IN VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΥΜΕΝΑ ΚΑΙ ΤΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΩΝ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ΚΟΞΙΜΠΕΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Π. ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ Αρ. Διατριβής: 2318 IN VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΥΜΕΝΑ ΚΑΙ ΤΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΩΝ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ΚΟΞΙΜΠΕΣ ΘΕΟΔΩΡΙΔΟΥ ΑΘΗΝΑ ΙΑΤΡΟΣ ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Π. ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ Αρ. Διατριβής: 2318 IN VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΥΜΕΝΑ ΚΑΙ ΤΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΩΝ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ΚΟΞΙΜΠΕΣ ΘΕΟΔΩΡΙΔΟΥ ΑΘΗΝΑ ΙΑΤΡΟΣ ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

4 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΛΟΥΚΑΣ ΣΕΤΤΑΣ ΠΑΥΛΟΣ ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΛΟΥΚΑΣ ΣΕΤΤΑΣ ΠΑΥΛΟΣ ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΜΙΧΑΗΛ ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΕΛΕΝΗ ΤΣΟΥΚΑΛΗ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΡΑΪΚΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Ή έγκρισης της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 5

6 6

7 7 Στους γονείς μου

8 8

9 Στους Καθηγητές μου Λουκά Σέττα, Παύλο Νικολαϊδη Ευδοξία Δίζα-Ματαυτσή 9

10 10

11 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ M 1. ΑΡΘΡΩΣΕΙΣ Α. ΕΙΔΗ ΑΡΘΡΩΣΕΩΝ. 27 Β. ΔΟΜΗ ΑΡΘΡΩΣΗΣ.. 27 Β.1. Αρθρικός χόνδρος Β.2. Αρθρικός θύλακας.. 27 Β.3. Αρθρικός υμένας Β.4. Αρθρικό υγρό Γ. ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΑΡΘΡΙΤΙΔΕΣ Η ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Α. ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΤΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΧΟΥΝ ΣΤΗ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Α.1. Φαγοκυττάρωση. 42 Α.2. Κύτταρα της φλεγμονής. 42 Α.3. Μεσολαβητές της φλεγμονής. 44 Β. ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ. 47 Β.1. IL-1 και υποδοχείς. 52 Β.2. IL-6 και υποδοχείς. 55 Β.3. TNF-α και υποδοχείς. 57 Β.4. Πολυμορφισμός γονιδίων κυτταροκινών.. 61 Β.5. Βιολογικές θεραπείες ΜΣΑΦ-ΚΟΞΙΜΠΕΣ Α. ΓΕΝΙΚΑ. 68 Β. ΚΟΞΙΜΠΕΣ Β.1. ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΜΣΑΦ-ΚΟΞΙΜΠΩΝ 72 Β.1α. Αντιφλεγμονώδης δράση. 74 Β.1β. Αναστολή αγγειογένεσης

12 Β.1γ. Αντικαρκινική δράση Β1δ. Αναστολή κυτταροκινών Β.2. ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΜΣΑΦ. 94 Β.3. ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΚΟΞΙΜΠΩΝ.. 95 Β.3α. Σελεκοξίμπη. 97 Β.3β. Ετορικοξίμπη ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ M 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α. ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ Β. ΣΤΑΔΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ. 111 Γ. ΜΕΘΟΔΟΙ. 113 Γ.1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕΛΕΚΟΞΙΜΠΗΣ ΚΑΙ ΕΤΟΡΙΚΟΞΙΜΠΗΣ Γ.1α. Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης/High Performance Liquid Chromatography (HPLC) και Υγρή Χρωματογραφία Υπέρ-υψηλής Απόδοσης/Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Γ.1β. Φασματομετρία Μάζας/Mass Spectrommetry (MS) Γ.1β.1 Φασματομετρία Μάζας Επαγωγικά Συζευγμένου Πλάσματος/Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP- MS) Γ.1β.2. Φασματομετρία Μάζας με Αναλυτή Χρόνου Πτήσης/Quadrupole Time Of Flight (QTOF-MS) Γ.1γ. Βιβλιογραφική επισκόπηση για τον προσδιορισμό της σελεκοξίμπης και ετορικοξίμπης Γ.1δ. Πειραματικές συνθήκες. 121 Γ.1δ.1. Μέθοδος προκατεργασίας δειγμάτων Γ.1δ.2. Πείραμα. 121 Γ.1δ.3. Καμπύλη αναφοράς. 123 Γ.1δ.4. Ακρίβεια και επαναληψιμότητα μεθόδου Γ.1δ.5. Χρωματογραφήματα

13 Γ.2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ. 130 Γ.2.α. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός της IL-1β. 130 Γ.2.β. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός της IL Γ.2γ. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός του TNF-α 134 Γ.2δ. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός του IL-1Ra 136 Γ.2ε. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός του stnf RΙ. 137 Γ.2στ. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός του stnf RΙΙ Γ.3. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΥΠΑΡΞΗΣ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ ΣΤΗΝ ΑΡΘΡΩΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΑΤΟΣ. 140 Γ.4. VAS-ΟΠΤΙΚΗ ΚΛΙΜΑΚΑ ΠΟΝΟΥ 140 Γ.5. ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ Γ.6. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. 143 Α. ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Β. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ CELECOXIB ΚΑΙ ETORICOXIB ΣΕ ΟΡΟ ΚΑΙ ΑΡΘΡΙΚΟ ΥΓΡΟ Γ. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΟΥΣ ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕΛΕΚΟΞΙΜΠΗ ΚΑΙ ΕΤΟΡΙΚΟΞΙΜΠΗ. 148 Δ. ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ VAS ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΤΟΥ ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΑΝΑ ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΩΝ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΟΥΣ, ΤΟΥ VAS, ΤΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΣ ΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΔΕΙΚΤΗ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

14 14

15 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΜΣΑΦ: μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη ΣΕΛ: συστηματικός ερυθηματώδης λύκος AP-1: activator protein 1/πρωτεΐνη ενεργοποίησης 1 Apaf-1: apoptotic protease activating factor 1/παράγοντας 1 ενεργοποίησης της πρωτεάσης της απόπτωσης APC: antigen presenting cells/αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα APC: adenomatosis polyposis coli/αδενωματώδης πολυποδίαση του κόλου AUC: area under the curve/εμβαδόν κάτω από την καμπύλη BAX ή BCL-X: Bcl-2 associated X protein /Χ-πρωτεΐνη σχετιζόμενη με Βcl-2 Bcl-2: B-cell lymphoma 2 /λέμφωμα 2 Β-κυττάρων bfgf: Basic fibroblast growth factor /βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών b.i.d.: δις ημερησίως BLyS: B Lymphocyte Stimulator/παράγοντας ενεργοποίησης Β-κυττάρων bmpa1: bone morphogenic protein/μορφογενετικής πρωτεΐνης των οστών A1 camp: κυκλικό AMP CDK: Cyclin-dependent kinase/κινάσες εξαρτώμενες από τις κυκλίνες cdna: κυκλικό DNA CE: τριχοειδής ηλεκτροφόρηση COX: κυκλοξυγενάση CREB: camp response element-binding/στοιχείο δέσμευσης αντιδρών στο camp CRP: C reactive protein/c αντιδρώσα πρωτεΐνη CSF: colony stimulating factor/παράγοντας διεγερτικός αποικιών CTLA4: Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4/ αντιγόνο 4 κυτταροτοξικών Τ- λεμφοκυττάρων CYP: κυτόχρωμα P Cyr61: cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 /πλούσιος σε κυστεΐνη, αγγειογενής επαγωγέας, 61 DAF: Decay accelerating factor/παράγοντας επιτάχυνσης αποσύνθεσης DMARDs: disease modyfing antirheumatic drugs/φάρμακα τροποιητικά της νόσου Egr-1: Early Growth Response Protein 1/παράγοντας πρώϊμης αυξητικής απάντησης 1 ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay/ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεάς φάσεως με σύνδεση ενζύμου ERK2: extracellular signal-regulated kinases/εξωκυτταρικές κινάσες.-ρυθμιζόμενες μέσω σήματος FDA: food and drug administration/αμερικανικός οργανισμός τροφίμων και φαρμάκων FADD: Fas-associated death domain FcγRIIIa/συνδεδεμένη με Fas-περιοχή θανάτου FcγRIIIa FAP: Familial adenomatous polyposis/οικογενής καρκινωματώδης πολυποδίαση flk: vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)/υποδοχέας 2 του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα flt: vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGFR-1)/υποδοχέας 1 αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα GH: Growth Hormone/ αυξητική ορμόνη GM-CSF: granulocyte colony-stimulating factor/παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων HA: υαλουρονικό οξύ HLA-B27: Human Leucocyte Antigen-B27 HIF: Hypoxia-inducible factor/παράγοντας που επάγεται από την υποξία 15

