علوم و فناوري زيستي مدرس دورة 1 شمارة 1 پاييز 1389 جداسازي و كلونينگ ژن فيوژن (F) از ويروس سرخك سوش واكسينال (AIK-C) * - 1 كارشناسي ارشد بيولوژي سلولي مولكولي دانشگاه امام حسين (ع) تهران - 2 دانشيار دانشگاه امام حسين (ع) و دانشگاه علوم پزشكي بقيه ا... (عج) مركزتحقيقات بيوتكنولوژي كاربردي و محيط زيست تهران چكيده - - 3 استاديار بخش بيوتكنولوژي موسسه تحقيقات واكسن و سرم سازي رازي كرج *تهران صندوق پستي 19395-5739 Saadati_m@yahoo.com (دريافت مقاله: 89/4/31 پذيرش مقاله: 89/8/24) ويروس سرخك عضو خانواده پاراميكسو ويروسها و از جنس موربيلي ويروسها است كه داراي ژنوم RNA با قطبيت منفي است. در اين تحقيق ابتدا از محيط حاوي ويروسهاي سرخك سوش واكسينال AIK-C كه روي سلولهايMRC-5 رشد كرده RNA استخراج شد از RNA استخراج شده فورا براي ساخت cdna تكرشتهاي با استفاده از واكنش نسخهبرداري معكوس استفاده شد. از cdna تكرشتهاي بهعنوان رشته الگو براي تكثير ژن F با پرايمرهاي اختصاصي در واكنش PCR استفاده شد. محصول PCR با طول 1662 bp درون وكتورهاي بياني pet-28a(+) و pet-22b(+) كلون شد. براي تا ييد كلونينگ پلاسميدهاي نوتركيب بهدرون سلولهاي مستعد.E coli DH5α ترانسفورم شد. كلونيهاي بهدست آمده با استفاده از PCR مستقيم غربالگري شدند. سپس پلاسميدهاي نوتركيب بهروش ليز قليايي استخراج شد. هضم آنزيمي پلاسميدهاي نوتركيب با استفاده از آنزيمهاي با اثر محدود NdeI و HindIII انجام شد و قطعه DNA بهطول 1662 bp جداسازي شد. توالي پلاسميد نوتركيب pet-28af با شركت MWG آلمان تعيين شد. مقايسه اين توالي با توالي ژن F ويروس سرخك از بانك ژن (سوش واكسينال ادمونستون (AIK-C) با (Accession number: AF266286 حاكي از همولوژي بالا بين اين دو ژن است. نتايج اين تحقيق نشان داد ژن F بسيار حفاظت شده و پايدار است. بنابراين مطالعه ژن F براي تهيه واكسن نوتركيب اهميت دارد. كليدواژگان: ويروس سرخك ژن F وكتورهاي بياني pet-28a(+) و pet-22b(+) 35 كلونينگ.
جداسازي و كلونينگ ژن فيوژن (F) از ويروس... مليحه اسماعيلزاده خراساني و همكاران 1- مقدمه ويروس سرخك عضو خانواده پاراميكسو ويروسها و از جنس موربيلي ويروسها است و پوشش غشايي آن داراي دو گليكو پروتي ين H وF ميباشد. پروتي ين H در جذب ويروس به گيرنده سلولي و پروتي ين F ويروس سرخك در فرايند فيوژن و ورود ويروس به سلول نقش دارد و عامل كليدي در ايجاد عفونت و بيماريزايي اين ويروس است. اين پروتي ينها علاوه بر نقش بيولوژيك مهمترين آنتيژنهاي ويروس سرخك هستند [1 2]. سرخك عموما يك بيماري مربوط به دوران كودكي است كه از طريق دستگاه تنفسي گسترده ميشود. بيماري داراي يك دوره كمون 10 تا 14 روزه است و سپس تب سرفه زكام و التهاب چشم به مدت 2 تا 3 روز طول ميكشد و به دنبال آن راشه يا ماكولوپاپولار ظاهر ميشود [3]. ارگانه يا لنفاوي و بافتهايي مثل تيموس طحال لنفوي يدها آپانديس و لوزهها جايگاه اصلي تكثير ويروس هستند [4]. اين ويروس از طرق مختلف آزمايشگاهي از جمله جداسازي ويروس تشخيص