ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Β. ΝΙΚΗΦΟΡΙ Η ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Β. ΝΙΚΗΦΟΡΙ Η ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΑΠΟ ΦΥΤΡΟ ΑΡΑΒΟΣΙΤΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ Ι ΙΟΤΗΤΩΝ ΚΑΙ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011 i

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Β. ΝΙΚΗΦΟΡΙ Η ΧΗΜΙΚΟΥ ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΑΠΟ ΦΥΤΡΟ ΑΡΑΒΟΣΙΤΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ Ι ΙΟΤΗΤΩΝ ΚΑΙ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τοµέα Χηµικής Τεχνολογίας και Βιοµηχανικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας Ηµεροµηνία προφορικής εξέτασης: 05/12/2011 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Β. Κιοσέογλου Καθηγήτρια Μ. Τσιµίδου Αναπλ. Καθηγητής Γ. Μπλέκας Καθηγητής Κ. Μπιλιαδέρης Επίκ. Καθηγήτρια Α. Παρασκευοπούλου Λεκτόρισσα Φ. Μαντζουρίδου Λέκτορας Ν. Νενάδης Επιβλέπων Καθηγητής Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης ii

3 i

4 Κωνσταντίνος Β. Νικηφορίδης Α.Π.Θ Παραλαβή φυσικών γαλακτωµάτων από φύτρο αραβοσίτρου Μελέτη φυσικοχηµικών ιδιοτήτων και αξιοποίησή τους σε συστήµατα τροφίµων ISBN Η έγκριση της ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του ΑΠΘ δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα. Νόµος 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2 ii

5 ii

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Κύριος στόχος της διατριβής ήταν η αξιολόγηση των παραµέτρων της υδατικής εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρου αραβοσίτου και η µελέτη της σύστασης και των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων του παραγόµενου φυσικού γαλακτώµατος. Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Χηµείας, ΑΠΘ, η ρεολογική µελέτη των πηκτών πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Βιοχηµείας Τροφίµων του Τµήµατος Γεωπονίας, ΑΠΘ, ενώ η παρατήρηση των ελαιοσωµάτων µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο έλαβε χώρα στο Wageningen Electron Microscopy Center (WEMC) του τµήµατος Plant Science του πανεπιστήµιου του Wageningen στην Ολλανδία. Ευχαριστώ θερµά τον Καθηγητή Β. Κιοσέογλου που µου έδωσε την ευκαιρία εκπόνησης αυτής της διατριβής, αλλά τον ευχαριστώ κυρίως για τις συζητήσεις που είχαµε και το ότι µοιράστηκε απλόχερα τις γνώσεις του µαζί µου. Ευχαριστώ την Καθηγήτρια Μ. Τσιµίδου για τις υποδείξεις και παρατηρήσεις που βοήθησαν στην ολοκλήρωση της διατριβής. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γ. Μπλέκα ευχαριστώ για τις υποδείξεις του και τις διορθώσεις των δοκιµιών. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή Κ. Μπιλιαδέρη και τα υπόλοιπα µέλη του Εργαστηρίου Χηµείας και Βιοχηµείας Τροφίµων του Τµήµατος Γεωπονίας, ΑΠΘ για την δυνατότητα που µου παρείχαν να χρησιµοποιήσω το ρεόµετρο προκειµένου να µελετήσω τα ρεολογικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια Α. Παρασκευοπούλου, αλλά και τα υπόλοιπα µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής και του Εργαστηρίου Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων για το άψογο και φιλικό κλίµα που επικρατούσε σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της διατριβής. iii

7 iv

8 οποιαδήποτε αρχή πέρα της συνείδησης είναι δουλεία v

9 vi

10 στη µητέρα µου ήµητρα στον αδερφό µου Γιώργο και στη µνήµη του πατέρα µου Βασίλη vii

11 viii

12 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή οµή και σύσταση των ελαιοσωµάτων Οι πρωτεΐνες των ελαιοσωµάτων υνατότητα αξιοποίησης των ελαιοσωµάτων στην παρασκευή τροφίµων Το φύτρο του αραβοσίτου ως πρώτη ύλη για την παραλαβή ελαιοσωµάτων Αξιοποίηση του σπέρµατος του αραβοσίτου από τη βιοµηχανία τροφίµων Οι πρωτεΐνες του φύτρου Παραλαβή ελαιοσωµάτων από ελαιούχες πρώτες ύλες µε υδατική εκχύλιση Τα γαλακτώµατα στα συστήµατα των τροφίµων- εµβάµµατα σαλάτας Φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων Ο ρόλος των πρωτεϊνών στα γαλακτώµατα Ο ρόλος των πολυσακχαριτών στα γαλακτώµατα Ανταγωνιστική προσρόφηση µεταξύ πρωτεϊνών και τασενεργών µικρού µοριακού βάρους στα γαλακτώµατα Ρεολογικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων Ρεολογικά χαρακτηριστικά εµβαµµάτων σαλάτας ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΙΑΤΡΙΒΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά Όργανα-Συσκευές Μέθοδοι Υδατική εκχύλιση των ελαιοσωµάτων από το φύτρο Παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε ισοηλεκτρική συσσωµάτωση και φυγοκέντρηση Παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε φυγοκέντρηση µετά από προσθήκη σακχαρόζης Προσδιορισµός της περιεκτικότητας της κρέµας σε λίπος, υγρασία και πρωτεΐνη.46 ix

13 Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαµιδίου (SDS-PAGE) Παρασκευή γαλακτωµάτων µε βάση την κρέµα ελαιοσωµάτων που παραλήφθηκε µε ισοηλεκτρική συσσωµάτωση Παρασκευή γαλακτωµάτων από την κρέµα ελαιοσωµάτων που παραλήφθηκε µε φυγοκέντρηση παρουσία σακχαρόζης Μέτρηση της µέσης διαµέτρου των σταγονιδίων των γαλακτωµάτων Εκτίµηση της σταθερότητας των γαλακτωµάτων κατά την αποθήκευση Μέτρηση του ζ-δυναµικού της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων Προσδιορισµός των διεπιφανειακών πρωτεϊνών των ελαιοσωµάτων που εκροφώνται λόγω ανταγωνιστικής προσρόφησης του Tween Προσδιορισµός των διεπιφανειακών πρωτεϊνών των ελαιοσωµάτων στα γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας Μελέτη των ρεολογικών χαρακτηριστικών των γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας Προσδιορισµός του αριθµού υπεροξειδίων του ελαίου του φύτρου αραβοσίτου Εκτίµηση της οξειδωτικής σταθερότητας του ελαίου στις κρέµες των ελαιοσωµάτων Παρατήρηση του φύτρου αραβοσίτου µε µικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης (cryo-sem) Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρατήρηση των ελαιοσωµάτων στο φύτρο αραβοσίτου, µε ειδικό µικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης Υδατική εκχύλιση των ελαιοσωµάτων από το φύτρο Παραλαβή των ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε τη µορφή κρέµας Σύσταση και φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ Σύσταση και φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά της κρέµας ελαιοσωµάτων Σ Φυσικοχηµική σταθερότητα γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται µε αραίωση της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ x

14 3.7. Επίδραση της προσθήκης ξανθάνης στη φυσικοχηµική σταθερότητα γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες ΙΣ και Σ Επίδραση της προσθήκης Tween 80 στα επιφανειακά χαρακτηριστικά και τη σταθερότητα γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται µε βάση την κρέµα Σ Μεταβολή του ζ-δυναµικού και της σύστασης των πρωτεϊνών Φυσικοχηµική σταθερότητα των γαλακτωµάτων Μελέτη γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες Σ και ΙΣ Σύσταση των πρωτεϊνών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων στα γαλακτώµατα Ρεολογικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων Γαλακτώµατα πριν την αποθήκευση Γαλακτώµατα µετά από θερµική επεξεργασία Γαλακτώµατα µετά την αποθήκευση Φυσικοχηµική σταθερότητα των γαλακτωµάτων Οξειδωτική σταθερότητα του ελαίου στις κρέµες Σ και ΙΣ ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ xi

15 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ σελ. Πίνακας 3.1 Επίδραση του βαθµού άλεσης, της τιµής ph και του αριθµού των διαδοχικών εκχυλίσεων στην απόδοση της µεθόδου της υδατικής εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρο. 60 xii

