Κουρμουλάκης Γεώργιος

Transcript

1 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ανάπτυξη λιποσωμικών συστημάτων για αργή αποδέσμευση φαρμάκων Για την απόκτηση του Μεπταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση Βιομηχανική Φαρμακευτική και Νανοτεχνολογία Κουρμουλάκης Γεώργιος Φαρμακοποιός Πάτρα, 2018

2 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ανάπτυξη λιποσωμικών συστημάτων για αργή αποδέσμευση φαρμάκων Για την απόκτηση του Μεπταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση Βιομηχανική Φαρμακευτική και Νανοτεχνολογία «Μοναδικός υπεύθυνος για το περιεχόμενο και την σύνταξη του κειμένου και την σωστή καταγραφή των πηγών είναι ο συγγραφέας. Ο Επιβλέπων Καθηγητής και τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς επιτροπής δεν φέρουν καμία ευθύνη.» ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιμησιάρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Επιβλέπων/ Πρόεδρος της εξεταστικής επιτροπής Παύλος Κλεπετσάνης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Μπουργανός Βασίλειος Διευθυντής Ινστιτούτου Επιστημών Χημικής Μηχανικής (ΙΤΕ/ ΙΕΧΜΗ) Κουρμουλάκης Γεώργιος Φαρμακοποιός Πάτρα,

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Πανεπιστήμιου Πατρών, στο πλαίσιο του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση Βιομηχανική Φαρμακευτική- Νανοτεχνολογία κατά τα έτη Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα Καθηγήτριά μου κα. Σοφία Αντιμησιάρη για την πολύτιμη βοήθεια της τόσο στο πειραματικό (εργαστηριακό) μέρος όσο και στη συγγραφή αυτής της εργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ Σπυρίδων Μουρτά, μεταδιδάκτορα της ερευνητικής ομάδας της κας Αντιμησιάρη, για την ουσιαστική βοήθεια του στην οργάνωση, εκτέλεση των πειραμάτων καθώς και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή Κλεπετσάνη Παύλο για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου για την πολύ καλή συνεργασία που είχαμε. Ειδικότερα, θέλω να ευχαριστήσω τους μεταπτυχιακούς φοιτητές: Αλεξάκο Κωνσταντίνο, Μητροπούλου Αθηνά, Πεφάνη- Αντιμησιάρη Κωνσταντίνα και Κρεμεζή Σταύρο. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη μεταδιδάκτορα Μαραζιώτη Αντωνέλλα. Ευχαριστώ τον Καθηγητή Στάικο Γεώργιο του Τμήματος Χημικών Μηχανικών της Πολυτεχνικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών καθώς και την υποψήφια διδάκτορα Ciocoiu Oana-Nicoleta για την διεξαγωγή των πειραμάτων ιξωδομετρίας. Ευχαριστώ τον Μπουργανό Βασίλειο που δέχτηκε να αποτελεί μέλος της τριμελούς εξεταστικής Επιτροπής καθώς και για τον χρόνο που αφιέρωσε. Ιδιαιτέρως ευχαριστώ τους υποψήφιους διδάκτορες: Μαρούση Κωνσταντίνο καθώς και Κίντο Διονύση για την ουσιαστική βοήθειά τους καθώς και για την καλή συνεννόηση και συνεργασία που είχαμε. Τέλος, ευχαριστώ την οικογένειά μου για την υποστήριξή τους σε κάθε μου επιλογή. Αφιερώνεται στην οικογένειά μου 3

4 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΟΙ ΟΡΟI ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΑ Chol CDCl 3 CPMG DIC DLS DMAP D 2 O Et 2 O FFTEM LUV Mal MLV MeOD Mmt- NMR PBS PC PDI PE P 2 O 5 ppm SUV TEM TES TFA T m VPGs ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Χοληστερόλη Δευτεριωμένο χλωροφόρμιο Carr-Pursell-Meiboom-Gill παλμική ακολουθία Διϊσοπροπυλοκαρβοδιϊμίδιο Δυναμική σκέδαση φωτός 4-Διμεθυλαμινοπυριδίνη Δευτεριωμένο νερό Διαιθυλαιθέρας Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης παγωμένης κατάτμησης Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα Μαλεϊμίδιο Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα Δευτεριωμένη μεθανόλη Μονομεθόξυτριτυλ- ομάδα Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών Φωσφατιδυλοχολίνη Δείκτης πολυδιασποράς Φωσφατιδυλαιθανολαμίνη Πεντοξείδιο του φωσφόρου Μέρος στο εκατομμύριο Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης Τριαιθυλσιλάνιο Τριφθοροξικό οξύ Θερμοκρασία τήξης Φωσφολιπιδικές γέλες 4

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα λιποσώματα είναι μικροσκοπικά σφαιρικά σωματίδια που αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια και χοληστερόλη, και χρησιμοποιούνται ως φορείς για τη χορήγηση φαρμάκων. Για την τοπική χορήγηση των λιποσωμάτων απαιτείται η ρύθμιση των ρεολογικών ιδιοτήτων τους, η οποία συνήθως επιτυγχάνεται με την ενσωμάτωσή τους σε γέλες. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της παρασκευής λιποσωμικής γέλης μέσω διασύνδεσης (cross linking) των λιποσωμάτων. Τα λιποσώματα συνδέονται μεταξύ τους με τη βοήθεια κατάλληλων τροποποιημένων πολυμερών πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Για το λόγο αυτό συντέθηκε παράγωγο PEG-διθειόλης (μόριο μεγάλου μοριακού βάρους) το οποίο στη συνέχεια αντέδρασε μέσω τύπου Michael προσθήκης με ομάδες μαλεϊμιδίου, οι οποίες έχουν ενσωματωθεί στα λιποσώματα ως λιπίδιο- pegμαλεϊμίδιο και βρίσκονται στην επιφάνεια των λιποσωμάτων. Η αντίδραση της PEG-διθειόλης με τις ομάδες μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων επιβεβαιώθηκε με φασματοσκοπία 1 H-NMR. Επιπλέον μελετήθηκε η επίδραση του παραγώγου PEG διθειόλης (που συντέθηκε για πρώτη φορά στο εργαστήριό μας) στο ιξώδες και στο μέγεθος των λιποσωμάτων που φέρουν ομάδες μαλεϊμιδίου στην επιφάνειά τους, ως μέτρο εκτίμησης της επιδιωκόμενης διασύνδεσης μεταξύ των λιποσωμάτων και της in-situ παρασκευής λιποσωμικής γέλης. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η αντίδραση της PEG-διθειόλης με τις ομάδες μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους των λιποσωμάτων καθώς και σε αύξηση του ιξώδους των διασπορών τους. 5

6 ABSTRACT Liposomes are microscopic spherical vesicles that can be created from cholesterol and phospholipids. Liposomes are promising systems for drug delivery. When mucosal or topical delivery of liposomal formulation is considered, the rheological and/ or mucoadhesive properties should be adjusted. This can be managed by adding gelling agents to liposome dispersion. The aim of this study is to prepare liposomal gel via liposomes crosslinking. Liposomes are crosslinked through modified polyethylenglycol polymer. In order to achieve this goal, we synthesized PEG- di- thiol (a high molecular weight molecule) which then reacted with maleimide groups of liposomes, through Michael type addition (Maleimide groups have been incorporated in liposome membrane as lipid-peg-maleimide). The reaction between PEG-di-thiol and maleimide groups (of liposomes) was confirmed with 1 H-NMR analysis. Additionally, we studied the effect of PEGdi-thiol in size and viscosity of liposomes (which contain Maleimide groups on their surface). We concluded that the increase in viscosity and size of liposomes can be partly attributed to Michael type addition. 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 3 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5 ΑΒSTRACT 6 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Λιποσώματα Εισαγωγή στα λιποσώματα Συστατικά λιποσωμάτων- λιπίδια Δομή φωσφολιπιδίου Σχηματισμός διπλοστοιβάδων λιπιδίων Θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης λιπιδίων (Τ m ) - Ρευστότητα μεμβρανών Χοληστερόλη και ο ρόλος της στη ρευστότητα των μεμβρανών Ταξινόμηση λιποσωμάτων Μέθοδοι παρασκευής των λιποσωμάτων Μέθοδος ενυδάτωσης λεπτού λιπιδικού υμενίου Μέθοδος χρήσης υπερήχων Μέθοδος εξώθησης μέσω φίλτρων Μέθοδος εξάτμισης αντίστροφης φάσης Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων Προσδιορισμός μέσου μεγέθους και κατανομής του μεγέθους των λιποσωμάτων Τεχνικές μορφολογικού χαρακτηρισμού των λιποσωμάτων- Ηλεκτρονική μικροσκοπία

8 Προσδιορισμός ζ-δυναμικού των λιποσωμάτων Εφαρμογές των λιποσωμάτων στη χορήγηση φαρμάκων Γέλες- Υδρογέλες Εισαγωγή στις υδρογέλες Ταξινόμηση υδρογελών Μηχανισμοί παρασκευής υδρογέλης/ Τρόποι διασύνδεσης πολυμερικών αλυσίδων Φυσικές και χημικές ιδιότητες των υδρογελών Απελευθέρωση του φαρμάκου από την υδρογέλη Μηχανισμός απελευθέρωσης των μορίων του φαρμάκου από την 39 υδρογέλη Παράγοντες που επηρεάζουν την απελευθέρωση του φαρμάκου 40 από την υδρογέλη Εφαρμογές των υδρογελών στη χορήγηση φαρμάκων Λιποσωμικές Γέλες Λιποσωμικές Υδρογέλες Εισαγωγή στις λιποσωμικές υδρογέλες Μορφολογικός και ρεολογικός χαρακτηρισμός των λιποσωμικών υδρογελών Απελευθέρωση φαρμάκων από τη λιποσωμική υδρογέλη Λιποσωμικές υδρογέλες ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων Φωσφολιπιδικές Γέλες (Vesicular phospholipid gels, VPGs) Εισαγωγή στις φωσφολιπιδικές γέλες Μέθοδος παρασκευής των VPGs Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των VPGs Εγκλωβισμός/ Ενσωμάτωση φαρμάκων στις VPGs 47 8

9 VPGs ως συστήματα χορήγησης υδρόφιλων φαρμάκων Μικρογέλη σε λιποσώματα (Microgel in liposomes, M-i-L) Εισαγωγή στις μικρογέλες σε λιποσώματα Μέθοδοι παρασκευής των M-i-L Ενσωμάτωση φαρμάκων στις M-i-L Απελευθέρωση μορίων φαρμάκου από M-i-L M-i-L ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων 52 Σκοπός της εργασίας ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όργανα και Υλικά Όργανα Υλικά Παρασκευή διαλυμάτων- αντιδραστηρίων Παρασκευή λιποσωμάτων Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων Προσδιορισμός λιπιδικής συγκέντρωσης με την χρωματομετρική μέθοδο Stewart Μέτρηση μέσου μεγέθους και κατανομής του μεγέθους των λιποσωμάτων Σύνθεση PEG-διθειόλης Εκτίμηση αντίδρασης μεταξύ ομάδας μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδας PEG-διθειόλης με 1 H-NMR Αντίδραση μεταξύ των ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και των θειολομάδων PEG-διθειόλης Αρχή τεχνικής NMR- Φάσμα 1 H-NMR Μελέτη αντίδρασης μεταξύ ομάδας μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων 68 9

10 και θειολομάδας PEG-διθειόλης με 1 H-NMR 2.7 Μέτρηση ιξώδους λιποσωμικής διασποράς ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σύνθεση PEG-διθειόλης Μελέτη αντίδρασης μεταξύ ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδων PEG-διθειόλης με 1 H-NMR Φασματοσκοπία 3.3 Μελέτη της επίδρασης της PEG-διθειόλης στο μέγεθος των λιποσωμάτων και το ιξώδες των λιποσωμικών διασπορών ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 87 10

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11

12 1.1 Λιποσώματα Εισαγωγή στα λιποσώματα Τα λιποσώματα είναι μικροσκοπικά σφαιρικά σωματίδια που αποτελούνται από μια ή περισσότερες λιπιδικές διπλοστοιβάδες οι οποίες περικλείουν έναν υδατικό πυρήνα (υδατικό διάλυμα). Το μέγεθος των λιποσωμάτων κυμαίνεται από μερικά νανόμετρα (συνήθως nm) έως μερικά μικρόμετρα. Οι λιπιδικές διπλοστοιβάδες των λιποσωμάτων αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια και χοληστερόλη. Τα φωσφολιπίδια είναι αμφίφιλα μόρια, δηλαδή φέρουν ένα υδρόφοβο (υδρογονανθρακικές αλυσίδες λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων) και ένα υδρόφιλο τμήμα [Popovska et al., 2013]. Συνεπώς, όταν αυτά βρεθούν σε υδατικό περιβάλλον, σχηματίζουν αυθόρμητα κλειστές σφαιρικές δομές, όπως μικκύλια ή διπλοστοιβάδες λιπιδίων/ λιποσώματα (Εικόνα 1.1). Τα περισσότερα φωσφολιπίδια όταν διασπείρονται σε υδατικό περιβάλλον σχηματίζουν διπλοστοιβάδες λιπιδίων (και όχι μικκύλια). Αυτό συμβαίνει διότι τα φωσφολιπίδια περιέχουν δυο υδρογονανθρακικές αλυσίδες λιπαρών οξέων, οι οποίες καταλαμβάνουν μεγάλο όγκο και δε χωρούν στο εσωτερικό του μικκυλίου. Εικόνα 1.1 Δομή: (α) λιπιδικής διπλοστοιβάδας, (β) λιποσώματος, (γ) μικκυλίου. (δ) Eνσωμάτωση υδρόφοβων φαρμάκων και εγκλωβισμός υδρόφιλων και φορτισμένων φαρμάκων στα λιποσώματα [Kotla et al., 2017]. 12

13 Τα λιποσώματα αρχικά μελετήθηκαν ως μοντέλα κυτταρικών μεμβρανών, καθώς η λιπιδική διπλοστοιβάδα των λιποσωμάτων παρουσιάζει ομοιότητες με το λιπιδικό τμήμα των κυτταρικών μεμβρανών. Σήμερα, χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική ως συστήματα μεταφοράς-χορήγησης φαρμάκων, εξαιτίας των πλεονεκτημάτων τους (Εικόνα 1.1δ). Τα κυριότερα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των λιποσωμάτων παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 1.1.1). Πίνακας 1.1.1: Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των λιποσωμάτων [Akbarzadeh et al., 2013]. Πλεονεκτήματα λιποσωμάτων Μειονεκτήματα λιποσωμάτων Βιοσυμβατότητα, βιοαποικοδομησιμότητα, χαμηλή τοξικότητα και ανοσογονικότητα Ικανότητα εγκλωβισμού και μεταφοράς τόσο υδρόφιλων όσο και υδρόφοβων φαρμάκων Προστασία του εγκλωβισμένου στα λιποσώματα φαρμάκου από ενζυμική αποικοδόμηση Μείωση της τοξικότητας των εγκλωβισμένων φαρμάκων (αμφοτερικίνη Β) Δυνατότητα εκλεκτικής μεταφοράς φαρμάκων σε ιστό-στόχο Δυνατότητα τροποποίησης του μεγέθους και των επιφανειακών ιδιοτήτων (όπως επιφανειακό ηλεκτρικό φορτίο) των λιποσωμάτων Φυσική και χημική αστάθεια των λιποσωμάτων (όπως συσσωμάτωση λιποσωμάτων, υπεροξείδωση λιπιδίων) Διαφυγή/ διαρροή του εγκλωβισμένου φαρμάκου από τα λιποσώματα Ευαισθησία των λιποσωμάτων στη θερμοκρασία και ακτινοβολία Υψηλό κόστος παραγωγής 13

14 1.1.2 Συστατικά λιποσωμάτων- λιπίδια Τα συμβατικά λιποσώματα αποτελούνται από φωσφολιπίδια και χοληστερόλη. Τα φωσφολιπίδια βρίσκονται σε μεγάλη συγκέντρωση σε όλες τις βιολογικές μεμβράνες Δομή φωσφολιπιδίου Τα φωσφολιπίδια αποτελούνται από τέσσερα συστατικά: λιπαρά οξέα, μια εξέδρα (δηλαδή ένα μόριο πολυαλκοόλης) στην οποία προσδένονται τα λιπαρά οξέα, μια φωσφορική ομάδα και μια αλκοόλη η οποία συνδέεται με τη φωσφορική ομάδα (Εικόνα 1.2). Τα λιπαρά οξέα αποτελούν το υδρόφοβο τμήμα του φωσφολιπιδίου (υδρόφοβες ουρές), ενώ το υπόλοιπο μόριο έχει υδρόφιλο χαρακτήρα και συνεπώς μπορεί να αλληλεπιδρά με το υδάτινο περιβάλλον. Εικόνα 1.2 Σχηματική δομή ενός φωσφολιπιδίου (φωσφογλυκεριδίου) [Stryer L, Biochemistry, W.H. Freeman and Company, 2002, p 358]. Πιο αναλυτικά, τα λιπαρά οξέα των φωσφολιπιδίων είναι υδρογονανθρακικές αλυσίδες διαφόρων μηκών και βαθμών κορεσμού, οι οποίες απολήγουν σε καρβοξυλικές ομάδες. Το μήκος των υδρογονανθρακικών αλυσίδων (των λιπαρών οξέων) ποικίλλει από 14 έως 24 άτομα άνθρακα, συχνότερα όμως είναι άτομα άνθρακα. Μια από τις δυο υδρογονανθρακικές αλυσίδες των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων είναι δυνατόν να έχει έναν ή περισσότερους διπλούς δεσμούς και γι αυτό λέγεται ακόρεστη (σε σχέση με τον αριθμό των ατόμων του υδρογόνου). Η δεύτερη αλυσίδα δεν έχει διπλούς 14

15 δεσμούς και λέγεται κορεσμένη. Κάθε διπλός δεσμός σε μια ακόρεστη υδρογονανθρακική αλυσίδα δημιουργεί μια κάμψη της αλυσίδας. Ο κορμός στον οποίο στήνονται τα φωσφολιπίδια μπορεί να είναι η γλυκερόλη (αλκοόλη με τρία άτομα άνθρακα και τρεις υδροξυλομάδες) ή η σφιγγοσίνη (μια πιο πολύπλοκη αλκοόλη). Τα φωσφολιπίδια που προκύπτουν από τη γλυκερόλη ονομάζονται φωσφογλυκερίδια, ενώ τα φωσφολιπίδια που προκύπτουν από τη σφιγγοσίνη ονομάζονται σφιγγολιπίδια. Ένα φωσφογλυκερίδιο αποτελείται από ένα μόριο γλυκερόλης (εξέδρα) στο οποίο συνδέονται δυο μόρια λιπαρών οξέων και μια φωσφορυλιωμένη αλκοόλη. Ειδικότερα, οι υδροξυλομάδες των ατόμων άνθρακα C-1 και C-2 της γλυκερόλης εστεροποιούνται με τις καρβοξυλομάδες δυο λιπαρών οξέων. Η υδροξυλομάδα του C-3 της γλυκερόλης εστεροποιείται με φωσφορικό οξύ. Το φωσφογλυκερίδιο στο οποίο δε γίνονται άλλες προσθήκες ονομάζεται φωσφατιδικό (ή 3- φωσφορική διακυλογλυκερόλη) και είναι το απλούστερο φωσφογλυκερίδιο (Εικόνα 1.3). Εικόνα 1.3 Δομή του φωσφατιδικού [Stryer L, Biochemistry, W.H. Freeman and Company, 2002, p 359]. Τα πιο κοινά φωσφογλυκερίδια έχουν προκύψει από το φωσφατιδικό με εστεροποίηση της φωσφορικής ομάδας του (φωσφατιδικού) με την υδροξυλομάδα μιας αλκοόλης. Οι πιο κοινές αλκοολικές ομάδες των φωσφογλυκεριδίων είναι της χολίνης, της αιθανολαμίνης, της σερίνης, της γλυκερόλης και της ινοσιτόλης. Το φωσφολιπίδιο/ φωσφογλυκερίδιο που απαντάται στις περισσότερες κυτταρικές μεμβράνες είναι η φωσφατιδυλοχολίνη (Εικόνα 1.4). 15