مستقيم ويروس رديا يب RNA ويروسي يا آنتيژنهاي ويروسي در ترشحات مهار هماگلوتيناسيون (HI) ثبوت كمپلمان (CF) و خنثيسازي ويروس شناسايي ميشود [1]. واكسن اين ويروس در حال حاضر به صورت سرخك زنده تخفيف حدت يافته است. مشكل اصلي با اين واكسنهاي تضعيف شده توانايي ضعيف پاسخهاي ايمني در حضور آنتي بادي مادري ميباشد [5]. از اين رو براي حل اين مشكل تلاشهاي زيادي براي تهيهي واكسنهاي نوتركيب با استفاده از آنتيژنهاي H و F انجام شده است. پروتي ين F ويروس سرخك بهعلت نقش مهم ايمونولوژنيك و عملكردي در اين تحقيق مورد بررسي قرار گرفته است. 2- مواد و روشها 1-2- باكتريها و ويروس محيط حاوي ويروس سرخك سوش AIK-C كه در تهيه واكسن استفاده شد از بخش واكسنه يا ويروسي مو سسه سرمسازي رازي تهيه شد. از باكتري.E coli سوش DH5α براي كلونينگ استفاده شد. -2-2 استخراج RNA استخراج RNA از محيط حاوي ويروس سرخك سوش واكسينال AIK-C كه روي سلولهاي ديپلوي يد انساني MRC-5 رشد كرده بودند انجام شد. استخراج RNA با كيت ) (Roche High Pure Viral Nucleic Acid Kit انجام شد. اين روش بر اساس ليز ويروس بهوسيله گوانيدين هيدروكلرايد كه يك ماده دناتوره كننده قوي است انجام شد [6]. RNA استخراج شده فورا براي واكنش نسخهبرداري معكوس و توليد cdna تك- رشتهاي استفاده شد. -3-2 سنتز cdna سنتز cdna ژن F با استفاده از آنزيم AMV Reverse Transcriptase با غلظت (Roche) 25 unit/ l انجام شد. به اين ترتيب كه ابتدا RNA استخراج شده در مرحله قبل براي جلوگيري از ساختار ثانويه بهمدت 3 دقيقه در دماي 65 درجهي سانتيگراد قرار داده شد. سپس نسخهبرداري معكوس (RT) در دماي 42 درجه سانتيگراد 36
علوم و فناوري زيستي مدرس دورة 1 شمارة 1/ پاييز 1389 بهمدت 60 دقيقه با 2 ماكروليتر Random primer 0/8 ماكروليتر آنزيم AMV Reverse Transcriptase 1 ماكروليتر RNase inhibitor 2 ماكروليتر 10 dntp ميلي مولار و 2 ماكروليتر بافر 10x آنزيم AMV انجام شد. سپس آنزيم AMV در دماي 99 درجه سانتيگراد بهمدت 5 دقيقه انكوبه و غيرفعال شد [7]. PCR -4-2 پرايمرهاي M-FFS2 و M-FRS با استفاده از نرمافزار OLIGO طراحي شد. پرايمرها طوري طراحي شدند تا ناحيه ORF ژن F بهطور كامل جداسازي و در وكتورهاي بيا ين كلون شود. براي ايجاد سايت برشي با طراحي مناسب پرايمر جايگاه آنزيم برشي NdeI در ابتداي ژن و جايگاه آنزيم برشي HindIII در انتهاي ژن قرار گرفت. PCR با استفاده از 5 ماكروليتر cdna تكرشتهاي ساخته شده در مرحلهي قبل 2 ماكروليتر 0.1 ( 2.5 mm ) dntp ميكرومولار از هر كدام از پرايمرهاي M-FFS2 و M-FRS و 1 ماكروليتر از آنزيم Pfu DNA polymerase با غلظت 2.5 unit/µl ساخت شركت فرمنتاز در حجم نهايي 25 ماكروليتر انجام شد [8]. برنامه PCR مورد استفاده در تكثير cdna ژن F شامل مرحله دناتوراسيون اوليه در دماي 95 درجه سانتيگراد بهمدت 5 دقيقه براي جلوگيري از اتصالات غيراختصاصي و در ادامه 20 سيكل شامل دناتوراسيون در دماي 95 درجهي سانتيگراد به مدت 1 دقيقه و اتصال پرايمر (annealing) در دماي 