ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΒΙΟΤΥΠΩΝ ΜΟΣΧΟΚΥΠΕΡΗΣ (Cyperus difformis) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ALS ΣΥΜΕΛΑ Ι. ΝΤΟΑΝΙΔΟΥ ΓΕΩΠΟΝΟΣ του Π.Θ. Επιβλέπων καθηγητής: Ηλίας Γ. Ελευθεροχωρινός ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Θεσσαλονίκη 2013
ii ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΒΙΟΤΥΠΩΝ ΜΟΣΧΟΚΥΠΕΡΗΣ (Cyperus difformis) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ALS ΣΥΜΕΛΑ Ι. ΝΤΟΑΝΙΔΟΥ ΓΕΩΠΟΝΟΣ του Π.Θ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Γεωπονίας Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Ειδίκευση Γενετικής Βελτίωσης Φυτών, Αγροκομίας και Ζιζανιολογίας Τριμελής Eξεταστική Επιτροπή Ηλίας Ελευθεροχωρινός, επιβλέπων καθηγητής Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Γρηγόριος Διαμαντίδης, καθηγητής Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Χρήστος Δόρδας, αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ.
iii Ντοανίδου Ι. Συμέλα Α.Π.Θ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΒΙΟΤΥΠΩΝ ΜΟΣΧΟΚΥΠΕΡΗΣ (Cyperus difformis) ΣΕ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΑ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ALS ISBN «Η έγκριση της παρούσης Μεταπτυχιακής Διατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλομίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφεως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2
iv ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Επιθυμώ να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον καθηγητή του Τμήματος Γεωπονίας, της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ., κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό, για την αμέριστη συμπαράσταση που έδειξε στην προσπάθειά μου να εκπονήσω την παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή. Ειδικότερα, τον ευχαριστώ για την ανάθεση εποπτεία των πειραμάτων, την βοήθειά του κατά την ερμηνεία των δεδομένων, καθώς επίσης και για τις πολύτιμες υποδείξεις κατά την διάρκεια συγγραφής της εργασίας αυτής, οι οποίες ήταν καθοριστικές για την πληρότητά της ως προς το περιεχόμενο, τη δομή και την παρουσίαση της. Ευχαριστώ θερμά τον καθηγητή κ. Γρηγόριο Διαμαντίδη καθώς και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Χρήστο Δόρδα για τις πολύτιμες υποδείξεις κατά την διεξαγωγή των εργαστηριακών πειραμάτων, αλλά και για την κριτική ανάγνωση του κειμένου και τις χρήσιμες υποδείξεις. Επίσης ευχαριστώ θερμά τον καθηγητή κ. Νικόλαο Κατή, καθώς επίσης και την καθηγήτρια κα. Ελένη Ίσις Κωνσταντινίδου για την φιλοξενία κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στα εργαστήριά τους. Θα ήθελα ιδιαιτέρως να ευχαριστήσω την οικογένειά μου Ιωάννη, Μαγδαληνή και Λάζαρο Ντοανίδη για την αμέριστη συμπαράσταση και ενθάρρυνση καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων, αλλά και για την οικονομική βοήθεια που μου παρείχαν. Εκφράζονται επίσης θερμές ευχαριστίες στον μεταδιδάκτορα Νικόλαο Καλούμενο, τον συνάδελφο και διοικητικό προσωπικό του εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας Κωνσταντίνο Ευθυμίου καθώς και στον υποψήφιο διδάκτορα Γρηγόριο Μοράκη για την πολύτιμη βοήθειά τους καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω το Ινστιτούτο Τεχνολογίας και Έρευνας για την μερική χρηματοδότηση των πειραματικών εργασιών (Πρόγραμμα ΘΑΛΗΣ).
v ΟΝΟΜΑΤΟΛΟΓΙΑ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΩΝ Πίνακας Α. Κοινά ονόματα και ονόματα κατά IUPAC των ζιζανιοκτόνων αναστολέων του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS). Σουλφονυλουρίες Κοινό όνομα Όνομα κατά IUPAC Imazosulfuron Ιμιδαζολινόνες Κοινό όνομα Αzimsulfuron 1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-[1-methyl-4-(2-methyl-2Htetrazol-5-yl)pyrazol-5-ylsulfonyl]urea Halosulfuron-methyl methyl3-chloro-5-(4,6-dimethoxypyrimidin- 2ylcarbamoylsulfamoyl)-1-methylpyrazole-4-carboxylate Bensulfuron α-[(4,6-dimethoxypyrimidin-2-ylcarbamoyl)sulfamoyl]-o-toluic acid Chlorsulfuron 1-(2-chlorophenylsulfonyl)-3-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5- triazin-2-yl)urea Mesosulfuron methyl 2-[(4,6-dimethoxypyrimidin-2-ylcarbamoyl)sulfamoyl]- α-(methanesulfonamido)-p-toluate Iodosulfuron methyl 4-iodo-2-[(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2- yl)carbamoylsulfamoyl]benzoate Tribenuron methyl 2-[4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2- yl(methyl)carbamoylsulfamoyl]benzoate Triasulfuron 1-[2-(2-chloroethoxy)phenylsulfonyl]-3-(4-methoxy-6-methyl- 1,3,5-triazin-2-yl)urea Foramsulfuron 1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-[2-(dimethylcarbamoyl)-5- formamidophenylsulfonyl]urea Nicosulfuron 2-[(4,6-dimethoxypyrimidin-2-ylcarbamoyl)sulfamoyl]-N,Ndimethylnicotinamide Rimsulfuron 1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-(3-ethylsulfonyl-2- pyridylsulfonyl)urea 1-(2-chloroimidazo[1,2-a]pyridin-3-ylsulfonyl)-3-(4,6- dimethoxypyrimidin-2-yl)urea Όνομα κατά IUPAC Imazethapyr ammonium 5-ethyl-2-[(RS)-4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2- imidazolin-2-yl]nicotinate
vi Imazamox Τριαζολοπυριμιδίνες Κοινό όνομα Diclosulam Florasulam Penoxsulam Πυριμιδινιλοβενζοϊκά Κοινό όνομα Pyrithiobac Bispyribac-sodium ammonium 2-[(RS)-4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin- 2-yl]-5-methoxymethylnicotinate Όνομα κατά IUPAC 2,6 -dichloro-5-ethoxy-7-fluoro[1,2,4]triazolo[1,5- c]pyrimidine-2-sulfonanilide 2,6,8-trifluoro-5-methoxy[1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidine-2- sulfonanilide 3-(2,2-difluoroethoxy)-N-(5,8-dimethoxy[1,2,4]triazolo[1,5- c]pyrimidin-2-yl)-α,α,α-trifluorotoluene-2-sulfonamide Όνομα κατά IUPAC sodium 2-chloro-6-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-ylthio)benzoate sodium 2,6-bis(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yloxy)benzoate Σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινόνες Κοινό όνομα Όνομα κατά IUPAC Flucarbazone sodium 4,5-dihydro-3-methoxy-4-methyl-5-oxo-N-{[2- (trifluoromethoxy)phenyl]sulfonyl}-1h-1,2,4-triazole-1- carboximidate Propaxycarbazone sodium 4,5-dihydro-N-{[2-(methoxycarbonyl)phenyl]sulfonyl}- 4-methyl-5-oxo-3-propoxy-1H-1,2,4-triazole-1-carboximidate Πίνακας Β. Κοινά ονόματα και ονόματα κατά IUPAC των ζιζανιοκτόνων που ανήκουν σε λοιπές χημικές ομάδες-οικογένειες. Κοινό όνομα Όνομα κατά IUPAC Χχημική ομάδα-οικογένεια Glyphoste N-(phosphonomethyl) glycine Γλυκίνες 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Φαινοξυαλκανοϊκά οξέα MCPA 4-chloro-o-tolyloxyacetic acid Φαινοξυαλκανοϊκά οξέα Propanil 3,4 -dichloropropionanilide Αμίδια φυλλώματος Simazine Oxadiazon 6-chloro-N 2,N 4 -diethyl-1,3,5-triazine- 2,4-diamine 5-tert-butyl-3-(2,4-dichloro-5- isopropoxyphenyl)-1,3,4-oxadiazol- Χλωροτριαζίνη Οξαδιαζόλες
