ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 «ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΟΡΦΗΣ ΓΙΑ ΚΟΛΠΙΚΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΥ MC-1220» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΠΥΡΙ ΩΝ ΜΟΥΡΤΑΣ ΠΑΤΡΑ 2010

2 ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σ. Αντιµησιάρη (Επιβλέπουσα) Καθηγήτρια Τµήµα Φαρµακευτικής K. Αυγουστάκης Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµα Φαρµακευτικής Π. Κλεπετσάνης Επίκουρος Καθηγητής Τµήµα Φαρµακευτικής 2

3 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ (Αλφαβητική παράθεση) BSE Back Scattered Electrons (οπίσθια σκέδαση ηλεκτρονίων) CD Cyclodextrin (Κυκλοδεξτρίνη) Chol Cholesterol (Χοληστερόλη) CL conventional liposomes, C-liposomes (συµβατικά λιποσώµατα) CMC critical micelle concentration (κρίσιµη συγκέντρωση µικκυλίων) DNA Deoxyribonucleic acid ( εοξυριβονουκλεϊκό οξύ) DRV Dehydration Rehydration Vesicles Αφυδατωµένα Ενυδατωµένα σωµατίδια DSPC Distearoylο-glycerophosphocholine (διστεαροϋλφωσφατιδυλοχολίνη) FTS Freeze thaw sonication method (Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση) GL Glycerine (Γλυκερίνη) HDL High-density lipoprotein (υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη) 3

4 HEC Hydroxyethylceluloze (υδροξυαιθυλοσελουλόζη) HIV Human Immunodeficiency Virus (ανθρώπινος ανοσοελλειµµατικός ιός) ΗΜ-HEC Hydrophobically modified Hydroxyethylcellulose (Υδροφοβικώς τροποποιηµένη Υδροξυµεθυλοσελουλόζη) HPC Hydrogenated Phosphatidylocholine (Υδρογονωµένη φωσφατιδυλοχολίνη) HP-β-CD Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (Υδροξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη) HPLC High-performance liquid chromatography 9Υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης) LUV Large Unilamellar Vesicles (Μεγάλα µονοστοιβαδιακά σωµατίδια) MLV Multilamellar Vesicles (Πολυστοιβαδιακά σωµατίδια) ΜΟ Mineral Oil MVV Multivesicular vesicles (Πολυ-διαµερισµατικά) NNRTI Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (µη-νουκλεοτιδικός αναστολέας της αντίστροφης µεταγραφάσης) 4

5 OLV OligoLamellar Vesicles (Ολιγοστοιβαδιακά σωµατίδια) PC Phosphatidylocholine (Φωσφατιδυλοχολίνη) PCS Photon Correlation Spectroscopy (Φασµατοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων) PEG polyethylene glycol (πολυαιθυλενογλυκόλη) PG Propylene Glycol (προπυλενογλυκόλη) PS φωσφατιδυλοσερίνη REV Reverse-phase evaporation vesicles (Αναστροφής φάσης εξατµιζόµενα σωµατίδια) RES ( ΕΣ) Reticuloendothelial system ( ικτυοενδοθηλιακό σύστηµα) SB sodium benzoate (βενζοϊκό νάτριο) SEE Secondary Electron Emission (δευτεροταγή εκποµπή ηλεκτρονίων) SEM Scanning Electron Microscopy (Ηλεκτρονική µικροσκοπία σάρωσης) 5

6 SL sterically stabilized liposomes (Στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα λιποσώµατα) SM σφιγγοµυελίνη SUV Small Unilamellar Vesicles (Μικρά µονοστοιβαδιακά σωµατίδια) TBS Tris-buffered saline (Tris Ρυθµιστικό ιάλυµα) Tc transition temperature (θερµοκρασία µετάπτωσης; κρίσιµη θερµοκρασία) TEM Transmission Electron Microscopy (Ηλεκτρονική µικροσκοπία διερχόµενης δέσµης) T m θερµοκρασία τήξης ULV UniLamellar Vesicles (Μονοστοιβαδιακά σωµατίδια) 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Προκειµένου να παρεµποδιστεί διάδοση του σεξουαλικά µεταδιδόµενου HIV είναι απαραίτητη η ανάπτυξη κατάλληλης κολπικής φαρµακοµορφής για τοπική χορήγηση η οποία θα αποτρέπει την µετάδοση του ιού σε υγιείς ανθρώπους. Το κολπικό αυτό σκεύασµα είναι σηµαντικό να αποτελείται από κατάλληλη βιολογικώς δραστική ουσία και ως τέτοια µπορεί να θεωρηθεί το MC-1220 και το δραστικό (R)- εναντιοµερές του (MC-εναντιοµερές). Πρόκειται για µικροβιοκτόνα της κατηγορίας των DABOs (3,4-Dihyro-2-Alkoxy-6-Benzyl-4-OxopyrimidineS DABOs) αναστολέων και ανήκουν στην κατηγορία των µη-νουκλεοτιδικών αναστολέων της αντίστροφης µεταγραφάσης (NNRTI). Η εξαιρετικά χαµηλή διαλυτότητα του MC σε υδατικά διαλύµατα (< 3 ppm) µας οδήγησε στην ανάπτυξη µικρογαλακτωµάτων των MC και MC-εναντιοµερούς. Τα µικρογαλακτώµατα αυτά χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή φαρµακοµορφών (απλές γέλες) στις οποίες η συγκέντρωση του MC και MC-εναντιοµερούς ήταν ~1.000 και ppm αντίστοιχα. Αντιθέτως η ανάπτυξη κατάλληλης λιποσωµικής µορφής του MC (DRV_HPC/Chol(2:1) λιποσώµατα) µε υψηλές τιµές εγκλωβισµού MC, µας έδωσε την δυνατότητα παρασκευής τελικών σκευασµάτων (σύνθετες - λιποσωµικές γέλες) µε εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις MC (~ ppm). Επιπλέον και προκειµένου να αυξηθεί η συγκέντρωση του MC στις τελικές φαρµακοµορφές (λιποσωµικές γέλες), αναπτύχθηκαν σύµπλοκα υδροξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνης/mc (HP-β- CD/MC), τα οποία επίσης ενσωµατώθηκαν κατάλληλα στις τελικές λιποσωµικές φαρµακοµορφές. Τέλος αναπτύχθηκαν κατάλληλες in vitro µέθοδοι, προκειµένου να γίνει συγκριτική αξιολόγηση των νέων φαρµακοµορφών, ως προς την δυνατότητα σταδιακής αποδέσµευσης του MC στην περιοχή ενδιαφέροντος. Οι νέες φαρµακοµορφές µελετήθηκαν in vivo σε πειραµατόζωα (µακάκους), µε ιδιαίτερα επιτυχή αποτελέσµατα ως προς την πρόληψη και θεραπεία από τον HIV. 7

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ 1.1 Γενικά 1.2. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ οµικά στοιχεία λιποσωµάτων Χοληστερόλη Οµάδες φωσφολιπιδίων που χρησιµοποιούνται στην παρασκευή των λιποσωµάτων 1.3 ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΛΙΠΙ ΙΚΗΣ ΙΠΛΟΣΤΟΙΒΑ ΑΣ Ρύθµιση της ρευστότητας της λιπιδικής διπλοστοιβάδας στα λιποσώµατα ιαπερατότητα των λιπιδικών µεµβρανών 1.4 Τύποι λιποσωµάτων 1.5 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Μηχανική διασπορά Ακίδα Υπερήχων Εξώθηση µέσω φίλτρων Χρήση Μικρογαλακτωµατοποιητή Εξώθηση σε θάλαµο εφαρµογής µεγάλης πίεσης Ένεση λιπιδίων ηµιουργία µεικτών µικκυλίων µε απορρυπαντικά Άλλες ειδικές µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Αφυδατωµένα Ενυδατωµένα λιποσώµατα Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση Τεχνική ενός βήµατος 1.6 Εγκλωβισµός βιοδραστικών µορίων σε λιποσώµατα Παθητικός Ενεργητικός Εγκλωβισµός Τεχνικές Καθαρισµού Λιποσωµάτων Χρωµατογραφία στήλης ιαπίδυση Φυγοκέντρηση 1.7. Τεχνικές χαρακτηρισµού λιποσωµάτων Ηλεκτρονική Μικροσκοπία 8

9 Ηλεκτρικές Ιδιότητες λιποσωµάτων 1.8. Πορεία των λιποσωµάτων στον οργανισµό Ενδοφλέβια χορήγηση Εναλλακτικές οδοί χορήγησης 1.9. Μηχανισµός προστασίας των λιποσωµάτων από την πολυαιθυλενογλυκόλη Εναλλακτικές οδοί χορήγησης Εφαρµογές Λιποσωµάτων 1.12 Οι γέλες ως συστήµατα κολπικής χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων Εισαγωγή Οι γέλες ως συστήµατα κολπικής χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων Περιβαλλοντικά ευαίσθητες γέλες Φαρµακευτικός χαρακτηρισµός κολπικών γελών Έλεγχος αποδέσµευσης βιοδραστικών ενώσεων και µελέτες διαπερατότητας Μηχανικές µελέτες: ρεολογικές και δοµικές ιδιότητες Τοξικολογική εκτίµηση Κολπική κατανοµή και συγκράτηση Προσκόλληση στη βλέννα Συστατικά που χρησιµοποιούνται σε κολπικές γέλες Κλινική χρήση και δυνατότητες των κολπικών γελών Οι κολπικές γέλες ως µικροβιοκτόνα Κολπικές γέλες ως αντισυλληπτικά Κολπικές γέλες που προκαλούν τοκετό Άλλες εφαρµογές κολπικών γελών Πρόσφατα εµπορικές κολπικές γέλες Αποδεκτικότητα γελών για κολπική χορήγηση Συµπεράσµατα Β. ΣΚΟΠΟΣ Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Συσκευές Όργανα 2.2 Αντιδραστήρια Παρασκευή διαλύµατος καλσεΐνης 9

10 2.2.2 Προσδιορισµός συγκέντρωσης λιπιδίου Παρασκευή ρυθµιστικού διαλύµατος κιτρικών Παρασκευή διαλύµατος έκλουσης από HPLC 2.3 Μεθοδολογία Παρασκευή λιποσωµάτων που εγκλωβίζουν MC-1220 ή MC-εναντιοµερές Πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα (MLV) που εγκλωβίζουν MC-1220 ή MCεναντιοµερές Μονοστοιβαδιακά λιποσώµατα (SUV) που εγκλωβίζουν MC-1220 ή MCεναντιοµερές Αφυδατωµένα ενυδατωµένα λιποσώµατα (DRV) που εγκλωβίζουν MC-1220 ή MC-εναντιοµερές Καθαρισµός λιποσωµικών διασπορών από µη εγκλωβισµένο MC-1220 ή MCεναντιοµερούς Καθαρισµός πολυστοιβαδιακών λιποσωµάτων (MLV) από µη εγκλωβισµένο MC-1220 ή MC-εναντιοµερές Καθαρισµός µονοστοιβαδιακών λιποσωµάτων (SUV) από µη εγκλωβισµένο MC-1220 ή MC-εναντιοµερές Καθαρισµός αφυδατωµένων ενυδατωµένων λιποσωµάτων (DRV) από µη εγκλωβισµένο MC-1220 ή MC-εναντιοµερές 2.4 Μέτρηση µεγέθους λιποσωµάτων µε εγκλωβισµένο MC-1220 ή MC-εναντιοµερές 2.5 Μέτρηση συγκέντρωσης λιπιδίων 2.6 Προσδιορισµός διαλυτότητας MC-1220 ή MC-εναντιοµερούς 2.7 Παρασκευή απλών και σύνθετων γελών που περιέχουν MC-1220 ή MC-εναντιοµερές Πορεία παρασκευής µικρογαλακτώµατος (µίγµα ) {για το MC-1220 σε διάφορους παράγοντες διάλυσης} Πορεία παρασκευής µικρογαλακτώµατος (µίγµα ) {για το MC-εναντιοµερές σε διάφορους παράγοντες διάλυσης} Πορεία παρασκευής απλής (simple) γέλης {simple gel / MC-1220 ή MCεναντιοµερές} Πορεία παρασκευής σύνθετης (complex) γέλης {complex gel / DRV_MC-1220} Πορεία παρασκευής συµπλόκου HP-β-CD_MC-1220 και HP-β-CD_MCεναντιοµερές 10

11 2.7.6 Πορεία παρασκευής σύνθετης (complex) γέλης {complex gel / HP-β-CD_MC DRV_MC-1220} µε 400mg HP-β-CD/ml λιποσωµικής διασποράς 2.8 Σταθερότητα απλών και σύνθετων γελών. 2.9 Πειράµατα αποδέσµευσης MC-1220 και MC-εναντιοµερούς από λιποσωµικές διασπορές Με διαπίδυση Με τη µέθοδο της αγαρόζης 2.10 Πειράµατα αποδέσµευσης MC-1220 και MC-εναντιοµερούς από απλές (simple) και σύνθετες (complex) λιποσωµικές γέλες Με διαπίδυση Με τη µέθοδο της αγαρόζης. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ιαλυτότητα του MC ιαλυτότητα του MC-εναντιοµερούς στο µίγµα 3.3 Παρασκευή λιποσωµικών διασπορών (MLV, SUV, DRV) σε διάφορες λιπιδικές συστάσεις που εγκλωβίζουν MC Παρασκευή DRV-λιποσωµικών διασπορών που εγκλωβίζουν MC-εναντιοµερές. 3.5 Παρασκευή σκευασµάτων MC-1220 (Απλή γέλη και σύνθετες λιποσωµικές γέλες). 3.6 Παρασκευή σκευασµάτων MC-1220 και MC-εναντιοµερούς [Λιποσωµικές γέλες παρουσία συµπλόκων κυκλοδεξτρίνης (HP-β-CD-MC)]. 3.7 Σταθερότητα απλής και σύνθετης γέλης του MC Πειράµατα αποδέσµευσης MC-1220 και MC-εναντιοµερούς από λιποσωµικές διασπορές και γέλες Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµικές διασπορές και γέλες σε σύστηµα αγαρόζης α Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµικές διασπορές σε σύστηµα αγαρόζης β Αποδέσµευση MC-1220 από απλή γέλη και λιποσωµικές γέλες σε σύστηµα αγαρόζης γ Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµική γέλη σε σύστηµα αγαρόζης παρουσία PC-λιπιδίου δ Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµική γέλη σε σύστηµα αγαρόζης ε Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµική γέλη MC-1220 σε σύστηµα αγαρόζης στ Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµική γέλη MC-1220 σε σύστηµα 11

12 αγαρόζης Αποδέσµευση MC-1220 από λιποσωµικές γέλες παρουσία κυκλοδεξτρίνης σε σύστηµα αγαρόζης Αποδέσµευση MC-1220 και MC-εναντιοµερούς από λιποσωµικές διασπορές και γέλες µε διαπίδυση α Σύγκριση λιποσωµικής διασποράς MC-1220 και λιποσωµικής διασποράς MC παρουσία HP-β-CD β Σύγκριση λιποσωµικής γέλης HP-β-CD_MC-1220 (σύµπλοκο)/drv_mc και λιποσωµικής γέλης DRV_MC-1220 (απουσία HP-β-CD) γ Σύγκριση λιποσωµικής γέλης {DRV_MC HP-β-CD (στερεή)} και λιποσωµικής γέλης DRV_MC-1220 (απουσία HP-β-CD) δ Σύγκριση DRV λιποσωµικής διασποράς MC-εναντιοµερούς και λιποσωµικής διασποράς MC-εναντιοµερούς παρουσία HP-β-CD (στερεή) Ε. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΤ. ΑΝΑΦΟΡΕΣ (Αλφαβητική παράθεση) 12

13 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ 1.1 Γενικά Τα λιποσώµατα είναι σφαιρικά σωµατίδια που αποτελούνται από µία ή περισσότερες διπλοστοιβάδες λιπιδίων, οι οποίες εναλλάσσονται µε υδατικά τµήµατα. Σχηµατίζονται «αυθόρµητα» όταν τα λιπίδια διασπαρθούν σε υδατικό µέσο, προκαλώντας έτσι το σχηµατισµό πληθυσµών σωµατιδίων µε µέγεθος που ποικίλλει από µερικά νανόµετρα (nm) µέχρι µερικά µικρόµετρα (µm). Οι διπλοστοιβάδες λιποσωµάτων έχουν ως κύριο συστατικό τα φωσφολιπίδια, µολονότι και άλλα αµφίφιλα µόρια καθώς και µη ιονικά επιφανειοδραστικά µπορούν να συµµετέχουν στη δοµή τους (Εικ.1.1). Η µορφολογία των λιποσωµάτων επιτρέπει τον εγκλωβισµό διαφόρων ουσιών τόσο στα υδατικά διαµερίσµατα όσο και στη λιπιδική διπλοστοιβάδα αυτών. Εικόνα 1.1 Λιποσώµατα σε τοµή Τα λιποσώµατα έχουν χρησιµοποιηθεί ως µοντέλα για τη µελέτη βιολογικών µεµβρανών επειδή η δοµή των κλειστών διπλοστοιβάδων παρουσιάζει δοµικές και λειτουργικές οµοιότητες µε τις φυσικές βιολογικές µεµβράνες, οι οποίες γίνονται περισσότερες µε κατάλληλες χηµικές τροποποιήσεις της λιποσωµικής µεµβράνης, έτσι ώστε να µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε εφαρµογές όπως στόχευση βιοδραστικών ενώσεων (drug targeting) και πρόκληση ανοσολογικών αντιδράσεων, in vivo και in vitro. Η εκτεταµένη χρήση λιποσωµικών µορφών ως οχήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων σε κύτταρα στόχους, έχει ως αποτέλεσµα να µεταβάλλονται οι φαρµακοκινητικές παράµετροι και η 13

14 κατανοµή των βιοδραστικών ενώσεων στους ιστούς, ενώ συγχρόνως ελαττώνεται η τοξικότητα και αυξάνει η δραστικότητα ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ οµικά στοιχεία λιποσωµάτων Τα φωσφολιπίδια είναι τα κύρια δοµικά συστατικά των λιποσωµικών δοµών. Υπάρχουν δύο είδη φωσφολιπιδίων, τα φωσφογλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια. Η δοµή των φωσφογλυκεριδίων αποτελείται από ένα µόριο γλυκερόλης, στο οποίο λιπαρά οξέα ακυλιώνονται στις θέσεις C 1 και C 2, και από µία φωσφορική οµάδα εστεροποιηµένη στη θέση C 3. Τα λιπαρά οξέα µπορεί να είναι κορεσµένα ή ακόρεστα (Πίνακας ). Πίνακας οµή φωσφογλυκεριδίων. 14

15 Τα σφιγγολιπίδια αποτελούνται από ένα µόριο σφιγγοσίνης στο οποίο ακυλιώνεται στη θέση C-2 ένα λιπαρό οξύ και από µία φωσφορική οµάδα εστεροποιηµένη στη θέση C 3 (Πίνακας ). Πίνακας οµή Σφιγγολιπιδίων. Τα φωσφολιπίδια µπορεί να είναι ουδέτερα, όπως η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και η σφιγγοµυελίνη (SM), αρνητικά φορτισµένα, όπως η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) καθώς και θετικά φορτισµένα. Οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων στα φωσφολιπίδια συνήθως περιέχουν έναν άρτιο αριθµό ατόµων άνθρακα, συνήθως µεταξύ 14 και 24. Πιο συχνά απαντώνται τα λιπαρά οξέα µε 16 και 18 άτοµα άνθρακα. Τα λιπαρά οξέα µπορεί να είναι ακόρεστα ή κορεσµένα. Το ισόµερες που ανευρίσκεται στα ακόρεστα λιπαρά είναι σχεδόν πάντα στη cis µορφή. Ένα κεκορεσµένο λιπαρό οξύ περιέχει µόνο απλούς δεσµούς ενώ τα ακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν διπλούς δεσµούς στην υδρογονανθρακική αλυσίδα τους. Οι διπλοί δεσµοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων χωρίζονται από µια τουλάχιστον µεθυλενική οµάδα. Η διαµόρφωση και ο αριθµός αυτών των διπλών δεσµών καθώς και το µήκος της αλυσίδας επιδρά στο σηµείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της µεµβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είµαι «µίγµατα» επειδή τα λιπαρά οξέα που συνάπτονται στις θέσεις 1 και 2 του ίδιου µορίου συνήθως είναι διαφορετικά µεταξύ τους. Η 15

16 αλυσίδα του λιπαρού οξέως στην εσωτερική θέση είναι ακόρεστη ενώ της εξωτερικής θέσης είναι κεκορεσµένη και µεγαλύτερου µήκους όσο αφορά τον αριθµό των ατόµων άνθρακα Χοληστερόλη Από τα συνήθη δοµικά συστατικά των λιποσωµάτων είναι και η χοληστερόλη, η οποία µόνη της δε σχηµατίζει διπλοστοιβάδες, ενσωµατώνεται όµως σε φωσφολιπιδικές µεµβράνες σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις (2:1 ή ακόµα και 1:1 mol/mol φωσφολιπιδίου/χοληστερόλης), επιφέροντας αλλαγές στις ιδιότητές των λιποσωµάτων (π.χ. στη ρευστότητα και διαπερατότητά τους). Εικόνα Η ενσωµάτωση της χοληστερόλης λαµβάνει χώρα όπως φαίνεται στην εικόνα Ο ογκώδης στεροειδής πυρήνας της χοληστερόλης περιέχει ένα υδροξύλιο στη µια άκρη και µια ευέλικτη υδρογονανθρακική ουρά στην άλλη πλευρά. Η χοληστερόλη εισχωρεί στις διπλοστοιβάδες µε τον επιµήκη της άξονα κάθετο προς το µεµβρανικό επίπεδο. Η υδροξυλοµάδα της χοληστερόλης σχηµατίζει δεσµούς υδρογόνου µε το καρβονυλικό οξυγόνο από την πολική κεφαλή ενός φωσφολιπιδίου ενώ η υδρογονανθρακική ουρά της χοληστερόλης βρίσκεται µέσα στον µη πολικό πυρήνα της διπλοστοιβάδας. Η παρουσία της χοληστερόλης µεταβάλλει επιπλέον τη θερµοκρασία µετάβασης φάσης των λιποσωµικών µεµβρανών, ανάλογα µε την κατάσταση του λιπιδίου. Όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερµοκρασίες υψηλότερες από την θερµοκρασία µετάβασης φάσης, η χοληστερόλη συµβάλλει στη µείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συµπύκνωση τελικά της µεµβράνης και µείωση της ρευστότητάς της. Αντίθετα, χαµηλότερα από την θερµοκρασία µετάβασης φάσης η απόσταση µεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της µεµβράνης αυξάνει. 16