58 درجه سانتيگراد بهمدت 1 دقيقه و افزايش طول زنجيره بهمدت 1 دقيقه انجام شد. مرحله نهايي افزايش طول زنجيره (Final extention) DNA دردماي 72 درجه سانتيگراد بهمدت 10 دقيقه انجام شد. محصول PCR روي ژل آگارز %1/5 الكتروفورز و با اتيديوم برمايد رنگآميزي شد. 3- كلونينگ محصول PCR پس از آنكه تخليص محصول PCR بهطور مستقيم با استفاده از كيت Product High Pure PCR (Roche) Purification Kit و انجام پلاسميدهاي pet-22b(+) و(+) pet-28a بروش ليز قليايي در حجم زياد استخراج شد هضم آنزيمي روي پلاسميدهاي نامبرده و محصول PCR (ژنF ) با دو آنزيم با اثر محدود NdeI و HindIII بهطور همزمان انجام شد. به اين ترتيب كه هضم آنزيمي روي 3 ميكروگرم از هر وكتور بهطور جداگانه با 20 واحد آنزيم NdeI با غلظت 10 unit/μl و 10 واحد آنزيم HindIII با غلظت 10 unit/μl ساخت شركت فرمنتاز و در حجم نهايي 30 ماكروليتر در دماي 37 درجه سانتيگراد بهمدت يك شب انجام شد. بههمين ترتيب هضم آنزيمي روي 3 ميكروگرم از محصول PCR (ژنF ) انجام گرديد [9]. اين فرايند باعث ايجاد انتهاي چسبنده در هر دو انتهاي پلاسميدها ميشود كه لازمه انجام كلونينگ است [10]. پس از هضم آنزيمي بهطور كامل وكتورهاي مورد نظر با آلكالين فسفاتاز ساخت شركت Roche دفسفريله شدند. 100 نانوگرم از هر وكتور آمادهسازيشده بهطور جداگانه همراه 0/2 پيكومول از محصول PCR (extention) DNA در دماي 72 درجه سانتيگراد آمادهسازي شده 0/5 ماكروليتر آنزيم T4DNALigase و 37
جداسازي و كلونينگ ژن فيوژن (F) از ويروس... مليحه اسماعيلزاده خراساني و همكاران 3- نتايج پس از استخراج RNA از س وش واكس ينال AIK-C ويروس سرخك روي سلوله يا MRC-5 رشد كرده و در محيط آزاد شد. سپس اقدام به انجام RT-PCR دو مرحلهاي شد پس از انجام ژل الكتروفورز و رنگآميزي با اتيديوم برمايد و مقايسه با ماركر 1 kb bp يك باند در منطقهي بين دو باند (Fermentase) 1500 و 2000 bp ماركر مشاهده شد (شكل 1 باند موجود در ستون 2). اين باند از لحاظ اندازه مشابه با DNA مورد نظر ما (ژن F) و حدود 1662 bp است. شكل 1 محصول RT-PCR با استفاده از پرايمرهاي,M-FFS2 (ژنF ) PCR ستون 2: محصول ستون 1: ماركر 1kb..M-FR پس از هضم آنزيمي روي ژن F و پلاسميدهاي pet- (+)22b و pet-28a(+) با استفاده از هر دو آنزيم مح دودگر NdeI و HindIII بهطور هم زمان ژل الكتروفورز و رنگآميزي با اتيديوم برمايد انجام شد. باندهاي مشاهده شده نشاندهنده اين بود كه هضم آنزيمي بهطور كامل انجام شده است (شكل 2 ستونهاي 3 2 و 4). 2 ماكروليتر بافر لايگيشن (10X) در حجم نهايي 20 ماكروليتر در فرايند لايگيشن استفاده شد[ 11 ]. پلاسميدهاي نوتركيب pet-22bf و pet-28af بهوسيله شوك حرارتي درون سلولهاي مستعد.E coli DH5α ترانسفورم شدند براي تا ييد و بررسي كلونينگ روي كلونيهاي بهدست آمده PCR مستقيم انجام شد. كلونيه يا با PCR مثبت در محيط LB-broth داراي آنتي بيوتيك مناسب كشت داده شدند و پلاسميد بهروش ليز قليايي استخراج شد [12]. با انجام ژل الكتروفورز براساس وزن