vii Νιτρίλια Μεθυλθειοτριαζίνες Τριαζινόνες Βενζοθειαδιαζόνες Πίνακας Γ. Κοινά ονόματα και ονόματα κατά IUPAC των ζιζανιοκτόνων αναστολέων του ενζύμου καρβοξυλάση του ακετυλο CoA (ACCase). Αρυλοφαινόξυπροπιονικά ζιζανιοκτόνα Κοινό όνομα Clodinafop Diclofop 2(3H)-one Bromoxynil potassium 2,6-dibromo-4- cyanophenolate Prometryn N 2,N 4 -diisopropyl-6-methylthio-1,3,5- triazine-2,4-diamine Metribuzin 4-amino-6-tert-butyl-4,5-dihydro-3- methylthio-1,2,4-triazin-5-one Bentazone sodium3-isopropyl-3h- 2,1,3benzothiadiazin-4-olate 2,2-dioxide Όνομα κατά IUPAC prop-2-ynyl(r)-2-[4-(5-chloro-3-fluoro-2- pyridyloxy)phenoxy]propionate methyl (RS)-2-[4-(2,4-dichlorophenoxy)phenoxy]propionate Quizalofop ethyl(2rs)-2-[4-(6-chloroquinoxalin-2- yloxy)phenoxy]propionate Propaquizafop 2-isopropylideneaminooxyethyl (R)-2-[4-(6-chloroquinoxalin- 2-yloxy)phenoxy]propionate Fenoxaprop ethyl (RS)-2-[4-(6-chloro-1,3-benzoxazol-2- yloxy)phenoxy]propionate Φαινυλοπυραζολίνες Κοινό όνομα Pinoxaden Κυκλοεξαδιόνες Κοινό όνομα Tralkoxydim Όνομα κατά IUPAC 8-(2,6-diethyl-p-tolyl)-1,2,4,5-tetrahydro-7-oxo-7Hpyrazolo[1,2-d][1,4,5]oxadiazepin-9-yl2,2-dimethylpropionate Όνομα κατά IUPAC (RS)-2-[(EZ)-1-(ethoxyimino)propyl]-3-hydroxy-5- mesitylcyclohex-2-en-1-one
viii ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σε πειράματα φυτοδοχείων που πραγματοποιήθηκαν στο Αγρόκτημα του Α.Π.Θ. κατά την χρονική περίοδο 2010-11 αξιολογήθηκαν 10 βιότυποι μοσχοκύπερης (Cyperus difformis) για την πιθανότητα σταυρανθεκτικότητάς τους σε ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της δράσης του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS). Η σύγκριση έγινε με βάση πιστοποιημένο ευαίσθητο βιότυπο από Ηνωμένο Βασίλειο. Η οκταπλάσια δόση των azimsulfuron, halosulfuron-methyl και imazosulfuron προκάλεσε μείωση του νωπού βάρους των φυτών των 10 δυνητικώς ανθεκτικών βιοτύπων του ζιζανίου κατά 2-40%, ενώ η αντίστοιχη μείωση από τη συνιστώμενη δόση των bentazone και glyphosate ήταν 100% και 68-82%. Επίσης, η διπλάσια δόση των penoxsulam, bispyribac-sodium και imazamox μείωσε το νωπό βάρος των φυτών των 10 δυνητικώς ανθεκτικών βιοτύπων κατά 7-40%, 7-40% και 14-70%, αντιστοίχως. Όλες οι επεμβάσεις των ζιζανιοκτόνων ήταν αποτελεσματικές εναντίον του ευαίσθητου βιότυπου. Τα πειράματα της έντασης ανθεκτικότητας έδειξαν ότι η 64x δόση των ζιζανιοκτόνων azimsulfuron και halosulfuron-methyl μείωσε την ανάπτυξη των φυτών των ανθεκτικών βιοτύπων λιγότερο από 50%. Αντιθέτως, η 1/2x (0.5 g/στρ) δόση τους επέφερε μείωση του ευαίσθητου βιοτύπου κατά 50%. Η αλληλούχηση του als γονιδίου έδειξε ότι η ανθεκτικότητα των δέκα βιοτύπων στα παραπάνω ζιζανιοκτόνα οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη της α- περιοχής του ενζύμου ALS και συγκεκριμένα στο κωδικόνιο της προλίνης (Pro, CCT) στη θέση 197, με συνέπεια την αντικατάσταση της προλίνης από αλανίνη (Ala, GCT) ή σερίνη (Ser, TCT). Η δράση του ενζύμου ALS των δέκα ανθεκτικών βιοτύπων στην παρουσία των ζιζανιοκτόνων azimsulfuron και halosulfuron-methyl έδειξε ότι οι I50 τιμές (συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου που προκαλεί μείωση της δράσης του ενζύμου ALS κατά 50%) κυμάνθηκαν από 10,3 έως 50,8 μμ azimsulfuron και από 6,41 έως 48,5 μμ halosulfuron-methyl. Οι αντίστοιχες I50 τιμές των azimsulfuron και halosulfuron-methyl για τον ευαίσθητο βιότυπο ήταν 0,09 και 0,10 μμ. Η ένταση
ix ανθεκτικότητας (R/S), όπου αριθμητής είναι η τιμή I50 του ανθεκτικού βιότυπου (R) και παρανομαστής η τιμή I50 του ευαίσθητου βιότυπου (S), κυμάνθηκε για τους ανθεκτικούς βιότυπους από 116 έως 900 για το azimsulfuron και από 65 έως 490 για το halosulfuron-methyl. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η σταυρανθεκτικότητα των 10 βιοτύπων στα ζιζανιοκτόνα-αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS οφείλεται σε μετάλλαξη του als γονιδίου, η οποία οδήγησε σε τροποποίηση του ενζύμου ALS και ειδικότερα σε αντικατάσταση της Pro στη θέση 197 από Ala ή Ser.
x SUMMARY Ten smallflower umbrella-sedge (Cyperus difformis) biotypes, collected from rice fields in Nothern Greece, were evaluated in pot experiments conducted at the university farm of The Aristotle University of Thessaloniki for possible development of cross-resistance to ALS-inhibiting herbicides. Azimsulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron applied at eight times higher than the recommended rate reduced fresh weight of plants by 2-40%, whereas the respective reduction from the application of the recommended rate of bentazone and glyphosate was 100% and 68-82%. In addition, the application of penoxsulam, bispyribac-sodium, and imazamox at two times higher than the recommended rate reduced fresh weight of the ten Cyperus biotypes by 7-40%, penoxsulam 7-40%, and 14-70%, respectively. The rate response experiments showed that both azimsulfuron and halosulfuron methyl, applied at sixty four (64) times higher than the recommended, failed to reduce growth of the ten resistant biotypes by 50%. However, for the susceptible biotype, both herbicides applied at 1/2x of the recommended rate reduced growth by 50%. The als gene sequencing for the 10 resistant and one susceptible biotype revealed that the observed resistance is attributed to point mutations on the A- domain of the enzyme acetolactate synthase (ALS) and particularly on the codon 197 (CCT) leading to substitution of proline by alanine (GCT) or serine (TCT). The catalytic activity of the ALS enzyme in the presence of azimsulfuron and halosulfuron-methyl indicated that the I50 values (herbicide concentration needed for 50% reduction of the ALS activity) ranged from 10,3 to 50,8 μm azimsulfuron and from 6,41 to 48,5 μm halosulfuron-methyl, whereas the corresponding values for the susceptible biotype were 0.09 and 0.10 respectively. The resistance ratio [(R/S, calculated by dividing the I50 value of each resistant biotype (R) with the I50 for the susceptible one (S)] ranged from 80,15 to 900 for azimsulfuron and from 65 to 490 for halosulfuron-methyl. These results strongly support that the cross-resistance of the ten biotypes was due to Pro197 substitution by Ala or Ser, which resulted in reduced ALS sensitivity to ALS-inhibiting herbicides.