17 1.2.3 Οµάδες φωσφολιπιδίων που χρησιµοποιούνται στην παρασκευή των λιποσωµάτων Υπάρχουν πέντε κύριες οµάδες φωσφολιπιδίων διαθέσιµα που µπορούν να χρησιµοποιηθούν στην παρασκευή των λιποσωµάτων. 1. Φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης. 2. Τροποποιηµένα φωσφολιπίδια από φυσικές πηγές. 3. Ηµι-συνθετικά φωσφολιπίδια. 4. Εξ ολοκλήρου συνθετικά φωσφολιπίδια. 5. Φωσφολιπίδια µε µη-φυσικές κεφαλές (non-natural head groups) Η φωσφατιδυλοχολίνη (PC), φωσφατιδυλαιθανολαµίνη (PE) και φωσφατιδυλοσερίνη (PS) είναι τα πιο συχνά χρησιµοποιούµενα φωσφολιπίδια κατά την παρασκευή των λιποσωµάτων. Μερικά χαρακτηριστικά λιπιδίων και άλλων ουσιών που χρησιµοποιούνται στην παρασκευή των λιποσωµάτων είναι τα παρακάτω: Egg phosphatidylcholines γνωστές και ως λεκιθίνες: Αποτελούν τα κύρια συστατικά που χρησιµοποιούνται συχνότερα κατά την παρασκευή λιποσωµάτων για πολλές εφαρµογές εξαιτίας του χαµηλού κόστους σχετικά µε τα αλλά φωσφολιπίδια και του ουδέτερου φορτίου που τους καθιστά χηµικά αδρανείς. Οι λεκιθίνες µπορεί να προέρχονται από φυσικές ή να είναι συνθετικά. Οι πιο γνωστές φυσικές πήγες είναι ο κρόκος των αυγών και σπόροι σόγιας. Λιγότερα εύκολες πηγές αποτελούν η καρδιά και η σπονδυλική στήλη βοοειδούς. Dipalmitoyl-PC: Συνθετική πλήρως κεκορεσµένη φωσφατιδυλοχολίνη. Distearoyl-PC: Λιγότερα διαπερατή σε υδατική φάση από την egg-pc. Sphingomyelin: Συχνά προτιµάται στις ανοσολογικές µελέτες από την egg-pc. Βελτιώνει την σταθερότητα λιποσωµάτων in-vivo. Cholesterol: Μειώνει τη διαπερατότητα των λιποσωµικών φορέων που αποτελούνται από egg-pc. Η µέγιστη επί τοις εκατό σε mol αναλογία ενσωµάτωσης χοληστερόλης σε σχέση µε τα φωσφολιπίδια της διπλοστοιβάδας φτάνει το 50%. Stearylamine: ίνει ένα δίχτυο θετικού φορτιού. εν απαντάται στη φύση και µπορεί να είναι τοξική στα κύτταρα. Phosphatidic acid: Προσδίδει αρνητικό φορτίο στη µεµβράνη. Phosphatidylserine: Προσδίδει αρνητικό φορτίο στη µεµβράνη. Cardiolipid: Αντιγονικό λιπίδιο που χρησιµοποιείται σε ανοσολογικές εφαρµογές. 17

18 Phosphatidylethanolamine: ε σχηµατίζει έγκλειστους φορείς από µόνο του. Είναι χρήσιµο για τη σύζευξη µορίων στην εξωτερική επιφάνεια των λιποσωµάτων. Τα υποκατεστηµένα παράγωγα χρησιµοποιούνται στις ανοσολογικές µελέτες. Lysophosphatidylcholine: Αυξάνει τη διαπερατότητα των λιποσωµάτων. Μπορεί να ενισχύει τη σύντηξη λιποσωµάτων µε τα κύτταρα. 1.3 ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΛΙΠΙ ΙΚΗΣ ΙΠΛΟΣΤΟΙΒΑ ΑΣ Οι λιπιδικές µεµβράνες δεν είναι άκαµπτες και αδιατάρακτες δοµές. Αντιθέτως τα λιπίδια βρίσκονται σε διαρκή κίνηση µέσα στο επίπεδο της µεµβράνης. Παρατηρείται πλευρική και flipflop (η διαπέραση από το ένα πλευρό της διπλοστοιβάδας στο άλλο) κίνηση των λιπιδίων µέσα στη διπλοστοιβάδα. Η λιπιδική σύσταση ρυθµίζει τις φυσικοχηµικές ιδιότητες των µεµβρανών όπως: δοµή ρευστότητα και ίξωδο-ελαστικές ιδιότητες διαπερατότητα καταπόνηση σε διάφορα στρες (π.χ. διατµητική τάση). πυκνότητα φορτίου Ρύθµιση της ρευστότητας της λιπιδικής διπλοστοιβάδας στα λιποσώµατα Οι αλυσίδες λιπαρών οξέων στα µόρια των φωσφολιπιδίων στις µεµβρανικές διπλοστοιβάδας µπορεί να βρίσκονται σε µια καλώς διατεταγµένη και δύσκαµπτη διάταξη (φάση γέλης) ή σε µια άτακτη και ρευστή κατάσταση (υγρή φάση ή κρυσταλλική φάση). Στην καλώς διατεταγµένη κατάσταση όλοι οι δεσµοί C-C είναι σε στερεοδιάταξη trans, ενώ στην άτακτη κατάσταση ορισµένοι είναι σε στερεοδιάταξη gauche. Σχήµα Απεικόνιση α) φάσης γέλης και β) υγρής κρυσταλλικής φάσης της λιπιδικής διπλοστοιβάδας. 18

19 Η µετάπτωση από τη δύσκαµπτη (όλο trans) στη ρευστή (εν µέρει gauche) κατάσταση όπου η ελευθερία κινήσεως των µορίων αυξάνεται συµβαίνει κάπως απότοµα όταν η θερµοκρασία έχει ξεπεράσει τη θερµοκρασία τήξης T m. Αυτή η θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης εξαρτάται από: το µήκος των αλυσίδων των λιπαρών οξέων και το βαθµό ακορεστότητάς τους. Η δύσκαµπτη κατάσταση ευνοείται από την παρουσία κορεσµένων λιπαρών οξέων γιατί οι άκαµπτες υδρογονανθρακικές αλυσίδες τους αλληλεπιδρούν µε µεγάλη ευκολία µεταξύ τους. Αντίθετα ένας διπλός δεσµός cis προκαλεί µια κάµψη στην υδρογονανθρακική αλυσίδα. Αυτή η κάµψη παρεµποδίζει το καλώς διατεταγµένο πακετάρισµα των αλυσίδων των λιπαρών οξέων µε αποτέλεσµα την ελάττωση της T m. Η θερµοκρασία µετάπτωσης επηρεάζεται επίσης από το µήκος της αλυσίδας των λιπαρών οξέων. Οι επιµήκεις αλυσίδες αλληλεπιδρούν πολύ πιο έντονα µεταξύ τους παρά οι αντίστοιχες µικρότερου µήκους. Ένα άλλο συστατικό της µεµβράνης που επιδρά στη ρευστότητα είναι η χοληστερόλη. Η χοληστερόλη παρεµποδίζει την κρυστάλλωση των αλυσίδων λιπαρών οξέων παρεµβαλλόµενη µεταξύ τους. Στην πραγµατικότητα, οι υψηλές συγκεντρώσεις χοληστερόλης παρεµποδίζουν τις αλλαγές φάσης στις διπλοστοιβάδες. Μια αντίθετη δράση της χοληστερόλης είναι η στερεοχηµική παρεµπόδιση µεγάλης έκτασης κινήσεων των αλυσίδων λιπαρών οξέων, καθιστώντας έτσι τις µεµβράνες λιγότερο ρευστές. Άρα η χοληστερόλη τροποποιεί τη ρευστότητα των µεµβρανών. Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τη ρευστότητα της λιπιδικής διπλοστοιβάδας είναι το φορτίο και το µέγεθος της πολικής κεφαλής των µορίων των φωσφολιπιδίων όπως και η παρουσία ιόντων. Η θερµοκρασία µετάπτωσης για τα φωσφολιπίδια που προέρχονται από το κρόκο αυγού ποικίλλει µεταξύ -15 C (υψηλό βαθµό ακορεστότητας) και πάνω από 50 C για πλήρη κεκορεσµένα φωσφολιπίδια όπως είναι η διστεαροϋλφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC). Στον πίνακα φαίνονται οι θερµοκρασίες µετάπτωσης διαφόρων φωσφολιπιδίων. Μίγµατα δυο συνθετικών λεκιθίνων µε διαφορετικού µήκους αλυσίδες δίνουν την κύρια µετάβαση σε θερµοκρασία ενδιάµεση αυτής που έχουν τα συστατικά τους, εκτός εάν τα µήκη των ανθρακικών αλυσίδων είναι πολύ διαφορετικά οπότε παρατηρούνται δυο διαφορετικές µεταβάσεις. Στη θερµοκρασιακή περιοχή ανάµεσα στις δυο µεταβάσεις, η στερεά και η υγρή φάση συνυπάρχουν εµπλουτίζοντας η µια την άλλη. Η κατανόηση των µεταπτώσεων φάσεων και της ρευστότητας της µεµβράνης είναι σηµαντικό τόσο στην κατασκευή όσο και στην αξιοποίηση 19

20 Πίνακας Θερµοκρασίες µετάπτωσης διαφόρων φωσφολιπιδίων Φωσφολιπίδιο dic22 Φωσφατιδυλοχολίνη dic18 Φωσφατιδυλοχολίνη dic16 Φωσφατιδυλοχολίνη dic14 Φωσφατιδυλοχολίνη dic18:1 Φωσφατιδυλοχολίνη dic16 Φωσφατιδυλοσερίνη (low ph) dic16 Φωσφατιδυλοσερίνη (high ph) dic16 Φωσφατιδυλαιθανολαµίνη dic14 Φωσφατιδυλαιθανολαµίνη Θερµοκρασία µετάπτωσης ( C) των λιποσωµάτων επειδή η συµπεριφορά φάσης της λιποσωµικής µεµβράνης καθορίζει τέτοιες ιδιότητες όπως διαπερατότητα, σύντηξη, συσσωµάτωση, πρόσδεση πρωτεϊνών οι οποίες συνολικά επηρεάζουν σηµαντικά τη σταθερότητα των λιποσωµάτων καθώς και τη συµπεριφορά τους στα βιολογικά συστήµατα ιαπερατότητα των λιπιδικών µεµβρανών Οι λιπιδικές διπλοστοιβάδες είναι ηµιδιαπερατές µεµβράνες, δηλαδή εµφανίζουν εκλεκτικότητα ως προς τις ουσίες που θα περάσουν µέσα από την µεµβράνη. Ο µηχανισµός µε το οποίο οι ουσίες περνάνε µέσα από τη λιποσωµική µεµβράνη είναι η απλή διάχυση. Εποµένως η ταχύτητα διάχυσης των µορίων και των ιόντων διαµέσου της µεµβράνης διαφέρει σηµαντικά. Τα αέρια O 2, CO 2, διαχέονται πολύ γρήγορα µέσω της µεµβράνης. Για µόρια µε µεγάλη διαλυτότητα τόσο σε οργανικό όσο και σε ένα υδατικό µέσο µια µεµβράνη φωσφολιπιδίων αποτελεί ένα ισχνό φραγµό. Από την άλλη, πολικά µόρια όπως γλυκόζη και συστατικά µεγαλύτερου µοριακού βάρους διαπερνούν διαµέσου της µεµβράνης µόνο πολύ αργά. Μικρότερα µόρια µε ουδέτερο φορτίο όπως νερό και ουρία µπορούν να διαχυθούν πολύ γρήγορα ενώ τα φορτισµένα ιόντα διαφέρουν σηµαντικά στη συµπεριφορά τους. Τα µόρια του νερού βρίσκονται βαθιά στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας έως τη χαµηλότερη καρβονυλοµάδα. Τα πρωτόνια και τα ιόντα υδροξυλίου διαπερνούν τη µεµβράνη πολύ γρήγορα. Τα ιόντα νατρίου και καλίου διασχίζουν τη µεµβράνη πολύ αργά σε σχέση µε τα πρωτόνια καθώς επίσης και µε τα ανιόντα όπως τα χλωριούχα και τα νιτρικά. Φαίνεται ότι ο µηχανισµός διάχυσης των µεταλλικών ιόντων δια της µεµβράνης είναι πολύ διαφορετικός από εκείνο των άλλων κατηγοριών µορίων όπως υποδεικνύεται και από το γεγονός ότι η διαπερατότητα των ιόντων νατρίου µειώνεται καθώς 20

21 αυξάνεται ο βαθµός ακορεστότητας των αλυσίδων λιπαρών οξέων ενώ η διαπερατότητα της γλυκόζης αυξάνεται ελαφρώς καθώς αυξάνεται ο βαθµός ακορεστότητας των αλυσίδων λιπαρών οξέων. Μια εξήγηση µπορεί να είναι ότι τα µεταλλοϊόντα κινούνται διάµεσου προσωρινών συστροφών των αλυσίδων των λιπαρών οξέων που δηµιουργούνται ως αποτέλεσµα περιστροφών των απλών δεσµών. Αντίθετα το µόριο της γλυκόζης είναι πολύ µεγάλο για να χρησιµοποιήσει αυτές τις αλλαγές διαµόρφωσης στα ξεχωριστά µόρια. Παρόλα αυτά αύξηση στο µήκος της αλυσίδας δηλαδή στο πάχος της διπλοστοιβάδας έχει την ίδια επίδραση σε όλες τις ουσίες φορτισµένες και µη Αυτό σηµαίνει ότι σε όλες τις περιπτώσεις µειώνει το ρυθµό διάχυσης. Η διαπερατότητα των λιποσωµικών µεµβρανών στο ασβέστιο και άλλες πολυσθενικά ιόντα είναι µικρότερη από ότι για τα µονοσθενικά ιόντα όπως το νάτριο και αυτό µπορεί να οφείλεται στο µεγαλύτερο φορτίο και τη µεγαλύτερη διάµετρο της στοιβάδας νερού που περιβάλλει τα ιόντα. Το γεγονός ότι υπάρχουν διαφορετικοί µηχανικοί για τη διαπερατότητα των µορίων διαµέσου της λιπιδικής διπλοστοιβάδας ενισχύεται από τη διαφορετική συµπεριφορά µεταξύ των πρωτονίων και µεταλλοϊόντων στη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσεως. Η διαπερατότητα των πρωτονίων αυξάνεται στην κρίσιµη θερµοκρασία (Τ C ) και παραµένει υψηλή καθώς η θερµοκρασία αυξάνεται αντίθετα µε τα ιόντα νατρίου και πολλές άλλες διαλυµένες ουσίες για τις οποίες η διαπερατότητα πάνω και κάτω από τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσεως είναι χαµηλότερη από τη διαπερατότητα της µεµβράνης σε αυτήν τη θερµοκρασία. Εποµένως τα πρωτόνια και τα µόρια νερού των οποίων η µεταφορά είναι σηµαντικά πιο γρήγορη από τα ιόντα νατρίου έχουν επιπλέον οδούς διαµέσου της µεµβράνης οι οποίοι είναι ποιοτικά διαφορετικοί, πιθανώς υπό τη µορφή των διαύλων νερού. Η πιο πάνω συζήτηση αναφέρεται σε λιποσώµατα στα οποία τα εσωτερικά και εξωτερικά υδατικά διαµερίσµατα είναι σε ισορροπία µεταξύ τους. Αν και οι φωσφολιπιδικές διπλοστοιβάδες είναι ηµιδιαπερατές, παρόλο αυτό µια διαφορά συγκέντρωσης της διαλυµένης ουσίας µεταξύ των δυο πλευρών της µεµβράνης µπορεί να δηµιουργήσει διαφορά οσµωτικής πίεσης που θα οδηγήσει στη συσσώρευση των µορίων του νερού στη µια πλευρά. Στην περίπτωση που η συγκέντρωση της διαλυµένης ουσίας εγκλωβισµένης εντός των λιποσωµάτων είναι υψηλή ενώ η συγκέντρωση του ρυθµιστικού διαλύµατος στο οποίο εναιωρούνται τα λιποσώµατα είναι χαµηλή, τα λιποσώµατα θα υπερδιογκωθούν καθώς ο όγκος του νερού στο εσωτερικό διαµέρισµα θα αυξάνεται σε τέτοιο βαθµό που η επιφάνεια της µεµβράνης αυξάνεται σηµαντικά καθώς αυξάνεται αντίστοιχα ο χώρος των γειτονικών µορίων των φωσφολιπιδίων. Κάτω από αυτές τις συνθήκες µια αναπτυσσόµενη διαρροή διαµέσου της µεµβράνης µπορεί να συµβαίνει για διαλυµένες ουσίες µε µέγεθος µορίων ίσο ή µικρότερο από αυτό των µορίων της γλυκόζης. Η διαρροή σουκρόζης δεν επηρεάζεται. Σε µερικές περιπτώσεις, η πίεση που δηµιουργείται µπορεί να είναι ικανή να προκαλέσει εντελώς τη ρήξη της 21

22 µεµβράνης, δίνοντας αφορµή για να χαθεί το όλο περιεχόµενο των λιποσωµάτων στο κύριο όγκο της υδατικής φάσης, πριν σχηµατιστούν ξανά τα λιποσώµατα. Χαµηλή διαπερατότητα µεµβράνης Υψηλή διαπερατότητα µεµβράνης Χαµηλή διαπερατότητα µεµβράνης Σχήµα Σχέση µεταξύ θερµοκρασίας και διαπερατότητας της λιπιδικής διπλοστοιβάδας. Μερικοί παράγοντες που επηρεάζουν τη διαπερατότητα της λιπιδικής διπλοστοιβάδας σε διάφορα µόρια και ιόντα αναφέρονται παρακάτω: Παράγοντες που επηρεάζουν τη ρευστότητα της µεµβράνης όπως: λιπιδική σύσταση, παρουσία χοληστερόλης και θερµοκρασία. Χηµική φύση των µορίων (εάν το µόριο είναι ένα λιπίδιο τότε διαλύεται εύκολα στα λιπιδικά συστατικά της µεµβράνης και τη διαπερνά αµέσως) Το µοριακό ή ατοµικό βάρος (τα µικρότερα σε µέγεθος µόρια περνάνε πιο γρήγορα τη µεµβράνη) Το σθένος των ιόντων και το βαθµό ενυδάτωσης (το µόριο γίνεται πιο πολικό και εποµένως δύσκολα περνά τη λιπιδική διπλοστοιβάδα). Από τη κλίση της διαβάθµισης συγκέντρωσης. Από το pka της διαχεόµενης ουσίας και το ph του περιβάλλοντος. 1.4 Τύποι λιποσωµάτων Το µέγεθος των λιποσωµάτων είναι σηµαντική παράµετρος καθορισµού του χρόνου ηµιζωής των λιποσωµάτων. Το µέγεθος και ο αριθµός των διπλοστοιβάδων επηρεάζουν το ποσοστό της βιοδραστικής ένωσης που εγκλωβίζεται στα λιποσώµατα. Το µέγεθος των λιποσωµάτων ποικίλλει από 0,025 µm (25 nm) έως 10 µm και ο αριθµός των διπλοστοιβάδων από µία µέχρι και δεκάδες. Ο καθοριστικός παράγοντας που προσδιορίζει το µέγεθος και τον αριθµό διπλοστοιβάδων είναι η µέθοδος παρασκευής των λιποσωµάτων. Έτσι µε βάση αυτές τις παραµέτρους τα λιποσώµατα κατατάσσονται σε τρεις κύριες κατηγορίες: 22

23 Πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα (Multilamellar vesicles, MLV) Αποτελούνται από πέντε έως δεκάδες οµόκεντρες πολλαπλές διπλοστοιβάδες, µε µέγεθος που κυµαίνεται από 100nm 1000nm (1µm). Η απόσταση µεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάµεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάµεων άπωσης. Η κυριότερη µέθοδος παρασκευής MLV λιποσωµάτων είναι η µέθοδος του Bangham (solvent evaporation method) (Bangham A.D. et al., 1965). Μεγάλα µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα (large unilamellar vesicles, LUV) Τα λιποσώµατα αυτά έχουν διάµετρο της τάξης των 1000 nm και είναι µονοστοιβαδιακά. Ανάλογα µε το επιθυµητό µέγεθος, τα LUV µπορούν να παρασκευασθούν µε διαφορετικές µεθόδους όπως η αποµάκρυνση απορρυπαντικού, η έγχυση αιθανολικού ή αιθερικού διαλύµατος φωσφολιπιδίων και η εξάτµιση διαλύτη. Μικρά µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα (small unilamellar vesicles, SUV) ιαθέτουν το µικρότερο δυνατό µέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο µπορεί να σχηµατίσει λιποσωµική µορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύµατος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των µεµβρανών. Οι µέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωµάτων είναι: (i) η κατεργασία µε υπέρηχους και (ii) η µέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - θέρµανσης (freeze - thaw). Πίνακας 1.4. Κατάταξη λιποσωµάτων σε διάφορες κατηγορίες και γενικά χαρακτηριστικά τους Τύπος σωµατιδίου Σύντµηση ιάµετρος Αριθµός διπλοστοιβάδων Μικρά µονοστοιβαδιακά SUV nm Μια λιπιδική διπλοστοιβάδα Μεγάλα µονοστοιβαδιακά LUV ~100nm Μια λιπιδική διπλοστοιβάδα Πολυστοιβαδιακά MLV ~0.5-10µm 5-20 λιπιδικές διπλοστοιβάδες Ολιγο-στοιβαδιακά OLV 0.1-1µm ~5 λιπιδικές διπλοστοιβάδες Πολυ-διαµερισµατικά MVV ~1µm Πολυδιαµερισµατική δοµή Σχήµα 1.4. Κατηγόριες λιποσωµάτων. 23