مولكولي پلاسميدهاي نوتركيب از پلاسميدهاي فاقد ژنF جدا شدند. همچنين هضم آنزيمي روي پلاسميدهاي نوتركيب pet-22bf و pet-28af بهوسيله دو آنزيم NdeI و HindIIIانجام شد كه پس از انجام الكتروفورز روي ژل آگارز قطعه DNA بهطول 1662 bp جدا شد. آناليز پلاسميدهاي نوتركيب كلون شدن ژن F را درون پلاسميدهاي مورد نظر تا ييد كرد. 6-2- تعيين توالي پس از كلون شدن ژن F درون پلاسميدهاي pet-22b(+) و pet-28a(+) منطقهي موردنظر(منطقه واقع بين دو جايگاه HindIII و (Nde I در pet-28af تعيين شد. براي تعي ين ت والي از دو پرايمرT7-promoter و T7-terminator استفاده شد. سپس توالي بهدست آمده با توالي موجود در بانك ژن (سوش واكسينال ادمونستون ( AIK-C )با (Accession number : AF266286 با نرمافزار DNAMAN مقايسه شد. 38
علوم و فناوري زيستي مدرس دورة 1 شمارة 1/ پاييز 1389 پلاسميدهاي نوتركيب بهدليل كلون شدن ژن F درون آنهاست. وجود دو باند در هر ستون به خاطر اين است كه پلاسميد ميتواند به سه حالت سوپركويل حلقوي و خطي وجود داشته باشد كه بر اساس سرعت پلاسميد سوپركويل سريعتر از حالته يا ديگر سپس شكل خطي و بعد حلقوي حركت ميكند. همچنين براي آناليز پلاسميد نوتركيب PCR مستقيم با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي M-FFS2 و M-FRS وآنزيم Taq DNA Polymerase روي چند كلوني از هر پليت (پليت مربوط به كلونيه يا حاوي پلاسميد نوتركي ب pet-22bf و پليت مربوط به كلونيهاي حاوي پلاسميد نوتركي ب (pet-28 af انجام شد. پس از انجام ژل الكتروفورز و رنگآميزي با اتيديوم برمايد و مقايسه با ماركر 1 kb 1500 bp يك باند در منطقه بين دو باند (Fermentase) و 2000 bp ماركر مشاهده شد (شكل 4 باندهاي موجود در ستونهاي 2 تا 5 و 6 تا 11). اين باندها از لحاظ اندازه مشابه با DNA مورد انتظار ما (ژن F) وحدود 1662bp است. همچنين پلاسميدهاي نوتركيب pet-22bf و pet-28af با استفاده از آنزيمهاي محدودگر NdeI و HindIII هضم آنزيمي شدند. سپس با انجام ژل الكتروفورز و رنگآميزي با اتيديوم برمايد با ماركر 1 kb مقايسه شدند. در هر ستون دو باند مشاهده شد (شكل 5 ستون 2 و 5) كه يكي از باندها مربوط به پلاسميد (باند بين 5000 bp و 6000 bp ماركر) و ديگري مربوط به ژن F (باند بين 1500 bp و 2000) bp است و ستون 3 و 4 مربوط به پلاسميدهاي نوتركيب قبل از هضم آنزيمي است. اين نشان ميدهد كه ژن F به درستي درون وكتورها كلون شده كه پس از هضم آنزيمي وكتورهاي نوتركيب بهوسيله دو آنزيم نامبرده از اين وكتورها جدا شده است. شكل 2 نتايج حاصل از هضم آنزيمي ژنF و پلاسميدهاي pet-28a(+) و pet-22b(+) بهوسيله هر دو آنزيم NdeI و F ستون 2: ژن بهطور همزمان. ستون 1: ماركر 1kb HindIII برش داده شده با هر دو آنزيم NdeI و HindIII بهطور همزمان ستون 3: پلاسميد (+) pet-22b برش داده شده با هر دو آنزيم NdeI و HindIII بهطور همزمان. ستون 4 : پلاسميد (+) pet-28a برش داده شده با هر دو آنزيم NdeI و HindIII بهطور همزمان. براي بررسي و تا ييد كلونينگ از برخي كلونيهاي حاصل از ترانسفورماسيون وكتورهاي نوتركيب pet-28af) (pet-22bf, به سلولهاي مستعد.E coli DH5 استفاده شد. پس از استخراج پلاسميد از كلونيه يا بهدست آمده ژل الكتروفورز انجام شد. بعد از رنگآميزي ژل با اتيديوم برمايد و مقايسه با ماركرkb 1 مشاهده شد كه پلاسميدهاي نوتركيب (شكل 3 ستونه يا 1 و 3 ) بالاتر از پلاسميدهاي فاقد ژن (شكل 3 ستونهاي 2 و 4) قرار گرفتهاند كه اين نشاندهنده سنگينتر شدن 39
