ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ (ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ-ΙΟΥΣ) 1
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ 19 Παράγοντες που συμβάλλουν σε αύξηση των εντόμων 1. Μονοκαλλιέργειες 2. Βελτίωση με κριτήριο αποκλειστικά την παραγωγικότητα (σε ιδανικές συνθήκες) 3. Εκτεταμένη χρήση ισχυρών εντομοκτόνων (χλωριωμένοι υδρογονάνθρακες) που αφενός δεν έχουν εκλεκτικότητα και αφετέρου ασκούν πίεση για δημιουργία νέων πιο επιβλαβών εντόμων 1. Βελτιωμένοι κληρονομήσιμοι μηχανισμοί αντοχής 2. Αξιοποίηση φυσικών μεταβολιτών από φυτά ή μικροοργανισμούς Χαμηλότερες και οικονομικότερες δόσεις χημικών εντομοκτόνων 2
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ 20 ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΟΞΙΝΕΣ (Bacillus thuringiensis) Διάφορα στελέχη και υποείδη του βακτηρίου που το καθένα παράγει διαφορετική τοξίνη και θανατώνει διαφορετικά έντομα. 4 ομάδες τοξινών: CryI CryII CryIII CryIV υποομάδες: CryIΑ, CryIΒ, CryIC. CryIF, υπο-υποομάδες: CryIΑ(a), CryIΑ(b), CryIΑ(c) 3
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ 21 ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΟΞΙΝΕΣ (Bacillus thuringiensis) 4
ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΟΞΙΝΕΣ (Bacillus thuringiensis) 22 παρασπορικός κρύσταλλος αποτελούμενος από πρωτεϊνες CryI παράγεται κατά την σποριογένεση του βακτηρίου και αποτελεί τροφή για τα έντομα σε αλκαλικό περιβάλλον ο κρύσταλλος διαλύεται αρχικά στις επιμέρους διπεπτίδια CryI και στη συνέχεια στις επιμέρους πολυπεπτιδικές αλυσίδες (προτοξίνη) ηπροτοξίνημετατρέπεται σε τοξίνη Bt στο στομάχι του εντόμου 5 Εικ. 10.4
ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΟΞΙΝΕΣ (Bacillus thuringiensis) 23 Μηχανισμός δράσης Βt τοξίνης η τοξίνη Bt εισέρχεται στη μεμβράνη του επιθυλιακού κυττάρου του εντόμου σχηματίζοντας ιοντικό κανάλι μεταξύ κυτταροπλάσματος και εξωκυττάριου χώρου, με συνέπεια η εκροή ATP μέσω του καναλιού να οδηγεί στο θάνατο του εντόμου 6 Εικ. 10.5
24 ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΟΞΙΝΗΣ Βt γονίδια πλασμιδιακά στα οποία είναι κωδικοποιημένες οι πρωτεϊνες Cry γονίδιο Bt πρωτεϊνη Cry NH 2 Ι ΙΙ ΙΙΙ COOH περιοχή Ι: άμινο άκρο που εμπλέκεται στην εξειδικευμένη σύνδεση της τοξίνης στα επιθηλιακά κύτταρα των εντόμων περιοχή ΙΙ: δεν φαίνεται να παίζει ρόλο στη δράση της τοξίνης περιοχή ΙΙΙ: καρβοξύ άκρο που δεν περιέχει τμήμα της τοξίνης 7
25 ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΟΞΙΝΗΣ Βt Ο γενετικός ανασυνδυασμός των πλασμιδίων στα βακτήρια Bt διευρύνει την εντομοκτόνο δράση τους 8
26 ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ Bt ΤΟΞΙΝΕΣ Όταν στα φυτά ενσωματώνονται ακέραια γονίδια Βt τοξίνης αυτά δεν εκφράζονται ικανοποιητικά, ελλειμματικά όμως που περιλαμβάνουν την περιοχή Ι των πρωτεϊνών Cry εκφράζονται περισσότερο. Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών με τροποποιημένα (ελλειμματικά) γονίδια Βt 9