16 Εικόνα 1.4 Δομή φωσφολιπιδίου (φωσφογλυκεριδίου): (α) χημικός τύπος φωσφατιδυλοχολίνης, (β) σύμβολο φωσφολιπιδίου Σχηματισμός διπλοστοιβάδων λιπιδίων Όταν τα φωσφολιπίδια βρεθούν σε υδάτινο περιβάλλον σχηματίζουν διπλοστοιβάδες (διμοριακά φύλλα) αυθόρμητα. Ο σχηματισμός διπλοστοιβάδων λιπιδίων είναι μια διεργασία αυτοσυγκρότησης που οφείλεται στον αμφιπαθή χαρακτήρα των φωσφολιπιδίων. Ειδικότερα, οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων (που αναφέρονται και ως lamellae) αποτελούνται από δυο φύλλα λιπιδίων. Οι υδρόφοβες ουρές του κάθε λιπιδικού φύλλου αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας ένα υδρόφοβο περιβάλλον. Αντίθετα, οι υδρόφιλες κεφαλές αλληλεπιδρούν με το υδάτινο περιβάλλον που υπάρχει στην κάθε πλευρά της διπλοστοιβάδας. Οι δυνάμεις που εμπλέκονται στο σχηματισμό της διπλοστοιβάδας λιπιδίων είναι οι εξής: α) υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και ελκτικές δυνάμεις Van Der Waals μεταξύ των υδρογονανθρακικών αλυσίδων των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων, β) ηλεκτροστατικές δυνάμεις και δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των πολικών κεφαλών των λιπιδίων και των μορίων νερού του υδατικού περιβάλλοντος. 16

17 Θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης λιπιδίων (Τ m ) - Ρευστότητα μεμβρανών Οι υδρογονανθρακικές αλυσίδες των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων μπορεί να βρίσκονται είτε σε μια καλά οργανωμένη και δύσκαμπτη κατάσταση (το φωσφολιπίδιο βρίσκεται στη στερεή κρυσταλλική κατάσταση) είτε σε μια άτακτη και ρευστή κατάσταση (το φωσφολιπίδιο βρίσκεται στη ρευστή κρυσταλλική κατάσταση). Η κατάσταση στην οποία βρίσκονται οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων επηρεάζει τη ρευστότητα της λιπιδικής διπλοστοιβάδας (της μεμβράνης) των λιποσωμάτων. Κάθε φωσφολιπίδιο έχει μια χαρακτηριστική θερμοκρασία τήξης ή μετάπτωσης φάσης (Τ m ). Η θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης των φωσφολιπιδίων είναι η θερμοκρασία στην οποία τα φωσφολιπίδια μεταβαίνουν από τη στερεή στην υγρή κρυσταλλική κατάσταση και συνεπώς η θερμοκρασία στην οποία η λιποσωμική μεμβράνη μεταπίπτει από τη δύσκαμπτη στη ρευστή κατάσταση (Εικόνα 1.5). Εικόνα 1.5 Δομή λιποσωμικής μεμβράνης που αποτελείται από φωσφατιδυλοχολίνη ανάλογα με τη θερμοκρασία [Brandl, 2001]. 17

18 Η Τ m εξαρτάται από: α) το μήκος των υδρογονανθρακικών αλυσίδων των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων. Τα φωσφολιπίδια με μακρύτερες υδρογονανθρακικές αλυσίδες λιπαρών οξέων έχουν υψηλότερη θερμοκρασία μετάπτωσης από τα φωσφολιπίδια που έχουν υδρογονανθρακικές αλυσίδες μικρότερου μήκους. Οι επιμήκεις υδρογονανθρακικές αλυσίδες αλληλεπιδρούν πιο έντονα μεταξύ τους, από τις αντίστοιχες μικρότερου μήκους. β) το βαθμό κορεσμού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων των λιπαρών οξέων. Για φωσφολιπίδια με την ίδια πολική κεφαλή και το ίδιο μήκος υδρογονανθρακικής αλυσίδας, η απουσία διπλών δεσμών στις υδρογονανθρακικές αλυσίδες των λιπαρών οξέων αυξάνει τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης. Η ύπαρξη διπλού δεσμού προκαλεί μια κάμψη της αλυσίδας. Η κάμψη αυτή παρεμποδίζει την καλώς διατεταγμένη στοίχιση (πακετάρισμα) των αλυσίδων των λιπαρών οξέων, με αποτέλεσμα την ελάττωση της Tm. γ) την καθαρότητα των φωσφολιπιδίων. Η χαμηλή καθαρότητα των φωσφολιπιδίων, δηλαδή η ύπαρξη προσμίξεων, έχει ως αποτέλεσμα η μετάπτωση του λιπιδίου από τη στερεή στην υγρή κρυσταλλική κατάσταση να μη συμβαίνει σε μια ορισμένη θερμοκρασία αλλά σε ένα εύρος θερμοκρασιών [Li et al., 2015] Χοληστερόλη και ο ρόλος της στη ρευστότητα των μεμβρανών Η χοληστερόλη είναι ένα λιπίδιο με διαφορετική δομή από εκείνη των φωσφολιπιδίων. Η χοληστερόλη περιέχει έναν στεροειδή πυρήνα (που αποτελείται από τέσσερις συνδεδεμένους δακτυλίους υδρογονανθράκων), ο οποίος έχει ένα υδροξύλιο στη μια άκρη και μια υδρογονανθρακική ουρά στην άλλη άκρη (Εικόνα 1.6α). 18

19 Εικόνα 1.6 (α) Χημικός τύπος χοληστερόλης, (β) χοληστερόλη ως σύμβολο, (γ) ενσωμάτωση της χοληστερόλης στη λιπιδική διπλοστοιβάδα [Brandl, 2001]. Στις μεμβράνες (κυτταρικές, λιποσωμικές), το μόριο της χοληστερόλης κατευθύνεται παράλληλα προς τις υδρογονανθρακικές αλυσίδες των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων. Η υδροξυλομάδα της χοληστερόλης αλληλεπιδρά με τις πολικές κεφαλές των φωσφολιπιδίων (Εικόνα 1.6γ). Ειδικότερα, τα μόρια της χοληστερόλης καλύπτουν τα κενά που υπάρχουν μεταξύ των γειτονικών μορίων φωσφολιπιδίων. (Τα κενά δημιουργούνται από τις κάμψεις των ακόρεστων υδρογονανθρακικών αλυσίδων). Με τον τρόπο αυτό, η χοληστερόλη μειώνει τη ρευστότητα της μεμβράνης (κυτταρικής, λιποσωμικής) και την καθιστά λιγότερο διαπερατή Ταξινόμηση λιποσωμάτων Τα λιποσώματα ταξινομούνται με βάση ορισμένα χαρακτηριστικά. Τα χαρακτηριστικά αυτά είναι: α) το μέγεθος, β) ο αριθμός των διπλοστοιβάδων, γ) η μέθοδος παρασκευής, δ) η λιπιδική σύσταση και ε) οι εφαρμογές τους. Τα λιποσωμάτα με βάση το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστοιβάδων τους ταξινομούνται σε δυο κατηγορίες: Α) τα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (unilamellar vesicles) και Β) τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (multilamellar vesicles) (Εικόνα 1.7) [Akbarzadeh et al., 2013]. 19

20 Εικόνα 1.7 Ταξινόμηση λιποσωμάτων με βάση το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστοιβάδων τους: μικρά μονοστοιβαδιακά (SUV), μεγάλα μονοστοιβαδιακά (LUV) και πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLV) [Brandl, 2001]. Α) Τα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα αποτελούνται από μια μόνο λιπιδική διπλοστοιβάδα, η οποία περικλείει έναν υδάτινο πυρήνα. Τα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα ανάλογα με το μέγεθός τους διακρίνονται σε: i) μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Small unilamellar vesicles, SUVs). Το μέγεθός τους κυμαίνεται από 20 nm έως 100 nm. Τα SUV λιποσώματα μπορούν να παρασκευαστούν με τις εξής μεθόδους: α) κατεργασία των πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων με υπέρηχους, β) μέθοδο εξώθησης μέσω φίλτρων και γ) μέθοδο ένεσης λιπιδίων. ii) Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Large unilamellar vesicles, LUVs). Το μέγεθος των λιποσωμάτων κυμαίνεται από 100 nm έως 1000 nm. Τα LUV λιποσώματα μπορούν να παρασκευαστούν με τις εξής μεθόδους: α) μέθοδο ένεσης λιπιδίων, β) μέθοδος σύντηξης επαγόμενης από το ασβέστιο και γ) μέθοδο εξάτμισης αντίστροφης φάσης. Στα LUV λιποσώματα, ο υδάτινος πυρήνας που περικλείεται από τη λιπιδική διπλοστοιβάδα έχει μεγάλο όγκο. Για το λόγο αυτό, τα LUVs χρησιμοποιούνται για τον εγλωβισμό υδρόφιλων φαρμάκων και μακρομορίων. iii) Γιγαντιαία λιποσώματα (Giant unilamellar vesicles, GUVs). Το μέγεθός τους ξεπερνά το 1 μm [Akbarzadeh et al., 2013; Nikhil et al., 2012]. 20

21 Β) Τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar vesicles, MLVs) αποτελούνται από πολλές (περισσότερες από 2-3) λιπιδικές διπλοστοιβάδες, οι οποίες διαχωρίζονται μεταξύ τους με υδατικά μεσοδιαστήματα. Πρακτικά, τα MLVs αποτελούνται από πολλά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα ελαττούμενου μεγέθους, που το ένα βρίσκεται στο εσωτερικό του άλλου. Με τον τρόπο αυτό, σχηματίζεται μια πολυστοιβαδιακή δομή από ομόκεντρες φωσφολιπιδικές σφαίρες. Το μέγεθος των MLVs υπερβαίνει τα 0.5 μm. Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την παρασκευή των πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων είναι η μέθοδος ενυδάτωσης λεπτού λιπιδικού υμενίου [Akbarzadeh et al., 2013; Nikhil et al., 2012] Μέθοδοι παρασκευής των λιποσωμάτων Οι μέθοδοι παρασκευής των λιποσωμάτων είναι πολλές. Η επιλογή της πιο κατάλληλης μεθόδου εξαρτάται από τις ακόλουθες παραμέτρους: α) τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τόσο των λιπιδικών συστατικών όσο και της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί στα λιποσώματα, β) το μέγεθος, τον αριθμό των διπλοστοιβάδων των λιποσωμάτων και την πολυδιασπορά που επιθυμείται, γ) τη φυσική σταθερότητα των λιποσωμάτων που πρόκειται να δημιουργηθούν (λιπιδική σύσταση), δ) το επιθυμητό ποσοστό εγκλωβισμού της βιοδραστικής ένωσης (το οποίο έχει να κάνει με το μέγεθος των λιποσωμάτων και την τοξικότητα της ένωσης) και ε) το μέγεθος της παρτίδας παραγωγής, δηλαδή αν πρόκειται για μεγάλης (βιομηχανικής) ή μικρής κλίμακας παραγωγή [Dua et al., 2012]. Όλες οι μέθοδοι παρασκευής των λιποσωμάτων περιλαμβάνουν τέσσερα βασικά στάδια, τα οποία είναι: α) ξήρανση των λιπιδίων, η οποία επιτυγχάνεται με την απομάκρυνση του οργανικού διαλύτη στον οποίο είναι διαλυμένα τα λιπίδια, β) διασπορά των λιπιδίων σε υδατικό μέσο και σχηματισμός λιποσωμάτων, γ) καθαρισμός του προκύπτοντος λιποσώματος (απομάκρυνση της ένωσης που δεν εγκλωβίστηκε στα λιποσώματα) και δ) χαρακτηρισμός 21

22 (φυσικοχημικός) του τελικού προϊόντος (όπως προσδιορισμός λιπιδικής συγκέντρωσης των λιποσωμάτων) [Antimisiaris et al., 2008] Μέθοδος ενυδάτωσης λεπτού λιπιδικού υμενίου (Thin-film hydration method) Η μέθοδος της ενυδάτωσης του λεπτού υμενίου (μέθοδος του Bangham) είναι η πιο κοινή και απλή μέθοδος για την παρασκευή MLV λιποσωμάτων. Στη μέθοδο αυτή τα λιπίδια διαλύονται σε οργανικό διαλύτη (χλωροφόρμιο, διχλωρομεθάνιο) ή σε μίγμα οργανικών διαλυτών (μίγμα χλωροφορμίου/ μεθανόλης) και το προκύπτον διάλυμα προστίθεται σε σφαιρική φιάλη. Όταν ο οργανικός διαλύτης εξατμίζεται, τα λιπίδια αποτίθενται στο εσωτερικό τοίχωμα της σφαιρικής φιάλης και με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται λεπτό λιπιδικό υμένιο. Στη συνέχεια, για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα οργανικών διαλυτών, διοχετεύεται ρεύμα αζώτου στη σφαιρική φιάλη. Έπειτα, ακολουθεί η ενυδάτωση του λιπιδικού υμενίου. Στο στάδιο αυτό προστίθεται υδατικό διάλυμα (νερό, ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ή διάλυμα της βιοδραστικής ένωσης που πρόκειται να εγκλωβιστεί στα λιποσώματα) στα λιπίδια. Το υμένιο αποκολλάται από το τοίχωμα της σφαιρικής φιάλης με μηχανική ανάδευση (vortex) και λαμβάνεται μια θολερή λιποσωμική διασπορά αποτελούμενη από MLV λιποσώματα. Η μείωση του μεγέθους των λιποσωμάτων και η δημιουργία ομοιογενούς πληθυσμού λιποσωμάτων επιτυγχάνεται με λουτρό ή ακίδα υπερήχων, με τη μέθοδο εξώθησης μέσω φίλτρων. Τέλος, πραγματοποιείται η διαδικασία της ομαλοποίησης (annealing), κατά την οποία τα λιποσώματα παραμένουν σε υδατόλουτρο για περίπου μια ώρα, σε θερμοκρασία T > T m. Τα κυριότερα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι: α) χαμηλή απόδοση εγκλωβισμού, β) τα λιποσώματα της MLV διασποράς που παράγεται (με τη μέθοδο αυτή) παρουσιάζουν ετερογένεια ως προς το μέγεθός τους [Nikhil et al., 2012; Popovska et al., 2013]. 22

23 Μέθοδος χρήσης υπερήχων (Sonication method) Η μέθοδος χρήσης υπερήχων είναι η πιο συχνή μέθοδος για την παρασκευή SUV λιποσωμάτων. Τα MLV λιποσώματα εκτίθενται σε υπέρηχους, μειώνεται το μέγεθός τους (και ο αριθμός των διπλοστοιβάδων τους) και λαμβάνονται SUV λιποσώματα. Τα κυριότερα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι: α) χαμηλή απόδοση εγκλωβισμού, β) πιθανή αποικοδόμηση των φωσφολιπιδίων και των συστατικών που πρόκειται να εγκλωβιστούν στα λιποσώματα, γ) μεταλλική επιμόλυνση του δείγματος (λιποσωμικής διασποράς) από την ακίδα υπερήχων [Akbarzadeh et al., 2013]. Υπάρχουν δυο τύποι υπερήχων: Α) ακίδα υπερήχων και Β) λουτρό υπερήχων. Α) Ακίδα υπερήχων: Σε αυτόν τον τύπο υπερήχων, μια ακίδα τιτανίου τοποθετείται μέσα στη λιποσωμική διασπορά. Η ακίδα παρέχει στη (λιποσωμική) διασπορά υψηλή ενέργεια, αυξάνοντας τη θερμοκρασία της. Για το λόγο αυτό, ο περιέκτης (μέσα στον οποίο περιέχεται το λιποσώμα) πρέπει να τοποθετείται μέσα σε νερό ή πάγο. Η ακίδα απελευθερώνει σωματίδια τιτανίου μολύνοντας τη λιποσωμική διασπορά. Τα σωματίδια τιτανίου απομακρύνονται με φυγοκέντρηση. Β) Λουτρό υπερήχων: Η σφαιρική φιάλη που περιέχει τη λιποσωμική διασπορά τοποθετείται σε λουτρό υπερήχων. Συνεπώς, τα λιποσώματα δεν εκτίθενται άμεσα στους υπέρηχους. Το λουτρό υπερήχων χρησιμοποιείται κυρίως για μεγάλους όγκους λιπιδίων [Akbarzadeh et al., 2013] Μέθοδος εξώθησης μέσω φίλτρων (High pressure Extrusion method) Τα MLV λιποσώματα διέρχονται/ εξωθούνται επαναλαμβανόμενα μέσω φίλτρων. Τα φίλτρα αυτά φέρουν πόρους συγκεκριμένης διαμέτρου. Με τον τρόπο αυτό, μειώνεται το μέγεθος των λιποσωμάτων και τα προκύπτοντα λιποσώματα παρουσιάζουν ομοιομορφία μεγέθους. Η μέθοδος αυτή παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα. Είναι γρήγορη, απλή, παρέχει επαναλήψιμα αποτελέσματα και τα προκύπτοντα λιποσώματα είναι αρκετά 23

24 μεγαλύτερα από τα SUV λιποσώματα που έχουν προκύψει με τη χρήση ακίδας υπερήχων. Ένα βασικό μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι οι μεγάλοι όγκοι λιποσωμάτων παρουσιάζουν δυσκολία στο χειρισμό [Nikhil et al., 2012; Popovska et al., 2013] Μέθοδος εξάτμισης αντίστροφης φάσης (Reverse-Phase Evaporation method) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την παρασκευή LUV λιποσωμάτων από έναν μεγάλο αριθμό λιπιδίων. Το λιπιδικό μίγμα (φωσφατιδυλοχολίνη, χοληστερόλη) το οποίο είναι διαλυμένο σε μίγμα χλωροφορμίου/ μεθανόλης, αποτίθεται στο (εσωτερικό) τοίχωμα σφαιρικής φιάλης, όταν εξατμίζονται οι οργανικοί διαλύτες. Στη συνέχεια, το λιπιδικό υμένιο επαναδιαλύεται, χρησιμοποιώντας οργανικούς διαλύτες όπως ισοπροπυλαιθέρας και/ ή διαιθυλαιθέρας. Οι διαλύτες αυτοί είναι μη αναμίξιμοι με το νερό. Έπειτα, προστίθεται η υδατική φάση (ρυθμιστικό διάλυμα, διάλυμα της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί) και με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα διφασικό σύστημα. Με την εφαρμογή υπερήχων το διφασικό σύστημα μετατρέπεται σε γαλάκτωμα νερού σε έλαιο. Τέλος, η σφαιρική φιάλη τοποθετείται ξανά σε περιστροφικό εξατμιστήρα και ο οργανικός διαλύτης απομακρύνεται, κάτι που οδηγεί στο σχηματισμό των λιποσωμάτων (που περιέχουν το διάλυμα της προς εγκλωβισμό ουσίας). Το συγκριτικό πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου σε σχέση με τη μέθοδο ενυδάτωσης λιπιδικού υμενίου είναι ότι επιτυγχάνονται υψηλά ποσοστά εγκλωβισμού δραστικής ουσίας. Τα κυριότερα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι: α) έκθεση των συστατικών που πρόκειται να εγκλωβιστούν στα λιποσώματα σε οργανικούς διαλύτες και υπέρηχους και β) ότι τα λιποσώματα που σχηματίζονται, παρουσιάζουν ετερογένεια ως προς το μέγεθός τους [Akbarzadeh et al., 2013; Traikia et al., 2000] Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων 24