16 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ σελ. Σχήµα 1.1. Φωτογραφία µε οπτικό µικροσκόπιο ελαιοσωµάτων σε βρυόφυτα. 4 Σχήµα 1.2. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής των ελαιοσωµάτων. 5 Σχήµα 1.3. Μηχανισµός σχηµατισµού ελαιοσωµάτων στα φυτά. 6 Σχήµα 1.4. Φωτογραφία µε ειδικό µικροσκόπιο διερχόµενης δέσµης (TEM) των κυττάρων των καρπών σόγιας. ΚΤ: κυτταρικό τοίχωµα, ΠΣ: πρωτεϊνικά σωµατίδια, ΕΛ: ελαιοσώµατα. 7 Σχήµα 1.5. οµή του µορίου της ελαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων. 8 Σχήµα 1.6. Πιθανή δοµή της καλαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων. 10 Σχήµα 1.7. Πιθανή δοµή της στερελαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων. 11 Σχήµα 1.8. Φωτογραφία µε χρήση ηλεκτρονικής µικροσκοπίας διερχόµενης δέσµης (ΤΕΜ) του φύτρου αραβοσίτου. Με λευκό χρώµα είναι τα ελαιοσώµατα (Ε), ενώ µε έντονο γκρι τα πρωτεϊνικά σωµατίδια (Π). 14 Σχήµα 1.9. Ανατοµικά χαρακτηριστικά του σπέρµατος του αραβοσίτου. 16 Σχήµα Τρόπος προσρόφησης διαφόρων τύπων επιφανειακώς ενεργών µορίων σε διεπιφάνεια ελαίου-νερού. Κατά σειρά από τα αριστερά προς τα δεξιά, τασενεργό, ευέλικτη πρωτεΐνη και σφαιροπρωτεΐνη. 26 Σχήµα Aλληλεπίδραση µη ιονικών τασενεργών µε τα υδρόφοβα τµήµατα µιας πρωτεΐνης. 28 Σχήµα Φωτογραφίες από ειδικό µικροσκόπιο µικτού προσροφηµένου υµενίου β- καζεΐνης/tween 40 σε επιφάνεια αέρα-νερού σε διάφορες τιµές 29 επιφανειακής πίεσης. Σχήµα Μεταβολή του ιξώδους του γαλακτώµατος σε σχέση µε το κλάσµα της εν διασπορά φάσης. 32 Σχήµα Μεταβολή του φαινοµενικού ιξώδους γαλακτώµατος σε σχέση µε το ρυθµό διάτµησης κατά τη διάσπαση των συσσωµατωµάτων των σταγονιδίων. 32 Σχήµα Γραµµική ιξωδοελαστική περιοχή πηκτών (α) και διάγραµµα στο οποίο φαίνεται η έναρξη σχηµατισµού πηκτής κατά τη θέρµανση (β). 33 Σχήµα Μεταβολή του ιξώδους ενός εµβάµµατος σαλάτας µε διαφορετική αναλογία σε κρόκο αυγού/κασεϊνικό νάτριο από 0:8 έως 8:0 αντίστοιχα. xiii

17 0:8 ( ), 1:7 ( ), 2:6 ( ), 4:4 ( ), 5:1 ( ), 6:2 (+) και 8:0 (x). 35 Σχήµα Ρεολογικά χαρακτηριστικά ενός εµβάµµατος σαλάτας µε διαφορετική αναλογία σε κρόκο αυγού/καζεϊνικό νάτριο από 0:8 έως 8:0 αντίστοιχα. G : 0:8 ( ), 1:7 ( ), 2:6 ( ), 4:4 ( ), 5:1 ( ), 6:2 (+) και 8:0 (Ж), G : 0:8 ( ), 1:7 ( ), 2:6 ( ), 4:4 ( ), 5:1 ( ), 6:2 (x) και 8:0 (-). 35 Σχήµα 2.1. ιάγραµµα ροής για την παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από φύτρο αραβοσίτου µε ισοηλεκτρική συσσωµάτωση (Ι.Σ). 44 Σχήµα 2.2. ιάγραµµα ροής για την παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από φύτρο αραβοσίτου µε προσθήκη σακχαρόζης (Σ). 45 Σχήµα 3.1. Φωτογραφία φύτρου αραβοσίτου µετά από ενυδάτωση για 1 ηµέρα (α), για 2 ηµέρες (β), και ηλιόσπορου µετά από ενυδάτωση για 1 ώρα, µε µεγέθυνση 7000 φορές (γ) και φορές (δ), µε ηλεκτρονική µικροσκοπία σάρωσης (cryo-sem). 57 Σχήµα 3.2 Ηλεκροφορηµα SDS-PAGE των πρωτεϊνών της κρέµας των ελαιοσωµάτων του φύτρου αραβοσίτου (διαδροµή 1) και ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 2) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας. 64 Σχήµα 3.3. Κατανοµή του µεγέθους των σταγονιδίων των ελαιοσωµάτων φύτρου αραβοσίτου σε φρέσκες κρέµες (ΙΣ) και µετά από αποθήκευση. Κρέµα ΙΣ αποθηκευµένη για 1 ηµέρα και µηχανική διασπορά σε νερό, κρέµα ΙΣ αποθηκευµένη για µία ηµέρα και διασπορά σε νερό µε εφαρµογή υπερήχων, ( ) κρέµα αποθηκευµένη για 25 ηµέρες και µηχανική διασπορά σε νερό, ( ) κρέµα αποθηκευµένη για 25 ηµέρες και διασπορά σε νερό µε εφαρµογή υπερήχων. 65 Σχήµα 3.4. Επίδραση της τιµής του ph στο ζ-δυναµικό των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ. 66 Σχήµα 3.5. Μεταβολή κατά την αποθήκευση, των τιµών των µέσων διαµέτρων d 3,2 ( ) και d 4,3 ( )των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ. 67 Σχήµα 3.6. Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 1) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας, των πρωτεϊνών του φύτρου αραβοσίτου (διαδροµή 2), των πρωτεϊνών της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ (διαδροµή 3), και των πρωτεϊνών της κρέµας xiv

18 ελαιοσωµάτων Σ (διαδροµή 4). 71 Σχήµα 3.7. Επίδραση της τιµής της ενεργού οξύτητας στο ζ-δυναµικό της δυναµικό της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ (α) και ΙΣ (β), παρουσία και απουσία ξανθάνης: ( ) κρέµα Σ, ( ) κρέµα Σ, 0,1% ξανθάνη, ( ) 73 κρέµα ΙΣ, ( ) κρέµα ΙΣ, 0,1% w/w ξανθάνη. Σχήµα 3.8. Φωτογραφίες από µικροσκόπιο και στοιχεία για το µέσο µέγεθος των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ και ΙΣ, µετά την παραλαβή τους και την αποθήκευση. 74 Σχήµα 3.9. Κατανοµή του µεγέθους του αρχικού γαλακτώµατος ( ) των ελαιοσωµάτων και των κρεµών ΙΣ ( ) και Σ ( ) ελαιοσωµάτων µετά από αποθήκευση για 15 µέρες. 75 Σχήµα Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ, µε περιεκτικότητα σε έλαιο 5% w/w (---) και 10% w/w (-) και τιµή ph 6,5 ( ) ή 3,8 ( ). 76 Σχήµα Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση γαλακτωµάτων από κρέµα ελαιοσωµάτων Σ (α) και ΙΣ (β), µε περιεκτικότητα σε έλαιο 5% w/w, και επίδραση της τιµής του ph, απουσία (γεµάτα σύµβολα) ή παρουσία (άδεια σύµβολα) ξανθάνης: (, ) ph 3, (, ) ph 4, (, ) ph 5, (, ) ph 6, (γεµάτο x, ανοικτό x) ph7. 79 Σχήµα Μεταβολή της τιµής του ιξώδους, σε σχέση µε το ρυθµό διάτµησης, γαλακτωµάτων 5% w/w σε έλαιο, µε τιµή ph 6, τα οποία παρασκευάζονται µε κρέµα Σ ( )και ΙΣ ( ) που περιέχουν ξανθάνη 0,1% w/w, και ενός διαλύµατος ξανθάνης 0,1% w/w (x). 81 Σχήµα Επίδραση της τιµής του ph στο ιξώδες (7,92 s -1 ) γαλακτωµάτων 5% w/w σε έλαιο της κρέµας Σ (µαύρη στήλη) και της κρέµας ΙΣ (γκρι στήλη), που περιέχουν ξανθάνη 0,1% w/w, και η τιµή του ιξώδους ενός διαλύµατος ξανθάνης 0,1% w/w (λευκή στήλη). 81 Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του Tween 80 στο ζ-δυναµικό των γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων µε ph 6,8, µετά από αποθήκευση για ( ) 30 min και για ( ) 1 ηµέρα. 85 Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του Tween 80, στο ποσοστό της πρωτεΐνης xv

