ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ-ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΦΑΚΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΒΛΑΣΤΟ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ OLEA EUROPAEA L. ΚΑΙ CERCIS SILIQUASTRUM L. Καλαχάνης Δημήτριος Πάτρα 2006
Περιεχόμενα Περίληψη Εισαγωγή Τα υπό μελέτη φυτά Το περίδερμα Φακίδια Σκοπός της εργασίας Υλικά, όργανα και μέθοδοι Συλλογή φυτικού υλικού Παρατήρηση νωπών παρασκευασμάτων Μονιμοποίηση του φυτικού υλικού Αποτελέσματα Olea europaea L. Cercis siliquastrum L. Συζήτηση και συμπεράσματα Μορφολογία Φυσιολογία και ρυθμιστικοί μηχανισμοί Βιβλιογραφία σελ. 3 σελ. 4 σελ. 4 σελ. 5 σελ. 8 σελ. 12 σελ. 13 σελ. 13 σελ. 13 σελ. 18 σελ. 23 σελ. 23 σελ. 24 σελ. 45 σελ. 45 σελ. 46 σελ. 48 2
Περίληψη Η δομή των φακιδίων μελετήθηκε κατά τη διάρκεια του έτους με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (Scanning Electron Microscopy SEM), οπτικού μικροσκοπίου, οπτικού μικροσκοπίου φθορισμού καθώς και με ιστοχημικές τεχνικές. Παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των σχηματισμών των δύο υπό έρευνα φυτών. Τα φακίδια της Olea europaea (ελιά) ανήκουν στον τύπο Magnolia, Populus και Pyrus (Esau, 1965). Τα γεμιστικά κύτταρα είναι φελλοποιημένα, όπως προκύπτει από τις ιστοχημικά δεδομένα μας και δεν υπάρχει κανενός είδους καλυπτήριο στρώμα (closing layer). Χαλαρά διευθετημένα, με λεπτά τοιχώματα κύτταρα εναλλάσσονται ετησίως με κύτταρα με παχιά τοιχώματα με μικρότερους μεσοκυττάριους χώρους. Καθ όλη τη διάρκεια του έτους, ο φθορισμός της χλωροφύλλης παρατηρήθηκε εντονότερος σε περιοχές του φλοιού παρακείμενες στα φακίδια από ότι σε πιο απομακρυσμένες Τα φακίδια του Cercis siliquastrum (κουτσουπιά) ανήκουν στον τύπο Prunus και Robinia (Esau, 1965). Χαρακτηρίζονται από στιβάδες χαλαρά διευθετημένων, μη φελλοποιημένων γεμιστικών κυττάρων τα οποία καλύπτονται από ένα στρώμα φελλοποιημένων κυττάρων (closing layer). Το στρώμα αυτό σπάζει κατά την αρχή της βλαστητικής περιόδου εξαιτίας της πιέσεως που δημιουργείται από τα υποκείμενα, μη φελλοποιημένα κύτταρα, τα οποία συνεχώς παράγονται από το φελλογόνιο κατά την περίοδο αυτή και αντικαθίσταται από ένα νέο στρώμα που δημιουργείται προς το τέλος της. Αντιστοιχίες παρατηρήθηκαν με την Olea europaea όσον αφορά στο φθορισμό της χλωροφύλλης,. 3
Εισαγωγή Τα υπό μελέτη φυτά Olea europaea L. (Oleaceae) Η ελιά είναι ένα τυπικό αείφυλλο σκληρόφυλλο μεσογειακό είδος (Εικ 1). Τα φύλλα της είναι απλά, με μήκος 8-9 cm και διατάσσονται αντίθετα. Τα άνθη είναι υπόγυνα και τετραμερή. Η ωοθήκη αποτελείται από δύο καρπόφυλλα συμφυόμενα. Ο καρπός είναι δρύπη. Καλλιεργείται στις χώρες της λεκάνης της μεσογείου εδώ και τρεις περίπου χιλιετίες. Η υψηλή ανθεκτικότητά της στην ξηρασία και στην αλατότητα του εδάφους, καθώς και το γεγονός ότι έχει μεγάλη παραγωγικότητα σε καρπούς ακόμα και αν δεν φροντισθεί αρκετά ή εγκαταλειφθεί, είναι μερικά από τα χαρακτηριστικά που εξηγούν τους λόγους που καλλιεργήθηκε τόσο νωρίς από τους Μεσογειακούς λαούς. Το προϊόν με τη μεγαλύτερη οικονομική σημασία είναι φυσικά το ελαιόλαδο. Χρησιμοποιείται ευρέως στη μαγειρική -κυρίως στις μεσογειακές χώρες-, στη φαρμακευτική, ενώ στο παρελθόν είχε και άλλες χρήσεις (ως λιπαντικό ή φωτιστικό μέσο εξαιτίας της έλλειψης άλλων υποκατάστατων). Η σύσταση του ελαιόλαδου διαφέρει από ποικιλία σε ποικιλία. Αποτελείται, κατά κύριο λόγο, από αλυσίδες λιπαρών οξέων συνδεδεμένων με γλυκερόλη. Τυπικά, η ακόλουθη αναλογία λιπαρών οξέων χαρακτηρίζει το ελαιόλαδο: 66% ολεϊκό οξύ, 12% λινολεϊκό οξύ, 9% παλμιτικό οξύ, 5% εικοσενοϊκό οξύ και 5% παλμιτολεϊκό οξύ. Η γεύση του ελαιόλαδου εξαρτάται από αλδεΰδες (εξανάλη και 2-εξανάλη), ενώ ανώτερες αλδεΰδες, αλκοόλες και οι εστέρες των οξικών οξέων τους συμβάλλουν στο χαρακτηριστικό του άρωμα. Στο άρωμα επίσης μπορεί να συμβάλουν και ημιτερπενοειδή (3-μεθυλοβουτανάλη, 4-μεθόξυ-2-μεθυλοβουτανεθειόλη) που έχουν ανιχνευθεί σε μικρότερα ποσοστά. 4
Cercis siliquastrum L. (Leguminosae) Η κουτσουπιά είναι φυλλοβόλο δέντρο (Εικ. 2). Τα φύλλα της είναι απλά, καρδιόσχημα και διατάσσονται κατ εναλλαγή. Τα άνθη έχουν ωραίο κόκκινο χρώμα και η έκπτυξή τους προηγείται αυτής των φύλλων. Η ανθοφορία διαρκεί τον Μάρτιο και τον Απρίλιο. Ο καρπός είναι χέδρωπας. Σε ώριμη ηλικία αντέχει τις χειμερινές θερμοκρασίες που φθάνουν και μέχρι τους 15 ο C. Σε νεαρή όμως ηλικία είναι πολύ ευαίσθητο στους παγετούς. Αναπτύσσεται και σε φτωχά εδάφη, σε ξηρά ή νωπά, σε ελαφριά, μέτρια ή βαριά, αρκεί να αποστραγγίζονται καλά. Αντέχει επίσης σε όξινα, ουδέτερα μέχρι και πολύ αλκαλικά εδάφη, δεν αντέχει όμως σε αλατούχα. Χρησιμοποιείται για κατασκευή ακριβής ξύλινης επένδυσης και στη μαγειρική. Τα άνθη του δίνουν μια ελκυστική όψη και έτσι καλλιεργείται ως καλλωπιστικό. Δημιουργεί συμβιώσεις (μυκόρριζα) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εδαφοβελτιωτικό, ιδίως σε φτωχά σε άζωτο εδάφη. Το περίδερμα Γενικά Το περίδερμα αποτελεί έναν προστατευτικό ιστό δευτερογενούς προέλευσης. Αντικαθιστά την επιδερμίδα όταν αυτή διαρρηγνύεται εξαιτίας της κατά πλάτος αύξησης του άξονα του φυτού, πράγμα το οποίο κατά κανόνα συμβαίνει μετά την έναρξη της δευτερογενούς ανάπτυξης. Ο σχηματισμός περιδέρματος είναι κοινό φαινόμενο σε δευτερογενείς βλαστούς και ρίζες γυμνοσπέρμων και δικοτυληδόνων, ενώ μπορεί να παρατηρηθεί σε φύλλα ή ακόμα και σε καρπούς μετά από τραυματισμό. Σπάνια, μονοκοτυλήδονα φυτά αναπτύσσουν προστατευτικό ιστό παρόμοιο με αυτό των δικοτυληδόνων. Το περίδερμα αποτελείται από τρία διακριτά στρώματα. Το φελλογόνιο, το φελλό και το φελλόδερμα. Το φελλογόνιο είναι ένα δευτερογενές μερίστομα το οποίο παράγει το φελλό προς τα έξω και το φελλόδερμα προς τα μέσα. Τα κύτταρά του έχουν λεπτά πρωτογενή κυτταρικά τοιχώματα και πυκνό κυτταρόπλασμα. Μπορεί να 5
