بررسي مولكولي القاي كلروز توسط ژنهاي rolc و trolc در گياه توتون 2 *1 1 حسين گردونپر هانيه محجل شجاء و محمدعلي حسينپور فيضي 1 تبريز دانشگاه تبريز دانشكده علوم طبيعي گروه زيست شناسي گياهي تبريز دانشگاه تبريز دانشكده علوم طبيعي گروه زيست شناسي جانوري 2 تاريخ دريافت: 94/1/10 تاريخ پذيرش: 94/5/5 چكيده ژنهاي (rol) rooting locus بر روي (T-DNA) Transferred DNA باكتري Agrobacterium rhizogenes قرار دارند كه با انتقال به ميزبان گياهي باعث ايجاد تغييرات مورفولوژيك و رشد و نمو در گياه ميشوند. اين تحقيق با هدف بررسي تا ثير ژن Nicotiana tabacum از گياه توتون بر رشد و نمو گياه trolc از اين باكتري و هومولوگ گياهي آن يعني ژن rolc cv.samsun انجام گرفته است. در اين تحقيق ابتدا DNA گياهان تراژن rolc و trolc استخراج و از حضور ژنهاي مورد نظر اطمينان حاصل شد. با توجه به اينكه گياهان تراژن با بيان ژنهاي rolc وtrolC فنوتيپ كلروزه نشان ميدهند انتظار ميرفت كه بيان ژنهاي كلروپلاستي نيز با بيان تراژنها كاهش يابد. براي بررسي اين موضوع استخراج RNA از گياهان تراژن سنتز cdna و در نهايت واكنش PCR بر روي نمونهها با پرايمرهاي اختصاصي ژن psba كلروپلاستي انجام گرفت. نتايج حاصل از RT- PCR نشان داد كه بيان ژن فوق كه كد كننده يكي از پروتي ينهاي فتوسيستم II مي باشد در گياهان تراژن و كلروزه به شدت كاهش يافته يا متوقف مي شود و به عبارت ديگر يكي از دلايل ايجاد كلروز ناشي از اين تراژنها از نقطه نظر مولكولي ميتواند نقص بيان ژن psba در گياهان بيان كننده ژنهاي rolc وtrolC باشد. واژه هاي كليدي: آگروباكتريوم RT-PCR trolc rolc T-DNA كلروز مقدمه * نويسنده مسي ول تلفن: 04133379762 پست الكترونيكي: h_mohajjel@tabrizu.ac.ir آگروباكتريوم ريزوژنز( rhizogenes (Agrobacterium داراي ژنهاي مورد نياز براي هميوغي trb) (tra, و توليد مثل رويشي reproduction) (rep or بر روي ژنوم اصلي خود است. پلاسميد (Root inducing) Ri اين باكتري نيز داراي ژنهاي بيماريزايي virulence) (vir or و قسمتي موسوم به (Transferred DNA) T-DNA مي باشد كه بر روي آن انكوژنها و ژنهاي سنتز اوپين (opine) وجود دارند (12). انكوژنها رشد ني وپلاستيكي يا توموري سلولهاي ميزبان را موجب شده (13) و با سنتز هورمونهاي گياهي موجب تكثير سلولهاي توموري ميگردند (30). اوپين ها تركيباتي با وزن مولكولي كم هستند كه حاصل تجمع يك اسيدآمينه با يك قند يا يك α -كتواسيد مي باشند و به عنوان منبع كربن و نيتروژن براي باكتري محسوب مي شوند. آگروباكتريوم جهت تراژن نمودن ميزبان از ژنهاي متعددي استفاده ميكند كه شامل: الف) ژنهاي chromosomal ) chv (virulence بر روي كروموزوم باكتري جهت شناسايي و اتصال باكتري به ميزبان ب) ژنهاي vir جهت فرآيندهايي چون آماده سازي انتقال و الحاق T-DNA در ژنوم ميزبان و ج) برخي از ژنهاي ميزبان كه براي انتقال T-DNA در سيتوپلاسم سلول گياهي و الحاق آن در ژنوم به كار مي- روند مي باشد (33). سندرم ريشههاي موي ين يا حصيري disease) (root-mat 579
(23) كه ناشي از انتقال T-DNA به ژنوم ميزبان گياهي مي باشد با ايجاد ريشههاي بسيار منشعب كه عدم تمايل به جاذبه (ageotropic) را دارند مشخص مي گردد. از لحاظ مورفولوژيك اين ريشهها بسيار مشابه انواع طبيعي هستند. ريشههاي تراژن قابليت باززايي گياهان زايا را دارند كه در بسياري از گونهها اين گياهان با ويژگيهايي چون كندي رشد ميان گرههاي كوتاه شده برگهاي چروكيده كاهش غالبيت رأسي و ريشههاي حجيم و آژي وتروپيك متمايز ميشوند. به مجموع اين صفات سندرم ريشههاي موي ين roots) (hairy گفته ميشود (31). مهم ترين ويژگي ريشه- هاي موي ين قابليت رشد سريع آنها در عدم حضور هورمونها است كه به دليل حضور ژنهاي القاگر ريشه (rol genes) و ژنهاي سنتز هورمون