16 HIV: ιός επίκτητης ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου HPLC: (High Performance Liquid Chromatography)/Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης HUVEC: human umbilical vein endothelial cells/φλεβικά ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου ICAM: Intercellular adhesion molecules/μεσοκυττάρια μόρια προσκόλλησης ICP- MS: Φασματομετρία Μάζας Επαγωγικά Συζευγμένου Πλάσματος IGF: Insulin-like growth factor 1/ ομοιάζων την ινσουλίνη παράγοντας αύξησης IFN: ιντερφερόνη ΙΚΚα: subunit α of IκB kinase/υπομονάδα α της ΙκΒ κινάσης ΙΚΚβ: subunit β of IκB kinase/υπομονάδα β της ΙκΒ κινάσης IκΒ: inhibitor of kappa B/αναστολέας του κβ IL: ιντερλευκίνη inos: συνθετάση του νιτρικού οξειδίου JNK1: αμινοτελική κινάση του ογκογονιδίου Jun LT: λευκοτριένη Lta: λεμφοτοξίνη-α MAP kinase: mitogen-activated protein kinase/πρωτεινική κινάση ενργοποιημένη απο μιτογόνα Mcl: Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)/ακολουθία λευχαιμίας μυελικών κυττάρων (σχετιζόμενα με BCL2) MCP: Monocyte chemotactic protein-1/χημειοτακτική πρωτεΐνη μονοκυττάρων MCSF: macrophage colony stimulating factor/παράγοντας διέγερσης αποικιών μακροφάγων MHC: μείζων σύστημα ιστοσυμβατότητας MMP: μεταλλοπρωτεϊνάσες mrna: αγγελιοφόρο RNA MS: Multiple Sclerosis/σκλήρυνση κατά πλάκας NF-κΒ: πυρηνικός παράγοντας-κβ ΝΚ: κύτταρα φυσικοί φονείς NO: νιτρικό οξείδιο o.d.: άπαξ ημερησίως PAF: παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων PDK1: Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1/κινάση 1 της πυρουβικής δεϋδρογονάσης PENETRATION INDEX: δείκτης διαπερατότητας PG: προσταγλανδίνες PGF: αυξητικός παράγοντας αιμοπεταλίων PLA2: φωσφολιπάση Α2 PMN: πολυμορφοπύρηνα PPAR-δ: Peroxisome proliferator-activated receptor delta/παράγοντας δ- που επάγει τον πολλαπλασιασμό των υπεροξειδιοσωμάτων QTOF-MS: Φασματομετρία Μάζας με Αναλυτή Χρόνου Πτήσης RA: ρευματοειδής αρθρίτιδα SCF: stem cell factor/παράγοντας αρχέγονων αιμοποιητικώ κυττάρων SERCA: Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca 2+ -ATPase/Ca 2+ -ATPάση σαρκο/ενδοπλασματικού δικτύου STAT proteins: Signal Transducers and Activator of Transcription proteins/πρωτεΐνες μετατροπείς σήματος και ενεργοποίησης μεταγραφής stnfr: διαλυτός υποδοχέας του παράγοντα νέκρωσης όγκων 16

17 TACE: μετατρεπτικό ένζυμο του TNF-α TGFβ: Transforming growth factor beta/αυξητικός παράγοντας μετατροπής β TIMP: ιστικός αναστολέας μεταλλοπρωτεϊνασών TNF-α: παράγοντας νέκρωσης όγκων α TRADD: TNF receptor-associated death domain/υποδοχέας ΤΝF σχετιζόμενος με περιοχή θανάτου TRAFs: TNF receptor-associating factors/παράγοντες σχετιζόμενοι με ΤΝF υποδοχείς UPLC: Υγρή Χρωματογραφία Υπέρ-υψηλής Απόδοσης VCAM: vascular cell adhesion molecule/μόριο προσκόλλησης αγγειακών κυττάρων VEGF: Vascular endothelial growth factor/αυξητικός παράγοντας του ενδοθηλίου των αγγείων VEGF receptors: υποδοχείς του VEGF VHL: Hippel-Lidau tumor suppressor/hippel-lidau ογκοανασταλτικό γονίδιο WBC: λευκά αιμοσφαίρια 17

18 18

19 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η ιστορία των αντιφλεγμονωδών φαρμάκων έχει τις ρίζες της στην ανακάλυψη φυτών και εκχυλισμάτων τους που χρησιμοποιούνταν στην ανακούφιση από τον πόνο, τον πυρετό και τη φλεγμονή. Όταν στα μέσα του 19ου αιώνα ανακαλύφθηκε ότι τα σαλικυλικά ήταν το ενεργό συστατικό του φυτού Willow Spp. που χρησιμοποιούνταν από την αρχαιότητα ως θεραπευτικό του πόνου και της φλεγμονής, ξεκίνησε η σύνθεση και η βιομηχανική παραγωγή του ακετυλοσαλικυλικού οξέως ή ασπιρίνης. Με την πρόοδο της επιστήμης της χημείας συνετέθηκαν έκτοτε τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), τα περισσότερα από τα οποία ήταν, αρχικά, οργανικά οξέα, ενώ αργότερα παρασκευάσθηκαν και μη όξινα ΜΣΑΦ. Από τη στιγμή της κυκλοφορίας της ασπιρίνης το 1897, το πρώτο μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο, τα ΜΣΑΦ χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του πόνου και της φλεγμονής. Υπολογίζεται ότι 30 εκατοµµύρια άτοµα κάθε µέρα χρησιµοποιούν ΜΣΑΦ. Μετά το δεύτερο παγκόσμιο πόλεμο υπήρξαν δύο περίοδοι στη σύνθεση νέων ΜΣΑΦ: η περίοδος μέχρι τη δεκαετία του 1970 που ήταν η περίοδος πριν την ανακάλυψη των προσταγλανδινών, και η περίοδος από τότε μέχρι το τέλος του προηγούμενου αιώνα όπου την σύνθεση νέων ΜΣΑΦ καθόριζε εν μέρει η δράση τους στις προσταγλανδίνες. Αυτά τα νέα ΜΣΑΦ διερευνήθηκαν μέχρι τις αρχές του 1990, και οι ανεπιθύμητες ενέργειές τους από το Γαστρεντερικό Σύστημα ήταν λιγότερες σε σχέση με τα πρώτα ΜΣΑΦ (ασπιρίνη, ινδομεθακίνη κλπ). Στη δεκαετία του 1990 έγινε η σημαντική ανακάλυψη ότι υπάρχουν δύο ενζυμικά συστήματα κυκλοξυγενάσης (COX) που ρυθμίζουν την παραγωγή των προστανοειδών (προσταγλανδίνες και θρομβοξάνη): η COX-1 που συνδέεται με την παραγωγή των προσταγλανδινών που απαιτούνται για τη διατήρηση της ομοιοστασίας του οργανισμού, και η COX-2 που ρυθμίζει την παραγωγή προσταγλανδινών που μεσολαβούν στην φλεγμονή, στον πόνο και στον πυρετό. Έτσι η έρευνα στράφηκε στη σύνθεση ουσιών που αναστέλλουν εκλεκτικά την COX-2 και καθόλου την COX-1. Αποτέλεσμα της έρευνας αυτής ήταν η παρασκευή των κοξιμπών που έχουν λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες από το γαστρεντερικό σύστημα. Η ροφεκοξίμπη και η σελεκοξίμπη ανήκουν στην πρώτη γενιά των κοξιμπών που κυκλοφόρησε το Στο τέλος του 2004 όμως, η ροφεκοξίμπη αποσύρθηκε λόγω ανεπιθύμητων ενεργειών από το καρδιαγγειακό σύστημα και οι υπόλοιπες κοξίμπες τέθηκαν υπό παρακολούθηση για παρόμοιες δράσεις. Τώρα γίνονται προσπάθειες για την ανακάλυψη των μηχανισμών των παραπάνω ανεπιθύμητων ενεργειών, τον εντοπισμό των ασφαλέστερων κοξιμπών, και την 19

20 αποκάλυψη του ρόλου της COX-1 και της COX-2 στα καρδιαγγειακά νοσήματα και στα ΑΕΕ, με την ελπίδα να βρεθεί τρόπος να αναπτυχθούν ΜΣΑΦ που θα στερούνται των παραπάνω ανεπιθύμητων ενεργειών. Η ανακάλυψη των ισομορφών της κυκλοξυγενάσης οδήγησε στην κατανόηση της σημασίας της στην παθογένεια νόσων όπως καρκίνο, νόσος Alzheimer και άλλα νευροεκφυλιστικά νοσήματα. Η χορήγηση των ΜΣΑΦ και των κοξιμπών στην πρόληψη και θεραπεία των παραπάνω παθήσεων, κατ αναλογία με τη χρήση στης ασπιρίνης στην πρόληψη των καρδιαγγειακών παθήσεων, αποτελεί μια από τις μέγιστες ερευνητικές προσπάθειες του αιώνα αυτού. Επίσης η έρευνα για τη σύνθεση νέων ΜΣΑΦ βασίζεται τώρα στη δράση που αυτά έχουν στη μετάδοση σήματος και στην ανασταλτική τους δράση στις φλεγμονώδεις κυτταροκίνες. Έτσι, ενώ τους προηγούμενους δύο αιώνες τα ΜΣΑΦ ήταν φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν για την αντιμετώπιση της φλεγμονής, του πόνου και του πυρετού, σήμερα τα ΜΣΑΦ είναι μια ευρεία κατηγορία που περιλαμβάνει ένα μεγάλο φάσμα αντιφλεγμονωδών παραγόντων που επεκτείνεται με την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών στόχων τους στη θεραπεία ενός μεγάλου εύρους παθήσεων. Τα νέα αυτά ΜΣΑΦ πιθανόν να αποτελέσουν νέες θεραπείες για παθήσεις όπως οι χρόνιες φλεγμονώδεις και νευροεκφυλιστικές, όπου οι κυτταροκίνες και άλλα μόρια που συμμετέχουν στη φλεγμονή, αποτελούν παράγοντες της παθογένειάς τους. Προς την κατεύθυνση αυτή φιλοδοξεί να συμβάλει η παρούσα εργασία με τη μελέτη της επίδρασης δύο κοξιμπών, της σελεκοξίμπης και της ετορικοξίμπης, σε κυτταροκίνες και τους υποδοχείς τους, στον ορό και στο αρθρικό υγρό ασθενών με φλεγμονώδη αρθρίτιδα, και τη μελέτη της διαπερατότητας των φαρμάκων αυτών στον αρθρικό υμένα. Από άποψη πρωτοτυπίας: 1) είναι η πρώτη εφαρμογή όπου χρησιμοποιούνται αυτές οι αναλυτικές τεχνικές (QTOF-MS και ICP-MS) σε φαρμακοκινητική μελέτη της σελεκοξίμπης και ετορικοξίμπης, 2) είναι η πρώτη αναφορά στη βιβλιογραφία για την επίδραση της ετορικοξίμπης στις κυτταροκίνες, 3) επίσης η πρώτη μελέτη για τη σελεκοξίμπη που να ερευνά in vivo τη μεταβολή των φλεγμονωδών κυτταροκινών και υποδοχέων τους οι οποίοι μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή (υπάρχει μία μελέτη για τον TNF-α και την IL-1β και μία για την IL-6 και IL- 8), 4) είναι η πρώτη αναφορά ανίχνευσης ετορικοξίμπης σε αρθρικό υγρό, 5) είναι η πρώτη φορά που ανιχνεύεται σε άνθρωπο η σελεκοξίμπη σε αρθρικό υγρό (υπάρχει μία μελέτη σε σκυλιά) 6) και η πρώτη φορά όπου υπολογίζεται ο δείκτης διαπερατότητας στο αρθρικό υγρό από τη σελεκοξίμπη και την ετορικοξίμπη 7) είναι η πρώτη φορά που συσχετίζεται ο δείκτης διαπερατότητας με τη μεταβολή των φλεγμονωδών 20