xi ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΟΝΟΜΑΤΟΛΟΓΙΑ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY 1. Εισαγωγή 1 1.1 Γενική εισαγωγή 1.2 Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος 1.3 Σκοπός της διατριβής 2. Διερεύνηση ανθεκτικότητας και σταυρανθεκτικότητας διαφόρων πληθυσμών μοσχοκύπερης 2.1 Εισαγωγή 2.1.1Ορισμοί Ορολογία 2.1.2 Βιολογία του ζιζανίου μοσχοκύπερης 2.1.3 Αντιμετώπιση του ζιζανίου Cyperus difformis 2.1.3.1 Σουλφονυλουρίες (Sulfonylureas) 2.1.3.2 Ιμιδαζολινόνες (Imidazolinones) 2.1.3.3 Πυριμιδινυλoβενζοϊκά οξέα (Pyrimidinylbenzoates) 2.1.3.4 Τριαζολοπυριμιδίνες (Triazopyrimidines) 2.1.3.5 Σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινόνες (Sulfonylaminocarbonyltriazolinones) 11 Σελ iv v viii x 1 2 2 4 4 4 5 7 8 9 10 10 2.1.4 Ανάπτυξη ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα 2.1.5 Μηχανισμοί και παράγοντες που επηρεάζουν την εμφάνιση ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα 12 13 2.1.6 Ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων στην Ελλάδα 15
xii 2.1.7 Σκοπός της εργασίας 16 2.2 Υλικά και μέθοδοι 16 2.2.1 Συλλογή φυτικού υλικού 16 2.2.2 Πειράματα φυτοδοχείων 17 2.2.3 Πείραμα ανθεκτικότητας 2.2.4 Πειράματα σταυρανθεκτικότητας 2.2.5 Πείραμα προσδιορισμού της έντασης ανθεκτικότητας 2.2.6 Στατιστική ανάλυση 2.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση 2.3.1 Πείραμα ανθεκτικότητας 2.3.2 Πειράματα σταυρανθεκτικότητας 2.3.3 Πειράματα προσδιορισμού της έντασης ανθεκτικότητας 2.4 Συμπεράσματα 3. Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας 10 βιοτύπων μοσχοκύπερης στα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron και halosulfuron-methyl 32 18 19 21 23 24 24 26 29 31 3.1 Εισαγωγή 3.1.1 Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS 32 32 3.1.2 Τεχνικές διάγνωσης της ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα αναστολείς της δράσης του ενζύμου ALS 33 3.1.3 Ενίσχυση αλληλομόρφων γονιδίων με τεχνικές αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης PCR 3.1.4 Σκοπός της εργασίας 3.2 Υλικά και μέθοδοι 3.2.1 Προέλευση σπόρων και παραγωγή φυτικού υλικού 3.2.2 Απομόνωση, ενίσχυση και αλληλούχηση τμήματος του als γονιδίου 34 35 35 35 36
xiii 3.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση 38 3.4 Συμπεράσματα 42 4. Αξιολόγηση της δράσης του ενζύμου ALS από έντεκα βιοτύπους μοσχοκύπερης παρουσία των ζιζανιοκτόνων azimsulfuron και 43 halosulfuron-methyl 4.1 Εισαγωγή 43 4.1.1 Δομή του ενζύμου ALS 43 4.1.2 Δράση του ενζύμου ALS 4.1.3 Μοριακή βάση της πρόσδεσης μεταξύ ενζύμου ALS και ζιζανιοκτόνων 4.1.4 Μοριακή βάση της ανθεκτικότητας των ζιζανίων σε ALS-αναστολείς 4.1.5 Σκοπός της εργασίας 49 4.2 Υλικά και μέθοδοι 4.2.1 Προέλευση σπόρων και παραγωγή φυτικού υλικού 4.2.2 Εκχύλιση ALS ενζύμου 4.2.3 Δοκιμή της δράσης του ενζύμου ALS 4.2.4 Στατιστική ανάλυση 53 4.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση 4.4 Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Παράρτημα 69 44 46 47 49 49 50 51 54 60 61
1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γενική εισαγωγή Τα είδη του γένους Cyperus είναι τα σημαντικότερα ζιζάνια στην οικογένεια Cyperaceae (Tucker κ.ά., 2002) και, σύμφωνα με τους Holm κ.ά. (1977), το γένος Cyperus περιλαμβάνει τα χειρότερα-δυσκολοεξόντωτα ζιζάνια παγκοσμίως. Η μοσχοκύπερη (Cyperus difformis), η οποία ανήκει στην οικογένεια αυτή, θεωρείται ένα από τα σπουδαιότερα ζιζάνια στις καλλιέργειες του ρυζιού, αφού προκαλεί σημαντική οικονομική ζημία. Στην Ελλάδα και ειδικότερα στη Βόρεια Ελλάδα, η μοσχοκύπερη (Cyperus difformis) θεωρείται ένα από τα χειρότερα ζιζάνια στις καλλιέργειες του ρυζιού μαζί με την μουχρίτσα (Echinochloa spp) και το κόκκινο ρύζι (Oryza sativa). Η αποτελεσματική αντιμετώπισή της κρίνεται αναγκαία, επειδή η συνεχιζόμενη αύξηση του πληθυσμού της μπορεί να επιφέρει μείωση της απόδοσης κατά 12-50% και υποβάθμιση της ποιότητας του ρυζιού (Ampong- Nyarko και De Datta, 1991). Η αντιμετώπιση του ζιζανίου αυτού σε καλλιέργειες ρυζιού βασίζεται αποκλειστικά στη χρήση ζιζανιοκτόνων, επειδή θεωρείται η αποτελεσματικότερη και η οικονομικότερη μέθοδος (Bryson και Carter, 2008). Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιούνται ευρέως για την καταπολέμηση της μοσχοκύπερης σε ορυζώνες, είναι αυτά που που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS, AcetoLactate Synthase,EC 4.1.3.18). Η ομάδα των ζιζανιοκτόνων-αναστολέων του ALS ανακαλύφθηκε στα τέλη της δεκαετίας του 70 και συμπεριλαμβάνει τις οικογένειες των σουλφονυλουριών, ιμιδαζολινονών, τριαζολοπυριμιδινών, πυριμιδινυλ(θειο)βενζοϊκών οξέων και σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινονών. Η ανάπτυξη αυτών των ζιζανιοκτόνων θεωρείται ως επίτευγμα της ζιζανιολογίας διότι συνέβαλε στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση πολυετών και ετήσιων ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες και μάλιστα με πολύ χαμηλές δόσεις με συνέπεια και την μικρότερη ρύπανση του περιβάλλοντος (Whitcomb, 1999). Ο εφησυχασμός των περισσότερων παραγωγών εξαιτίας της αποτελεσματικότερης αντιμετώπισης των ζιζανίων με τη χρήση αυτών των ζιζανιοκτόνων και κυρίως η εμμονή
2 τους για συνεχή και μη εναλλασσόμενη (με ζιζανιοκτόνα διαφορετικού μηχανισμού δράσης) χρήση τους αύξησε την πιθανότητα εμφάνισης βιοτύπων ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Mallory-Smith κ.α.,1990; Tranel και Wright, 2002; Whitcomb, 1999). Έτσι, οι πρώτοι βιότυποι ζιζανίων με ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνααναστολείς του ενζύμου ALS καταγράφηκαν στις Η.Π.Α. πέντε χρόνια μετά τη συνεχή χρήση τους (Preston και Mallory-Smith, 2001; Saari κ.ά., 1994; Whitcomb, 1999). Ακολούθως, η εμφάνιση νέων ανθεκτικών βιοτύπων στην ομάδα αυτή των ζιζανιοκτόνων ήταν ταχύτατη, με αποτέλεσμα να έχουν καταγραφεί 132 ανθεκτικά είδη ζιζανίων, τα οποία υπερβαίνουν σε αριθμό το 50% όλων των ειδών (218) με ανθεκτικότητα παγκοσμίως σε όλα τα ζιζανιοκτόνα (Heap, 2013). 1.2 Αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος Η αναγκαιότητα διερεύνησης του προβλήματος προέκυψε κατά την χρονική περίοδο 2009, όταν διάφοροι παραγωγοί εξέφρασαν παράπονα για μειωμένη αντιμετώπιση του ζιζανίου μοσχοκύπερης (Cyperus difformis) από το ζιζανιοκτόνο azimsulfuron σε καλλιέργειες ρυζιού. Η μη επιτυχής αντιμετώπιση του ζιζανίου αλλά και η συνεχώς διευρυνόμενη κατάσταση του προβλήματος οδήγησε στην υπόθεση της πιθανής εμφάνισης ανθεκτικότητας. Έτσι, αποφασίστηκε η εκπόνηση της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής για τη διερεύνηση του προβλήματος και την πιθανή εξεύρεση λύσεων. Πραγματοποιήθηκαν επιτόπιες επισκέψεις σε ορυζώνες του Νομού Θεσσαλονίκης και συλλέχθηκε σπόρος δέκα βιοτύπων του ζιζανίου μοσχοκύπερης από ορυζώνες όπου η επέμβαση με το ζιζανιοκτόνο azimsulfuron δεν ήταν αποτελεσματική. 1.3 Σκοπός της διατριβής Ο σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής ήταν η διερεύνηση της πιθανότητας εμφάνισης ανθεκτικότητας σε δέκα βιοτύπους του ζιζανίου μοσχοκύπερης στο ζιζανιοκτόνο azimsulfuron, halosulfuron-methyl, glyphosate και bentazone, καθώς επίσης και της πιθανής ύπαρξης βιοτύπων με σταυρανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα imazosulfuron, imazamox, penoxsulam, bispyribac-sodium, azimsulfuron. Επιπλέον, μετά τη διαπίστωση της σταυρανθεκτικότητας, μελετήθηκε η ένταση ανθεκτικότητας των δέκα ανθεκτικών βιοτύπων του ζιζανίου και ενός ευαίσθητου στα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron και halosulfuron-methyl. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε ο μηχανισμός ανθεκτικότητάς τους στα
3 στα παραπάνω ζιζανιοκτόνα με αξιολόγηση της δράσης του ενζύμου ALS παρουσία των προαναφερθέντων ζιζανιοκτόνων-αναστολέων της δράσης του. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση τμήματος του als γονιδίου του ευαίσθητου και των δέκα ανθεκτικών βιοτύπων του ζιζανίου για τον εντοπισμό των σημειακών μεταλλάξεων που είναι υπεύθυνες για την ανθεκτικότητα.