اكسين genes) (aux بر روي T-DNA ميباشد (22). خانواده ژنهاي rol مستقر برروي T-DNAي آ. ريزوژنز عامل اصلي ايجاد سندرم ريشههاي موي ين محسوب مي- شوند. اين ژنها شامل rolc rolb rola rold و مهمترين (27). تا ثيرات ژنهاي rol است در گياهان بالا بردن ميزان حساسيت گياه به هورمونها از جمله اكسين است (6) كه از طريق آزمايشهاي انجام گرفته بر روي گياهاني چون و N. tabacum L. corniculotus مورد تا ييد قرار گرفته است ) 25 و 28). ژن rolc به لحاظ اهميتي كه در بهبود صفات تزي يني و باغباني بر روي گياه دارد بيشتر از ژنهاي ديگر مورد بررسي و مطالعه محققين قرار گرفته است (7). به لحاظ بيماريزايي بيان ژن rolc با ايجاد سندرم ريشههاي موي ين و تغييراتي همچون توليد تركيبات ثانويه جديد تغيير توازن هورموني گياه و ايجاد كلروز است. توأم افزايش شاخههاي جانبي ايجاد برگهاي سوزني شكل گلدهي زودهنگام كاهش اندازه گلها و ايجاد نر عقيمي با كاهش توليد دانه گرده از ديگر تغييرات مورفولوژيكي ناشي از بيان ژن rolc در گياهان مي باشد (8 18 10 و.(24 يكي از مهم ترين تنظيمكنندههاي بيان ژن rolc ساكارز است. طبق بررسيهاي به عمل آمده ناحيه پاسخ به ساكارز در پروموتر اين ژن در ناحيه - 94 تا - 135 قرار دارد. وجود منابع بالاي ساكارز در بافتهاي فلوي م منجر به بيان بالاي ژن rolc در اين بافتها شده است (35). از نقطه نظر تا ثير ژن rolc بر هورمونهاي گياهي بايد اشاره نمود كه اين ژن بر ميزان سايتوكينينها اكسينها و جيبرلينها (GA) تا ثير ميگذارد. تغييراتي چون كاهش غالبيت رأسي و افزايش ميزان شاخههاي فرعي اشاره بر تغيير ميزان هورمون سايتوكينين دارد ( 24 و 36). Maurel و همكارانش (1991) با بررسي پروتوپلاستهاي تراژن rolc توتون افزايش هايپرپلاريزاسيون غشاي اين سلولها را در مواجهه با اكسين به اثبات رساندند. به عبارت ديگر تحريكپذيري غشاي پروتوپلاستها در مواجهه با اين هورمون افزايش مي يابد (19). در گياه سيبزميني تراژن rolc كاهش اندازه گياه همراه با تعداد جوانههاي بيشتر مشاهده شده است (14). همچنين Schmulling و همكارانش (1988) مشاهده نمودند كه در گياهان تراژن rolc به علت كاهش ميزان كلروفيل فتوسنتز كمتري انجام ميگيرد و در مقايسه با انواع گياهان طبيعي برگها به رنگ سبز متمايل به زرد (كلروزه) نمايان ميشوند. گياهان تراژن 35S-rolC (ژن rolc تحت كنترل پروموترقوي 35S ويروس (CaMV نيز داراي ميزان بيان بالاي اين ژن در برگها بوده و در نتيجه چنين برگهايي كلروز بيشتري نشان ميدهند (24). علاوه بر موارد ذكر شده در بالا تحريك توليد متابوليتهاي ثانويه و پروتي ينهاي دفاعي در گياهان تراژن و نيز رابطه آن با راديكالهاي آزاد اكسيژن و پروتي ين كينازهاي وابسته به سايكلين (CDPK) از ديگر نقشهاي ژن rolc در گياهان مي باشد( 5 و 26 ). برخي از گونههاي گياهي به طور طبيعي داراي تواليهاي مشابه با قسمتهايي از توالي T-DNA آگروباكتريوم مي باشند كه به (cellular T-DNA) ct-dna يا T-DNA سلولي موسوم است( 32 ). آزمايشات متعددي شباهت 580
و 3 جلد 28 شماره 1394 4 عملكردي ژنهاي T-DNA و ct-dna را به اثبات رسانده اند ) 29). توالي مشابه با ژن rolc در گياه توتون (tobacco rolc) trolc ناميده مي شود (20) كه از نظر مورفولوژيك تغييرات مشابه ژن rolc را در گياهان تراژن ايجاد ميكند (21). از نظر مولكولي شباهت عملكردي بين ژن rolc و trolc همچنان ناشناخته ميباشد و لذا در اين تحقيق تصميم بر آن است تا گوشهاي از عملكرد مولكولي القاي كلروز توسط ژن rolc و trolc با بررسي نحوه بيان ژنهاي كلروپلاستي در گياهان تراژن مورد بررسي و مطالعه قرار گيرد. مواد و روشها گياهان مورد استفاده: گياهان توتون تراژن مورد استفاده در اين تحقيق cv.samsun) (Nicotiana tabacum داراي ژن rolc و trolc در ژنوم خود مي باشند كه ژنها تحت