περιέχουν χλωροπλάστες και συχνά συσσωρεύουν ανθοκυανίνες στα πρώιμα στάδια ανάπτυξής τους και ταννίνες αργότερα. Το φελλόδερμα αποτελείται από ζωντανά παρεγχυματικά κύτταρα που μοιάζουν με αυτά του φελλογονίου μόνο κατά τα πρώιμα στάδια. Τα κύτταρα του φελλού, τέλος, διατάσσονται σε αλλεπάλληλες σειρές πάνω από το φελλογόνιο, συμπαγώς, χωρίς μεσοκυττάριους χώρους. Πεθαίνουν μετά από σύντομο χρονικό διάστημα, συνήθως πριν το τέλος της αναπτυξιακής περιόδου. Στα τοιχώματά τους εναποτίθεται φελλίνη (σουβερίνη). Η εναπόθεση ξεκινά ενώ τα κύτταρα αυξάνονται σε μέγεθος και συνεχίζεται αφού το αποκτήσουν. Τα τοιχώματά τους μπορεί να είναι λεπτά ή παχιά. Το πρωτογενές τοίχωμα αποτελείται από κυτταρίνη. Εάν τα τοιχώματα είναι λεπτά, η φελλίνη έχει εναποτεθεί βαθμιαία με αποτέλεσμα τον σχηματισμό διακριτών στρωμάτων. Στα κύτταρα με παχιά τοιχώματα, κυτταρίνη συνεχίζει να παράγεται προς το εσωτερικό των κυττάρων. Αφού τα κυτταρικά τοιχώματα λάβουν την τελική μορφή τους, τα κύτταρα συσσωρεύουν ταννίνες ή ρητίνες. Τελικά, ο πρωτοπλάστης εξαφανίζεται και ο χώρος, τον οποίο αυτός κατελάμβανε, γεμίζει με αέρα. Η προέλευση του φελλογονίου Προτού αναφερθούμε εκτενώς στην προέλευση του φελλογονίου, είναι απαραίτητο να γίνει διάκριση μεταξύ του πρώτου περιδέρματος και των επόμενων, τα οποία αναπτύσσονται κάτω από το πρώτο και το αντικαθιστούν, καθώς συνεχίζεται η ανάπτυξη. Η προέλευση του φελλογονίου του πρώτου περιδέρματος ποικίλλει ανάλογα με το είδος του φυτού σε ότι αφορά τη θέση αλλά και τον ιστό από τον οποίο προέρχεται. Στους βλαστούς μπορεί να προέρχεται από διάφορα σημεία εξωτερικά του καμβίου. Συγκεκριμένα δε, από την επιδερμίδα, από υποεπιδερμικά στρώματα ή από εξωτερικά στρώματα του φλοιού. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις προέλευσης του φελλογονίου ακόμα και από το φλοίωμα. Εάν το πρώτο περίδερμα ακολουθείται και από επόμενα, τότε αυτά σχηματίζονται σε σταδιακά βαθύτερα στρώματα του φλοιού ή του φλοιώματος. Στη ρίζα το φελλογόνιο προέρχεται πάντα από το περικύκλιο. Τα μητρικά κύτταρα του φελλογονίου συσσωρεύουν αρχικά ταννίνες, ουσίες οι οποίες εξαφανίζονται μετά την πλήρη διαφοροποίησή τους. Οι πρώτες περικλινείς διαιρέσεις λαμβάνουν χώρα είτε σε διασκορπισμένες απομονωμένες θέσεις στην περιφέρεια, είτε σχηματίζουν έναν δακτύλιο. Από αυτές τις διαιρέσεις προκύπτουν 6
δύο όμοια θυγατρικά κύτταρα. Εξ αυτών, το εσωτερικό παύει να διαιρείται και γίνεται κύτταρο του φελλοδέρματος, ενώ το εξωτερικό διαφοροποιείται σε μεριστοματικό κύτταρο του φελλογονίου. Από την δεύτερη περικλινή διαίρεση, το εσωτερικό κύτταρο παραμένει μεριστοματικό, ενώ το εξωτερικό διαφοροποιείται σε κύτταρο του φελλού. Το αρχικό περίδερμα στα περισσότερα γυμνόσπερμα και δικοτυλήδονα φυτά σχηματίζεται κατά το πρώτο έτος της ανάπτυξης, συνήθως μετά τη συμπλήρωση της επιμήκυνσης του οργάνου. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η ανάπτυξη είναι σχεδόν ταυτόχρονη σε όλη την περιφέρεια του βλαστού. Εάν το περίδερμα σχηματισθεί αργότερα, τότε οι διαιρέσεις ξεκινούν σε απομακρυσμένες θέσεις και εξαπλώνονται με αργό ρυθμό γύρω από την περιφέρεια. Εκτός από το είδος του φυτού, πλήθος άλλων παραγόντων επηρεάζει την έναρξη του σχηματισμού του περιδέρματος, χωρίς ο τρόπος με τον οποίο αυτοί οι παράγοντες επιδρούν να είναι καλά διευκρινισμένος. Μεταξύ άλλων έχουν αναφερθεί το υδατικό δυναμικό του ιστού, η ένταση του φωτός, η παρουσία ορμονών και η φωτοπερίοδος. Δραστηριότητα του φελλογονίου Δύο μεριστοματικοί ιστοί συμβάλλουν στην κατά πλάτος αύξηση των φυτών. Το κάμβιο και το φελλογόνιο. Ο ρυθμός με τον οποίο το φελλογόνιο παράγει νέα κύτταρα είναι κατά πολύ μικρότερος από αυτόν του καμβίου. Σε κάθε αναπτυξιακή περίοδο 200 ή και περισσότερα στρώματα κυττάρων (ο αριθμός προφανώς εξαρτάται από το είδος και τις περιβαλλοντικές συνθήκες) μπορεί να παραχθούν από το κάμβιο. Το φελλογόνιο σε αντίστοιχες συνθήκες παράγει λίγα μόνο στρώματα. Ο ρυθμός ανάπτυξης, όμως, δεν είναι η μόνη διαφορά μεταξύ των δύο ιστών. Σε αρκετά φυτά έχει παρατηρηθεί ότι οι περίοδοι κατά τις οποίες οι δύο ιστοί είναι ενεργοί δεν συμπίπτουν (Waisel, 1995). Επιπλέον, ο τρόπος με τον οποίο η μεταβολή των περιβαλλοντικών συνθηκών τους επηρεάζει, δεν είναι ο ίδιος. Οι παραπάνω διαφορές έχουν αποδοθεί σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες, ή στην παρουσία διαφορετικών παραγόντων που επηρεάζουν τα δύο μεριστόματα. 7
Φακίδια Τα φακίδια είναι ειδικές διαφοροποιημένες δομές του περιδέρματος και χαρακτηρίζονται από τη χαλαρή διευθέτηση των κυττάρων τους. Εξαιτίας της παρουσίας μεγάλων, σε σχέση με το υπόλοιπο περίδερμα, μεσοκυττάριων χώρων, στα φακίδια αποδόθηκε ο ρόλος της ανταλλαγής των αερίων στο βλαστό. Διαφορετικοί ρόλοι έχουν πρόσφατα προταθεί για τους σχηματισμούς αυτούς, αλλά αυτοί θα εκτεθούν αναλυτικότερα στη συνέχεια. Σε περιδέρματα που προέρχονται από τα υποεπιδερμικά στρώματα, τα φακίδια συνήθως σχηματίζονται κάτω από τα στόματα. Μπορεί να εμφανισθούν πριν ο βλαστός ολοκληρώσει την πρωτογενή ανάπτυξή του και πριν σχηματισθεί το φελλογόνιο, ή να εμφανισθούν ταυτόχρονα με το φελλογόνιο με τη λήξη της πρωτογενούς ανάπτυξης. Τα παρεγχυματικά κύτταρα τα οποία περιβάλλουν τον υποστομάτιο χώρο διαιρούνται, όχι με συγκεκριμένο προσανατολισμό, εξαφανίζεται η χλωροφύλλη και δημιουργείται ένας άχρωμος χαλαρός ιστός. Εν συνεχεία, οι διαιρέσεις γίνονται σε βαθύτερα στρώματα, αποκτούν συγκεκριμένο προσανατολισμό (γίνονται περικλινείς) και έτσι έχουμε το σχηματισμό ενός δευτερογενούς μεριστόματος, του φελλογονίου του φακιδίου, το οποίο είναι συνεχές με το υπόλοιπο φελλογόνιο. Τα κύτταρα που έχουν προέλθει από τις αρχικές διαιρέσεις καθώς και αυτά που παράγονται από το μερίστομα προς το εξωτερικό, καλούνται γεμιστικά. Καθώς τα κύτταρα αυτά αυξάνουν