19 που εκτοπίζεται από την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων ( )και στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης που παραµένει στην επιφάνεια, ( ). 86 Σχήµα Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 1) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας, των πρωτεϊνών της κρέµας Σ (διαδροµή 2), των πρωτεϊνών της επιγάνειας των ελαιοσωµάτων που εκτοπίστηκαν λόγω της παρουσίας 0,5% w/w Tween (διαδροµή 3) και 1,5% w/w Tween (διαδροµή 4), και των πρωτεϊνών που παρέµειναν στην επιφάνεια για συγκέντρωση 1,5% w/w Tween (διαδροµή 5). 87 Σχήµα Σχηµατική αναπαράσταση των πιθανών µεταβολών που λαµβάνουν χώρα στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων, λόγω της ανταγωνιστικής προσρόφησης των µορίων του Tween Σχήµα Μεταβολή µε το χρόνο αποθήκευσης της µέσης διαµέτρου των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ µε 5% w/w έλαιο, ( ) απουσία ή παρουσία ( ) 0,5, (x) 0,75, (+) 1,0 και ( ) 1,5% w/w Tween Σχήµα Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση των γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων µε 5% w/w έλαιο, ( ) απουσία και παρουσία ( ) 0,5, ( ) 1,0, ( ) 1,5 και (x) 2,0% w/w Tween Σχήµα Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 1) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας, των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ (διαδροµή 2), των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ, µετά την προσθήκη του κρόκου του αυγού (διαδροµή 3), των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ (διαδροµή 4), και των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ µετά την προσθήκη του κρόκου του αυγού (διαδροµή 5). 94 Σχήµα Μεταβολή του ιξώδους σε σχέση µε το ρυθµό διάτµησης γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες ελαιοσωµάτων ΙΣ και Σ πριν (α) ή µετά την αποθήκευσή τους για 75 ηµέρες (β). 96 Σχήµα Μηχανικά φάσµατα (20 ο C, γ=0,001) νωπών γαλακτωµάτων ΙΣ µε συγκέντρωση ελαίου 20% w/w (α) και 45% w/w (β), και νωπών xvi

20 Σχήµα Σχήµα Σχήµα Σχήµα Σχήµα γαλακτωµάτων Σ µε συγκέντρωση ελαίου 20% w/w (γ). 98 Επίδραση της εφαρµογής ενός κύκλου ψύξης-θέρµανσης (από τους 20 οc στους 80 ο C και µετά πάλι στους 20 ο C) στις τιµές των συντελεστών G και G γαλακτώµατος της κρέµας ΙΣ µε 20% w/w έλαιο, χωρίς (α) ή µετά την προσθήκη 2,5% w/w κρόκου αυγού (β), και στην εφαπτοµένη απώλειας (tanδ) του γαλακτώµατος Σ µε 20% w/w έλαιο και 2,5% w/w κρόκο αυγού (γ). 100 Επίδραση του χρόνου αποθήκευσης στις τιµές των ρεολογικών παραµέτρων G και tanδ των γαλακτωµάτων ΙΣ µε 20% w/w έλαιο (α) και των γαλακτωµάτων Σ µε 45% w/w έλαιο. 103 Μεταβολή µε το χρόνο αποθήκευσης της µέσης διαµέτρου των γαλακτωµάτων εµβάµµατος σαλάτας που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες ΙΣ και ΚΕ-ΣΓ. 105 Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση των γαλακτωµάτων εµβάµµατος σαλάτας που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες ΙΣ και ΚΕ-ΣΓ. 106 Μεταβολή µε το χρόνο αποθήκευσης στους 25 ο C του Α.Υ. του ελαίου της κρέµας ΙΣ ( ) και Σ ( ) µε περιεκτικότητα σε έλαιο 20% w/w. 110 xvii

21 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1. Εισαγωγή Κατά την κατανάλωση ενός τροφίµου, η αντίληψη των οργανοληπτικών του χαρακτηριστικών, όπως είναι η ευχυµία και η υφή, εξαρτάται εκτός από τη σύστασή του και από τις αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα συστατικά που καθορίζουν τη δοµή του. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητος ο έλεγχος των αλληλεπιδράσεων αυτών, καθώς είναι δυνατό να οδηγήσουν σε επιθυµητές ή µη, φυσικές (π.χ. συσσωµάτωση σωµατιδίων, διαχωρισµός φάσεων), χηµικές (δηµιουργία χηµικών δεσµών µεταξύ των µορίων) ή βιολογικές µεταβολές (π.χ. ζυµώσεις). Τα περισσότερα τρόφιµα είναι πολύπλοκα φυσικοχηµικά συστήµατα στα οποία οι αλληλεπιδράσεις που λαµβάνουν χώρα ανάµεσα στα διάφορα συστατικά οδηγούν σε δοµές και χαρακτηριστικά υφής και ευχυµίας που είναι πολύ διαφορετικές από αυτές των επιµέρους συστατικών τους. Μία τέτοια κατηγορία αποτελούν και τα τρόφιµα που εµφανίζονται µε τη µορφή γαλακτώµατος. Για παράδειγµα, γαλακτώµατα τροφίµων, όπως είναι τα παγωτά, οι κρέµες γάλακτος, τα εµβάµµατα σαλάτας, τα αλλαντικά κ.α., εµφανίζουν τελείως διαφορετικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά σε σχέση µε τα κύρια συστατικά που τα αποτελούν, δηλαδή το νερό και τα λιπίδια. Η κατανόηση, του τρόπου µε τον οποίο συµπεριφέρονται και αλληλεπιδρούν τα διάφορα συστατικά στο σύστηµα αποτελεί αναγκαία προϋπόθεση για την παρασκευή προϊόντων τροφίµων µε προβλέψιµα επιθυµητά χαρακτηριστικά και φυσικοχηµική σταθερότητα. Για την παρασκευή τροφίµων που εµφανίζονται µε τη µορφή γαλακτώµατος, εκτός από την επιλογή των κατάλληλων συστατικών και τη χρήση τους στις σωστές αναλογίες, θα πρέπει να λαµβάνονται υπόψη και άλλοι σηµαντικοί, µη τεχνολογικοί παράγοντες, όπως είναι αυτοί που συνδέονται µε την υγεία, αλλά και σε ορισµένες περιπτώσεις οικονοµικοί, ηθικοί και θρησκευτικοί παράγοντες (Becher, 1996). Ως γαλάκτωµα ορίζεται το κολλοειδές σύστηµα διασποράς ενός υγρού µε τη µορφή σταγονιδίων (ασυνεχής φάση ή φάση σε διασπορά) σε µια άλλη υγρή φάση (Dickinson, 1992). Μεταξύ των δύο φάσεων υπάρχει µία διεπιφανειακή µεµβράνη, η οποία σχηµατίζεται µετά την προσρόφηση µορίων που χαρακτηρίζονται από επιφανειοδραστικότητα, δηλαδή γαλακτωµατοποιητών. Οι γαλακτωµατοποιητές είναι ουσίες που παίζουν καθοριστικό ρόλο τόσο στο σχηµατισµό όσο και στη σταθεροποίηση των γαλακτωµάτων. Ανάλογα µε την κατανοµή της 1