كنترل پروموتر القا شونده با گلوكوكورتيكوي يد دگزامتازون (dexamethasone) مي باشند. گياهان در حضور دگزامتازون در شرايط تيمار و در غياب آن در شرايط كنترل يا شاهد هستند. به علاوه از گياهان غير تراژن به عنوان شاهدين ديگر نيز استفاده شد. بذر گياهان تراژن در تحقيق قبلي (21) توسط نويسندگان در "انستيتو بيولوژي مولكولي گياهي" شهر استراسبورگ فرانسه تهيه شدند. استرليزاسيون بذرها: بذرها به مد ت 2 دقيقه در اتانول 70 درصد و سپس به مد ت 15 دقيقه در هيپوكلريت سديم 10 درصد (حاوي يك قطره (Tween 20 استريل سطحي شدند. سپس 3 بار هر يك به مد ت 10 دقيقه با آب مقطر استريل شستشو داده شدند و در انتها بذرها بر روي كاغذ صافي قرار داده شدند تا سطح بذرها خشك شود (حدود 1 ساعت در هود لامينار). سپس بذرها روي محيط جوانه ز ين (Murashig and Skoog) MS قرار داده شدند (حدود 30-20 بذر در هر ظرف كشت گياه) و در دماي 23 درجه سانتي گراد شرايط 16 ساعت روشنايي و هشت ساعت تاريكي رشد داده شدند. بعد از جوانهزني بذرها جهت القاي بيان ژن مورد نظر به محيط دگزامتازون افزوده شد. آزمايشات مولكولي: - استخراج DNA (مطابق با متد ( CTAB : حدود 300 ميليگرم از برگ گياه درون هاون چيني همراه با 500 ميكروليتر از بافر CTAB به خوبي ساييده شد. در ادامه محتوي ات هاون به مد ت 20 دقيقه در دماي 65 درجه سانتي گراد قرار گرفت. سپس يك حجم از كلروفورم به نمونه ها اضافه و به مدت 5 دقيقه ورتكس گرديد. سپس سانتريفيوژ در دماي اتاق با سرعت 13500rpm انجام و فاز رويي به تيوب جديد منتقل شد. در انتها DNA به روش اتانول رسوب داده شد و بعد از خشك شدن 30-50 ميكروليتر آب استريل اضافه و در - 20 درجه سانتي گراد نگهداري گرديد. استخراج : RNA حدود 200 ميليگرم از برگ گياه درون هاون و در حضور ازت مايع ساييده شدند. در ادامه 700 ميكروليتر تريزول اضافه شد و كاملا مخلوط گرديد تا محلول يكنواختي ايجاد شود. سپس به آن 200 ميكروليتر كلروفرم اضافه گرديد و پس از ورتكس كردن سانتريفيوژ با سرعت 14000rpm به مد ت 15 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد صورت گرفت. مايع رويي به تيوب جديد منتقل و به ميزان 2 حجم ايزوپروپانول اضافه گرديد. تيوبها به مد ت يك شب در - 20 درجه سانتي گراد نگهداري شدند و روز بعد سانتريفيوژ به مد ت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتي گراد با سرعت 14000rpm انجام شد. در ادامه رسوبدهي به روش اتانول انجام شد و بعد از خشك شدن به ميزان 30-50 ميكروليتر آب مقطر استريل عاري از RNase به آن اضافه گرديد. به منظور حذف مولكولهاي DNA از RNA استخراج شده واكنش DNase توس ط كيت Qiagen انجام گرفت و بررسي كم ي RNA با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر (Eppendorf) و محاسبه نسبت ميزان جذب طول موج 260 نانومتر بر طول موج 280 نانومتر (A260/280) صورت پذيرفت. سنتزcDNA و واكنش :PCR براي سنتز cdna از كيت ) 581
Superscriptساخت III شركت (Invitrogene استفاده گرديد. پرايمرهاي ژن housekeeping به نام rrna 16s براي سنجش كيفي ت cdna سنتز شده مورد استفاده قرار گرفت و جهت نرماليزاسيون باندهاي حاصل محصولات واكنش روي ژل آگارز 1 درصد الكتروفورز گرديد. بعد از نرماليزاسيون در واكنشهاي PCR بعدي (با همان شرايط) از پرايمرهاي اختصاصي قطعه ژني استفاده گرديد. نتايج همان گونه كه اشاره شد ژن rolc آگروباكتريوم و هومولوگ گياهي آن - trolc - فنوتيپ كلروز را در گياهان بيان كننده اين ژنها اعمال ميكنند ( 21 و 23). در اين تحقيق به منظور شناسايي عملكرد مولكولي اين ژنها در ايجاد كلروز در گياه توتون مبنا بر اين قرار گرفت تا با طراحي پرايمرهاي گوناگون ژنوم كلروپلاستي ميزان بيان اين ژنها در گياهان تراژن القاء شده با دگزامتازون توسط تكنيك- RT (Reversetranscription-PCR) PCR بررسي گردد و آنها با گياهان تراژن القاء نشده و نيز گياهان غير تراژن (#) كه به عنوان شاهد به كار مي روند مقايسه شود. در ابتدا بذر گياهان طبق دستورالعمل ذكر شده در بخش مواد و روشها استريل شده و در محيط جوانهزني قرار گرفتند تا اندازه گياهچهها به حدي برسد كه براي انتقال به محيط حاوي dex (دگزامتازون) جهت القاء بيان ژنها مناسب باشد (حدود 15 روز). پس از رسيدن گياهچهها به اين مرحله آنها در محيط كشت حاوي dex قرار گرفتند. البته براي هر نمونه نيمي از گياهچهها در محيط فاقد dex (به عنوان شاهدي ديگر) قرار داده شدند تا تغييرات فنوتيپي ايجاد شده در هر گروه به صورت واضحي مورد تشخيص قرار گيرد (تصوير 1 الف و ب). در اين مرحله صفات مورفولوژيكي همچون كلروزه شدن گياه كوتولگي و توليد ريشههاي منشعب و كوتاهتر از حد نرمال حتي ريشههاي نابه جا در ساقههاي گياه و گاها با انتهاي پيچ خورده مشاهده شدند (تصوير 1 ج تا ز). اين صفات مربوط به گياهان تراژن rolc و trolc و پس از القاء بودند و در گياهان تراژن بدون القاء و گياهان غير تراژن (# يا شاهد) مشاهده نشدند. تصوير 1 - الف و ب) گياهچههاي 21 روزه تراژن صورت مجزا نشان داده شده است. تفاوتهاي مورفولوژيك ناشي از ژنهاي rolc و trolc در محيط داراي دگزامتازون (+) يا فاقد آن (-). ج تا ه) هر كدام از گياهچهها را به rolc و trolc به خوبي آشكار است. در گياهچههاي حالت القاء (+) يا عدم آن () مشاهده نميشود. و) توليد ريشههاي نابه جا بر روي ساقه در گياه القاء شده.rolC ز)رشد گياهچهه يا پارچه نازك. كاهش رشد كلي گياه و فنوتيپ كلروزه در گياهان القاء شده آشكار است. # تفاوتي بين بر روي rolc 582
rolc ژنومي از بافت برگ گياهچههاي توتون DNA trolc,و شاهد استخراج گرديد و براي اطمينان از تراژن بودن گياهچهها واكنش PCR با پرايمر ژنهاي rolc و trolc انجام و نتيجه بر روي ژل آگارز 1 درصد مورد بررسي قرار گرفت. همان طوري كه در تصوير 2 مشاهده ميشود باند مربوط به ژنهاي rolc و trolc در لاين 1 و 2 كاملا قابل مشاهده است (500bp) در حالي كه در ستون مربوط به نمونه شاهد (لاين 3) اين باند مشاهده نميشود. اين آزمايش تراژن بودن گياهان مورد بررسي را تا ييد كرد. نمودن باندها انجام شد و نتيجه واكنش بر روي ژل آگارز 1 درصد مورد بررسي قرار گرفت. نتايج الكتروفورز ژل آگارز نشان داد كه اين ژن به خوبي در همه گياهان بيان ميشود (تصوير 3). تصوير 2- rolc (لاين (1 PCR بر روي DNAهاي استخراج شده از گياهچههاي trolc (لاين 2) و شاهد # (لاين 3). M معرف ماركر وزن مولكولي ميباشد. جهت سنجش كيفي RNAهاي استخراج شده و اطمينان از عاري بودن DNA واكنش در آنها PCR بر روي اين house keeping با استفاده از پرايمرهاي يك ژن RNAها به نام الكتروفورز 16srRNA بررسي انجام گرديد شد و نتيجه بر روي ژل آگارز (تصوير مربوطه آورده نشده است). مطابق انتظار در هيچ كدام از نمونهها باند مربوط به rrna16s نشد مشاهده و به عبارت ديگر RNAهاي استخراجي به دليل عملكرد خوب آنزيم DNase عاري از DNA بودند. رونويسي معكوس از روي RNAها به كمك آنزيم ترانس- كريپتاز معكوس بر روي PCR واكنش و انجام گرفت تصوير 3 - RT-PCR توس ط پرايمرهاي اختصاصي ژنهاي rolc و M).trolC ماركر وزن مولكولي 1-4) گياهان تراژن و 5 و 6) گياه تيپ وحشي #. باندهاي مشاهده شده مربوط به ژنهاي rolc و trolc همراه با القاء توسط (+) dex ميباشند (400bp) و در گياهاني كه القاء نشده اند (-) حضور ندارد. تصوير پايين مربوط به نتيجه واكنش PCR توس ط پرايمرهاي ژن rrna16s مي باشد. در مرحله بعد بيان ژن psba كه يكي از مهم ترين ژنهاي كلروپلاستي گياه توتون مي باشد بررسي گرديد. اين ژن از ژنهاي اصلي درگير در مسير فتوسنتز ميباشد و اختلال در بيان آن مي تواند موجب كاهش يا قطع توليد كلروفيل و در