24 1.5 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηµατισµό λεπτού υµενίου (film) κατά την εξάτµιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουµένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να αποµακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χηµικά αποικοδόµηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηµατίζεται το λεπτό υµένιο, εκτίθεται σε ρεύµα αζώτου για πέντε λεπτά. Η ενυδάτωση (hydratation) του υµενίου που ακολουθεί πραγµατοποιείται µε νερό ή µε ρυθµιστικό διάλυµα ή µε διάλυµα της προς εγκλωβισµό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτµισης των διαλυτών, πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασίες υψηλότερες της θερµοκρασίας µετάβασης φάσης του χρησιµοποιούµενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυµα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερµανθεί σε αυτή τη θερµοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με µηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υµένιο αποκολλάται από τα τοιχώµατά της, οπότε λαµβάνεται µία θολερή διασπορά µε πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα µεγάλου µεγέθους MLV. Η µείωση του µεγέθους των MLV λιποσωµάτων και η δηµιουργία οµογενούς σε αναφορά µε το µέγεθος πληθυσµού, υλοποιείται µε τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση µέσω φίλτρων ή µεµβρανών (extrusion), µικρoγαλακτωµατοποίηση (microemulcification) κ.ά.. Στο τελευταίο στάδιο πραγµατοποιείται η διαδικασία του "annealing", κατά την οποία τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερµοκρασία υψηλότερη αυτής της µετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραµένουν για µία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να οµαλοποιηθεί η µορφοποίηση της δοµής τους. Η διάµετρος των λιποσωµάτων που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή κυµαίνεται από 5 έως 6 µm Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) Τα λιποσώµατα (SUV) που λαµβάνονται µε τη χρήση ακίδας υπερήχων έχουν διάµετρο της τάξης µερικών δεκάδων nm. Το σηµείο εκκίνησης είναι συνήθως µία διασπορά πολυστοιβαδιακών MLV λιποσωµάτων. εδοµένου ότι αυτά τα σωµατίδια θα σπάσουν ολοκληρωτικά στην πορεία, δεν είναι απαραίτητο να ληφθεί προσοχή σχετικά µε το αρχικό 24

25 µέγεθος των MLV λιποσωµάτων, το ποσοστό εγκλωβισµού και το πάχος του λιπιδικού υµενίου. Η ακίδα υπερήχων προτιµάται για διασπορές που απαιτούν υψηλή ενέργεια σε µικρό όγκο (π.χ. υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου, ή παχύρρευστη υδατική φάση), ενώ το λουτρό υπερήχων είναι περισσότερο κατάλληλο για µεγάλους όγκους διαλυµένου λιπιδίου και για περιπτώσεις που δεν είναι απαραίτητη η απόδοση οριακού µεγέθους σωµατιδίων. Την υπερήχηση µε ακίδα ακολουθεί φυγοκέντρηση στις στροφές για πέντε λεπτά προκειµένου να αποµακρυνθούν αδιάσπαρτο λιπίδιο και MLV λιποσώµατα καθώς και ρινίσµατα τιτανίου που σχηµατίζονται από τη µεγάλη δύναµη τριβής µεταξύ της διασποράς και της ακίδας Εξώθηση µέσω φίλτρων Στα λιποσώµατα αυτού του τύπου η µείωση µεγέθους επιτυγχάνεται µε τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριµένη διάµετρο. Η µέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτηµα ότι παρέχει επαναλήψιµα αποτελέσµατα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σηµαντική µεταβολή. Επιπλέον µπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισµού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση µέσω φίλτρων διαµέτρου 0,2 µm οδηγεί σε εξαιρετικά οµοιογενείς πληθυσµούς λιποσωµάτων διαµέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979) Χρήση Μικρογαλακτωµατοποιητή Για την παρασκευή λιποσωµάτων µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν γαλακτωµατοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι µικρογαλακτωµατοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειµένη περίπτωση τα λιποσώµατα, µε πολύ υψηλές πιέσεις µέχρι και (10000 p.s.i., bar) µέσα από φίλτρα διαµέτρου 5µm. Στη συνέχεια διαπερνούν το µίγµα χωρισµένο σε δύο τµήµατα µε πολύ µεγάλη ταχύτητα, από µικρά κανάλια που αναµιγνύουν τα δύο ρεύµατα υπό ορθή γωνία παρέχοντας µε τον τρόπο αυτό πολύ µεγάλη ενέργεια. Τα λιπίδια εισάγονται στο µικρογαλακτωµατοποιητή µε τη µορφή εναιωρήµατος µεγάλων λιποσωµάτων MLV ή µε τη µορφή µη ενυδατωµένου λιπιδίου εντός υδατικού µέσου. Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται µικρά MLV λιποσώµατα µε καλή κατανοµή µεγέθους nm (micro emulsification liposomes, MEL). Οι γαλακτωµατοποιητές µπορούν να χρησιµοποιηθούν και στη βιοµηχανική παραγωγή για την παρασκευή µεγάλων ποσοτήτων λιποσωµάτων (Vemuri S. et al., 1989). 25

26 Εξώθηση σε θάλαµο εφαρµογής µεγάλης πίεσης Η τεχνική περιλαµβάνει την εισαγωγή προσχηµατισµένων µεγάλων λιποσωµάτων σε θάλαµο (French Press) υπό µεγάλη πίεση ( p.s.i.), και αποδίδει οµογενείς µονο- ή ολιγο- στοιβαδιακές λιποσωµικές διασπορές ενδιάµεσων µεγεθών (30 80 nm σε διάµετρο ανάλογα µε την εφαρµοζόµενη πίεση) (Barenholtz Y. et al., 1979). Τα λιποσώµατα που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιούνται για τη µεταφορά ευαίσθητων µακροµορίων και είναι πιο σταθερά από τα κατεργασµένα µε υπέρηχους λιποσώµατα Ένεση λιπιδίων Περιλαµβάνει µεθόδους κατάλληλες για την παρασκευή SUV και LUV λιποσωµάτων. ιάλυµα λιπιδίου σε οργανικό διαλύτη ενίεται ταχέως σε περίσσεια υδατικού µέσου που περιέχει την ουσία που πρόκειται να εγκλωβισθεί στα λιποσώµατα. Στη διεπιφάνεια µεταξύ νερού και οργανικού διαλύτη, τα φωσφολιπίδια αυτο-διατάσσονται σε λιποσώµατα µικρής διαµέτρου. Τα µεγάλα συγκριτικά πλεονεκτήµατα των µεθόδων είναι η εύκολη εφαρµογή της και ο περιορισµένος κίνδυνος αποικοδόµησης των λιπιδίων. Μειονέκτηµα των µεθόδων είναι το χαµηλό ποσοστό εγκλωβισµού για υδατοδιαλυτές ουσίες. Οι πιο συχνά εφαρµοζόµενες µεθοδολογίες παρασκευής τέτοιων λιποσωµικών διασπορών περιγράφονται παρακάτω και αφορούν σε περιπτώσεις κατά τις οποίες: ο οργανικός διαλύτης είναι αναµίξιµος µε την υδατική φάση, ο οργανικός διαλύτης είναι µη αναµίξιµος µε την υδατική φάση, ο οργανικός διαλύτης είναι σε περίσσεια και µη αναµίξιµος µε την υδατική φάση. Έγχυση Αιθανόλης Κατά την τεχνική αυτή το ή τα λιπίδια διαλύονται σε αιθανόλη και στη συνέχεια τοποθετούνται σε περίσσεια υδατικού µέσου ή κάποιου άλατος µε χρήση σύριγγας. Τα µόρια του λιπιδίου έρχονται σε επαφή µε τα µόρια του νερού και µε τον τρόπο αυτό σχηµατίζονται αστραπιαία λιποσώµατα µικρής διαµέτρου (25 nm). Το ποσοστό εγκλωβισµού που επιτυγχάνεται µε τη µέθοδο αυτή είναι εξαιρετικά χαµηλό εάν οι προς εγκλωβισµό ουσίες είναι διαλυτές στην υδατική φάση. Επιπλέον η περιορισµένη διαλυτότητα λιπιδίων στην αιθανόλη (40 mm για PC), ο µικρός όγκος λιπιδίων (διαλυµένων σε αιθανόλη) που µπορεί να εισαχθεί στο υδατικό διάλυµα καθώς και η δυσκολία αποµάκρυνσης της αιθανόλης από τις 26

27 λιποσωµικές µεµβράνες κυρίως µε διαπίδυση (dialysis), συµπεριλαµβάνονται στα µειονεκτήµατα της µεθόδου. (Batzri et al., 1973). Λιποσώµατα µε αυτή τη µέθοδο παρασκευάσθηκαν για πρώτη φορά από τους Szoka και Papahadjopoulos το Τα λιποσώµατα αυτά ονοµάζονται αναστροφής φάσης εξατµιζόµενα σωµατίδια (reverse phase evaporation vesicles, REV). Κατά τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιείται γαλάκτωµα νερού σε έλαιο (αναστροφή του τυπικού "έλαιο σε νερό" γαλακτώµατος) και η αποµάκρυνση του διαλύτη από το γαλάκτωµα γίνεται µε εξάτµιση. Έγχυση Αιθέρα Η τεχνική αυτή παρουσιάζει αρκετές διαφορές συγκριτικά µε την ένεση αιθανόλης (Deamer D.W. et al., 1976). Περιλαµβάνει την ένεση µη αναµίξιµου µε το νερό οργανικού διαλύµατος µε αργούς ρυθµούς εντός υδατικής φάσης µε χρήση βελόνας µικρής εσωτερικής διαµέτρου. Η θερµοκρασία έγχυσης πρέπει να είναι τέτοια ώστε να επιτρέπει την εξάτµιση του οργανικού διαλύτη κατά τη διαδικασία προσθήκης του. Λόγω άµεσης εξάτµισης του διαλύτη αυξάνει η βαθµίδωση του λόγου νερού / αιθέρα στη διεπιφάνεια της λιπιδικής µονοστοιβάδας και των δύο µέσων. Η αναδίπλωση της σχηµατιζόµενης διπλοστοιβάδας οδηγεί στο σχηµατισµό µεγάλων λιποσωµάτων (LUV). Η µέθοδος χρησιµοποιείται αποτελεσµατικά στην περίπτωση ευπαθών λιπιδίων, καθώς µειώνει σηµαντικά την πιθανότητα οξείδωσής τους, µε την προϋπόθεση ότι ο αιθέρας έχει επαναποσταχθεί προσεκτικά για την αποµάκρυνση τυχόν υπεροξειδίων που προκύπτουν από την αυθόρµητη οξείδωσή του. Επιπλέον ο ρυθµός αποµάκρυνσης του διαλύτη είναι ίσος µε το ρυθµό εισαγωγής, οπότε δεν υπάρχει περιορισµός στην τελική συγκέντρωση λιποσωµάτων και η όλη διαδικασία µπορεί να διαρκεί για µεγάλο χρονικό διάστηµα καταλήγοντας σε λιποσώµατα µε υψηλό ποσοστό ενκαψυλίωσης. Νερό σε οργανική φάση Περιλαµβάνει το σχηµατισµό λιποσωµάτων σε δύο φάσεις. Πρώτα παρασκευάζεται η εσωτερική µονοστοιβάδα και έπειτα η δεύτερη εξωτερική. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της τεχνικής, κατά βάση όµως παράγεται ένα γαλάκτωµα νερού σε έλαιο µε την εισαγωγή µικρής ποσότητας υδατικού µέσου (που περιέχει την προς εγκλωβισµό ουσία) σε µεγάλο όγκο µη αναµίξιµου διαλύµατος λιπιδίων, συνοδευόµενη από µηχανική ανάδευση ώστε η 27

28 υδατική φάση να διασπαστεί σε µικροσκοπικά σταγονίδια ύδατος. Τα σταγονίδια αυτά σταθεροποιούνται από την παρουσία της λιπιδικής διπλοστοιβάδας στη διεπιφάνεια των δύο φάσεων. Το µέγεθος των σταγονιδίων εξαρτάται από την ένταση της µηχανικής ενέργειας κατά την παρασκευή του γαλακτώµατος και από το ποσό του λιπιδίου σχετικά µε τον όγκο της υδατικής φάσης αφού κάθε σταγονίδιο απαιτεί µια ολοκληρωµένη µονοστοιβάδα φωσφολιπιδίου που να καλύπτει πλήρως την επιφάνειά της ώστε να παρεµποδισθεί η συσσωµάτωση µε άλλες σταγόνες. Το υδατικό τµήµα που περιβάλλεται από αυτή τη διπλοστοιβάδα θα αποτελέσει τον τελικό πυρήνα του τελικού λιποσώµατος. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι προετοιµασίας των σταγονιδίων νερού σε έλαιο πριν την προσθήκη της εξωτερικής κάλυψης, οι οποίοι υπό κατάλληλες συνθήκες παράγουν διαφορετικά µεγέθη σταγονιδίων. Με την επίδραση ακίδας υπερήχων λαµβάνονται σταγονίδια διαµέτρου 100 nm ηµιουργία µεικτών µικκυλίων µε απορρυπαντικά Κατά την ανάµιξη λιπιδίων µε απορρυπαντικά ιονικά αµφοτερικά ή µη ιονικά σε ρυθµιστικό διάλυµα, σχηµατίζονται αυθόρµητα µεικτά µικκύλια (micelles). Το είδος και η κατανοµή των πολικών και λιπόφιλων οµάδων του απορρυπαντικού µέσα στο µικκύλιο καθορίζουν το µέγεθος και το σχήµα του. Η συγκέντρωση απορρυπαντικού στο νερό κατά την οποία αρχίζουν να σχηµατίζονται µικκύλια είναι γνωστή ως κρίσιµη συγκέντρωση µικκυλίων (critical micelle concentration, CMC). Σε συγκεντρώσεις µικρότερες της κρίσιµης τα µόρια του απορρυπαντικού απαντούν ελεύθερα στο διάλυµα, ενώ σε µεγαλύτερες σχηµατίζουν ολοένα µεγαλύτερες ποσότητες µικκυλίων. Τα απορρυπαντικά διακρίνονται σύµφωνα µε την κατανοµή της πολικής και υδρόφοβης περιοχής που διαθέτουν σε πεπλατυσµένα (αλκυλογλυκοσίδια που δίνουν σφαιρικά µικκύλια) και επιµήκη (χολικά άλατα που σχηµατίζουν δισκοειδή µικκύλια). Η αποµάκρυνση του απορρυπαντικού από τα µικκύλια γίνεται µε διαπίδυση ή χρωµατογραφία στήλης και έτσι σχηµατίζονται λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ότι υπάρχει στην υδατική φάση. Στο στάδιο αυτό είναι εύκολο να αποµακρυνθούν και µικρά µόρια, γι`αυτό τα ποσοστά εγκλωβισµού µε αυτή την τεχνική δεν είναι αξιόλογα. Είναι όµως αποτελεσµατική µέθοδος για το σχηµατισµό λιποσωµάτων που φέρουν λιπόφιλα µόρια, αφού αυτά µπορούν να εισαχθούν στα µικκύλια παρουσία ήπιων απορρυπαντικών µε ποσοστό εγκλωβισµού ακόµη και 100%. 28

29 Άλλες ειδικές µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Αφυδατωµένα Ενυδατωµένα Σφαιρίδια (DRV) Η µέθοδος αυτή έχει αναπτυχθεί από τους C. Kirby and G.Gregoriadis, Κατά την τεχνική αυτή, πραγµατοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze - drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωµάτων παρουσία διαλύµατος της προς εγκλωβισµό ουσίας. Εδώ, σε αντίθεση µε την κλασσική παρασκευή µέσω εξάτµισης του διαλύτη όπου τα µόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανοµή, το λιπίδιο το οποίο βρίσκεται στα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωµένο στη δοµή της µεµβράνης. Έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού µέσου σχηµατίζονται λιποσώµατα µε υψηλή ικανότητα εγκλωβισµού και διάµετρο από 400 nm µέχρι µερικά µm Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση (Freeze thaw sonication method, FTS) Η προηγούµενη DRV µέθοδος είναι παραλλαγή µίας άλλης παρόµοιας που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, κατά την οποία το προς εγκλωβισµό υλικό εισάγεται στα λιποσώµατα επίσης µετά το σχηµατισµό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται µία πορεία επαναλαµβανόµενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωµάτων, κατά τη διάρκεια της οποίας η διαλυµένη ουσία εξισορροπείται µεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώµατα συντήκονται και αυξάνουν αξιοσηµείωτα σε µέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισµού µέχρι και 30%. Τα λιποσώµατα που παράγονται µε τη µέθοδο αυτή παρουσιάζουν σηµαντικά µειονεκτήµατα σε σύγκριση µε τα DRV λιποσώµατα. Το κυριότερο δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηµατισµό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόµοιους λόγους η σουκρόζη, δισθενή µεταλλικά ιόντα (που µπορούν να εξουδετερώνουν το επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύµατα αλάτων δεν µπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσµατικά. Ωστόσο η µέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία, ήπια και καταλήγει σε µεγάλα µονοστοιβαδιακά σωµατίδια, χρήσιµα για τη µελέτη φαινοµένων µεταφοράς µέσω µεµβρανών. 29

30 Τεχνική ενός βήµατος (one step method) Κατά την τεχνική αυτή το λιπίδιο ή µίγµα λιπιδίων τοποθετούνται σε φιαλίδιο µε πώµα. Προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα νερού ή ρυθµιστικού διαλύµατος, το οποίο έχει προθερµανθεί σε θερµοκρασία υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου. Ακολουθεί θέρµανση υπό ανάδευση σε θερµοκρασία επίσης µεγαλύτερη της θερµοκρασίας µετάπτωσης για 4 έως 7 ώρες (Shmeider et al., 1995). Ο µηχανισµός σχηµατισµού λιποσωµάτων απουσία οργανικών διαλυτών και επιφανειοδραστικών ουσιών, δεν είναι πλήρως γνωστός. Κάτω από ήπιες συνθήκες, η ενυδάτωση των λιπιδίων είναι µία αργή διαδικασία (Lasic D.P. et al., 1988). Η ύπαρξη φορτισµένων λιπιδίων, η παρουσία και η συγκέντρωση της χοληστερόλης και η ιονική ισχύς του υδατικού µέσου, επηρεάζουν το σχηµατισµό λιποσωµάτων. Μία εναλλακτική περίπτωση είναι η µέθοδος γνωστή ως µέθοδος φυσαλίδας (bubble method) που χρησιµοποιεί άζωτο στη διεπιφάνεια νερού λιπιδίου, για τη µείωση του µεγέθους των παρασκευασθέντων λιποσωµάτων (Talsma H. et al., 1994). Στην πράξη, οι περισσότερες µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων οδηγούν σε αρκετά ετερογενείς πληθυσµούς σωµατιδίων µε ευρεία κατανοµή µεγέθους. εδοµένου ότι ο διαθέσιµος προς εγκλωβισµό, όγκος λιποσωµάτων ποικίλλει µε την κατανοµή µεγέθους, είναι πολύ σηµαντικό οι λιποσωµικές παρασκευές να χαρακτηρίζονται σχετικά µε το µέγεθος, ώστε να ερµηνεύονται σωστά οι ιδιότητές τους in vivo και in vitro. Ακόµη και λιποσώµατα µε το ίδιο µέγεθος και τον ίδιο αριθµό στοιβάδων είναι δυνατό να διαφέρουν στην εσωτερική κατανοµή της υδατικής φάσης και στην ποσότητα λιπιδίου που συµµετέχει στη δοµή των σωµατιδίων. Η επιλογή του τύπου λιποσωµάτων που θα χρησιµοποιηθεί για συγκεκριµένη εφαρµογή εξαρτάται εν µέρει από το είδος της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί αλλά και από την επιθυµητή συµπεριφορά του λιποσώµατος µετά την παρασκευή του. 1.6 Εγκλωβισµός βιοδραστικών µορίων σε λιποσώµατα Παθητικός Ενεργητικός Εγκλωβισµός Σε όλες τις µεθόδους που περιγράφηκαν παραπάνω, γίνεται σαφές ότι υδατοδιαλυτές ουσίες εγκλωβίζονται µε την εισαγωγή υδατικών διαλυµάτων τους πριν ή σε κάποιο στάδιο κατά την παρασκευή λιποσωµάτων (παθητικός εγκλωβισµός). Ωστόσο, συγκεκριµένα 30