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ 27 ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΜΕ ΑΜΥΝΤΙΚΟΥΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥΣ ΑΠΟ ΑΛΛΑ ΦΥΤΑ Μεταφορά γονιδίων που κωδικοποιούν δευτερογενείς μεταβολίτες όπως τερπενοειδή, φλαβονοειδή, αλκαλοειδή, ανάλογα αμινοξέων, τοξικές πρωτεϊνες Προϋποθέσεις: 1. Το γνώρισμα να ελέγχεται από ένα γονίδιο 2. Η έκφραση του γονιδίου να είναι εφικτή στους επιθυμητούς ιστούς σε κατάλληλες συγκεντρώσεις 3. Η ανθεκτικότητα να είναι σταθερά κληρονομήσιμη 4. Να μη υπάρχουν δυσμενείς επιδράσεις στο φυσιολογικό μεταβολισμό του φυτού 5. Το προϊόν έκφρασης να μη είναι τοξικό για άνθρωπο και ζώα 10
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ 27 ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΦΥΤΑ ΜΕ ΑΜΥΝΤΙΚΟΥΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥΣ ΑΠΟ ΑΛΛΑ ΦΥΤΑ Συσχέτιση θνησιμότητας προνυμφών βρούχου του μπιζελιού σε διαγονιδιακά μπιζέλια που εκφράζουν την α-αμυλάση του φασολιού Εικ. 10.10 11
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ Δομή ιών πρωτεϊνική κάψα πρώιμα γονίδια κεφαλή DNA όψιμα γονίδια ουρά 12
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ φυτικό κύτταρο 13
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ φυτικό κύτταρο 14
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ φυτικό κύτταρο 15
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ φυτικό κύτταρο 16
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ 1. μεταφορά όψιμων γονιδίων για τον ιό της μωσαϊκής του καπνού γονίδια πρωτεϊνικής κάψας στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 17
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ 1. μεταφορά όψιμων γονιδίων για τον ιό της μωσαϊκής του καπνού Συσχέτιση συχνότητας εμφάνισης συμπτωμάτων ιώσεων σε φυτά μάρτυρες (άγριος τύπος), μεταμορφωμένα για το περίβλημα του ιού ΖΥΜV, για το περίβλημα του ιού WMV, ή ταυτόχρονα για τα περιβλήματα των δύο ιών Εικ. 10.13 18
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ 2. μεταφορά πρώιμων γονιδίων σε καπνό, τομάτα και ζαχαρότευτλα γονίδια αναπαραγωγής DNA στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 19
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ 2. μεταφορά πρώιμων γονιδίων σε καπνό, τομάτα και ζαχαρότευτλα γονίδια αναπαραγωγής DNA στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 20
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΙΟΥΣ 2. μεταφορά πρώιμων γονιδίων σε καπνό, τομάτα και ζαχαρότευτλα γονίδια αναπαραγωγής DNA στον πυρήνα φυτικό κύτταρο 21
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ-ΜΥΚΗΤΕΣ 1. μεταφορά γονιδίων που κωδικοποιούν αντιβιοτικές ουσίες 2. τροποποίηση ενζύμου «στόχου» ή αύξηση των γονιδίων του ενζύμου «στόχου» 3. ενίσχυση της αντίδρασης υπερ-ευαισθησίας 22
ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΠΑΓΕΤΟΥΣ Ψεκασμός με μεταλλαγμένα βακτήρια στα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί τη δημιουργία παγοκρυστάλλων 23