25 Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του μέσου μεγέθους (και της κατανομής του μεγέθους), του σχήματος, της μορφολογίας της επιφάνειας καθώς και του ηλεκτρικού επιφανειακού φορτίου των λιποσωμάτων (φυσικές παράμετροι). Επιπλέον, περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της (φωσφο)λιπιδικής συγκέντρωσης των λιποσωμάτων (χημική παράμετρος) [Popovska et al., 2013]. Η φαρμακοκινητική (βιοκατανομή, μεταβολισμός και απέκκριση) των λιποσωμάτων των λιποσωμικών παρασκευασμάτων εξαρτάται από το μέγεθος, το σχήμα και το επιφανειακό φορτίο των λιποσωμάτων [Xia et al., 2014]. Παρακάτω περιγράφονται τεχνικές για τον προσδιορισμό του μεγέθους, του σχήματος και του επιφανειακού ηλεκτρικού φορτίου των λιποσωμάτων Προσδιορισμός μέσου μεγέθους και κατανομής του μεγέθους των λιποσωμάτων Η τεχνική της δυναμικής σκέδασης του φωτός (Dynamic light scattering, DLS) ή αλλιώς φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων ανήκει στις τεχνικές σκέδασης του φωτός και χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του μέσου μεγέθους (υδροδυναμική διάμετρος) και της κατανομής του μεγέθους (πολυδιασπορά) των λιποσωμάτων. Η βασική αρχή της τεχνικής είναι η εξής: Μονοχρωματική ακτινοβολία σκεδάζεται από τα σωματίδια (λιποσώματα), τα οποία είναι εναιωρημένα (διεσπαρμένα) σε ένα μέσο διασποράς. Ένας ανιχνευτής μετράει την ένταση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας. Η τεχνική DLS μετρά της διακυμάνσεις στην ένταση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας και τις χρησιμοποιεί για τον υπολογισμό του μεγέθους των σωματιδίων. Η ένταση της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας μεταβάλλεται με το χρόνο επειδή τα σωματίδια κινούνται (αλλάζουν θέσεις) συνεχώς εξαιτίας της κίνησης Brownian (δηλαδή της κίνησης των σωματιδίων εξαιτίας των συνεχών και τυχαίων συγκρούσεών τους με τα μόρια του μέσου διασποράς που τα περιβάλλουν). Η ανάλυση αυτών των διακυμάνσεων της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας επιτρέπει τον προσδιορισμό των συντελεστών 25

26 διάχυσης των σωματιδίων (λιποσωμάτων), οι οποίοι συσχετίζονται με το μέγεθος (υδροδυναμική διάμετρος) των λιποσωμάτων μέσω της εξίσωσης Stokes- Einstein. Επιπλέον, με την τεχνική αυτή προσδιορίζεται ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI), ο οποίος λαμβάνει τιμές από το 0 έως το 1. Όταν ο PDI ενός δείγματος (μιας λιποσωμικής διασποράς) παίρνει υψηλές τιμές (πλησιάζει τη μονάδα), τότε πρόκειται για ένα δείγμα που παρουσιάζει πολυδιασπορά, δηλαδή τα λιποσώματα της διασποράς (του δείγματος) παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια ως προς το μέγεθος Τεχνικές μορφολογικού χαρακτηρισμού των λιποσωμάτων- Ηλεκτρονική μικροσκοπία Η ηλεκτρονική μικροσκοπία είναι μια από τις πιο σύγχρονες μεθόδους ανάλυσης που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του μεγέθους, του σχήματος και της μορφολογίας της επιφάνειας των σωματιδίων. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είναι ένα όργανο που λειτουργεί χρησιμοποιώντας δέσμη ηλεκτρονίων αντί για φως (όπως το οπτικό μικροσκόπιο) και έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα από το οπτικό μικροσκόπιο. Η αρχή λειτουργίας του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης περιγράφεται παρακάτω. Αρχικά παράγεται μια δέσμη ηλεκτρονίων από νήμα βολφραμίου, η οποία επιταχύνεται από ηλεκτρικό πεδίο και εστιάζεται σε ένα σημείο του (προς μελέτη) δείγματος (του οποίου η επιφάνεια επικαλύπτεται με χρυσό - Au) με τη βοήθεια δυο ηλεκτρομαγνητικών φακών. Το όλο σύστημα βρίσκεται σε θάλαμο κενού που επιτυγχάνεται με τη χρήση δυο τουλάχιστον αντλιών. Η δέσμη ηλεκτρονίων προσπίπτει στην επιφάνεια του δείγματος (σαρώνει μια περιοχή της επιφάνειας του δείγματος) και αλληλεπιδρά με αυτό. Ως αποτέλεσμα αυτής της αλληλεπίδρασης παράγονται διάφορα σήματα, όπως δευτερογενή και οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια. Τα ηλεκτρόνια αυτά συλλέγονται από τον ανιχνευτή (διαφορετικός ανιχνευτής για κάθε είδος ηλεκτρονίων), ο οποίος φέρει κατάλληλο σύστημα που μετατρέπει κάθε 26

27 ηλεκτρόνιο σε φωτόνιο. Τα φωτόνια οδηγούνται σε έναν φωτοπολλαπλασιαστή όπου και παίρνουν τη μορφή ηλεκτρικών παλμών, οι οποίοι ενισχύονται από έναν ενισχυτή σήματος και χρησιμοποιούνται για να διαμορφώσουν τη φωτεινότητα ενός καθοδικού σωλήνα. Στην οθόνη του καθοδικού σωλήνα παράγεται η εικόνα. Η εικόνα που παράγεται είναι ασπρόμαυρη, δηλαδή αποτελείται από φωτεινές και σκοτεινές περιοχές. Οι ανοιχτόχρωμες περιοχές αντιστοιχούν σε περιοχές του δείγματος στις οποίες τα ηλεκτρόνια της προσπίπτουσας δέσμης ηλεκτρονίων σκεδάζονται εντονότερα, δηλαδή σε περιοχές του δείγματος μεγάλου πάχους (προεξοχές- περιοχές στις οποίες υπάρχουν λιποσώματα) καθώς και σε περιοχές του δείγματος που περιέχουν στοιχεία μεγάλου ατομικού αριθμού. Οι σκοτεινόχρωμες περιοχές αντιστοιχούν σε εσοχές της επιφάνειας του δείγματος. Παρόμοια τεχνική είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (transmission electron microscopy, TEM). Σε αυτήν, τα ηλεκτρόνια της προσπίπτουσας δέσμης που διαπερνούν το δείγμα οδηγούνται με τη βοήθεια συγκεντρωτικών φακών στη φθορίζουσα οθόνη, στην οποία σχηματίζεται το είδωλο. Συνεπώς, το ΤΕΜ μπορεί να σχηματίσει είδωλα πολύ λεπτών δειγμάτων μέσα από τα οποία μπορούν να διέλθουν ηλεκτρόνια. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης παγωμένης κατάτμησης (Freeze- fracture TEM, FFTEM) είναι τύπος ΤΕΜ. Σε αυτήν, το προς ανάλυση δείγμα ψύχεται ταχέως με υγρό άζωτο. Το παγωμένο δείγμα κατατέμνεται με μικροτόμο και η επιφάνειά του επικαλύπτεται με Pt. Έπειτα, το δείγμα βομβαρδίζεται με δέσμη ηλεκτρονίων. Με την FFTEM λαμβάνονται μορφολογικές και δομικές πληροφορίες για το δείγμα. Η τεχνική αυτή έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των λιποσωμάτων, των υδρογελών και λιποσωμικών γελών Προσδιορισμός ζ-δυναμικού των λιποσωμάτων Η παρουσία ηλεκτρικού φορτίου στην επιφάνεια των σωματιδίων (λιποσωμάτων) επηρεάζει την κατανομή των γειτονικών ιόντων στο πολικό μέσο διασποράς. Ειδικότερα, ιόντα με αντίθετο φορτίο προς το επιφανειακό 27

28 φορτίο των σωματιδίων έλκονται από την επιφάνεια του σωματιδίου, ενώ ιόντα ομώνυμου φορτίου απωθούνται από την επιφάνεια του σωματιδίου. Συνεπώς, τα ιόντα κατανέμονται κατά συγκεκριμένο τρόπο από τη φορτισμένη επιφάνεια του σωματιδίου μέχρι και την κύρια μάζα του διαλύματος, σχηματίζοντας έτσι μια ηλεκτρική διπλοστοιβάδα. Η ηλεκτρική διπλοστοιβάδα αποτελείται από δυο τμήματα: α) το διάχυτο τμήμα της διπλοστοιβάδας και β) το εσωτερικό τμήμα της διπλοστοιβάδας (στοιβάδα Stern). Τα τμήματα αυτά χωρίζονται μεταξύ τους με ένα νοητό διαχωριστικό επίπεδο το οποίο ονομάζεται επίπεδο Stern (το οποίο ταυτίζεται με το εσωτερικό επίπεδο Helmholtz). Το εσωτερικό τμήμα της διπλοστοιβάδας περιλαμβάνει τα ιόντα, τα οποία είναι προσκολλημένα/ προσροφημένα στη φορτισμένη επιφάνεια του σωματιδίου. Μετά το στρώμα των προσροφημένων ιόντων ακολουθεί ένα στρώμα εφυδατωμένων ιόντων (το σύνολο των κέντρων των ιόντων αυτών αποτελεί το εξωτερικό επίπεδο Helmholtz). Η διαφορά δυναμικού μεταξύ του επιπέδου ολίσθησης και της κύριας μάζας του διαλύματος ονομάζεται ζ-δυναμικό (Εικόνα 1.8). Εικόνα 1.8 Σχηματική παρουσίαση ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας και ζ-δυναμικό. 28

29 Η τιμή του ζ-δυναμικού παρέχει μια ένδειξη για τη σταθερότητα του κολλοειδούς συστήματος (λιποσωμικής διασποράς). Η τιμή του ζ-δυναμικού εξαρτάται από: α) τη φωσφολιπιδική σύσταση των λιποσωμάτων και β) το μέσο στο οποίο διασπείρονται τα λιποσώματα. Εάν τα διεσπαρμένα σωματίδια έχουν χαμηλές τιμές (κατά απόλυτη τιμή) ζ-δυναμικού, τότε αυτά τείνουν να συσσωματώνονται. Αντίθετα, όταν τα σωματίδια έχουν υψηλές τιμές (κατά απόλυτη τιμή) ζ-δυναμικού τείνουν να απωθούνται και με τον τρόπο αυτό να δημιουργούνται σταθερά κολλοειδή συστήματα (σταθερές λιποσωμικές διασπορές). Το ζ-δυναμικό μπορεί να προσδιοριστεί με τη μέθοδο της μικροηλεκτροφόρησης. Η μικροηλεκτρόφορηση περιλαμβάνει την κίνηση φορτισμένων σωματιδίων μέσα σε ένα στάσιμο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρμοζόμενης διαφοράς δυναμικού. Για τη μέτρηση του ζ- δυναμικού χρησιμοποιείται μια κυψελίδα, η οποία φέρει δυο ηλεκτρόδια στα οποία εφαρμόζεται διαφορά δυναμικού. Εξαιτίας της διαφοράς δυναμικού τα φορτισμένα σωματίδια κινούνται προς το ηλεκτρόδιο αντίθετου φορτίου. Η ταχύτητα μετακίνησης κάθε φορτισμένου σωματιδίου προσδιορίζεται με την τεχνική της φασματοσκοπίας συσχέτισης φωτονίων. Από την ταχύτητα μετακίνησης του φορτισμένου σωματιδίου και με τη βοήθεια της εξίσωσης Helmholtz Smolukowski μπορεί να προσδιοριστεί η τιμή του ζ-δυναμικού του φορτισμένου σωματιδίου (λιποσώματος):, όπου, u (cm/ sec) η ταχύτητα μετακίνησης του φορτισμένου σωματιδίου (λιποσώματος) στην κυψελίδα ηλεκτροφόρησης, n (dyne sec/cm -1 ) το ιξώδες του μέσου διασποράς, ε η διηλεκτρική σταθερά του μέσου διασποράς και Ε (V/cm) η ένταση του δυναμικού που εφαρμόζεται Εφαρμογές των λιποσωμάτων στη χορήγηση φαρμάκων Τα λιποσώματα ανήκουν στους νανοφορείς μεταφοράς και χορήγησης θεραπευτικών παραγόντων. Άλλοι νανοφορείς είναι: μικκύλια, δενδριμερή, 29

30 πολυμερικά νανοσωματίδια, νανοσωλήνες άνθρακα και μεταλλικά νανοσωματίδια. Οι συμβατικοί θεραπευτικοί παράγοντες παρουσιάζουν προβλήματα όπως χαμηλή υδατική διαλυτότητα, ευαισθησία στις πρωτεάσες του πλάσματος, έλλειψη εκλεκτικότητας (κατανομή και δράση σε υγιείς και πάσχοντες ιστούς) και χαμηλό θεραπευτικό δείκτη. Τα προβλήματα αυτά μπορούν να περιοριστούν σημαντικά αν τα φαρμακομόρια εγκλωβιστούν μέσα σε έναν νανοφορέα [Xia et al., 2014]. Ακολουθεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα εφαρμογής των λιποσωμάτων στην αντικαρκινική θεραπεία. Η δοξορουβικίνη είναι ένα από τα πιο σημαντικά και ευρέως χρησιμοποιούμενα αντικαρκινικά φάρμακα. Αναστέλλει τη σύνθεση του DNA παρεμβαίνοντας ανάμεσα σε γειτονικά ζεύγη βάσεων της διπλής έλικας του DNA. Η δοξορουβικίνη σκοτώνει τα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα, χωρίς να κάνει διάκριση μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων (φυσιολογικά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται γρήγορα: κύτταρα στους θύλακες της τρίχας, κύτταρα του στοματικού και γαστρεντερικού βλεννογόνου και κύτταρα του μυελού των οστών). Συνεπώς, εξαιτίας αυτής της έλλειψης εκλεκτικότητας της δοξορουβικίνης προς τα καρκινικά κύτταρα παρουσιάζονται ανεπιθύμητες ενέργειες όπως αλωπεκία, στοματίτιδα, γαστρεντερικές διαταραχές. Η πιο σοβαρή ανεπιθύμητη ενέργεια της δοξορουβικίνης είναι η μη αναστρέψιμη και δοσοεξαρτώμενη καρδιοτοξικότητα. Η ενκαψακίωση της δοξορουβικίνης σε λιποσώματα, τα οποία είναι επικαλυμμένα με μεθόξυ πολυαιθυλενογλυκόλη (σκεύασμα με εμπορική ονομασία Doxil ) πραγματοποιήθηκε για να μειωθεί η τοξικότητα της συμβατικής δοξορουβικίνης. Εξαιτίας του φαινομένου της αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης (EPR effect of enhanced permeability and retention) καθώς και του μεγέθους των λιποσωμάτων, τα λιποσώματα εξαγγειώνονται εκλεκτικά στην περιοχή του καρκινικού όγκου και απελευθερώνουν τη δοξορουβικίνη. Ειδικότερα, μεταξύ των γειτονικών ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων που αιματώνουν τον όγκο υπάρχουν κενά (αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα) μέσα από τα οποία διέρχονται τα 30

31 λιποσώματα κατάλληλου μεγέθους και καταλήγουν στον όγκο. Επιπλέον, το λεμφικό σύστημα του όγκου είναι δυσλειτουργικό και επομένως τα λιποσώματα συσσωρεύονται στον καρκινικό ιστό (αυξημένη συγκράτηση). Συνεπώς, μεγαλύτερη ποσότητα δοξορουβικίνης θα μεταφέρεται στα καρκινικά κύτταρα και λιγότερη στα φυσιολογικά. Αυτό έχει ως συνέπεια να περιορίζονται οι ανεπιθύμητες ενέργειες της δοξορουβικίνης [Xia et al., 2014]. Οι αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης που επικαλύπτουν την επιφάνεια των λιποσωμάτων, τα οποία περιέχουν τη δοξορουβικίνη, τα προστατεύουν από οψωνινοποίηση (επικάλυψη λιποσωμάτων με πρωτεΐνες του συμπληρώματος και ανοσοσφαιρίνες) και φαγοκυττάρωση. Αυτό έχει ως συνέπεια να παρατείνεται η παραμονή των λιποσωμάτων στην κυκλοφορία του αίματος [Xia et al., 2014]. 1.2 Γέλες- Υδρογέλες Εισαγωγή στις υδρογέλες Οι όροι γέλη και υδρογέλη δεν είναι ταυτόσημοι. Παρόλο που τόσο οι γέλες όσο και οι υδρογέλες είναι δίκτυα πολυμερών, παρουσιάζουν ορισμένες διαφορές. Οι υδρογέλες συχνά περιγράφονται ως υδατοειδείς γέλες (δηλαδή γέλες που περιέχουν νερό). Οι γέλες είναι ημιστερεά συστήματα, αποτελούμενα από μικρές ποσότητες στερεού (πολυμερούς), διεσπαρμένες σε σχετικά μεγάλες ποσότητες υγρού. Ωστόσο οι γέλες παρουσιάζουν χαρακτήρα στερεού. Οι υδρογέλες είναι τρισδιάστατα δίκτυα υδρόφιλων/ υδατοδιαλυτών πολυμερών. Οι μακρομοριακές αλυσίδες των πολυμερών διασυνδέονται μεταξύ τους είτε με ομοιοπολικούς είτε με μη-ομοιοπολικούς δεσμούς και με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται το τρισδιάστατο δίκτυο [Gioffredi et al., 2016]. Οι υδρογέλες έχουν την ικανότητα να απορροφούν και να συγκρατούν μεγάλες ποσότητες νερού κάτι που οφείλεται στις πολικές/ υδρόφιλες ομάδες (όπως υδροξυλομάδες, καρβοξυλομάδες, αμινομάδες) των πολυμερών [Ganji et al., 2010]. Η απορρόφηση νερού έχει ως αποτέλεσμα τη διόγκωση του 31

32 πολυμερικού δικτύου της υδρογέλης, το οποίο ωστόσο διατηρεί την τρισδιάστατη δομή του. Συνεπώς, οι υδρογέλες είναι αδιάλυτες στο νερό, κάτι που μπορεί να αποδοθεί στις διασυνδέσεις μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων [Ahmed, 2013]. Αντίθετα, οι γέλες είναι ήδη διογκωμένα τρισδιάστατα δίκτυα πολυμερών και η οποιαδήποτε προσθήκη υγρού (σε αυτές) έχει ως αποτέλεσμα τη διάλυση του δικτύου και όχι τη διόγκωσή του. Εάν η υδρογέλη αποβάλλει μέρος του νερού που περιέχει, τότε συρρικνώνεται. Αν απομακρυνθεί ολόκληρη η ποσότητα του νερού από την υδρογέλη, τότε παραμένει μόνο το πολυμερικό πλέγμα και η υδρογέλη ονομάζεται xerogel. Παράγοντες σχηματισμού γέλης (gelling agents): Ορισμένα πολυμερή (φυσικά, ημισυνθετικά, συνθετικά) τα οποία σχηματίζουν υδρογέλες, όταν αυτά διαλυθούν στο νερό (συνήθως 1% πολυμερές και 99% νερό), είναι: ζελατίνη, χιτοζάνη, άμυλο, παράγωγα κυτταρίνης (όπως μεθυλοκυτταρίνη, υδροξυπρόπυλοκυτταρίνη), αλγινικό νάτριο, πολυβινυλική αλκοόλη και πολυαιθυλενογλυκόλη [Grijalvo et al., 2016]. Οι υδρογέλες χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων. Η πορώδης δομή τους (που οφείλεται στην ύπαρξη κενού χώρου ανάμεσα στις πολυμερικές αλυσίδες του πλέγματος) επιτρέπει την ενσωμάτωση φαρμάκων στην πολυμερική μήτρα [Calό et al., 2015]. Η απελευθέρωση του φαρμάκου από τις υδρογέλες εξαρτάται από πολλούς παράγοντες και μπορεί να ρυθμιστεί κατάλληλα. Παρακάτω παρουσιάζονται ορισμένα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των υδρογελών στη θεραπευτική (Πίνακας 1.2.1). Πίνακας 1.2.1: Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των υδρογελών ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων [Hoare et al., 2008]. Πλεονεκτήματα υδρογελών Μειονεκτήματα υδρογελών Βιοσυμβατότητα, που οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα των υδρογελών σε νερό και στη φυσικοχημική ομοιότητά Δυσκολία ενσωμάτωσης υδρόφοβων φαρμάκων στην υδρογέλη, εξαιτίας της εγγενούς ασυμβατότητας μεταξύ του 32