31 συστατικά µε οµάδες που ιονίζονται και εκείνα που επιδεικνύουν και λιπο και υδατο διαλυτότητα µπορούν επίσης να εισαχθούν σε λιποσώµατα µετά το σχηµατισµό των µεµβρανών. (Madden et al., 1990). Αυτά τα συστατικά όµως είναι δύσκολο να παραµείνουν µέσα στα λιποσώµατα, µιας και η λιποφιλικότητά τους, τους επιτρέπει την εύκολη κίνησή τους διαµέσου των µεµβρανών (ενεργητικός εγκλωβισµός). Κατά τον ενεργητικό εγκλωβισµό, οι συνθήκες στο εσωτερικό των λιποσωµάτων τροποποιούνται έτσι ώστε οι ουσίες µε αυτές τις ιδιότητες είναι πάντα στην ιονισµένη µορφή τους και έτσι δε µπορούν να διαφύγουν από τα λιποσώµατα (η λιποφιλικότητα ελαττώνεται σηµαντικά). Επιπλέον οι ουσίες αυτές συγκεντρώνονται µέσα στα λιποσώµατα όσο διασφαλίζονται διαφορετικές συνθήκες ph µεταξύ των δύο πλευρών της µεµβράνης, µε τον εγκλεισµό ρυθµιστικού διαλύµατος µε ιόντα τα οποία δε διαχέονται µέσα από τη µεµβράνη. Εναλλακτικά ενσωµατώνονται στη µεµβράνη φορτισµένα λιπίδια σε χαµηλό ph ενώ το περιβάλλον µέσο ρυθµίζεται σε ουδέτερο Τεχνικές Καθαρισµού Λιποσωµάτων Στις περισσότερες περιπτώσεις, είναι απαραίτητος ο διαχωρισµός της ελεύθερης από τη δεσµευµένη στα λιποσώµατα ουσία. Αυτό συνήθως γίνεται µε φυγοκέντρηση, µε χρωµατογραφία στήλης ή µε διαπίδυση µέσω ηµιπερατής µεµβράνης Χρωµατογραφία στήλης (Gel filtration - Column Chromatography) Οι πλέον διαδεδοµένες γέλες για αυτόν τον τύπο διαχωρισµού, είναι οι στήλες µε υλικό Sephadex (διακλαδούµενα πολυµερή δεξτράνης). ύο σηµεία αξίζει να σηµειωθούν σχετικά µε τη χρήση Sephadex για τα λιποσώµατα: (i) Ένας µικρός αριθµός θέσεων επάνω στην επιφάνεια της πολυδεξτράνης είναι δυνατό να συνδέεται και να αλληλεπιδρά µε τη λιποσωµική µεµβράνη. Αν και αυτή η αλληλεπίδραση µπορεί να µην επηρεάζει τα χαρακτηριστικά ροής του λιποσωµικού εναιωρήµατος µέσω της στήλης, ίσως υπάρχει µικρή απώλεια λιπιδίου και κάποιου βαθµού αποσταθεροποίηση της µεµβράνης που να οδηγεί σε µεταβολές της διαπερατότητας και σε διαφυγή εγκλωβισµένης ουσίας. Αυτό παρατηρείται ιδιαίτερα σε χαµηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου. Το πρόβληµα µπορεί να ξεπεραστεί είτε µε τη διαπέραση λιποσωµάτων που δεν είναι αρκετά µικρά σε 31

32 (ii) µέγεθος, είτε µε κορεσµό της στήλης µε άδεια λιποσώµατα ίδιας λιπιδικής σύστασης µε τα προς διαχωρισµό δείγµατα. Τα µεγαλύτερα λιποσώµατα (> 0,4 µm) µερικές φορές συγκρατούνται στη στήλη εάν το µέγεθος πόρων της γέλης είναι αρκετά µικρό. Στήλες Sephadex µε µέγεθος σωµατιδίων µm είναι κατάλληλα για το διαχωρισµό MLV λιποσωµάτων, ενώ δεν υπάρχει κανένας περιορισµός για τα SUV λιποσώµατα ιαπίδυση (Dialysis) Από το 1861, ο Graham είχε ήδη προτείνει τη χρήση µεµβρανών διαπίδυσης από νιτροκυτταρίνη ή σελοφάν ή κολλόδιο για τον καθαρισµό κολλοειδών συστηµάτων. Κατά τη διεργασία της διαπίδυσης η λιποσωµική διασπορά τοποθετείται σε µεµβράνη και µέσα σε δοχείο µε ορισµένο όγκο καθαρού διαλύτη. Κατά τη διαπίδυση τα ιόντα ηλεκτρολυτών και άλλες ουσίες µικρού µοριακού βάρους εξέρχονται µέσω των πόρων της µεµβράνης, ενώ τα λιποσώµατα λόγω µεγέθους δε µπορούν να εξέλθουν Φυγοκέντρηση (Centrifugation) Η φυγοκέντρηση είναι ακόµη µία τεχνική διαχωρισµού µε ευρεία εφαρµογή, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις κατά τις οποίες πρωτεΐνες ή DNA έχουν εγκλωβιστεί στα λιποσώµατα ή το εγκλωβισµένο υλικό είναι γνωστό ότι σχηµατίζει µεγάλα συσσωµατώµατα. Η πυκνότητα των λιποσωµάτων από PC είναι 1,0135 g/ml (Johnson S.M. et al., 1973). Η τιµή αυτή αυξάνει ελαφρώς µε την προσθήκη χοληστερόλης και είναι ακόµη µεγαλύτερη για κορεσµένα λιπίδια κάτω από τη θερµοκρασία µετάπτωσης. Στην περίπτωση εγκλωβισµού πρωτεϊνών στα λιποσώµατα η πυκνότητα αυξάνεται δραµατικά. Έχει υπολογιστεί ότι για SUV λιποσώµατα από PC ο συντελεστής καταβύθισης S (sedimentation coefficient) νερό από 2,6 γίνεται 5,2 όταν στη λιπιδική διπλοστοιβάδα εγκλωβιστούν µεγάλα ποσά χοληστερόλης. Η καταβύθιση των SUV χρειάζεται περίπου 10 ώρες στα g σε υπερφυγόκεντρο, ενώ για τον καθίζηση των MLV λιποσωµάτων αρκεί µία ώρα φυγοκέντρηση στα g. 32

33 1.7. Τεχνικές χαρακτηρισµού λιποσωµάτων Οι παράγοντες που χαρακτηρίζουν τα λιποσώµατα και επηρεάζουν τη συµπεριφορά τους, είναι κυρίως το φυσικό τους µέγεθος και οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειάς τους. Για τον προσδιορισµό των ανωτέρω χρησιµοποιούνται διάφορες τεχνικές που παρουσιάζονται στη συνέχεια Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Από τις πλέον διαδεδοµένες τεχνικές παρατήρησης λιποσωµάτων είναι η ηλεκτρονική µικροσκοπία διερχόµενης δέσµης, (Transmission Electron Microscopy, TEM). Στην περίπτωση αυτή το δείγµα µεταφέρεται σε ένα διαφανές πλαστικό υπόστρωµα ή φιλµ άνθρακα (πάχους nm) το οποίο είναι τοποθετηµένο σε δίκτυο χαλκού. Το δείγµα σκεδάζει ηλεκτρόνια εκτός πεδίου παρατήρησης και η τελική εικόνα γίνεται ορατή σε φθορίζουσα οθόνη. Το ποσό σκέδασης ηλεκτρονίων εξαρτάται από το πάχος και τον ατοµικό αριθµό των ατόµων του µείγµατος. Με την τεχνική αυτή τα σωµατίδια φαίνονται διάχυτα φωτισµένα και έτσι µπορεί να µετρηθεί το µέγεθος και η συσσωµάτωσή τους, αλλά υπάρχει περιορισµένη ένδειξη του βάθους. Με την ηλεκτρονική µικροσκοπία σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM), µία λεπτή δέσµη ηλεκτρονίων µέσης ενέργειας από ένα λεπτό σύρµα βολφραιµίου εστιάζεται µε σύστηµα µαγνητικών φακών σε µια επιφάνεια διαµέτρου 5-15 nm σε ένα κενό θάλαµο. Η δέσµη ηλεκτρονίων σαρώνει το προς παρατήρηση δείγµα σε µια σειρά µέχρι και 1000 διαδοχικών παράλληλων σαρώσεων. Οι ηλεκτρονικές αυτές σαρώσεις αλληλεπιδρούν µε το δείγµα και παράγουν διάφορα σήµατα, όπως δευτεροταγή εκποµπή ηλεκτρονίων (Secondary Electron Emission, SEE), οπίσθια σκέδαση ηλεκτρονίων (Back Scattered Electrons, BSE), ακτίνες Χ. Τα σήµατα ενισχύονται και εµφανίζονται σε οθόνη σωλήνα καθοδικών ακτινών όπου και φωτογραφίζονται. Με την τεχνική αυτή τα σωµατίδια φαίνονται να φωτίζονται από µία σηµειακή πηγή και η προκύπτουσα σκιά δίνει αρκετά καλή αίσθηση του βάθους. Άλλες τεχνικές παρατήρησης λιποσωµάτων µε τη χρήση ηλεκτρονικής µικροσκοπίας είναι η τεχνική παγωµένης κατάτµησης (Freeze fracture technique), όπου είναι δυνατή η παρατήρηση των στοιβάδων και των εσωτερικών µορφολογικών χαρακτηριστικών τους (Fluck D.J et al., 1969) και η cryo TEM τεχνική µε υψηλή ποιότητα αποτελεσµάτων (Dubochet J. et al., 1996). 33

34 Ηλεκτρικές Ιδιότητες λιποσωµάτων Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειας των λιποσωµάτων µπορούν να µελετηθούν µε ηλεκτροφόρηση κατά την οποία προκαλείται κίνηση των λιποσωµάτων µέσα σε στάσιµο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρµοζόµενης διαφοράς δυναµικού. Η κίνηση αυτή µετράται µε Φασµατοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) και βασίζεται στη µετατόπιση Doppler που προκαλείται από την πρόσπτωση µονοχρωµατικής ακτινοβολίας (laser He Ne, 5 Mv, 633 nm) στα κινούµενα σωµατίδια. Γενικά δύο παράµετροι που χαρακτηρίζουν την επιφάνεια των λιποσωµάτων µπορούν να υπολογισθούν από τις µετρούµενες κινητικότητες το δυναµικό επιφάνειας, ζ δυναµικό (zpotentional) και η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου σ (surface charge denzity). Η εξίσωση Helmholtz Smoluchowski (Jones M.N., 1995) που ακολουθεί δίνει την τιµή του ζ - δυναµικού: ζ = (u * n) / (ε * Ε), όπου: u (cm/sec) η ταχύτητα µετακίνησης του λιποσώµατος στο σωλήνα του κελιού ηλεκτροφόρησης, n (dyne * sec/cm 2 ) το ιξώδες του µέσου, ε η διηλεκτρική σταθερά του µέσου και Ε (V/cm) η ένταση του εφαρµοζόµενου δυναµικού. Το ζ - δυναµικό σχετίζεται µε το δυναµικό επιφάνειας των σωµατιδίων και επηρεάζει µεγάλο φάσµα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστηµάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους µε ηλεκτρολύτες και φάρµακα καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρηµάτων τους. Η τιµή του ζ - δυναµικού αποτελεί ένδειξη για την καλή εκτίµηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι λιποσωµικές διασπορές µε µεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ - δυναµικό εµφανίζουν απωστικές δυνάµεις που εµποδίζουν τη συσσώρευση, πήξη, συσσωµάτωση και κατακρήµνιση των σωµατιδίων τους. Η φύση και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου είναι επίσης πολύ σηµαντικοί παράµετροι που επηρεάζουν τη συµπεριφορά των λιποσωµάτων. Και οι δύο παράµετροι µπορούν να µεταβληθούν µε την αλλαγή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωµάτων. Η έλλειψη φορτίου επιφάνειας µπορεί να µειώσει τη φυσική σταθερότητα των SUV, αυξάνοντας τη συσσωµάτωσή τους. Επιπλέον τα ουδέτερα λιποσώµατα δεν αλληλεπιδρούν µε τα κύτταρα, ενώ µεγάλο επιφανειακό φορτίο προάγει σηµαντικά αλληλεπιδράσεις τέτοιου είδους. 34

35 1.8. Πορεία των λιποσωµάτων στον οργανισµό Ενδοφλέβια χορήγηση Μετά από ενδοφλέβια χορήγηση τα λιποσώµατα αλληλεπιδρούν µε τις υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες του πλάσµατος (HDL), οι οποίες ανταλλάσσονται µε τα φωσφολιπίδια των λιποσωµικών µεµβρανών, αποσταθεροποιώντας έτσι τη µεµβρανική συνέχεια. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη διαφυγή της περιεχόµενης ουσίας στην κυκλοφορία (Lasic D.D. et al., 1991). Ταυτόχρονα οι πρωτεΐνες οψωνίνες του ανοσοποιητικού συστήµατος προσκολλώνται στην επιφάνεια των λιποσωµάτων και λειτουργούν ως ενδεικτικά για να αναγνωρισθούν αυτά ως «ξένα σώµατα» και να καταστραφούν από τα µακροφάγα κύτταρα του δικτυοενδοθηλιακού συστήµατος ( ΕΣ), του σπλήνα, του ήπατος και των λεµφαδένων. Τα µακροφάγα κύτταρα έχουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες, οπότε εγκολπώνουν τα λιποσώµατα µέσω ενδοκύττωσης και τα περικλείουν σε ένα πεπτικό κενοτόπιο (ενδόσωµα). Το πεπτικό κενοτόπιο εν συνεχεία συντήκεται µε ένα ή περισσότερα λυσοσώµατα που περιέχουν υδρολυτικά ένζυµα. Επακολουθεί καταστροφή της λιποσωµικής µεµβράνης και οι δραστικές ουσίες που απελευθερώνονται είτε αντιδρούν µέσα στο λυσόσωµα, είτε µεταναστεύουν σε άλλες κυτταρικές περιοχές (π.χ. στον πυρήνα κατά η διάρκεια χηµειοθεραπείας καρκίνου) διαχεόµενα µέσω της λυσοσωµικής µεµβράνης.(gregoriadis G. 1976) (Εικ ). Πιο πρόσφατα έχουν σχεδιαστεί λιποσώµατα που αποφεύγουν την εντόπιση από τα λυσοσώµατα και την αδρανοποίηση του περιεχοµένου τους. Για παράδειγµα, όταν ευαίσθητα στο ph λιποσώµατα βρεθούν στο όξινο περιβάλλον των ενδοσωµάτων, πιστεύεται ότι συντήκονται µε τη µεµβράνη των κενοτοπίων και απελευθερώνουν το περιεχόµενό τους στο κυτταρόπλασµα (Connor J. et al., 1985). Ωστόσο τα αποτελέσµατα που έχουν παρατηρηθεί in vitro είναι υπό διερεύνηση σε in vivo µελέτες, όπου οι πρωτεΐνες του πλάσµατος που προσροφώνται στην λιποσωµική επιφάνεια ίσως παρεµβαίνουν στις συντηκογόνες ιδιότητές τους. 35

36 Εικόνα Ένα µονοστοιβαδιακό σωµατίδιο που περιέχει ένα φάρµακο (*) αναγνωρίζει το κύτταροστόχος, µέσω ενός συνδέσµου όπως π.χ. η οψωνίνη (~<). Σε αυτό το απλοποιηµένο σχήµα, η επαφή µε το κύτταρο ακολουθείται από ενδοκύττωση του λιποσώµατος ( ). Το ενδόσωµα που περιέχει το λιπόσωµα µπορεί να συντηχθεί µε ένα λυσόσωµα. Το προκύπτον σωµατίδιο (γνωστό και ως φαγολυσόσωµα), λυσοσωµικές φωσφολιπάσες ( ) αποικοδοµούν το λιπόσωµα και ελευθερώνουν το φάρµακο που είτε µπορεί να δράσει εντός του οργανιδίου, η να διαχυθεί σε άλλες περιοχές του κυττάρου. Ν: πυρήνας, GA: σύµπλεγµα Golgi SER:λείο ενδοπλασµατικό δίκτυο, REP: αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο, M: µιτοχόνδριο, L: λυσόσωµα, e: περιβάλλον (Gregoriadis G., 1990). Η πρόσληψη των λιποσωµάτων από τα κύτταρα του ΕΣ µπορεί να παρεµποδιστεί στερεοχηµικά, τροποποιώντας την επιφάνειά τους µε την προσθήκη πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται "αόρατα" λιποσώµατα (stealth liposomes) µακράς κυκλοφορίας (Borison O. et al., 1996) (Εικ ). Εικόνα Σχηµατική αναπαράσταση στερεοχηµικά σταθεροποιηµένων λιποσωµάτων. Τα stealth λιποσώµατα ενκαψυλιώνουν ένα φάρµακο (1) σε µια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα (2). Μία PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώµατα να αποφεύγουν το ανοσοσύστηµα, αυξάνοντας το χρόνο ηµιζωής της βιοδραστικής ένωσης στο σώµα. 36

37 Τα προηγούµενα χρόνια τα λιποσώµατα που χρησιµοποιούνταν στις in vivo µελέτες ήταν λιποσώµατα συντιθέµενα από ουδέτερα λιπίδια όπως σφιγγοµυελίνη ή φωσφατιδυλοχολίνη µε την παρουσία χοληστερόλης ή ακόµη και τη χρήση κάποιων φορτισµένων λιπιδίων (Gregoriadis G.,1988). Η παρουσία της χοληστερόλης εξασφάλιζε τη σταθερότητα των λιποσωµάτων απέναντι στις πρωτεΐνες του πλάσµατος (Mayhew E. et al., 1979, Szoka F. And Papahadjopoulos D., 1981), ενώ η παρουσία φορτισµένων λιπιδίων εξασφάλιζε την αποφυγή συσσωµάτωσης και την αύξηση της ικανότητας εγκλωβισµού. Τέτοιου είδους συστάσεις αναφέρονται πλέον ως συµβατικά λιποσώµατα «conventional liposomes (CL)», ενώ τα λιποσώµατα µε την παρουσία πολυµερών χαρακτηρίζονται ως «sterically stabilized liposomes (SL)». Γενικά ο χρόνος ηµιζωής των συµβατικών λιποσωµάτων αυξάνει µε την ελάττωση του µεγέθους τους και η προσθήκη χοληστερόλης τα σταθεροποιεί περισσότερο. Επίσης ουδέτερη λιπιδική διπλοστοιβάδα είναι λιγότερο ευαίσθητη σε υδρόφοβες ή αλληλεπιδράσεις φορτίων µε τις πρωτεΐνες του πλάσµατος ή µε κυτταρικούς υποδοχείς επιφάνειας Εναλλακτικές οδοί χορήγησης Τα λιποσώµατα µπορούν εναλλακτικά να χορηγηθούν ενδοµυϊκά, υποδόρια και ενδοπεριτοναΐκά, οπότε τα ίδια και οι παγιδευµένες σε αυτά δραστικές ουσίες εισέρχονται κυρίως στο λεµφικό σύστηµα, ένα ποσοστό τους στους λεµφικούς κόµβους και το υπόλοιπο ποσοστό καταλήγει µέσω των λεµφικών αγγείων στο ήπαρ και το σπλήνα. Άλλες παρεντερικές οδοί χορήγησης είναι η ενδοτραχειακή, η ενδοαρτηριακή και η τοπική. Η στοµατική χορήγηση αντενδείκνυται εξαιτίας της καταστρεπτικής δράσης των φωσφολιπασών και των χολικών αλάτων του εντέρου. Παρόλα αυτά µε κατάλληλη λιπιδική σύσταση το λιπόσωµα µπορεί να έχει επαρκή σταθερότητα στις συγκεκριµένες in vivo συνθήκες (Kokkona et al., 2000) Μηχανισµός προστασίας των λιποσωµάτων από την πολυαιθυλενογλυκόλη Η προστατευτική δράση της πολυαιθυλενογλυκόλης αποδίδεται στη στερεοχηµική παρεµπόδιση των αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα λιποσώµατα και τις πρωτεΐνες του πλάσµατος (Papisov, 1998). Μάλιστα, για τα στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα λιποσώµατα σε διαµόρφωση brush, ο Papisov αναλύει τη στερεοχηµική παρεµπόδιση σε δύο διαφορετικούς τύπους: ο πρώτος τύπος παρεµπόδισης αναφέρεται σα στερεοχηµική προστασία (steric shielding), σύµφωνα µε 37

38 τον οποίο οι αλυσίδες της πολυαιθυλενογλυκόλης προστατεύουν τα λιποσώµατα από την προσέγγιση ξένων µορίων, ενώ ο δεύτερος τύπος παρεµπόδισης αναφέρεται ως στερεοχηµικός φραγµός (steric obstruction), σύµφωνα µε τον οποίο η απευθείας επαφή ανάµεσα σε κάποιο µόριο και τη λιποσωµική επιφάνεια καθίσταται µηχανικά δύσκολη ή αδύνατη. Η πολυαιθυλενογλυκόλη δηµιουργεί µια προστατευτική στοιβάδα διάχυσης, παρεµποδίζοντας τη διάχυση των πρωτεϊνών από το αίµα προς τη λιποσωµική επιφάνεια. Ενώ το ένα άκρο της πολυαιθυλενογλυκόλης είναι συνδεδεµένο στη λιποσωµική επιφάνεια, η υπόλοιπη αλυσίδα διατηρεί την ελευθερία κίνησής της. Έτσι το πολυµερές παραµένει διαλυµένο και περιελίσσεται τυχαία γύρω από το σηµείο σύνδεσης (Μilner, 1991). Οι Torchilin et al (Torchilin et al., 1995) αναφέρουν ότι µόνο εάν ένα πολυµερές συνδυάζει υδροφιλικότητα και ευλυγισία µπορεί να προστατεύει τα λιποσώµατα, ακόµα και σε χαµηλές συγκεντρώσεις. Όσο πιο ευλύγιστο είναι το πολυµερές τόσο µεγαλύτερος είναι ο αριθµός των πιθανών διαµορφώσεων και τόσο µεγαλύτερος είναι ο ρυθµός µετάβασης από τη µια διαµόρφωση στην άλλη. Αυτό σηµαίνει ότι τα υδατοδιαλυτά και ευλύγιστα πολυµερή υπάρχουν σαν µια κατανοµή πιθανών διαµορφώσεων πάνω από τα λιποσώµατα. Έτσι οι πρωτεΐνες του πλάσµατος πρέπει να διαπεράσουν αυτό το νέφος για να προσεγγίσουν τη λιποσωµική επιφάνεια. Επίσης, καθώς η αλυσίδα της πολυαιθυλενογλυκόλης αλλάζει συνεχώς διαµορφώσεις το ανοσοποιητικό σύστηµα δεν είναι σε θέση αν παράγει τα κατάλληλα αντισώµατα (Woodle et al., 1992). Οι Bogdanov et al (Bogdanov et al., 1993) αναφέρουν ότι η παρουσία ενός υδρόφιλου περιβλήµατος στη λιποσωµική επιφάνεια εµποδίζει την προσέγγιση των οψωνινών Εναλλακτικές οδοί χορήγησης Τα λιποσώµατα µπορούν εναλλακτικά να χορηγηθούν ενδοµυϊκά, υποδόρια και ενδοπεριτοναΐκά, οπότε τα ίδια και οι παγιδευµένες σ αυτά δραστικές ουσίες εισέρχονται κυρίως στο λεµφικό σύστηµα, ένα ποσοστό τους στους λεµφικούς κόµβους και το υπόλοιπο ποσοστό καταλήγει µέσω των λεµφικών αγγείων στο ήπαρ και το σπλήνα. Άλλες παρεντερικές οδοί χορήγησης είναι η ενδοτραχειακή η ενδοαρτηριακή και η τοπική. Η στοµατική χορήγηση αντενδεικνύεται εξαιτίας της καταστρεπτικής δράσης των φωσφολιπασών και των χολικών αλάτων του εντέρου. Παρόλα αυτά µε κατάλληλη λιπιδική σύσταση το λιπόσωµα µπορεί να έχει επαρκή σταθερότητα στις συγκεκριµένες in vivo συνθήκες (Kokkona et al., 2000). 38