22 ελαιώδους και της υδατικής φάσης, τα γαλακτώµατα διακρίνονται σε γαλακτώµατα ελαίου σε νερό (o/w) όπως είναι για παράδειγµα τα εµβάµµατα σαλάτας, οι µαγιονέζες, οι κρέµες λικέρ και οι κρέµες γάλακτος, στα οποία τα σταγονίδια του ελαίου διασπείρονται στην υδατική φάση, και σε γαλακτώµατα νερού σε έλαιο (w/o) όπως είναι η µαργαρίνη και το βούτυρο, όπου τα σταγονίδια νερού διασπείρονται στη φάση του ελαίου. Υπάρχει και µία τρίτη κατηγορία γαλακτωµάτων, τα γαλακτώµατα πολλαπλής φάσης, τα οποία δηµιουργούνται από τη διασπορά στο νερό ενός γαλακτώµατος νερού σε έλαιο (w/o/w). Τα γαλακτώµατα αυτά είναι δύσκολο να παρασκευασθούν αλλά και να διατηρηθούν σταθερά σε αυτή την κατάσταση για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Η συγκέντρωση των σταγονιδίων σε ένα γαλάκτωµα ονοµάζεται κλάσµα όγκου φάσης σε διασπορά, συµβολίζεται µε Φ για το οποίο ισχύει: (1) όπου V D και V E ο όγκος των σταγονιδίων και ο συνολικός όγκος του γαλακτώµατος, αντίστοιχα (McClements, 2005). Η παρασκευή ενός γαλακτώµατος πραγµατοποιείται µε τη διαδικασία της οµογενοποίησης. Κατά την οµογενοποίηση τα δυο υγρά αναµιγνύονται, µε αποτέλεσµα τη διασπορά του ενός υγρού στο δεύτερο µε τη µορφή σταγονιδίων το µέγεθος των οποίων, στη συνέχεια, ελαττώνεται καθώς διασπώνται βίαια σε µικρότερα τα οποία σταθεροποιούνται άµεσα µε τη βοήθεια του γαλακτωµατοποιητή (Bergenstahl & Alander, 1997). Εκτός όµως από τα τεχνητά γαλακτώµατα που παρασκευάζονται σε οικιακή ή βιοµηχανική κλίµακα, µε ανάµιξη και/ή οµογενοποίηση, στη φύση υπάρχουν και γαλακτώµατα, ο σχηµατισµός των οποίων λαµβάνει χώρα χωρίς την ανάγκη της κατανάλωσης µηχανικής ενέργειας αλλά µε τη βοήθεια βιοχηµικών µηχανισµών που επιτρέπουν ορισµένους ζωικούς οργανισµούς και φυτά να συνδυάζουν, το νερό µε τα λιπίδια µε τη βοήθεια φυσικών γαλακτωµατοποιητών όπως είναι οι πρωτεΐνες και τα φωσφολιπίδια. Ένα τέτοιο φυσικό γαλάκτωµα αποτελεί το γάλα των θηλαστικών (Ahn, Ganesan & Kwak, 2011) αλλά και το «γάλα» της καρύδας (Rohrbach, 2002) Το γάλα είναι ένα φυσικό γαλάκτωµα που καταναλώνεται ευρέως από την αρχαιότητα. Παράγεται από τα θηλυκά θηλαστικά και είναι η βασική τροφή των νεογνών. Το γάλα 2

23 αποτελείται από σφαιρίδια λίπους που σταθεροποιούνται από την παρουσία πρωτεϊνών, οι οποίες απαντούν τόσο στη διεπιφάνεια όσο και στη συνεχή φάση (Dickinson, 2001). Το φρέσκο γάλα δεν είναι πολύ σταθερό ως προς την αποκορύφωση και για αυτό απαιτείται οµογενοποίηση για αύξηση της σταθερότητάς του (Huppertz, 2006). Αποτελεί τη βάση για την παρασκευή πολλών γαλακτοκοµικών προϊόντων, όπως είναι το γιαούρτι, τα διάφορα τυριά και ορισµένα ποτά που παρασκευάζονται µε βάση την κρέµα γάλακτος (Krzeninski, Grosshable & Hinrichs, 2011). Το «γάλα» της καρύδας είναι επίσης ευρέως διαδεδοµένο και χρησιµοποιείται κυρίως στην ασιατική κουζίνα. Υπάρχουν αρκετές συνταγές µε βάση το γάλα καρύδας για παραγωγή τυριών, µαρµελάδας, διάφορων γλυκών και ποτών (Pelgrum, 1987). Το γάλα καρύδας παράγεται µετά από έκθλιψη της καρύδας και παραλαβή του ελαίου σε µορφή σταγονιδίων. Στο «γάλα» που προκύπτει περιέχονται κυρίως αλβουµίνες και γλοβουλίνες ενώ το 30% των πρωτεϊνών βρίσκεται στη συνεχή φάση. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν αρκετές εργασίες που µελετούν τις λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών των µη προσροφηµένων πρωτεϊνών (Haimanot, 1985), αλλά δεν έχουν γίνει εκτενείς µελέτες των πρωτεϊνών της διεπιφάνειας. Φυσικό γαλάκτωµα θεωρείται και το «γάλα» της σόγιας (Hankin & Hanna, 1983, Yan Tsz, 1977) που παραλαµβάνεται από τα σπέρµατα της σόγιας µε κατάτµηση, παρουσία νερού, της πρώτης ύλης µε αποτέλεσµα να προκύπτει ένα µικτό σύστηµα διασποράς στερεών σωµατιδίων του σπέρµατος και σφαιρικών σταγονιδίων ελαίου που ονοµάζονται ελαιοσώµατα. Τα τελευταία αποτελούν φυσικώς γαλακτωµατοποιηµένα λιπίδια µε τη βοήθεια µιας λιποπρωτεϊνικής µεµβράνης. Το «γάλα» της σόγιας καταναλώνεται κυρίως ως υποκατάστατο γάλακτος, είτε από χορτοφάγους, ή από άτοµα που παρουσιάζουν δυσανεξία στη λακτόζη (Hankin & Hanna, 1983). Πρόσθετοι παράγοντες που οδηγούν σε αύξηση των πωλήσεων του «γάλακτος» σόγιας, είναι η χαµηλότερη τιµή του σε σχέση µε το κανονικό γάλα (Moede, 1974), και ο ισχυρισµός ορισµένων επιστηµόνων ότι υπερτερεί διατροφικά από το κανονικό γάλα λόγω της µείωσης της χοληστερόλης που επιφέρει και της παρουσίας σε αυτό ενώσεων µε αντιοξειδωτικές ιδιότητες (Tripathi & Misra, 2005). Με τη θεωρία αυτή δε συµφωνούν όλοι οι επιστήµονες και πολλοί από αυτούς, προειδοποιούν για τα αρνητικά αποτελέσµατα της ευρείας κατανάλωσης της σόγιας και του «γάλακτός» της (Cassidy, Bingham & Setchell, 1995, Setchell et al., 1998). Από το «γάλα» της σόγιας παράγονται διάφορα προϊόντα όπως είναι το τοφού που είναι πήγµα του γάλακτος σόγιας και καταναλώνεται ευρέως στην ανατολική Ασία. Στην αγορά, µπορεί κανείς να συναντήσει και άλλα γαλακτώµατα παρόµοια µε το «γάλα» της σόγιας, 3

24 όπως είναι για παράδειγµα το «γάλα» βρώµης (Campling, 1991). Τα φυσικά αυτά γαλακτώµατα, παρασκευάζονται, µετά από υδατική εκχύλιση των αντίστοιχων πρώτων υλών οµή και σύσταση των ελαιοσωµάτων Τα φυτά αποθηκεύουν στους βολβούς, τους καρπούς και τα σπέρµατα, ενέργεια µε τη µορφή πολυσακχαριτών και λιπιδίων την οποία χρειάζονται κατά την περίοδο της βλάστησης και της ανάπτυξης του νέου φυτού (Murphy & Vance, 1999). Σχήµα 1.1. Φωτογραφία από οπτικό µικροσκόπιο ελαιοσωµάτων σε βρυόφυτα (Raven, 2005). Ειδικά τα λιπίδια των ελαιούχων σπερµάτων και των πλούσιων σε έλαιο ξηρών καρπών, αποθηκεύονται ενδοκυτταρικά και εντοπίζονται ακόµα και σε ορισµένους ζωικούς οργανισµούς, αλλά και στα κύτταρα µυκήτων (Huang, 1996). Για πρώτη φορά ανιχνεύθηκαν σε βρυόφυτα, όπου το σχήµα και το µέγεθός τους ποικίλλει (Σχήµα 1.1), ενώ δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως ο ρόλος τους, καθώς η συγκέντρωση του ελαίου είναι πολύ µεγαλύτερη από αυτήν που χρειάζεται ο βλαστός (Raven, 2005). Τα ενδοκυτταρικά αυτά σταγονίδια αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως ελαιοσώµατα (oil bodies, oleosomes) (Huang, 1992, Parker & Murphy, 1981). Τα ελαιοσώµατα στα διάφορα φυτά, έχουν διάµετρο που κυµαίνεται από 0,5 έως 2,5 µm, ενώ το σχήµα τους επηρεάζεται από το περιβάλλον στο οποίο βρίσκονται (Huang, 1992). 4