33 τους με το εξωκυτταρικό υλικό. Βιοαποικοδομησιμότητα, όταν οι υδρογέλες σχηματίζονται από βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή. Ο σχηματισμός της υδρογέλης μπορεί να πυροδοτηθεί από κάποιο εξωτερικό περιβαλλοντικό ερέθισμα (όπως μεταβολή ph, θερμοκρασίας, ιοντικής ισχύος). Εύκολη εφαρμογή των υδρογελών (είναι σχετικά ελαστικές/ εύπλαστες) και συγκράτησή/ προσκόλλησή τους σε επιφάνειες και κοιλότητες του ανθρώπινου σώματος. υδρόφιλου πλέγματός της και του υδρόφοβου φαρμάκου. Γρήγορη απελευθέρωση από την πολυμερική μήτρα των υδρόφιλων φαρμάκων μικρού μοριακού βάρους [Gariepy et al., 2004]. Πολλές υδρογέλες εισάγονται στο σώμα χειρουργικά, διότι δεν είναι αρκετά εύπλαστες για να χορηγηθούν με ένεση Ταξινόμηση υδρογελών Οι υδρογέλες μπορούν να ταξινομηθούν με βάση ορισμένα χαρακτηριστικά, όπως: τη μέθοδο παρασκευής τους, το φορτίο, τη δομή τους, τη φύση των δεσμών μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων του πλέγματος και το πορώδες τους [Grijalvo et al., 2016]. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 1.2.2) εξετάζονται μερικά κριτήρια κατάταξης των υδρογελών. 33

34 Πίνακας 1.2.2: Κατηγορίες υδρογελών [Ahmed, 2015; Ganji et al., 2010; Garg et al., 2016; Gioffredi et al., 2016; Jeong et al., 2012; Rizwan et al., 2017]. Ταξινόμηση υδρογελών Κριτήριο κατάταξης υδρογέλης Κατηγορίες Περιγραφή κατηγορίας- παράδειγμα Μέθοδος παρασκευής (ή η πολυμερική σύσταση) των υδρογελών Υδρογέλες ομοπολυμερών (homopolymeric hydrogels) Υδρογέλες συμπολυμερών (copolymeric hydrogels) Υδρογέλες πολυμερικής ενδοδιείσδυσης δικτύων (interpenetrating polymeric networks, IPNs) Αποτελούνται από ένα είδος υδρόφιλου πολυμερούς (όπως υδρογέλες PNIPAm). Αποτελούνται από δυο ή περισσότερα διαφορετικά είδη πολυμερών, από τα οποία το ένα τουλάχιστον είναι υδρόφιλο (όπως υδρογέλες PEO-PPO-PEO/ Pluronics). Αποτελούνται από δυο διαφορετικά διασταυρωμένα/ δικτυωτά πολυμερή (δικτυωτό πολυμερές: διάκριση πολυμερούς με βάση την αρχιτεκτονική της πολυμερικής αλυσίδας), τα οποία συγκρατούνται σε ένα δίκτυο/ πλέγμα. Φύση των δεσμών μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων του πλέγματος της υδρογέλης Φυσικές ή αναστρέψιμες υδρογέλες (physical or reversible hydrogels) Οι πολυμερικές αλυσίδες διασυνδέονται μεταξύ τους μέσω μηομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων όπως: δυνάμεις Van der Waals, ιοντικές αλληλεπιδράσεις, δεσμοί υδρογόνου. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι ασθενείς και μπορούν να διαταραχθούν με εφαρμογή πίεσης στο πολυμερικό δίκτυο ή αλλάζοντας τις συνθήκες (ph, θερμοκρασία, ιοντική ισχύς) του εξωτερικού περιβάλλοντος της υδρογέλης. 34

35 Διόγκωση υδρογελών προκαλούμενη από ερέθισμα Χημικές ή μόνιμες υδρογέλες (chemical or permanent hydrogels) Συμβατικές υδρογέλες (conventional hydrogels) Ευαίσθητες σε ερεθίσματα υδρογέλες (stimuli-sensitive hydrogels) Οι πολυμερικές αλυσίδες της υδρογέλης διασυνδέονται μεταξύ τους μέσω ομοιοπολικών δεσμών. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι ισχυρές και οδηγούν σε υδρογέλες με καλές μηχανικές ιδιότητες (μηχανική αντοχή). - Διογκώνονται ή συρρικνώνονται αποκρινόμενες σε κάποια μεταβολή του εξωτερικού περιβάλλοντος (δηλαδή μεταβολή στο ph, τη θερμοκρασία, την ιοντική ισχύ) της υδρογέλης (όπως ph-ευαίσθητες υδρογέλες). 35

36 1.2.3 Μηχανισμοί παρασκευής υδρογέλης/ Τρόποι διασύνδεσης πολυμερικών αλυσίδων Ο σχηματισμός της υδρογέλης μπορεί να πραγματοποιηθεί με φυσική ή χημική διασύνδεση των αλυσίδων του πολυμερούς. Η φυσική διασύνδεση των πολυμερικών αλυσίδων επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας μια ποικιλία ερεθισμάτων (όπως αλλαγή ph, θερμοκρασίας) και φυσικοχημικών αλληλεπιδράσεων (όπως υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) (Πίνακας 1.2.3) [Hoare et al., 2008]. Πίνακας 1.2.3: Είδη μη-ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων και παράδειγμα υδρογέλης για κάθε είδος, ερέθισμα που πυροδοτεί την αλληλεπίδραση/ τη διασύνδεση των πολυμερικών αλυσίδων και συνοπτική περιγραφή του φαινομένου [Hoare et al., 2008]. Φυσική διασύνδεση μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων Είδος μη ομοιοπολικής αλληλεπίδρασης Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις Ηλεκτροστατικές/ ιοντικές αλληλεπιδράσεις Δεσμοί υδρογόνου Ερέθισμα Αύξηση θερμοκρασίας Αλλαγή ph του εξωτερικού περιβάλλοντος της υδρογέλης Αλλαγή ph του Περιγραφή φαινομένου Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ υδρόφοβων περιοχών αμφίφιλων πολυμερών. Με την αύξηση της θερμοκρασίας οι υδρόφοβες περιοχές συσσωματώνονται, για να μειωθεί η υδρόφοβη επιφάνεια που εκτίθεται στο νερό. Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ: α) ενός πολυμερούς και ενός ιόντος, που έχουν αντίθετο φορτίο β) δυο αντίθετα φορτισμένων πολυμερών. Ασθενείς δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των πολυμερικών Παράδειγμα υδρογέλης Υδρογέλη PEO-PPO- PEO Υδρογέλη αλγινικού- ασβεστίου Υδρογέλη 36

37 αλυσίδων. Εφαρμογή πίεσης σπάει τους δεσμούς υδρογόνου. εξωτερικού περιβάλλοντος της υδρογέλης ή διαδικασία παγώματοςξεπαγώματος αμύλουκαρβοξυμεθυλοκυτταρίνης Οι πολυμερικές αλυσίδες μπορούν να συνδέονται μεταξύ τους με τη βοήθεια χημικής αντίδρασης (χημική διασύνδεση). Παραδείγματα τέτοιων αντιδράσεων είναι τα εξής: α) αντίδραση μιας αλδεΰδης με μια αμίνη, προς σχηματισμό βάσης Schiff. β) αντίδραση μιας αλδεΰδης με μια υποκατεστημένη υδραζίνη, προς σχηματισμό υδραζόνης και γ) προσθήκη Michael μεταξύ μιας πυρηνόφιλης ομάδας (όπως θειόλη, αμίνη) και μιας ηλεκτρονιόφιλης ομάδας (όπως βινυλομάδα) (Εικόνα 1.9) [Hoare et al., 2008]. Εικόνα 1.9 Χημικές αντιδράσεις μέσω των οποίων μπορούν να διασυνδεθούν οι πολυμερικές αλυσίδες, ώστε να σχηματιστεί υδρογέλη [Hoare et al., 2008] Φυσικές και χημικές ιδιότητες των υδρογελών Η διόγκωση της υδρογέλης, το πορώδες, η βιοσυμβατότητα, οι ρεολογικές και οι μηχανικές ιδιότητες ανήκουν στις φυσικοχημικές ιδιότητες της υδρογέλης 37

38 [Garg et al., 2016]. Παρακάτω περιγράφονται: η διόγκωση της υδρογέλης καθώς και οι ρεολογικές και μηχανικές ιδιότητές της. Α) Διόγκωση υδρογελών Όταν η υδρογέλη έρχεται σε επαφή με το νερό ή με υδατικό διάλυμα, τότε το τρισδιάστατο πολυμερικό δίκτυό της απορροφά νερό και διογκώνεται. Παρακάτω περιγράφεται το φαινόμενο διόγκωσης της υδρογέλης. Η ξερή υδρογέλη απορροφά νερό. Τα πρώτα μόρια του νερού εισέρχονται στη μήτρα της υδρογέλης και ενυδατώνουν τις πιο πολικές, υδρόφιλες ομάδες των πολυμερικών αλυσίδων. Αυτά τα μόρια του νερού αποτελούν το πρωτογενές δεσμευμένο νερό (primary bound water). Καθώς οι πολικές ομάδες ενυδατώνονται, το πλέγμα διογκώνεται και εκθέτει τις υδρόφοβες ομάδες, οι οποίες αλληλεπιδρούν με τα μόρια του νερού. Τα μόρια του νερού που αλληλεπιδρούν με τις υδρόφοβες ομάδες του πλέγματος ονομάζονται δευτερογενές δεσμευμένο νερό (secondary bound water). Το πρωτογενές και το δευτερογενές δεσμευμένο νερό αναφέρονται μαζί ως ολικό δεσμευμένο νερό (total bound water). Μετά την αλληλεπίδραση των μορίων του νερού με τις πολικές και υδρόφοβες ομάδες των πολυμερικών αλυσίδων, το πλέγμα απορροφά επιπλέον νερό με κινητήρια δύναμη την όσμωση, επειδή οι αλυσίδες του πλέγματος τείνουν προς άπειρη διάλυση. Αυτό το επιπρόσθετο νερό διόγκωσης καλείται <<ελεύθερο νερό>> (free water ή bulk water) και γεμίζει το χώρο που υπάρχει ανάμεσα στις πολυμερικές αλυσίδες του πλέγματος. Αυτή η επιπρόσθετη διόγκωση αντιτίθεται στις φυσικές ή χημικές διασυνδέσεις που υπάρχουν μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων, δημιουργώντας μια ελαστική δύναμη ανάκλησης στο πλέγμα. Όταν η οσμωτική δύναμη εξισωθεί με την ελαστική δύναμη ανάκλησης του πλέγματος, τότε η διόγκωση σταματά. Η ποσότητα του νερού μέσα στην υδρογέλη καθορίζει τη μετακίνηση των διαλυμένων ουσιών διαμέσου της υδρογέλης [Garg et al., 2016]. Β) Ρεολογικές και Μηχανικές ιδιότητες των υδρογελών Οι ρεολογικές και μηχανικές ιδιότητες των υδρογελών καθορίζονται σε σημαντικό βαθμό από το βαθμό διασύνδεσης των πολυμερικών αλυσίδων του 38

39 πλέγματος. Όσο αυξάνεται ο βαθμός διασύνδεσης των πολυμερικών αλυσίδων, τόσο μειώνεται η ρευστότητα και η ελαστικότητα των υδρογελών, ενώ αντίθετα αυξάνεται η σκληρότητα και η αντίσταση που προβάλλουν στην παραμόρφωση. Οι υδρογέλες (και γενικότερα οι γέλες) παρουσιάζουν μη νευτώνεια χαρακτηριστικά ροής. Η συμπεριφορά ροής τους καθορίζει τον τύπο του ιξωδομέτρου που θα χρησιμοποιηθεί, ώστε να προσδιοριστούν οι ρεολογικές ιδιότητές τους. Τα ιξωδόμετρα που χρησιμοποιούνται πρέπει να λειτουργούν σε διαφορετικές ταχύτητες μετατόπισης ώστε να λαμβάνονται αρκετά σημεία για να επιτευχθεί ένα πλήρες ρεόγραμμα. Πολλές γέλες είναι θιξότροπα συστήματα. Θιξότροπες είναι οι υδρογέλες των οποίων το ιξώδες μειώνεται (και συνεπώς ξεκινά η ροή), όταν σε αυτές εφαρμόζεται ορισμένη δύναμη (διατμητική τάση). Ωστόσο, όταν σταματήσει να εφαρμόζεται η δύναμη αυτή, το ιξώδες τους αποκαθίσταται, δηλαδή η δομή της υδρογέλης ανακτάται σταδιακά [Zanna et al., 2017]. Η μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων των γελών/ υδρογελών περιλαμβάνει τη μελέτη της συμπεριφοράς τους, όταν σε αυτές εφαρμόζονται δυνάμεις και παραμορφώσεις. Η πιο βασική μηχανική ιδιότητα είναι το μέτρο ελαστικότητας (μέτρο του Young), το οποίο εκφράζει την αντίσταση που προβάλλει το υλικό σε μικρές παραμορφώσεις/ επιμηκύνσεις [Garg et al., 2016] Απελευθέρωση του φαρμάκου από την υδρογέλη Μηχανισμός απελευθέρωσης των μορίων του φαρμάκου από την υδρογέλη Ο κυριότερος μηχανισμός απελευθέρωσης του φαρμάκου από την υδρογέλη είναι η διάχυση. Οι υδρογέλες ανήκουν στα διογκούμενα συστήματα μήτρας. Στα συστήματα αυτά, το φάρμακο διασπείρεται ομοιογενώς στην πολυμερική μήτρα. Όταν τα συστήματα αυτά (υδρογέλες) τοποθετούνται στο σώμα απορροφούν νερό και διογκώνονται. Η διόγκωση προκαλεί αύξηση του 39

40 υδατικού περιεχομένου του συστήματος καθώς και αύξηση του μεγέθους των πόρων μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων, επιτρέποντας στο φάρμακο να διαχυθεί στο περιβάλλον. Παρακάτω περιγράφεται πιο αναλυτικά η απελευθέρωση του φαρμάκου από την υδρογέλη. Οι περισσότερες υδρογέλες είναι υαλώδεις στην αφυδατωμένη (ξηρή) μορφή τους. Τα μόρια του νερού εισέρχονται στο δίκτυο της υδρογέλης. Η περιοχή της υδρογέλης στην οποία εισέρχονται τα μόρια του νερού μεταπίπτει από την υαλώδη (glassy state) σε μια πιο εύκαμπτη κατάσταση, την ελαστόμορφη κατάσταση (rubbery state). Στην υαλώδη κατάσταση τα μόρια του φαρμάκου είναι ακίνητα [Zarzycki et al., 2010]. Στην ελαστόμορφη κατάσταση το μέγεθος των πόρων του πολυμερικού δικτύου αυξάνεται (χαλάρωση των πολυμερικών αλυσίδων). Με τον τρόπο αυτό τα μόρια του νερού εισέρχονται βαθύτερα στην πολυμερική μήτρα. Το νερό διαλύει τα μόρια του φαρμάκου τα οποία διαχέονται/ μετακινούνται μέσω της διογκωμένης μήτρας προς το εξωτερικό περιβάλλον [Lam et al., 2014; Lee, 1985] Παράγοντες που επηρεάζουν την απελευθέρωση του φαρμάκου από την υδρογέλη Ορισμένες παράμετροι που επηρεάζουν τον ρυθμό απελευθέρωσης των φαρμακομορίων από το δίκτυο της υδρογέλης είναι: α) ο βαθμός διόγκωσης της υδρογέλης, β) το μέγεθος των πόρων και οι διασυνδέσεις μεταξύ τους (μεταξύ των πόρων), γ) το μέγεθος του φαρμακομορίου, δ) το είδος και το πλήθος των αλληλεπιδράσεων μεταξύ φαρμάκου και αλυσίδων του πολυμερούς. Η απελεύθερωση του φαρμάκου από την υδρογέλη μπορεί να καθυστερήσει περισσότερο, με τους εξής τρόπους: α) ενισχύοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ φαρμάκου και των πολυμερικών αλυσίδων του πλέγματος της υδρογέλης, β) αυξάνοντας το πλήθος των διασυνδέσεων μεταξύ των πολυμερικών αλυσίδων στο δίκτυο της υδρογέλης. Ο υψηλός βαθμός διασύνδεσης σε μια υδρογέλη καθυστερεί τη διόγκωσή της, η οποία μπορεί να προκαλείται από κάποιο ερέθισμα, γ) εγκλωβίζοντας τα 40

41 μόρια του φαρμάκου σε λιποσώματα και στη συνέχεια τα λιποσώματα διασπείρονται στην υδρογέλη [Hoare et al., 2008; Pachis et al., 2017; Peptu et al., 2008] Εφαρμογές των υδρογελών στη χορήγηση φαρμάκων Οι υδρογέλες χρησιμοποιούνται στην κατασκευή φακών επαφής, ειδών υγιεινής και επιδέσμων για την επούλωση πληγών και εγκαυμάτων. Επιπλέον, αυτές χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική ως συστήματα μεταφοράς φαρμάκων. Τέλος, έχουν μελετηθεί και χρησιμοποιούνται ως ικριώματα (scaffolds) στη μηχανική ιστών (tissue engineering) [Calό et al., 2015]. Οι υδρογέλες χρησιμοποιούνται ως συστήματα για την τοπική χορήγηση φαρμάκων. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα εφαρμογής των υδρογελών στη θεραπευτική είναι οι κολπικές υδρογέλες που προκαλούν τοκετό. Ένα τέτοιο παρασκεύασμα ελεγχόμενης αποδέσμευσης είναι το Cervidil (εμπορική ονομασία). Το σκεύασμα αυτό περιέχει 10 mg δινοπροστόνη (προσταγλανδίνη Ε 2, PGE 2 ), η οποία έχει ενσωματωθεί σε έναν πολυμερικό φορέα. Η δινοπροστόνη προκαλεί διαστολή του τραχήλου της μήτρας, κάτι που αποτελεί το πρώτο στάδιο του τοκετού. Η υδρογέλη (πολυμερικός φορέας) αποτελείται από πολυμερή πολυαιθυλενοξειδίου διαφόρων μοριακών βαρών τα οποία διασυνδέονται μέσω ομάδων ουρεθάνης. Η υδρογέλη διογκώνεται όταν βρεθεί στο υγρό κολπικό περιβάλλον και τότε ξεκινά η απελευθέρωση της δινοπροστόνης. Ο ρυθμός απελευθέρωσης της δινοπροστόνης είναι περίπου 0.3 mg/h (η απελευθέρωση διαρκεί 12 ώρες) [Calό et al., 2015]. Οι υδρογέλες δοκιμάζονται ως φορείς/ συστήματα χορήγησης πρωτεϊνών από το στόμα. Για το σκοπό αυτό έχουν παρασκευαστεί ph ευαίσθητες (ανιονικές) υδρογέλες οι οποίες διογκώνονται (και απελευθερώνουν την πρωτεΐνη) στο ελαφρώς βασικό περιβάλλον του εντέρου. Με τον τρόπο αυτό αποφεύγεται η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης από το όξινο περιβάλλον του στομάχου. Οι Demirdirek et al (2009) συνέθεσαν μια ph ευαίσθητη υδρογέλη ορισμένης σύστασης. Στην υδρογέλη αυτή ενσωμάτωσαν ινσουλίνη 41