21 κυτταροκινών για κάποιο ΜΣΑΦ, 8) είναι η πρώτη φορά που συσχετίζεται ο δείκτης διαπερατότητας ενός ΜΣΑΦ στο αρθρικό υγρό, με τη μεταβολή του πόνου, 9) είναι η πρώτη φορά που συγκρίνεται η αναλγητική ικανότητα της σελεκοξίμπης με ετορικοξίμπη σε αυτές στις δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν σ αυτή τη διατριβή (υπάρχουν δύο πανομοιότυπες μελέτες σε άλλες δόσεις). Η διατριβή εκπονήθηκε στο Ρευματολογικό Τμήμα της Α Παθολογικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με την υποστήριξη, σε εργαστηριακό επίπεδο, του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ., και του Εργαστηρίου Αναλυτικής Χημείας του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Για τη συμβολή τους στην εκπόνηση αυτής της διδακτορικής διατριβής, ευχαριστώ θερμά: Τον Καθηγητή Παθολογίας-Ρευματολογίας του Τμήματος της Ιατρικής του Α.Π.Θ. κ. Λουκά Σέττα. Ο κύριος Σέττας μου έκανε την τιμή να με επιλέξει ως συνεργάτιδά του και να μου δώσει την ευκαιρία να εκπονήσω αυτή τη διατριβή, και με διευκόλυνε ποικιλοτρόπως για την ολοκλήρωσή της. Τον Καθηγητή Παθολογίας του Τμήματος της Ιατρικής και Διευθυντή της Α Παθολογικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ., κ. Παύλο Νικολαϊδη, για τη δυνατότητα που μου έδωσε να περατώσω την διατριβή μου, και για την αναντικατάστατη συμβολή του στο μέρος της φαρμακοκινητικής αυτής της διατριβής. Την Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Εργαστήριο Ανοσολογίας του Τμήματος της Ιατρικής και Διευθύντρια του Β Εργαστηρίου Μικροβιολογίας Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Ευδοξία Δίζα Ματαυτσή, η οποία μου προσέφερε αμέριστη συμπαράσταση στην εκπόνηση του εργαστηριακού μέρους της διατριβής, ηθική και ουσιαστική συμπαράσταση σε κάθε στάδιο της διατριβής, και αρκετό προσωπικό της χρόνο για τη διόρθωση του χειρογράφου της διατριβής. Τον Καθηγητή Ορθοπεδικής και Διευθυντή της Β Ορθοπεδικής Κλινικής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ., κ. Ιωάννη Χριστοφορίδη, καθώς και τον Επιμελητή Α και Αν. Διευθυντή της Β Ορθοπεδικής Κλινικής του Γενικού Νομαρχειακού Νοσοκομείου Γ. Γεννηματάς κ. Νικόλαο Σφαιρόπουλο, για τη βοήθειά τους και το συναδελφικό πνεύμα στην παραπομπή ασθενών για τη μελέτη. Τον αδελφό μου Επίκουρο Καθηγητή Αναλυτικής Χημείας του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ. κ. Γεώργιο Θεοδωρίδη, και τη Χημικό Δρ. Ελένη Γκίκα, για την αναντικατάστατη βοήθειά τους στο αναλυτικό μέρος της διατριβής μου, και για την αμέριστη ηθική τους συμπαράσταση. 21

22 22

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ) χρησιμοποιούνται ευρέως στη θεραπεία της φλεγμονής και του πόνου σε ασθενείς με ρευματικά νοσήματα. Καθώς οι αρθρώσεις είναι ένας από τους τόπους δράσης των ΜΣΑΦ, η συγκέντρωση ενός ΜΣΑΦ στο αρθρικό υγρό, είναι σημαντικό στοιχείο που καθορίζει την κλινική ανταπόκριση στο φάρμακο αυτό. Ο σημαντικός ρόλος των φλεγμονωδών προσταγλανδινών στις αρθρώσεις και η αναχαίτηση από τα ΜΣΑΦ της παραγωγής τους από το αραχιδονικό οξύ, καθιστούν το διαμέρισμα της άρθρωσης ιδανικό σημείο δράσης των ΜΣΑΦ. Έχουν γίνει λίγες έρευνες πάνω στη μετακίνηση των ΜΣΑΦ στον αρθρικό υμένα και οι περισσότερες περιλαμβάνουν τη μέτρηση της συγκέντρωσης των ΜΣΑΦ στο αρθρικό υγρό. H δράση των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών (ΜΣΑΦ) είναι πολυπαραγοντική και εκτείνεται πέρα από τη γνωστή αναστολή των κυκλοξυγενασών (COX). Η επίδραση των ΜΣΑΦ σε διάφορα σημεία της φλεγμονώδους αντίδρασης και σε διάφορα κύτταρα που συμμετέχουν στην ανοσία, παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον για την καλύτερη κατανόηση της εξατομικευμένης δράσης των φαρμάκων αυτών στα ρευματικά νοσήματα, και γενικότερα για την πιθανή δράση τους σε διάφορα άλλα νοσήματα, όπως κακοήθειες, νόσος Alzheimer κλπ.. Μελέτη των ιδιοτήτων αυτών για το κάθε αντιφλεγμονώδες ξεχωριστά, θα οδηγούσε πιθανώς 1) σε κατανόηση της διαφορετικότητας στη δράση του καθενός σε σχέση με τα άλλα, πιθανώς και της ίδιας κατηγορίας, 2) της διαφορετικότητας στην αποτελεσματικότητα που έχουν σε διαφορετικούς ασθενείς και 3) της διαφορετικότητας στο είδος και τη συχνότητα των ανεπιθύμητων ενεργειών. Οι κοξίμπες είναι η καινούρια κατηγορία ΜΣΑΦ, οι οποίες εκλεκτικά αναστέλλουν την κυκλοξυγενάση-2 (COX-2). Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν η in vivo μεταβολή ορισμένων κυτταροκινών που προάγουν τη φλεγμονή και των διαλυτών υποδοχέων τους ή ανταγωνιστών τους, στο αίμα και αρθρικό υγρό ασθενών με φλεγμονώδεις αρθρίτιδες κατά τη θεραπεία με τις κοξίμπες σελεκοξίμπη και ετορικοξίμπη. Μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις των φαρμάκων στο αίμα και στο αρθρικό υγρό, και υπολογίσθηκε η διαπερατότητα του αρθρικού υμένα από τις παραπάνω κοξίμπες. Επίσης μελετήθηκε η σχέση της διαπερατότητας του αρθρικού υμένα από τα παραπάνω φάρμακα, με τη μεταβολή των κυτταροκινών. Λεπτομερέστερα: 23

24 Προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση των: IL1β, IL-6, TNF-α, IL-1rα, stnfr1 και stnfr2 στο αίμα και στο αρθρικό υγρό. Υπολογίσθηκε η συγκέντρωση στο αίμα και στο αρθρικό υγρό των υπό μελέτη φαρμάκων, σελεκοξίμπης και ετορικοξίμπης, και εκτιμήθηκε η διαπερατότητα του αρθρικού υμένα από αυτά. Με στατιστική ανάλυση εκτιμήθηκε η ικανότητα των φαρμάκων αυτών να μεταβάλλουν τους προαναφερθέντες βιολογικούς παράγοντες στο αίμα και στο αρθρικό υγρό. Επιπλέον, συσχετίσθηκε η μεταβολή των δεικτών αυτών με τη συγκέντρωση των φαρμάκων στο αίμα και στο αρθρικό υγρό, και με τη διαπερατότητά τους στον αρθρικό υμένα. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε τηρώντας τις προδιαγραφές της υπουργικής απόφασης αριθμ. Α6/10983/1(Φ.Ε.Κ. 886/Β ) περί «Διεξαγωγής κλινικών δοκιμών, φαρμάκων και προστασίας του ανθρώπου», η οποία παραπέμεπει στη Διακήρυξη του Ελσίνκι και στις κατοπινές αναθεωρήσεις, προκειμένου να τηρηθούν απαράκλητα οι δεοντολογικές αρχές για έρευνα, η οποία αφορά ανθρώπους. Από άποψη δομής η παρούσα μελέτη χωρίζεται σε δύο μέρη: στο γενικό μέρος και στο ειδικό μέρος. Στο γενικό μέρος περιλαμβάνονται τρία κεφάλαια: οι αρθρώσεις, η φλεγμονώδης αντίδραση, και τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Στο ειδικό μέρος περιλαμβάνονται πέντε κεφάλαια: ο σκοπός της μελέτης, το υλικό και η μέθοδος της μελέτης, τα αποτελέσματα, η συζήτηση, και τα συμπεράσματα. Τέλος παρατίθενται οι περιλήψεις στην ελληνική και αγγλική γλώσσα, το παράρτημα και η βιβλιογραφία. Η βιβλιογραφία συντάχθηκε με το σύστημα Vancouver. 24