25 Σύµφωνα µε πρόσφατες µελέτες, τα ελαιοσώµατα που εκχυλίζονται από φύτρο αραβοσίτου έχουν ακόµα πιο µικρό µέγεθος, γύρω στα 0,1 µm. Η διαφορά αυτή σε σχέση µε προηγούµενες εργασίες είναι πιθανό να οφείλεται στη διαφορετική τεχνική µέτρησης που εφαρµόζεται αλλά και στο διαφορετικό τρόπο εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το υπόστρωµα (Nikiforidis, Karkani & Kiosseoglou, 2011). Η δοµή των ελαιοσωµάτων όπως παρατηρήθηκε µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, χαρακτηρίζεται στο εσωτερικό από ένα αδιαφανές υλικό, που αποτελείται από τριακυλογλυκερόλες που περιβάλλονται από αδιαφανή µεµβράνη. Η τελευταία αποτελείται από φωσφολιπίδια που διευθετούνται µε τέτοιο τρόπο, ώστε το υδρόφοβο τµήµα τους να προσανατολίζεται προς τα συστατικά του πυρήνα και η υδρόφιλη κεφαλή να εκτίθεται προς τα υπόλοιπα συστατικά του κυτταροπλάσµατος. Εκτός από τα φωσφολιπίδια, στη διεπιφανειακή µεµβράνη των ελαιοσωµάτων υπάρχουν πρωτεΐνες, και πιο συγκεκριµένα µίγµα πρωτεϊνών που ονοµάζονται ελαιοσίνες, καλαιοσίνες και στερελαιοσίνες (Σχήµα 1.2). Σχήµα 1.2. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής των ελαιοσωµάτων (Tzen, et al. 1993). Η χηµική σύσταση των ελαιοσωµάτων τα οποία αποµονώθηκαν από διάφορες πρώτες ύλες, έδειξε ότι αποτελούνται κατά 94 µε 98% w/w από ουδέτερα λιπίδια, τα οποία είναι κυρίως τριακυλογλυκερόλες, κατά 0,6 µε 2% w/w από φωσφολιπίδια και κατά 0,6 έως 3% w/w από πρωτεΐνες. Τα παραπάνω ποσοστά διαφοροποιούνται ανάλογα µε την προέλευση των ελαιοσωµάτων, ενώ το ίδιο ισχύει και για τη σύσταση των τριακυλογλυκερολών σε λιπαρά οξέα (Murphy et al., 1999, Tzen et al., 1993). 5

26 Τα ελαιοσώµατα παράγονται κυρίως ενδοκυτταρικά, µε ένα µηχανισµό ανάλογο µε αυτόν που παράγονται τα σταγονίδια του λίπους του γάλακτος. Πιο συγκεκριµένα, αρχικά δηµιουργείται µία µεµβράνη που περικλείει τη λιπαρή ύλη και αποτελείται κυρίως από φωσφολιπίδια. Στη συνέχεια παράγονται οι πρωτεΐνες οι οποίες µε ειδικό µηχανισµό τοποθετούνται στην επιφάνεια όπου και αλληλεπιδρούν µε τα φωσφολιπίδια (Σχήµα 1.3) (Engelman, 2005). Σχήµα 1.3. Μηχανισµός σχηµατισµού ελαιοσωµάτων στα φυτά (Murphy et al., 1999). Τα ελαιοσώµατα είναι πιθανό ορισµένες φορές να αποτελούν ακόµα και το 75% του ελαιούχου καρπού (Murphy et al., 1999). Εκτός από τα ελαιοσώµατα, στα κύτταρα των ελαιούχων καρπών, σχηµατίζονται και δοµές που αποτελούνται από πρωτεΐνες (πρωτεϊνικά σωµατίδια). Οι σχηµατισµοί αυτοί είναι αρκετά µεγαλύτεροι από τα ελαιοσώµατα και καταλαµβάνουν το µεγαλύτερο χώρο των κυττάρων (Σχήµα 1.4). Η αναλογία των πρωτεϊνών και του ελαίου, ποικίλλει, ανάλογα µε τον καρπό (Campbell et al., 2011). 6

27 Σχήµα 1.4. Φωτογραφία µε ειδικό µικροσκόπιο διερχόµενης δέσµης (TEM) των κυττάρων των καρπών σόγιας. ΚΤ: κυτταρικό τοίχωµα, ΠΣ: πρωτεϊνικά σωµατίδια, ΕΛ: ελαιοσώµατα (Campbell et al., 2011) Οι πρωτεΐνες των ελαιοσωµάτων Η επιφανειακή µεµβράνη των ελαιοσωµάτων, αποτελείται κυρίως από ελαιοσίνες (Huang, 1994). Οι ελαιοσίνες είναι αλκαλικές πρωτεΐνες µε µοριακό βάρος που κυµαίνεται από 15 έως 30 kda, το οποίο διαφοροποιείται ανάλογα µε την προέλευση. Στο µόριο της ελαιοσίνης διακρίνονται τρεις κύριες περιοχές, η περιοχή του Ν-τελικού άκρου που αποτελείται από 50 έως 70 αµινοξέα, το κεντρικό υδρόφοβο τµήµα που αποτελείται από 70 περίπου αµινοξέα, και το C- τελικό άκρο, το µέγεθος του οποίου ποικίλει ανάλογα µε την προέλευση. Σύµφωνα µε τα µοντέλα του µορίου που παρουσιάζονται στη βιβλιογραφία (Tzen & Huang, 1992, Tzen, Lie & Huang, 1992), το κεντρικό τµήµα της ελαιοσίνης που είναι προσανατολισµένο προς το εσωτερικό των ελαιοσωµάτων, σχηµατίζει δύο παράλληλες έλικες που καταλήγουν σε ένα σύµπλεγµα το οποίο σχηµατίζεται λόγω ενδοµοριακών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα σε µονάδες προλίνης (Σχήµα 1.5). Σύµφωνα µε µοντέλο αυτό, τα C- και Ν- τελικά άκρα της πρωτεΐνης εκτείνονται στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων όπου και αλληλεπιδρούν µε τα µόρια της πρωτογενούς επιφανειακής µεµβράνης που αποτελείται από φωσφολιπίδια. Μελέτες της δευτεροταγούς δοµής της ελαιοσίνης (Lacey et al., 1998, Lee, Ratnayake & Huang, 1995, Li et al., 1992, Millichip et al., 1996, Vanrooijen, Terning & Moloney, 1992) συνηγορούν υπέρ αυτού 7

28 του µοντέλου. Τα C- και Ν- τελικά άκρα σχηµατίζουν πιθανώς α-έλικες και σε ορισµένα σηµεία σχηµατίζουν πάλι έλικες αλλά µικρού µεγέθους. Σχήµα 1.5. οµή του µορίου της ελαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων (Millichip, et al., 1996, Lee, Ratnayake & Huang, 1995). Ο κύριος ρόλος της ελαιοσίνης είναι η φυσικοχηµική σταθεροποίηση των ελαιοσωµάτων. Για παράδειγµα, όπως αναφέρεται από τους Tzen & Huang (1992), η επεξεργασία µε θρυψίνη ενός αιωρήµατος ελαιοσωµάτων στο νερό έχει ως αποτέλεσµα την 8