42 καθώς και σαλικυλικό οξύ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υδρογέλη αυτή απελευθερώνει το 90% της ινσουλίνης σε υγρό που προσομοιάζει το εντερικό, ενώ απελευθερώνει μόνο 4-8% ινσουλίνης σε υγρό που προσομοιάζει το γαστρικό (όξινο περιβάλλον) [Rizwan et al., 2017]. 1.3 Λιποσωμικές Γέλες Οι λιποσωμικές γέλες μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τη σύστασή τους καθώς και τις μεθόδους παρασκευής τους σε λιποσωμικές υδρογέλες, φωσφολιπιδικές γέλες (VPGs) και μικρογέλες σε λιποσώματα (M-i-L) [Elnaggar et al., 2014]. Παρακάτω περιγράφονται οι κατηγορίες των λιποσωμικών γελών Λιποσωμικές Υδρογέλες Εισαγωγή στις λιποσωμικές υδρογέλες Οι λιποσωμικές υδρογέλες είναι υβριδικά συστήματα που αποτελούνται από λιποσώματα τα οποία διασπείρονται σε υδρογέλες [Grijalvo et al., 2016]. Οι λιποσωμικές υδρογέλες μπορούν να παρασκευαστούν με: α) ενσωμάτωση των λιποσωμάτων σε προσχηματισμένη (πολυμερισμένη) υδρογέλη, αφού πρώτα απομακρυνθεί το ελεύθερο (μη εγκλωβισμένο στα λιποσώματα) φάρμακο. β) προσθήκη παραγόντων σχηματισμού γέλης (δηλαδή υδρόφιλων πολυμερών) στις λιποσωμικές διασπορές (Εικόνα 1.10). Σε αυτήν την περίπτωση δεν απαιτείται απομάκρυνση του ελεύθερου φαρμάκου [Elnaggar et al., 2014]. Εικόνα 1.10 Σχηματισμός λιποσωμικής υδρογέλης [Elnaggar et al., 2014] 42

43 Μορφολογικός και ρεολογικός χαρακτηρισμός των λιποσωμικών υδρογελών Απαιτείται μορφολογικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων πριν και μετά την ενσωμάτωσή τους στο δίκτυο της υδρογέλης. Το μέγεθος των λιποσωμάτων πριν την ενσωμάτωσή τους στην υδρογέλη προσδιορίζεται με την τεχνική DLS (βλέπε ενότητα ), ενώ ο μορφολογικός χαρακτηρισμός τους πραγματοποιείται με τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (βλέπε ενότητα ). Οι λιποσωμικές υδρογέλες (αφού πρώτα αραιωθούν κατάλληλα) μπορούν να μελετηθούν με τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Στις εικόνες που λαμβάνονται από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (για τις λιποσωμικές υδρογέλες) αναγνωρίζονται συνήθως σφαιρικές (ή μη) δομές των οποίων το μέγεθος είναι συγκρίσιμο με εκείνο των λιποσωμάτων (πριν την ενσωμάτωσή τους στο δίκτυο της υδρογέλης). Επιπλέον απαιτείται ρεολογικός χαρακτηρισμός των υδρογελών πριν και μετά την ενσωμάτωση των λιποσωμάτων σε αυτές [El Kechai et al., 2015; Elnaggar et al., 2014; Mourtas et al., 2008, 2009] Απελευθέρωση φαρμάκων από τη λιποσωμική υδρογέλη Όταν παρασκευάζεται μια λιποσωμική υδρογέλη, η πρώτη παράμετρος που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη είναι η τιμή του συντελεστή ελαίου-ύδατος μερισμού του φαρμάκου (τιμή logp) [Mourtas et al., 2007]. Ο συντελεστής αυτός (εκφρασμένος με τη μορφή λογαρίθμου) αποτελεί ένα μέτρο λιποφιλικότητας του φαρμάκου. Α) Απελευθέρωση υδρόφιλων φαρμάκων από τη λιποσωμική υδρογέλη Ο ρυθμός απελευθέρωσης υδρόφιλου φαρμάκου από τη λιποσωμική υδρογέλη εξαρτάται από: α) τη σταθερότητα των λιποσωμάτων (ακεραιότητα λιποσωμικής μεμβράνης), η οποία καθορίζεται από τη λιπιδική σύστασή τους. Ειδικότερα, τα λιποσώματα με σύσταση PC (φωσφατυδιλοχολίνη) είναι λιγότερο σταθερά από τα λιποσώματα σύστασης DSPC/ Chol (1:1 mol/ mol) (DSPC: διστεαροϋλο 43

44 γλυκερο- φωσφατιδυλοχολίνη, Chol: χοληστερόλη). Πράγματι, η καλσεΐνη (υδρόφιλο μόριο που προσομοιάζει ένα υδρόφιλο φάρμακο) όταν εγκλωβίζεται σε λιποσώματα PC, τα οποία διασπείρονται σε υδρογέλη, απελευθερώνεται γρηγορότερα από ότι όταν εγκλωβίζεται σε λιποσώματα DSPC/ Chol. Τα λιποσώματα PC και DSPC/ Chol διασπείρονται στον ίδιο τύπο υδρογέλης. β) τον τύπο (ρεολογική συμπεριφορά) της υδρογέλης, ο οποίος καθορίζει την ευκολία διάχυσης των υδρόφιλων συστατικών διαμέσου του δικτύου της υδρογέλης [Mourtas et al., 2007, 2009]. Β) Απελευθέρωση λιπόφιλων/ αμφίφιλων φαρμάκων από τη λιποσωμική υδρογέλη Ο ρυθμός απελευθέρωσης λιπόφιλου/ αμφίφιλου φαρμάκου από τη λιποσωμική υδρογέλη εξαρτάται από: α) την υδατική διαλυτότητα του φαρμάκου β) την ποσότητα του λιποσώματος (και συνεπώς του φαρμάκου) που ενσωματώνεται στην υδρογέλη [Mourtas et al., 2007, 2009] Λιποσωμικές υδρογέλες ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων Ένα βασικό μειονέκτημα των υδρογελών είναι η ταχεία και ανεξέλεγκτη απελευθέρωση των φαρμάκων (και ιδιαίτερα των υδρόφιλων φαρμάκων μικρού μοριακού βάρους) από το πολυμερικό δίκτυό τους. Αυτή η γρήγορη αποδέσμευση του φαρμάκου αποδίδεται στο υψηλό πορώδες της υδρογέλης και μπορεί να οδηγήσει σε τοξικότητα [Grijalvo et al., 2016]. Ο συνδυασμός των δυο τεχνολογιών (δηλαδή των λιποσωμάτων και των υδρογελών) παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα, μερικά από τα οποία περιγράφονται παρακάτω: Α) τα λιποσώματα προστατεύουν τα φάρμακα από ενζυμική αποικοδόμηση. Διασπείροντας τα λιποσώματα στο δίκτυο της υδρογέλης, η προστασία των φαρμάκων ενισχύεται [Grijalvo et al., 2016]. 44

45 Β) όταν το φάρμακο εγκλωβίζεται/ ενσωματώνεται σε λιποσώματα, τα οποία στη συνέχεια διασπείρονται σε υδρογέλη, τότε η απελευθέρωση του φαρμάκου από το πολυμερικό δίκτυο της υδρογέλης καθυστερεί [Elnaggar et al., 2014]. Γ) οι υδρογέλες (και οι λιποσωμικές υδρογέλες), εξαιτίας του υψηλού ιξώδους τους, μπορούν να παραμένουν στη θέση χορήγησής τους και συνεπώς να συγκρατούν τα λιποσώματα στη θέση αυτή για μεγάλο χρονικό διάστημα [Pitorre et al., 2017]. Οι λιποσωμικές υδρογέλες δοκιμάζονται ως συστήματα για την τοπική χορήγηση φαρμάκων. Οι λιποσωμικές υδρογέλες (ως φαρμακοτεχνικές μορφές) εξετάζονται ως προς την ικανότητά τους: α) να βελτιώνουν το φαρμακοκινητικό προφίλ των φαρμάκων, β) να επιβραδύνουν/ παρατείνουν την απελευθέρωση του φαρμάκου, προσφέροντας θεραπευτικό αποτέλεσμα για μεγάλο χρονικό διάστημα [Pitorre et al., 2017]. Τα τελευταία χρόνια πραγματοποιούνται προκλινικές μελέτες στις οποίες οι λιποσωμικές υδρογέλες έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών (όπως καρκίνος, μικροβιακές λοιμώξεις, δερματικές παθήσεις και άλλες). Ειδικότερα, οι Mulik et al (2009) ανέπτυξαν μια θερμοευαίσθητη λιποσωμική υδρογέλη συγκεκριμένης σύστασης (υδρογέλη χιτοζάνης που περιείχε λιποσώματα στα οποία είχε εγκλωβιστεί κυταραβίνη). Στη μελέτη αυτή χορηγήθηκαν ενδομυϊκά σε ποντικούς (albino rats) τρία διαφορετικά παρασκευάσματα (φαρμακοτεχνικές μορφές) κυταραβίνης. Αυτά ήταν τα εξής: λιποσωμική κυταραβίνη, κυταραβίνη που ενσωματώθηκε σε υδρογέλη και κυταραβίνη σε λιπόσωμα σε υδρογέλη. Τα παρασκευάσματα αυτά αξιολογήθηκαν ως προς ορισμένα φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά. Ειδικότερα, η κυταραβίνη σε λιπόσωμα σε υδρογέλη είχε: α) το μεγαλύτερο χρόνο ημίσσειας ζωής σε σχέση με την κυταραβίνη των άλλων παρασκευασμάτων και β) τη μικρότερη σταθερά ρυθμού απομάκρυνσης, υποδεικνύοντας ότι ο ρυθμός απελευθέρωσης του φαρμάκου ήταν αργός και ότι το φάρμακο παρέμενε στο σώμα των πειραματοζώων για μεγάλο χρονικό διάστημα [Pitorre et al., 2017]. 45

46 1.3.2 Φωσφολιπιδικές Γέλες (Vesicular phospholipid gels, VPGs) Εισαγωγή στις φωσφολιπιδικές γέλες Οι φωσφολιπιδικές γέλες (vesicular phospholipid gels, VPGs) είναι υψηλής συγκέντρωσης λιποσωμικές διασπορές (ειδικότερα mm λιπιδίου ή mg λιπιδίου/g στερεής λιποσωμικής διασποράς). Οι VPGs έχουν ημιστερεό χαρακτήρα (υψηλό ιξώδες), εξαιτίας της υψηλής λιπιδικής συγκέντρωσής τους. Παρασκευάζονται με ομογενοποίηση υψηλής πίεσης [Brandl et al., 1990, 1993] και αποτελούνται από πυκνά πακεταρισμένα (πακτωμένα) μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Εικόνα 1.11). Οι VPGs μπορούν να μετατραπούν εύκολα σε συμβατικές SUV λιποσωμικές διασπορές αν προστεθεί σε αυτές μεγάλη ποσότητα υδατικού διαλύματος [Brandl, 2007]. Εικόνα 1.11 Σύγκριση μεταξύ: (α) φωσφολιπιδικών γελών (VPGs) και (β) συμβατικών SUV λιποσωμικών διασπορών (κάθε σφαίρα αντιπροσωπεύει ένα SUV λιπόσωμα) [Elnaggar et al., 2014] Μέθοδος παρασκευής των VPGs Αρχικά παρασκευάζεται μια ημιστερεή λιποσωμική διασπορά αποτελούμενη από MLV λιποσώματα με τη μέθοδο ενυδάτωσης λεπτού λιπιδικού υμενίου (βλέπε ενότητα ). Η ημιστερεή αυτή διασπορά λιποσωμάτων υπόκειται σε ομογενοποίηση υψηλής πίεσης (70ΜPa). Με την τεχνική αυτή μειώνεται τόσο το μέγεθος των λιποσωμάτων όσο και ο αριθμός των διπλοστοιβάδων τους. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται φωσφολιπιδική γέλη (VPG), η οποία 46

47 αποστειρώνεται σε αυτόκλειστο (121 ο C, 15 λεπτά) και αποθηκεύεται στους 4-8 ο C έως ότου χρησιμοποιηθεί [Kaiser et al., 2003] Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των VPGs Οι VPGs χαρακτηρίζονται χρησιμοποιώντας τις τεχνικές φυσικοχημικού χαρακτηρισμού των λιποσωμάτων (βλέπε ενότητα 1.1.5). Πιο συγκεκριμένα, η κατανομή του μεγέθους και το μέσο μέγεθος των λιποσωμάτων των VPGs προσδιορίζεται με την τεχνική DLS (αφού πρώτα αραιωθούν κατάλληλα οι VPGs). Επιπρόσθετες πληροφορίες για το μέγεθος των λιποσωμάτων, πληροφορίες για τον αριθμό των λιπιδικών διπλοστοιβάδων τους, το σχήμα τους καθώς και τη διάταξη των λιποσωμάτων στις VPGs λαμβάνονται με τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, όπως FFTEM [Brandl et al., 1996] Εγκλωβισμός/ Ενσωμάτωση φαρμάκων στις VPGs Οι VPGs δοκιμάζονται ως φορείς υδρόφιλων, λιπόφιλων και αμφίφιλων φαρμάκων. Τα φάρμακα μπορούν να εγκλωβιστούν σε προσχηματισμένη VPG ή μπορούν να εγκλωβιστούν/ ενσωματωθούν στην VPG κατά τη διαδικασία της παρασκευής της. Στην πρώτη περίπτωση, η προσχηματισμένη (άδεια) VPG αναμιγνύεται με υδατικό διάλυμα φαρμάκου. Το μίγμα αυτό επωάζεται στους 60 ο C για αρκετές ώρες, ώστε να διευκολυνθεί η μεταφορά (διάχυση) του φαρμάκου μέσα στα λιποσώματα [Moog et al., 2002]. Στη δεύτερη περίπτωση: Α) αν το φάρμακο είναι υδρόφιλο, διαλύεται σε πολικό διαλύτη και το προκύπτον διάλυμα χρησιμοποιείται για την ενυδάτωση του λεπτού λιπιδικού υμενίου. Β) αν το φάρμακο είναι λιπόφιλο, διαλύεται μαζί με τα λιπίδια σε μίγμα οργανικών διαλυτών (πριν τον σχηματισμό του λιπιδικού υμενίου) VPGs ως συστήματα χορήγησης υδρόφιλων φαρμάκων Οι VPGs εξετάζονται ως θεραπευτικά συστήματα για την τοπική χορήγηση υδρόφιλων φαρμάκων, αφού εξαιτίας του υψηλού ιξώδες τους, οι VPGs θα 47

48 συγκρατούνται για μεγάλο χρονικό διάστημα στη θέση χορήγησής τους, ή/ και ως συστήματα για ενδοφλέβια χορήγηση (αφού πρώτα αραιωθούν κατάλληλα) [Brandl, 2001; Kaiser et al., 2003]. Οι VPGs θεωρούνται χρήσιμα συστήματα μεταφοράς υδρόφιλων φαρμάκων μικρού μοριακού βάρους, για τους εξής λόγους: Α) στις VPGs, μεγάλο ποσοστό υδρόφιλου φαρμάκου εγκλωβίζεται σε μικρά λιποσώματα [Kaiser et al., 2003; Moog et al., 2002]. Στις VPGs, εξαιτίας του υψηλού λιπιδικού περιεχομένου τους, ο υδάτινος όγκος στο εσωτερικό των λιποσωμάτων είναι σημαντικά μεγαλύτερος από τον υδάτινο όγκο που περιβάλλει τα λιποσώματα. Συνεπώς, μεγαλύτερη ποσότητα υδρόφιλου φαρμάκου θα εγκλωβίζεται στην υδατική φάση εντός των λιποσωμάτων, επιτυγχάνοντας έτσι υψηλή απόδοση εγκλωβισμού [Brandl et al., 1998]. Επομένως, δεν είναι απαραίτητη η απομάκρυνση του ελεύθερου (μη εγκλωβισμένου στα λιποσώματα) φαρμάκου. Β) Το ποσοστό του εγλωβισμένου στα λιποσώματα φαρμάκου παραμένει σταθερό για μεγάλο χρονικό διάστημα, οδηγώντας σε παρασκευάσματα με μεγάλη διάρκεια ζωής [Kaiser et al., 2003; Moog et al., 2002; Elnaggar et al., 2014]. Στις VPGs, τα υδρόφιλα φάρμακα κατανέμονται στην υδατική φάση εντός και εκτός των λιποσωμάτων. Τα υδρόφιλα φάρμακα μικρού μοριακού βάρους θα διαχέονται διαμέσου της λιποσωμικής μεμβράνης. Κάποτε θα επέλθει ισορροπία, δηλαδή η συγκέντρωση του φαρμάκου εντός των λιποσωμάτων θα εξισωθεί με τη συγκέντρωση του φαρμάκου έξω από τα λιποσώματα. Συνεπώς, δε θα υπάρχει βάθμωση (διαφορά) συγκέντρωσης (φαρμάκου) μεταξύ του υδάτινου πυρήνα των λιποσωμάτων και υδάτινου περιβάλλοντος, η οποία θα οδηγούσε σε γρήγορη απελευθέρωση του φαρμάκου από τα λιποσώματα [Moog et al., 2002]. Γ) Οι VPGs είναι συστήματα επιβραδυνόμενης αποδέσμευσης, διότι αποδίδουν/ απελευθερώνουν τα υδρόφιλα φάρμακα μικρού μοριακού βάρους για παρατεταμένο χρόνο [Elnaggar et al., 2014]. 48

49 Όταν χορηγούνται οι VPGs, αρχικά η ελεύθερη (μη εγκλωβισμένη στα λιποσώματα) μορφή του υδρόφιλου φαρμάκου προκαλεί το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Έπειτα, το φάρμακο θα αποδεσμεύεται από τα λιποσώματα και θα ασκεί φαρμακολογική δράση. Με τον τρόπο αυτό παρατηρείται παρατεταμένο φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Η γεμσιταβίνη αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα υδρόφιλου φαρμάκου (μικρού μοριακού βάρους) που εγκλωβίστηκε σε VPG, επιτυγχάνοντας υψηλά και σταθερά ποσοστά εγκλωβισμού. Η γεμσιταβίνη (dfdc) είναι ένα αντικαρκινικό φάρμακο. Έχει μικρό χρόνο ημιζωής καθώς μεταβολίζεται γρήγορα (από ένζυμα της αιματικής κυκλοφορίας) προς αδρανή μεταβολίτη. Επιπλέον, τα μικρά μόρια της γεμσιταβίνης τείνουν να διαχέονται γρήγορα έξω από τα λιποσώματα. Συνεπώς, τα λιποσωμικά παρασκευάσματα της γεμσιταβίνης, που παρασκευάζονται με συμβατικές μεθοδολογίες, δεν έχουν επαρκή διάρκεια ζωής και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην κλινική πράξη [Moog et al., 2002]. Για την αποφυγή των ανωτέρω προβλημάτων, η γεμσιταβίνη εγκλωβίζεται σε VPG με στόχο να παρασκευαστούν dfdc-vpg παρασκευάσματα με μεγάλη διάρκεια ζωής και υψηλή απόδοση εγκλωβισμού. Οι Moog et al (2002) συνέκριναν την συμβατική γεμσιταβίνη με την γεμσιταβίνη που έχει εγκλωβιστεί στην VPG (dfdc-vpg παρασκευάσματα) ως προς την αντικαρκινική δράση τους σε συγκεκριμένους όγκους και ως προς ορισμένες φαρμακοκινητικές παραμέτρους. Από τη μελέτη αυτή προέκυψαν τα εξής: α) στις VPGs, το ποσοστό εγκλωβισμού της γεμσιταβίνης είναι σταθερό και υψηλό, β) τα μη αραιωμένα dfdc-vpg παρασκευάσματα είναι σταθερά για περισσότερους από 8 μήνες στους 4 ο C (δηλαδή δεν άλλαξε η φωσφολιπιδική συγκέντρωση του παρασκευάσματος, το μέγεθος των λιποσωμάτων και το ποσοστό εγκλωβισμού της dfdc), γ) τα αραιωμένα dfdc-vpg παρασκευάσματα έδειξαν καλύτερα φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά και 49