39 1.11. Εφαρµογές Λιποσωµάτων Εξαιτίας της ικανότητάς τους να προφυλάσσουν και να µεταφέρουν πλήθος υδρόφοβων και υδρόφιλων µακροµορίων, τα λιποσώµατα χρησιµοποιούνται εκτενώς ως συστήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων. Η τάση που έχουν να υφίστανται φαγοκυττάρωση από τα µακροφάγα µπορεί να γίνει θετικά εκµεταλλεύσιµη στην κατανοµή βιοδραστικών ενώσεων. Οι ενώσεις αυτές όταν εγκλωβίζονται σε λιποσώµατα (και άλλους σωµατιδιακούς φορείς π.χ. νανοσωµατίδια) είναι δυνατό να απελευθερώνονται αργά µετά την αποικοδόµηση του µεταφορέα τους. Αυτή η βραδεία και ελεγχόµενη αποδέσµευση έχει µεγάλα πλεονεκτήµατα στον περιορισµό των διακυµάνσεων της συγκέντρωσης στο πλάσµα για φάρµακα µε στενό θεραπευτικό εύρος ενώ ταυτόχρονα επιτυγχάνεται µείωση της τοξικότητας και αύξηση της εκλεκτικότητας προς το στόχο. Η αντιµικροβιακή θεραπεία µολύνσεων από ιούς, βακτήρια και πρωτόζωα, η θεραπεία διαφορετικών τύπων καρκίνου, η γονιδιακή θεραπεία, η θεραπεία µε ενζυµική υποκατάσταση σε κληρονοµικές µεταβολικές ανωµαλίες, τοπική θεραπεία όπως οφθαλµική (Mezei M. et al., 1992), η θεραπεία αρθρίτιδας και η χορήγηση λιποσωµάτων µε εγκλωβισµένη αιµοσφαιρίνη (αιµοσώµατα) για την αναπλήρωση αίµατος σε επείγουσες καταστάσεις όπου δεν υπάρχει διαθέσιµος κατάλληλος δότης είναι µερικά µόνο παραδείγµατα από τις πάρα πολλές θεραπευτικές εφαρµογές λιποσωµάτων, όπως προέκυψαν από επιτυχή πειράµατα σε ζώα (Torchillin V.P., 1985). Τα οφέλη της χρήσης λιποσωµάτων ως µεταφορείς βιοδραστικών ενώσεων συνοψίζονται στο ακόλουθο παράδειγµα: Οι ανθρακυκλίνες ανήκουν στην κατηγορία φυσικών αντιβιοτικών, µε µηχανισµό δράσης, κυρίως την παρεµβολή τους στις βάσεις του DNA (µεταξύ κυτοσίνης και γουανίνης) και χρησιµοποιούνται στη θεραπεία οξείας λευχαιµίας, σαρκώµατος, καρκίνου του στήθους, των ωοθηκών, του πνεύµονα και του προστάτη. Ωστόσο, όπως συµβαίνει και µε άλλα κυτταροστατικά, η χρήση τους συνοδεύεται από σοβαρές ανεπιθύµητες παρενέργειες όπως αλωπεκία, καρδιοτοξικότητα, ναυτία. Προκλινικές µελέτες σε ζώα έχουν αποκαλύψει ότι εάν οι ανθρακυκλίνες χορηγούνται µε τη χρήση λιποσωµάτων, παρατηρείται µείωση της πρόσληψης βιοδραστικών ενώσεων από τους ιστούς της καρδιάς και ως εκ τούτου µείωση της καρδιοτοξικότητας (Forssen E. et al., 1981). Χάρη σε αυτές τις ιδιότητές τους τα λιποσώµατα έχουν χρησιµοποιηθεί και σε περιπτώσεις όπου είναι απαραίτητη η βελτίωση της βιοσυµβατότητας όπως συµβαίνει στη δηµιουργία ιατρικών διατάξεων και συσκευών οι οποίες έρχονται σε άµεση επαφή µε το ανθρώπινο αίµα, για παράδειγµα συσκευές αιµοδιαλύσεως, συσκευές πλασµαφαιρέσεως, 39

40 προσθετικές καρδιακές βαλβίδες, συσκευές εξωσωµατικής κυκλοφορίας σε εγχειρήσεις ανοιχτής καρδιάς, αγωγοί by pass, καθετήρες αγγειοπλαστικής, ενδοαγγειακές προσθέσεις και πολλές άλλες. Είναι γνωστό ότι όταν το αίµα βρίσκεται σε επαφή µε µία τεχνητή επιφάνεια ένα σύµπλεγµα περίπλοκων αλληλεπιδράσεων λαµβάνει χώρα: προσρόφηση πρωτεϊνών, κυτταρική (κυρίως αιµοπεταλίων) συγκόλληση, ενεργοποίηση των µηχανισµών πήξης του αίµατος, ενεργοποίηση συµπληρώµατος και τελικά σχηµατισµός ινώδους και θρόµβου Οι γέλες ως συστήµατα κολπικής χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων Εισαγωγή Η χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων δια της κολπικής οδού χρησιµοποιείται παραδοσιακά µε στόχο την τοπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων, αν και σε ορισµένες περιπτώσεις παρατηρείται και κάποιο ποσοστό συστεµικής απορρόφησης. ιάφορες κατηγορίες βιοδραστικών ενώσεων έχουν χορηγηθεί δια της κοπλικής οδού όπως αντιµικροβιακά (antimicrobials), σπερµατοκτόνα (spermicides), βιοδραστικές ενώσεις για πρόκληση τοκετού (labour inducers) και σεξουαλικές ορµόνες (sexual hormones). Μέχρι το 1920 η κολπική χορήγηση δεν είχε συνδυαστεί µε την συστεµική απορρόφηση βιοδραστικών ενώσεων. Αν και οι περισσότερες βιοδραστικές ενώσεις που χορηγούνται δια της κολπικής οδού έχουν ως στόχο την τοπική χορήγηση, για ένα µεγάλο αριθµό βιοδραστικών ενώσεων έχει παρατηρηθεί η µεταφορά τους στον ορό του αίµατος (Alexander et al., 2004; Song et al. 2004). Ο µηχανισµός διαπέρασης των περισσότερων βιοδραστικών ενώσεων είναι η απλή διάχυση (simple diffusion). Ενώ οι υδρόφοβες ουσίες απορροφούνται ενδοκυτταρικώς, οι υδρόφιλες απορροφούνται κυρίως µέσω των πόρων της κολπικής µεµβράνης (Vermani and Garg, 2000) Οι γέλες ως συστήµατα κολπικής χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων Τα συστήµατα κολπικής χορήγησης περιλαµβάνουν ένα µεγάλο αριθµό φαρµακευτικών µορφών όπως ηµιστερεά (semi-solids), ταµπλέτες (tamplets), κάψουλες (capsules), υγρά παρασκευάσµατα (liquid preparations), κολπικά υµένια (vaginal film), αφροί (foams) και ταµπόν (tampon). Οι περισσότερο συχνά χρησιµοποιούµενες µορφές ηµιστερεών παρασκευασµάτων για κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων είναι οι κρέµες (creams), οι αλοιφές (ointments) και οι γέλες (gels) (Prista et al., 1996; Vermani and Garg, 2000). Εκτός της σταθερότητάς τους, η 40

41 ικανότητα προσκόλλησης για ικανοποιητικό χρονικό διάστηµα πριν αποµακρυνθούν µε πλύσεις ή φυσικούς παράγοντες, είναι το κοινό χαρακτηριστικό των παρασκευασµάτων αυτών (Lachman et al., 2001). Τα κύρια χαρακτηριστικά των ηµιστερεών παρασκευασµάτων είναι η αποδεκτικότητα (acceptability) και το χαµηλό κόστος. Αντιθέτως, η αίσθηση ακαταστασίας (messiness) και ενόχλησης (discomfort) καθώς και η διαρροή αυτών είναι τα κυριότερα µειονεκτήµατα των ηµιστερεών παρασκευασµάτων (Hussain and Ahsan, 2005). Ένα από τα προβλήµατα που δηµιουργούνται από την συνηθισµένη κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων είναι η γρήγορη αποµάκρυνση από το σηµείο χορήγησης (Garg et al. 2003b). Οι γέλες είναι ηµιστερεά συστήµατα τα οποία αποτελούνται από µικρά ποσοστά στερεού, διεσπαρµένου σε σχετικά µεγάλα ποσοστά υγρού, τα οποία ωστόσο εµφανίζουν χαρακτήρα στερεού (Justin-Temu et al., 2004). Τα συστήµατα αυτά σχηµατίζουν ένα τρισδιάστατο πολυµερικό σύµπλεγµα το οποίο αποτελείται από ένα υψηλό ποσοστό φυσικής (ή µερικές φορές χηµικής) δικτύωσης (Lachman et al., 2001). Αποτελούνται από µακριές, άτακτες αλυσίδες οι οποίες διασυνδέονται σε συγκεκριµένα σηµεία, αλλά οι συνδέσεις πρέπει να είναι αντιστρεπτές. Οι µοριακοί µηχανισµοί σχηµατισµού της γέλης (gelation) δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως, ωστόσο ερευνητές επιχειρούν να σχεδιάσουν µόρια µε τέτοιες ιδιότητες (Goodsell, 2004). Οι γέλες µπορεί να εµφανίζουν διάφορα πλεονεκτήµατα σε σχέση µε άλλα συστήµατα κολπικής χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων όπως η υψηλότερη βιοδιαθεσιµότητα, ασφάλεια, ποικιλοµορφία και το χαµηλό κόστος (Justin-Temu at al., 2004) Περιβαλλοντικά ευαίσθητες γέλες Οι περιβαλλοντικά ευαίσθητες γέλες είναι συστήµατα στα οποία πραγµατοποιείται µεταβολή των φυσικών χαρακτηριστικών τους σαν αποτέλεσµα της έκθεσής τους σε περιβαλλοντικές αλλαγές. Ιδιαίτερης σηµασίας στην κολπική χορήγηση είναι οι θερµοευαίσθητες γέλες (thermosensitive gels). Οι γέλες αυτές είναι συστήµατα ικανά να λαµβάνουν τη µορφή γέλης ως απόκριση της θερµοκρασιακής αλλαγής, κυρίως για θερµοκρασιακές µεταβολές από αυτή του περιβάλλοντος στη θερµοκρασία του σώµατος. Συνήθως η θερµοκρασία σχηµατισµού της γέλης (gelation temperature) θεωρείται κατάλληλη εάν βρίσκεται µεταξύ o C (Chang et al., 2002b). Ο µηχανισµός της διεργασίας αυτής περιλαµβάνει µερική κρυστάλλωση και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (Jeong et al., 2002). Τα περισσότερο κοινά χρησιµοποιούµενα πολυµερή περιλαµβάνουν πολυσακχαρίτες, συµπολυµερή N-ισοπροπυλακριλαµιδίων, πολoξαµερή (poloxamers) και τα συµπολυµερή του poly(ethylene oxide)/poly(d,l-lactic acid-coglycolic acid) και µερικά λιποσωµικά συστήµατα. 41

42 Οι υδρογέλες της κατηγορίας πολοξαµερή (poloxamer) αντιπροσωπεύουν τα εκτενέστερα µελέτηµένα συστήµατα, ενώ οι πολυσακχαρίτες συνήθως εµφανίζουν καλή βιοσυµβατότητα ή/και βιοδιάσπαση, των οποίων τα διαλύµατα είναι θερµοευαίσθητα σε χαµηλές πολυµερικές συγκεντρώσεις (Ruel-Gariepy and Leroux, 2004) Φαρµακευτικός χαρακτηρισµός κολπικών γελών Όσον αφορά τη κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων, η βελτιστοποίηση των φαρµακοµορφών απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή, ιδίως χαρακτηριστικά όπως η υδροφιλικότητα (hydrophilicity), η κατανοµή (distribution), το ιξώδες (viscosity) και η βιοπροσκόλληση (bioadhesion) (Keller et al., 2003). Ο χαρακτηρισµός της γέλης πρέπει να πραγµατοποιείται καθόλη τη διάρκεια αποθήκευσης (Santos et al., 2002). Είναι γνωστό ότι τα χαρακτηριστικά της γέλης τα οποία επηρεάζουν την δράση της µπορεί να µεταβληθούν, όπως για παράδειγµα µεταβολή του ποσού του διαλύτη στο σύστηµα µπορεί να µεταβάλει τη µετανάστευση ενεργών µορίων διαµέσω της γέλης (Gallagher et al., 2003) Έλεγχος αποδέσµευσης βιοδραστικών ενώσεων και µελέτες διαπερατότητας Στη φαρµακευτική βιοµηχανία, ο έλεγχος απελευθέρωσης βιοδραστικών ενώσεων είναι πολύ σηµαντική διαδικασία στην ανάπτυξη φαρµάκων και τον ποιοτικό έλεγχο. Η επιλογή της σωστής in vitro µεθόδου µπορεί να µην µιµείται επακριβώς το in vivo περιβάλλον (Siewert et al, 2003). Το σύστηµα κυτταρικής διάχυσης του Franz (Franz cell diffusion system) θεωρείται γενικά ως η πιο κατάλληλη in vitro µέθοδος για τον έλεγχο απελευθέρωσης βιοδραστικών ενώσεων από γέλες για τοπική κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων (FDA, 1997 Siewert et al., 2003). Κατά την µορφοποίηση κολπικών γελών, διάφοροι παράγοντες, όπως το ph και η ωσµωτικότητα θα πρέπει να ληφθούν υπόψη, καθώς µπορεί να επηρεάσουν τη διάχυση (diffusion) και τη διαπερατότητα (permeation) των χορηγούµενων βιοδραστικών ενώσεων διαµέσω της γέλης και της κολπικής βλέννας (Owen et al., 1999). Για τις κολπικές γέλες που προορίζονται για επιτύχουν συστεµική απορρόφηση θα πρέπει επίσης να πραγµατοποιούνται δοκιµές διαπερατότητας. Η ανθρώπινη και ζωική κολπική βλεννώδη µεµβράνη (vaginal mucosa) έχει χρησιµοποιηθεί ως µοντέλο διαπερατότητας για in vitro µελέτες. Αν και διάφορα ζωικά µοντέλα, όπως η κολπική βλεννώδη µεµβράνη χοίρου, θεωρούνται γενικά κατάλληλα να αξιολογήσουν το βαθµό απορρόφησης µέσω του κολπικής κοιλότητας. Ωστόσο οι µελέτες διαπερατότητας στα µοντέλα αυτά δεν αντιστοιχούν πάντα απόλυτα µε τις µελέτες διαπερατότητας που 42

43 πραγµατοποιούνται σε ανθρώπινα δείγµατα (van Eyk and van der Bijl, 2005). Όταν χρησιµοποιείται ανθρώπινη κολπική µεµβράνη, θα πρέπει να γίνεται κατάλληλη επεξεργασία των δειγµάτων προκειµένου να επιτευχθούν επαναλαµβανόµενα και οµοιογενή αποτελέσµατα διαπερατότητας. Μια τεχνική γνωστή ως «Ussing chamber technique» προτάθηκε, τα αποτελέσµατα της οποίας έδειξαν ότι η µέθοδος αυτή µπορεί να θεωρηθεί χρήσιµη για τις in vitro µελέτες της κολπικής διαπερατότητας (Bechgaard et al., 1994) Μηχανικές µελέτες: ρεολογικές και δοµικές ιδιότητες Η σύνθεση µίας γέλης µπορεί να επηρεάσει σε µεγάλο βαθµό τις ρεολογικές της ιδιότητές. Ακόµα και ένα διαφορετικό συστατικό µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντική διαφοροποίηση της ρεολογικής της συµπεριφοράς (Bahia, 2001 Owen et al., 2001). Οι ρεολογικές ιδιότητες µπορούν να προσδιορισθούν µε την ρεοµετρία ταλάντωσης (oscillatory rheometry) ή ρεοµετρία ροής (flow rheometry), αν και οι µετρήσεις των ταλαντώσεων είναι προτιµητέες σε σχέση µε τις µετρήσεις ροής αφού επιτρέπουν ένα πλήρη χαρακτηρισµό τόσο των ελαστικών όσο και των ιξωδών συστατικών των συστηµάτων που µελετώνται (Madsen et al., 1998 Jones et al., 2003). Η ιδανική τιµή του ιξώδους των κολπικών γελών είναι δύσκολο να καθοριστεί. εδοµένου ότι οι γέλες παρουσιάζουν πάντα µη νευτώνια συµπεριφορά ροής, µια απλή µέτρηση του ιξώδους σε ένα καθορισµένο ρυθµό διάτµησης (shear rate) δεν είναι επαρκής για να χαρακτηρίσει πλήρως το προϊόν. Αντ' αυτού απαιτείται µια πολυσηµειακή µέτρηση (multipoint measurement) ικανή να αποσυνθέτει τη ρεολογική συµπεριφορά στα επιµέρους ιξώδη και ελαστικά συστατικά. Επίσης είναι σηµαντικό οι κολπικές γέλες να διατηρούν το ιξώδες τους όταν εφαρµόζονται υψηλότεροι ρυθµοί διάτµησης (shear rates) ή µετά από την ανάµειξη µε τα υγρά του κόλπου (Garg et al., 2001a). Η αξιολόγηση των ρεολογικών ιδιοτήτων πριν από µια κλινική µελέτη είναι ένα σηµαντικό στάδιο. Η προς εξέταση φαρµακοµορφή και το πλασέµπο (ψευδοφάρµακο) πρέπει να έχουν παρόµοιες ρεολογικές ιδιότητες και να διαφέρουν µόνο στην παρουσία ή την απουσία του ενεργού συστατικού (Owen et al., 2001). Η βελτιστοποίηση της γέλης δεν πρέπει να εντοπίζεται µόνο προς τη ρεολογία του αδιάλυτου υλικού, αλλά να περιλαµβάνει και µια επιλογή µακροµορίων τα οποία παράγουν τις επιθυµητές αλληλεπιδράσεις µε το κολπικό περιβάλλον. Η θερµοκρασία, το ph και οι αλληλεπιδράσεις των φαρµακοµορφών µε τα υγρά του κόλπου προκαλούν αλλαγές στο ιξώδες της γέλης οι οποίες πρέπει να ληφθούν υπόψη κατά τη µορφοποίηση της βιοδραστικής ένωσης (Owen et al.l, 2003). Κατά συνέπεια, οι ρεολογικές µετρήσεις πρέπει να καθοριστούν πριν και µετά από την ανάµειξη µε προσοµοιωµένα κολπικά ή 43