جداسازي و كلونينگ ژن فيوژن (F) از ويروس... مليحه اسماعيلزاده خراساني و همكاران شكل 5 آناليز پلاسميد نوتركيب با استفاده از هضم آنزيمي. ستون 1 :مارك 1kb ستون 2: pet-28afبعد از هضم آنزيمي با استفاده از دوآنزيم NdeI و HindIII ستون 3:- pet 28aFقبل از هضم آنزيمي ستون 4: pet-22bf قبل از هضم آنزيمي ستون 5- pet-22bf بعد از هضم آنزيمي با استفاده از دوآنزيم NdeI وHindII 6- بحث در اين طرح ابت دا RNA از محيط حاوي وي روس سرخك سوش واكسينال AIK-C كه روي سلولهاي ديپلوي يد انساني MRC-5 رشد كردهبودند استخراج شد. بعد از انجام RT-PCR دو مرحلهاي و انجام ژل الكتروفورز ژن F با موفقيت جداسازي شد. بهترين زمان براي استخراج RNA از سلول در مراحل عفونت سلولها است كه ميزان CPE ايجاد شده در كشت سلولي 10-20 درصد باشد. در اين مراحل تكثير ويروسي mrnaه يا ويروسي ساخته ميشوند و سپس بهسمت توليد ژنوم تغيير پيدا ميكنند. شكل 3 آناليز پلاسميدهاي نوتركيب و مقايسه با پلاسميدهاي pet-22b(+) و pet-28a(+) از لحاظ وزن مولكولي. ستون 1: پلاسميد نوتركيب pet-22bf,ستون 2: پلاسميد pet- (+)22b (كنترل منفي) ستون 3: مارك,1kb ستون 4: پلاسميد pet-28a(+) (كنترل منفي), ستون 5: پلاسميد نوتركيب..pET-28aF شكل 4 آناليز پلاسميد نوتركيب با استفاده ازPCR مستقيم.ستون 1: ماركر 1 k ستونهاي( 2-5 ): مربوط به محصولات PCR مستقيم كلونيهاي حاويbF pet-22 ستونهاي (6-11): مربوط به محصولات PCR مستقيم كلونيهاي حاويpET-28aF. 40
علوم و فناوري زيستي مدرس دورة 1 شمارة 1/ پاييز 1389 بهوجود حلقهاي نسبتا پايدار 9 نوكلي وتيدي در پرايمر -M FFS2 اشاره كرد. براي حل اين مشكل از روش شروع داغ در PCR استفاده شد. سادهترين روش براي جلوگيري براي ساخت cdna از روي RNA استخراج شده از Random hexamer بهعنوان پرايمر استفاده شد كه روشي متداول براي جداسازي قطعات ژنوميك ويروسي است. براي ساخت cdna ميتوان از هر دو آنزيم نسخهبرداري معكوس AMV وM-MuLV استفاده كرد. آنزيم AMV هم براي الگوهاي RNA و هم براي الگوهاي DNA فعاليت پليمرازي 3 5 وابسته به پرايمر دارد. آنزيم M-MuLV كاملا"شبيه آنزيم AMV است و فقط از RNA بهعنوان الگو استفاده ميكند. در اين طرح به علت در دسترس بودن آنزيم AMV از اين آنزيم استفاده شد كه نتيجه خوبي هم حاصل شد [7]. براي انجام PCR روي cdna تكرشتهاي از پرايمرهاي M-FRS و M-FFS2 استفاده شد. اين پرايمرها طوري طراحي شدند كه بتوان ناحيه ORF ژن F را جدا براي كلونينگ در وكتورهاي بيا ين استفاده كرد. در اين پرايمرها براي ايجاد انتهاي چسبنده سايتهاي برشي براي آنزيمهاي