50 ανώτερη αντικαρκινική δράση σε σχέση με τη συμβατική γεμσιταβίνη [Moog et al., 2002] Μικρογέλη σε λιποσώματα (Microgel in liposomes, M-i-L) Εισαγωγή στις μικρογέλες σε λιποσώματα Η μικρογέλη σε λιποσώματα (microgel in liposomes, M-i-L) αποτελεί μια κατηγορία λιποσωμικής γέλης. Διαφορετικοί όροι έχουν χρησιμοποιηθεί (στη βιβλιογραφία) για να περιγράψουν αυτήν την κατηγορία λιποσωμικής γέλης, όπως: λιπογέλες (lipogels), λιποσώματα με πυρήνα γέλης (gel core liposomes), μικρογέλες επικαλυμμένες με λιπίδιο (lipid coated microgels) κ. ά.. Οι M-i-L θα μπορούσαν να οριστούν ως λιποσώματα των οποίων η λιπιδική διπλοστοιβάδα περικλείει ένα τρισδιάστατο δίκτυο πολυμερούς (σωματίδιο υδρογέλης, μικρογέλη) (Εικόνα 1.12) [Kazakov, 2016]. Εικόνα 1.12 Μικρογέλη σε λιπόσωμα (Microgel in liposomes, M-i-L) [Kazakov, 2016]. Οι M-i-L παρουσιάζουν δομική ομοιότητα με τα κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα αποτελούνται από λιπιδική διπλοστοιβάδα (κυτταρική μεμβράνη) η οποία περικλείει το κυτταρόπλασμα που είναι μια παχύρρευστη μάζα, εξαιτίας της σύστασής του Μέθοδοι παρασκευής των M-i-L Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι παρασκευής των M-i-L. Οι μέθοδοι αυτές μπορούν να χωριστούν σε δυο κατηγορίες: Α) Η μια κατηγορία περιλαμβάνει τον σχηματισμό λιπιδικής διπλοστοιβάδας γύρω από (προσχηματισμένα) σωματίδια υδρογέλης. Η επικάλυψή τους με 50

51 λιπιδική διπλοστοιβάδα μπορεί να πραγματοποιηθεί με τους εξής τρόπους: α) αναμιγνύοντας φορτισμένα λιποσώματα με σωματίδια υδρογέλης αντίθετου φορτίου, β) επικαλύπτοντας την επιφάνεια των σωματιδίων της υδρογέλης με λιπαρά οξέα (δηλαδή ομοιοπολική σύνδεση λιπαρών οξέων στην επιφάνεια των σωματιδίων υδρογέλης). Έπειτα, τα επικαλυμμένα σωματίδια υδρογέλης προστίθενται σε λιποσωμική διασπορά και σχηματίζεται αυθόρμητα διπλοστοιβάδα λιπιδίων γύρω από την υδρογέλη [Elnaggar et al., 2014]. Β) Η δεύτερη κατηγορία μεθόδων περιλαμβάνει τον πολυμερισμό (σχηματισμό) υδρογέλης στο εσωτερικό του λιποσώματος. Ειδικότερα, διάλυμα πολυμερούς (διάλυμα που περιέχει όλα εκείνα τα συστατικά που χρειάζονται για να σχηματιστεί η υδρογέλη) χρησιμοποιείται για την ενυδάτωση του λιπιδικού υμενίου (βλέπε ενότητα ). Συνεπώς, το διάλυμα του πολυμερούς εγκλωβίζεται στο εσωτερικό των λιποσωμάτων. Έπειτα, κατάλληλο ερέθισμα πυροδοτεί το σχηματισμό του τρισδιάστατου πολυμερικού δικτύου της υδρογέλης στο εσωτερικό του λιποσώματος [Elnaggar et al., 2014; Kazakov, 2016] Ενσωμάτωση φαρμάκων στις M-i-L Τα λιπόφιλα φάρμακα ενσωματώνονται στη λιπιδική διπλοστοιβάδα των λιποσωμάτων (διαλύονται μαζί με τα λιπίδια σε μίγμα οργανικών διαλυτών, πριν τον σχηματισμό του λιπιδικού φιλμ). Τα υδρόφιλα φάρμακα εγκλωβίζονται στο πολυμερικό δίκτυο της υδρογέλης. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί βυθίζοντας τα σωματίδια της υδρογέλης σε υδατικό διάλυμα φαρμάκου. Το δίκτυο της υδρογέλης διογκώνεται και τα μόρια του φαρμάκου διαχέονται στο εσωτερικό των σωματιδίων Απελευθέρωση μορίων φαρμάκου από M-i-L Ο κυριότερος μηχανισμός απελευθέρωσης φαρμάκου από τη μικρογέλη σε λιποσώματα περιγράφεται παρακάτω (Εικόνα 1.13). 51

52 Εικόνα 1.13 Μηχανισμός απελευθέρωσης φαρμάκου από την M-i-L [Kazakov, 2016]. Τα μόρια του φαρμάκου είναι εγκλωβισμένα στο πολυμερικό δίκτυο της υδρογέλης. Αρχικά, το δίκτυο της υδρογέλης βρίσκεται σε συρρικνωμένη κατάσταση. Μια περιβαλλοντική αλλαγή (αλλαγή ph, θερμοκρασίας) προκαλεί τη διόγκωση του πολυμερικού δικτύου. Το σωματίδιο της υδρογέλης διογκώνεται και διαρρηγνύει τη λιπιδική διπλοστοιβάδα. Με τον τρόπο αυτό δημιουργούνται πόροι στη λιπιδική διπλοστοιβάδα, μέσα από τους οποίους απελευθερώνεται το φάρμακο M-i-L ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων Οι M-i-L παρουσιάζουν ορισμένα χαρακτηριστικά, όπως: α) βιοσυμβατότητα, εξαιτίας της λιπιδικής διπλοστοιβάδας που επικαλύπτει τον πυρήνα υδρογέλης. β) ικανότητα στόχευσης σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων (που υπερεκφράζουν υποδοχείς). Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί, τροποποιώντας τη λιπιδική διπλοστοιβάδα, ώστε να φέρει κατάλληλους προσδέτες. γ) μηχανική σταθερότητα και ικανότητα ανταπόκρισης σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Τα χαρακτηριστικά αυτά αποδίδονται στο σωματίδιο της υδρογέλης το οποίο υποστηρίζει τη λιπιδική διπλοστοιβάδα και έχει την ικανότητα να ανταποκρίνεται σε αλλαγές του εξωτερικού περιβάλλοντος. Οι M-i-L έχουν δοκιμαστεί ως συστήματα μεταφοράς αντικαρκινικών φαρμάκων και πρωτεϊνών. Ειδικότερα, οι M-i-L έχουν δοκιμαστεί με ενθαρρυντικά αποτελέσματα ως εμβόλια κατά της ελονοσίας. Πιο συγκεκριμένα, στον πυρήνα υδρογέλης έχουν εγκλωβιστεί μαζί: α) η 52

53 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Pfs25, η οποία είναι ένα αντιγόνο χαμηλής ανοσογονικότητας που εκφράζεται στην επιφάνεια του παρασίτου που προκαλεί ελονοσία και β) ένα ολιγονουκλεοτίδιο (CpG ODN), το οποίο είναι ανοσοενισχυτικός παράγοντας (adjuvant) [Tiwari et al., 2009]. Τέλος οι M-i-L, εξαιτίας της σύστασής τους και της δομικής ομοιότητάς τους με τα κύτταρα, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν μελλοντικά ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων, πρωτεϊνών, γονιδίων, στη μηχανική ιστών καθώς και στη βιοτεχνολογία [Kazakov, 2016]. Σκοπός της εργασίας Σκοπός αυτής της εργασίας είναι η μελέτη της παρασκευής λιποσωμικής γέλης μέσω διασύνδεσης των λιποσωμάτων, με τελικό (μελλοντικό) στόχο την ανάπτυξη λιποσωμικών συστημάτων τα οποία θα αποδεσμεύουν αργά φαρμακευτικές ενώσεις. Η διασύνδεση των λιποσωμάτων επιτυγχάνεται με τη βοήθεια αντίδρασης τύπου προσθήκης Michael. Η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται στην εξωτερική επιφάνεια των λιποσωμάτων μεταξύ της ομάδας μαλεϊμιδίου που υπάρχει σε λιπιδικό παράγωγο πολυαιθυλενογλυκόλης και βρίσκεται στην επιφάνεια των λιποσωμάτων και της θειολομάδας μιας διθειόλης, η οποία προστίθεται στα λιποσώματα. Η δεύτερη θειολομάδα του ίδιου μορίου αναμένεται να αντιδράσει με ομάδα μαλεϊμιδίου γειτονικού λιποσώματος. Με τον τρόπο αυτό, η διθειόλη δρα ως συνδέτης (linker). Η σύνδεση αυτή των λιποσωμάτων αναμένεται να επιφέρει αλλαγές στο μέγεθος των λιποσωμάτων και το ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς τους. Ειδικότερα, παρασκευάστηκαν λιποσώματα στη μεμβράνη των οποίων ενσωματώθηκε λιπίδιο-peg-μαλεϊμίδιο (λιποσωμική διασπορά Lips-Mal). Έπειτα, οι ομάδες μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων αντέδρασαν με θειολομάδες PEG-διθειόλης (ενός παραγώγου μεγάλου μοριακού βάρους το οποίο συντέθηκε στο εργαστήριό μας) και πραγματοποιήθηκαν οι εξής μελέτες: Αρχικά, επιβεβαιώθηκε και μελετήθηκε η αντίδραση μεταξύ ομάδων 53

54 μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και των θειολομάδων της PEG-διθειόλης με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της PEG-διθειόλης στο μέγεθος των λιποσωμάτων και το ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς (Lips-Mal). Προκειμένου να διερευνηθεί αν η αύξηση του μεγέθους των λιποσωμάτων και η αύξηση του ιξώδους που παρατηρήθηκε (μετά την προσθήκη συγκεκριμένων ποσοτήτων PEG-διθειόλης στη διασπορά Lips-Mal), οφείλεται αποκλειστικά στην αντίδραση μεταξύ μαλεϊμίδιου θειόλης, πραγματοποιήθηκαν επιπλέον πειράματα (πειράματα ελέγχου). Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν λιποσώματα που δεν έφεραν ομάδες μαλεϊμιδίου στην επιφάνειά τους (λιποσωμική διασπορά Control Lips) και σε αυτή τη λιποσωμική διασπορά προστέθηκαν οι ίδιες ποσότητες PEG-διθειόλης με εκείνες που είχαν προστεθεί στη λιποσωμική διασπορά Lips-Mal. Μέσα από τα πειράματα ελέγχου διαπιστώθηκε ότι η αύξηση του μεγέθους των λιποσωμάτων και του ιξώδους οφείλεται κυρίως στην αντίδραση μαλεϊμιδίου θειόλης. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι το μέγεθος των λιποσωμάτων δεν επηρεάζει το ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς. 54

55 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 55

56 2.1 Όργανα και Υλικά Όργανα Παρακάτω παρατίθενται τα όργανα και οι συσκευές που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραμάτων: -Περιστρεφόμενος Εξατμιστήρας (BÜCHI Rotavapor R-200) -Λουτρό Υπερήχων (Bransonic 2510) -Ακίδα Υπερήχων (Sonics Vibra Cell) -Φυγόκεντρος (Labofuge 200, HERAEUS) -Αναδευτήρας έντονης ανάδευσης (vortex) (Scientific Industries, Vortex Genie 2) -Μαγνητικός αναδευτήρας (VELP SCIENTIFICA, ARE Heating Magnetic Stirrer) -Αναδευτήρας Mini Rocker (Kisker Biotech, Rocking Shaker) -Φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV-mini 1240) -Ζυγός (4 δεκαδικών ψηφίων) [Mettler Toledo AB204-S] -Μετρητής μεγέθους και ζ- δυναμικού κολλοειδών διασπορών Zeta-sizer (Malvern Nano-ZS, Malvern Instrument) -όργανο μέτρησης σημείου τήξεως (Fisherbrand Melting Point Apparatus) -Ιξωδόμετρο σφαίρας (Anton Paar GmbH) Υλικά Λιπίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των λιποσωμάτων: -PC: L-α-φωσφατιδυλοχολίνη (Egg PC), πηγή: Avanti Polar Lipids -PEG-2000PE: 1,2-διστεαροϋλο-sn-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαμίνη-Ν [μεθοξυ (πολυαιθυλογλυκόλη)-2000] (άλας αμμωνίου), πηγή: Avanti Polar Lipids -DSPE-PEG2000-Maleimide: 1,2-διστεαροϋλο-sn-γλυκερο-3- φωσφοαιθανολαμίνη-ν-[μαλεϊμίδιο (πολυαιθυλενογλυκόλη)-2000] (άλας αμμωνίου), πηγή: Avanti Polar Lipids - Χοληστερόλη (Chol) καθαρότητα 99%, πηγή: Sigma 56

57 Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή του αντιδραστηρίου Stewart: -Εξαένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος (FeCl 3.6H 2 O), πηγή: Merck -Θειοκυανιούχο αμμώνιο (NH 4 SCN), πηγή: Merck Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή ισότονου ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS): -Χλωριούχο νάτριο (NaCl), (Μ.Β ), πηγή: Merck -Χλωριούχο κάλιο (KCl), (Μ.Β ), πηγή: Merck -Μονόξινο φωσφορικό νάτριο ή φωσφορικό δινάτριο (Na 2 HPO 4 ), (Μ.Β ), πηγή: Sigma -Δισόξινο φωσφορικό κάλιο (KH 2 PO 4 ), (Μ.Β ), πηγή: Merck -Νατραζίδιο (NaN 3 ), (Μ.Β ), πηγή: Sigma-Aldrich Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στη σύνθεση της PEG-διθείολης: -Πολυαιθυλενογλυκόλη (HO-PEG OH), (Μ.Β ), πηγή: Sigma- Aldrich -Μονομεθοξυτριτυλ θειογαλακτικό οξύ (Mmt-thiolactic acid), (Μ.Β ), από την εταιρία CBL (στην ΒΙΠΕ Πάτρας) -4-(διμεθυλαμινο)πυριδίνη (DMAP) καθαρότητα 99%, (Μ.Β ), πηγή: Sigma-Aldrich - Ν,Ν -διισοπροπυλ καρβοδιιμίδιο (DIC) καθαρότητα 99%, (M.B ), πηγή: Alfa Aesar -Τριφθοροξικό οξύ (TFA) καθαρότητα 99%, (Μ.Β ), πηγή: Sigma- Aldrich -Τριαιθυλσιλάνιο (TES) καθαρότητα 99%, (Μ.Β ), πηγή: Sigma- Aldrich Άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν: 57

58 -Δευτεριωμένο νερό (D 2 O) καθαρότητα 99.9%, (M.B ), πηγή: Euriso- Top 2.2 Παρασκευή διαλυμάτων- αντιδραστηρίων Διάλυμα αντιδραστηρίου Stewart για μέτρηση λιπιδικής συγκέντρωσης Σε 1 L απεσταγμένου νερού διαλύονται 27.03gr εξαένυδρου τριχλωριούχου σιδήρου (FeCl 3.6H 2 O) και 30.4 gr θειοκυανιούχου αμμωνίου (NH 4 SCN). Πραγματοποιείται μαγνητική ανάδευση των συστατικών για 2 ώρες. Το διάλυμα είναι σταθερό σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετούς μήνες. Ωστόσο, πρέπει να φυλάσσεται σε σκιερό μέρος. Ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS Σε 1 L απεσταγμένου νερού διαλύονται 8gr άνυδρου χλωριούχου νατρίου (NaCl), 0.2gr άνυδρου χλωριούχου καλίου (KCl), 0.248gr δισόξινου φωσφορικού καλίου (KH 2 PO 4 ), 1.44gr άνυδρου μονόξινου φωσφορικού νατρίου (Na 2 HPO 4 ) και 0.2gr νατραζίδιου (NaN 3 ). Το νατραζίδιο χρησιμεύει ως συντηρητικό και αποτρέπει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Το διάλυμα αποθηκεύεται στους 4 ο C. Διαλύματα λιπιδίων Τα διαλύματα όλων των λιπιδίων προετοιμάζονται ως εξής: κατάλληλη ποσότητα στερεού λιπιδίου (υπό μορφή κόνεως) διαλύεται σε διάλυμα χλωροφορμίου/ μεθανόλης (2: 1 v/v) (ανάλογα με την λιπιδική συγκέντρωση που απαιτείται). Τόσο οι κόνεις των λιπιδίων όσο και τα διαλύματα των λιπιδίων διατηρούνται στην κατάψυξη (-20 ο C). 2.3 Παρασκευή λιποσωμάτων Αρχικά παρασκευάζονται πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLV) με τη μέθοδο ενυδάτωσης του λεπτού λιπιδικού υμενίου (όπως περιγράφεται στην ενότητα ). Έπειτα, μειώνεται το μέγεθος των λιποσωμάτων (καθώς και ο αριθμός 58

59 των λιπιδικών διπλοστοιβάδων τους) και προκύπτουν SUV λιποσώματα με τη χρήση ακίδας υπερήχων (βλέπε ενότητα ). Η λιπιδική σύσταση καθώς και η λιπιδική συγκέντρωση των λιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 2.1). Πίνακας 2.1: Λιπιδική σύσταση και συγκέντρωση των λιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Λιπιδική σύσταση Μοριακή αναλογία λιπιδίων Λιπιδική συγκέντρωση (mg/ ml) PC/ Chol/ DSPE-PEG2000 methoxy (Control Lips) 2: 1: PC/ Chol/ DSPE-PEG2000 methoxy 2: 1: PC/ Chol/ DSPE-PEG2000- Maleimide (Lips- Mal) 2: 1: PC/ Chol/ DSPE-PEG2000- Maleimide/ DSPE- PEG2000 methoxy (Lips- Mal- PEGmethoxy) 2:1: 0.03: Παρακάτω περιγράφεται συνοπτικά η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την παρασκευή των SUV λιποσωμάτων (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1 Μέθοδος ενυδάτωσης λιπιδικού υμενίου. 59

60 Κατάλληλοι όγκοι από πρότυπα διαλύματα λιπιδίων προστίθενται σε σφαιρική φιάλη των 50 ή 100 ml. Τα πρότυπα διαλύματα λιπιδίων παρασκευάζονται, διαλύοντας συγκεκριμένες ποσότητες λιπιδίων σε διάλυμα χλωροφορμίου/ μεθανόλης (2: 1 v/v). Οι οργανικοί διαλύτες εξατμίζονται με περιστροφική εξάτμιση και τα λιπίδια αποτίθενται στο εσωτερικό τοίχωμα της σφαιρικής φιάλης, σχηματίζοντας μια λεπτή και ομοιογενής μεμβράνη (υμένιο). Τυχόν υπολείμματα οργανικών διαλυτών απομακρύνονται από τη σφαιρική φιάλη με εφαρμογή ρεύματος αζώτου. Στη συνέχεια, ακολουθεί η ενυδάτωση του λιπιδικού υμενίου είτε PBS είτε με D 2 O (δευτεριωμένο νερό), ανάλογα με την πειραματική εφαρμογή των λιποσωμάτων. Το υμένιο αποκολλάται από το τοίχωμα της σφαιρικής φιάλης εφαρμόζοντας μηχανική ανάδευση (vortex), λουτρό υπερήχων και θέρμανση πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου (T m ). Με τον τρόπο αυτό, λαμβάνεται μια θολερή διασπορά αποτελούμενη από MLV λιποσώματα. Έπειτα μειώνεται το μέγεθος των MLV λιποσωμάτων και λαμβάνεται SUV λιποσωμική διασπορά με τη χρήση ακίδας υπερήχων. Η ακίδα υπερήχων (ακίδα τιτανίου) βυθίζεται μέσα στη λιποσωμική διασπορά. Ο περιέκτης της λιποσωμικής διασποράς τοποθετείται σε πάγο ή πολύ ψυχρό νερό, διότι οι υπέρηχοι αυξάνουν τη θερμοκρασία της λιποσωμικής διασποράς. Η λιποσωμική διασπορά παραμένει στην ακίδα τιτανίου για λεπτά ή έως ότου η διασπορά γίνει διαυγής. Τα σωματίδια τιτανίου που απελευθερώνονται, μολύνουν τη λιποσωμική διασπορά και απομακρύνονται από αυτήν με φυγοκέντρηση στις στροφές για 10 λεπτά. Τέλος, το λιποσωμικό παρασκεύασμα αφήνεται σε ηρεμία, σε T > T m για τουλάχιστον μισή ώρα. Με τον τρόπο αυτό, ολοκληρώνεται και ομαλοποιείται η μορφοποίηση της δομής τους. 2.4 Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων Προσδιορισμός λιπιδικής συγκέντρωσης με την χρωματομετρική μέθοδο Stewart 60