44 τραχηλικά υγρά, δεδοµένου ότι το µίγµα αυτό παρουσιάζει συχνά διαφορετική συµπεριφορά (Owen et al., 2000). Τα συνθετικά αυτά υποκατάστατα χρησιµοποιούνται κυρίως επειδή τα ανθρώπινα και ζωικά κολπικά υγρά είναι αφενός δύσκολο να συλλεχθούν και αφετέρου διασπώνται σχετικά εύκολα (Burruano et al., 2002). Μερικά τέτοια προσοµοιωµένα υγρά έχουν προταθεί από τους Owen and Katz, 1999 και Burruano et al., Επιπλέον, οι γέλες κατά τη διάρκεια της παραµονής τους µέσα στον κόλπο µπορεί να έλθουν σε επαφή µε σπέρµα, το αποτέλεσµα της προκύπτουσας αλληλεπίδρασης µπορεί να έχει επιπτώσεις στη ρεολογία της φαρµακοµορφής. Συνεπώς, όσο αφορά τα κολπικά υγρά µπορεί να χρησιµοποιηθούν στις ρεολογικές µελέτες προσοµοιωτές σπέρµατος (Owen και Katz, 2005). Επιπλέον, οι ρεολογικές αυτές δοκιµές πρέπει να εκτελούνται καθόλη τη διάρκεια αποθήκευσης καθώς είναι πιθανό να παρουσιασθούν αλλαγές στη δοµή των γελών (Tamburic και Craig, 1996). Μια µέθοδο γνωστή ως «texture profile analysis» (TPA) αποτελεί µια σηµαντική τεχνική προκειµένου να προσδιορισθούν οι µηχανικές ιδιότητες των ηµιστερεών, ιδιαίτερα των κολπικών γελών. Όσον αφορά στις ρεολογικές µετρήσεις, αυτοί οι προσδιορισµοί πρέπει να πραγµατοποιηθούν µέσα στη γέλη καθώς και στο µίγµα γέλη/κολπικά υγρά (Jones et al., 2003). Η µέθοδος TPA µπορεί να µας δώσει µερικές σηµαντικές παραµέτρους όπως η σκληρότητα (hardness), η συµπιεστότητα/ικανότητα εξάπλωσης (compressibility/spreadability), και η προσκολλητικότητα (adhesiveness) ενός φαρµακευτικού σκευάσµατος Τοξικολογική εκτίµηση Οι γέλες µπορεί να εµφανίζουν τοξικότητα στην κολπική βλεννώδη µεµβράνη και συνεπώς η τοξικότητα αυτή θα πρέπει να υπολογισθεί (Van Damme et al., 2000). Αν και µια γέλη µπορεί να αποδειχθεί ασφαλής, ωστόσο θα πρέπει να προστατεύει την κολπική περιοχή όταν χρησιµοποιείται σαν σύστηµα χορήγησης µίας ερεθιστικής βιοδραστικής ένωσης όπως π.χ. το nonoxynol-9 (Amaral et al., 1999). In vitro ανασυσταµένα ανθρώπινα κολπικά επιθηλιακά κύτταρα (reconstituted human vaginal epithelial cells) ή ιστοί (tissues) χρησιµοποιούνται για έλεγχο της τοξικότητας των γελών στις βλεννώδεις µεµβράνες. Μεταβολές στην δοµή των επιθηλιακών κυττάρων κατά την χορήγηση της βιοδραστικής ένωσης µπορεί να υποδηλώνει τοξικότητα (D Cruz et al., 2004). Πολλά ζωικά είδη χρησιµοποιούνται ως µοντέλα κατά τη χρήση κολπικών γελών ώστε να γίνει πρόβλεψη της in vivo τοξικότητας τους στη βλεννώδη µεµβράνη σε προκλινικές µελέτες. Τα κουνέλια είναι το κύριο ζωικό µοντέλο, αν και άλλα, όπως οι χοίροι, έχουν µελετηθεί ως εναλλακτικά µοντέλα (Catalone et al., 2004; D Cruz et al., 2005). Επίσης, εναλλακτικά µοντέλα σε σχέση µε τα σπονδυλωτά, για έλεγχο της τοξικότητας, ειδικά 44

45 στα πρώτα στάδια ανάπτυξης της κολπικής γέλης, είναι τα τεστ τοξικότητας σε γυµνοσάλιαγκες (Dhondt et al., 2005). Τα in vivo τεστ σε γυναίκες είναι τα πιο αξιόπιστα και θα πρέπει να πραγµατοποιούνται στη φάση Ι των κλινικών δοκιµών µίας γέλης. Μετά από απλή και πολλαπλή έκθεση στη γέλη ο ερεθισµός των γεννητικών οργάνων προσδιορίζεται από µεταβολές που παρατηρούνται στο επιθηλίωµα µε πυελική εξέταση και κολποσκόπηση καθώς και από τις παρατηρήσεις των ίδιων των γυναικών (Mauck et al., 2004). Ο προσδιορισµός των φλεγµονωδών κυτοκινών στα κολπικά υγρά (Paternoster et al., 2004), καθώς και µεταβολές στην κολπική µικροχλωρίδα (Patton et al., 1999) µπορεί επίσης να δώσει στοιχεία για την εκτίµηση του κολπικού ερεθισµού. Συγκριτικές µελέτες της φάσης Ι µεταξύ νέων φαρµακοµορφών και των εµπορικά διαθέσιµων έχουν χρησιµοποιηθεί και φάνηκαν χρήσιµες στον προσδιορισµό εάν οι νέες φαρµακοµορφές είναι κατάλληλες αναφορικά µε τον κολπικό ερεθισµό, την ασφάλεια, την κολπική διαρροή, την αποδεκτικότητα (acceptability) και άλλα χαρακτηριστικά (Mauck et al., 2001) Κολπική κατανοµή (distribute) και συγκράτηση (retention) Η κολπική κατανοµή και συγκράτηση των γελών είναι σηµαντικοί παράµετροι που πρέπει να συνεκτιµηθούν ώστε να επιτευχθεί αποτελεσµατικότητα. Συνεπώς, µία κολπική γέλη πρέπει να κατανεµηθεί και να διατηρήσει ένα στρώµα στο επιθήλιο (Geonnotti et al., 2005). Το ιδανικό είναι κάθε γέλη να ικανοποιεί τις δύο αυτές παραµέτρους (Barnhart et al., 2004). Παράγοντες όπως ένας υψηλότερος όγκος χορήγησης (π.χ. 3,5 ml αντί 2,5 ml), το βάδην και η σεξουαλική διείσδυση φαίνονται σηµαντικά ώστε να βελτιωθεί η εξάπλωση (spread) και η επιφανειακή επαφή (surface contact) της γέλης κατά την εφαρµογή της στον κόλπο (Barnhart et al., 2005b). Η σεξουαλική διείσδυση είναι ένας σηµαντικός παράγοντας στην κατανοµή της γέλης και της συγκράτησης αυτής. Πιστεύεται ότι η σεξουαλική πράξη µπορεί να αυξήσει δραµατικά την εξάπλωση στον κόλπο, αν και είναι πιθανό να παρατηρηθεί σε κάποιο ποσοστό συγκέντρωση της γέλης σε συγκεκριµένες περιοχές. Προσοµοιωµένη διείσδυση χρησιµοποιώντας διάφορα σεξουαλικά αντικείµενα, ως εναλλακτική µέθοδο της κανονικής διείσδυσης, έχει αποδειχθεί ικανοποιητική για τον προσδιορισµό του αποτελέσµατος της σεξουαλικής ενεργότητας στην εξάπλωση της γέλης και στην διατήρηση αυτής (Pretorius et al., 2002). Αρχικά, in vitro µελέτες χρησιµοποιήθηκαν για να εκτιµήσουν εάν ένα παρασκεύασµα έχει την δυνατότητα να εξαπλωθεί και να διατηρηθεί στον κόλπο. Αρκετές in vitro µελέτες έχουν αναπτυχθεί ώστε να επιτευχθεί ο στόχος αυτός. Στα τεστ αυτά η γέλη εκτίθεται σε κολπικά υγρά (vaginal fluid), τραχυλική βλέννα (cervical mucus), σπέρµα (semen) και προσοµοιωµένη συνουσία (simulating coital shearing 45

46 activity) (Geonnotti et al., 2005). Μια απλή in vitro µέθοδο βάση της οποίας µελετάτε η ροή της γέλης λόγω βαρύτητας µπορεί να χρησιµοποιηθεί ώστε να εκτιµηθεί η εξάπλωση των κολπικών γελών. Η απλή αυτή τεχνική η οποία βασίζεται στην ροή των γελών σε κεκλιµένες επιφάνειες, σε συνδυασµό µε µηχανιστικά µαθηµατικά µοντέλα, µπορεί να βοηθήσει στην επιλογή υποψήφιων φαρµακοµορφών πριν τα in vivo τεστ (Kieweg et al., 2004). Οι ρεολογικές ιδιότητες των γελών είναι σηµαντικές στην εξάπλωση και συγκράτηση τους στην κολπική επιφάνεια, κάτι το οποίο είναι ουσιώδες για την αποτελεσµατικότητά τους (Owen et al., 2000; El-Gizawy and Aglan, 2003). Το σωστό ιξώδες µίας γέλης είναι σηµαντικός παράγοντας στην επίτευξη ικανοποιητικής συγκράτησης και κατανοµής στον κόλπο. Τα απλά αυτά χαρακτηριστικά είναι σηµαντικά ώστε να επιτευχθεί ένα θεραπευτικό αποτέλεσµα, ιδιαίτερα στην περίπτωση των µικροβιοκτόνων (Di Fabio et al., 2003). Πρόσφατα αναπτύχθηκε ένα απλό τεστ για την µέτρηση της βιοπροσκόλλησης (bioadhesion) σε προσοµοιωµένες κολπικές συνθήκες, βασισµένο στην αρχή της εφαρµογής της αντοχής σε εφελκυσµό (tensile strength) και διατµητική τάση (shear stress) ώστε να διασπασθεί ο δεσµός προσκόλλησης (adhesive bond) µεταξύ του δείγµατος και ενός µοντέλου µεµβράνης. Στις µελέτες αυτές χρησιµοποιήθηκε ως µεµβράνη είτε ενυδατωµένη σελοφάνη (cellophane hydrated) µε προσοµοιωµένο κολπικό υγρό ή κολπική βλεννώδη µεµβράνη προβάτου (sheep vaginal mucosa). Ο έλεγχος της αντοχής σε εφελκυσµό (tensile strength) και της διατµητικής τάσης θα πρέπει να πραγµατοποιηθούν καθώς µπορεί να µας δώσουν διαφορετικά αποτελέσµατα για την ίδια γέλη, λόγω των διαφορετικών τύπων δυνάµεων που εµπλέκονται (Vermani et al., 2002b). Οι µελέτες απεικόνισης (imaging studies) παραµένουν οι πιο αξιόπιστες τεχνικές για τον in vivo προσδιορισµό κατανοµής του φαρµάκου για τοπικές χορηγήσεις, όπως η κολπική χορήγηση (Berridge et al., 2003). Η απεικόνιση µαγνητικού συντονισµού (magnetic resonance imaging) µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την εκτίµηση της κολπικής εξάπλωσης των γελών (Barnhart et al., 2001, 2005a,b). Στην πραγµατικότητα, η τεχνική αυτή µπορεί να παρέχει αντικειµενική in vivo σύγκριση της κάλυψης σε διαφορετικές χρονικές στιγµές ή µεταξύ συναγωνιστικών προϊόντων, και επίσης παρακολουθεί την µετανάστευση ουσιών από τον κόλπο προς τον τράχηλο (Barnhart et al., 2001, 2004). Μια ακόµα τεχνική απεικόνισης (imaging technique) που χρησιµοποιείται για να καταγράψει (monitor) την κολπική κατανοµή και συγκράτηση είναι το γ-σπινθηρογράφηµα (gamma scintigraphy). Αν και χρησιµοποιείται µόνο σε γυναίκες µετά το στάδιο της εµµηνόπαυσης (postmenopausalwomen), αυτή η ραδιενεργός ανιχνευτική µέθοδο (radioactive tracer method) έχει αποδειχθεί χρήσιµη στον προσδιορισµό της κολπικής συγκράτησης και κατανοµής των κολπικών φαρµακοµορφών (Brown et al., 1997; Chatterton et al., 2004). 46

47 Προσκόλληση στη βλέννα (mucoadhesion) Ως βιοπροσκόλληση ορίζεται η κατάσταση στην οποία δύο υλικά, από τα οποία τουλάχιστο το ένα είναι βιολογικής φύσεως, συγκρατούνται µεταξύ τους για µεγάλο χρονικό διάστηµα µε διαφασικές δυνάµεις (interfacial forces). Εάν η σύνδεση αυτή οφείλεται στη βλεννώδη επικάλυψη (mucus coating), το φαινόµενο καλείτε προσκόλληση στη βλέννα (mucoadhesion). Η κολπική οδό φαίνεται να είναι ιδανική για βιοπροσκολλώµενα (bioadhesive) συστήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων, ώστε να διατηρούνται τα συστήµατα αυτά τοπικά (παρά κάποιας συστεµικότητας) ή για αντισύλληψη (Smart, 2004). Οι γέλες είναι ένα από τα περισσότερο κοινά µελετούµενα συστήµατα από τις βλεννο-προσκολλητικές φαρµακοµορφές (mucoadhesive formulations) για κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων (Edsman and Hagerstrom, 2005). Το κύριο πλεονέκτηµα των βλεννο-προσκολλητικών συστηµάτων είναι η δυνατότητά τους να αυξάνουν το χρόνο παραµονής in situ, και έτσι να ελαττώνουν τον αριθµό χορηγήσεων. Σε ιδανικές καταστάσεις η φαρµακοµορφή παραµένει στην βιολογική επιφάνεια και η βιοδραστική ένωση απελευθερώνεται κοντά στην µεµβράνη απορρόφησης (absorptive membrane), µε αποτέλεσµα την αύξηση της βιοδιαθεσιµότητας (Woodley, 2001). Αν και διάφορες θεωρίες προσπαθούν να εξηγήσουν την προσκόλληση στη βλέννα (mucoadhesion), καµία από αυτές δεν µπορεί να εφαρµοσθεί ξεχωριστά σε όλες τις διαφορετικές φαρµοκοµορφές, αλλά διάφορες πρέπει να συνδυαστούν ώστε να ληφθεί µια εικόνα για την διαδικασία προσκόλλησης στη βλέννα. Οι θεωρίες αυτές περιλαµβάνουν την ηλεκτρονική θεωρία (electronic theory), τη θεωρία προσρόφησης (adsorption theory), τη θεωρία διαβροχής (wetting theory), τη µηχανική θεωρία (mechanical theory), τη θεωρία θραύσης (fracture theory) και τη θεωρία διάχυσης (diffusion theory) ή θεωρία αλληλοδιείσδυσης (interpenetration theory). Η τελευταία αυτή θεωρία είναι µία από τις περισσότερο αποδεκτές και έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών. Γενικώς, µπορεί να περιγραφεί σε δύο βήµατα: τη δηµιουργία αρχικής επαφής µεταξύ της φαρµακοµορφής και της βλεννώδους µεµβράνης, και την αλληλεπίδραση των συστατικών των δύο συστηµάτων (Εικόνα ). Η αλληλεπίδραση των πολυµερικών αλυσίδων κατά µήκος της βλεννώδους στοιβάδας η οποία καλύπτει την κολπική βλεννώδη µεµβράνη µπορεί να οδηγήσει σε προσκόλληση (adhesion). Το βάθος της αλληλοδιείσδυσης εξαρτάται από τον συντελεστή διάχυσης (diffusion coefficient) και τον χρόνο επαφής (time of contact), επηρεάζοντας την δύναµη του προσκολλητικού δεσµού (adhesive bond) (Smart, 2005). Στην περίπτωση ενός συστήµατος γέλης, τα άκρα της αλυσίδας και οι µικρότερου µοριακού βάρους αλυσίδες συµβάλλουν στην διαδικασία αλληλοδιείσδυσης. Επιπλέον, µια ικανοποιητική διαλυτότητα του βιοπροσκολλητικού στον κόλπο είναι σηµαντική 47

48 για µια καλή βλεννο-προσκόλληση (Huang et al., 2000; Edsman and Hagerstrom, 2005). Ο προσκολλητικός δεσµός (adhesive bond) µπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως µη-ειδικός (nonspecific) (τα περισσότερα συνθετικά πολυµερή) ή ειδικός (specific) (λεκτίνες και άλλα βιολογικά µόρια). Ο µηχανισµός την µη-ειδικής βιοπροσκόλλησης δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά φυσικοχηµικές διεργασίες όπως ηλεκτροστατικές δυνάµεις (electrostatic forces), υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις (hydrophobic interactions), δεσµοί υδρογόνου (hydrogen bonding), και αλληλεπιδράσεις Van der Wall s (Van der Wall s interactions) παίζουν σηµαντικό ρόλο (Woodley, 2001). Εικόνα Σχηµατική αναπαράσταση των σταδίων της θεωρίας αλληλοδιείσδυσης. (1) Πολυµερείς αλυσίδες που προσεγγίζουν τη βλεννώδη στοιβάδα. (2) Αλληλεπίδραση πολυµερούς και αλυσίδων της µεµβράνης (musin chains). (3) Ανάπτυξη δυνάµεων συγκράτησης (A: σωµατίδιο πολυµερούς, Β: βλεννώδη στοιβάδα, C: σειρά επιθηλιακών κυττάρων). Η βλεννο-προσκόλληση επιτυγχάνεται συνήθως µε τη χρήση συνθετικών και φυσικών βιοπροσκολλητικών πολυµερών (natural bioadhesive polymers). Μέχρι σήµερα τα περισσότερο χρησιµοποιούµενα βλεννο-προσκολλητικά πολυµερή είναι συνθετικοί πολυακριλικοί εστέρες (synthetic polyacrylates), αν και µερικά άλλα όπως η χιτοζάνη (chitosan), καραγενάνη (carragenan) ή µετα νατρίου άλατα αλγινικών οξέων (sodium alginate) θεωρείται οτι θα παίξουν σηµαντικό ρόλο στο µέλλον (Valenta, 2005). Πρόσφατα, θειο-πολυµερή (thyolated polymers) έχουν ερευνηθεί ως νέα βλεννο-προσκολλητικά µόρια. Σε µια συγκριτική µελέτη τα πολυµερή αυτά έδειξαν µεγαλύτερο χρόνο προσκόλλησης από τα συνηθισµένα χρησιµοποιούµενα πολυµερή (Grabovac et al., 2005). Οι ιδιότητες των πολυµερών όπως η διόγκωση, η βιοπροσκόλληση και η επίδραση στο µέσο pη έχουν µεγάλη σηµασία για τις βιοπροσκολλητικές κολπικές φαρµακοµορφές (bioadhesive 48

49 vaginal formulations) (Baloglu et al., 2003). Μερικά πολυµερή εµφανίζουν ειδικές βιοπροσκολλητικές ιδιότητες (site-specific bioadhesive properties) και για το λόγο αυτό οι βλεννο-προσκολλητικές ιδιότητες θα πρέπει να εκτιµούνται και να βελτιστοποιούνται σε σχέση µε το φυσιολογικό περιβάλλον (Garg et al., 2003a). Η δύναµη βλεννο-προσκόλλησης (mucoadhesive force) µπορεί να µελετηθεί µε διάφορες in vitro και in vivo µεθόδους (Edsman and Hagerstrom, 2005), ενώ η ρεολογία των γελών φαίνεται να συνδέεται µε τη βλεννο-προσκόλληση (Tamburic and Craig, 1995). Ρεολογικές µελέτες κολπικών γελών µε µίγµατα των φαρµακοµορφών και βλέννα παρέχουν πληροφορίες σχετικά µε αλληλεπίδραση µεταξύ των δύο αυτών υγρών, και συνεπώς των πιθανών βλεννοπροσκολλητικών ιδιοτήτων της κολπικής φαρµακοµορφής (Burruano et al., 2004). Σε µια συγκεκριµένη συγκέντρωση κάποιων πολυµερών, παρατηρείται ρεολογική συνέργια και συνεπώς και αύξηση της αντοχής της γέλης όταν αναµιγνύεται µε βλέννα (Madsen et al., 1998) Συστατικά που χρησιµοποιούνται σε κολπικές γέλες Η ελαστικότητα (compliance) είναι µία από τις κύριες παραµέτρους που θα πρέπει να έχουν τα κολπικά συστήµατα χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων. Κατηγορίες συστατικών που συνήθως χρησιµοποιούνται σε κολπικές γέλες περιλαµβάνουν παράγοντες σχηµατισµού γέλης (gelling agents), υλικά διατήρησης υγρασίας (humectants), συντηρητικά (preservatives) και σωµατίδια (vehicles) (Garg et al., 2001b). Πολυµερή που χρησιµοποιούνται εκτενώς ως παράγοντες σχηµατισµού γέλης στη µορφοποίηση κολπικών υδρόφιλων γελών είναι τα εξής: Carbopol (974P, 980, 971P and 943) Gelatin Hydroxyethylcellulose Hydroxypropylcellulose Hydroxypropylmethylcellulose Methylcellulose Polycarbophil Polyethylene glycol Polysaccharide hyaluronic Polyvinylpyrrolidone Sodium alginate, Sodium carboxymethylcellulose Starch 49

50 Εξ ορισµού, συνήθως επιλέγονται συστατικά, από αυτά που παρουσιάζονται, ώστε η γέλη να είναι φαρµακο-τοξικολογικά αδρανή (Pifferi and Restani, 2003) και συνεπώς σε γενικές γραµµές τα συστατικά στερούνται θεραπευτικής ενεργότητας. Ωστόσο αυτό δεν είναι κανόνας και ανάλογα των περιπτώσεων µπορεί τα συστατικά των γελών να εµφανίζουν θεραπευτική ενεργότητα και µάλιστα αυτό να είναι σκοπός στην ανάπτυξη ενός φαρµακευτικού συστήµατος. Σαν παράδειγµα, κάποια σουλφονιωµένα πολυµερή (sulphated polymers) όπως οι καραγενάνες (carrageenans) τα οποία συνήθως χρησιµοποιούνται ως παράγοντες σχηµατισµού γέλης (gelling agents) παρουσιάζονται ως µια από τις πιο σηµαντικές κατηγορίες πιθανών µικροβιοκτόνων (microbicides) (Coggins et al., 2000). Φαρµακοµορφές καραγενάνων µπορεί να είναι αποτελεσµατικές κατά HIV µολύνσεων καθώς φαίνεται να εµποδίζουν την µεταφορά των HIV µολυσµένων µονοπυρηνικών κυττάρων (HIV-infected mononuclear cells) από τα κολπικά υγρά στην βλεννώδη µεµβράνη. Τα πολυµερή αυτά σχηµατίζουν ένα αρνητικά φορτισµένο στρώµα γύρω από τα HIV µολυσµένα µονοπυρηνικά κύτταρα εµποδίζοντας την προσκόλληση τους στην κολπική επιθηλιακή επιφάνεια (Perotti et al., 2003). Επιπλέον, στοιχεία από µία φάσης Ι αρχική µελέτη δείχνει ότι µια γέλη Carbopol που περιέχει καραγενάνες ως µικροβιοκτόνο παράγοντα δεν προκαλεί σηµαντικό ερεθισµό στην γυναικεία αναπαραγωγική οδό, το οποίο µπορεί να είναι πλεονέκτηµα σε σχέση µε άλλα µικροβιοκτόνα τα οποία µπορεί να προκαλούν ερεθισµό στην κολπική βλεννώδη µεµβράνη (Coggins et al., 2000). Τα κολπικά συστήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων που χορηγούνται µε στόχο ένα συστεµικό αποτέλεσµα απαιτούν να διευκολυνθεί η διαπέραση των ενεργών ουσιών διαµέσω της βλεννώδους µεµβράνης. Για να γίνει αυτό διάφορα ενισχυτικά διαπέρασης (penetration enhancers) χρησιµοποιούνται (Finnin and Morgan, 1999; Thomas and Finnin, 2004; Ting et al., 2004). Η χιτοζάνη είναι ευρέως χρησιµοποιούµενη ώστε να παρασκευασθούν φαρµακευτικά συστήµατα για χορήγηση δια µέσω της βλεννώδους µεµβράνης, ιδιαίτερα βιοτεχνολογικών φαρµάκων (Issa et al., 2005). Μάλιστα η χιτοζάνη έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον σε ιατρικές και φαρµακευτικές εφαρµογές κυρίως λόγω της ικανότητάς της να αυξάνει τη διαπέραση, µαζί µε άλλες ιδιότητές της, όπως η βιοσυµβατότητα (biocompatibility), βιοαποικοδόµηση (biodegradability), βιοπροσκόλληση (bioadhesivity) και βακτηριοστατική επίδραση (bacteriostatic effect) (Berger et al., 2004). Ο µηχανισµός διαπέρασης οφείλεται στο γεγονός ότι η χιτοζάνη δεσµεύεται σε αρνητικά φορτισµένους ιστούς και κυτταρικές επιφάνειες, διευκολύνοντας έτσι την διαπερατότητα µέσω των επιθηλιακών φραγµών (epithelial barriers) (Issa et al., 2005). Η διείσδυση φαίνεται να είναι µεγαλύτερη για µεγάλου µοριακού βάρους χιτοζάνες, όπως η 5-µεθυλοπυρρολιδόνη χιτοζάνη (5-methyl-pyrrolidinone chitosan) η οποία 50

