγνωριστεί ένας μεγάλος αριθμός από γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη. Ο λόγος που κάνει τις γενετικές και αναπτυξιακές μελέτες πάνω στη δροσόφιλα τόσο σημαντικές είναι ότι πολλά γονίδιά της έχουν λειτουργικά ορθόλογα στους ανθρώπους, κι έτσι ένας μεγάλος αριθμός αναπτυξιακών μονοπατιών στα θηλαστικά γενικότερα διερευνήθηκε και αναγνωρίστηκε μέσω αυτών των μελετών. Η σημασία της δροσόφιλας στην έρευνα αναγνωρίστηκε με το βραβείο Nobel Ιατρικής και Φυσιολογίας στους Ed Lewis, Christiane Nusslein-Volhard και Eric Wieschaus το 1995. Γιατί έχει αποτελέσει οργανισμό μοντέλο στη μοριακή βιολογία; 1. Συγκριτικά με ένα θηλαστικό, είναι ένας πολύ μικρός οργανισμός, με σύντομο (περίπου 11 μέρες) και πλήρως γνωστό βιολογικό κύκλο ανάπτυξης 2. Παράγει μεγάλο αριθμό απογόνων 3. Έχει μικρό γονιδίωμα που αποτελείται από 4 χρωμοσώματα και περίπου 14,000 γονίδια. 4. Η θέση και η γενεαλογία κάθε κυττάρου σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια είναι γνωστά 5. Απαιτεί εύκολους χειρισμούς και φτηνά υλικά εκτροφής: τρέφεται με χυμούς φρούτων και μούχλες που αναπτύσσονται σε σαπισμένα φρούτα 6. Πειραματικά «εργαλεία» όπως, μεταλλαγμένες και διαγονιδιακές σειρές είναι εύκολο να φτιαχτούν και είναι διαθέσιμες για τα περισσότερα από τα γονίδια που κωδικοποιεί το γονιδίωμά της. 7. Αν και εξελικτικά είναι ένα είδος πολύ απομακρυσμένο από τον άνθρωπο, σε επίπεδο γονιδιακής ομολογίας, είναι αρκετά κοντά με αυτόν (40% νουκλεοτιδική ομολογία και 60% ομολογία με τις ανθρώπινες πρωτεΐνες) 8. Αποτελεί μοντέλο για μελέτες αναπτυξιακής βιολογίας του ανθρώπου και για διάφορες ασθένειες όπως καρκίνο, parkinson, γήρας κλπ. Όργανα, όπως τα φτερά, και τα μάτια (αλλά και τα σχετιζόμενα με αυτά γονίδια) είναι τα πιο σημαντικά μέρη του σώματος της δροσόφιλας που έχουν γίνει μοντέλα έρευνας. Β. Ταξινομική κατάταξη (πηγή : http://flymove.uni-muenster.de/) 2
Όπως όλα τα Αρθρόποδα, οι μύγες περιβάλλονται από εξωσκελετό, έχουν αρθρωτά άκρα και στοματικά εξαρτήματα, έχουν ανοικτό κυκλοφορικό σύστημα και αναπνέουν μέσω τραχειακών στιγμάτων. Επιπλέον, όπως σε όλα τα έντομα, το σώμα τους χωρίζεται σε τρία τάγματα κεφάλι, θώρακα και κοιλία-, έχουν τρία ζεύγη ποδιών, ένα ζεύγος κεραιών και, από τα δύο ζεύγη φτερών τους, το ένα έχει μετατραπεί σε αλτήρες. Τα στοματικά τους εξαρτήματα είναι απομυζητικά για να εξασφαλίζουν το ρούφηγμα των υγρών τροφών τους. Έχουν πολύ μικρό βιολογικό κύκλο και παράγουν πολύ μεγάλο αριθμό αυγών. Η δροσόφιλα είναι ένα κοσμοπολίτικο ολομετάβολο έντομο που απαντάται σε όλες τις θερμές περιοχές. Συχνά μεταναστεύει σε πιο κρύες περιοχές τα καλοκαίρια και επιστρέφει σε θερμότερα κλίματα τους χειμώνες. Γ. Γονιδίωμα Το γονιδίωμα της δροσόφιλας, το οποίο διαβάστηκε σχεδόν πλήρως το 2000, αποτελείται από 165 x 10 6 βάσεις που κωδικοποιούν περί τα 13,781 γονίδια. Τα γονίδια αυτά είναι οργανωμένα σε 4 χρωμοσώματα (Εικ. 1): τα X/Y φυλετικά και τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα 2, 3, και 4. Το 4 ο χρωμόσωμα είναι ελάχιστο σε μέγεθος και συχνά θεωρείται αμελητέο. Εικ. 1. Τα χρωμοσώματα της δροσόφιλας 3