نتيجه ايجاد كلروز گردد. تصوير 4- RT-PCR توس ط پرايمرهاي ژن كلروپلاستي M).psbA ماركر وزن مولكولي لاينهاي 1 و 4 به ترتيب مربوط به گياهان القاء شده trolc و rolc و لاينهاي شماره 2 و 3 مربوط به گياهان القاء نشده مذكور مي باشد. همان گونه كه در تصوير 4 مشاهده ميشود در گياهان تراژن trolc و rolcي بدون القاء ژن psba به خوبي بيان ميشود (لاين 2 و 3) در صورتي كه در گياهان rolc القاء شده بياني از ژن psba مشاهده نميشود(لاين 4) و trolc و rolc سنتز شده با استفاده از پرايمر ژنهاي DNA جهت اطمينان از بيان اين ژنها در گياهان تراژن القاء شده و عدم بيان آنها در صورت عدم القاء استفاده شد. PCR ديگري نيز با پرايمرهاي ژن rrna16s جهت نرماليزه 583
در گياهان trolc القاء شده نيز اين بيان بسيار ضعيف است (لاين 1). آزمايشات فوق مو يد اين مطلب است كه با بيان ژنهاي rolc و trolc بيان ژن كلروپلاستي psba مختل شده كه نتيجه آن مي تواند اختلال در سنتز طبيعي متابوليتهاي فتوسنتزي و در نهايت توليد طبيعي كلروفيل و در نتيجه ايجاد كلروز گردد. ژن psba كد كننده يكي از پروتي ينهاي فتوسيستم II ميباشد كه عدم بيان آن با اختلال در تشكيل فتوسيستم II و سنتز نشدن كلروفيل و در نتيجه عاملي براي ايجاد كلروز است. بحث و نتيجه گيري يكي از دغدغههاي بسيار مهم كه امروزه ذهن بسياري از محققان علوم گياهي را به خود مشغول نموده است رفع پديده كلروز در بسياري از گياهان به ويژه انواع زينتي و خوراكي است. علتيابي اين موضوع به خصوص از نقطه نظر ژنتيكي و مولكولي آن در عصر حاضر از اهميت بسيار زيادي برخوردار است. كاهش محتواي كلروفيل در برگها ميتواند به خاطر عواملي چون اختلال در مسير توليد كلروفيل ويا تجزيه آن (1 و 4) كمبود مواد معدني مانند آهن (17) به كارگيري تركيبات سمي مانند تنتوكسين و افزايش راديكالهاي آزاد اكسيژن (2 و 16) باشد. ژنهاي بسياري در ژنوم كلروپلاست گياهان وجود دارند كه بيان يا عدم بيان آنها مستقيم يا غير مستقيم ميتواند موجب بروز كلروز در گياهان گردد. مطالعات گستردهاي در زمينه يافتن ارتباط ميان اين دسته از ژنها با پديده كلروز در گياهان مدل صورت گرفته است كه نشان دهنده وجود ارتباط ميان آنها است. Yoshida و همكارانش (1996) با بررسيهايي كه بر روي گياه برنج انجام دادند متوجه وجود بين ميزان بيان ارتباط rpob ژن كلروپلاستي (كدكننده زيرواحد β از RNA پليمراز پلاستي) و ايجاد كلروز در اين گياه شدند (34). در يك بررسي ديگر محققان با استفاده از گياهان توتون جهش يافته در ژنهاي كلروپلاستي rpob rpoa و (rpo ) rpoc1 فنوتيپ سفيد رنگ (كلروزه) را در گياهان مشاهده نمودند (11). ژنهاي psba و psbb نيز دسته ديگري از ژنهاي كلروپلاستي هستند كه عدم بيانشان موجب ايجاد كلروز ميگردد. اين ژنها كد- كننده پروتي ينهاي مربوط به كمپلكس فتوسيستم در باشند. گياهان تراژن جو II (Barley) مي- به علت وجود جهش در ژنهاي فوق الذكر نقص عملكرد صحيح فتوسيستم II و عدم تكامل كلروپلاست و در نهايت فنوتيپ كلروزه مشاهده گرديده است (15). Chen و همكارانش با (2011) مطالعه بر روي ژن كد كننده زيرواحد بزرگ آنزيم روبيسكو (rbcl) گزارش كردند كه افزايش بيان اين ژن تحت تا ثير برخي عوامل اگزوژن همچون سولفيد هيدروژن (H2S) منجر به افزايش محتواي كلروفيل در گياهان و سبز شدن هرچه بيشتر آنها مي شود.