محدودگر NdeI و HindIII قرار داده شد. سايت NdeI يا NcoI درتعداد زيادي از وكتورهايpET براي كلونينگ به درون كدون شروع AUG كه در انتهاي 5 توالي كدكننده ژن هدف وجود دارد موجود است. ژنه يا هدف كه سايت NdeI و يا سايتهايي كه Overhang سازگار در ابتداي ORFشان را دارند بهدرون سايت NdeI وكتور كلون ميشوند [19]. ازاينرو پرايمرها طوري طراحي شدند كه باعث ايجاد سايت برشي NdeI در ژن F شوند كه اين سايت در پرايمر M-FFS2 قرار داده شد براي ايجاد سايت برشي HindIII پرايمر M-FRS طوري طراحي شد كه حاوي اين سايت باشد. طراحي پرايمرهاي مناسب در چنين شرايطي با مشكلاتي همراه است. براي مثال ميتوان از اتصالات اوليه غيراختصاصي و بهتر كردن شرايط اتصال صحيح پرايمر استفاده از روش شروع داغ (Hot-Start) است. در حين ساخت DNA آنزيم DNA پلي مراز نوكلي وتيد صحيح را براي افزودن به پرايمر انتخاب ميكند تا طول زنجير يه واتسون- كريك افزايش دهد. DNA را بر اساس قانون جفت شدن پس از ايجاد محصول PCR (ژن F) مراحل لازم براي انجام فرآيند كلونينگ آغاز شد كه اين مراحل شامل آمادهسازي وكتورها و ژن هدف است. به اينمنظور وكتورهاي pet-28a(+) و pet-22b(+) با آنزيمهاي با اثر محدود NdeI و HindIII بهطور همزمان برش داده شدند (هضم آنزيمي). بعد از هضم آنزيمي بهطور كامل براي جلوگيري از Self-Ligation در وكتورهاي خطي شده فرايند دفسفريلاسيون انجام شد. براي آمادهسازي ژن F تخليص مستقيم محصول PCR براي حذف dntp و پرايمرها و ناخالصيها از نمونه محصول PCR انجام شد و پس از آن هضم آنزيمي ژن F با همان شرايط بافري و همان دو آنزيم NdeI و HindIII انجام شد. اين عمل باعث ايجاد انتهاي چسبنده ميشود كه لازمه كلونينگ اين ژن درون وكتورهاي ذكر شده است [9]. پس از آمادهسازي وكتورها و ژنF اين ژن در هر دو وكتورهاي بيا ين pet-22b(+) و pet-28a(+) كلون شد. بهعلت اينكه سيستم pet يك ابزار بيان پروتي ين بسيار قوي است ميتوانيم بيان پروتي ين را با پروموتر T7/T7lac ميزبانه يا plyss يا plyse و اضافه كردن 41
جداسازي و كلونينگ ژن فيوژن (F) از ويروس... مليحه اسماعيلزاده خراساني و همكاران گلوكز به محيط بر اساس خصوصيا يت از پروتي ين هدف كنترل كنيم. بنابراين كلونينگ از اين وكتورهاي بيا ين استفاده شد تا در صورت نياز به بيان اين ژن درتحقيقات بعدي نيازي به انجام ساب كلونينگ نباشد [13 9]. وكتورهاي pet-28a(+) و pet-22b(+) هر دو داراي پروموتر قوي T7lac هستند كه براي كنترل بيان پايه مناسبترند. (پروموتر قوي T7 از فاژ T7 گرفته شده است كه كارايي بالايي در نسخهبرداري دارد). اين پلاسميدها حاوي يك توالي اوپراتور lac در پايين دست پرو موتر T7 و توالي كدكننده براي رپرسور (LacI) lac هستند. T7 RNA براي مهار نس خهب رداري ژن LacI Polymerase با پلي مراز ميزبان روي پروموتور LacUV5 در كروموزوم ميزبان اثر دارد. همچنين در پروموتر T7lac وكتور براي جلوگيري از نسخهبرداري ژن هدف بهوسيلهPolymerase T7 RNA مو ثر است و به اين ترتيب در به حداقل رساندن بيان پايه دخالت