4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Διερεύνηση ανθεκτικότητας και σταυρανθεκτικότητας διαφόρων πληθυσμών μοσχοκύπερης. 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1.1 Ορισμοί Ορολογία Ο όρος ανθεκτικότητα αναφέρεται στην η κληρονομούμενη ικανότητα μερικών φυτών ενός είδους ζιζανίου να επιβιώνουν και να αναπαράγονται μετά από επέμβαση με τη συνιστώμενη δόση ενός ζιζανιοκτόνου, στο οποίο τα περισσότερα φυτά του αρχικού πληθυσμού ήταν ευαίσθητα (Ελευθεροχωρινός, 2008). Αυτό σημαίνει ότι τα ανθεκτικά άτομα προϋπάρχουν στον αρχικό πληθυσμό σε μικρότερη συχνότητα από ό,τι τα ευαίσθητα και επιλέγονται μετά από την χρήση του ζιζανιοκτόνου (πίεση επιλογής). Αντίθετα με την ανθεκτικότητα, ο όρος αντοχή αναφέρεται στην κληρονομούμενη ικανότητα όλων των φυτών του αρχικού πληθυσμού ενός είδους ζιζανίου να επιβιώνουν και να αναπαράγονται στην καθορισμένη αρχική και συνιστώμενη δόση ενός ζιζανιοκτόνου (Ελευθεροχωρινός, 2008). Με βάση τον ορισμό αυτό, ο αρχικός πληθυσμός του ζιζανίου δεν είναι ευαίσθητος στη συνιστώμενη δόση του ζιζανιοκτόνου και για το λόγο αυτό το ζιζάνιο κατατάσσεται μεταξύ των μη ευαίσθητων στην ετικέτα πρώτης έγκρισης του ζιζανιοκτόνου. Έτσι λοιπόν γίνεται αντιληπτό ότι η ανθεκτικότητα και η αντοχή περιγράφουν την ευαισθησία ενός ζιζανίου στο ζιζανιοκτόνο αλλά με διαφορές στην ένταση. Ο όρος σταυρανθεκτικότητα περιγράφει «την ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε περισσότερα από ένα ζιζανιοκτόνα με τον ίδιο μηχανισμό δράσης και ανήκουν στην ίδια ή σε διαφορετικές οικογένειες»(rubin, 1997; Ελευθεροχωρινός, 2008). Η ανθεκτικότητα αυτής της μορφής ελέγχεται από ένα γονίδιο. Ο όρος πολλαπλή ανθεκτικότητα αναφέρεται στην «ανθεκτικότητα ενός ζιζανίου σε περισσότερα από ένα ζιζανιοκτόνα με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης και ανήκουν σε διαφορετικές ομάδες» (Rubin, 1997; Ελευθεροχωρινός, 2008). Η ανθεκτικότητα αυτής της μορφής ελέγχεται από πολλά γονίδια. 2.1.2 Βιολογία του ζιζανίου μοσχοκύπερης
5 Η βοτανική ταξινόμηση του γένους Cyperus είναι ιδιαίτερα δύσκολη ακόμη και σήμερα (Tucker κ.ά., 2002). Είναι γηγενές στη Νότια Αφρική, Αυστραλία αλλά και στην Ασία. Έχει εξαπλωθεί στη Βόρεια και Νότια Αμερική, στην Νοτιοανατολική Ασία, στην Αίγυπτο, στην Τουρκία αλλά και στις περισσότερες εύκρατες και τροπικές περιοχές του πλανήτη. Πίνακας 1. Βοτανική κατάταξη του ζιζανίου μοσχοκύπερης (Cyperus difformis) Βασίλειο: Υποβασίλειο: Υπερδιαίρεση: Διαίρεση: Κλάση: Υποκλάση: Τάξη: Οικογένεια: Γένος: Είδος: Plantae Tracheobionta Spermatophyta Magnoliophyta Liliopsida Commelinidae Cyperales Cyperaceae Cyperus Cyperus difformis Η οικογένεια των Cyperaceae περιλαμβάνει κάποια από τα σπουδαιότερα ζιζάνια του κόσμου όπως είναι η πορφυρή κύπερη (Cyperus rotundus), η οποία περιλαμβάνεται στα δέκα χειρότερα ζιζάνια του κόσμου, της Ευρώπης και της χώρας μας (Ελευθεροχωρινός 2008). Το Cyperus difformis κατατάσσεται στην 32 η θέση των πιο δυσεξόντοτων ζιζανίων παγκοσμίως (Holm κ.ά., 1977). Είναι ετήσιο, μονοκοτυλήδονο, εαρινό είδος. Έχει κάθετη έκφυση και ύψος που ποικίλει από 6 έως 80 cm. Ο βλαστός είναι πράσινος, συμπαγής και τρίπλευρος με πάχος 0,7 3 mm. Ο κολεός των φύλλων είναι ωχρο-κίτρινος χωρίς τρίχες. Τα φύλλα του είναι λεία, χωρίς τρίχες και με ευδιάκριτο κεντρικό νεύρο. Το μήκος τους κυμαίνεται από 5 έως 25 cm και το πλάτος του από 2 έως 6 mm. Τα φύλλα, ανά τρία, σχηματίζουν γωνίες 120 0 μοιρών και διατάσσονται σε τρεις κατευθύνσεις. Η ρίζα του είναι ινώδης, κόκκινη και θυσανωτή (Ελευθεροχωρινός και Γιαννοπολίτης, 2009). Η ταξιανθία είναι στάχυς ή φόβη με πυκνές σφαιρικές ομάδες σταχυδίων σε σχήμα ομπρέλας, με διάμετρο 5-15 mm και φέρουν 10-60 διασκορπισμένους ανθήρες. Η ταξιανθία στη βάση της περιβάλλεται από 2-3 φυλλόμορφα βράκτια, ένα εκ των οποίων
6 μπορεί να φτάσει σε μήκος τα 25 cm. Ανθοφορεί από Ιούνιο έως και Αύγουστο. Ο καρπός είναι αχαίνιο. Εικόνα 1. Εικόνα φυτών, ρίζας και ταξιανθίας μοσχοκύπερης. Το ζιζάνιο αυτό είναι υδροχαρές, αυτογονιμοποιούμενο, ανήκει στην ομάδα C3 και απαντάται συνήθως σε αποστραγγιστικές τάφρους, ορυζώνες και κακώς στραγγιζόμενες γεωργικές γαίες (Merotto κ.ά., 2009). Το Cyperus difformis αδερφώνει πολύ εύκολα και παράγει σπόρο σε σύντομο χρονικό διάστημα (10-16 εβδομάδες), ενώ στις τροπικές περιοχές με βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης, ανθοφορεί και παράγει σπόρο καθ όλη την διάρκεια του έτους (Holm κ.ά., 1977). Ένα και μόνο φυτό μπορεί να παράγει 50.000 σπόρους, εκ των οποίων το 60% είναι βιώσιμοι. Ο μικρός βιολογικός κύκλος και η μεγάλη σποροπαραγωγή ευνοούν την ταχεία εξάπλωση του είδους (Bryson και Carter, 2008). Επίσης, η διασπορά μεγάλου αριθμού σπόρων στο έδαφος σε συνδυασμό με την ύπαρξη μεγάλου πληθυσμού του Cyperus difformis στους ορυζώνες υποβοηθούν στην εξέλιξη της ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα. Γενικώς, οι πολλές γενεές παραγωγής σπόρου κατά τη διάρκεια του έτους σε συνδυασμό με τον τεράστιο αριθμό παραγόμενων σπόρων και τη συνεχή χρήση του bensulfuron σε ορυζώνες της Καλιφόρνιας ήταν τα κύρια αίτια αύξησης
7 του αριθμού βιοτύπων ανθεκτικών στο ζιζανιοκτόνο αυτό (Pappas-Fader κ.ά., 1993; Hill κ.ά., 1994). 2.1.3 Αντιμετώπιση του ζιζανίου Cyperus difformis Η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου για την αντιμετώπιση ενός ζιζανίου γίνεται με βάση το κόστος, των αναγκών σε εργασία, τη διαθεσιμότητα νέων τεχνολογιών, του μεγέθους της γεωργικής εκμετάλλευσης και των ειδών των ζιζανίων που απαντώνται στην καλλιέργεια. Ο έλεγχος των ζιζανίων μπορεί να επιτευχθεί με καλλιεργητικές, μηχανικές, χημικές και βιολογικές τεχνικές. Η κάθε τεχνική έχει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, ενώ μια μόνο τεχνική δεν επαρκεί για αποτελεσματικό και οικονομικό έλεγχο των ζιζανίων. Ο στόχος των καλλιεργητικών τεχνικών είναι η αύξηση της ανταγωνιστικής ικανότητας του ρυζιού με αποτέλεσμα να παρεμποδίσει την ανάπτυξη των ζιζανίων. Στις καλλιεργητικές τεχνικές περιλαμβάνεται η κατεργασία του εδάφους, η καλή προετοιμασία της σποροκλίνης, η αμειψισπορά, η εποχή σποράς και ο τρόπος σποράς, η πυκνότητα των φυτών της καλλιέργειας, η λίπανση, η σωστή διαχείριση του αρδευτικού νερού και τέλος ο περιορισμός της διασποράς των ζιζανίων. Ο συνδυασμός όλων των προαναφερθέντων καλλιεργητικών μέτρων συμβάλλει μερικώς και όχι στην πλήρη αντιμετώπιση των ζιζανίων και μάλιστα η αποτελεσματικότητα τους εξαρτάται από το είδος της καλλιέργειας, την ποικιλία, τα είδη των ζιζανίων και τις εδαφοκλιματολογικές συνθήκες (Monaco κ.ά., 2002). Όλα αυτά εξηγούν την στροφή των παραγωγών στην χρήση ζιζανιοκτόνων για την αποτελεσματικότερη και οικονομικότερη αντιμετώπιση της μοσχοκύπερης και άλλων ζιζανίων μέσα στην καλλιέργεια του ρυζιού. Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της μοσχοκύπερης (Cyperus difformis) στην καλλιέργεια του ρυζιού είναι τα ζιζανιοκτόνα με δράση αυξίνης (2,4-D, MCPA) με ταυτόχρονη χρήση του propanil (αναστολέας της λειτουργίας του φωτοσυστήματος IΙ), το bentazone (αναστολέας της λειτουργίας του φωτοσυστήματος IΙ), του glyphosate (αναστολέα της δράσης του ενζύμου EPSPS) και τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS) (Ampong-Nyarko και De Datta, 1991). Στην τελευταία ομάδα των ζιζανιοκτόνων ανήκουν οι οικογένειες των σουλφονυλουριών, των ιμιδαζολινονών, των τριαζολοπυριμιδινών, των
