ΓΕΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 ΓΕΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ (Μεταφορά γενετικού υλικού στους προκαρυωτικούς οργανισμούς) Μαντώ Κυριακού 2015

2 Γενετικό υλικό των βακτηρίων Αποτελείται από ένα μόριο DNA σε υπερελιγμένη μορφή και τα άκρα του είναι ενωμένα (κυκλικό μόριο): βακτηριακό χρωμόσωμα Εκτός από το χρωμοσωμικό γενετικό υλικό πολύ σημαντικό ρόλο παίζει και το εξωχρωμοσωμικό: : (μικρά( μόρια DNA) τα πλασμίδια, τα μεταθετά γενετικά στοιχεία, οι προϊοί

3 Το μέγεθος ποικίλει Γενετικό στοιχείο Μεταθετά γενετικά στοιχεία (transposons) Πλασμίδια Προ-ιοί Φάγοι Βακτηριακό χρωμόσωμα Διακύμανση του μεγέθους kbp 1kbp-150kbp 3kbp-300kbp 4knt-170kbp 600kbp-9.45Mbp

4 Μηχανισμοί μεταφοράς του γενετικού υλικού στα βακτήρια Στα βακτήρια εκτός από τον κλασικό τρόπο μεταφοράς του γενετικού υλικού που γίνεται από το μητρικό κύτταρο στα δύο θυγατρικά, μετά από τον διπλασιασμό του DNA, έχει παρατηρηθεί το φαινόμενο της οριζόντιας μεταφοράς γενετικού υλικού, η οποία γίνεται κυρίως με τρεις διαδικασίες: τον μετασχηματισμό (transformation) τη μεταγωγή (transduction) τη σύζευξη (conjugation)

5 Μετασχηματισμός (transformation) H πρώτη μεταφορά γενετικού υλικού που παρατηρήθηκε από τον Griffith, το 1928 Στο περίφημο πείραμά του με τα δύο στελέχη των πνευμονιόκοκκων που δημιουργούν αδρές και λείες αποικίες, παρατήρησε ότι μόνο το στέλεχος με τις λείες αποικίες ήταν παθογόνο για τα ποντίκια. Η διαφορά αυτού του στελέχους είναι στη σύνθεση ενός εξωτερικού καλύμματος πολυσακχαρίτη που του επιτρέπει να αποφύγει το αμυντικό σύστημα του ποντικού και κατά συνέπεια να γίνει παθογόνο. Ο Griffith απέδειξε ότι ακόμα και εάν εμβολιάσει το ποντικό με νεκρά κύτταρα από το στέλεχος αυτό μαζί με ζωντανά κύτταρα από το μη-παθογόνο (αδρές αποικίες), το πειραματόζωο μολύνεται Την εποχή εκείνη αναφέρθηκε σε έναν παράγοντα ο οποίος μεταμορφώνει τα μη-παθογόνα βακτηριακά κύτταρα σε παθογόνα Χρειάστηκε να περάσουν 14 χρόνια για να αποδείξουν οι Avery, MacLeod και McCarty ότι ο παράγοντας αυτός ήταν το DNA

6 Πείραμα του Griffith

7 Μετασχηματισμός (transformation)

8 Μετασχηματισμός (transformation) O μετασχηματισμός είναι ένα φαινόμενο που παρατηρείται σε αρκετά γένη βακτηρίων όπως τα Azotobacter,, Bacillus, Campylobacter, Clostridium, Haemophilus, Mycobacterium, Neisseria,, Streptococcus, Streptomyces Η φυσική ικανότητα που έχουν αυτοί οι μικροοργανισμοί να δέχονται ξένο γυμνό DNA, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν εργαλείο στις τεχνικές της Γενετικής Μηχανικής Η διαδικασία εισόδου του κάποιου μορίου DNA επάγεται είτε με χημική επεξεργασία των κυττάρων, είτε με χρήση ηλεκτρικού

9 Μεταγωγή (transduction) Mεταφορά DNA από κάποιο κύτταρο-δότη σε κάποιο κύτταρο-δέκτη, μέσω της παρουσίας ενός ιού που προσβάλλει βακτήρια και ονομάζεται βακτηριοφάγος ή φάγος Παρατηρήθηκε για πρώτη φορά από τους Zinder & Lederberg, το 1952 σε κάποιο στέλεχος του βακτηρίου Salmonella και του φάγου P22 Kατά την αντιγραφή του φαγικού DNA στο βακτηριακό κύτταρο (δότη), αποσπάται ένα τμήμα του βακτηριακού DNA μαζί με το DNA του φάγου. Το τροποποιημένο γενετικό υλικό του φάγου εξακολουθεί να μπορεί να μολύνει καινούργια βακτηριακά κύτταρα, στα οποία όμως εισάγει το τροποποιημένο γενετικό υλικό του, το οποίο περιέχει και τμήματα του βακτηριακού DNA. Στην περίπτωση αυτή δημιουργούνται περιοχές διπλοειδείς μέσα στο βακτηριακό κύτταρο δέκτη