ميكند [9]. البته پلاسميدهاي بياني ديگري مثل pqe وpGEXهم وجود دارند كه بهترتيب حاوي پروموتر T5 و پروموتر Tac (تركيبي از پروموترهاي trp و ( la هستند كه در مقايسه با وكتور pet پروموتر ضعيفتري دارند. وكتورهاي pet بهعلت داشتن پروموتر قوي كه دارند براي بيان ژن مناسبترند و از سويهه يا باكتري زيادي ميتوان براي بيان آنها استفاده كرد بههمين دليل باعث گستردهتر شدن زمينه تحقيق و بررسي ميشوند و بهدليل مزيته يا ذكر شده در اين طرح اين وكتورها انتخاب شدهاند[ 9 ]. ساختار قوي سيستم pet توانايي كلون كردن ژنه يا هدف را درشرايط نسخهبرداري بسيار اندك دارد. اين عمل در غياب منبع T7 RNA polymerase انجام ميشود. ازاينرو براي كلونينگ از ميزبانه يا كلونينگ كه reca و enda هستند استفاده شد[ 13 9]. اين ميزبانها توانايي انتقال (ترانسفورماسيون) بالا دارند و قادر به نگهداري پلاسميد و توليد مقادير بالاي پلاسميد هستند زيرا محصول ژن enda آنزيم آندونوكلي از I است و اين آنزيم DNA دو رشتهاي را بهعنوان سوبسترا ميشناسد و باعث هضم آنمي شود بنابراين در اين ميزبانها كه enda هستند اين آنزيم توليد نميشود و باعث پايداري DNA ميشود. بنابراين براي استخراج پلاسميد از اين ميزبانها استفاده ميشود. از جمله اين ميزبانه يا كلونينگ ميتوان به سوشهاي.E coli K12 از JM109 NovaBlue و DH5 اشاره كرد كه ما در اين طرح از DH5 استفاده كرديم [13]. 28aF بعد از تا ييد كلونينگ توالي پلاسميد نوتركيب pet- توسط شركت MWG آلمان تعيين شد. سپس نتايج بهدست آمده توسط نرمافزار DNAMAN با توالي F ويروس سرخك كه از بانك ژن (سوش واكسينال ادمونستون (AIK-C) با (Accession number:af266286 استخراج شده بود مقايسه شد. در نتايج بهدست آمده حاصل از مقايسه مناطق مختلف ژن در تمامي موارد همولوژي بالايي مشاهده شد. اين نتايج نشاندهنده اين است كه عادت دادن سوش واكسينال AIK-C از سلول فيبروبلاست جنين جوجه به سلول MRC-5 هيچگونه تغييري در سطح توالي اسيد نوكلي يك و اسيدآمينه در مورد ژن F ايجاد نكرده است. در يك مطالعه ژنوم كاملF از RNA ويروس سرخك سوش Halle كه روي سلولهاي ميمون رشد كرده بود جداسازي شد. سپس ژنوم كامل F درون پلاسميد pcd-1 كلون شد و پلاسميدهاي نوتركيب به 42
علوم و فناوري زيستي مدرس دورة 1 شمارة 1/ پاييز 1389 سلولهاي.E coli MC1061 ترانسفورم شدند پس از غربالگري كلونيها و تا ييد كلونينگ توالي پلاسميد نوتركيب تعيين توالي شد. DNA حاوي 2384 نوكلوي يد بود كه در مقايسه اين توالي با توالي ژن F حاصل از ويروس سرخك سوش Edmonston مشاهده شد كه توالي ژن فيوژن (F) بسيار حفاظت شده است. همچنين در مقايسه اين توالي با توالي ژن F ديگر پاراميكوويروس- ها همولوژي زيادي بين آنها مشاهده شده و نشان دهنده اين است كه ژن F بسيار حفاظت شده و پايدار است كه باعث اهميت بررسي اين ژن در تهيه واكسن نوتركيب شده است [14]. در مطالعاتي ديگر ناحيه كدكننده پروتي ين فيوژن از ويروس سرخك سوش ادمونستون در وكتور كلونينگ pbr322 و در باكتري.E coli سوش HB101 كلون شد. بعد