8 πυριμιδινυλβεζοϊκών και των σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινών. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά και ιδιότητες των οικογενειών αυτών αναφέρονται παρακάτω. 2.1.3.1 Σουλφονυλουρίες (Sulfonylureas). Η χημική δομή των ζιζανιοκτόνων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, αποτελείται από μια αρυλομάδα και μια ετεροκυκλική ομάδα που συνδέονται με σουλφονυλουρική γέφυρα (Σχήμα 1). α) azimsulfuron β) chlorsulfuron Σχήμα 1. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου α)azimsulfuron και β) chlorsulfuron Η πρώτη δραστική ουσία της οικογένειας αυτής ήταν το chlorsulfuron, το οποίο ανακαλύφθηκε το 1977 και πήρε έγκριση για χρήση στις ΗΠΑ και στην Μεγάλη Βρετανία το 1982, ενώ στην Ελλάδα πήρε έγκριση το 1985. Δέκα χρόνια μετά την σύνθεση του chlorsulfuron, η οικογένεια των σουλφονυλουριών περιελάμβανε 230 δραστικές ουσίες, πολλές από τις οποίες έχουν ήδη έγκριση για χρήση ως ζιζανιοκτόνα σε διάφορες χώρες, ενώ άλλες βρίσκονται στα τελευταία στάδια ανάπτυξης τους ως ζιζανιοκτόνα. Τα ζιζανιοκτόνα αυτά ψεκάζονται στο έδαφος (προφυτρωτικά) ή /και στο φύλλωμα για την αντιμετώπιση ετήσιων και πολυετών ζιζανίων σε διάφορες καλλιέργειες. Απορροφώνται
9 από τις ρίζες και τα φύλλα και μετακινούνται στους μεριστωματικούς ιστούς διαμέσου του συμπλάστη και του αποπλάστη (Ελευθεροχωρινός, 2008). Τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής είναι δραστικά σε δόσεις 10-100 φόρες μικρότερες από εκείνες των ήδη χρησιμοποιούμενων ζιζανιοκτόνων. Η εκλεκτικότητα των ζιζανιοκτόνων αυτών οφείλεται στην ικανότητα των ανθεκτικών φυτών να τα μεταβολίζουν σε μη τοξικές ουσίες ή στο να περιέχουν το ένζυμο ALS με μειωμένη ευαισθησία στα ζιζανιοκτόνα αυτά. Ο μεταβολισμός των ζιζανιοκτόνων αυτών εντός των ανθεκτικών φυτών γίνεται διαμέσου της υδροξυλίωσής τους [η αντίδραση καταλύεται από το ένζυμο μονοοξυγονάση (CytP450)] και στην συνέχεια σχηματίζεται σύμπλοκο με τη γλυκόζη [η αντίδραση καταλύεται από το ένζυμο γλυκοζυλοτρανσφεράση]. Τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της μοσχοκύπερης στην καλλιέργεια του ρυζιού είναι το azimsulfuron, το bensulfuron, το halosulfuron-methyl και το imazosulfuron. 2.1.3.2 Ιμιδαζολινόνες (Imidazolinones) Τα ζιζανιοκτόνα της οικογένειας αυτής, τα οποία αναπτύχτηκαν μετά το 1970, αποτελούνται από έναν αρωματικό δακτύλιο με την καρβοξυλική ομάδα και από τον ιμιδαζολινικό δακτύλιο (Σχήμα 2). Χρησιμοποιούνται ως φυλλώματος ή εδάφους. Απορροφώνται από τις ρίζες και τα φύλλα των φυτών και μετακινούνται στους μεριστωματικούς ιστούς διαμέσου του συμπλάστη και του αποπλάστη (Ελευθεροχωρινός, 2008). Σχήμα 2. Χημική δομή του Imazamox Τα ανθεκτικά καλλιεργούμενα φυτά δεν εμφανίζουν συμπτώματα τοξικότητας όπως τα ευαίσθητα επειδή έχουν την ικανότητα να μεταβολίζουν ταχύτητα τα ζιζανιοκτόνα αυτά σε μη τοξικές ουσίες ή να απορροφούν μικρότερες ποσότητες ή να περιέχουν ενζυμο ALS με μειωμένη ευαισθησία στα ζιζανιοκτόνα αυτά (Ελευθεροχωρινός, 2008).
10 Οι ποικιλίες ρυζιού που δημιουργήθηκαν με τεχνικές ιστοκαλλιέργειας, είναι ανθεκτικές στα ζιζανιοκτόνα imazamox και imazethapyr επειδή διαθέτουν το γονίδιο που κωδικοποιεί ανθεκτικό ALS ενζυμο. 2.1.3.3 Πυριμιδινυλoβενζοϊκά οξέα (Pyrimidinylbenzoates) O χημικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής είναι ένας πυριμιδινικός δακτύλιος ενωμένος με ένα βενζοϊκό οξύ διαμέσου S ή O (Σχήμα 3.) Σχήμα 3. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου bispyribac-sodium Το bispyribac-sodium, το οποίο ανήκει στην οικογένεια αυτή, χρησιμοποιείται από φυλλώματος για την αντιμετώπιση κυρίως του αγρωστώδους ζιζάνιου μουχρίτσα στην καλλιέργεια του ρυζιού, ενώ το pyrithiobac χρησιμοποιείται από φυλλώματος και εδάφους για την αντιμετώπιση ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων στην καλλιέργεια βαμβακιού (Velentza κ.ά., 2005; Kaloumenos κ.ά., 2005; Ελευθεροχωρινός, 2008). 2.1.3.4 Τριαζολοπυριμιδίνες (Triazopyrimidines) O χημικός τύπος των ζιζανιοκτόνων της οικογένειας αυτής περιλαμβάνει έναν τριαζολοπυριμιδινικό δακτύλιο και έναν φαινυλικό δακτύλιο που συνδέονται μεταξύ τους με μια σουλφαμιδική γέφυρα (Σχήμα 4).
11 Σχήμα 4. Χημική δομή του penoxsulam Είναι ζιζανιοκτόνα εδάφους και φυλλώματος, αποτελεσματικά εναντίον των ετήσιων πλατύφυλλων ζιζανίων, χωρίς όμως να αποκλείονται από το φάσμα δράσης τους και ορισμένα ετήσια αγρωστώδη ζιζάνια (penoxsulam) ή /και ορισμένα είδη ζιζανίων που ανήκουν στα κυπεροειδή (penoxsulam, diclosulam). Απορροφώνται από τις ρίζες των ζιζανίων και κινούνται διαμέσου του αποπλάστη και συμπλάστη. Τα ζιζανιοκτόνα αυτά είναι δραστικά σε πολύ μικρότερες δόσεις από ό,τι τα περισσότερα από τα ήδη χρησιμοποιούμενα ζιζανιοκτόνα. Η εκλεκτικότητα αυτών των ζιζανιοκτόνων οφείλεται στο μεταβολισμό τους από τα καλλιεργούμενα φυτά σε ουσίες μη τοξικές (Ελευθεροχωρινός, 2008). 2.1.3.5 Σουλφονυλαμινοκαρβονυλοτριαζολινόνες (Sulfonylaminocarbonyltriazolinones) H οικογένεια αυτή περιλαμβάνει τα δύο ζιζανιοκτόνα φυλλώματος το flucarbazone και το prοpaxycarbazone (Σχήμα 5). Σχημα 5. Χημική δομή του ζιζανιοκτόνου flucarbazone
12 Είναι αποτελεσματικά εναντίον των ετήσιων αγρωστωδών ζιζανίων, χωρίς όμως να αποκλείονται από το φάσμα δράσης τους και ορισμένα ετήσια πλατύφυλλα ζιζάνια. Απορροφούνται εύκολα από την ρίζα και τα φύλλα και μετακινούνται εντός των φυτών διαμέσου του συμπλάστη και του αποπλάστη (Ελευθεροχωρινός, 2008). 2.1.4 Εξέλιξη ανθεκτικότητας ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα Η πρώτη καταγραφή βιοτύπου ζιζανίου με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνο έγινε το 1957 στον Καναδά, όπου ένας βιότυπος του ζιζανίου άγριο καρότο (Daucus carota) παρουσίασε μειωμένη ευαισθησία (ανθεκτικότητα) στο μέχρι τότε αποτελεσματικό ζιζανιοκτόνο 2,4-D. Επίσης, το 1964 αναφέρθηκε ότι ένας βιότυπος του ζιζανίου περικοκλάδα (Convolvulus arvensis) ήταν ανθεκτικός στο 2,4-D, ενώ το 1968 έγινε η πρώτη επαρκώς τεκμηριωμένη καταγραφή ενός βιοτύπου του ζιζανίου μαρτιάκος (Senecio vulgaris) στις ΗΠΑ, με ανθεκτικότητα στο μέχρι τότε αποτελεσματικό ζιζανιοκτόνο simazine. Έκτοτε, έχουν καταγραφεί 403 περιπτώσεις βιοτύπων ζιζανίων που ανήκουν σε 218 είδη (89 μονοκοτυλήδονα και 129 δικοτυλήδονα) με ανθεκτικότητα σε 21 ομάδες ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό τρόπο δράσης. Οι περισσότερες περιπτώσεις ανθεκτικότητας (132 είδη ζιζανίων) αφορούν τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου οξικογαλακτική συνθάση (ALS), με κύριο εκπρόσωπο τα ζιζανιοκτόνα που ανήκουν στην οικογένεια των σουλφονυλουριών. Ορισμένα ετήσια ζιζάνια είναι ήδη ανθεκτικά σε αυτά τα ζιζανιοκτόνα με αποτέλεσμα μίγματα σουλφονυλουριών με άλλα ζιζανιοκτόνα να χρησιμοποιούνται ευρέως σε ορυζώνες για την αντιμετώπιση πλατύφυλλων και αγρωστωδών ζιζανίων. Η επαναλαμβανόμενη χρήση διαφόρων ζιζανιοκτόνων και κυρίως των σουλφονυλουριών (azimsulfuron, bensulfuron, halosulfuron-methyl και imazosulfuron) είχε ως συνέπεια την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε αρκετά ζιζάνια της καλλιέργειας του ρυζιού (Kuk κ.ά., 2003). Τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν την ροη ηλεκτρόνιων στο φωτοσύστημα II περιλαμβάνουν 71 ανθεκτικά είδη, ενώ ακολουθούν τα ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ACCase με 43 περιπτώσεις. Τα ζιζανιοκτόνα με δράση αυξίνης έχουν 30 περιπτώσεις, οι αναστολείς του φωτοσυστήματος I 28 ανθεκτικά είδη, ενώ τα παράγωγα ουρίας, οι γλυκίνες και οι δινιτροανιλίνες έχουν 23, 24 και 11 καταγεγραμμένες περιπτώσεις, αντίστοιχα (Σχήμα 6) (Heap, 2013).