29 πλήρη καταστροφή της δοµής τους, ενώ, αντίθετα η επεξεργασία µε φωσφολιπάση δεν έχει καµία επίδραση στην ακεραιότητα των ελαιοσωµάτων. Τα αποτελέσµατα αυτά οδηγούν στο συµπέρασµα ότι τα µόρια της ελαιοσίνης δηµιουργούν ένα προστατευτικό στρώµα πάνω από αυτό των φωσφολιπιδίων, εµποδίζοντας µε αυτό τον τρόπο τη δράση της φωσφολιπάσης. Ο προσανατολισµός αυτός της ελαιοσίνης έχει ως αποτέλεσµα να εκτίθενται προς το κυτταρόπλασµα οι αρνητικά φορτισµένες περιοχές του µορίου, το οποίο και είναι πολύ πιθανό να αποτρέπει τη συσσωµάτωση και τη συγχώνευση των ελαιοσωµάτων (Tzen et al., 1990). Το αρνητικό φορτίο της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων αλλά και οι πολυµερικές απώσεις που αναπτύσσονται ανάµεσα στις µεµβράνες των γειτονικών σταγονιδίων όταν αυτά αρχίζουν να πλησιάζουν το ένα το άλλο είναι, πιθανώς, η αιτία της µεγάλης σταθερότητας των ελαιοσωµάτων στα ελαιούχα σπέρµατα και τους ξηρούς καρπούς, όπου τα πολύ χαµηλά επίπεδα υγρασίας ωθούν τα ελαιοσώµατα να συµπιέζονται µεταξύ τους και να αναπτύσσονται έντονες τάσεις στην επιφάνειά τους (Ting & Huang, 1997). Σε αντίθεση µε τα ελαιούχα σπέρµατα και τους ξηρούς καρπούς, τα ελαιοσώµατα των καρπών της ελιάς αλλά και του αβοκάντο, δεν περιέχουν ελαιοσίνη (Ross et al., 1993). Αυτό συµβαίνει επειδή, όπως ισχυρίζονται ορισµένοι ερευνητές (Murphy et al., 1999), τα ελαιοσώµατα των καρπών αυτών δεν προορίζονται για την αποθήκευση του ελαίου για πολύ µεγάλο χρονικό διάστηµα, όπως συµβαίνει στην περίπτωση των ελαιούχων σπερµάτων και των ξηρών καρπών που χρησιµοποιούν το έλαιο µετά την πάροδο µεγάλου χρονικού διαστήµατος. Το µέγεθος των ελαιοσωµάτων είναι πιθανό να επηρεάζεται από τη συγκέντρωση της ελαιοσίνης (Sarmiento, Ross & Murphy, 1997). Για παράδειγµα, τα ελαιοσώµατα στο φύτρο ποικιλιών αραβοσίτου µε µεγάλη περιεκτικότητα σε έλαιο και υψηλή αναλογία ελαίου προς ελαιοσίνη, έχουν µεγάλο σχετικά µέγεθος, ενώ αυτά των ποικιλιών µε χαµηλή περιεκτικότητα σε έλαιο και χαµηλή αναλογία ελαίου προς ελαιοσίνη, έχουν µικρότερο µέγεθος (Ting et al., 1997, Ting et al., 1996). Έως πριν από ορισµένα χρόνια, οι ερευνητές πίστευαν ότι οι ελαιοσίνες αποτελούσαν τη µοναδική οµάδα πρωτεϊνών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων (Herman, 2008, Murphy et al., 1999). Μεταγενέστερες έρευνες έδειξαν ότι στα ελαιοσώµατα υπάρχουν σε µικρότερη συγκέντρωση και πρωτεΐνες µε µεγαλύτερο µοριακό βάρος από αυτό της ελαιοσίνης. Επειδή οι πρωτεΐνες αυτές σχηµατίζουν δεσµούς µε τα ιόντα ασβεστίου ονοµάστηκαν καλαιοσίνες. Η δοµή του µορίου τους είναι παρόµοια µε αυτήν των ελαιοσινών, και το µοριακό τους βάρος 9

30 κυµαίνεται από 25 έως 35 kda. Όπως και στην περίπτωση της ελαιοσίνης, στο µόριο της καλαιοσίνης διακρίνονται τρεις περιοχές, αλλά µε µικρότερο υδρόφοβο τµήµα. Το ιόν του ασβεστίου συνδέεται µε την καλαιοσίνη στο υδρόφιλο τµήµα του Ν-τελικού άκρου της (Σχήµα 1.6) (Chen et al., 1997, Naested et al., 2000). Ακόµα δεν έχει εξακριβωθεί αν το δισθενές ιόν του ασβεστίου αλληλεπιδρά µε ένα µόριο καλαιοσίνης ή συµµετέχουν δύο µόρια οπότε σχηµατίζονται διµερή. Σύµφωνα µε κάποιους ερευνητές, είναι πιθανό να υπάρχει στο µόριο και δεύτερο ιόν ασβεστίου (Ikura, 1996) ή να έχει εγκλωβιστεί το ιόν του ασβεστίου µεταξύ του Ν- τελικού άκρου και της επιφάνειας του ελαιοσώµατος (Frandsen, Mundy & Tzen, 2001). Το C- τελικό άκρο της καλαιοσίνης έχει και υδρόφιλο χαρακτήρα και εκτείνεται προς την υδατική φάση (Naested et al., 2000). Σχήµα 1.6. Πιθανή δοµή του µορίου της καλαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων (Naested et al., 2000). Μέχρι πολύ πρόσφατα, υπήρχε η αντίληψη ότι η καλαιοσίνη έπαιζε ένα δευτερεύοντα ρόλο στη σταθεροποίηση των ελαιοσωµάτων. Μετά όµως από µελέτη της φυσικοχηµικής σταθερότητας τεχνητά παρασκευασµένων ελαιοσωµάτων, παρατηρήθηκε ότι και η καλαιοσίνη, αν και απαντά σε σχετικά χαµηλή συγκέντρωση στην επιφάνεια των σταγονιδίων, παίζει έναν σηµαντικό σταθεροποιητικό ρόλο (Liu et al., 2009). Σηµαντικό ρόλο στη σταθερότητα των ελαιοσωµάτων παίζει και η παρουσία στο µόριο της καλαιοσίνης των ιόντων ασβεστίου, αφού 10

31 όπως παρατηρήθηκε, απουσία των ιόντων αυτών τα ελαιοσώµατα ήταν πολύ πιο ασταθή (Poxleitner et al., 2006). Επίσης παρατηρήθηκε ότι η παρουσία του ασβεστίου έχει σηµαντική επίδραση στην επιφανειοδραστικότητα του µορίου της καλαιοσίνης. Πιο συγκεκριµένα, τόσο η τιµή της επιφανειακής τάσης όσο και ο χρόνος που απαιτείται για τη σταθεροποίηση από την καλαιοσίνη µιας διεπιφάνειας νερού/ελαίου ή νερού/αέρα, εξαρτάται από τη συγκέντρωση των ιόντων του ασβεστίου (Purkrtova et al., 2008, Le Bon et al., 2008). Σχήµα 1.7. Πιθανή δοµή του µορίου της στερελαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων (Lin, et al., 2005). Τέλος, στη διεπιφάνεια των ελαιοσωµάτων παρατηρήθηκε η παρουσία σε µικρή συγκέντρωση και µίας τρίτης πρωτεΐνης, της στερελαιοσίνης. Λόγω της ενζυµικής δράσης του µορίου και του σχηµατισµού δεσµών στο C-τελικό της άκρο µε µόρια στερολών, η πρωτεΐνη αυτή εµφανιζόταν στη βιβλιογραφία µέχρι πρόσφατα µε το όνοµα στερολοαφυδρογονάση. Το µοριακό βάρος του µορίου της στερελαιοσίνης κυµαίνεται από 40 µέχρι 55 kda, ανάλογα µε την προέλευση. Το υδρόφοβο τµήµα ελαιοσίνης και στερελαιοσίνης είναι προσανατολισµένο προς το εσωτερικό των ελαιοσωµάτων, σχηµατίζοντας δύο παράλληλες έλικες που καταλήγουν σε ένα σύµπλεγµα λόγω ενδοµοριακών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα σε µονάδες προλίνης. Το υδρόφοβο τµήµα της στερελαιοσίνης σχηµατίζει µικρότερες έλικες από το αντίστοιχο της ελαιοσίνης (Σχήµα 1.7). Μία ακόµη σηµαντική διαφορά µεταξύ των πρωτεϊνών αυτών είναι ότι 11