51 θεωρείται η περισσότερο υποσχόµενη όσο αφορά την αύξηση της απορρόφησης υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων µέσω της κολπικής βλεννώδους µεµβράνης (Sandri et al., 2004). Πριν τη χρήση πρέπει να αποδειχθεί η βιοσυµβατότητα των συστατικών τα οποία χρησιµοποιούνται στη µορφοποίηση κολπικών συστηµάτων µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων. Τα τέστ αυτά συνήθως πραγµατοποιούνται σε µοντέλα κυτταροκαλλιέργειας (cell culture models) και η βιοσυµβατότητα υπολογίζεται από την κυτταρική ανάπτυξη (cell growth), την κυτταρική βιωσιµότητα (cell viability), τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό (cell proliferation), την κυτταρική τοξικότητα (cytotoxicity), την αποτίµηση του νιτρώδους άλατος (nitrite assay), και την πρωτεϊνική αποτίµηση και προσδιορισµό (protein assay and identification) (Warrier et al., 2004). Επίσης η θερµιδοµετρία διαφορικής ανίχνευσης (differential scanning calorimetry, DSC) µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε ζωικά µοντέλα ώστε να εξαχθεί µια απευθείας σχέση µεταξύ της σταθερότητας της κολπικής µεµβράνης και του ποσοστού διαταραχής των λιπιδικών στρωµάτων κατά την έκθεση σε πολυµερικά συστήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων, και συνεπώς, της βιοσυµβαστότητας (Wang and Lee, 2002) Κλινική χρήση και δυνατότητες των κολπικών γελών Οι κολπικές γέλες ως µικροβιοκτόνα Σήµερα, το µεγαλύτερο µέρος της έρευνας στην κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων επικεντρώνεται στην παρεµπόδιση του µόλυνσης από τον HIV και των σεξουαλικά µεταδιδόµενων ασθενειών. Εµβόλια για την παρεµπόδιση της µετάδοσης του HIV είναι απίθανο να τεθούν στην κυκλοφορία σύντοµα (Garber et al., 2004). Τα µικροβιοκτόνα παρακάµπτουν πολλά από τις ανοσολογικές δυσκολίες που σχετίζονται µε την ανάπτυξη των HIV εµβολίων και κάνουν τις τοπικές γέλες ένα περισσότερο ρεαλιστικό στόχο, ειδικότερα µεσοπρόθεσµα (Greenberger, 2001; Markel, 2005). Αντιθέτως, τα προφυλακτικά δεν είναι πάντα αποδεκτά και δεν χρησιµοποιούνται πάντα σωστά από τους άνδρες, ώστε να εµποδίζονται οι σεξουαλικώς µεταδιδόµενες ασθένειες (Elias and Heise, 1994; Langenberg, 2004; Mukenge-Tshibaka et al., 2005). Επιπλέον, σε αντίθεση µε τα προφυλακτικά, η χρήση µικροβιοκτόνων ελέγχεται από τις γυναίκες, και δεν απαιτούν την συνεργασία, συγκατάθεση ή ακόµα και τη γνώση του συντρόφου. Τα µικροβιοκτόνα παρέχουν τη δυνατότητα επιλογής σε εκατοµµύρια γυναίκες που έχουν τον φόβο του HIV αλλά δεν µπορούν να διαπραγµατευτούν την χρήση προφυλακτικού, λόγω της ανισότητας των δύο φύλλων, την χαµηλού επιπέδου µόρφωσή τους και τη φτώχεια (Joshi et al., 2005). Έτσι τα µικροβιοκτόνα µπορεί να είναι η λύση στην σεξουαλική µετάδοση του HIV. 51

52 Τα µικροβιοκτόνα είναι χηµικοί παράγοντες που χρησιµοποιούνται τοπικά από τις γυναίκες µέσα στον κόλπο, ώστε να εµποδίσουν την µόλυνση από τον HIV και πιθανών από άλλους ιούς καθώς και σεξουαλικά µεταδιδόµενες παθογένειες όπως τα Chlamydia trachomatis και Τreponema pallidum (Pilcher, 2004; Weber et al., 2005). ιάφορες ουσίες έχουν µελετηθεί για τις µικροβιοκτόνες ιδιότητές τους, όπως ιϊκοί αναστολείς (viral entry inhibitors), µονοκλωνικά αντισώµατα (monoclonal antibodies) (Veazey et al., 2003), αναστολείς της αντίστροφης µεταγραφάσης (reverse transcriptase inhibitors) (Di Fabio et al., 2003), φυτικά προϊόντα (plant products) (Bourne et al., 1999; Vermani and Garg, 2002a; Dezzutti et al., 2004; Whaley and Zeitlin, 2005), ιονικά επιφανειοδραστικά (ionic surfactants) (Roy et al., 2001), δενδριµερή (dendrimers) (Bourne et al., 2000; McCarthy et al., 2005), σουλφιδικά και σουλφωνιωµένα πολυµερή (sulphated and sulphonated polymers) (Cheshenko et al., 2004), άλατα ψευδαργύρου (zinc salts) (Bourne et al., 2005) και άλατα χολικού οξέως (bile salts) (Herold et al., 1999). Πρόσφατα δεδοµένα που λήφθηκαν από κολπικά µοντέλα µακάκων έδειξαν ότι η τοπική χρήση µονοκλονικών αντισωµάτων µπορεί να είναι επίσης αποτελεσµατική στην παρεµπόδιση της µετάδοσης του HIV. Οι παράγοντες αυτοί µπορεί να δρουν και ως αντισυλληπτικά, αν και αυτό δεν παρατηρείται στα περισσότερα από τα τρέχοντα χρησιµοποιούµενα πιθανά µικροβιοκτόνα. Τα µικροβιοκτόνα µπορεί να κατηγοριοποιηθούν σαν πρώτης γενιάς ή επιφανειοδραστικά (π.χ. nonoxynol-9), ως δεύτερης γενιάς ή σαν ουσίες που µπλοκάρουν την δέσµευση του HIV (blocking HIV binding) [π.χ. πολυµερή του σουλφωνιωµένου ναφθαλενίου (naphthalene sulphonate polymer), καραγενάνη (carageenan), και σουλφιδική σελουλόζη (cellulose sulphate)], και τρίτης γενιάς ή τοπικά αντιρετροιϊκά (topical antiretrovirals) (π.χ. tenofovir, UC781 και TMC120) (Weber et al., 2005). Έχει παρατηρηθεί ότι κατά την εισαγωγή τοπικών µικροβιοκτόνων στον κόλπο υπάρχει µετανάστευση των ενεργών ουσιών στον τράχηλο, την ουρήθρα και τις σάλπιγγες. Τα ευρήµατα αυτά µπορεί να εκφράζουν ένα σηµαντικό µη αναγνωρίσιµο προς το παρόν µικροβιακό µηχανισµό δράσης (Barnhart et al., 2001). Είναι άξιο αναφοράς το γεγονός ότι αν και διάφορες κλινικές δοκιµές είναι σε εξέλιξη (βλέπε Πίνακα ), προς το παρόν, δεν είναι διαθέσιµο κάποιο αποτελεσµατικό µικροβιοκτόνο. Όσο αφορά το Nonoxynol-9, αν και κάποτε θεωρούταν ως ένα από τα πιο υποσχόµενα µικροβιοκτόνα, έχει σιγά-σιγά µειωθεί το ενδιαφέρον των ερευνητών προς αυτό, αφού µελέτες δείχνουν ότι το µόριο αυτό δεν είναι το ίδιο δραστικό in vivo όπως και in vitro κατά των κοινών σεξουαλικά µεταδιδόµενων παθογόνων (Roddy et al., 2002; Wilkinson, 2002). 52

53 Πίνακας Πρόσφατες κλινικές µελέτες σε µικροβιοκτόνα. Κλινική δοκιµή Φαρµακοµορφή Φάση Στόχος Στάδιο Safety and Tolerability of the Naphthalene Phase I Determine whether the vaginal gel PRO Completed Vaginal Gel PRO 2000/5 2-sulphonate gel 2000/5 causes irritation when used Safety and acceptability of PRO 2000/5 gel Phase I Determine the safety and acceptability In progress PRO 2000/5 Vaginal Gel in HIV Uninfected Women in India when used by women Safety and Acceptability of the Tenofovir PMPA gel Phase I Evaluate the PMPA gel in HIV-infected In progress Anti-Microbe Vaginal Gel, PMPA Gel and HIV-uninfected women BufferGel and PRO 2000/5 : BufferGel and PRO Phase II Determine the safety and effectiveness In progress Vaginal Gels to Prevent HIV 2000/5 gel of these gels Infection in Women Safety and Acceptability of a 1% Tenofovir gel Phase II Determine the safety and acceptability in Not yet started Vaginal Microbicide HIV uninfected sexually active women Effectiveness of 851B Gel for the 851B gel Phase II Determine the effectiveness compared to In progress Treatment of High-Risk Cervical Human Papillomavirus (HPV) placebo by assessing clearance of the HPV infection on the cervix Infection Effectiveness of BufferGel BufferGel Phases II Compare BufferGel to Gynol II, a In progress as a Vaginal Contraceptive and III currently available contraceptive gel Randomized Controlled 1.0% C31G Phase III Determine the effectiveness and safety In progress Trial of SAVVY and HIV SAVVY vaginal gel for the prevention of male-to-female Cellulose Sulphate (CS) Gel 6% cellulose sulphate Phase III Determine the effectiveness and safety In progress and HIV in Nigeria vaginal gel for the prevention of HIV infection A Study of Nonoxynol-9 (N-9) Nonoxynol-9 (N-9) Phase III Determine if it can prevent the spread of In progress and HIV Infection gel HIV πηγή: 53

54 Αν και τα µικροβιοκτόνα µπορεί να µορφοποιηθούν σε κρέµες, υµένια ή κολπικά υπόθετα οι γέλες φαίνεται να προτιµώνται. Οι ιδιότητες των γελών στις οποίες εγκλωβίζονται τα µικροβιοκτόνα επιδρούν στον ρυθµό διαπέρασης της βλεννώδους µεµβράνης από τα µικροβιοκτόνα και τις µικροβιοκτόνες ιδιότητές τους. Μια γέλη (Carbopol 974P % και hydroxypropylmethylcellulose %) έδειξε να είναι κατάλληλη για χορήγηση µικροβιοκτόνων, καθώς είναι αποτελεσµατική στην κολπική ελεγχόµενη αποδέσµευση µικροβιοκτόνων κατά σεξουαλικά µεταδιδόµενων ασθενειών (Wang and Lee, 2002). Επιπλέον, η ανάπτυξη µίας «παγκόσµιας» γέλης πλασέµπο απαιτείται ώστε να εξασφαλισθεί ότι η παρασκευή του control δεν διαταράσσει την ασφάλεια ή την αποτελεσµατικότητα των µετρήσεων των µικροβιοκτόνων. Πρόσφατα µια πλασέµπο υδροξυαιθυλοκυτταρίνη γέλη προτάθηκε ως κατάλληλο «παγκόσµιο πλασέµπο», καθώς παρουσιάσθηκε ως ασφαλές και επαρκώς ανενεργό για χρήση σε κλινικές µελέτες ερευνώµενων µικροβιοκτόνων (Tien et al., 2005). Εκτός της κολπικής χορήγησης κοινών χρησιµοποιούµενων ή µελετούµενων µικροβιοκτόνων, άλλες δραστικές ουσίες και µέθοδοι βασιζόµενες σε γέλες έχουν µελετηθεί. Γέλες οι οποίες περιέχουν µονοκαπρίνη (monocaprin, 1-monoglyceride of capric acid) έχουν ελεγχθεί ως πιθανά µικροβιοκτόνα, παρουσιάζοντας καλά χαρακτηριστικά ώστε να χρησιµοποιηθούν στο µέλλον για την παρεµπόδιση σεξουαλικώς µεταδιδόµενων ασθενειών (Neyts et al., 2000). Μελέτες που έγιναν in vitro έδειξαν ότι µορφοποιηµένες γέλες που περιέχουν µονοκαπρίνη, χρησιµοποιώντας ως παράγοντα σχηµατισµού γέλης sodium carboxymethylcellulose και polyvinylpyrrolidone (ph 7.0) ή carbomer and hydroxypropylmethylcellulose (ph 5.0), έχουν ιοκτόνα δράση (HSV-1) και είναι λιγότερο κυτοτοξικές σε σχέση µε το nonoxynol-9 (Kristmundsdottir et al., 1999). Άλλες µελέτες έδειξαν ότι οι γέλες αυτές όταν περιέχουν µονοκαπρίνη είναι επίσης αποτελεσµατικές κατά άλλων παθογόνων, όπως HIV-1 και κοινά βακτήρια που µπορεί να προκαλέσουν κολπίτιδα. Επιπλέον, οι γέλες παρουσίασαν σπερµοκτόνες ιδιότητες, υποδεικνύοντας πιθανή αντισυλληπτική δράση (Thormar et al., 1999), ενώ in vivo µελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι οι γέλες αυτές δεν παρουσιάζουν ερεθισµό ή τοξικότητα µετά από εφαρµογή στον κόλπο (Neyts et al., 2000). Σουλφιδικοί πολυσακχαρίτες (Sulphated polysaccharides) έχουν ελεγχθεί ως πιθανά µικροβιοκτόνα. Μία µορφοποιηµένη γέλη (PC 213) µε ι-καραγενάνη (iota-carrageenan) έδειξε να είναι αποτελεσµατική και ασφαλής στην παρεµπόδιση της HIV µόλυνσης σε µια δοκιµή φάσης I. Η φαρµακοµορφή περιείχε 2% ι-καραγεννάνη, βενζυλική αλκοόλη ως συντηρητικό και υδροχλωρικό οξύ για προσαρµογή του pη στο 6.0 (Elias et al., 1997). Poly(sodium 4-styrene sulphonate) (T-PSS) µορφοποιηµένες γέλες εµφάνισαν in vivo δράση ως τοπικά µικροβιοκτόνα και παρουσιάζονται ως εναλλακτικά του nonoxynol-9. Η δράση του T- 54

55 PSS οφείλεται στο µπλοκάρισµα της δέσµευσης των παθογόνων κυττάρων. T-PSS µορφοποιηµένες γέλες που ελέγχθηκαν περιείχαν 5 10% T-PSS, υδροξυµεθυλο σελουλόζη (hydroxyethyl cellulose), γλυκερίνη (glycerine), προπυλενο γλυκόλη (propylene glycol), βενζοϊκό οξύ (benzoic acid), methylparaben και ανθρακικό νάτριο (sodium hydroxide) (Bourne et al., 2003). Επιπλέον, η γέλη αυτή έδειξε να είναι αποτελεσµατική και ασφαλής ως αντισυλληπτικό σε κουνέλια (Zaneveld et al., 2002). Επίσης, δενδριµερή έχουν προταθεί σαν πιθανά µικροβιοκτόνα. Οι ουσίες αυτές είναι ισχυρά διακλαδισµένα µακροµόρια τα οποία συνθέτονται µε βάση ένα πολυλειτουργικό πυρήνα (polyfunctional group) (Bourne et al., 2000). To SPL7013 εµφανίσθηκε ως ένα από τα πιο υποσχόµενα δενδριµερή µετά από προ-κλινικές µελέτες και µορφοποιήθηκε σαν γέλη (VivaGel ) που είναι ήδη σε κλινικές δοκιµές (McCarthy et al., 2005). Οι Bernstein και οι συνάδελφοί του έδειξαν ότι µια γέλη µε 5% Carbopol (ph 4.5) µπορεί επίσης να είναι ικανή για ενδοκολπική χορήγηση του SPL7013 (Bernstein et al., 2003) Κολπικές γέλες ως αντισυλληπτικά Όπως ήδη αναφέρθηκε, γέλες που χρησιµοποιούνται ως µικροβιοκτόνα, όπως αυτές που περιέχουν nonoxynol-9, µπορεί να είναι αποτελεσµατικές ως αντισυλληπτικοί παράγοντες. Επίσης, κάποιες κολπικές γέλες έχουν ειδικά αναπτυχθεί µε στόχο την αντισύλληψη, ειδικά αυτές που περιέχουν σπερµοκτόνα. Αν και όχι τόσο αποτελεσµατικές όσο άλλες µέθοδοι αντισύλληψης, οι γέλες αυτές είναι ακόµα στην αρχή της ανάπτυξής τους και µερικές εµφανίζεται να έχουν µεγάλες δυνατότητες. Μερικές νέες κατηγορίες αντισυλληπτικών παραγόντων και πρωτοποριακών προσεγγίσεων έχουν εξετασθεί τα τελευταία χρόνια. ις(κυκλοπενταδιενυλ) σύµπλοκα του βαναδίου (IV) ή βαναδοκένια (vanadocenes) είναι πιθανές νέες κατηγορίες αντισυλληπτικών παραγόντων. Μελέτες σε ζώα και αποτελέσµατα ενδοκολπικής χρήσης vanadocene dithiocarbamate µέσω ενός µικρογαλοκτώµατος γέλης έδειξε ότι η γέλη αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί κλινικώς ως ένα ασφαλές εναλλακτικού τύπου αντισυλληπτικό που χρησιµοποιείται σήµερα (D Cruz and Uckun, 2005). Όσο αφορά τα µικροβιοκτόνα, η µορφοποίηση µίας γέλης µπορεί να εξασφαλίσει αντισυλληπτικό αποτέλεσµα, όπως για παράδειγµα γέλες σε όξινο ρυθµιστικό διάλυµα (acidbuffering gels). Η γέλη ACIDFORM έχει καλές όξινα-ρυθµιστικές ιδιότητες (acid-buffering properties) όταν αναµιγνύεται µε σπέρµα, και έτσι εµφανίζει σπερµατοκτόνα δράση. Επιπλέον, η γέλη αυτή επιτρέπει τον εγκλωβισµό ενεργών υδατοδιαλυτών και σταθερών σε οξέα συστατικών 55

56 (Garg et al., 2001a). Το πιθανό σπερµατοκτόνο αποτέλεσµα της γέλης αυτής επιβεβαιώθηκε κατά τη φάση Ι µιας κλινικής µελέτης, ενώ η διατήρηση της δραστικότητάς της όταν εισχωρείτε στον κόλπο ακόµα και περισσότερο από 10 ώρες πριν από την συνουσία είναι µια ενδιαφέρουσα παρατήρηση (Amaral et al., 2004). Μια θερµοευαίσθητη γέλη (πολυοξυπροπυλένιο, πολυοξυαιθυλένιο) σε όξινα ρυθµιστικό διάλυµα έχει συνεργικό αποτέλεσµα µε sodium lauryl sulphate στην αναστολή της σπερµικής κινητικότητας και για το λόγο αυτό η γέλη αυτή θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί σαν τοπικό κολπικό αντισυλληπτικό (Haineault et al., 2003). Οι ρεολογικές ιδιότητες των γελών έχουν σηµαντική επίδραση στην επιτυχία της αντισύλληψης. Καθώς η συνοχή του εφαρµοζόµενου προϊόντος αυξάνει, η αποτελεσµατικότητά του επίσης αυξάνει ως αποτέλεσµα του ότι γίνεται πιο σταθερό και ανθεκτικό στην µετανάστευση σπέρµατος και συνεπώς οδηγεί σε ελάττωση της ικανότητας του σπέρµατος να προσεγγίσει την περιοχή γονιµοποίησης (El-Gizawy and Aglan, 2003) Κολπικές γέλες που προκαλούν τοκετό Ενδοκολπικές γέλες που περιέχουν προσταγλανδίνες είναι γνωστό εδώ και πολλά χρόνια ότι µπορεί να χρησιµοποιηθούν για την πρόκληση τοκετού (MacKenzie and Embrey, 1977; Mackenzie et al., 1978; Taylor et al., 1999). ιάφορες γέλες που βασίζονται σε πολυµερή όπως το άµυλο (Harris et al., 1980), η υδροξυαιθυλοκυτταρίνη (Gauger, 1984), µεθυλοκυτταρίνη (Gauger, 1983), ή υδροξυαιθυλοµεθυλοκυτταρίνη (Calder et al., 1977) χρησιµοποιούνταν ως µεταφορείς προσταγλανδίνης. Η κολπική οδό σε ορισµένες περιπτώσεις έχει αποδειχθεί περισσότερο αποτελεσµατική στην πρόκληση τοκετού σε σχέση µε άλλες. Σε µια κλινική µελέτη, η χορήγηση µίας γέλης µε προσταγλανδίνη Ε2 έδειξε οτι είναι περισσότερο αποτελεσµατική στην πρόκληση τοκετού, συγκρινόµενη µε χορήγηση του ίδιου παρασκευάσµατος µέσω του τραχήλου της µήτρας (Seeras, 1995). Επίσης η κολπική µισοπροστόλη (misoprostol) είναι αποτελεσµατικότερη από την ισοδύναµη δόση που χορηγείται από το στόµα (Bartusevicius et al., 2005). Ωστόσο, η κολπική οδό µπορεί να σχετισθεί µε υψηλότερο ρίσκο υπερδιέγερσης της µήτρας και έχει το µειονέκτηµα ότι είναι λιγότερο βολική τόσο για τους ασθενείς όσο και για τους γιατρούς (Bartusevicius et al., 2005; Uludag et al., 2005). Επίσης, η υψηλότερη τιµή και η αναγκαιότητα ψύξης κατά την αποθήκευση των γελών είναι περιοριστικοί παράγοντες για τη χρήση τους (Gregson et al., 2005). Σε σύγκριση µε µία άλλη µορφή κολπικής χορήγησης, κατόπιν αναδροµικής ανάλυσης, παρατηρήθηκε ότι δεν υπήρχαν σηµαντικές διαφορές στον τοκετό µεταξύ µίας κολπικής γέλης που περιείχε προσταγλανδίνη Ε2 και ενός κολπικού δισκίου που χρησιµοποιήθηκε στην 56