10 Μεταγωγή (transduction)

11 Σύζευξη (conjugation) Ανακαλύφθηκε το 1946 από τους Lederberg & Tatum και προϋποθέτει την επαφή των κυττάρων δότη και δέκτη, για την μεταφορά του γενετικού υλικού Πρωταγωνιστής: εξωχρωμοσωμικό γενετικό υλικό, που ονομάζεται πλασμίδια Τα πλασμίδια: υπερελιγμένα μικρά μόρια DNA που διαθέτουν πολλά βακτηριακά είδη και τα οποία έχουν τη δυνατότητα να αυτοδιπλασιάζονται ανεξάρτητα από το βακτηριακό χρωμόσωμα. Η πληροφορία για την αντιγραφή τους βρίσκεται στο ίδιο το πλασμίδιο Κάποιες φορές ενσωματώνονται και στο βακτηριακό DNA και μπορούν πάλι να αποκολληθούν, αποσπώντας και τμήμα του βακτηριακού χρωμοσώματος

12 Σύζευξη (conjugation)

13 Σύζευξη Κατά τη σύζευξη γίνεται μεταφορά του πλασμιδίου από ένα κύτταρο δότη σε ένα κύτταρο δέκτη, αφού έρθουν σε επαφή τα κυτταρικά τους τοιχώματα Η διαδικασία ελέγχεται από τα γονίδια που βρίσκονται στο πλασμίδιο στην περιοχή tra (transfer) του πλασμιδίου Η μία αλυσίδα του DNA του πλασμιδίου εισέρχεται στο κύτταρο δέκτη και αμέσως μετά ξεκινά η διαδικασία διπλασιασμού της στο κύτταρο δότη Αρκετά πλασμίδια που δεν διαθέτουν την ικανότητα μεταφοράς τους, ενεργοποιούνται από τα πλασμίδια που διαθέτουν

14 Σύζευξη Επίσης πιο σπάνια ενεργοποιούνται και τμήματα του βακτηριακού χρωμοσώματος τα οποία μεταφέρονται Το πλασμίδιο ενσωματώνεται με το χρωμόσωμα, το οποίο ενεργοποιεί και το μεταφέρει στο κύτταρο δέκτη Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται Hfr (High frequency recombination) λόγω του εκτεταμένου ανασυνδυασμού μεταξύ πλασμιδίου και χρωμοσώματος

15 Πλασμίδια o o o Διαθέτουν πληροφορίες που δεν είναι απαραίτητες για την αύξηση του βακτηρίου, αλλά βοηθούν να προσαρμοστεί στις ιδιαίτερες συνθήκες του περιβάλλοντος: η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά, η παραγωγή τοξινών, δημιουργία όγκων σε φυτά, αποικοδόμηση υδρογονανθράκων και αρωματικών ενώσεων όπως ναφθαλένιο, σαλικυλικό κ.α. Ιδιαίτερα η χαρακτηριστική ιδιότητά τους, της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά, αποδείχτηκε πολύ χρήσιμη στις τεχνικές της Γενετικής Μηχανικής Το μέγεθος των πλασμιδίων: : 1kbp1-150bp bp, αν και μεγαλύτερα πλασμίδια έχουν απομονωθεί από βακτηριακά στελέχη των γενών Agrobacterium, Pseudomonas, Streptomyces. Τα πλασμίδια κυμαίνονται από >0,1% έως 4% του μεγέθους του βακτηριακού χρωμοσώματος, ενώ σπάνια φτάνουν έως 20%

16 Πλασμίδια ανθεκτικότητας (R) Πλασμίδια που διαθέτουν γονίδια τα οποία προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά και σε διάφορους άλλους αναστολείς της αύξησης των κυττάρων όπως σε βαρέα μέταλλα (Hg) Πρώτα ανακαλύφθηκαν στην Ιαπωνία, σε παθογόνα εντεροβακτήρια που παρουσίαζαν πολύ-ανθεκτικότητα ανθεκτικότητα, και στη συνέχεια διαπιστώθηκε η παρουσία τους παντού Πλέον, έχει αναγνωριστεί μεγάλη ποικιλία από πλασμίδια που φέρουν ανθεκτικότητες στα αντιβιοτικά. Από τα πιο γνωστά είναι το R100 πλασμίδιο (89,3kb) που φέρει γονίδια ανθεκτικότητας στις sulfonamides,, streptomycin, spectinomycin, fusidic acid, chloramphenicol,, tetracycline και στον υδράργυρο. Έχει βρεθεί σε στελέχη των γενών Escherichia, Klebsiella,, Proteus, Salmonella, Shigella Συνήθως τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν πρωτείνες που είτε απενεργοποιούν το αντιβιοτικό, είτε παρεμποδίζουν την είσοδο του στο βακτηριακό κύτταρο