25 25 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

26 26

27 1. ΑΡΘΡΩΣΕΙΣ Οι αρθρώσεις είναι ανατομικολειτουργικά όργανα συνδέσεως και κινήσεως, σε συνεργασία με νευρομυϊκές μονάδες των διαφόρων οστών του σκελετού, και ανήκουν στο μυοσκελετικό ή ερειστικό σύστημα. Συνοπτικά η βασική τους δομή και τα είδη τους είναι [1,2,3]: Α. ΕΙΔΗ ΑΡΘΡΩΣΕΩΝ 1. Συναρθρώσεις: ινώδης συνδετικός ιστός μεταξύ των οστικών άκρων, π.χ. ραφές κρανίου. 2. Αμφιαρθρώσεις: ινώδης χόνδρος μεταξύ των οστικών άκρων π.χ. ηβική σύμφυση, μεσοσπονδύλιοι δίσκοι, οπίσθιο τμήμα ιερολαγονίων αρθρώσεων, κροταφογναθικές, στερνοκλειδικές αρθρώσεις. 3. Διαρθρώσεις: υαλοειδής χόνδρος στην επιφάνεια των αντιτιθέμενων επιφανειών των οστικών άκρων τα οποία είναι κινητά, και επιπλέον αρθρικός υμένας και αρθρικό υγρό, π.χ. ισχίο, γόνατο κλπ. Β. ΔΟΜΗ ΑΡΘΡΩΣΕΩΝ Η άρθρωση αποτελείται από: Β.1. ΑΡΘΡΙΚΟ ΧΟΝΔΡΟ Ο αρθρικός χόνδρος καλύπτει τις αντιτιθέμενες επιφάνειες των οστικών άκρων, και μπορεί να είναι υαλοειδής (με κολλαγόνο τύπου I) ή ινώδης (με κολλαγόνο τύπου II), ανάλογα με τον τύπο της άρθρωσης, με ειδικές ιδιότητες ελαστικότητας και ανθεκτικότητας. Είναι διαφοροποιημένο είδος συνδετικού ιστού και αποτελείται α) από χονδροκύτταρα και β) από θεμέλιο (μεσοκυττάριο) ουσία που περιέχει κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες και μη κολλαγονικές πρωτεΐνες. Στερείται αγγείων και τρέφεται σε ενήλικα άτομα από το αρθρικό υγρό (μηχανική μετακίνηση διαμέσου διαδοχικής συμπιέσεως και αποσυμπιέσεως του χόνδρου κατά τη διάρκεια του κινητικού έργου της αρθρώσεως) [3]. Β.2. ΑΡΘΡΙΚΟ ΘΥΛΑΚΟ Η ΚΑΨΑ Ο αρθρικός θύλακος αποτελείται από ινώδη συνδετικό ιστό (κολλαγόνο τύπου I) ποικίλου πάχους που περιβάλλει και σταθεροποιεί την άρθρωση, και έχει στενή ανατομική σχέση με τους περιβάλλοντες συνδέσμους. 27

28 Β.3. ΑΡΘΡΙΚΟ ΥΜΕΝΑ Ο αρθρικός υμένας είναι ένας υμένας χωρίς βασική μεμβράνη, που επικαλύπτει στις διαρθρώσεις όλα τα ενδοαρθρικά ανατομικά στοιχεία εκτός των περιοχών επαφής χόνδρου με χόνδρο, και αποτελείται από: αγγεία, λεμφαγγεία, νευρικές απολήξεις, χαλαρό συνδετικό ιστό (μεσοκυττάρια ουσία πλούσια σε ινίδια κολλαγόνου και πρωτεογλυκάνες) και 1-4 στιβάδες καλυπτηρίων κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά διακρίνονται σε: α) διαφοροποιημένους ινοβλάστες που παράγουν υαλουρονάνη, πρωτεϊνάσες και λιπαντικές πρωτεΐνες και β) ιστικά μακροφάγα που συμμετέχουν σε φλεγμονώδεις διεργασίες. Οι συνεχόμενες αυτές στιβάδες κυττάρων δημιουργούν μια συνεχόμενη επιφάνεια χωρίς ιδιότητες προσκόλλησης [1,2]. Οι ιδιότητες αυτής της στιβάδας επιτρέπουν τη διατήρηση του αρθρικού υγρού εντός της αρθρικής κοιλότητας. Κάτω από αυτές τις στιβάδες κυττάρων υπάρχει η υποκείμενη στιβάδα στην οποία υπάρχουν αγγεία του υμένα και μια δεξαμενή ινοβλαστών [4]. Στις αρθρικές επιφάνειες υπάρχει μεγάλος πληθυσμός από μακροφάγα και ινοβλάστες [5]. Ο αρθρικός υμένας αποτελεί εκλεκτικό ηθμό για τη δίοδο μακρομορίων και η φλεγμονή του (υμενίτιδα) αποτελεί την κύρια υποκείμενη βλάβη της αρθρίτιδας. Οι λειτουργίες της επιφάνειας του αρθρικού υμένα που έρχεται σε επαφή με την αρθρική κοιλότητα είναι: η διατήρηση της ακεραιότητας της, χωρίς ιδιότητες προσκόλλησης, επιφάνειας του αρθρικού υμένα, η λίπανση του χόνδρου, ο έλεγχος του όγκου και της σύστασης του αρθρικού υγρού, και η θρέψη των χονδροκυττάρων μέσα στις αρθρώσεις. Ο ΑΡΘΡΙΚΟΣ ΥΜΕΝΑΣ ΩΣ ΣΤΟΧΟΣ ΑΥΤΟΑΝΟΣΩΝ ΝΟΣΩΝ. Θεωρητικά στις φλεγμονώδεις αρθρίτιδες η αυτοάνοση απάντηση μπορεί να είναι έναντι των αντιγόνων του αρθρικού υμένα, αλλά δεν υπάρχουν ακόμη στοιχεία που να το αποδεικνύουν αυτό, και επίσης καμία αυτοάνοση πάθηση δεν προσβάλλει μόνο τις αρθρώσεις. Οι σύγχρονες θεωρίες υποστηρίζουν ότι στις φλεγμονώδεις αρθρίτιδες η προσβολή του αρθρικού υμένα έχει περισσότερο να κάνει με το τοπικό ανοσολογικό μικροπεριβάλλον παρά με τοπικά αντιγόνα [1,6-8]. Δύο στοιχεία του αρθρικού υμένα φαίνεται πιθανό να συμμετέχουν στην παθογένεση των αρθρίτιδων: η έκφραση του FcγRIIIa (υποδοχέα Fc τμήματος των ανοσοσφαιρινών) στα μακροφάγα της έσω στιβάδας και η ευαισθησία των ινοβλαστών του στον TNF-α. Οι υποδοχείς Fc των ανοσοσφαιρινών IgG, διεγείρουν την παραγωγή μεσολαβητών που προάγουν τη φλεγμονή, όπως, ο TNF-α, ως απάντηση σε διασταυρούμενη σύνδεση με IgG μόρια σε ανοσοσυμπλέγματα. Από τα έξι ή περισσότερα είδη, ο FcγRIIIa φαίνεται ότι είναι ο μόνος που μεσολαβεί για απαντήσεις 28

29 σε συμπλέγματα αρκετά μικρά ώστε να διαφύγουν τη σύνδεση με το συμπλήρωμα και να περάσουν το τοίχωμα των αγγείων [1]. Είναι λοιπόν πιθανό ο FcγRIIIa να μεσολαβεί στη φλεγμονή σε διαταραχές που χαρακτηρίζονται από κυκλοφορούντα μικρά ανοσοσυμπλέγματα. Υψηλά επίπεδα μικρών ή ενδιάμεσων κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων έχουν βρεθεί στη ρευματοειδή αρθρίτιδα (RA) και η κλινική εικόνα της νόσου αντανακλά την κατανομή των μακροφάγων που εκφράζουν τον FcγRIIIa [9]. Έτσι, η ενεργοποίηση των μακροφάγων στον αρθρικό υμένα, στο περικάρδιο, στον υπεζωκότα, στο σκληρό χιτώνα, στο ήπαρ, στο μυελό των οστών και το λεμφικό ιστό θα εξηγούσε όλες τις μείζονες εκφάνσεις της νόσου. Μερικές από τις εκδηλώσεις της RA είναι παρόμοιες και στον ΣΕΛ, όπου επίσης ανευρίσκονται ανοσοσυμπλέγματα. Οι κλινικές αυτές εκδηλώσεις δεν οφείλονται σε εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων, αλλά σε διαφορετική διαδικασία που οδηγεί σε παραγωγή κυτταροκινών με συνεπαγόμενη απάντηση οξείας φάσης. Σε εκδηλώσεις του ΣΕΛ που δεν συναντώνται στην RA, όπως τη νεφρίτιδα του λύκου, εμπλέκονται μηχανισμοί με εναπόθεση μεγάλων ανοσοσυμπλεγμάτων, τα οποία δε μπορεί να εκκαθαρίσει ο ανοσολογικός μηχανισμός λόγω δυσλειτουργίας του συμπληρώματος. Οι παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του FcγRIIIa δεν είναι καλά κατανοητοί, αλλά φαίνεται ότι αυτή επάγεται από την IL-10 [1]. Η υμενίτιδα στην RA για πολλά χρόνια θεωρούνταν ως μια μη ειδική φλεγμονώδης διαδικασία μικρής διαγνωστικής σημασίας και χωρίς σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της νόσου. Τα τελευταία χρόνια έχει φανεί ότι ο αρθρικός υμένας είναι το όργανο που λαμβάνουν χώρα ειδικές ανοσιακές απαντήσεις, και αυτό είναι προφανές από την παρατήρηση ότι Τ- και Β- λεμφοκύτταρα έχουν ολιγοκλωνική ανάπτυξη στον αρθρικό υμένα και ότι τα Β- κύτταρα είναι ικανά να αναπτύξουν τοπικά αντίδραση βλαστικού κέντρου [10,11]. Σε αρθρικό υμένα από οστεοαρθρίτιδα τα πλασματοκύτταρα έχουν συχνές μεταλλάξεις στα γονίδια του V τμήματος της ανοσοσφαιρίνης [10,12]. Επειδή δεν υπάρχει κλωνική ενεργοποίηση Β-λεμφοκυττάρων και τοπική ανάπτυξη βλαστικού κέντρου, φαίνεται ότι τα Β-λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται σε περιφερικά λεμφικά όργανα και μετά μεταναστεύουν στον αρθρικό υμένα. Η καταστροφή των αρθρικών ιστών μπορεί να προκληθεί από κυτταροκίνες που προάγουν τη φλεγμονή, μεταλλοπρωτεϊνάσες και διήθηση των ιστών από ινοβλάστες και μακροφάγα, από αγγειογένεση, φαγοκυττάρωση, απόπτωση, αυτοαντιδραστικά Τ- κύτταρα, και παθογενετικά αυτοαντισώματα [10]. Ο TNF-α μόνος του μπορεί να οδηγήσει σε χρόνια διαβρωτική αρθροπάθεια, όπως φαίνεται από μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια [13]. Τα κυκλοφορούντα ανοσοσυμπλέγματα μπορεί να είναι 29