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποιες είναι οι κατηγορίες Bt τοξινών που παράγονται από στελέχη και υποείδη του βακτηρίου Bacillus thuregiensis; Ποια η φύση των Bt τοξινών; Να αναπτυχθεί ο μηχανισμός τοξικής επίδρασης των Bt τοξινών στα έντομα Ποια η φύση και δομή των γονιδίων που κωδικοποιούν Bt τοξίνες και γιατί είναι απαραίτητο να είναι ελλειμματικά όταν εισάγονται σε διαγονιδιακά φυτά; Πως είναι εφικτό να δημιουργηθούν διαγονιδιακά φυτά που κωδικοποιούν περισσότερες από μια Bt τοξίνες ώστε να αντέχουν σε περισσότερα από ένα έντομα; Τι γονίδια αφορούν οι αμυντικοί μηχανισμοί από ανθεκτικά σε έντομα φυτά που αξιοποιούνται στη γενετική τροποποίηση ευαίσθητων και ποιες είναι οι προϋποθέσεις Μηχανισμοί δημιουργίας φυτών με ανθεκτικότητα σε ιούς (από Γενετική) Μηχανισμοί δημιουργίας φυτών με ανθεκτικότητα σε βακτήρια και μύκητες (από Γενετική) Μηχανισμοί δημιουργίας φυτών με ανθεκτικότητα σε παγετούς (από Γενετική) 24
ΑΝΤΟΧΗ ΣΕ ΕΝΤΟΜΑ 3 Για τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών αντοχή στα έντομα πηγή γονιδίων αντοχής είναι το βακτήριο Bacillus thuringiensis. Υπάρχουν διάφορα στελέχη και υποείδη του βακτηρίου που το καθένα παράγει διαφορετική τοξίνη και θανατώνει διαφορετικά έντομα. Οι τοξίνες αυτές που είναι γνωστές και ως Bt τοξίνες, είναι πρωτεϊνικής φύσης και διακρίνονται σε τέσσερις ομάδες: CryI (λεπιδόπτερα), CryII, CryIII, CryIV. Σε κάθε ομάδα υπάρχουν υποομάδες (πχ cryia, cryiβ, ), και υπο-υποομάδες (cryia(a), cryia(b), ) 4 Το bt πιάνει κυρίως λεπιδόπτερα και λιγότερο δίπτερα και κολεόπτερα, δεν είναι τοξικό για υμενόπτερα (μέλισσες) 5-6 Μηχανισμός δράσης της Bt τοξίνης Κατά τη σποριογένεση τα βακτήρια παράγουν ενδοκυτταρικά παρασπορικούς κρυστάλλους (πρωτεϊνικής φύσης) που χρησιμοποιούνται ως τροφή από τα έντομα Βλέπε διαφάνειες 6 Η τοξικότητα έναντι ανθρώπων και θηλαστικών είναι μικρή γιατί εκλείπουν οι απαραίτητες συνθήκες (ΡΗ, πρωτεάσες) για μετατροπή της προτοξίνης σε τοξίνη. Για να δράσει το Bt πρέπει να ληφθεί ως τροφή, που σημαίνει ότι δεν είναι δραστικό με επαφή, είναι δύσκολο να καταπολεμήσει έντομα που ζουν μέσα σε ιστούς. 7 Το γονίδιο Bt βρίσκεται στο πλασμίδιο του βακτηρίου. Σ αυτό είναι κωδικοποιημένη μια πρωτεϊνη Cry η οποία περιλαμβάνει τρεις περιοχές (βλ. διαφάνεια) 8 Επειδή υπάρχει μεγάλη εξειδίκευση τοξίνης-εντόμου, και οι καλλιέργειες προσβάλλονται από διάφορα έντομα, συνδυασμός τοξινών με γενετικό ανασυνδυασμό διευρύνει την εντομοκτόνο δράση. Στον πίνακα φαίνεται η μεμονωμένη (Ν) ή η συνδυασμένη δράση διάφορων Bt τοξινών 9 Ο πίνακας δείχνει ότι στη γενετική τροποποίηση αν ενσωματωθούν στα φυτά Bt γονίδια η έκφρασή τους και κατ επέκταση η τοξικότητά τους βελτιώνεται όταν εισάγεται μόνο το τμήμα που αντιστοιχεί στην περιοχή Ι της πρωτεϊνης. 10 Για τη δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών με αντοχή σε έντομα μπορεί να μεταφέρονται από άλλα φυτά γονίδια που κωδικοποιούν δευτερογενείς μεταβολίτες και τα οποία επίσης προσδίδουν αντοχή
11 Διαγονιδιακά μπιζέλια στα οποία μεταφέρθηκε το γονίδιο για την α-αμυλάση του φασολιού εξέφραζαν σε διαφορετικό βαθμό το γονίδιο με αποτέλεσμα να δείξουν διαφορετικό επίπεδο αντοχής στο βρούχο 12-. Για αντοχή σε ιούς, βακτήρια, μύκητες και παγετό βλ. Βιβλίο Γενετικής