Δ. Βιολογικός κύκλος Η δροσόφιλα είναι ένα μικρό έντομο μήκους 3 mm. Το αυγό της έχει μήκος περίπου 0.5 mm. Μία μέρα μετά τη γονιμοποίηση, το έμβρυο αναπτύσσεται και μεταμορφώνεται σε μία σκωληκόμορφη προνύμφη (larva) (Εικ. 2). Η προνύμφη αυτή τρώει και μεγαλώνει συνεχώς, κάνοντας έκδυση μία, δύο και τρείς μέρες μετά την εκκόλαψή της, περνώντας αντίστοιχα από το πρώτο, δεύτερο και τρίτο προνυμφικό στάδιο. Μετά από δύο μέρες που θα περάσει ως προνύμφη 3 ου σταδίου, εκδύεται ακόμα μία φορά για να σχηματίσει μία ακίνητη νύμφη (pupa). Κατά τις επόμενες μέρες το σώμα αναδιατάσσεται πλήρως ώστε να δώσει την ώριμη πτερωτή μορφή, η οποία τότε εκκολάπτεται από το κουκούλι και καθίσταται γόνιμη μέσα στις επόμενες 12 ώρες, αν η θερμοκρασία ανάπτυξής της 25 C. Η ανάπτυξη σε χαμηλότερες θερμοκρασίες, π.χ. 18 C διαρκεί το διπλάσιο σχεδόν χρόνο. Εικ. 2. Ο βιολογικός κύκλος της δροσόφιλας. (πηγή : http://flymove.uni-muenster.de/) Ε. Εργαστηριακή άσκηση Στην άσκηση αυτή θα παρατηρήσετε τα εξωτερικά χαρακτηριστικά φυσικών (Εικ.3) και μεταλλαγμένων πληθυσμών (Εικ. 4 και 5) δροσόφιλας και θα δείτε βασικά ανατομικά γνωρίσματα σε ενήλικα άτομα (αναπαραγωγικό σύστημα) και σε προνύμφες του 3 ου σταδίου. Υλικό για παρατήρηση: 1. ολόκληροι πληθυσμοί 2. διάκριση αρσενικού/θηλυκού γένους (στερεοσκόπιο) 3. μεταλλαγμένοι πληθυσμοί 4. πλακίδια από άγαρ με έμβρυα 5. διάκριση προνυμφικών σταδίων με βάση το μέγεθος και τα στοματικά εξαρτήματα 6. ανατομή ώριμων ατόμων για παρατήρηση αναπαραγωγικού συστήματος 7. ανατομή προνυμφικών σταδίων 4
Διάκριση αρσενικού θηλυκού Εικ. 3. Διάκριση αρσενικών και θηλυκών ατόμων δροσόφιλας (πηγή : http://flymove.uni-muenster.de/) Πιο γνωστές μεταλλάξεις Κάποιες φυσικές μεταλλάξεις χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες για τη διάκριση μεταξύ χρωμοσωμάτων κατά τις διασταυρώσεις σε πειράματα γενετικής. Οι μεταλλάξεις αυτές έχουν φαινότυπο που αφορά συχνά στα μάτια, τα φτερά, τις τρίχες και το χρώμα του εξωσκελετού. Οι πιο κοινές αναφέρονται παρακάτω (Εικ. 4&5): Εικ. 4. Χαρακτηριστικές μεταλλάξεις στη δροσόφιλα (πηγή: R. J. Greenspan Fly Pushing- The theory and practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Maboratory Press). 5
ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ [παρατηρήστε το χρώμα των ματιών, το σχήμα των φτερών και το μέγεθος] ΚΟΝΤΑ ΦΤΕΡΑ ΣΓΟΥΡΑ ΦΤΕΡΑ Φαινότυπος που οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου "vestige", που βρίσκεται στο 2ο χρωμόσωμα (υπολειπόμενη μετάλλαξη). Φαινότυπος που οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου "curly" του 2ου χρωμοσώματος. (επικρατής μετάλλαξη). ΛΕΥΚΑ ΜΑΤΙΑ Φαινότυπος που οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου "white"του 1ου χρωμοσώματος. Το μεταλλαγμένο γονίδιο δεν παράγει καθόλου κόκκινη χρωστική του ματιού (επικρατής μετάλλαξη). ΠΟΡΤΟΚΑΛΙ ΜΑΤΙΑ Φαινότυπος που οφείλεται επίσης σε μετάλλαξη του γονιδίου "white". Το γονίδιο υποεκφράζεται παράγοντας λιγότερες κόκκινες χρωστικές του ματιού Εικ. 5. Χαρακτηριστικές μεταλλάξεις στη δροσόφιλα. (http://www.exploratorium.edu/exhibits/mutant_flies/mutant_flies.html). Παρατήρηση εμβρύων Παρατηρήστε τα έμβρυα πάνω στο πλακίδιο με το άγαρ (Εικ. 6). Απομακρύνετε μερικά άτομα και τοποθετήστε τα σε μία καλυπτρίδα πάνω στην οποία έχετε κολλήσει ταινία διπλής όψης. Στη συνέχεια μπορείτε να απομακρύνετε το εξωτερικό κάλυμμα (chorion) κυλώντας με προσοχή τα έμβρυα πάνω στην κολλητική ταινία. Εικ. 6. πηγή : http://flymove.uni-muenster.de 6
Διάκριση προνυμφικών σταδίων Τα τρία προνυμφικά στάδια διακρίνονται από το μέγεθος, από τη συμπεριφορά και από την ανατομία των στοματικών εξαρτημάτων ή "σιαγόνων" (Εικ. 6). Η προνύμφη τρώει και μεγαλώνει συνεχώς, περνώντας αντίστοιχα από το πρώτο, δεύτερο (μήκους 2 mm) και τρίτο προνυμφικό στάδιο (μήκους 4.5 mm). Κατά τα δύο πρώτα στάδια οι προνύμφες κινούνται μέσα στην τροφή, ενώ μόνο όταν μεγαλώσουν σε μέγεθος και φτάσουν στο τρίτο στάδιο αρχίζουν και κινούνται εκτός τροφής ("wandering stage"). Για την προετοιμασία των δειγμάτων, τοποθετήστε μία προνύμφη από κάθε στάδιο ανάμεσα σε δύο καλυπτρίδες και πιέστε μέχρι να βγουν τα στοματικά εξαρτήματα προς τα έξω. Παρατηρήστε στο στερεοσκόπιο. Εικ. 7. Στοματικά εξαρτήματα δροσόφιλας πρώτου (Α), δεύτερου (Β) και τρίτου (C ) σταδίου. Η μεγέθυνση είναι η ίδια και στις τρεις εικόνες. (πηγή : D. B. Roberts Drosophila. Oxford Sciences Publications). Ανατομία ώριμης δροσόφιλας αναπαραγωγικό σύστημα Σε μία σταγόνα νερό, καθηλώστε ένα ενήλικο άτομο με το θώρακα/κοιλιά προς τα πάνω με τη βοήθεια μιας λαβίδας. Με μία δεύτερη λαβίδα τραβήξτε το γεννητικό σύστημα προς τα έξω και τοποθετήστε το σε μια άλλη σταγόνα νερού για παρατήρηση στο στερεοσκόπιο. Εικ. 8 7
Ανατομία δροσόφιλας 3 ου προνυμφικού σταδίου νευρικό σύστημα και λεμφικοί αδένες Σε μία σταγόνα νερό καθηλώστε από το κεφάλι μία προνύμφη 3 ου σταδίου με τη βοήθεια μιας λαβίδας ή βελόνας. Ανοίξτε την προνύμφη με την βοήθεια μιας δεύτερης βελόνας που θα χρησιμοποιήσετε, για να τραβήξετε και να αποσπάσετε τον υπόλοιπο κορμό από το κεφάλι. Προσπαθήστε να διακρίνετε τα εσωτερικά όργανα/σχηματισμούς της Εικόνας 8 -κυρίως αυτά που φαίνονται με βέλη- και τα οποία θα δώσουν τα αντίστοιχα όργανα στα ενήλικα άτομα. Εικ. 9 8