از تعيين توالي مشخص شد كه اين پروتي ين حاوي 550 اسيد آمينه است و 81/64 درصد از اسيد آمينهها هيدروفوبيك يا بدون بار هستند [15]. ناحيه حفاظتشدهاي در انتهاي آميني F1 است كه در فرآيند فيوژن دخالت دارد و از ويژگيهاي بيشترپاراميكسو ويروسها است. در مقايسهي توالي ژن پروتي ين F با ساير پارا ميكسوويروسها (Sendai,RSV SV5,) همولوژي زيادي در انتهاي حفاظت شدهي F1 و 9 سيستي ين مشاهده شده است [15]. مطالعات اخير نشان داده است كه گليكو پروتي ين نوتركيب F به همراه گليكو پروتي ين H به علت اهمي ت بالاي ايمونولوژيك به عنوان كانديد يا واكسن نوتركي ب مطرح هستند [16]. در مطالعاتي كلونينگ ژن هم اگلوتينين (H) و ژن فيوژن (F) س وش ادمونس تون ويروس سرخك در وكتور بياني pjw4303 انجام شده است. پلاسميد pjw4303 جزء پلاسميدهاي بياني در تهيه واكسنهاي نوتركيب است. بعد از انجام كلونينگ پلاسميدهاي نوتركيب به موش تلقيح شدند. پس از بررسيهاي ايمونولوژيكي نتايج اميدواركننداي در رابطه با توسعه واكسنهاي نوتركيب ويروس سرخك بهدست آمده است [17]. 7- مراجع [1] Knipe D, Howley P, Filds - Virology. 5 th ed., Lippincott Williams &Wilkins. 2006; ISBN 0-7817-1832-5. [2] Flint SJ, Racaniello VR. Principles of virology. 2000; ISBN 1-55581- 172-2. [3] Jawetz., Melnick. and Adelberg's. Medical Microbiology. 25 th ed. 2010. [4] Bellini WJ, Rota JS. Virology of measles virus. J. Gen. Virol. 1994; 170: 15-23. [5] Mary P, Paul A. DNA vaccination of infants in the presence of maternal antibody. Virology, 2003; 307: 67-75. [6] High Pure Viral Nucleic Acid Kit, Roche 2004. [7] Protocol for first strand cdna synthesis Kit for RT PCR (AMV) +, Roche 2004. [8] Protocol for PCR with Pfu DNA Polymerase, fermentase. 2004. [9] pet System manual, 10 th ed., Novagen 2002. 43
جداسازي و كلونينگ ژن فيوژن (F) از ويروس... مليحه اسماعيلزاده خراساني و همكاران [15] Richardson C, Hull D. The nucleotide sequence of the mrna encoding the Fusion of Measles virus (Edmonston strain). Virology, 1986; 155: 508-523. [16] SangKon O, Pendleton D. Protective immunity provided by HLA-A2 epitopes for fusion and hemagglutinin proteins of measles virus. J. Virol. 2006; 04. 040. [17] Yang KF, Mustafa F. Early studies on DNA-based immunizations for measles virus. 1997; 888-892. [10] Brown TA. Gene cloning. 3 th ed., 1998. [11] Molecular Biology Catalog and Product. Application guide, Fermentase 2004-2005. [12] Rusel D, Sambrook J. Molecular cloning A laboratory Manual. 3 th ed., 2001. [13] pet System Tutorial (Protein Expression), Novagen. 2002. [14] Buckland R, Gerand C. Fusion glycoprotein of measles virus: Nucleotid sequence of the gene and comprision with other p aramixoviruses. J. gen. virol. 1987; 68: 1695-1703. 44