(9) پژوهش حاضر به يكي ديگر از ابعاد بسيار مهم و تا ثيرگذار در ايجاد فنوتيپ كلروز در گياهان با به كارگيري گياهان تراژن توتون پرداخته است. هدف از انتخاب اين گياه علاوه بر كشت آسان و راندمان بالاي تراژنسازي ساده بودن و آشنايي زياد با ژنوم آن ميباشد. در اين تحقيق تا ثير و نقش ژنهاي خارجي وارد شده به ژنوم گياه - يعني ژن rolc از باكتري آ. ريزوژنز توتون يا ژن -trolc گرفته شده است. كلروپلاستي psba و هومولوگ گياهي آن در بر روي پديده كلروز مورد توجه قرار به نتايج در گياهان تراژن دست آمده نشان داد كه rolc و trolc ژن در صورت عدم القاء به خوبي بيان مي شود در حاليكه با القاي ژنهاي rolc و trolc بيان ژن psba كاسته و حتي متوقف مي گردد كه در واقع با زردي گياهان تراريخت نيز توأم است. اين ژن كد كننده يكي از پروتي ينهاي سازنده فتوسيستم II ميباشد كه عدم بيان آن با اختلال در تشكيل فتوسيستم II و سنتز نشدن كلروفيل در اين گياهان و در نتيحه ايجاد كلروز در آنها مي باشد. با توجه به هومولوژي توالي نوكلي وتيدي و اسيد آمينهاي ژنهاي rolc و trolc و پروتي ينهاي مربوطه و شباهتهاي فيزيومورفولوژيك حاصل 584
شجا و همكاران) تحقيق پيش رو شباهت عملكردي ژنهاي rolc و trolc را در سطح مولكولي به اثبات مي رساند كه همراستا با مشاهدات فتوتيپي ميباشند. به عبارت ديگر (psba) با كاهش بيان يك ژن خاص trolc و rolc موجب تظاهر يك فنوتيپ خاص (كلروز) ميگردند. از گياهان تراريخت rolc و trolc كه شامل مواردي چون كاهش رشد كلي گياه ريشههاي كوتاه و پيچ خورده و نيز افزايش جذب قند و نشاسته (21) ميباشد و نيز وجود پروتي ينهاي ميانكنش كننده مشابه با پروتي ينهاي RolC و trolc مثل پروتي ين TCP13 (نتايج منتشر نشده محجل منابع 1- زهره اميني و رحيم حداد. 1392. نقش رنگيزه هاي فتوسنتزي و آنزيمهاي آنتي اكسيدان در مقابل تنش اكسيداتيو. مجله پژوهشهاي سلولي مولكولي. شماره 3. صفحه 265-251 2 -مريم السادات ذكري صالحي پروين شانجاني جوادي حميده محمد علي عليزاده. 1393. بررسي تنوع ژنتيكي جمعيتهاي سه گونه بابونه sp) (Anthemis با استفاده از فعاليت آنزيمي پراكسيداز. مجله پژوهشهاي سلولي مولكولي. شماره 1. صفحه.43-35 3- Aoki, S. and Syono, K. 1999. Synergistic function of rolb, rolc, ORF13 and ORF14 of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes in hairy root induction in Nicotiana tabacum. Plant Cell Physiol. 40, 252 256. 4- Arsova, B., Hoja, U., Wimmelbacher, M., Greiner, E., Ustun, Sx., Melzer, M., Petersen, K., Lein, W. and Bornke, F. 2010. Plastidial thioredoxin z interacts with two fructokinase like proteins in a thiol-dependent manner: Evidence for an essential role in chloroplast development in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana. Plant Cell, 22, 1498 1515. 5- Bulgakov, V. P., Veselova, M. V., Tchernoded, G. K., Kiselev, K. V., Fedoreyev, S. A. and Zhuravlev, Y. N. 2005. Inhibitory effect of the Agrobacterium rhizogenes rolc gene on rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon transformed cell cultures. Planta, 221, 471 478. 6- Cardarelli, M., Mariotti, D., Pomponi, M., Spano, L., Capone, I. and Contantino, P. 1987. Agrobacterium rhizogenes T-DNA capable of inducing hairy root phenotype. Mol. Gen. Gene, 209, 475-480. 7- Casanova, E., Trillas, M.I., Moysset, L.a. and Vainstein, A. 2005. Influence of rol genes in floriculture. Biotechnol Adv, 23, 3-39. 8- Casanova, E., Valdes, A. E., Zuker, A., Fernandez, B., Vainstein, A. and Trillas, M. I. 2004. rolc-transgenic carnation plants: adventitious organogenesis and levels of endogenous auxin and cytokinins. Plant Sci. 167, 551 560. 9- Chen, J., Wu, F.H., Wang, W.H., Zheng, C.J., Lin, G.H., Dong, X.J., He, J.X., Pei, Z.M. and Zheng, H.L. 2011. Hydrogen Sulphide Enhances Photosynthesis Through Promoting Chloroplast Biogenesis, Photosynthetic Enzyme Expression, and Thiol Redox Modification in Spinacia Oleracea Seedlings. Journal of Experimental Botany, 62, 4481-4493. 