σε αριθμό, σπάζουν την υπερκείμενη επιδερμίδα και προβάλλουν στην επιφάνεια. Τα εκτεθειμένα κύτταρα νεκρώνονται, απομακρύνονται και εν συνεχεία αντικαθίστανται από αυτά που παράγει το φελλογόνιο. Προς το εσωτερικό, το φελλογόνιο του φακιδίου παράγει κύτταρα φελλοδέρματος, συνήθως περισσότερα από ότι σε άλλα σημεία. Δεδομένου ότι τα κύτταρα που παράγονται προς το εξωτερικό και προς εσωτερικό είναι περισσότερα από το υπόλοιπο φελλογόνιο, τα φακίδια προεκβάλλουν εξωτερικά αλλά και εισχωρούν περισσότερο εσωτερικά, πράγμα το οποίο τα καθιστά ευκόλως διακριτά, ακόμα και με γυμνό μάτι στις περισσότερες περιπτώσεις. Κάποια φακίδια αναπτύσσονται σε περιοχές όπου δεν υπάρχουν στόματα, είτε ταυτόχρονα με αυτά που σχηματίζονται κάτω από τα στόματα, είτε αργότερα. Φακίδια μπορεί να σχηματισθούν σε περιοχές του περιδέρματος που πρωτύτερα έχει παραχθεί φελλός. Σε αυτή την περίπτωση σταματά η παραγωγή φελλού, το 8
φελλογόνιο παράγει γεμιστικά κύτταρα (μετατρέπεται δηλαδή σε φελλογόνιο του φακιδίου) τα οποία σπάζουν τα υπερκείμενα στρώματα του φελλού και προεκβάλλουν στην επιφάνεια. Φακίδια που σχηματίζονται σε περιδέρματα των οποίων το φελλογόνιο δεν έχει επιδερμική ή υποεπιδερμική προέλευση δεν σχετίζονται με κανένα τρόπο με τα στόματα. Το ίδιο φυσικά ισχύει για φακίδια των περιδερμάτων που έπονται του αρχικού. Τύποι φακιδίων Η ποιότητα του γεμιστικού ιστού ποικίλλει ανάμεσα στα φακίδια με αποτέλεσμα να γίνεται δυνατή μία κατηγοριοποίηση των σχηματισμών αυτών. Στα γυμνόσπερμα, τα γεμιστικά κύτταρα είναι φελλοποιημένα και συνεπώς ομοιάζουν με τα κύτταρα του φελλού. Η διαφορά τους έγκειται στα λεπτότερα τοιχώματα τους και στην ύπαρξη μεσοκυττάριων χώρων. Στα δικοτυλήδονα φυτά, διακρίνονται τρεις τύποι φακιδίων (Esau, 1965): Τύπος Magnolia, Populus και Pyrus: Τα γεμιστικά κύτταρα είναι φελλοποιημένα και συμπαγώς διατεταγμένα, ωστόσο υπάρχουν μεσοκυττάριοι χώροι. Κύτταρα με λεπτά τοιχώματα και αραιότερη διάταξη εναλλάσονται ετησίως με κύτταρα με παχιά τοιχώματα και πυκνή διάταξη. Τύπος Quercus και Fraxinus: Τα γεμιστικά κύτταρα είναι μη φελλοποιημένα και εναλλάσονται με καλυπτήρια στρώματα (closing layers) φελλοποιημένων κυττάρων. Τύπος Prunus και Robinia: Αποτελούνται από στιβάδες χαλαρά διευθετημένων, μη φελλοποιημένων γεμιστικών κυττάρων τα οποία καλύπτονται από ένα στρώμα φελλοποιημένων κυττάρων (closing layer). Το στρώμα αυτό σπάζει κατά την αρχή της βλαστητικής περιόδου εξαιτίας της πιέσεως που δημιουργείται από τα υποκείμενα, μη φελλοποιημένα κύτταρα, τα οποία συνεχώς παράγονται από το φελλογόνιο κατά την περίοδο αυτή και αντικαθίσταται από ένα νέο στρώμα που δημιουργείται προς το τέλος της. 9
Φυσιολογία των φακιδίων Όπως αναφέρθηκε σε προηγουμένη ενότητα, η ύπαρξη των μεσοκυττάριων χώρων του γεμιστικού ιστού και η συνέχειά τους με αντίστοιχους χώρους στο εσωτερικό των βλαστών οδήγησε εύλογα στην υπόθεση ότι τα φακίδια παίζουν το ρόλο των στομάτων στους βλαστούς και τις ρίζες με δευτερογενή ανάπτυξη. Την υπόθεση αυτή υποστηρίζουν και τα δεδομένα των Groh et al. (2002). Στην εργασία αυτή μετρήθηκε η περατότητα μεμονωμένων φακιδίων των φυτών Betula potanii και Sambucus nigra σε νερό και αέρια (Ο 2 ) και συγκρίθηκε με αυτή του φελλού (σε περιοχές χωρίς φακίδια) και με αυτή των στομάτων. Διαπιστώθηκε ότι η περατότητα των φακιδίων είναι στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή των περιοχών του φελλού που στερείται φακιδίων. Επιπλέον, η περατότητα των στομάτων βρέθηκε υψηλότερη από αυτή των φακιδίων, οι διαφορές ωστόσο ήταν μικρότερες της μίας τάξης μεγέθους. Τα παραπάνω στοιχεία οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι υπάρχει σαφής αντιστοιχία μεταξύ επιδερμίδας και στομάτων από τη μία, και φελλού και φακιδίων από την άλλη. Περαιτέρω ενίσχυση της αρχικής υπόθεσης δίνουν οι παρατηρήσεις του Lendzian (2006). Σύμφωνα με αυτές, στα αποτελέσματα των Groh et al. (2002), έχει υποεκτιμηθεί σημαντικά η περατότητα των φακιδίων. Ο λόγος για αυτήν την υποεκτίμηση είναι ότι ο υπολογισμός της περατότητας έγινε με βάση τη συνολική επιφάνεια του φακιδίου, ενώ, σύμφωνα με τα δεδομένα του Lendzian, μόνο το 5% περίπου της επιφάνειας του φακιδίου καταλαμβάνεται από μεσοκυττάριους χώρους. Συνεπώς η περατότητα των φακιδίων πρέπει να διορθωθεί προς τα πάνω κατά 20 περίπου φορές. Οι Langefeld Heyser et al. (1996) μελέτησαν με μικροαυτοραδιογραφικές μεθόδους βλαστούς του Fraxinus excelsior. Συγκεκριμένα, τους τοποθέτησαν σε περιβάλλον με ραδιενεργό διοξείδιο του άνθρακα ( 14 CO 2 ) και διαπίστωσαν ότι οι περιοχές οι παρακείμενες στα φακίδια παρουσίασαν τη μέγιστη απορρόφηση του αερίου. Ο αυτοφθορισμός της χλωροφύλλης σε αυτές τις περιοχές ήταν έντονος και από το γεγονός αυτό εύλογα προέκυψε ότι το 14 CO 2 αφομοιώθηκε φωτοσυνθετικά. Οι ερευνητές ωστόσο υποστηρίζουν ότι ο κύριος ρόλος του χλωρεγχύματος του φακιδίου, δεν είναι η απορρόφηση του από το εξωτερικό προερχόμενου διοξειδίου του άνθρακα, αλλά η επανάκτηση του προερχόμενου από την αναπνοή του βλαστού, 10
το οποίο μπορεί, σε διαφορετική περίπτωση, να διαφύγει διαμέσου των μεσοκυττάριων χώρων των γεμιστικών κυττάρων. Σε διαφορετικά αποτελέσματα κατέληξαν οι Mancuso & Marras (2003) μελετώντας τους τρόπους με τους οποίους το οξυγόνο παρέχεται στους βλαστούς της Olea europaea. Κατέληξαν στο ότι η κύρια οδός παροχής οξυγόνου και ενδεχομένως και άλλων αερίων - στο βλαστό είναι, κατά τη διάρκεια της ημέρας, το διαπνευστικό ρεύμα και, κατά τη διάρκεια της νύχτας, η διάχυση από το ξύλωμα καθώς και στο ότι τα φακίδια ελάχιστα, ή λίγο, συνεισφέρουν σε αυτή. Πρέπει ωστόσο να τονισθεί ότι η μελέτη αυτή αφορούσε μόνο το παρέγχυμα του ξυλώματος και όχι το σύνολο του βλαστού. Οι ερευνητές μάλιστα τονίζουν ότι το οξυγόνο που προέρχεται από τα φακίδια μπορεί να καταναλώνεται από το κάμβιο ειδικά κατά την βλαστητική περίοδο όταν και οι ενεργειακές απαιτήσεις του μεριστοματικού ιστού είναι πολύ υψηλές. Οι Pfanz et al (2002) πρότειναν ένα εναλλακτικό ρόλο για τα φακίδια. Συγκεκριμένα, θεώρησαν ότι τα φακίδια μπορεί να λειτουργούν ως φυσικά ανοίγματα διαμέσου των οποίων διέρχεται το φως ώστε να επιτελεσθεί η φωτοσύνθεση στο εσωτερικό του βλαστού. Η υπόθεση αυτή ελέγχθηκε (Manetas & Pfanz, 2004) και, αντίθετα από ότι ανεμένετο, αποδείχθηκε λανθασμένη. Η διαπερατότητα των φακιδίων σε φως μετρήθηκε σε δέκα φυτά και σε όλες τις περιπτώσεις ήταν χαμηλότερη από περιοχές που στερούνταν φακιδίων. 11