30 υπεύθυνα για την παραγωγή του TNF-α, αλλά η υπεροχή των εκδηλώσεων από τις αρθρώσεις στη ρευματοειδή αρθρίτιδα σε σύγκριση με τις εκδηλώσεις από τον πνεύμονα ή τους ορογόνους, δείχνει ότι υπάρχουν μηχανισμοί ενίσχυσης της παραγωγής του στις αρθρώσεις. Πιθανόν το φαινόμενο αυτό να σχετίζεται με αποικισμό των αρθρώσεων από λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα και την τοπική σύνθεση ρευματοειδούς παράγοντα, που σχηματίζει ανοσοσυμπλέγματα και οδηγεί στην παραγωγή TNF-α και στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Υπάρχουν μελέτες που δείχνουν την υπεραντιδραστικότητα των στρωματικών κυττάρων του αρθρικού υμένα στον TNF-α [14]. Σε καλλιέργειες κυττάρων οι ινοβλάστες του αρθρικού υμένα και του μυελού των οστών εκφράζουν μόρια επιφανείας, όπως VCAM-1 και DAF, και μεταλλοπρωτεϊνάσες, σε απάντηση στις κυτταροκίνες των μακροφάγων, πιο γρήγορα από τους ινοβλάστες άλλων ιστών. Η σύνδεση των κυττάρων αυτών, που φέρουν μόρια επιφανείας VCAM-1 και DAF, με τα Β-λεμφοκύτταρα είναι πολύ ισχυρή, και τα τύπου ινοβλάστης κύτταρα που συνεκφράζουν τα παραπάνω μόρια, εκτός από τον αρθρικό υμένα, είναι τα στρωματικά κύτταρα των βλαστικών κέντρων και του μυελού των οστών. Η έκφραση αυτών των μορίων επιφανείας από τα στρωματικά κύτταρα είναι απαραίτητη για την επιβίωση και ωρίμανση των Β κυττάρων σε διάφορα στάδια της ζωής τους, και οι ινοβλάστες του αρθρικού υμένα φαίνεται να προηγούνται των ινοβλαστών από άλλους ιστούς στην υποστήριξη της επιβίωσης και διαφοροποίησης σε πλασματοκύτταρα των Β λεμφοκυττάρων [14]. Έτσι, η επιβίωση και διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων που εκκρίνουν αυτοαντισώματα, όπως ρευματοειδή παράγοντα (RF), μέσα στους αρθρικούς υμένες εξηγεί την ενίσχυση των ανοσιακών φαινομένων που οδηγεί στην κύρια εκδήλωση της νόσου από τις αρθρώσεις [15-17]. Πιθανόν, επίσης, να υπάρχει ευαισθησία των στρωματικών κυττάρων στον TNF-α, υπόθεση που είναι σημαντική για ρευματικές νόσους στις οποίες δεν εμπλέκονται ανοσοσυμπλέγματα. Φαίνεται λοιπόν ότι στην αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα ο απλότυπος HLA-B27, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, ευνοεί την παραγωγή TNF-α [18,19]. Η παρουσία όμως του HLA-B27 συνδέεται με διαφορετικές μορφές νόσου, όπως πχ την αξονική κατανομή στην αγκυλοποιητική και την περιφερική κατανομή στην αντιδραστική αρθρίτιδα, γεγονός που αντανακλά τη συσχέτιση του HLA-B27 με άλλους παράγοντες για την εκδήλωση της νόσου. Τέτοιος παράγοντας μπορεί να είναι ο TGFβ που παράγεται σε περιοχές με άσκηση τάσης όπως στις ενθέσεις, και ο οποίος ρυθμίζει ανοσιακά γεγονότα στα οποία μεσολαβεί το μείζων σύστημα ιστοσυμβατότητος (MHC) τάξης I [20]. 30

31 Β.4. ΑΡΘΡΙΚΟ ΥΓΡΟ Το αρθρικό υγρό διαχωρίζεται από τον κυκλοφορούντα όγκο αίματος, μέσω της αρθρικής μεμβράνης που θεωρείται διπλός ηθμός λόγω της ύπαρξης του ενδοθηλίου των αγγείων και του επιθηλίου του αρθρικού υμένα [21]. Το αρθρικό υγρό είναι υπερδιήθημα πλάσματος με χαμηλή περιεκτικότητα ολικών λευκωμάτων (1-2 g/dl), και εμπλουτισμένο με μόρια υψηλού μοριακού βάρους πλούσια σε πολυσακχαρίδες, κυρίως υαλουρονάνη, που παράγονται από υμενοκύτταρα τύπου Β προερχόμενα από ινοβλάστες. Το αρθρικό υγρό «καθαρίζεται» από τα υπολείμματα χάρη στα υμενοκύτταρα τύπου Α, και η ισορροπία μεταξύ παραγωγής και απομάκρυνσής του από την άρθρωση επιτυγχάνεται χάρη στα λεμφαγγεία του αρθρικού υμένα. Τον αρθρικό υμένα επικαλύπτει ένα ατελές στρώμα κυττάρων χωρίς υποκείμενη βασική μεμβράνη, πράγμα που τον διαχωρίζει από τις επικαλύψεις άλλων κοιλοτήτων στο ανθρώπινο σώμα όπου υπάρχει επιθήλιο ή μεσοθήλιο με υποκείμενη βασική μεμβράνη, τα οποία ρυθμίζουν την διακίνηση υγρών από τους γύρω ιστούς στην κοιλότητα [22]. Ο αρθρικός χόνδρος επίσης δεν έχει επικάλυψη και έτσι η θεμελιώδης ουσία του χόνδρου και του αρθρικού υμένα είναι σε άμεση επαφή με το αρθρικό υγρό, επιτρέποντας έτσι την ανάπτυξη μέσα στην άρθρωση ενός ομογενούς χημικού περιβάλλοντος. Το αρθρικό υγρό περιέχει λίγα κύτταρα, κυρίως χονδροκύτταρα και υμενοκύτταρα, τα οποία αποπίπτουν μέσα στην άρθρωση από τους γύρω ιστούς, μαζί με μεταναστευτικά ανοσιακά κύτταρα [1]. Οποιαδήποτε διαφοροποίηση στον όγκο και στη σύσταση του αρθρικού υγρού αντανακλά παθολογικές διαδικασίες μέσα στην άρθρωση (πίνακας 1 και πίνακας 2). Λόγω της ασυνήθιστης συσχέτισης μεταξύ των ιστών στην άρθρωση, γεγονότα όπως η φλεγμονή και η ενζυμική αποδόμηση μέσα στον αρθρικό υμένα και στο χόνδρο αντανακλώνται στη χημική σύνθεση του αρθρικού υγρού. Αυτές οι αλλαγές περιλαμβάνουν την παραγωγή παραγόντων που είναι υπεύθυνοι για τη συγκέντρωση διαφόρων κυττάρων μέσα στην άρθρωση. Οι βιοχημικές αλλαγές του αρθρικού υγρού στα διάφορα νοσήματα μπορεί να αντανακλούν διαταραχές στο αίμα ή να είναι το αποτέλεσμα τοπικής παραγωγής παθολογικών ουσιών, ή τοπικής παραγωγής περίσσειας ουσιών στον αρθρικό υμένα ή στο χόνδρο. Γενικά τα παράγωγα ενός φυσιολογικού ή παθολογικού μεταβολισμού στην άρθρωση είναι σε δυναμική ισορροπία με τον ορό και εξαρτώνται από περίπλοκες παραμέτρους όπως υδροστατική και ωσμωτική διαβάθμιση μέσα στην άρθρωση [1,21,22]. Έτσι, είναι δύσκολο να εκτιμηθούν μεμονωμένες περιπτώσεις ενός 31