10- Christensen, B., Sriskandarajah, S., Serek, M. and Müller, R. 2008. Transformation of Kalanchoe blossfeldiana with rol-genes is useful in molecular breeding towards compact growth. Plant Cell Rpt. 27, 1485 1495. 11- De Santis-Maciossek, G., Kofer, W., Bock, A., Schoch, S., Maier, R.M., Wanner, G., Rüdiger, W., Koop, H.U. and Herrmann, R.G. 1999. Targeted disruption of the plastid RNA polymerase genes rpoa, B and C1: molecular biology, biochemistry and ultra structure. Plant J. 18, 477 489. 12- Dessaux, Y., Petit, A., Farrand, S. K. and Murphy, P. J. 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant/rhizobiaceae interactions. In The Rhizobiaceae (eds H. P.Spaink, A. Kondorosi and P. J. Hooykaas), 173 197. 13- Draper J., Scott R., Armitage P. and Walden R. 1988. Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual.London. Blackwell Scientific Publications Ltd. 14- Fladung, M., Ballvora, A. and Schmülling, T. 1993. Constitutive or light regulated expression of the rolc gene in transgenic potato plants has different effects on yield attributes and tuber carbohydrate composition. Plant Molecular Biology, 23, 749-757. 15- Gamble, P. E. and Mullet, J. E. 1989. J. Biol. Chem. 264, 7236-7242 585
16- Holland, N., Evron, Y., Jansen, A.k., Edelman, M. and Pick, U. 1997. lnvolvement of Thylakoid Overenergization in Tentoxin induced Chlorosis in Nicotiana spp. Plant Physiol. 114, 887-892. 17- Koenig, R. and M.R. Kuhns. 1996. Control of iron chlorosis in ornamental and crop plants. Utah StateUniv. AG-SO-01. Electronic publication. 18- Kurioka, Y., Suzuki, Y., Kamads, H. and Harada, H. 1992. Promotion of flowering and morphological alteration in Atropa belladonna transformed with CaMV 35S-rolC chimeric gene of the Ri plasmid. Plant Cell Rpt. 12, 1 6. 19- Maurel, S., Barbier-Bryqoo, H., Spena, A., Tempe, G. and Guern, G. 1991. Single rol genes from the Agrobacterium rhizogenes TL-DNA alter some of the cellular responses to auxin in Nicotiana tobacum. Plant Physiol. 97, 212 216. 20- Meyer A. D., Ichikawa T. and Meins F. 1995. Horizontal gene transfer: regulated expression of tobacco homologue of the Agrobacterium rhizogenes rolc gene. Mol. Gen. Genet, 249, 265 273. 21- Mohajjell shoja, H., Clement, B., Perot, J. and Otten. L. 2011. Contribution to the study of the Agrobacterium rhizogenes plast genes, rolb and rolc, and their homologs in Nicotiana tabacum. Molecular Plant-Microbe Interaction, 24, 44-53. 22- Rao, S.R. and Ravishankar, G. 2002. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol Adv, 20, 101 153. 23- Riker, A.J., Banfield, W.M., Wright, W.H., Keitt, G.W. and Sagen, H.E. 1930. Studies on infectious hairy root of nursery-apple tree. J Agric Res, 41, 507 540. 24- Schmülling, T., Schell, J. and Spena, A. 1988. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development. EMBO J, 7, 2621 2629. 25- Shen, W.H., Petit, A., Guern, J. and Tempe, J. 1988. Hairy roots are more sensitive to auxin than normal roots. Proc Natl Acad Sci USA, 85, 3417-3421. 26- Shkryl, Y. N., Veremeichik, G. N., Bulgakov, V. P., Tchernoded, G. K., Mischenko, N. P., Fedoreyev, S. A. and Zhuravlev, Y. N. 2008. Individual and combined effects of the rola, B and C genes on anthraquinone production in Rubia cordifolia transformed calli. Biotechnol. Bioeng. 