Σκοπός της εργασίας Τα φακίδια θεωρούνταν κατά το παρελθόν στατικές δομές. Διαπιστώθηκε, όπως προανεφέρθη, ότι κάτι τέτοιο δεν ισχύει και ότι κατά τη διάρκεια του έτους παρατηρούνται αλλαγές στη δομή τους (Wutz, 1955; Rosner & Kartush, 2003). Οι αλλαγές αυτές ενδέχεται να αποτελούν ενδείξεις ενός ρυθμιστικού μηχανισμού των φυτών, ο οποίος φυσικά δρα σε μεγαλύτερο βάθος χρόνου, συγκρινόμενος με αυτό των στομάτων. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δομή των φακιδίων των βλαστών των φυτών Olea europaea και Cercis siliquastrum. Η μελέτη έγινε κατά τη διάρκεια του έτους με σκοπό να διαπιστωθούν τυχόν περιοδικές-εποχικές αλλαγές. Απώτερος σκοπός ήταν να δοθούν στοιχεία που να αφορούν στην οντογένεση, τη δομή και τη φυσιολογία των σχηματισμών αυτών. 12
Υλικά, όργανα και μέθοδοι Συλλογή φυτικού υλικού Η συλλογή του προς μελέτη υλικού έγινε από φυτά που αναπτύσσονται στο χώρο του Πανεπιστημίου Πατρών. Ελήφθησαν δείγματα από τρία διαφορετικά στάδια ωριμότητας. Συγκεκριμένα: Βλαστοί ηλικίας ενός έτους Βλαστοί ηλικίας τριών ετών Βλαστοί ηλικίας πέντε έξι ετών Οι δειγματοληψίες έλαβαν χώρα στο χρονικό διάστημα από το Νοέμβριο του 2004 μέχρι και τον Ιούνιο του 2006 και επαναλαμβάνονταν μηνιαίως (από τις 20 μέχρι τις 25 κάθε μήνα). Παρατήρηση νωπών παρασκευασμάτων Τμήση και χρώση του ιστού Για την παρατήρηση νωπών παρασκευασμάτων ελήφθησαν με τη βοήθεια λεπίδας λεπτές εγκάρσιες τομές βλαστών από τα τρία προαναφερθέντα στάδια ωριμότητας. Δεν κατέστη δυνατό να χρησιμοποιηθεί μικροτόμος (και άρα να καθορισθεί με ακρίβεια το πάχος των τομών) εξαιτίας της μαλθακότητας των βλαστών. Για τη χρώση των τομών χρησιμοποιήθηκαν σε πρώτο στάδιο τρεις διαφορετικές χρωστικές. Η χρωστική Toluidine blue O, η Sudan III και η Fluorol yellow 088. Η Toluidine blue O είναι μη ειδική χρωστική, έχει ωστόσο χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την παρατήρηση στρωμάτων φελλίνης σε μικροσκόπιο επιφθορισμού (Ma & Peterson, 2001). Η Sudan III είναι ειδική χρωστική και βάφει εκλεκτικά τα λιπίδια (συμπεριλαμβανομένης της φελλίνης). Η Fluorol yellow 088 είναι ειδική φθορίζουσα χρωστική η οποία προσδένεται επίσης στα λιπιδικά συστατικά του κυττάρου. Η χρήση και των τριών αυτών χρωστικών ήταν κατ αρχήν σημαντική για τον εντοπισμό της φελλίνης στους ιστούς. Στη 13
συνέχεια των δειγματοληψιών χρησιμοποιήθηκε μόνο η Fluorol yellow 088, καθώς, όπως προέκυψε από τα δεδομένα μας (Εικ. 3, 4, 5) αλλά και από τη βιβλιογραφία (Brundrett et al, 1991), η ποιότητα των εικόνων με τη χρήση αυτής της χρωστικής είναι σαφώς ανώτερη. Φθορισμός Μικροσκόπιο φθορισμού Ο φθορισμός αποτελεί έναν από τους τρόπους αποδιέγερσης ενός μορίου το οποίο έχει διεγερθεί μετά από ακτινοβόληση με φως ενός ορισμένου μήκους κύματος. Η απορρόφηση της ακτινοβολίας αυτής έχει ως αποτέλεσμα ένα ή περισσότερα ηλεκτρόνια να μεταπηδούν σε τροχιές υψηλότερης ενεργειακής στάθμης. Ως γνωστόν, η ενέργεια ενός ηλεκτρονίου εξαρτάται από τη θέση της τροχιάς και από την ταχύτητά του, ωστόσο και τα δύο περιορίζονται σε καθορισμένες επιτρεπτές τιμές (συγκεκριμένες για κάθε μόριο). Συνεπώς, για να μεταπηδήσει ένα ηλεκτρόνιο από τη μία επιτρεπτή τιμή στην άλλη, η φωτεινή ακτινοβολία που θα απορροφήσει θα πρέπει να έχει συγκεκριμένη ενέργεια και άρα συγκεκριμένο μήκος κύματος. Με την απορρόφηση, λοιπόν, φωτός κατάλληλου μήκους κύματος ένα μόριο μεταπίπτει από τη βασική κατάσταση σε κατάσταση διεγέρσεως. Η κατάσταση διεγέρσεως είναι εξαιρετικά ασταθής και το μόριο ταχύτατα επανέρχεται στη βασική κατάσταση αποδίδοντας με διάφορους τρόπους την ενέργεια που απορρόφησε. Ένας εξ αυτών είναι η εκπομπή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας μικρότερης ενέργειας (και άρα μεγαλύτερου μήκους κύματος) από αυτή που απορροφήθηκε. Το φαινόμενο αυτό καλείται φθορισμός. Η μικροσκοπία φθορισμού βασίζεται στα προααφερθέντα φαινόμενα. Στο σχήμα 1 αναπαρίσταται η αρχή λειτουργίας του μικροσκοπίου επιφθορισμού. Το φώς εξέρχεται από τη φωτεινή πηγή (ΗΒΟ lamp 50 W) και συναντά το πρώτο κατά σειρά φίλτρο (excitation filter). Το φίλτρο αυτό επιτρέπει τη διέλευση φωτός μόνο των μηκών κύματος που θα διεγείρουν τα προς εντοπισμό και παρατήρηση μόρια. Αυτό το φως κατόπιν συναντά τον διχρωικό κρύσταλλο (dichroic beam splitter) ο οποίος αντανακλά τη δέσμη προς το δείγμα (specimen). Το δείγμα ακτινοβολείται, γεγονός που οδηγεί στη σειρά των φαινομένων που περιγράψαμε παραπάνω. Στο σημείο αυτό είναι σημαντικό να τονίσουμε ότι δεν έχουν όλα τα μόρια την ικανότητα φθορισμού. Έτσι, είναι σε κάποιες περιπτώσεις απαραίτητη η χρήση ορισμένων φθοριζουσών χρωστικών (fluorochromes), οι οποίες προσδένονται πάνω στα μόρια αυτά. Το φως 14
που εκπέμπεται διέρχεται ξανά από τον διχρωικό κρύσταλλο και το δεύτερο φίλτρο (barrier filter) με αποτέλεσμα στον προσοφθάλμιο φακό (ή/και τη φωτογραφική μηχανή) να φθάνει μόνο ο φθορισμός του προς μελέτη μορίου. Είναι προφανές ότι ανάλογα με το προς μελέτη μόριο χρησιμοποιούνται διαφορετικά σετ φίλτρων. Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν τα σετ φίλτρων 02 (G 365, FT 395, LP 420) και 09 (450-490, FT 510, LP 520) της εταιρείας Zeiss. Στα σχήματα 2 και 3 διακρίνονται τα χαρακτηριστικά αυτών των φίλτρων. Παρατήρηση Η παρατήρηση των νωπών παρασκευασμάτων πραγματοποιήθηκε σε οπτικό μικροσκόπιο τύπου Axioplan της εταιρίας Zeiss εφοδιασμένο με λυχνία υπεριώδους ακτινοβολίας (ΗΒΟ 50W, Osram) και οι φωτογραφίες ελήφθησαν με ψηφιακή μηχανή τύπου AxioCam MRc 5 της Zeiss. 15