32 παραγώγου. Επιπλέον, η δυσκολία στη λήψη και μελέτη φυσιολογικού αρθρικού υγρού, οι διαφορετικοί όγκοι αρθρικού υγρού που αναρροφώνται και οι διαφορετικές αραιώσεις των διαφόρων παραγόντων μέσα στην άρθρωση οδηγούν στην μικρή διαγνωστική αξία που έχει η μελέτη της χημικής σύστασης του αρθρικού υγρού στις διάφορες αρθρίτιδες. Πίνακας 1: Φυσικοχημικές παράμετροι φυσιολογικού αρθρικού υγρού [1]. Παράμετρος Φυσιολογική τιμή Παράμετρος Φυσιολογική τιμή Οσμωτικότητα 296mosmol/l Ολικά λευκώματα 25g/l Ph 7,44 λευκωματίνη 8g/l Pco 2 6,0kPa (range 4,7-7,3) α 1 -αντιθρυψίνη 0,78μg/l Po 2 <4,0kPa Σερουλοπλασμίνη 43mg/l Κάλιο 4,0mmol?l Απτοσφαιρίνη 90mg/l Νάτριο 136mmol/l α 2 -μακροσφαιρίνη 0,31g/l Ασβέστιο 1,8mmol/l Λακτοφερρίνη 0,44mg/l Ουρία 2,5mmol/l IgG 2,62g/l Ουρικό οξύ 0,23mmol/l IgA 0,85g/l Χοληστερόλη Μικρά ποσά IgM 0,14g/l Γλυκόζη 100mmol/l IL-1β 20pg/ml Θεϊκή χονδροϊτίνη 40mg/l IL-2 15,1U/ml Υαλουρονικό οξύ 2,14g/l TNF-α 1,38ng/ml IFN-α 350U/ml IFN-δ 13,7U/ml Συντομογραφίες: IL=ιντερλευκίνη, TNF=παράγοντας νέκρωσης όγκων, IFN=ιντερφερόνη Τα επίπεδα των φλεγμονωδών μορίων, όπως εικοσανοειδή, πρωτεάσες και κυτταροκίνες, είναι αυξημένα στο αρθρικό υγρό ασθενών στις διάφορες αρθροπάθειες, αντανακλώντας το επίπεδο της φλεγμονής [23,24]. Διάφορα αντισώματα, όπως, ρευματοειδείς παράγοντες, έχει αναφερθεί ότι αντανακλούν την τοπική παραγωγή. Επίσης, τα επίπεδα του συμπληρώματος σχετίζονται με την τοπική φλεγμονή στην άρθρωση, όπως συμβαίνει με τα προϊόντα αποδόμησης του συμπληρώματος που έχει αναφερθεί ότι στη RA σχετίζονται με τη βαρύτητα της υμενίτιδας [25]. Οι παρατηρήσεις αυτές δεν έχουν την ευαισθησία και την ειδικότητα που χρειάζεται για να χρησιμοποιηθούν διαγνωστικά. [26]. Αν και οι μόνες αξιόπιστες διαγνωστικές δοκιμασίες στην ανάλυση του αρθρικού υγρού είναι η χρώση κατά Gram, η καλλιέργεια και η παρουσία κρυστάλλων, 32

33 η μέτρηση του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων εξακολουθεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες στη διαγνωστική προσπάθεια. Ανάλογα με τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC), οι αρθρίτιδες μπορούν να διαχωρισθούν σε φλεγμονώδεις ή μη φλεγμονώδεις [27]. Όπως φαίνεται στον πίνακα 2 το αρθρικό υγρό μπορεί να χαρακτηρισθεί βάση του αριθμού των λευκών (WBC): φυσιολογικό (WBC < 200/mm 3 ), μη φλεγμονώδες (WBC < 2000/mm 3 ), φλεγμονώδες (WBC /mm 3 ), σηπτικό (WBC > /mm 3 ), και αιμορραγικό. Ο Shmerling και συν υπολόγισαν ότι η ανεύρεση WBC > 2000/mm 3 έχει 84% ευαισθησία και 84% ειδικότητα για όλες τις φλεγμονώδεις αρθρίτιδες. Όταν χρησιμοποιηθεί στη διαφορική διάγνωση και ο πολυμορφοπυρηνικός (PMN) τύπος (75% τουλάχιστον), τότε η ακρίβεια στη διαφορική διάγνωση μεταξύ φλεγμονωδών και μη φλεγμονωδών αρθρίτιδων φτάνει το 90% [28], καθώς στα αρθρικά υγρά των μη φλεγμονωδών αρθρίτιδων προεξάρχουν τα μονοπύρηνα. Φυσικά δεν μπορεί κανείς με αυτόν τον τρόπο να διακρίνει ποιος τύπος φλεγμονώδους αρθρίτιδας είναι (κρυσταλλογενής, RA, SLE κλπ) [28,29]. Πίνακας 2: Χαρακτηριστικά αρθρικού υγρού [28] Παράμετρος Μηφλεγμονώδες Αρθρικού Φυσιολογικό υγρού Φλεγμονώδες Σηπτικό Αιμορραγικό πολύ διαυγές διαυγές κίτρινο θολερό Εμφάνιση θολερό αιμορραγικό αχυρόχρουν αχυρόχρουν πολύ θολερό αδιαφανές Ιξώδες υψηλό υψηλό χαμηλό χαμηλό ποικίλλει Θρόμβος βλέννης καλός καλός μέτριος πτωχός WBC/mm 3 < 200 < > ποικίλλει % PMN < 25 < 25 > 50 > 75 ποικίλλει Γλυκόζη (% σε σχέση % % % < 50% με το πλάσμα) Πρωτεΐνη mg/dl > 4.0 > 4.0 Κρύσταλλοι καθόλου καθόλου πολλοί ή καθόλου καθόλου καθόλου Τα τελευταία χρόνια υπάρχει ενδιαφέρον και έρευνα για τη διαγνωστική σημασία της μελέτης των κυττάρων στο ίζημα του αρθρικού υγρού μετά φυγοκέντρηση 33

34 και με ειδικές χρώσεις [30-32]. Για παράδειγμα, η ύπαρξη αποπτωτικών PMN, φαγοκυττάρων μονοπυρήνων και σιτευτικών κυττάρων βοηθά στη διαφορική διάγνωση μεταξύ οροαρνητικών σπονδυλαρθρίτιδων και RA, καθώς στη RA υπάρχουν αποπτωτικά PMN, αλλά όχι φαγοκύτταρα μονοπύρηνα [26,33,34]. Επίσης, εωσινοφιλία στο αρθρικό υγρό μπορεί να σημαίνει παρασιτική λοίμωξη, αλλεργία, όγκο ή νόσο Lyme. Παρόλες τις μέχρι τώρα μελέτες, οι δοκιμασίες αυτές δεν έχουν ακόμη γνωστή ευαισθησία, ειδικότητα και αξιοπιστία και για το λόγo αυτό δεν χρησιμοποιούνται ευρέως. Σε μια φλεγμαίνουσα άρθρωση υπάρχει αύξηση στην τοπική αιμάτωση και ανισορροπία μεταξύ αγγειακής διαπερατότητας και λεμφαγγειακής απομάκρυνσης, που οδηγεί στο τοπικό οίδημα και σε αλλαγές στη διάχυση μορίων από τον αρθρικό υμένα στο αρθρικό υγρό. Για τον υπολογισμό της ροής του αίματος στον αρθρικό υμένα έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι όπως Laser Doppler, υπέρηχοι, μαγνητική τομογραφία, αρτηριακή διάχυση με ραδιοσημασμένα μικροσφαιρίδια κ.λ.π. [35-37]. Γενικά, τα μόρια του αρθρικού υγρού βρίσκονται σε ισορροπία με αυτά του πλάσματος. Για μικρότερα σωματίδια όπως ηλεκτρολύτες, ουρία, κρεατινίνη ή ουρικό οξύ ο αρθρικός υμένας είναι βατός και εξαρτάται από τις πρωτεΐνες του πλάσματος και την υαλουρονάνη του αρθρικού υγρού [38]. Αυτές οι φυσιολογικές συνθήκες διαταράσσονται από χρόνιες υμενίτιδες, κυρίως λοιμώξεις και RA, όπου υπάρχει διαταραχή στην τοπική κυκλοφορία και μεταβολισμό. Σ αυτές τις περιπτώσεις η αγγείωση της άρθρωσης δεν είναι συγχρονισμένη με την αυξημένη μεταβολική δραστηριότητα, και σε σύγκριση με το πλάσμα το αρθρικό υγρό έχει αυξημένες συγκεντρώσεις γαλακτικού οξέος και μερικής πίεσης διοξειδίου του άνθρακα, μαζί με ελαττωμένο ph, μερική πίεση οξυγόνου και συγκέντρωση γλυκόζης [39]. Δεν υπάρχει αμφιβολία ότι η υπερπλασία του αρθρικού υμένα αυξάνει τις μεταβολικές απαιτήσεις. Τα ευρήματα αυτά μαζί με το παράδοξο της ελαττωμένης θερμοκρασίας καμιά φορά σε αρθρώσεις με ενεργό αρθρίτιδα στην RA, υπονοούν ότι μερικές φλεγμονώδεις αρθρώσεις είναι σε κατάσταση ισχαιμίας. Αυτή η ισχαιμία μπορεί να χειροτερεύει από τη μείωση των προσταγλανδινών κατά τη χρήση των ΜΣΑΦ [22]. Τις τελευταίες δεκαετίες υπάρχει ενδιαφέρον για δύο κατηγορίες μορίων μέσα στο αρθρικό υγρό: τις κυτταροκίνες και τα δομικά στοιχεία του αρθρικού χόνδρου [40]. Σε πολλές μελέτες επιβεβαιώνεται ότι η συγκέντρωσή τους στο αρθρικό υγρό είναι μεγαλύτερη από τη συγκέντρωσή τους στο πλάσμα, πράγμα που υποσημαίνει την ενδαρθρική σύνθεση και απελευθέρωσή τους [41]. Το ενδιαφέρον στα μόρια που προαναφέρθηκαν προέρχεται από τη σημασία που έχουν για την τοπική φλεγμονώδη 34