13 Σχήμα 6. Διαγραμματική απεικόνιση της πορείας ανάπτυξης (1950-2013) ανθεκτικών ειδών ζιζανίων σε διάφορες ομάδες ζιζανιοκτόνων (Heap, 2013). Η ανάπτυξη ανθεκτικών ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα διευκολύνεται από την επαναλαμβανόμενη χρήση ζιζανιοκτόνων με ίδιο μηχανισμό δράσης, τη μη εναλλαγή ζιζανιοκτόνων με διαφορετικό τρόπο δράσης, την μεγάλη δράση των ζιζανιοκτόνων, τη μεγάλη ευαισθησία των πληθυσμών ενός ζιζανίου στη συνιστώμενη δόση και την μεγάλη υπολειμματική διάρκεια (Corbett και Tardif, 2006). Σχετικώς με την επαναλαμβανόμενη χρήση του ίδιου ζιζανιοκτόνου, αυτή έχει ως συνέπεια την εξάλειψη των ευαίσθητων ατόμων από τον πληθυσμό με τελικό αποτέλεσμα την επικράτηση των ανθεκτικών ατόμων στον αγρό. 2.1.5 Μηχανισμοί και παράγοντες που επηρεάζουν την εμφάνιση ανθεκτικότητας των ζιζανίων στα ζιζανιοκτόνα Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων σε ένα ζιζανιοκτόνο μπορεί να οφείλεται είτε σε τροποποίηση του στόχου-θέσης δράσης του (target site-based resistance) ή σε μη τροποποίηση του στόχου δράσης του (non target site-based resistance). Ειδικότερα, η ανθεκτικότητα των ζιζανίων της πρώτης περίπτωσης οφείλεται σε τροποποίηση του στόχου-θέσης δράσης του ζιζανιοκτόνου ή στην υπερπαραγωγή του ενζύμου που αποτελεί στόχο-θέση δράσης του ζιζανιοκτόνου. Η ανθεκτικότητα των ζιζανίων της δεύτερης
14 περίπτωσης, οφείλεται σε μεταβολισμό του ζιζανιοκτόνου μέσω υδροξυλίωσης που καταλύεται με τη δράση της μονοοξυγονάσης (CytP450) (Preston και Mallory-Smith, 2001). Ο μηχανισμός αυτός μπορεί να οδηγήσει σε ανθεκτικότητα μέτριας έντασης ( 10φορες) (Hall κ.ά., 1994). Επίσης, η ανθεκτικότητα των ζιζανίων μπορεί να οφείλεται και σε φυσιολογικούς μηχανισμούς όπως για παράδειγμα 1) στη μείωση του ρυθμού απορρόφησης του ζιζανιοκτόνου, 2) στη μείωση του ρυθμού μετακίνησης και 3) στην τροποποίηση της ενδοκυτταρικής κατανομής (μεταφορά εντός του χυμοτοπίου ή απέκκριση στο κυτταρικό τοίχωμα) (Ελευθεροχωρινός, 2008). Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την ανθεκτικότητα των ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα είναι: Συχνότητα εμφάνισης του γονιδίου ανθεκτικότητας. Η ανάπτυξη/δημιουργία ανθεκτικού βιότυπου ζιζανίου προϋποθέτει πίεση επιλογής, ένταση επιλογής και κυρίως γενετική παραλλακτικότητα. Το als γονίδιο χαρακτηρίζεται από πληθώρα μεταλλάξεων και κατά συνέπεια από μεγάλη αρχική συχνότητα εμφάνισης αλληλομόρφων που κωδικοποιούν ανθεκτικό ALS ένζυμο (Jasieniuk κ.ά., 1996; Tranel και Wright, 2002; Καλούμενος, 2009). Θα πρέπει να τονισθεί ότι η παραλλακτικότητα ως προς το als γονίδιο δεν είναι ίδια σε όλα τα είδη των ζιζανίων, γεγονός που σημαίνει ότι η γενετική παραλλακτικότητα ως προς το als γονίδιο δεν είναι η μοναδική αιτία ύπαρξης ανθεκτικών βιοτύπων ζιζανίων (Tranel και Wright, 2002). Βαθμός κυριαρχίας του γονιδίου ανθεκτικότητας. Η εμφάνιση ανθεκτικότητας ευνοείται όταν το αλληλόμορφο γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την ανθεκτικότητα είναι κυρίαρχο (ΑΑ) σε σχέση με το ευαίσθητο (αα) του αρχικού πληθυσμού. Αυτό συμβαίνει επειδή ακόμη και ο ετερόζυγος γονότυπος (Aa) ως προς το γονίδιο ανθεκτικότητας μπορεί να οδηγήσει σε ανθεκτικό φαινότυπο και εξαιτίας της πίεση επιλογής που ασκείται από το ζιζανιοκτόνο που «σκοτώνει» τους ΑΑ και Αα φαινότυπους αλλά δεν επηρεάζει τους αα που επικρατούν (Christoffers, 1999; Foes κ.ά., 1999; Jasieniuk κ.ά., 1996). Η βιβλιογραφία αναφέρει ότι τα ανθεκτικά ALS αλληλόμορφα είναι κυρίαρχα των ευαίσθητων έστω και με κυμαινόμενο βαθμό κυριαρχίας μεταξύ των διαφόρων ειδών ζιζανίου (Tranel και Wright, 2002; Καλούμενος, 2009). Τρόπος κληρονόμησης του γονιδίου ανθεκτικότητας. Το ALS ενζυμο, αν και δρα εντός των χλωροπλαστών, κωδικοποιείται στον πυρήνα από το als γονίδιο. Αυτό σημαίνει ότι τα αλληλόμορφα γονίδια της ανθεκτικότητας μεταφέρονται μέσω της γύρης και των σπόρων
15 με αποτέλεσμα να αυξάνεται η συχνότητά τους τους εντός του αγρού (Jasieniuk κ.ά., 1996; Tranel και Wright, 2002). Αντίθετα, στην περίπτωση κληρονόμησης της ανθεκτικότητας μέσω DNA των χλωροπλαστών (μητρική κληρονόμηση), όπως στην περίπτωση των τριαζινών, αυτή αναπτύσσεται με βραδύτερο ρυθμό εξαιτίας της αδυναμίας να μεταφερθεί με τη γύρη σε φυτά ευαίσθητων βιοτύπων παρά μόνο με σπόρο (Souza-Machado κ.ά., 1978; Ελευθεροχωρινός, 2008). Προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών. Η επίδραση του χαρακτηριστικού της ανθεκτικότητας στην προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών φυτών επηρεάζει σημαντικά την αρχική συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών ατόμων στον πληθυσμό απουσία της πίεσης επιλογής εξαιτίας ενός ζιζανιοκτόνου. Συγκεκριμένα, όταν το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας μειώνει την προσαρμοστικότητα των φυτών κατά 25%, τα ανθεκτικά άτομα εμφανίζονται με συχνότητα 100 φορές μικρότερη μεταξύ των ευαίσθητων σε σύγκριση με την περίπτωση που το χαρακτηριστικό της ανθεκτικότητας δεν επηρεάζει την προσαρμοστικότητα (Jasieniuk κ.ά., 1996; Christoffers, 1999). Αξίζει να σημειωθεί ότι η τροποποίηση του ALS ενζύμου δεν επηρεάζει σημαντικά την προσαρμοστικότητα των ανθεκτικών ατόμων (fitness cost) των ζιζανίων επειδή η τροποποίηση δεν επηρεάζει το ενεργό κέντρο και ως εκ τούτου την απρόσκοπτη καταλυτική δράση του ενζύμου (Tranel και Wright, 2002). 2.1.6 Εμφάνιση ανθεκτικών ζιζανίων στην Ελλάδα Τα μέχρι σήμερα δεδομένα δείχνουν ότι στην Ελλάδα έχουν εμφανίσει ανθεκτικότητα δέκα είδη ζιζανίων σε ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν (Heap 2013) 1) τη ροή ηλεκτρονίων στο φωτοσύστημα II, 2) τη δράση του ενζύμου ACCase, 3) τη δράση του ενζύμου ALS, και 4) τη δράση του ενζύμου EPSPS (Ελευθεροχωρινός, 2014 υπό έκδοση). Αναλυτικότερα, η μουχρίτσα (Echinochloa crus-galli) εμφάνισε ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο propanil (Giannopolitis και Vassiliou, 1989; Vasilakoglou κ.ά., 2000), το τραχύ βλήτο (Amaranthus retroflexus) και η λουβουδιά (Chenopodium album) ανθεκτικότητα στο metribuzin (Eleftherohorinos κ.ά., 2000), η αγριοτομάτα (Solanum nigrum) ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο prometryn (Ελευθεροχωρινός και Παπαμιχαήλ, 2002), η λεπτή ήρα (Lolium rigidum) πολλαπλή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron, clodinafop, diclofop και tralkoxydim (Kotoula-Syka κ.ά., 2000; Kaloumenos κ.ά., 2012), η κοινή παπαρούνα (Papaver rhoeas) διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα
16 ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, tribenuron, triasulfuron, mesosulfuron + iodosulfuron, florasulam, pyrithiobac και imazamox (Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2008; Kaloumenos κ.ά., 2009; Kaloumenos κ.ά., 2011), ο βέλιουρας (Sorghum halepense) διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα quizalofop και propaquizafop (Kaloumenos και Eleftherohorinos, 2009), η αγριοβρώμη (Avena sterilis) διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα diclofop, clodinafop, fenoxaprop, tralkoxydim και pinoxaden (Papapanagiotou κ.ά., 2012; Travlos κ.ά., 2012), η μουχρίτσα (Echinochloa oryzicola) διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα penoxsulam, bispyribac, imazamox, foramsulfuron, nicosulfuron και rimsulfuron (Kaloumenos κ.ά., 2013a), το κόκκινο ρύζι (Oryza sativa) διασταυρωτή ανθεκτικότητα στα ζιζανιοκτόνα imazamox και imazethapyr (Kaloumenos κ.ά., 2013b), και η κόνυζα (Conyza spp.) ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο glyphosate (Nol κ.ά., 2012; Travlos και Chachalis, 2010). 2.1.7 Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός διεξαγωγής των επόμενων πειραμάτων ήταν η διερεύνηση της πιθανότητας ύπαρξης ανθεκτικότητας σε δέκα βιοτύπους του ζιζανίου μοσχοκύπερη (Cyperus difformis) στο ζιζανιοκτόνο azimsulfuron, καθώς επίσης και η πιθανή ύπαρξη σταυρανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα που αναστέλλουν τη δράση του ενζύμου ALS. 2.2 Υλικά και μέθοδοι 2.2.1 Συλλογή φυτικού υλικού Τον Μάιο του 2009 πραγματοποιήθηκαν επιτόπιες έρευνες σε ορυζώνες του Νομού Θεσσαλονίκης, όπου διαπιστώθηκαν παράπονα για μειωμένη αντιμετώπιση της μοσχοκύπερης (Cyperus difformis) μετά από χρήση του ζιζανιοκτόνου azimsulfuron. Ο σκοπός της έρευνας αυτής ήταν ο εντοπισμός και η επισήμανση των ορυζώνων όπου διαπιστώθηκε μη ικανοποιητική αντιμετώπιση του ζιζανίου από το ζιζανιοκτόνο και επιπροσθέτως κατανομή των επιβιωσάντων φυτών που δικαιολογούσε την πιθανή ύπαρξη ανθεκτικότητας. Από την επιτόπια έρευνα προέκυψαν δέκα ορυζώνες όπου υπήρχαν σοβαρές υπόνοιες για πιθανή εμφάνιση ανθεκτικών βιοτύπων του ζιζανίου. Πριν το τέλος της καλλιεργητικής περιόδου, συλλέχθηκε σπόρος από τα φυτά των προαναφερθέντων δέκα ορυζώνων οι οποίοι χαρακτηρίστηκαν ως «δυνητικώς ανθεκτικοί βιότυποι» (Πίνακας 2). Ως ευαίσθητος βιότυπος-μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε
17 πιστοποιημένος σπόρος του ζιζανίου μοσχοκύπερη από το Ηνωμένο Βασίλειο της εταιρείας Herbiseed 1 (Β11). Οι συγκομισθέντες σπόροι αρχικά τοποθετήθηκαν σε πλαστικές σακούλες για την μεταφορά τους στο Εργαστήριο Γεωργίας και κατόπιν τοποθετήθηκαν σε γυάλινα βάζα και αποθηκεύτηκαν στους 3-5 0 C έως την χρήση τους σε πειραματικές εργασίες. Πίνακας 2. Προέλευση και περιοχή δειγματοληψίας των βιοτύπων μοσχοκύπερης που αξιολογήθηκαν ως προς την ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο azimsulfuron. Προέλευση και περιοχή δειγματοληψίας Ν. Θεσσαλονίκης Χαλάστρα Κύμινα Ηνωμένο Βασίλειο Β1 Β4 Β11 Β2 Β3 Β7 Β10 Β5 Β6 Β8 Β9 2.2.2 Πειράματα φυτοδοχείων Τα πειράματα μελέτης της ανθεκτικότητας, της σταυρανθεκτικότητας, της πολλαπλής ανθεκτικότητας και της έντασης ανθεκτικότητας πραγματοποιήθηκαν σε φυτοδοχεία διαστάσεων 10 x 10 x 9 cm, τα οποία περιείχαν μίγμα τύρφης 2 και άμμου σε αναλογία 1:1 (v/v). Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκαν 100-200 σπόροι μοσχοκύπερης, στην επιφάνεια του εδαφικού μίγματος, και στη συνέχεια καλύφθηκαν με το ίδιο εδαφικό μίγμα (0,5 cm). Ακολούθως, τα φυτοδοχεία μεταφέρθηκαν στο θερμοκήπιο του Εργαστηρίου Γεωργίας στο Αγρόκτημα του Α.Π.Θ. (θερμοκρασία 18-28 ο C). Στο στάδιο των τριών φύλλων έγινε αραίωμα ώστε να μείνουν 8 ομοιόμορφα φυτά σε κάθε φυτοδοχείο. Κάθε εβδομάδα γινόταν εφαρμογή διαφυλλικής λίπανσης 3 (δόση 5 kg στρ -1 ) για την κάλυψη των αναγκών των φυτών σε όλα τα θρεπτικά στοιχεία. Για την κάλυψη των αναγκών των φυτών σε νερό εγκαταστάθηκε σύστημα αυτόματης άρδευσης με μικροψεκαστήρες τύπου υδρονέφωσης. Όλα τα φυτοδοχεία, καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος, διατηρήθηκαν καθαρά από άλλα ζιζάνια. 1 Herbiseed, New Farm Mire Lane West End Twford Berkshire RG 100NJ 2 Klasmann-Deilmann GmbH, 49744,GB 3 Nutrileaf 20-20-20 με ιχνοστοιχεία, Elliott Chemicals, New Zeland
18 Οι επεμβάσεις με τα ζιζανιοκτόνα έγιναν μεταφυτρωτικά, όταν τα σπορόφυτα ήταν στο στάδιο των 3-4 φύλλων (4-12 cm). Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε επιστήθιος ψεκαστήρας ακριβείας AZO 4, ο οποίος έφερε ιστό με έξι ακροφύσια τύπου ριπιδίου 8002 5 και ήταν πλάτους 2,4 m, ρυθμισμένος ώστε να παρέχει όγκο ψεκαστικού 30 L στρ 1 με πίεση 280 kpa. Το πειραματικό σχέδιο ήταν το πλήρως τυχαιοποιημένο (Complete Random Design, CRD). Για την κάθε επέμβαση υπήρχαν τρεις επαναλήψεις (φυτοδοχεία) για τα πειράματα ανθεκτικότητας, ενώ για τα πειράματα σταυρανθεκτικότητας και έντασης ανθεκτικότητας, οι επαναλήψεις ήταν τέσσερις ανά επέμβαση. 2.2.3 Πείραμα ανθεκτικότητας Οι δέκα δυνητικώς ανθεκτικοί βιότυποι αξιολογήθηκαν ταυτόχρονα σε ένα πείραμα ελέγχου ανθεκτικότητας που πραγματοποιήθηκε κατά την χρονική περίοδο 2010-2011. Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιήθηκαν στo πείραμα αυτό ήταν το azimsulfuron 6, το bentazone 7 και το glyphosate 8. Όλες οι επεμβάσεις του ζιζανιοκτόνου azimsulfuron έγιναν με ταυτόχρονη προσθήκη της μη ιονιζόμενης επιφανειοδραστικής ουσίας Extravon 9 (0,1% v/v) στο ψεκαστικό διάλυμα. Οι επεμβάσεις του πρώτου πειράματος παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Επεμβάσεις του πειράματος αξιολόγησης 10 βιοτύπων στα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron, bentazone και glyphosate. Επεμβάσεις Επιφανειοδραστικό Δόση εφαρμογής (g δ.ο./στρ) Extravon (0,1% v/v ) 30 ml/30 L στρ -1 2 Συνιστώμενη Azimsulfuron 30 ml/30 L στρ -1 4 Τετραπλάσια 30 ml/30 L στρ -1 16 Οκταπλάσια Bentazone - 144 Συνιστώμενη Glyphosate - 150 Συνιστώμενη Μάρτυρας - - - 4 AZO-SPRAYERS, P.O. Box 350-6710 BJ EDE, The Netherlands. 5 Teejet Spray System Co, P.O. Box 7900 Wheaton, IL 60188. 6 Gulliver 50 WG, DuPont Hellas, 152 32 Χαλάνδρι, Αττική. 7 Basagran 48 SL, Basf Hellas, 151 25 Μαρούσι, Αττική. 8 Roundup 36 SL, Monsanto, Ευθυμιάδης ΒΙ.ΠΕ.Θ, 570 22 Θεσσαλονίκη. 9 Extravon 25 EC Nonionic surfactant NIS, Ethoxylated octylphenol, Syngenta Hellas, 153 44 Λεωφόρος Ανθούσας, Αττική.