Μονιμοποίηση του Φυτικού υλικού Στερέωση Για τη διαδικασία της στερέωσης χρησιμοποιήθηκαν στερεωτικά ταχείας διείσδυσης με σκοπό την κατά το δυνατόν μικρότερη αλλοίωση του ιστού. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε γλουταρική αλδεΰδη (Glutaraldehyde, 25% v/v) και τετροξείδιο του οσμίου (OsO 4 ). Τα στερεωτικά αυτά είναι μη θρομβωτικά (non coagulant), δηλαδή δεν σχηματίζουν δικτυωτά πλέγματα (θρόμβους), και προσθετικά, δηλαδή σχηματίζουν πολλαπλούς δεσμούς με τις κυτταρικές δομές αποτελώντας μετά τη στερέωση ενσωματωμένα συστατικά αυτών. Η γλουταρική αλδεΰδη «ακινητοποιεί» τις πρωτεΐνες ενώ το τετροξείδιο του οσμίου συγκρατεί τα λιπίδια (ανορθώνει τους διπλούς δεσμούς των ανθρακικών αλυσίδων και συνδέεται με εστερικούς δεσμούς σε αυτά). Όπως είναι ευνόητο, οι λιποπρωτεϊνικής φύσεως μεμβράνες του κυττάρου, οι οποίες έχουν υποστεί επεξεργασία με αυτά τα στερεωτικά, διατηρούνται ανέπαφες. Η θερμοκρασία κατά την διάρκεια της διαδικασίας διατηρήθηκε σταθερή στους 5 ο C (θερμοκρασία ψυγείου). Η χαμηλή αυτή θερμοκρασία είναι απαραίτητη προκειμένου να ανασταλεί η δράση υδρολυτικών ενζύμων, τα οποία, μετά το θάνατο του κυττάρου, συντελούν στην αυτόλυσή του (καταστρέφουν τις πρωτοπλασματικές δομές). Το ph του στερεωτικού μέσου, με τη βοήθεια ρυθμιστικού διαλύματος, καθορίσθηκε σε τιμή μεταξύ του 7 και του 7,2, όση και η φυσιολογική του τιμή στα ζωντανά φυτικά κύτταρα. Το ρυθμιστικό αυτό αποτελείται από διάλυμα μονόξινου φωσφορικού νατρίου (Na 2 HPO 4.2H 2 O) 0,025Μ και δισόξινου φωσφορικού νατρίου (NaH 2 PO 4.H 2 O) 0,025Μ σε αναλογία 3/2. Η πορεία της στερέωσης είναι η εξής: Το φυτικό υλικό κόπηκε σε μικρά κομμάτια (έτσι ώστε να είναι πιο εύκολο στα στερεωτικά να διεισδύσουν στο εσωτερικό του ιστού) μέσα σε στερεωτικό μέσο. Το μέσο αυτό ήταν διάλυμα γλουταρικής αλδεΰδης και ρυθμιστικού σε αναλογία 1/7. Το υλικό παρέμεινε στο μέσο αυτό για 2 περίπου ώρες. Ξεπλύθηκε στη συνέχεια με το 16
ρυθμιστικό (2 δεκαπεντάλεπτα) για να απομακρυνθεί το στερεωτικό και ακολούθησε δεύτερη στερέωση (μεταστερέωση) σε διάλυμα τετροξειδίου του οσμίου 1% σε ρυθμιστικό. Το υλικό παρέμεινε εδώ για δύο ακόμα ώρες. Μετά από νέο ξέπλυμα δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα το υλικό ήταν έτοιμο προς αφυδάτωση. Αφυδάτωση Η αφυδάτωση είναι αναγκαία τόσο για την παρατήρηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (το οποίο λειτουργεί σε συνθήκες κενού και η υγρασία σε αυτή την περίπτωση μπορεί να έχει καταστροφικές συνέπειες στον ιστό), όσο και σε οπτικό (τα υλικά της έγκλεισης είναι λιπόφιλα). Ως αφυδατωτικό μέσο χρησιμοποιήθηκε η ακετόνη (CH 3 COCH 3 ). Το υλικό πέρασε διαδοχικά από διαλύματα αυξανόμενης συγκέντρωσης ακετόνης- νερού αρχίζοντας από 50% διάλυμα μέχρι και το απόλυτο αφυδατωτικό. Η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 5 0 C. Στο σημείο αυτό η διαδικασία χωρίζεται σε δύο διακριτές πορείες ανάλογα με το αν το υλικό προορίζεται για παρατήρηση σε ηλεκτρονικό ή οπτικό μικροσκόπιο. Α) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Critical point drying Η ακετόνη είναι ιδιαίτερα πτητική και αν το υλικό μετά την αφυδάτωση αφεθεί σε θερμοκρασία δωματίου, θα εξατμισθεί. Ωστόσο, αυτό θα έχει ως αποτέλεσμα η εικόνα του ιστού στο μικροσκόπιο να μην αντιστοιχεί στην πραγματική (artifact). Η ξήρανση συνεπώς πρέπει να γίνει με ήπιο τρόπο. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται η συσκευή Critical Point Drier τύπου Ε 3000 (Εικ. 6). Η συσκευή αυτή αποτελείται από ένα κυλινδρικό θάλαμο με παχιά τοιχώματα ικανά να αντέχουν ισχυρές πιέσεις. Στη μία πλευρά του κυλίνδρου υπάρχει γυαλί (επίσης παχύ) το οποίο επιτρέπει την παρατήρηση της στάθμης του υγρού κατά την διαδικασία. Η άλλη πλευρά σφραγίζεται αεροστεγώς με πώμα. Τρεις βαλβίδες 17
ρυθμίζουν την είσοδο και έξοδο διοξειδίου του άνθρακα και την έξοδο ακετόνης. Επιπλέον, παροχή νερού γύρω από τον θάλαμο καθορίζει τη θερμοκρασία του. Η λειτουργία της συσκευής είναι η εξής: Το υλικό φέρεται με ειδικό λεκανάκι που περιέχει ακετόνη στο εσωτερικό του θαλάμου ο οποίος και σφραγίζεται. Η θερμοκρασία του θαλάμου σε αυτή την φάση διατηρείται στους 20 0 C με παροχή κρύου νερού, ενώ όλες οι βαλβίδες είναι κλειστές. Ακολουθεί η διαδικασία έκλουσης του ιστού (FLUSHING). Συγκεκριμένα, η βαλβίδα εισόδου του διοξειδίου ανοίγεται και ο θάλαμος γεμίζει με υγρό διοξείδιο. Ταυτόχρονα ανοίγεται και η βαλβίδα εξόδου της ακετόνης. Το διοξείδιο με αυτό τον τρόπο αντικαθιστά την ακετόνη στον ιστό. Η διαδικασία αυτή διαρκεί 5 10 λεπτά ενώ καθ όλη την διάρκειά της η στάθμη του υγρού στο θάλαμο διατηρείται σταθερή (η παρατήρηση είναι δυνατή μέσω του γυαλιού). Οι βαλβίδες κατόπιν κλείνονται και το υλικό αφήνεται για μιάμιση περίπου ώρα στο θάλαμο. Μία δεύτερη έκλουση απομακρύνει τη μικρή ποσότητα ακετόνης που ενδεχομένως έχει απομείνει οπότε ο θάλαμος περιέχει μόνο διοξείδιο του άνθρακα και οι βαλβίδες κλείνονται ξανά. Στο σημείο αυτό η παροχή νερού αλλάζει και ζεστό νερό (35-40 0 C) κυκλοφορεί γύρω από το θάλαμο. Η θερμοκρασία αυξάνει και κατ επέκταση αυξάνει και η πίεση μέσα στο θάλαμο. Κάποια στιγμή οι τιμές θερμοκρασίας και πίεσης εγγίζουν το κρίσιμο σημείο (critical point) του διοξειδίου (συγκεκριμένα 31,5 0 C και 1200 psi). Πέραν του σημείου αυτού δεν υπάρχει ευκρινής υγρή φάση και η στάθμη εξαφανίζεται. Η παροχή ζεστού νερού κλείνεται και η βαλβίδα εξόδου του διοξειδίου ανοίγεται αργά και βαθμιαία απομακρύνοντας το διοξείδιο από το θάλαμο. Το υλικό είναι πλέον εντελώς ξηρό και άθικτο. Επιμετάλλωση Η επιμετάλλωση έγινε σε συσκευή ION SPUTTER JFC 100 και το υλικό καλύφθηκε με χρυσό. 18