35 απάντηση και την επίδραση της πάθησης στο χόνδρο. Δεν υπάρχουν ακόμη μελέτες για να συσχετισθεί η μεταβολή αυτών των δεικτών με την επιτυχία ή αποτυχία των διαφόρων θεραπευτικών παρεμβάσεων. Σε κάθε περίπτωση, η συγκέντρωση ενός μορίου στο αρθρικό υγρό αντανακλά όχι μόνο την παραγωγή του, αλλά και την απομάκρυνσή του από την άρθρωση μέσω των λεμφαγγείων, γεγονός που διαφέρει όχι μόνο από νόσο σε νόσο, αλλά και από άτομο σε άτομο. Έχει βρεθεί σε μια μελέτη ότι η λεμφική παροχέτευση στην RA είναι διπλάσια από αυτή της οστεοαρθρίτιδας [42], χωρίς όμως αυτό να έχει ακόμη επιβεβαιωθεί. Σε αυτή την περίπτωση θα έπρεπε οι συγκρίσεις μεταξύ ατόμων στο επίπεδο των βιολογικών δεικτών του αρθρικού υγρού να γίνονται χρησιμοποιώντας και τη συγκέντρωσή τους και την κάθαρση της άρθρωσης [35]. Οι κυτταροκίνες είναι, μια οικογένεια από μικρές ρυθμιστικές πρωτεΐνες που μεσολαβούν για την επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων και παίζουν σημαντικό ρόλο στις ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αντιδράσεις [43]. Κάποιες από αυτές, ειδικά ο TNF-α, και οι ιντερλευκίνες IL-1β (IL-1beta), ΙL-6, και η IL-8 που θεωρούνται ως προάγουσες τη φλεγμονή, μπορεί να έχουν μείζονα ρόλο στην παθογένεση των αρθρίτιδων. Έτσι, ο καθορισμός των κυτταροκινών στο αρθρικό υγρό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαγνωστικούς σκοπούς ή για καθορισμό της πρόγνωσης μιας αρθρίτιδας, μπορεί να υποδηλώνει τη δραστηριότητα της νόσου ή μπορεί να είναι χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας μιας θεραπείας [7]. Ένα από τα πιο χαρακτηριστικά γεγονότα μιας φλεγμονώδους αρθρίτιδας είναι η συλλογή αρθρικού υγρού στις αρθρώσεις. Έτσι, επειδή το αρθρικό υγρό αντανακλά τις παθοφυσιολογικές διαταραχές που λαμβάνουν χώρα σε μια προσβεβλημένη άρθρωση, αποτελεί ένα εύκολα προσβάσιμο βιολογικό υγρό χρήσιμο για in vitro και in vivo μελέτες, και σύμφωνα με τους Punzi και συν. 2002, το αρθρικό υγρό περιέχει τα υψηλότερα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτταροκινών, συγκρινόμενο με τα άλλα βιολογικά υγρά [7]. Μια κατάταξη των κυτταροκινών που εμπλέκονται στις αρθρίτιδες βασίζεται σε κριτήρια λειτουργικά, δηλαδή στο ρόλο τους στη φλεγμονή, και περιλαμβάνει τρεις κύριες κατηγορίες: φλεγμονώδεις, ρυθμιστικές και αντιφλεγμονώδεις (σχήμα 1). Αυτές οι κυτταροκίνες, αν και σε διαφορετικές ποσότητες και αναλογίες, ανευρίσκονται σε όλες τις φλεγμονώδεις αρθροπάθειες και ειδικά στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Τα υμενοκύτταρα μπορούν να παράγουν σχεδόν όλες τις κυτταροκίνες, και επιπρόσθετα τα μονοπύρηνα κύτταρα του αρθρικού υγρού, είναι σε θέση να επάγουν τη σύνθεση των κυτταροκινών ακόμη και χωρίς εξωγενές ερέθισμα (πίνακας 3) [44-46]. Οι κυτταροκίνες IL-1, IL-6 και TNF-α έχουν επιπρόσθετα τοπικές 35

36 δράσεις στην κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό, με σημαντική δράση στα αγγεία. Η IL-1 και ο TNF-α δρουν ανεξάρτητα αλλά και συνεργικά στην καταστροφή της άρθρωσης κυρίως λόγω της αύξησης διεργασιών, όπως του καταβολισμού του χόνδρου, της παραγωγής κολλαγενάσης, της δράσης των οστεοκλαστών με καταστροφή του οστού, και ελάττωσης της σύνθεσης πρωτεογλυκανών [41,46-50]. Στην οστεοαρθρίτιδα επίσης, οι πιο σημαντικές κυτταροκίνες για την παθογένεια είναι η IL- 1, ο TNF-α και σε μικρότερο βαθμό η IL-6. Σχήμα 1: Οι κυτταροκίνες και άλλες ουσίες που ανιχνεύονται στο αρθρικό υγρό, και τα κύρια κύτταρα παραγωγής τους. HA: υαλουρονικό οξύ, PG: προσταγλανδίνες, TIMP: ιστικός αναστολέας μεταλλοπρωτεϊνασών [7]. Στο αρθρικό υγρό ασθενών με RA και άλλες φλεγμονώδεις αρθρίτιδες έχουν ανιχνευθεί οι διαλυτοί υποδοχείς κάποιων κυτταροκινών όπως:, stnfr1, stnfr2, sil- 6R και ο ανταγωνιστής του υποδοχέα της IL-1, IL-1Ra [6,51-55]. 36

37 Πίνακας 3: Οι κύριες, σχετιζόμενες με αρθροπάθειες και ανευρισκόμενες στο αρθρικό υγρό, κυτταροκίνες [7]. Κυτταροκίνη IL-1 TNF-α Κύτταρα παραγωγής τους M, L, F και άλλα κύτταρα M, L, F και άλλα κύτταρα Κύριες δράσεις σε αρθροπάθειες APR, άλλων κυτταροκινών, MMPs, PGE2, COX-2, NO, μορίων προσκόλλησης στο ενδοθήλιο, αγγειογένεσης, ενεργοποίησης οστεοκλαστών, APR, άλλων κυτταροκινών, MMPs, PGE2, COX-2, NO, μορίων προσκόλλησης στο ενδοθήλιο IL-2 Th1 ανάπτυξης και ενεργοποίησης T και B κυττάρων, NK κυτ, TNF-α, INFγ IL-6 IL-7 IL-8 οικ. MCP οικ. M, Th2 και άλλα κύτταρα M, F και άλλα κύτταρα M, F και άλλα κύτταρα IL-4 Th2 ανάπτυξης B, T κυττάρων και μαστοκυττάρων, IL-1Ra, IL-1, TNFα, IL-6, IL-8, IFNγ APR σύνθεση πρωτεϊνών, πολ/σμός και ενεργοποίηση B και T κυττάρων, πολ/σμού ινοβλαστών σύνθεσης IgG, μορίων προσκόλλησης, απόπτωσης λεμφοκυττάρων ενεργοποίησης και χημειοταξίας ουδετεροφίλων, αγγειογένεσης ενεργοποίησης και χημειοταξίας μονοπυρήνων IL-10 Th2 διαφοροποίησης B κυττάρων και σύνθεσης IgG, τάξης II έκφρασης IL-11 IL-12 M και άλλα κύτταρα HLA, IL-1Ra, παραγωγής IL-1,IL-2,TNF-α,IL-6,IL-8,IFNγ μορίων προσκόλλησης, PGE2, NO, PLA-2, MMPs APR (σύνθεση πρωτεϊνών), IL-1,TNF-α, IFNγ, IL-12 IL-1,TNF-α,IFNγ,IL-18 IL-13 Th2 διαφοροποίησης B κυττάρων, IL-1,TNF, IL-6, IL-8, IFNγ, PGE2, IL-15 IL-16 IL-17 IL-18 TGFβ οικ. CD8 + T κύτταρα M, F και άλλα κύτταρα IL-1Ra πολ/σμού T κυττάρων, χημειοκινών, TNF χημειοταξίας εωσινοφίλων, διήθησης T κυττάρων ενεργοποίησης οστεοκλαστών, PGE2, NO, χημειοκινών IL-1, TNF-α, IFNγ, μορίων προσκόλλησης σύνθεσης κολλαγόνου, IL-1Ra, IL-1, IL-2, TNF Συντομογραφίες: M=μονοκύτταρα/μακροφάγα, L=λεμφοκύτταρα, F=ινοβλάστες, APR=αντίδραση οξείας φάσης, PGE2=προσταγλανδίνη Ε2, ΝΟ=νιτρικό οξείδιο, MMP=μεταλλοπρωτεϊνάσες της μεσοκυττάριας ουσίας, PLA2=φωσφολιπάση 2, IFNγ= ιντερφερόνη γ, =αύξηση, =ελάττωση 37