1, 118-125. 27- Slightom, J. L., Durand-Tardif, M., Jouanin, L. and Tepfer, D. 1986. Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine-type plasmid: identification of open reading frames. J. Biol.Chem, 261, 108 121. 28- Spano, L., Mariotti, D., Cardarelli, M., Branca, C. and Costantino, P. 1988. Morphogenesis and auxin sensitivity of transgenic tobacco with different complements of Ri T-DNA. Plant Physiol, 87, 479-483. 29- Suzuki, K., Yamashita, I. and Tanaka, N. 2002. Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution. Plant J, 32, 775 787. 30- Tempe J., Petit A. 1982. Opine Utilization by Agrobacterium. New York: Academic. 31- Tepfer, D. 1984. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: sexual transmission of the transformed geneotype and phenotype. Cell, 37, 959 967. 32- White, F. F., Garfinkel, D. J., Huffman, G. A., Gordon, M. P. and Nester, E. W. 1983. Sequence homologous to Agrobacteriurn rhizogenes T- DNA in the genomes of uninfected plants. Nature, 301, 348 350. 33- Winans, S. C. 1992. Two-Way Chemical Signaling in Agrobacterium-Plant Interactions. Microbiological reviews 51, 12 31. 34- Yoshida, R., Kanno, A. and Kameya, T. 1996. Cool Temperature-lnduced Chlorosis in Rice Plants. Plant Physiol. 112, 585-590. 35- Yokoyama, R., Hirose, T., Fujii, N., Aspuria, E., Kato, A. and Uchimiya, H. 1994. The role promoter of Agrobacterium rhizogenes Ri plasmid is activated by sucrose in transgenic tobacco plants. Mol Gen Genet, 244, 15 22. 36- Zuker, A., Tzfira, T., Scovel, G., Ovadis, M., Shklarman, E. and Itzhaki, H. 2001. rolctransgenic carnation with improved agronomic traits: Quantitative and qualitative analyses of greenhouse-grown plants. J. Am. Soc. Hortic. Sci, 126, 13 18. 586
Study of the effect of rolc and trolc genes on chlorosis in Tobacco plants Gardoonpar H. 1, Mohajjel shoja H. 2 and Hosseinpour feizi M.A. 3 1 Botany Dept., Faculty of Natural Science, University of Tabriz, Tabriz, I.R. of Iran 2 Zoology Dept., Faculty of Natural Science, University of Tabriz, Tabriz, I.R. of Iran Abstract The rol (rooting locus) genes are located on T-DNA (Transferred DNA) of Agrobacterium rhizogenes and induce the morphological and developmental abnormalities upon the integration in to the plant genome. In this study we investigated the effect of bacterial rolc gene and its homologue in Tobacco -tobacco rolc or ''trolc'' gene- on growth of Nicociana tabaccum cv.samsun plants. In the first time, the presence of rolc and trolc genes was confirmed in transgenic lines and then using RT- PCR technique, we have shown that the transgenic plants expressing the bacterial rolc or tobacco trolc genes -which demonstrate the chlorotic phenotype-, have very low or no expression of the chloroplastic gene ''psba''. This gene encodes for one of the proteins of photosystem II. We conclude that the lack of expression of chloroplastic psba gene and thus the defective feature of chloroplasts in rolc/trolc transgenic plants may cause the chlorotic phenotype of these plants. Key words: Agrobacterium, chlorosis, RT-PCR, rolc, trolc 587