Β) Οπτικό μικροσκόπιο Εμπότιση - Έγκλειση Μετά την αφυδάτωση το υλικό μεταφέρθηκε σε διάλυμα οξειδίου του προπυλενίου (propylene oxide) και παρέμεινε εκεί για 15 λεπτά. Το οξείδιο του προπυλενίου αντικαταστάθηκε με εποξική ρητίνη τύπου Durcupan ACM. Η αντικατάσταση έγινε σταδιακά με μίγματα propylene oxide/durcupan σε αυξανόμενη αναλογία του δεύτερου. Η όλη διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε συσκευή περιστροφής του δοχείου με το υλικό (για την επιτυχέστερη ανάμειξη του υλικού με το μέσο εμπότισης). Η έγκλειση έγινε σε μικρές αβαθείς μήτρες σε θερμοκρασία 60 0 C για 48 ώρες. Τμήση και χρώση του ιστού Οι τομές έγιναν σε υπερμικροτόμο Reichert Om U2 (Εικ. 10). Το μαχαιρίδιο ήταν η κόψη γυαλιού σχήματος ορθογωνίου ισοσκελούς τριγώνου. Η προώθηση του μαχαιριού έγινε με χειροκίνητο τρόπο και το πάχος των τομών καθορίσθηκε στα 4 6 μm. Για τη λήψη των τομών από το μαχαιρίδιο χρησιμοποιήθηκε μικρή, οξεία στην άκρη, ξύλινη ράβδος (οδοντογλυφίδα), και ακολούθησε η μεταφορά τους σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Οι τομές κατόπιν βάφτηκαν με μπλε της τολουιδίνης (Toluidine blue O), η οποία όπως προανεφέρθη, είναι μια γενική χρωστική. Μικροσκοπική παρατήρηση του ιστού Η παρατήρηση πραγματοποιήθηκε σε Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο σαρώσεως (Scanning Εlectron Μicroscope) τύπου JEOL 6300 (Εικ. 7), σε διάφορες μεγεθύνσεις ανάλογα με το υλικό, και οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε ψηφιακή μορφή. Για την παρατήρηση των τομών χρησιμοποιήθηκε (όπως και στα νωπά παρασκευάσματα) οπτικό μικροσκόπιο τύπου Axioplan της Zeiss (Εικ 8). Οι φωτογραφίες ελήφθησαν με ψηφιακή μηχανή τύπου AxioCam MRc 5 της Zeiss (Εικ 9). 19
Αποτελέσματα Olea europaea L. Οι βλαστοί της ελιάς καλύπτονται από τρίχωμα χαρακτηριστικής ασπιδοειδούς μορφής (Εικ. 11γ) κατά τα πρώτα έτη της ανάπτυξής τους. Τα φακίδια εμφανίζονται ήδη από το πρώτο έτος σχεδόν ταυτόχρονα με το σχηματισμό περιδέρματος. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από 0,03mm 2 μέχρι 0,60mm 2 και καλύπτουν το 5,4±0,46% της συνολικής επιφάνειας του βλαστού. Σε επιφανειακή άποψη τα φακίδια της ελιάς έχουν σχήμα κυκλικό (Εικ. 11στ, 12γ). Τα γεμιστικά κύτταρα είναι πιο σφαιρικά και πιο χαλαρά διευθετημένα στο κέντρο του κύκλου ενώ εμφανίζονται πεπλατυσμένα και με πυκνότερη διάταξη στην περιφέρεια (Εικ. 12γ). Σε εγκάρσια τομή παρατηρείται η χαρακτηριστική φακοειδής μορφή εξ αιτίας της αυξημένης δράσης του φελλογονίου του φακιδίου τόσο προς το εσωτερικό (φελλόδερμα), όσο και προς το εξωτερικό (Εικ. 11α, 11δ, 12α, 13α-δ, 16α-δ). Δεν διακρίνεται κανενός είδους καλυπτήριο στρώμα (Εικ.11γ, 11στ) και τα γεμιστικά κύτταρα είναι διαρκώς εκτεθειμένα ενώ, όπως οι ιστοχημικές τεχνικές καταδεικνύουν (Εικ. 11β. 11ε, 12β), στα τοιχώματα τους εναποτίθεται φελλίνη από τα πολύ πρώιμα στάδια. Καμία μορφολογική διαφορά δεν παρατηρήθηκε στα φακίδια σε συνάρτηση με την ηλικία του βλαστού. Το μόνο που φαίνεται να διαφοροποιείται είναι το μέγεθός τους (Εικ. 11α, 11δ, 12α). Εμφανείς μορφολογικές διαφορές δεν είναι δυνατό να παρατηρηθούν ούτε κατά τη διάρκεια του έτους (Εικ. 11, 14 και 12, 15). Το φελλογόνιο είναι δραστήριο από τα μέσα της εαρινής και μέχρι τα μέσα της θερινής περιόδου και παράγει γεμιστικά κύτταρα τα οποία σχεδόν άμεσα φελλοποιούνται και αντικαθιστούν τα υπερκείμενα τα οποία παρασύρονται από τον άνεμο. Είναι σημαντικό να τονισθεί ότι υπάρχουν μεσοκυττάριοι χώροι μεταξύ τους, τουλάχιστον κατά τα πρώτα στάδια (Εικ. 13). Αργότερα, όταν, πιεζόμενα από τα νεότερα κύτταρα, μεταφέρονται προς την περιφέρεια, οι μεσοκυττάριοι χώροι είναι σαφώς μικρότεροι. Αξιοσημείωτη είναι η παρουσία χλωροπλαστών, σε περιοχές του φλοιού υποκείμενες των φακιδίων (χλωρέγχυμα) κυρίως σε νεαρούς βλαστούς. Ο εξαιρετικά έντονος αυτοφθορισμός της χλωροφύλλης καθώς και η παρατήρηση με οπτικό 20
μικροσκόπιο επιβεβαιώνουν την παραπάνω διαπίστωση (Εικ. 12δ, 12στ και 15δ, 15στ). Cercis siliquastrum L. Οι βλαστοί της κουτσουπιάς δεν καλύπτονται από τρίχωμα σε κανένα αναπτυξιακό στάδιο, γεγονός που καθιστά δυνατή την παρατήρηση των φακιδίων με γυμνό μάτι ακόμα και σε νεαρούς βλαστούς. Τα φακίδια εμφανίζονται και εδώ ταυτόχρονα με το σχηματισμό του περιδέρματος σε κάποιες περιπτώσεις ακόμα και νωρίτερα. Το μέγεθός τους ποικίλει (από 0,04 mm 2, έως 0,5 mm 2 ) ενώ καλύπτουν το 3,8±0,31% της συνολικής επιφάνειας του βλαστού. Σε επιφανειακή άποψη τα φακίδια του C. siliquastrum έχουν σχήμα ελαφρώς ελλειπτικό (Εικ. 17γ) ενώ πάνω και κάτω από αυτά η επιφάνεια του βλαστού εμφανίζει σχισίματα (Εικ. 17στ). Στις περιοχές αυτές έχουν σπάσει τα δύο ή τρία ανώτερα στρώματα κυττάρων του φελλού πιθανότατα εξαιτίας των πιέσεων που ασκούνται από τη μεγαλύτερη, σε σχέση με τον υπόλοιπο βλαστό, δράση του φελλογονίου του φακιδίου. Τα γεμιστικά κύτταρα είναι εμφανή μόνο κατά τη θερινή περίοδο, για λόγους που θα αναλυθούν εκτενώς στη συνέχεια της ενότητας, και έχουν σχήμα σχεδόν σφαιρικό (Εικ. 22γ, 22στ). Σε εγκάρσια τομή διακρίνεται το τυπικό φακοειδές σχήμα των υπό μελέτη σχηματισμών. Σε αντίθεση, ωστόσο, με τα φακίδια της O. europaea, τα φακίδια του C. siliquastrum υφίστανται μορφολογικές τροποποιήσεις κατά τη διάρκεια του έτους και μάλιστα κατά σταθερό περιοδικό τρόπο. Είναι, λοιπόν, δυνατό να διαχωρίσουμε τέσσερα χρονικά διαστήματα μέσα στο έτος, τα οποία σχεδόν συμπίπτουν με τις τέσσερις εποχές και μέσα στα οποία συμβαίνουν οι εν λόγω τροποποιήσεις. Χειμερινή περίοδος Διαρκεί από τα μέσα Οκτωβρίου μέχρι περίπου τα μέσα Απριλίου. Την περίοδο αυτή το φελλογόνιο είναι ανενεργό, το ίδιο και το κάμβιο. Οι μεταβολικοί ρυθμοί 21