38 Μέχρι τώρα οι έρευνες των νέων φαρμάκων (βιολογικών παραγόντων) για τις αρθρίτιδες έχουν γίνει βασιζόμενες στη δράση που έχουν τα φάρμακα αυτά στις κυτταροκίνες του ορού, με ελάχιστες εξαιρέσεις έρευνες που έχουν γίνει βασιζόμενες στη δράση τους στα υμενοκύτταρα και στο αρθρικό υγρό [7,56,57,58]. Ειδικά για τα ΜΣΑΦ, παρόλο που γενικά θεωρείται ότι δεν μπορούν να επηρεάσουν τη σύνθεση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών, έχουν γίνει κάποιες in vivo μελέτες που δεικνύουν μείωση ορισμένων από αυτές τις κυτταροκίνες στο αρθρικό υγρό ασθενών υπό αγωγή με ΜΣΑΦ [7]. Ενδεικτικά: η ινδομεθακίνη, η δικλοφαινάκη και η ναπροξένη έχει βρεθεί ότι σε ασθενείς με RA μπορεί να ελαττώσουν τα επίπεδα της IL-6, ουσίας P, αλλά όχι της IL-1β [59]. Η ετοδολάκη ελάττωσε στο αρθρικό υγρό τα επίπεδα της IL-6 και αύξησε τα επίπεδα του TNF-α σε ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα [60]. Και στις δύο αυτές μελέτες φάνηκε ότι τα ΜΣΑΦ μπορούν να ελαττώσουν τα επίπεδα της IL-6 που ευθύνεται για μη ειδική φλεγμονή, αλλά όχι της IL-1β και του TNF-α που ευθύνονται για αρθρική καταστροφή [59,60]. Γ. ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΑΡΘΡΙΤΙΔΕΣ Ο αριθμός των λευκοκυττάρων και ο τύπος των πολυμορφοπυρήνων σχετίζεται με το χαρακτηρισμό μιας αρθρίτιδας ως φλεγμονώδη ή μη φλεγμονώδη [8,61]. Οι φλεγμονώδεις αρθρίτιδες είναι μια σειρά αρθροπαθειών που χαρακτηρίζονται από σημεία φλεγμονής (κλινικά και εργαστηριακά) και συστηματικών σημείων όπως πρωινή δυσκαμψία. Η φλεγμονή (αναλύεται στο επόμενο κεφάλαιο) είναι συνήθως αυτοπεριοριζόμενη όταν εξαφανιστεί ο ενοχοποιητικός παράγοντας, αλλά μπορεί να περιέλθει και σε χρονιότητα. Η χρόνια φλεγμονή είναι μια παθολογική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από συνεχή αυτοσυντηρούμενη χρόνια φλεγμονώδη απάντηση, η οποία δε σταματά ούτε όταν το αρχικό ερέθισμα εξαφανιστεί, και οδηγεί σε καταστροφή και αναδόμηση των ιστών που στη συνέχεια επηρεάζει τη λειτουργία των προσβεβλημένων οργάνων [62]. Στις αρθρώσεις η χρόνια αυτή φλεγμονώδης κατάσταση καταλήγει στην καταστροφή τους και στην κινητική ανικανότητα. Χαρακτηριστικά παραδείγματα τέτοιων αρθρίτιδων είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η ψωριασική αρθρίτιδα και οι οροαρνητικές σπονδυλαρθρίτιδες [63]. Στη ρευματοειδή και ψωριασική αρθρίτιδα η φλεγμονή του αρθρικού υμένα οδηγεί στην υπερπλασία του, που έχει την τάση να διεισδύει στην επιμεταλλωμένη εν τω βάθει ζώνη του αρθρικού χόνδρου και στο υποχόνδριο οστό, διαδικασία που οδηγεί στην καταστροφή τους [62]. Πολλές κυτταροκίνες παράγονται στον αρθρικό υμένα από διάφορους κυτταρικούς πληθυσμούς και πολλές από αυτές εκκρίνονται από τα κύτταρα που 38

39 μοιάζουν με μακροφάγα. Ανάμεσα σ αυτές είναι ο TNF-α και η IL-1, που αποτελούν τα τελευταία χρόνια και θεραπευτικούς στόχους διαφόρων φαρμάκων για τη ρευματοειδή αρθρίτιδα, τα οποία είτε αναστέλλουν άμεσα τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές, είτε παρεμβαίνουν στη σύνδεσή τους με τον υποδοχέα τους ή και τα δύο. Τα επίπεδα του TNF-α είναι πολύ αυξημένα στο αρθρικό υγρό και στον ορό ασθενών με RA [43]. Ειδικά για την RA είναι σημαντικό ότι ο TNF-α αναστέλλει τη σύνθεση των πρωτεογλυκανών και το σχηματισμό οστού και διεγείρει την απορρόφησή τους. Επιπλέον τα διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν TNF-α, αναπτύσσουν χρόνια φλεγμονώδη πολυαρθρίτιδα [13]. Μια άλλη προάγουσα τη φλεγμονή κυτταροκίνη, η IL-6, είναι ιδιαίτερου ερευνητικού ενδιαφέροντος τελευταία. Αυτή η κυτταροκίνη επάγεται και από τον TNF-α και την IL-1 και εμπλέκεται στην παθογένεση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Επάγει την παραγωγή αντισωμάτων από τα Β κύτταρα, ενεργοποιεί τα Τ κύτταρα, τα μακροφάγα και τους οστεοκλάστες, και επάγει την αντίδραση οξείας φάσης από τα ηπατικά κύτταρα [64]. Φλεγμονώδες στοιχείο υπάρχει και στην οστεοαρθρίτιδα σε κάποιους ασθενείς και σε κάποια φάση της νόσου, με υπερπλασία του αρθρικού υμένα και πυκνή διήθηση αυτού με μονοπύρηνα [65,66]. Η οστεοαρθρίτιδα είναι η πιο συχνή χρόνια νόσος των αρθρώσεων και γενικά θεωρείται εκφυλιστική, υπάρχουν όμως πολλές αναφορές, που, συνοψίζονται στην ανασκόπηση των Pelletier και συν 2001, και τονίζουν τη σημασία της φλεγμονής του αρθρικού υμένα στη εξέλιξη της οστεοαρθρίτιδας [67]. Πολλοί ερευνητές κατέδειξαν τις εξέχουσες φλεγμονώδεις βλάβες του αρθρικό υμένα στην οστεοαρθρίτιδα, όπως την αυξημένη αγγείωση, κυτταρική διήθηση και το οίδημα των υποκείμενων ιστών, καθώς και την υπερπλασία της έσω στιβάδας του αρθρικού υμένα. Έτσι η φλεγμονή του αρθρικού υμένα και η τοπική συγκέντρωση προφλεγμονωδών μεσολαβητών, παραγόντων ανάπτυξης και φλεγμονογόνων κυτταροκινών (κυρίως IL- 1β και TNF-α), φαίνεται να εμπλέκονται άμεσα στην εξέλιξη της οστεοαρθρίτιδας και στην εμφάνιση πόνου [68]. 39

40 2. Η ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Η φλεγμονή είναι μια σύνθετη διαδικασία που μπορεί να περιγραφεί ως η απάντηση των ζωντανών ιστών στη βλάβη. Αυτή η απάντηση εμφανίζεται μόνο σε ιστούς που αγγειώνονται, καθώς με τα αγγεία μεταφέρονται απαραίτητα διαλυτά μόρια και κύτταρα στη θέση της φλεγμονής. Η φλεγμονή είναι απαραίτητη για να προστατευθεί ο οργανισμός από παθογόνους μικροοργανισμούς και για να επανορθώσει φυσικό ή χημικό τραύμα [69]. Παρόλη την εκτεταμένη έρευνα που έχει ήδη γίνει οι μηχανισμοί της φλεγμονής δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Φαίνεται ότι υπάρχουν διαφορετικές φλεγμονώδεις οδοί, καθεμία από τις οποίες εξελίσσεται μέσα από ένα καταρράκτη βιολογικών γεγονότων. Πολλά από τα βήματα στις φλεγμονώδεις οδούς ελέγχονται από κυτταροκίνες και άλλα διαλυτά ρυθμιστικά μόρια γνωστά ως μεσολαβητές της φλεγμονής. Ένας συγκεκριμένος μεσολαβητής της φλεγμονής μπορεί είτε να δράσει άμεσα στο στόχο του είτε να διεγείρει την παραγωγή άλλων μεσολαβητών που ελέγχουν άλλα σημεία της φλεγμονώδους αντίδρασης. Την ίδια στιγμή, συμβαίνουν δευτερογενή γεγονότα τα οποία μπορεί να διεγείρονται από συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος ή από παράγωγα του συμπληρώματος. Έτσι κάθε βήμα στη διαδικασία έχει την ικανότητα να οδηγεί σε επόμενα βήματα αποδίδοντας τελικά μια ολοκληρωμένη αντίδραση [70]. Τελικά ποιες οδοί θα ενεργοποιηθούν και το σύνολο των γεγονότων που θα λάβουν χώρα στη διάρκεια μιας φλεγμονώδους αντίδρασης, εξαρτώνται από πολλούς παράγοντες, που περιλαμβάνουν τη φύση του εισβολέα, την πύλη εισόδου, και τα χαρακτηριστικά του ξενιστή. Δεν υπάρχει ανοσολογική μεσολάβηση για όλες τις φλεγμονές. Για παράδειγμα κάποια ξένα σώματα μπορεί απ ευθείας να ενεργοποιήσουν τα ουδετερόφιλα που είναι βασικά κύτταρα της φυσικής ανοσίας και να ενεργοποιήσουν οξεία φλεγμονή μέσω ουδετερόφιλων χωρίς τη συμμετοχή λεμφοκυττάρων που συνδεόνται κυρίως με την ειδική ανοσία. Ακόμη κι αυτές οι αντιδράσεις μπορεί να ελέγχονται και να ρυθμίζονται από το ανοσιακό σύστημα καθώς οι ανοσοσφαιρίνες δρουν ως οψωνίνες [71]. Η φλεγμονώδης αντίδραση μπορεί να είναι, είτε ευεργετική, είτε καταστροφική για τον ξενιστή. Για παράδειγμα η αύξηση της τοπικής αιμάτωσης μπορεί να έχει ευεργετικά αποτελέσματα αυξάνοντας την τροφοδοσία της περιοχής της φλεγμονής σε ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα κλπ. Η έκκριση υγρών πλούσιων σε λευκώματα στην περιοχή βοηθά να αραιωθούν ή να απενεργοποιηθούν βλαπτικά αντιγόνα, ενώ οι εκκρίσεις των αδένων στους βλεννογόνους εκλούουν ερεθιστικά ξένα σωματίδια από το επιθήλιο. Τοπική ενεργοποίηση του μηχανισμού της πήξης εμποδίζει την διασπορά ενός αντιγόνου μέσω 40