17 Πλασμίδια που κωδικοποιούν τοξίνες και άλλα χαρακτηριστικά παθογένειας o Οι παθογόνοι μο διαθέτουν δύο χαρακτηριστικά σημαντικά για την είσοδο τους στον ξενιστή : Ικανότητα να προσκολλώνται στον ξενιστή και να αποικίζουν συγκεκριμένες περιοχές Να συνθέτουν συστατικά (τοξίνες, ένζυμα κ.α.).) τα οποία δημιουργούν βλάβες στον ξενιστή o Παρατηρήθηκε ότι σε πολλά παθογόνα βακτήρια τα γονίδια που κωδικοποιούν αυτά τα χαρακτηριστικά εντοπίζονται σε πλασμίδια

18 Πλασμίδια που κωδικοποιούν τοξίνες και άλλα χαρακτηριστικά παθογένειας o o Το εντεροπαθογόνο E.coli μπορεί να αποικίσει το λεπτό έντερο και στη συνέχεια να εκκρίνει τοξίνη με αποτέλεσμα σοβαρή διάρροια, μόνο εάν διαθέτει μία πρωτείνη που το βοηθά στη προσκόλληση στα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου (CFA:colonization factor antigen). Η πρωτείνη αυτή κωδικοποιείται από πλασμίδιο. Επίσης, τουλάχιστον δύο από τις τοξίνες που εκκρίνει, ή αιμολυσίνη και η εντεροτοξίνη κωδικοποιούνται από πλασμίδιο Άλλο γνωστό παθογόνο που προκαλεί μεγάλο πρόβλημα στις ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις είναι το Staphylococcus aureus, το οποίο εκκρίνει πλήθος τοξινών. Πολλές από αυτές όπως η αγλουτινάση, αιμολυσίνη, εντεροτοξίνη κωδικοποιούνται από πλασμίδιο

19 Πλασμίδια που κωδικοποιοούν βακτηριοσίνες Πολλά βακτήρια παράγουν πρωτεϊνικής φύσεως παράγοντες οι οποίοι αναστέλλουν ή θανατώνουν βακτήρια που ανήκουν σε άλλα συγγενή είδη, ή άλλα στελέχη του ιδίου είδους. Ονομάζονται βακτηριοσίνες για να τις διακρίνουμε από τα αντιβιοτικά που έχουν μεγαλύτερο εύρος δράσης Οι βακτηριοσίνες ονομάζονται από το είδος που τις παράγει, όπως οι κολισίνες του E.coli. Κωδικοποιούνται από πλασμίδια, οι κολισίνες π.χ. κωδικοποιούνται από τα col πλασμίδια Οι βακτηριοσίνες των Gram+ βακτηρίων έχουν κάπως διαφορετική δράση αλλά κωδικοποιούνται και αυτές από πλασμίδια. H Nisin A είναι μία βακτηριοσίνη που παράγεται από τα οξυγαλακτικά βακτήρια και έχει εμπορική σημασία, γιατί χρησιμοποιείται ως φυσικό συντηρητικό στα τρόφιμα

20 Μετάθεση Η ακριβής σειρά των γονιδίων στο γενετικό υλικό δεν είναι πάντοτε σταθερή. Υπάρχουν γονίδια τα οποία μετακινούνται κάτω από κάποιες συνθήκες: το φαινόμενο αυτό ονομάζεται μετάθεση (transposition) και πιστεύεται ότι έχει παίξει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες της εξέλιξης Το φαινόμενο αυτό είναι σπάνιο δηλαδή συμβαίνει με συχνότητα ανά γενεά. Πρώτη φορά το φαινόμενο αυτό μελετήθηκε στο καλαμπόκι. Δεν μπορούν όλα τα γονίδια να μετακινούνται, παρά μόνο αυτά που σχετίζονται με ειδικά γενετικά στοιχεία, τα μεταθετά στοιχεία. Στα βακτήρια υπάρχουν 3 είδη μεταθετών στοιχείων: transposons,, insertion sequences (IS), ειδικοί φάγοι (π.χ.. Mu)

21 Transposons & Insertion sequences Οι IS είναι τα πιο απλά μεταθετά στοιχεία και δεν διαθέτουν άλλα γονίδια εκτός από εκείνα που κωδικοποιούν για την μετακίνησή τους. Έχουν μήκος περίπου 1000b και μπορούν να εισέρχονται σε ειδικές θέσεις στο γονιδίωμα. Βρίσκονται σε χρωμόσωμα και πλασμίδια Τα transposons είναι μεγαλύτερα και περιέχουν περισσότερα γονίδια, κάποια από αυτά είναι και γονίδια ανθεκτικότητας, τα οποία μεταδίδονται με αυτό τον τρόπο

22 Ευχαριστώ!!