32 η στερελαιοσίνη έχει αρκετά µεγαλύτερο υδρόφιλο τµήµα. Σε αντίθεση µε το µόριο των πρωτεϊνών αυτών, το µόριο της στερελαιοσίνης φέρει ένα αρκετά µεγαλύτερο υδρόφιλο τµήµα. Στο Σχήµα 1.7 δίνεται η πιθανή δοµή του µορίου της στερελαιοσίνης στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων όπου φαίνεται ότι λόγω του πολύ µεγαλύτερου υδρόφιλου χαρακτήρα του µορίου σε σχέση µε αυτό της ελαιοσίνης, το µόριο προσανατολίζεται προς το νερό ενώ ένα πολύ µικρό τµήµα του αλληλεπιδρά µε τα συστατικά της επιφανειακής µεµβράνης (Lin et al., 2005, Lin et al., 2002) υνατότητα αξιοποίησης των ελαιοσωµάτων στην παρασκευή τροφίµων Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, τα ελαιοσώµατα στα ελαιούχα σπέρµατα και τους ξηρούς καρπούς, εξαιτίας της παρουσίας και άλλων στερεών συστατικών και της σχετικά χαµηλής συγκέντρωσης του νερού, συµπιέζονται µεταξύ τους µε αποτέλεσµα να αποκτούν πολυεδρικά σχήµατα χωρίς όµως παρόλα αυτά να αποσταθεροποιούνται κατά την αποθήκευση των πρώτων υλών για πολύ µεγάλο χρονικό διάστηµα. Η φυσικοχηµική σταθερότητα που εµφανίζουν τα ελαιοσώµατα επιτρέπει την εκχύλισή τους µε τη βοήθεια του νερού, µε αποτέλεσµα να παραλαµβάνεται τελικά ένα φυσικό γαλάκτωµα ελαίου/νερού, το οποίο θα µπορούσε να αξιοποιηθεί στην παρασκευή προϊόντων, όπως είναι τα τρόφιµα, τα φαρµακευτικά προϊόντα και τα καλλυντικά. Ειδικά η βιοµηχανία τροφίµων θα µπορούσε να αξιοποιήσει τη φυσική αυτή παρουσία του ελαίου µε τη µορφή γαλακτώµατος και την προστασία που παρέχεται στη λιπαρή φάση, για τη δηµιουργία τροφίµων µε καλύτερες διατροφικές και οργανοληπτικές ιδιότητες σε σχέση µε αυτές των γαλακτωµάτων τροφίµων που παράγονται µε οµογενοποίηση τα οποία να εµφανίζουν µεγαλύτερη σταθερότητα κατά την επεξεργασία, την αποθήκευση και τη µεταφορά (Appelqvist et al., 2007). Τα γαλακτώµατα αυτά θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως έχουν µετά την εκχύλισή τους, οπότε και παραλαµβάνεται ένα προϊόν µε χαµηλή συγκέντρωση σε έλαιο, ή µετά από συµπύκνωσή τους σε κρέµα, ή, εναλλακτικά, ως συστατικά για την παρασκευή ενός µεγάλου αριθµού τροφίµων που εµφανίζονται µε τη µορφή γαλακτώµατος, όπως είναι τα εµβάµµατα σαλάτας, οι µαγιονέζες, τα ποτά, τα προϊόντα ζύµης και τα αλλαντικά. Γενικά, θα µπορούσαν να αξιοποιηθούν από τη βιοµηχανία για παρασκευή 12

33 οποιουδήποτε προϊόντος στο οποίο χρησιµοποιείται γαλακτωµατοποιηµένο φυτικό έλαιο ή λίπος (Takahashi, Iguchi & Mitamura, 1934). Με τη χρήση των γαλακτωµάτων των ελαιοσωµάτων είναι δυνατό να παραχθούν οικονοµικότερα προϊόντα τροφίµων, αλλά και φιλικότερα προς το περιβάλλον. Καταρχάς, για την παρασκευή του γαλακτώµατος δεν απαιτείται η χρήση γαλακτωµατοποιητή και η εφαρµογή του σταδίου της οµογενοποίησης. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει διεξοδικές µελέτες για την ενέργεια που απαιτείται ώστε να γαλακτωµατοποιηθεί ένα φυτικό έλαιο (Appelqvist et al., 2007). Η βιοµηχανία εκµεταλλεύεται τα δεδοµένα των µελετών αυτών για να επιλέξει τον κατάλληλο γαλακτωµατοποιητή ή συνδυασµό τους και την κατάλληλη µέθοδο οµογενοποίησης, µε σκοπό τη λιγότερη δυνατή κατανάλωση ενέργειας. Σε µία γραµµή παραγωγής όπου το στάδιο της γαλακτωµατοποίησης είναι πολύ σηµαντικό και ο οµογενοποιητής λειτουργεί σε καθηµερινή βάση, το ποσοστό της ενέργεια που καταναλώνεται έχει πολύ µεγάλη σηµασία (Becher, 1996). Η αποφυγή του σταδίου αυτού θα απέφερε µεγάλα οικονοµικά οφέλη στη µονάδα παραγωγής, λόγω της εξοικονόµισης ενέργειας. Η διεργασία καθίσταται φιλικότερη προς το περιβάλλον, καθώς κατά τις κλασικές τεχνικές εκχύλισης του ελαίου από ελαιούχες πρώτες ύλες χρησιµοποιούνται οργανικοί διαλύτες που είναι εύφλεκτοι, τοξικοί και το επιβαρύνουν (Gustone, 2011). Στη συνολική απαίτηση για ενέργεια µπορεί να συµπεριληφθεί και η κατανάλωση ενέργειας για τον εξευγενισµό του φυτικού ελαίου, ώστε να γίνει βρώσιµο, αλλά και εκείνη της ανακύκλωσης των οργανικών διαλυτών (De Greyt, 2000). Η υδατική εκχύλιση για την παραλαβή του ελαίου από τα ελαιούχα σπέρµατα µε τη µορφή ενός συστήµατος διασποράς των ελαιοσωµάτων στο νερό έχει το πλεονέκτηµα ότι δεν απαιτείται να υποβληθεί το έλαιο σε κάποια κατεργασία, και παραµένει εποµένως στην αρχική του φυσική µορφή (Iwanaga et al., 2007). Σύµφωνα µάλιστα µε µελέτες που έγιναν τα τελευταία χρόνια, διαπιστώθηκε ότι στη λιπαρή φάση των ελαιοσωµάτων απαντούν σε υψηλή συγκέντρωση συστατικά που είναι γνωστά για τη διατροφική τους αξία. Για παράδειγµα, σε ελαιοσώµατα που αποµονώθηκαν από ηλιόσπορο, ανιχνεύτηκαν τοκοφερόλες σε υψηλή συγκέντρωση, µε την α-τοκοφερόλη να είναι η κυρίαρχη µορφή (Fisk et al., 2006, Fisk et al., 2008). Η εξέταση της λιπαρής φάσης ελαιοσωµάτων που αποµονώθηκαν από σπόρους βρώµης, επιβεβαίωσε τη µεγάλη συγκέντρωση τοκοφερολών, µε κυρίαρχη αυτή τη φορά την παρουσία της δ-τοκοφερόλης. Στα ελαιοσώµατα της βρώµης ανιχνεύτηκαν επίσης σηµαντικά ποσοστά α- 13

34 τοκοτριενόλης (White, Fisk & Gray, 2006). Τα συστατικά αυτά ως φυσικά αντιοξειδωτικά είναι πιθανό να βοηθούν στην οξειδωτική σταθερότητα του φυσικώς γαλακτωµατοποιηµένου ελαίου. Πέρα από την σχετικά υψηλή συγκέντρωση σε συστατικά µε αντιοξειδωτική δράση, µεγάλη προστασία ως προς την οξείδωση της λιπαρής ύλης παρέχουν και ορισµένα συστατικά της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων. Η ελαιοσίνη, αλλά και οι άλλες πρωτεΐνες που απαντούν στην επιφάνεια, διευθετούνται µε τέτοιο τρόπο ώστε να σχηµατίζουν µεµβράνη µε πολύ µεγάλη συνοχή που πιθανώς παρεµποδίζει την εύκολη δίοδο προοξειδωτικών ενώσεων (Fisk et al., 2008) Το φύτρο του αραβοσίτου ως πρώτη ύλη για την παραλαβή ελαιοσωµάτων Τα ελαιοσώµατα, όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, περιέχονται κυρίως σε σπέρµατα που είναι πλούσια σε έλαιο, όπως είναι το σπέρµα της σόγιας, του ηλιόσπορου, του αραβοσίτου και άλλων (Huang, 1994, Huang, 1996, Huang et al., 1993). Σχήµα 1.8. Φωτογραφία µε χρήση ηλεκτρονικής µικροσκοπίας διερχόµενης δέσµης (ΤΕΜ) του φύτρου αραβοσίτου. Με λευκό χρώµα είναι τα ελαιοσώµατα (Ε), ενώ µε έντονο γκρι τα πρωτεϊνικά σωµατίδια (Π) (Mantese et al., 2006). 14