του φυτού γενικότερα είναι σε χαμηλά επίπεδα καθώς αυτό διέρχεται τη δυσμενή περίοδο (έχει ήδη αναφερθεί ότι η κουτσουπιά είναι φυλλοβόλο δέντρο). Στην περιοχή του φακιδίου μπορούμε να διακρίνουμε σαφώς τα κύτταρα του φελλογονίου καθώς είναι πεπλατυσμένα (Εικ. 17ε, 18β, 19β, 19δ) και αρκετά μικρότερα σε μέγεθος από τα γειτονικά τους. Το φελλόδερμα αποτελείται από μία με δύο σειρές κυττάρων ανάλογα με την ηλικία του βλαστού. Τα γεμιστικά κύτταρα, ελαφρώς σφαιρικά, διαθέτουν μεσοκυττάριους χώρους (Εικ. 19δ) και δεν φελλοποιούνται σε καμμία περίπτωση όπως καταδεικνύεται από τις ιστοχημικές τεχνικές (Εικ. 17β, 17ε, 18β). Ωστόσο, περιορίζονται προς τα πάνω από ένα στρώμα φελλοποιημένων κυττάρων, το καλυπτήριο (Εικ. 17, 18, 19). Τα κύτταρα του καλυπτήριου στρώματος είναι πεπλατυσμένα και με αρκετά παχιά κυτταρικά τοιχώματα και δεν φαίνεται να διαθέτουν μεσοκυττάριους χώρους (Εικ. 19ε, 19στ). Η χειμερινή περίοδος τελειώνει με την έναρξη της μεριστοματικής δραστηριότητας του φελλογονίου του φακιδίου περίπου στα μέσα της άνοιξης. Εαρινή περίοδος Διαρκεί από τα μέσα Απριλίου μέχρι περίπου τα μέσα Ιουνίου. Το φελλογόνιο είναι ενεργό, καθώς επίσης και το κάμβιο. Έχει προηγηθεί από τα μέσα Μαρτίου η ανθοφορία και από τις αρχές Απριλίου η έκπτυξη των φύλλων και το φυτό έχει υψηλούς μεταβολικούς και μεριστοματικούς ρυθμούς. Το φελλογόνιο του φακιδίου είναι επίσης ενεργό και παράγει αφενός κύτταρα φελλοδέρματος και αφετέρου νέα γεμιστικά κύτταρα τα οποία διακρίνονται εξαιτίας του πεπλατυσμένου σχήματός τους. Η αύξηση του αριθμού των στρωμάτων των γεμιστικών κυττάρων ασκεί μεγάλη πίεση στο υπερκείμενο καλυπτήριο στρώμα (Εικ. 22β). Το τέλος ουσιαστικά της περιόδου σηματοδοτείται από την διάρρηξη του καλυπτήριου στρώματος στην αρχή του καλοκαιριού (Εικ. 20, 21, 22). Θερινή περίοδος Διαρκεί από τα μέσα Ιουνίου μέχρι το τέλος του καλοκαιριού. Το φελλογόνιο και το κάμβιο είναι ενεργά μέχρι τα μέσα της περιόδου. Το φελλογόνιο του φακιδίου παράγει νέα, μη φελλοποιημένα, γεμιστικά κύτταρα τα οποία αντικαθιστούν τα παλιά καθώς αυτά παρασύρονται από τον άνεμο εξ αιτίας της απουσίας του καλυπτήριου στρώματος (Εικ. 23, 24, 25). 22
Φθινοπωρινή περίοδος Διαρκεί από τα τέλη του καλοκαιριού μέχρι και τα μέσα Οκτωβρίου. Κατά τη φάση αυτή σχηματίζεται το νέο καλυπτήριο στρώμα το οποίο θα παραμείνει μέχρι και την επόμενη βλαστητική περίοδο (Εικ. 26, 27, 28). Το καλυπτήριο στρώμα αποτελείται από μία ή το πολύ δύο σειρές φελλοποιημένων κυττάρων. Αξίζει να τονισθεί ότι η αρχή και το τέλος της κάθε φάσης εξαρτάται όχι μόνο από το φυτό αλλά και από τις κλιματολογικές συνθήκες και το υψόμετρο. Έτσι, σε φυτά που αναπτύσσονται σε υψηλότερα υψόμετρα η έναρξη και η λήξη κάθε φάσης μετατίθενται μία με δύο εβδομάδες αργότερα. Όπως και στα φακίδια της Ο. europaea έτσι και εδώ, διαπιστώθηκε η παρουσία χλωροπλαστών σε περιοχές του φλοιού υπό και περί των φακιδίων στους νεαρούς κυρίως βλαστούς (Εικ. 18στ, 21στ, 24στ, 27στ). 23
Συζήτηση και συμπεράσματα Μορφολογία Τα φακίδια των δύο υπό μελέτη φυτών διαφέρουν σημαντικά σε περισσότερους από έναν τομείς. Στην O. europaea είναι χαρακτηριστικό το κυκλικό σχήμα σε επιφανειακή άποψη με τα γεμιστικά κύτταρα να είναι εμφανή καθ όλο το έτος, ενώ στo C. siliquastrum το σχήμα είναι μάλλον ελλειπτικό και τα γεμιστικά κύτταρα διακρίνονται μόνο σε συγκεκριμένη περίοδο, όπως έχει ήδη αναφερθεί αλλά και θα συζητηθεί εκτενώς στη συνέχεια. Τα φακίδια της O. europaea δεν φαίνεται να υφίστανται σημαντικές μορφολογικές τροποποιήσεις απόρροια, ενδεχομένως, του γεγονότος ότι πρόκειται για αειθαλές είδος κάτι που ασφαλώς δεν ισχύει για τους αντίστοιχους σχηματισμούς του C. siliquastrum το οποίο είναι φυλλοβόλο φυτό. Η σημαντικότερη ωστόσο διαφορά μεταξύ των δύο φυτών έγκειται στην ιστοχημική σύσταση των κυττάρων. Έτσι, στα κυτταρικά τοιχώματα των γεμιστικών κυττάρων της O. europaea εναποτίθεται φελλίνη ήδη πριν από την πλήρη διαφοροποίησή τους. Το μόνο που ενδέχεται να διαφοροποιείται σε σχέση με τη χρονική περίοδο αλλά δεν προέκυψε από τις παρατηρήσεις μας είναι το πάχος τους, το οποίο εξαρτάται από την εναπόθεση και άλλων υλικών εκτός από φελλίνη. Στο C. siliquastrum, από την άλλη μεριά, τα γεμιστικά κύτταρα δεν φελλοποιούνται σε κανένα στάδιο ωριμότητάς τους. Τα μόνα φελλοποιημένα κύτταρα είναι αυτά του καλυπτήριου στρώματος και μάλιστα η εναπόθεση φελλίνης γίνεται, όπως και στα γεμιστικά κύτταρα της ελιάς, πριν αυτά διαφοροποιηθούν πλήρως. Μετά τις παραπάνω παρατηρήσεις, είναι δυνατό να κατατάξουμε τα φακίδια των δύο φυτών στους τύπους φακιδίων όπως αυτοί ορίστηκαν από την Esau (1965) και περιγράφονται αναλυτικά στην εισαγωγή. Τα φακίδια της Ο. europaea ανήκουν στον τύπο Magnolia, Populus και Pyrus, ενώ τα αντίστοιχα του C. siliquastrum ανήκουν στον τύπο Prunus και Robinia. Αξίζει εδώ να τονίσουμε ότι στα φακίδια της Picea abies, είδος γυμνοσπέρμων, οι Rosner & Kartusch (2003) διαπίστωσαν αντίστοιχες μορφολογικές τροποποιήσεις κατά τη διάρκεια του έτους με αυτές που εμείς παρατηρήσαμε στο C. siliquastrum. Η αντιστοιχία δεν έγκειται μόνο στη διαδοχή των φάσεων αλλά και σε επιμέρους λεπτομέρειες σχετικά με τον τρόπο που οι αλλαγές συμβαίνουν. Συγκεκριμένα, η 24