61 Η μέθοδος Stewart χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του φωσφολιπιδίου στις λιποσωμικές διασπορές. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ικανότητα των φωσφολιπιδίων να σχηματίζουν σύμπλοκο με το σιδηροθειοκυανιούχο αμμώνιο σε οργανικό διάλυμα. Η κόκκινη ανόργανη ένωση του σιδηροθειοκυανυούχου αμμωνίου είναι αδιάλυτη στο χλωροφόρμιο, αλλά σχηματίζει σύμπλοκο με τα φωσφολιπίδια, το οποίο είναι διαλυτό (το σύμπλοκο, όπως και τα φωσφολιπίδια) στο χλωροφόρμιο [Stewart, 1980]. Η συσχέτιση των τιμών απορρόφησης με τα μg του φωσφολιπιδίου πραγματοποιείται κατασκευάζοντας κατάλληλη καμπύλη αναφοράς. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης Stewart Παρακάτω περιγράφεται η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς για το αντιδραστήριο Stewart. Αρχικά, παρασκευάζεται διάλυμα φωσφολιπιδίου PC σε χλωροφόρμιο συγκέντρωσης 0.1 mg/ml και όγκου 10 ml (προέρχεται από διάλυμα αρχικής συγκέντρωσης 10 mg/ml). Έπειτα, προετοιμάζονται τα πρότυπα διαλύματα, σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 10 ml, με σύσταση που φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 2.2). Πίνακας 2.2: Πρότυπα διαλύματα για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης Stewart. Δείγμα Πρότυπο Ποσότητα Χλωροφόρμιο Αντιδραστήριο διάλυμα λιπιδίου (μg) (ml) Stewart (ml) λιπίδιου (ml) Αφού προετοιμαστούν τα πρότυπα διαλύματα (σύμφωνα με τους όγκους του ανωτέρω πίνακα), ακολουθεί μηχανική ανάδευση (vortex) των διαλυμάτων για 1 λεπτό. Έπειτα, τα διαλύματα αφήνονται σε ηρεμία στους 25 ο C, για 15 λεπτά περίπου, ώστε να διαχωριστούν οι δύο φάσεις (υδατική φάση: Stewart, 61

62 οργανική φάση: χλωροφόρμιο). Όταν πραγματοποιηθεί ο διαχωρισμός των δυο φάσεων, η υπερκείμενη υδατική φάση απομακρύνεται με τη βοήθεια αντλίας κενού και μετράται η οπτική απορρόφηση της οργανικής φάσης στα 485 nm. Για τη μέτρηση της οπτικής απορρόφησης, το φωτόμετρο UV/ Vis ρυθμίζεται στα 485 nm και ακολουθεί μηδενισμός με χλωροφόρμιο (τυφλό δείγμα). Τα δείγματα μετρώνται ξεκινώντας από το αραιότερο προς το πυκνότερο. Η πρότυπη καμπύλη Stewart συσχετίζει τις τιμές απορρόφησης με την ποσότητα (σε μg) του φωσφολιπιδίου (PC) (Διάγραμμα 2.1). Πρότυπη Καμπύλη Stewart Διάγραμμα 2.1 Τυπική πρότυπη καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό της ποσότητας φωσφολιπιδίων με τη μέθοδο Stewart. Προσδιορισμός λιπιδικής συγκέντρωσης των λιποσωμικών δειγμάτων Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 10 ml προστίθενται 20μl λιποσωμικής διασποράς (λιποσωμικό δείγμα), 2 ml χλωροφόρμιο και 2 ml αντιδραστήριο Stewart. Με την ίδια διαδικασία, που περιγράφεται πιο πάνω, μετράται η οπτική απορρόφηση των υπό μελέτη δειγμάτων. Βάσει των τιμών της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων και της καμπύλης αναφοράς, υπολογίζεται η 62

63 ποσότητα του φωσφολιπιδίου (σε μg) και τελικώς η συγκέντρωση του λιπιδίου (σε mg/ml) στα λιποσωμικά δείγματα Μέτρηση μέσου μεγέθους και κατανομής του μεγέθους των λιποσωμάτων Για τον προσδιορισμό του μέσου μεγέθους των λιποσωμάτων και του δείκτη πολυδιασποράς, οι λιποσωμικές διασπορές αραιώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ώστε να έχουν συγκέντρωση λιπιδίου mg/ml. Οι αραιωμένες λιποσωμικές διασπορές μετρούνται με την τεχνική DLS (βλέπε ενότητα ) (Malvern Nano- ZS, Malvern Instruments, UK) στους 25 ο C υπό γωνία 173 ο. Το υλικό που επιλέγεται στις ρυθμίσεις, για την μέτρηση των λιποσωμάτων, είναι λάτεξ πολυστυρενίου. Κάθε δείγμα μετρήθηκε 11 φορές σε τρεις ανεξάρτητες μετρήσεις. Ο δείκτης πολυδιασποράς χρησιμοποιήθηκε ως ένα μέτρο ομοιογένειας των λιποσωμικών διασπορών. Γενικά, οι διασπορές που έχουν PDI χαμηλότερο από πιστεύεται πως έχουν στενή διασπορά μεγέθους και αποτελούν καλά δείγματα (στην περίπτωση των λιποσωμάτων). Στην συσκευή Nano ZS (Malvern) ο ανιχνευτής βρίσκεται σε τέτοια θέση, ώστε να συλλέγει την ακτινοβολία που σκεδάζεται (από τα σωματίδια) κατά 173 ο από τη διεύθυνση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας (Εικόνα 2.2). Η γωνία αυτή είναι πολύ κοντά στις 180 ο. Συνεπώς, μετράται η οπισθοσκεζόμενη ακτινοβολία. Για το λόγο αυτό, η συσκευή NANO ZS παρουσιάζει τα εξής πλεονεκτήματα: α) η ακτίνα laser δε διέρχεται από όλο το δείγμα (δηλαδή μετρώνται τα σωματίδια κοντά στο τοίχωμα της κυψελίδας), αποφεύγοντας την πολλαπλή σκέδαση και επιτρέποντας να μετρηθούν πυκνά δείγματα και β) η επίδραση των κόνεων και των προσμίξεων είναι μειωμένη, διότι τα μεγάλα σωματίδια των κόνεων σκεδάζουν κυρίως την ακτινοβολία προς την αντίθετη κατεύθυνση (την κατεύθυνση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας). 63

64 Εικόνα 2.2 Σχηματική παρουσίαση του φαινομένου της σκέδασης του φωτός κατά τη μέτρηση του μεγέθους των σωματιδίων. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της συσκευής Nano ZS (Malvern) είναι η μέτρηση της σκέδασης στις 173 ο. 2.5 Σύνθεση PEG-διθείολης Παρακάτω περιγράφεται η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την σύνθεση της PEG διθειόλης (Εικόνα 2.3). Το παράγωγο αυτό της PEG-διθειόλης χαρακτηρίστηκε με φασματοσκοπία 1 H-NMR στον φασματογράφο των 600 MHz του Τμήματος Γεωλογίας στο Πανεπιστήμιο Πατρών και επιπλέον προσδιορίστηκε το σημείο τήξεώς του. Το σημείο τήξης προσδιορίστηκε στο αντίστοιχο όργανο στο Τμήμα Φαρμακευτικής. O MeO S CO 2 H HO-PEG-OH DIC/DMAP DCM Mmt-S O O O n S-Mmt TFA/TES/DCM C 23 H 22 O 3 S Exact Mass: Mol. Wt.: m/e: (100.0%) HS O O O n O SH 64

65 Εικόνα 2.3 Σχηματική παρουσίαση της σύνθεσης της PEG διθειόλης. Το n είναι περίπου ίσο με 226. Σε σφαιρική φιάλη αναμιγνύονται Mmt-thiolactic (119.22mgr, 0.315mmoles) και DMAP (44.06mgr, mmoles), και διαλύονται σε 2ml DCM. Στο παραπάνω μίγμα προστίθεται το DIC (54.25μl, mmoles) και το μίγμα αναδεύεται για 10 λεπτά (σε θερμοκρασία δωματίου). Ακολουθεί προσθήκη του HO-PEG OH (1000mgr, 0.1mmoles), το οποίο είναι διαλυμένο στον ελάχιστο δυνατό όγκο DCM. Η αντίδραση αφήνεται τουλάχιστον 12 ώρες (ή έως ότου ολοκληρωθεί). Ακολουθεί καθαρισμός του μίγματος της αντίδρασης. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιούνται τα εξής: α) εκχύλιση με διάλυμα κιτρικού οξέος (10% w/v), β) εκχυλίσεις με νερό. Η οργανική φάση (μίγμα αντίδρασης) αφυδατώνεται με MgSO 4 (αφυδατικό μέσο) και ακολουθεί διήθηση. Το διήθημα συμπυκνώνεται σε περιστρεφόμενο εξατμιστήρα. Για την αποπροστασία της Mmt-S ομάδας χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 20% TFA σε DCM/TES 95:5. Το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώνεται σε περιστρεφόμενο εξατμιστήρα και ακολουθούν τρεις διαδοχικές συμπυκνώσεις με μεθανόλη. Στο λάδι που παραλαμβάνεται, μετά την συμπύκνωση της μεθανόλης, προστίθεται διαιθύλαιθέρας (Et 2 O) και το στερεό που σχηματίζεται, παραλαμβάνεται δια φυγοκέντρισης (πλύσεις με Et 2 O) και ξηραίνεται σε P 2 O 5. Προσδιορισμός σημείου τήξεως Για τον προσδιορισμό του σημείου τήξεως εισάγεται μικρή ποσότητα (στερεής) PEG-διθειόλης σε τριχοειδή υάλινο σωλήνα, ο οποίος είναι κλειστός στο ένα του άκρο. Το υάλινο τριχοειδές εισάγεται στην ειδική υποδοχή (θέση) που υπάρχει στη συσκευή μέτρησης σημείου τήξεως. Στη θέση αυτή υπάρχει μεγεθυντικός φακός που επιτρέπει την παρακολούθηση της πορείας τήξης της ένωσης. Αρχικά, η συσκευή ρυθμίζεται ώστε να φτάσει γρήγορα στους 50 ο C. Μετά από αυτήν την θερμοκρασία, η θερμοκρασία της συσκευής αυξάνεται κατά 0.2 ο C ανά λεπτό. Έτσι, η θερμοκρασία αυξάνεται σταδιακά και καταγράφεται το εύρος των θερμοκρασιών στις οποίες πραγματοποιείται (παρατηρείται) η τήξη της ένωσης. 65

66 2.6 Εκτίμηση αντίδρασης μεταξύ ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδων PEG-διθειόλης με 1 H-NMR Αντίδραση μεταξύ των ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και των θειολομάδων PEG-διθειόλης Οι ομάδες μαλεϊμιδίου (Mal) ενσωματώνονται στα λιποσώματα ως λιπίδιοpeg-μαλεϊμίδιο και βρίσκονται στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, καθώς και στο εσωτερικό τμήμα της λιπιδικής διπλοστοιβάδας. Η αντίδραση που πραγματοποιείται μεταξύ μιας ομάδας μαλεϊμιδίου (Εικόνα 2.4β) των λιποσωμάτων και μιας θειολομάδας της PEG-διθειόλης είναι μια αντίδραση τύπου προσθήκης Michael (Εικόνα 2.4γ). Ειδικότερα, η προσθήκη τύπου Michael είναι συζυγής προσθήκη (1,4 προσθήκη) ενός πυρηνόφιλου (θειολομάδα της PEG-διθειόλης) στον διπλό δεσμό μιας α, β-ακόρεστης κετόνης (ομάδα μαλεϊμιδίου) (Εικόνα 2.4α). Εικόνα 2.4 (α) Σχηματική παρουσίαση συζυγούς 1,4 προσθήκης. Η πυρηνόφιλη ένωση προστίθεται στον διπλό δεσμό α,β ακόρεστης καρβόνυλο ένωσης [John McMurry, Οργανική Χημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2008, p 1113], (β) χημικός τύπος της ομάδας του μαλεϊμιδίου, (γ) σχηματική παρουσίαση προσθήκης τύπου Michael μεταξύ ομάδας μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδας μιας θειόλης (για λόγους απλούστευσης, στο λιπόσωμα υπάρχει μια μόνο ομάδα μαλεϊμιδίου). 66

67 2.6.2 Αρχή τεχνικής NMR- Φάσμα 1 H-NMR Οι πυρήνες με περιττό αριθμό πρωτονίων (όπως 1 H, 14 N, 19 F) και οι πυρήνες με περιττό αριθμό νετρονίων (όπως 13 C) εκδηλώνουν μαγνητικές ιδιότητες, δηλαδή έχουν ιδιοστροφορμή (σπιν). Όταν ένα δείγμα, που περιέχει αυτούς τους μαγνητικούς πυρήνες, τοποθετηθεί ανάμεσα στους πόλους ενός ισχυρού μαγνήτη (εξωτερικό μαγνητικό πεδίο), τότε τα πυρηνικά σπιν των μαγνητικών πυρήνων αποκτούν συγκεκριμένους προσανατολισμούς, δηλαδή μπορούν να διαταχθούν είτε παράλληλα είτε αντιπαράλληλα προς το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο (Β o ). Ο παράλληλος προσανατολισμός είναι χαμηλότερης ενέργειας σε σχέση με τον αντιπαράλληλο (Εικόνα 2.5). Εικόνα 2.5 (α) Απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τα πυρηνικά σπιν προσανατολίζονται τυχαία, αντίθετα (β) παρουσία ενός εξωτερικού πεδίου, Β ο, αποκτούν συγκεκριμένο προσανατολισμό. Μερικά σπιν (κόκκινα) διατάσσονται παράλληλα προς το εξωτερικό πεδίο, ενώ κάποια άλλα (γαλάζια) αντιπαράλληλα. Η παράλληλη διάταξη των σπιν είναι χαμηλότερης ενέργειας και άρα ευνοείται [John McMurry, Οργανική Χημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2011, p 561]. Αν οι προσανατολισμένοι πυρήνες (Εικόνα 2.5β) ακτινοβοληθούν με κατάλληλης συχνότητας ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία (ακτινοβολία στην περιοχή των ραδιοσυχνοτήτων, RF), τότε ο κάθε μαγνητικός πυρήνας του μορίου, ανάλογα με το ηλεκτρονιακό του περιβάλλον, απορροφά συγκεκριμένης συχνότητας ακτινοβολία RF και πραγματοποιείται αναστροφή του σπιν του (δηλαδή μεταβαίνει από κατάσταση χαμηλότερης ενέργειας σε κατάσταση υψηλότερης ενέργειας). Όταν πραγματοποιηθεί αυτή η αναστροφή του σπιν, τότε λέγεται ότι οι πυρήνες έχουν συντονιστεί με την εφαρμοζόμενη ακτινοβολία, εξ ου και ο όρος πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός. 67

68 Σε ένα φάσμα 1 H-NMR: α) ο κατακόρυφος άξονας δείχνει την ένταση απορρόφησης της ενέργειας RF, β) ο οριζόντιος άξονας δείχνει τη χημική μετατόπιση. Η θέση στο γράφημα όπου ένας πυρήνας απορροφά ονομάζεται χημική μετατόπιση. Η χημική μετατόπιση βαθμολογείται χρησιμοποιώντας κλίμακα δέλτα. Μια μονάδα δέλτα (δ) ισούται με 1 μέρος στο εκατομμύριο (ppm) της συχνότητας λειτουργίας του φασματομέτρου. Η χημική μετατόπιση του TMS (τετραμεθυλσιλάνιο) ορίζεται κατά σύμβαση μηδέν. Οι μη ισοδύναμοι πυρήνες (μαγνητικοί πυρήνες ενός μορίου που έχουν διαφορετικό ηλεκτρονιακό περιβάλλον) απορροφούν σε διαφορετικές θέσεις (έχουν διαφορετική χημική μετατόπιση). Αντίθετα, οι ισοδύναμοι πυρήνες (όπως τα άτομα του υδρογόνου του διπλού δεσμού της ομάδας μαλεϊμιδίου) εμφανίζουν πάντοτε μία απορρόφηση Μελέτη αντίδρασης μεταξύ ομάδας μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδας PEG-διθειόλης με 1 H-NMR Η αντίδραση μεταξύ ομάδας μαλεϊμιδίου και θειολομάδας (της PEG-διθειόλης) μελετήθηκε με 1 H-NMR, στον φασματογράφο των 700 MHz του Τμήματος Φαρμακευτικής στο Πανεπιστήμιο Πατρών. Συγκεκριμένα, η μελέτη της ανωτέρω αντίδρασης πραγματοποιήθηκε με πείραμα 1 H-NMR CPMG. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκε η παλμική ακολουθία Carr-Pursell-Meiboom- Gill γνωστή και ως CPMG. Με αυτήν την παλμική ακολουθία εξαλείφονται οι συντονισμοί πρωτονίου μακρομορίων (όπως της πολυαιθυλενογλυκόλης), δηλαδή καταστέλλεται σημαντικά το σήμα NMR των μακρομορίων και ενισχύονται τα σήματα των μορίων μικρού μοριακού βάρους (όπως άτομα υδρογόνου του διπλού δεσμού της ομάδας μαλεϊμιδίου) [Skoog DA, et al. 2007]. Τα λιποσώματα σύστασης PC/ Chol/ DSPE-PEG2000-Maleimide με μοριακή αναλογία (λιπιδίων) 2: 1: 0.03 και λιπιδική συγκέντρωση 20 mg/ml διασπείρονται σε δευτεριωμένο νερό (D 2 O). Η λιποσωμική διασπορά εισάγεται σε έναν λεπτό γυάλινο σωλήνα (σωληνάριο NMR). Ο σωλήνας τοποθετείται 68

69 ανάμεσα στους πόλους ενός μαγνήτη. Το λιποσωμικό δείγμα παραμένει στο μαγνήτη για τουλάχιστον 3 λεπτά με σκοπό τη ρύθμιση και σταθεροποίηση της θερμοκρασίας στους 27 ο C. Το ισχυρό μαγνητικό πεδίο αναγκάζει τους πυρήνες του 1 H να ευθυγραμμιστούν με κάποιον από τους δυο δυνατούς προσανατολισμούς (παράλληλο, αντιπαράλληλο) και το δείγμα ακτινοβολείται με ενέργεια RF. Ένας ανιχνευτής καταγράφει την απορρόφηση της ενέργειας RF και στη συνέχεια το ηλεκτρονικό σήμα ενισχύεται και εμφανίζεται ως κορυφή στον καταγραφέα (Εικόνα 2.6). Εικόνα 2.6 Σχηματική λειτουργία ενός φασματομέτρου NMR. Ένας λεπτός γυάλινος σωλήνας που περιέχει το δείγμα (λιποσωμική διασπορά) τοποθετείται ανάμεσα στους πόλους ενός ισχυρού μαγνήτη και ακτινοβολείται με ενέργεια RF [John McMurry, Οργανική Χημεία, Πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης, 2011, p 565]. Λαμβάνονται μονοδιάστατα 1 H-NMR CPMG φάσματα πριν και μετά την προσθήκη συγκεκριμένης ποσότητας PEG-διθειόλης στη λιποσωμική διασπορά. 2.7 Μέτρηση ιξώδους λιποσωμικής διασποράς Για τη μέτρηση του ιξώδους των λιποσωμικών διασπορών χρησιμοποιήθηκε μικροϊξωδόμετρο σφαίρας (Automated Microviscometer AMVn, Anton Paar GmbH, USA) του Τμήματος Χημικών Μηχανικών στο Πανεπιστήμιο Πατρών. Το λιποσωμικό δείγμα εισάγεται σε υάλινο σωλήνα διαμέτρου 1.8 mm. Στον σωλήνα αυτόν έχει προηγουμένως εισαχθεί ατσάλινη σφαίρα διαμέτρου 1.5 mm (πυκνότητας g/cm 3 ). Ο υάλινος σωλήνας (που περιέχει τη σφαίρα 69