57 πρόκληση του τοκετού, αν και στην περίπτωση όπου χρησιµοποιήθηκε κολπική γέλη παρατηρήθηκε µεγαλύτερο ποσοστό καθυστέρησης στην ανάπτυξη της µήτρας, µε λίγες γυναίκες να απαιτούν αύξηση της οκιτοκίνης (Shetty et al., 2004). Οι γέλες που περιέχουν προσταγλανδίνες έχουν δείξει ότι είναι χρήσιµες και σε άλλες καταστάσεις τοκετού, όπως για παράδειγµα γέλες που περιέχουν προσταγλανδίνη Ε2 µπορεί να είναι αποτελεσµατικές και ασφαλείς στην επίλυση δυστοκίας (dystocia) (Oppenheimer et al., 2005) Άλλες εφαρµογές κολπικών γελών Όπως στην περίπτωση σεξουαλικώς µεταδιδόµενων ασθενειών, ενδοκολπικές γέλες µπορεί να χρησιµοποιηθούν για την θεραπεία µολύνσεων από µη σεξουαλικώς µεταδιδόµενα παθογόνα. Μάλιστα, οι κολπικές γέλες που περιέχουν αντιµικροβιακούς παράγοντες έδειξαν ότι µπορεί να είναι το ίδιο αποτελεσµατικές όσο οι per os θεραπείες κατά τη θεραπεία της βακτηριακής κολπίτιδας (Sweet, 1993). Επίσης, οι γέλες µπορεί να χρησιµοποιηθούν για κολπική χορήγηση λιποσωµάτων (φωσφατιδυλοχολίνη ή διστεαρουλοφωσφατιδυλοχολίνη) που περιέχουν αντιβακτηριακά φάρµακα όπως clotrimazole, metronidazole, και chloramphenicol για τη θεραπεία των κολπικών µολύνσεων (Pavelic et al., 1999). Η ελεγχόµενη αποδέσµευση των αντιµικροβιακών µπορεί να επιτευχθεί χρησιµοποιώντας υδρόφιλες γέλες. Η χρήση µίας γέλης που περιείχε miconazole το οποίο αποδεσµεύεται σταδιακά έδειξε ότι µπορεί να επιφέρει ικανοποιητική ελάττωση των χορηγούµενων δόσεων, ακόµα και να οδηγήσει σε θεραπεία µε χορήγηση µίας απλής δόσης (Mandal, 2000). Η απλή µορφοποίηση ενός συστήµατος χορήγησης βιοδραστικής ένωσης µπορεί επίσης να οδηγήσει σε γέλες µε µικροβιοκτόνα δραστικότητα. Σε µια µελέτη 12 εβδοµάδων µία βλεννοπροσκολλητική κολπική γέλη µε όξινα-ρυθµιστικές ιδιότητες έδειξε να είναι δραστική στην θεραπεία της βακτηριακής κολπίτιδας. Η γέλη αυτή σχηµατίσθηκε από δύο πολυµερή, polycarbophil (υπεύθυνο για τις όξινα-ρυθµιζόµενες ιδιότητες) και Carbopol (Fiorilli et al., 2005). Η διατήρηση του κολπικού ph περίπου στο 4.5 µπορεί να είναι αρκετό να παρεµποδίσει τη µόλυνση. Επιπλέον, η όξινα-ρυθµιζόµενη γέλη µπορεί να έχει αξία όταν χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε peros χορήγηση αντιβακτηριακών βιοδραστικών ενώσεων, ώστε να επιτευχθεί η θεραπεία της βακτηριακής κολπίτιδας (Milani et al., 2003). Καθώς οι όξινα-ρυθµιζόµενες γέλες διατηρούν το φυσιολογικό ph του κόλπου, επιτρέπουν την αποκατάσταση της κανονικής φυσιολογίας (Robinson and Bologna, 1994). Επιπλέον µία όξινα-ρυθµιζόµενη polycarbophil γέλη είναι αποτελεσµατική στην θεραπεία της κολπικής ξηρότητας, ιδιαίτερα µετά και κατά τη 57

58 διάρκεια της εµµηνόπαυσης (Bachmann et al., 1991). Οι γέλες αυτές µπορεί επίσης να είναι χρήσιµες στην ελάττωση των συµπτωµάτων που σχετίζονται µε την κολπική ατροφία κατά το στάδιο µετά την εµµηνόπαυση, ειδικά σε γυναίκες που δε µπορούν να χρησιµοποιήσουν συστεµικά οιστρογόνα (Greendale et al., 1997). Επιπλέον, λιποσώµατα που περιέχουν αντιµικροβιακές βιοδραστικές ενώσεις έδειξαν πιθανότητα να εφαρµοσθούν στον κόλπο ώστε να θεραπευτεί η κολπίτιδα, αν και η συµπεριφορά τους στον κόλπο δεν είναι ακόµα πλήρως κατανοητή (Pavelic et al., 1999). Πολυακρυλικές γέλες έδειξαν να βελτιώνουν τη σταθερότητα λιποσωµάτων [phosphatidylcholine και phosphatidylglycerol-sodium, (9:1)] που περιέχουν καλσείνη, και συνεπώς, αποδείχθηκαν κατάλληλες για κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων. Οι βιοπροσκολλόµενες αυτές γέλες µπορεί να είναι ικανές να παρέχουν συνεχή και ελεγχόµενη αποδέσµευση βιοδραστικών ενώσεων για τοπική κολπική θεραπεία (Pavelic et al., 2001). Πρόσφατες µελέτες επιβεβαίωσαν την δυνατότητα εφαρµογής του τύπου αυτού γελών, ως κατάλληλα λιποσωµικά συστήµατα κολπικής χορήγησης, τα οποία µπορεί να παρέχουν τοπική και συνεχή αποδέσµευση ενεργών ουσιών, όπως acyclovir, clotrimazole και metronidazole, για τη θεραπεία του γεννητικού έρπη, όπως και της κολπίτιδας (Pavelic et al., 2005a,b). Χορήγηση ινσουλίνης µέσω του κόλπου έχει ελεγχθεί χρησιµοποιώντας πολυακριλικές υδατικά όξινες γέλες (polyacrylic acid aqueous gels). Όταν οι γέλες αυτές χορηγήθηκαν σε ποντίκια και κουνέλια, η ινσουλίνη στο πλάσµα έφτασε ένα µέγιστο, και τα υπογλυκεµικά αποτελέσµατα διατηρήθηκαν για 30 λεπτά. Ωστόσο, οι µεγαλύτεροι χρόνοι αποδέσµευσης είναι απαραίτητοι ώστε να επιτευχθούν µεγαλύτεροι χρόνοι υπογλυκεµίας (Morimoto et al., 1982). Πρόσφατα αναπτύχθηκαν κολπικές γέλες από χιτοζάνη (vaginal chitosan gels) για τη µεταφορά ινσουλίνης. Οι γέλες αυτές που περιέχουν 5% διµεθυλο-β-κυκλοδεξτίνη για αύξηση της διαπερατότητας, µπορεί να οδηγήσουν σε αύξηση του χρόνου αποδέσµευσης ινσουλίνης (Degim et al., 2005) Πρόσφατα εµπορικές κολπικές γέλες Αν και πολλά από τα κολπικά προϊόντα που βασίζονται σε γέλες είναι ακόµα υπό ανάπτυξη, υπάρχουν µερικά που είναι στην αγορά για κάποια χρόνια. Ο Πίνακας περιλαµβάνει µερικές τέτοιες γέλες καθώς και την ποιοτική τους σύσταση και τις χρήσης για τις οποίες προορίζονται. Προσπάθειες γίνονται να λανσαριστούν νέα προϊόντα στην αγορά καθώς τα κλινικά αποτελέσµατα κάποιων κολπικών γελών φαίνονται ελπιδοφόρα, ιδιαίτερα αυτά που αφορούν µικροβιοκτόνα και αντισυλληπτικά. Χαρακτηριστικά όπως η κολπική συγκράτηση 58

59 Πίνακας Εµπορικά διαθέσιµες κολπικές γέλες. Εµπορική ονοµασία Παράγοντας πήξης Άλλα συστατικά Ενεργά συστατικά Χρήση Εταιρία Acid Jelly a Tragacanth gum and Egg albumen, glycerin, Oxyquinoline Maintenance of Hope acacia gum perfume, potassium sulphate, vaginal acidity, Pharmaceuticals bitartrate, potassium ricinoleic acid, antiseptic hydroxide, acetic acid (ph ) propylparaben, stannous chloride, water Advantage- Polycarbophil and Glycerin, hydrogenated Nonoxynol-9 Contraceptive Columbia S b Carbopol 974P palm oil glyceride, (Bioahesive) Laboratories methylparaben, mineral oil, sodium hydroxide, sorbic acid, water Conceptrol Sodium Lactic acid, Nonoxynol-9 Contraceptive Advanced Care carboxymethyl- methylparaben, povidone, Products cellulose propylene glycol, sorbic acid, sorbitol solution, water Gynol II Sodium Lactic acid, Nonoxynol-9 Contraceptive Janssen Cilag carboxymethyl- methylparaben, povidone, cellulose propylene glycol, sorbic acid, sorbitol solution, water K-Y Hydroxyethyl- Chlorhexidine gluconate, - Vaginal Johnson & cellulose gluconolactone, glycerin, lubrication Johnson methylparaben, sodium hydroxide, water Metrogel Carbopol 974P EDTA, methylparaben, Metronidazole Bacterial 3M Vaginal c propylene glycol, vaginosis Pharmaceuticals propylparaben, sodium ph 4.0 hydroxide, water Crinone d Polycarbophil and Glycerin, hydrogenated Progesterone Infertility, Serono Carbopol 974P palm oil glyceride, secondary mineral oil, sodium amenorrhea hydroxide, sorbic acid, (Bioahesive) water Prostin E2 e Colloidal silicon Triacetin Dinoprostone Labour inducer Pharmacia dioxide Replens Polycarbophil and Glycerin, hydrogenated - Vaginal LDS Consumer Carbopol 974P palm oil glyceride, moisturizer Products methylparaben, mineral (Bioadhesive) oil, sodium hydroxide, sorbic acid, water a Available in some countries by the trade name Aci-Jel (Janssen Cilag). b Available in some countries by the trade name Advantage 24 (Lake Pharmaceutical). c Available in some countries by the trade name Zidoval (3M Pharmaceuticals). d Available in some countries by the trade name Prochieve (Columbia Laboratories). e Available in some countries by the trade name Prepidil (Pharmacia). 59

60 (retention), εξάπλωση (distribution) και βλεννο-προσκόλληση (mucoadhesion) είναι τα σηµεία κλειδιά για την ανάπτυξη µίας πετυχηµένης γέλης Αποδεκτικότητα (acceptability) γελών για κολπική χορήγηση Κατανοώντας τους παράγοντες που καθορίζουν την αποδεκτικότητα µίας γέλης, και συνεπώς τη χρήση της, είναι σηµαντικό, αφού ένα προϊόν µπορεί να είναι αποτελεσµατικό όταν χρησιµοποιείται σωστά. Ενώ πολλά προϊόντα εξετάζονται για την ασφάλεια και την αποτελεσµατικότητά τους, οι κλινικές δοκιµές γενικώς παραβλέπουν την εκτίµηση της αποδεκτικότητας (acceptability evaluation). Μάλιστα, καθώς ένα κολπικό προϊόν προσεγγίζει τη φάση Ι, οι έλεγχοι αυτοί θα πρέπει οπωσδήποτε να πραγµατοποιούνται (Bentley et al., 2000). Ταµπού και προκαταλήψεις που αφορούν την εφαρµογή ενός προϊόντος στον κόλπο µπορεί να περιορίσει την αποδεκτικότητα (Hardy et al., 2003). Επιπλέον, παράγοντες όπως η µορφοποίηση, εφαρµογές και η συσκευασία είναι σηµαντικοί ώστε να επιτευχθεί επαναληψιµότητα κατά τη χρήση (Hardy et al., 1998). Αν και γίνονται πολύ λίγες µελέτες αποδεκτικότητας (acceptability studies) στη βιβλιογραφία σχετικά µε συστήµατα κολπικής χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων, τα περισσότερα από αυτά δείχνουν ότι οι γέλες αποτελούν βρίσκονται στις επιλογές των γυναικών, όσον αφορά την κολπική χορήγηση (Coggins et al., 1998; Hardy et al., 1998; Bentley et al., 2000; Morrow et al., 2003; Vandebosch et al., 2004). Οι γέλες έχουν λιπαντικές ιδιότητες και αυτό µπορεί να διακριθεί κατά την σεξουαλική διείσδυση. Το ποσοστό λίπανσης που παρέχεται από ένα προϊόν είναι ένα καθοριστικό σηµείο της αποδεκτικότητάς και χρήσης του (Braunstein and Van de Wijgert, 2005). Σύγκριση µίας κολπικής γέλης που περιείχε προσταγλανδίνη Ε2 µε µια µη-κολπική µέθοδο (αµνιοκέντηση και ενδοφλέβια οξυτοκίνη) σχετικά µε την πρόκληση τοκετού, έδειξε ότι από τις δύο µεθόδους προτιµήθηκε περισσότερο η ενδοκολπική χορήγηση γέλης (Taylor and Armour, 2000) Συµπεράσµατα Αν και τις περισσότερες φορές η κολπική χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων θεωρείται ως εναλλακτική λύση έναντι άλλων περισσότερο βολικών οδών χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων, ωστόσο σε ορισµένες περιπτώσεις έχει αποδειχθεί χρήσιµη ή και πλεονεκτικότερη. Οι γέλες χρησιµοποιούνται για αρκετό διάστηµα ως µεταφορείς βιοδραστικών ενώσεων και πρόσφατες εξελίξεις στην τεχνολογία των γελών και πολυµερών προσέλκυσε το ερευνητικό ενδιαφέρον σε 60

61 αυτά τα πολυµερικά συστήµατα και για κολπική χορήγηση. Το αυξανόµενο ενδιαφέρον στον τοµέα αυτό είναι πλέον δεδοµένο. Ωστόσο υπάρχει πολύς δρόµος µέχρι να βελτιστοποιηθεί η φαρµακευτική απόδοση των κολπικών γελών και να επιτευχθεί τελειότητα στο κλινικό αποτέλεσµα. 61

62 Β. ΣΚΟΠΟΣ Προκειµένου να παρεµποδιστεί διάδοση του σεξουαλικά µεταδιδόµενου HIV είναι απαραίτητη η ανάπτυξη κατάλληλης κολπικής φαρµακοτεχνικής µορφής για τοπική χορήγηση η οποία θα αποτρέπει την µετάδοση του ιού σε υγιείς ανθρώπους. Το κολπικό αυτό σκεύασµα είναι σηµαντικό να αποτελείται από κατάλληλη βιολογικώς δραστική ουσία. Ως τέτοια µπορεί να θεωρηθεί το MC1220 {και το δραστικό εναντιοµερές του (R)-MC1220}, ένα µικροβιοκτόνο της κατηγορίας των DABOs αναστολέων (3,4-Dihyro-2- Alkoxy-6-Benzyl-4-OxopyrimidineS DABOs) (ArticoM., 2002). Πρόκειται για ένα µηνουκλεοτιδικό αναστολέα της αντίστροφης µεταγραφάσης (NNRTI) της κατηγορίας των αµινο- DABOs, όπου δηλαδή η µεθοξυ-οµάδα του C2 πυριµιδινικού δακτυλίου έχει αντικατασταθεί από την Ν,Ν-διµεθυλαµινο-οµάδα. Το MC1220 καθώς και το δραστικό R-εναντιοµερές αυτού, εµφανίζουν ισχυρή αντι-hiv δράση (Mai A, Artico M, et al και σχετικές παραποµπές). Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η παρασκευή κατάλληλου σκευάσµατος για την κολπική χορήγηση του MC [MC1220 και (R)-MC1220]. Η εξαιρετικά χαµηλή διαλυτότητα του MC σε υδατικά διαλύµατα µας οδήγησε στην ανάπτυξη κατάλληλων µικρογαλακτωµάτων, για αύξηση της διαλυτότητάς του, χρησιµοποιώντας διάφορους διαλύτες, επιφανειοδραστικά/αυξητικούς παράγοντες διαπέρασης, που συνήθως περιλαµβάνονται σε φαρµακοτεχνικές µορφές για τοπική χορήγηση. Τα µικρογαλακτώµατα αυτά χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή σκευασµάτων (απλές γέλες). Αντιθέτως η ανάπτυξη κατάλληλης λιποσωµικής µορφής του MC (DRV/MC λιποσώµατα) µε υψηλές τιµές εγκλωβισµού MC, µας έδωσε την δυνατότητα παρασκευής τελικών σκευασµάτων (λιποσωµικές γέλες) µε εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις MC. Επιπλέον και προκειµένου να αυξηθεί η συγκέντρωση του MC στις τελικές σύνθετες φαρµακοµορφές (λιποσωµικές γέλες), αναπτύχθηκαν σύµπλοκα υδροξυπροπυλ-βκυκλοδεξτρίνης/mc (HP-β-CD/MC), τα οποία επίσης χρησιµοποιήθηκαν για την ανάπτυξη σύνθετων (µε λιποσώµατα) γελών. Τέλος αναπτύχθηκαν κατάλληλες in vitro µέθοδοι, προκειµένου να γίνει συγκριτική αξιολόγηση των νέων φαρµακοµορφών, ως προς την δυνατότητα σταδιακής αποδέσµευσης του MC στην περιοχή ενδιαφέροντος. 62

63 Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Συσκευές Όργανα Παρακάτω περιέχονται οι συσκευές και τα όργανα που χρησιµοποιήθηκαν για την πραγµατοποίηση της παρούσας εργασίας 1. Ακίδα Υπερήχων (VibraCell) 2. Λουτρό Υπερήχων (Branson 2510) 3. Μηχανικός Αναδευτήρας (Vortex Genie 2) 4. Περιστρεφόµενος εξατµιστήρας (Buchi B-490) 5. Συσκευή επώασης 6. Συσκευή µέτρησης ph (Consort P902) 7. Συσκευή µέτρησης µεγέθους και δυναµικού ζ λιποσωµάτων (Nano2S) 8. Συσκευή λυοφιλοποίησης (Labconco) 9. Υδατόλουτρο ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας και ανακίνησης (Bioline) 10. Ηλεκτρονικό µικροσκόπιο σάρωσης (SEM) 11. HPLC (Diode Array Detector; Shimadzu) 12. Φασµατοφωτόµετρο (UV mini 124, Shimadzu) 13. Φυγόκεντρος (Biofuge 28RS της Heraeus Sepatech και Spectrafuge 16M της Labnet) 14. Φαρµακευτικός ζυγός (Mettler Toledo και Mettler AE 166) 2.2 Αντιδραστήρια 1. Φωσφατιδυλοχολίνη (PC, Egg-Chicken); (Lipoid S PC-3 της Lipoid) 2. Υδρογονωµένη φωσφατιδυλοχολίνη (HPC); (Lipoid) 3. Xοληστερόλη (Chol); (Sigma) 4. Έλαια; (Gattefossé) 5. Mineral Oil, Carboxymethyl cellulose (CMC), Glycerol, Chremophor EL, Pluronic F-68, Sucrose, Propylene Glycol, Agarose Type I-B; (Sigma) 6. Peg X; (Aldrich) 7. Captex 355; (Abitec Corporation) 63

64 8. MC [MC1220 και το (R)-MC1220 (MC-εναντιοµερές)]; logp = 2,76 ± 0,60. O O HN CH 3 HN CH 3 H 3 C N N CH 3 H 3 C N N (R) CH 3 CH 3 F F CH 3 F F 9. Carbopol 974P NF; (Noveon) * CH 2 H C * CO 2 H n Το Carbopol 974P NF είναι ένα όξινο πολυµερές του ακριλικού οξέως η διακλάδωση (crosslinking) των αλυσίδων επιτυγχάνεται µε αλλυλ-πεντα-ερυθριτόλη και ο πολυµερισµός πραγµατοποιείται σε οξικό αιθυλεστέρα. 10. Hydrophobically modified Hydroxyethylcellulose (ΗΜ-HEC) - Natrosol 250 HX; (Aldrich) OH HO O O O O * O OH O O OH O * OH O OH n Πρόκειται για υδρόφοβο γραµµικό πολυµερές (τροποποιηµένη HEC). 64