διάρρηξη του καλυπτήριου στρώματος στη P. abies είναι συνέπεια της πίεσης που ασκούν τα υποκείμενα γεμιστικά κύτταρα, όπως και στο C. siliquastrum. Αντίθετα, στη Fagus sylvatica, η οποία ανήκει στα αγγειόσπερμα, η διάρρηξη έρχεται ως αποτέλεσμα της καταστροφής των κυτταρικών τοιχωμάτων των κυττάρων του γεμιστικού ιστού (Jacob et al. 1989). Διαπιστώνουμε συνεπώς μία καλά συντηρημένη λειτουργία που απαντά τόσο στα γυμνόσπερμα όσο και στο C.siliquastrum, γεγονός που ενδεχομένως αντικατοπτρίζει την ύπαρξη αντίστοιχων ρυθμιστικών μηχανισμών στους βλαστούς αυτών των φυτών. Φυσιολογία και ρυθμιστικοί μηχανισμοί Όπως προανεφέρθη, τα φακίδια της O. europaea δεν υφίστανται σημαντικές μορφολογικές τροποποιήσεις κατά τη διάρκεια του έτους. Οι αλλεπάλληλες σειρές φελλοποιημένων γεμιστικών κυττάρων με τους μικρούς μεσοκυττάριους χώρους επιτρέπουν περιορισμένη μάλλον ανταλλαγή αερίων μεταξύ του βλαστού και του εξωτερικού περιβάλλοντος. Ο φραγμός αυτός πιθανώς αποτελεί έναν εκ των πολλών μηχανισμών που έχουν αναπτυχθεί από την O. europaea με σκοπό την άριστη προσαρμογή της στις ιδιαίτερα απαιτητικές συνθήκες του μεσογειακού κλίματος. Δεν πρέπει βέβαια εδώ να παραγνωρίσουμε την πιθανότητα τα γεμιστικά κύτταρα να έχουν διαφορετικό πάχος ανά περίοδο, κάτι που υποδηλώνει την ύπαρξη ενός ρυθμιστικού μηχανισμού, αρκετά πιο συντηρητικού ωστόσο από τον αντίστοιχο της κουτσουπιάς. Στο C. siliquastrum, τα φακίδια παραμένουν μεν κλειστά κατά το μεγαλύτερο μέρος του έτους, τη θερινή ωστόσο περίοδο, όταν και το καλυπτήριο στρώμα σπάζει, η ανταλλαγή αερίων προφανώς διευκολύνεται. Η κουτσουπιά, προσαρμοσμένη σε λιγότερο ξηρούς βιοτόπους από την ελιά, ίσως επιδιώκει με τη διάρρηξη του καλυπτήριου στρώματος να επιτύχει την κατά το δυνατόν μεγαλύτερη είσοδο οξυγόνου, με σκοπό να καλύψει τις ανάγκες των ενεργών, αυτή την περίοδο, μεριστοματικών ιστών. Προς τα τέλη του καλοκαιριού, όταν η μεριστοματική δραστηριότητα παύει και η απώλεια νερού από τα ανοίγματα του βλαστού καταντά ασύμφορη, δημιουργείται νέο καλυπτήριο στρώμα και τα φακίδια κλείνουν. Η ίδια υπόθεση διατυπώνεται και από τους Rosner & Kartusch (2003) για τη P. abies Άλλωστε, οι Mancuso & Marras (2003), ισχυρίζονται ότι το οξυγόνο που προέρχεται 25
από τη διάχυση μέσω των φακιδίων καταναλώνεται από το κάμβιο όταν οι ενεργειακές απαιτήσεις του ιστού είναι υψηλές.. Ο Lendzian (2006) διαπίστωσε ότι στη Betula potaninii η περατότητα των φακιδίων είναι υψηλότερη από την άνοιξη μέχρι τον Αύγουστο και το Σεπτέμβριο, γεγονός που έρχεται σε συμφωνία με τα προηγούμενα. Καθ όλη την διάρκεια του έτους ο αυτοφθορισμός της χλωροφύλλης σε περιοχές του φλοιού κάτω από τα φακίδια ήταν έντονος κυρίως στους νεαρούς βλαστούς και των δύο φυτών. Ο αυτοφθορισμός αυτός οφείλεται στην παρουσία μεγαλύτερου ποσού χλωροφύλλης και μεγαλύτερου αριθμού χλωροπλαστών στις περιοχές αυτές κάτι που αποδεικνύεται και από τις εικόνες που μας έδωσε το οπτικό μικροσκόπιο. Την ίδια παρατήρηση έκαναν οι Langenfeld Heyser et al. (1996) σε νεαρούς βλαστούς του φυτού Fraxinus excelsior κατά την εαρινή περίοδο και υποστήριξαν, όπως αναφέραμε στην εισαγωγή, ότι ο ρόλος του χλωρεγχύματος του φακιδίου είναι η επανάκτηση του από την αναπνοή προερχόμενου διοξειδίου του άνθρακα. Μία τέτοια υπόθεση μπορούμε να διατυπώσουμε στην περίπτωση του C. siliquastrum. Όταν το καλυπτήριο στρώμα έχει διαρρηχθεί με ενδεχόμενο στόχο, όπως αναφέραμε παραπάνω, την είσοδο του οξυγόνου, η απώλεια του CO 2 από τα φακίδια μπορεί να περιορίζεται από τους χλωροπλάστες των κυττάρων του φλοιού που βρίσκονται κάτω ακριβώς από τους σχηματισμούς. Με μία τέτοια εικασία έρχονται σε διαφωνία τα αποτελέσματα των Manetas & Pfanz (2005), οι οποίοι διαπίστωσαν ότι τα φακίδια είναι λιγότερο περατά στο φως από ότι οι υπόλοιπες περιοχές του περιδέρματος και ως εκ τούτου ελάχιστα συμβάλλουν στο συνολικό ισοζύγιο του άνθρακα. Στην εργασία αυτή ωστόσο δεν ελήφθησαν καθόλου υπόψιν οι τροποποιήσεις που υφίστανται τα φακίδια κατά την διάρκεια του έτους, γεγονός που ίσως θα διαφοροποιούσε τα αποτελέσματα. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες ώστε να διασαφηνιστεί πλήρως η φυσιολογία του χλωρεγχύματος του φακιδίου. 26
Βιβλιογραφία Brundrett, M.C., Kendrick, B., Peterson, C.A. (1991): Efficient lipid staining in plant material with Sudan red 7B or Fluorol yellow 088 in polyethylene glycol glycerol. Biotechnic & Histochemistry, 66: 111-116 Esau, K. (1965): Plant anatomy. 2 nd ed., John Wiley & Sons, N.Y., U.S.A Graça, J., Pereira, H. (2004): The periderm development in Quercus suber. IAWA Journal, 25 (3): 325 335 Groh, B., Hübner, C., Lendzian, J. (2002): Water and oxygen permeance of phellems isolated from trees: the role of waxes and lenticels. Planta, 215: 794 801 Jacob, A., Lehmann, H. & Stelzer R, (1989): Entiwicklung und Struktur von Lenticellen der Buche (Fagus sylvatica f. purpurea Ait.). Flora 183: 417-427 Langenfeld - Heyser, R., Schella, B., Buschmann, K., Speck, F. (1996): Microautoradiographic detection of CO 2 fixation in lenticel chlorenchyma of young Fraxinus excelsior L. stems in early spring. Trees, 10: 255 260 Lendzian K. J. (2006): Survival strategies of plants during secondary growth: barrier properties of phellems and lenticels towards water, oxygen, and carbon dioxide. Journal of Experimental Botany, doi: 10.1093/jxb/erl014 Ma, F., Peterson, C.A., (2001): Development of cell wall modifications in the endodermis and exodermis of Allium cepa roots. Canadian Journal of Botany, 79: 621-634 Mancuso, S., Marras, A.M., (2003): Different pathways of the oxygen supply in the sapwood of young Olea europaea trees. Planta, 216: 1028 1033 Manetas, Y., Pfanz, H., (2005): Spatial heterogeneity of light penetration through periderm and lenticels and concomitant patchy acclimation of corticular photosynthesis. Trees, 19: 409 414 Pfanz, H., Aschan, G., Langenfeld Heyser, R., Wittmann, C., Loose, M. (2002): Ecology and ecophysiology of tree stems: corticular and wood photosynthesis. Naturwissenschaften, 89: 147 162 Rosner. S., Kartusch B. (2003): Structural changes in primary lenticels of Norway spruce over the seasons. IAWA journal, 24 (2):105 116 Waisel, Y. (1995): The outer derivatives. In: M. Igbal (Ed.): Encyclopedia of plant anatomy: pp. 293 315. Glor. Borntraeger, Berlin, Germany 27
Wutz, A. (1955): Anatomische Untersuchungen über System und periodische Veränderungen der Lenticellen. Bot. Studien 4: 43-7 28