19 Τα ζιζανιοκτόνα bentazone και glyphosate χρησιμοποιήθηκαν ως χημικοί μάρτυρες (bentazone εναλλακτικό-προτεινόμενο ζιζανιοκτόνο αντιμετώπισης της μοσχοκύπερης στην καλλιέργεια του ρυζιού, ενώ το glyphosate μη εκλεκτικό-αποτελεσματικό). Η πρώτη αξιολόγηση των επεμβάσεων έγινε μακροσκοπικά στις 3 εβδομάδες από την εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων. Χρησιμοποιήθηκε κλίμακα από 0 έως 100, όπου με 0 τα φυτά με κανονική ανάπτυξη και 100 η πλήρης νέκρωση των φυτών. Επιπλέον, στις 4 εβδομάδες από την εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων, μετρήθηκε ο αριθμός επιβιωσάντων φυτών σε κάθε φυτοδοχείο και το χλωρό βάρος τους, το οποίο εκφράστηκε ως ποσοστό % του αψέκαστου μάρτυρα. 2.2.4 Πειράματα σταυρανθεκτικότητας Οι δέκα βιότυποι του πειράματος ανθεκτικότητας και ο ευαίσθητος βιότυπος (UK) χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα ελέγχου σταυρανθεκτικότητας. Πραγματοποιήθηκαν τρία πειράματα από Μάιο έως Ιούλιο του 2011, τα οποία εγκαταστάθηκαν σε υπαίθριο χώρο του αγροκτήματος καλυμμένο με δίχτυ. Όπως και στο προαναφερθέν πείραμα, εγκαταστάθηκε σύστημα αυτόματης άρδευσης με υδρονέφωση, ενώ η κάλυψη των αναγκών των φυτών σε θρεπτικά στοιχεία έγινε με εφαρμογή πλήρους διαφυλλικού λιπάσματος. Τα ζιζανιοκτόνα που χρησιμοποιήθηκαν στο πρώτο πείραμα σταυρανθεκτικότητας ήταν τα azimsulfuron, halosulfuron-methyl 10, bentazone και glyphosate (Πίνακας 4). Πίνακας 4. Επεμβάσεις του πρώτου πειράματος αξιολόγησης 11 βιοτύπων στα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron, halosulfuron-methyl, bentazone και glyphosate. Επεμβάσεις Επιφανειοδραστικό Extravon (0,1%) Δόση εφαρμογής (g δ.ο./στρ) Azimsulfuron 30 ml/στρ 2 Συνιστώμενη 30 ml/στρ 8 Τετραπλάσια 30 ml/στρ 16 Οκταπλάσια Halosulfuronmethyl - 2 Συνιστώμενη - 8 Τετραπλάσια 16 Οκταπλάσια 10 Permit 75 WG, ΑΛΦΑ Γεωργικά Εφόδια, 152 32 Χαλάνδρι, Αττική
20 Bentazone - 144 Συνιστώμενη Glyphosate - 150 Συνιστώμενη Μάρτυρας - - - Το δεύτερο πείραμα σταυρανθεκτικότητας περιελάμβανε τα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron, halosulfuron-methyl και imazosulfuron 11. Για τα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron, halosulfuron-methyl χρησιμοποιήθηκε η επιφανειοδραστική ουσία Dash 12. Οι δόσεις εφαρμογής των ζιζανιοκτόνων φαίνονται στον Πίνακα 5. Πίνακας 5. Επεμβάσεις του δευτέρου πειράματος αξιολόγησης 11 βιοτύπων στα ζιζανιοκτόνα azimsulfuron, halosulfuron-methyl και imazosulfuron. Ζιζανιοκτόνο Επιφανειοδραστικό Δόση Εφαρμογής (g δ.ο./στρ) Dash (0,33%) 100 ml/30 L στρ -1 2 Συνιστώμενη Azimsulfuron 100 ml/30 L στρ -1 16 Οκταπλάσια 100 ml/30 L στρ -1 2 Συνιστώμενη Halosulfuron-methyl 100 ml/30 L στρ -1 16 Οκταπλάσια - 0,8 Συνιστώμενη Imazosulfuron - 6,4 Οκταπλάσια Μάρτυρας - - Στο τελευταίο πείραμα ελέγχου σταυρανθεκτικότητας αξιολογήθηκαν τα ζιζανιοκτόνα bispyribac-sodium 13, penoxsulam 14, imazamox 15 και azimsulfuron. Για την εφαρμογή του imazamox χρησιμοποιήθηκε η επιφανειοδραστική ουσία Dash (0,33% v/v) και για το bispyribac-sodium χρησιμοποιήθηκε η επιφανειοδραστική ουσία Biopower 16 (0,1% v/v). Οι δόσεις εφαρμογής των ζιζανιοκτόνων φαίνονται στον Πίνακα 6. 11 Kocis 10,7% SC, Italy 12 Dash HC, Basf Hellas, Λεωφόρος Μεσογείων, 153 43, Αττική. 13 Adora 400 SL, Bayer Hellas, 151 25 Μαρούσι, Αττική. 14Viper 2 OD, Ευθυμιάδης, ΒΙ.ΠΕ.Θ, 570 22 Θεσσαλονίκη. 15 Pulsar 4 SL, BASF Hellas, 570 22 Σίνδος, Θεσσαλονίκη. 16 Biopower SL. Alkylethersulfate sodium salt, 26.92WG, Bayer Hellas, 151 25, Μαρούσι, Αττική.
21 Πίνακας 6. Επεμβάσεις του τρίτου πειράματος αξιολόγησης 11 βιοτύπων στα ζιζανιοκτόνα bispyribac-sodium, penoxsulam, imazamox και azimsulfuron. Ζιζανιοκτόνο Επιφανειοδραστικό Δόση Εφαρμογής (g δ.ο./στρ) Bispyribac-sodium Biopower (0,1% v/v) 3 Συνιστώμενη Biopower (0,1% v/v) 6 Διπλάσια Penoxsulam - 4 Συνιστώμενη - 8 Διπλάσια Imazamox Dash (0,33% v/v) 8 Συνιστώμενη Dash (0,33% v/v) 16 Διπλάσια Azimsulfuron Dash (0,33% v/v) 2 Συνιστώμενη Μάρτυρας - - Η πρώτη αξιολόγηση των επεμβάσεων, και στα δύο πειράματα, έγινε μακροσκοπικά στις 3 εβδομάδες από την εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων. Χρησιμοποιήθηκε κλίμακα από 0 έως 100, όπου με 0 τα φυτά με κανονική ανάπτυξη και 100 η πλήρης νέκρωση των φυτών. Επιπλέον, στις 4 εβδομάδες από την εφαρμογή των ζιζανιοκτόνων, μετρήθηκε ο αριθμός επιβιωσάντων φυτών σε κάθε φυτοδοχείο και το χλωρό βάρος τους, το οποίο εκφράστηκε ως ποσοστό % του αψέκαστου μάρτυρα. 2.2.5 Πείραμα προσδιορισμού της έντασης ανθεκτικότητας Οι δέκα βιότυποι μοσχοκύπερης N. Θεσσαλονίκης και ο ευαίσθητος βιότυπος (UK) αξιολογήθηκαν σε πείραμα προσδιορισμού της έντασης ανθεκτικότητας. Ειδικότερα, ο σκοπός του πειράματος αυτού ήταν να προσδιοριστεί η δόση των ζιζανιοκτόνων azimsulfuron και halosulfuron-methyl που απαιτείται για να μειωθεί κατά 50% η ανάπτυξη της μοσχοκύπερης των διαφόρων βιοτύπων (GR50) και ακολούθως να υπολογιστεί η ένταση ανθεκτικότητας R/S (όπου R=GR50 του ανθεκτικού βιοτύπου και S=GR50 του ευαίσθητου βιοτύπου). Το πείραμα πραγματοποιήθηκε δύο φορές τον Ιούλιο-Αύγουστο του 2011 και ως χημικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το ζιζανιοκτόνο bentazone. Το πείραμα προσδιορισμού της έντασης ανθεκτικότητας πραγματοποιήθηκε, όπως και το προηγούμενο, σε υπαίθριο χώρο καλυμμένο από δίχτυ. Εγκαταστάθηκε σύστημα