70 καθώς και το λιποσωμικό δείγμα) τοποθετείται μέσα σε ένα θερμοστατούμενο περίβλημα. Με τη βοήθεια του θερμοστατούμενου περιβλήματος η θερμοκρασία ρυθμίζεται στους 25 ο C και διατηρείται σταθερή καθ όλη τη διάρκεια των μετρήσεων. Το κάθε λιποσωμικό δείγμα μετράται 4 φορές. Κατά τη διάρκεια της κάθε μέτρησης το θερμοστατούμενο περίβλημα (και συνεπώς ο υάλινος σωλήνας) βρίσκεται υπό γωνία 20 ο ως προς οριζόντιο άξονα. Όλο το σύστημα (περίβλημα και υάλινος σωλήνας) μπορεί να περιστρέφεται κατά 180 ο ώστε να είναι εφικτή η επανάληψη των μετρήσεων (Εικόνα 2.7). Εικόνα 2.7 Σχηματική παρουσίαση ιξωδομέτρου σφαίρας. Το λιποσωμικό δείγμα καθώς και η ατσάλινη σφαίρα εισάγονται στον υάλινο σωλήνα. Κατά τη διάρκεια της μέτρησης το θερμοστατούμενο περίβλημα βρίσκεται υπό ορισμένη γωνία (α) ως προς οριζόντιο άξονα. Ο χρόνος που χρειάζεται η κυλιόμενη σφαίρα για να διανύσει απόσταση ΑΒ (στα σημεία Α και Β υπάρχουν ανιχνευτές) χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του ιξώδους. Η ατσάλινη σφαίρα μετακινείται (κυλάει) στον υάλινο σωλήνα υπό την επίδραση της βαρύτητας. Το ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς προσδιορίζεται από το χρονικό διάστημα που απαιτείται προκειμένου η κυλιόμενη σφαίρα να διανύσει απόσταση μεταξύ δυο σημείων, στα οποία υπάρχουν ανιχνευτές. Μερικά πλεονεκτήματα του μικροϊξωδόμετρου σφαίρας είναι: α) η επαναληψιμότητα των μετρήσεων και β) ότι για τη μέτρηση του ιξώδους απαιτείται μικρός όγκος δείγματος (στην προκειμένη περίπτωση περίπου 600 μl). 70

71 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 71

72 3.1 Σύνθεση PEG-διθειόλης Παρακάτω παρατίθενται τα φάσματα 1 H-NMR των χημικών ενώσεων: α) PEG di-SMmt σε MeOD (Εικόνα 3.1), β) PEG di-thiol σε CDCl 3 (Εικόνα 3.2). Από την ανάλυση των φασμάτων προκύπτουν τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 3.1.1). Πίνακας 3.1.1: Θεωρητικός και πειραματικός αριθμός ατόμων υδρογόνου, για τα υδρογόνα b, c των ενώσεων PEG di-SH και PEG di-S-Mmt (Εικόνα 3.1 και Εικόνα 3.2). Ο πειραματικός αριθμός ατόμων (H) έχει προκύψει από την ολοκλήρωση των αντίστοιχων κορυφών στα φάσματα 1 H-NMR των ανωτέρω ενώσεων. Άτομα υδρογόνου (H) Θεωρητικός αριθμός ατόμων H Πειραματικός αριθμός ατόμων H για την PEG di-S- Mmt Πειραματικός αριθμός ατόμων H για την PEG di-SH b c Μετά την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των ανωτέρω ενώσεων, προσδιορίστηκαν τα σημεία τήξης τους. Τα σημεία τήξης των ενώσεων είναι: α) σημείο τήξης της PEG di-S-Mmt: ( o C) β) σημείο τήξης της PEG di-SH: ( o C). Όπως φαίνεται, η τήξη των ενώσεων πραγματοποιείται σε ένα πολύ στενό εύρος θερμοκρασιών. Συνεπώς, οι ενώσεις αυτές χαρακτηρίζονται από υψηλή καθαρότητα. 72

73 Εικόνα 3.1 Φάσμα 1 H-NMR της ένωσης PEG di-S-Mmt σε MeOD. 73

74 Εικόνα 3.2 Φάσμα 1 H-NMR της ένωσης PEG di-SH σε CDCl 3. 74

75 3.2 Μελέτη αντίδρασης μεταξύ ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδων PEG-διθειόλης με 1 H-NMR ανάλυση Παρακάτω παρατίθεται φάσμα 1 H-NMR CPMG των λιποσωμάτων που φέρουν στην επιφάνειά τους ομάδες μαλεϊμιδίου, πριν την προσθήκη της PEGδιθειόλης (Εικόνα 3.3). Η κορυφή στα 6.81 ppm αντιστοιχεί στα άτομα του υδρογόνου του διπλού δεσμού των ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων (Εικόνα 3.4). Η λιπιδική σύσταση των λιποσωμάτων είναι: PC/ Chol/ DSPE- PEG2000-Maleimide (2: 1: 0.03), και η λιπιδική συγκέντρωση είναι: C liposomes = 20 mg/ml. Εικόνα 3.3 Φάσμα 1 H-NMR CPMG των λιποσωμάτων που φέρουν ομάδες μαλεϊμιδίου στην επιφάνειά τους. Η κορυφή στα 6.81 ppm αντιστοιχεί στα άτομα του υδρογόνου του διπλού δεσμού των ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων. 75

76 Εικόνα 3.4 Mεγέθυνση της φασματικής περιοχής ppm του προηγούμενου φάσματος (Εικόνα 3.3). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αντίδραση μεταξύ των ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων με τις θειολομάδες της PEG-διθειόλης. Για το σκοπό αυτό, προστέθηκε ορισμένη ποσότητα PEG-διθειόλης στη λιποσωμική διασπορά, η οποία υπολογίστηκε με βάση τα moles του λιπιδίου μαλεϊμιδίου. Ειδικότερα, η ποσότητα PEG-διθειόλης που προστέθηκε ήταν: n PEG-διθειόλη =2.5*n maleimide. Για την καλύτερη μελέτη της ανωτέρω αντίδρασης ελήφθησαν φάσματα 1 H- NMR στις 0 ώρες (δηλαδή αμέσως μετά την προσθήκη της PEG-διθειόλης στα λιποσώματα), στα 30, 60 και 120 λεπτά μετά την προσθήκη της PEG-διθειόλης στα λιποσώματα. Παρακάτω παρατίθενται τα φάσματα αυτά (Εικόνα 3.5). 76

77 Εικόνα 3.5 Υπέρθεση 1 H-NMR CPMG φασμάτων, τα οποία ελήφθησαν στις 0 ώρες, 30 λεπτά, 60 και 120 λεπτά μετά την προσθήκη της PEG-διθειόλης στα λιποσώματα. Η κορυφή στα 6.81 ppm (βέλος) εξαφανίζεται στις 2 ώρες μετά την προσθήκη της PEG-διθειόλης στα λιποσώματα. Παρατηρούμε ότι η κορυφή στα 6.81 ppm μειώνεται προοδευτικά και τελικά εξαφανίζεται στις 2 ώρες μετά την προσθήκη της PEG-διθειόλης στα λιποσώματα (Εικόνα 3.5). Συνεπώς, η αντίδραση της PEG-διθειόλης με τις ομάδες μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων ολοκληρώνεται σε 2 ώρες. 3.3 Μελέτη της επίδρασης της PEG-διθειόλης στο μέγεθος των λιποσωμάτων και το ιξώδες των λιποσωμικών διασπορών Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της PEG-διθειόλης στο ιξώδες και το μέγεθος των λιποσωμάτων: α) που φέρουν ομάδες μαλεϊμιδίου στην επιφάνειά τους (Lips-Mal), β) που δε φέρουν ομάδες μαλεϊμιδίου στην επιφάνειά τους (Control Lips). Η ακριβής λιπιδική σύσταση και η λιπιδική συγκέντρωση των λιποσωμάτων φαίνεται στον Πίνακα

78 Πίνακας 3.3.1: Λιπιδική σύσταση και συγκέντρωση των λιποσωμάτων Control Lips και Lips- Mal. Λιπιδική σύσταση Μοριακή αναλογία λιπιδίων Λιπιδική συγκέντρωση (mg/ ml) PC/ Chol/ DSPE-PEG2000 methoxy (Control Lips) 2: 1: 0.03 PC/ Chol/ DSPE-PEG2000- Maleimide (Lips-Mal) 2: 1: Στις λιποσωμικές διασπορές Lips-Mal και Control Lips προστέθηκαν συγκεκριμένες ποσότητες PEG-διθειόλης, οι οποίες υπολογίστηκαν με βάση τα moles του λιπιδίου-μαλεϊμιδίου. Συνεπώς, προέκυψαν τα δείγματα: control, x0.1, x2.5, x5, x10. Στο δείγμα control δεν προστέθηκε PEG-διθειόλη. Στο δείγμα x0.1 (είτε πρόκειται για τη λιποσωμική διασπορά Lips-Mal είτε για τη λιποσωμική διασπορά Control Lips) προστέθηκε ποσότητα PEG-διθειόλης ίση με: n PEG-διθειόλη = 0.1*n DSPE-PEG2000-Maleimide. Τα αντίστοιχα ισχύουν για τα υπόλοιπα δείγματα. Αρχικά παρουσιάζεται η επίδραση της PEG-διθειόλης στο μέγεθος των λιποσωμάτων και στη συνέχεια παρουσιάζεται η επίδρασή της στο ιξώδες των λιποσωμικών διασπορών Lips-Mal και Control Lips, για τις δυο λιπιδικές συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν. Επίδραση PEG-διθειόλης στο μέγεθος των λιποσωμάτων Στους παρακάτω πίνακες (Πίνακας και 3.3.3) αναγράφονται οι τιμές του μέσου μεγέθους των λιποσωμάτων και του δείκτη πολυδιασποράς των δειγμάτων των λιποσωμικών διασπορών Lips-Mal και Control Lips για τις δυο λιπιδικές συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν (C liposomes =20 mg/ml και C liposomes = 40 mg/ml). Στους πίνακες αυτούς δεν αναγράφεται η τιμή του ζ-δυναμικού των δειγμάτων διότι αυτό βρέθηκε κοντά στο 0 πριν και μετά την προσθήκη της 78

79 PEG-διθειόλης στα λιποσωμικά δείγματα. Η τιμή αυτή του ζ- δυναμικού οφείλεται πιθανώς στο γεγονός ότι δε χρησιμοποιήθηκε κάποιο φορτισμένο λιπίδιο (για την παρασκευή των λιποσωμάτων). Πίνακας 3.3.2: Ποσότητα PEG-διθειόλης (linker) που προστίθεται στο κάθε λιποσωμικό δείγμα, μέσο μέγεθος λιποσωμάτων και δείκτης πολυδιασποράς (PDI) για το κάθε δείγμα των λιποσωμικών διασπορών Lips-Mal και Control Lips για τη λιπιδική συγκέντρωση 20 mg/ml. PC/ Chol/ DSPE-PEG OMe (2: 1: 0.03) σε PBS, PC/ Chol/ DSPE-PEG2000- Maleimide (2: 1: 0.03) σε PBS, Control Lips Lips- Mal Δείγματα Μέση υδροδυναμική διάμετρος (nm) C liposomes =20mg/ml PDI Μέση υδροδυναμική διάμετρος (nm) control ± ± ± ± x ± ± ± ± x ± ± ± ± x ± ± ± ± x ± ± ± ± PDI Πίνακας 3.3.3: Ποσότητα PEG-διθειόλης (linker) που προστίθεται στο κάθε λιποσωμικό δείγμα, μέσο μέγεθος λιποσωμάτων και δείκτης πολυδιασποράς (PDI) για το κάθε δείγμα των λιποσωμικών διασπορών Lips-Mal και Control Lips για τη λιπιδική συγκέντρωση 40 mg/ml. PC/ Chol/ DSPE-PEG OMe (2: 1: 0.03) σε PBS, PC/ Chol/ DSPE-PEG2000- Maleimide (2: 1: 0.03) σε PBS, Control Lips Lips- Mal Δείγματα Μέση υδροδυναμική διάμετρος (nm) C liposomes =40mg/ml PDI Μέση υδροδυναμική διάμετρος (nm) control ± ± ± ± x ± ± ± ± x ± ± ± ± x ± ± ± ± x ± ± ± ± PDI 79

80 Από τους ανωτέρω πίνακες (Πίνακες και 3.3.3) φαίνεται ότι η προσθήκη (διαφορετικών ποσοτήτων) PEG-διθειόλης στη λιποσωμική διασπορά Lips- Mal (και στις δυο λιπιδικές συγκεντρώσεις) προκαλεί αύξηση της μέσης υδροδυναμικής διαμέτρου σε σχέση με το λιποσωμικό δείγμα control. Αντίθετα, η προσθήκη των ίδιων ποσοτήτων PEG-διθειόλης στη λιποσωμική διασπορά Control Lips δεν προκαλεί αύξηση του μεγέθους των λιποσωμάτων σε σχέση με το δείγμα control. Πιο συγκεκριμένα, μετά την προσθήκη της PEG-διθειόλης στη λιποσωμική διασπορά Control Lips το μέγεθος των λιποσωμάτων κυμαίνεται μέσα σε ένα στενό εύρος τιμών ( nm). Η αύξηση του μεγέθους των λιποσωμάτων, μετά την προσθήκη της PEGδιθειόλης στη λιποσωμική διασπορά Lips-Mal, μπορεί να αποδοθεί στην αντίδραση τύπου Michael ανάμεσα στις ομάδες μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και τις θειολομάδες της PEG-διθειόλης, η οποία είναι πιθανόν να προκαλεί τη συσσωμάτωση των λιποσωμάτων. Επίδραση PEG-διθειόλης στο ιξώδες των λιποσωμικών διασπορών Παρακάτω παρατίθενται διαγράμματα (Διάγραμμα και 3.1.2) στα οποία απεικονίζεται το ιξώδες (viscosity) των λιποσωμικών δειγμάτων έναντι της ποσότητας της PEG-διθειόλης που προστίθεται στις λιποσωμικές διασπορές Control Lips και Lips-Mal, για τις λιπιδικές συγκεντρώσεις C liposomes =20 mg/ml και C liposomes =40 mg/ml. 80

81 Διάγραμμα Ιξώδες λιποσωμικών δειγμάτων έναντι της ποσότητας της PEGδιθειόλης που προστίθεται στις λιποσωμικές διασπορές Lips-Mal και Control Lips για λιπιδική συγκέντρωση C liposomes =20 mg/ml. Οι αστερίσκοι δηλώνουν τη στατιστική σημαντικότητα των διαφορών. Στο επόμενο διάγραμμα (Διάγραμμα 3.3.2) προστίθεται μια επιπλέον ράβδος. Η ράβδος αυτή αντιστοιχεί στο PBS (το μέσο στο οποίο διασπείρονται τα λιποσώματα). Στο PBS προστίθενται οι ίδιες ποσότητες PEG-διθειόλης με εκείνες που προστίθενται στις λιποσωμικές διασπορές Control Lips και Lips- Mal. 81

82 Διάγραμμα Ιξώδες δειγμάτων έναντι της ποσότητας της PEG-διθειόλης που προστίθεται στα εξής μέσα: PBS, Control Lips και Lips-Mal για λιπιδική συγκέντρωση C liposomes =40 mg/ml. Οι αστερίσκοι δηλώνουν τη στατιστική σημαντικότητα των διαφορών. Από τα ανωτέρω διαγράμματα (Διαγράμματα και 3.3.2) φαίνεται ότι: Για το ίδιο λιποσωμικό δείγμα (δηλαδή προστίθεται η ίδια ποσότητα PEGδιθειόλης στις λιποσωμικές διασπορές Lips-Mal και Control Lips), οι τιμές ιξώδους για τις δυο λιποσωμικές διασπορές διαφέρουν ανάλογα με τη λιπιδική σύσταση των λιποσωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, η τιμή ιξώδους της λιποσωμικής διασποράς Lips-Mal είναι σημαντικά μεγαλύτερη από το ιξώδες της διασποράς Control Lips για το δείγμα x2.5 (και στις δυο λιπιδικές συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν), παρόλο που προστίθεται η ίδια ποσότητα PEG-διθειόλης στις λιποσωμικές διασπορές Control Lips και Lips-Mal. Το ίδιο ισχύει για τα δείγματα x5, x10. Επιπλέον, οι διαφορές αυτές στις τιμές του ιξώδους μεταξύ των δυο λιποσωμικών διασπορών (Lips-Mal και Control Lips) είναι πιο εμφανείς, όταν η λιπιδική συγκέντρωση των λιποσωμάτων είναι C liposomes =40 mg/ml. Οι διαφορές στις τιμές του ιξώδους μεταξύ των δυο λιποσωμικών διασπορών 82

83 SIZE (nm) μπορούν να αποδοθούν στην αντίδραση μεταξύ ομάδων μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και θειολομάδων PEG-διθειόλης. Επίδραση της PEG-διθειόλης στο μέγεθος των λιποσωμάτων και το ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς, λιποσωμάτων με λιπιδική σύσταση PC/ Chol/ DSPE-PEG2000- Maleimide/ DSPE-PEG2000 methoxy (Lips- Mal- PEGmethoxy) 2:1: 0.03: 0.15 και λιπιδική συγκέντρωση 40 mg/ml. Πρόκειται για λιποσώματα που φέρουν στην επιφάνειά τους ομάδες μαλεϊμιδίου (λιπίδιο DSPE-PEG2000-Maleimide) καθώς και αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης (λιπίδιο DSPE-PEG2000 methoxy). Το PEGmethoxy προστίθεται στη λιποσωμική μεμβράνη σε ποσοστό 5%. Παρακάτω παρατίθενται διαγράμματα (Διάγραμμα και 3.3.4): μεγέθους των λιποσωμάτων καθώς και ιξώδους των λιποσωμικών διασπορών Lips- Mal και Lips-Mal-PEGmethoxy έναντι της ποσότητας της PEG-διθειόλης που προστίθεται σε αυτές τις λιποσωμικές διασπορές (Lips Mal-PEGmethoxy και Lips-Mal) Lips- Mal- PEGmethoxy Lips- Mal Cliposomes=40 mg/ml control npeg-dithiol/ndspe-peg2000-mal Διάγραμμα Μέγεθος λιποσωμάτων (των λιποσωμικών δειγμάτων) έναντι της ποσότητας της PEG-διθειόλης που προστίθεται στις λιποσωμικές διασπορές Lips- Mal-PEGmethoxy και Lips-Mal. 83

84 Διάγραμμα Ιξώδες λιποσωμικών δειγμάτων έναντι της ποσότητας της PEGδιθειόλης που προστίθεται στις λιποσωμικές διασπορές Lips-Mal-PEGmethxy και Lips-Mal για λιπιδική συγκέντρωση C liposomes = 40 mg/ml. Οι αστερίσκοι δηλώνουν τη στατιστική σημαντικότητα των διαφορών. Από τα ανωτέρω διαγράμματα (Διάγραμμα και 3.3.4) φαίνεται ότι: Η επίδραση του λιπιδίου PEGmethoxy είναι πιο εμφανής στο ιξώδες του λιποσωμικού δείγματος x2.5 (Διάγραμμα 3.3.4). Πιο αναλυτικά, για το δείγμα αυτό, η τιμή ιξώδους της λιποσωμικής διασποράς Lips-Mal είναι σημαντικά μεγαλύτερη από το ιξώδες της διασποράς Lips-Mal-PEGmethoxy. Αυτή η διαφορά (στις τιμές του ιξώδους) μεταξύ των δυο λιποσωμικών διασπορών θα μπορούσε να αποδοθεί στο γεγονός ότι οι αλυσίδες της πολυαιθυλενογλυκόλης είναι πιθανό να παρεμποδίζουν την πρόσβαση της PEG-διθειόλης στις ομάδες μαλεϊμιδίου των λιποσωμάτων και συνεπώς να παρεμποδίζουν την αντίδραση μεταξύ μαλεϊμιδίου- θειόλης. Επίδραση του μεγέθους των λιποσωμάτων στο ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς Παρακάτω παρατίθεται πίνακας που συσχετίζει το μέγεθος των λιποσωμάτων με το ιξώδες της λιποσωμικής διασποράς (Πίνακας 3.3.4). Με το πείραμα αυτό 84