35 Στα σπέρµατα εκτός από τα ελαιοσώµατα, συνυπάρχουν και άλλα συστατικά, που είναι κυρίως πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες και διαιτητικές ίνες. Στην παρούσα διατριβή, η ελαιούχος πρώτη ύλη που επιλέχτηκε ήταν ο αραβόσιτος και πιο συγκεκριµένα το φύτρο αραβοσίτου, όπου κυρίως εντοπίζονται τα ελαιοσώµατα (Mantese, Medan & Hall, 2006). Από την παρατήρηση του Σχήµατος 1.8, διαπιστώνεται ότι στο φύτρο του αραβοσίτου µαζί µε τα ελαιοσώµατα συνυπάρχουν και κάποια άλλα σωµατίδια, που αποτελούνται από πρωτεΐνες. Η παραλαβή, εποµένως, των ελαιοσωµάτων από το φύτρο µε υδατική εκχύλιση είναι βέβαιο ότι αναµένεται να οδηγήσει σε συνεκχύλιση και ενός µεγάλου µέρους των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών του φύτρου, κάτι που θα πρέπει να λαµβάνεται υπόψη τόσο στην αξιολόγηση των ιδιοτήτων του φυσικού γαλακτώµατος που παραλαµβάνεται, όσο και στην περαιτέρω επεξεργασία του. Ο αραβόσιτος κατάγεται από την Αµερική και είναι το σπουδαιότερο καλλιεργούµενο δηµητριακό σε όλο τον κόσµο. Η εισαγωγή του στην Ευρώπη έγινε από τον Κολόµβο το 1494, ενώ καλλιεργήθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα το Οι Η.Π.Α εµφανίζουν τη µεγαλύτερη παραγωγή αραβοσίτου στον κόσµο µε 285 εκατοµµύρια τόνους ετησίως. Ακολουθούν η Κίνα, η Βραζιλία και το Μεξικό. Στην Ελλάδα καλλιεργείται κυρίως στη Μακεδονία, τη Θράκη, τη Στερεά Ελλάδα και την Πελοπόννησο και η ετήσια παραγωγή φτάνει το 1,5 εκατοµµύριο τόνους. Στην χώρα µας, όπως και στις περισσότερες χώρες της νοτίου και της κεντρικής Ευρώπης, ο αραβόσιτος αποτελεί τη βάση για τη διατροφή των ζώων, ενώ µικρό είναι το µέρος της παραγωγής, περίπου τόνοι (2,8%) που χρησιµοποιείται από την ελληνική βιοµηχανία για την παραγωγή τροφίµων (Agrotypos, 2011). Ο αραβόσιτος αποτελεί αξιόλογη πηγή πρωτεϊνών και σηµαντική πηγή αµύλου (περίπου 75%) (Hill, Bender & Yumkella, 1990, Hill & Shove, 1972). Συγκεκριµένα, το άλευρο που παραλαµβάνεται από το σκληρό µέρος του αραβοσίτου χρησιµοποιείται για την παρασκευή διάφορων προϊόντων αρτοποιίας (Tsen, Mojibian & Inglett, 1974), το άµυλο του αραβοσίτου για την παρασκευή αµυλοσιροπίου και τροποποιηµένου αµύλου, ενώ το φύτρο αραβοσίτου αξιοποιείται από τη βιοµηχανία για παραλαβή του αραβοσιτελαίου ή για ζωοτροφή (Nielsen et al., 1973). Επιπλέον, τα υπολείµµατα από την κατεργασία του αραβοσίτου αποτελούν µία από τις σηµαντικότερες πηγές βιοµάζας. Το φύτρο του αραβοσίτου αποτελεί το 12% του συνολικού σπέρµατος και εντοπίζεται στο κέντρο του (Σχήµα 1.9). Είναι το τµήµα του αραβοσίτου που περιέχει τα απαραίτητα στοιχεία (βιταµίνες, µέταλλα) που χρησιµοποιεί το φυτό για να αναπτυχθεί. Περιέχει έλαιο που 15

36 κυµαίνεται από 25-40% και πρωτεΐνη σε ποσοστό από 13-17%, ανάλογα µε την ποικιλία του αραβοσίτου (Bajaj, 1994, Banac, 1968). Φύτρο Αραβοσίτου Σχήµα 1.9. Ανατοµικά χαρακτηριστικά του σπέρµατος του αραβοσίτου Αξιοποίηση του σπέρµατος του αραβοσίτου από τη βιοµηχανία τροφίµων Η βιοµηχανία χρησιµοποιεί την υγρή ή την ξηρή άλεση για την αξιοποίηση του σπέρµατος του αραβοσίτου. Η υγρή άλεση εφαρµόζεται για την παραλαβή µεγάλων ποσοτήτων αµύλου από τον αραβόσιτο το οποίο προορίζεται για την παραγωγή πολλών προϊόντων τροφίµων και αιθανόλης µετά από ζύµωση. Η διεργασία είναι κατάλληλα σχεδιασµένη ώστε να διαχωρίζονται το φύτρο, οι πρωτεΐνες και το άµυλο από το σπέρµα. O διαχωρισµός αυτός επιτυγχάνεται κυρίως µε εµβάπτιση των σπερµάτων σε διαλύµατα που περιέχουν SO 2 το οποίο σπάει εν µέρη τον ιστό και συντελεί στον διαχωρισµό του αµύλου από την πρωτεΐνη. Η ξηρή άλεση περιλαµβάνει την αποµάκρυνση του φύτρου και του πιτύρου για την παραγωγή προϊόντων για ανθρώπινη κατανάλωση (Parris et al., 2006). Το πίτυρο χρησιµοποιείται κυρίως σε ζωοτροφές (Nielsen et al., 1973). Το φύτρο αραβοσίτου αξιοποιείται κυρίως για την παραλαβή ελαίου. Όπως και στις περισσότερες φυτικές ύλες που είναι πλούσιες σε έλαιο έτσι και στην περίπτωση του φύτρου αραβοσίτου για την παραλαβή του ελαίου εφαρµόζεται η µέθοδος της εκχύλισης. Στη βιοµηχανία ως διαλύτης εκχύλισης χρησιµοποιείται το εξάνιο (van der Vossen & Umali, 2001). Οι τριακυλογλυκερόλες του ελαίου διαλυτοποιούνται στο εξάνιο µε αποτέλεσµα την παραλαβή 16

37 του ελαίου. Μετά την αποµάκρυνση του εξανίου και των υπολειµµάτων του ακολουθεί το στάδίο του εξευγενισµού που οδηγεί τελικά στην παραλαβή αραβοσιτελαίου (Verheijen & Jimmink, 1995) Οι πρωτεΐνες του φύτρου Στο φύτρο αραβοσίτου, αλλά και σε πολλές πρώτες ύλες που είναι πλούσιες σε έλαιο, εκτός από τις πρωτεΐνες που είναι προσροφηµένες στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων και οι οποίες έχουν έναν σταθεροποιητικό ρόλο, υπάρχουν και οι αποθηκευτικές πρωτεΐνες που απαντούν µε τη µορφή σφαιρικών σωµατιδίων (Villegas & Mertz, 1971). Οι πρωτεΐνες του φύτρου ανήκουν στις κατηγορίες των αλβουµινών, γλοβουλινών, γλουτελινών και προλαµινών (ζεΐνη). Μία σηµαντική ιδιότητα της πρωτεΐνης του φύτρου του αραβοσίτου σε σχέση µε αυτές του υπόλοιπου σπέρµατος είναι η πολύ υψηλότερη περιεκτικότητά της σε λυσίνη και σε θειούχα αµινοξέα (κυστίνη και µεθειονίνη) (Bajaj,1994). Οι πρωτεΐνες του φύτρου παρουσιάζουν αξιόλογες λειτουργικές ιδιότητες, όπως είναι η καλή συγκράτηση του νερού και µπορούν για το λόγο αυτό να συµβάλλουν στην ικανοποιητική συγκράτηση του νερού όταν αξιοποιούνται στην παρασκευή ενός τροφίµου (Bauman & Mertz, 1972). Για παράδειγµα, η παρουσία τους στα προϊόντα κρέατος είναι δυνατό να βελτιώσει τα βασικά χαρακτηριστικά των προϊόντων αυτών αφού όσο µεγαλύτερη η συγκράτηση του νερού τόσο µεγαλύτερη είναι η τρυφερότητα των τελικών προϊόντων. Λόγω αυτής της ιδιότητας είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν στα τρόφιµα για να υποκαταστήσουν µέρος των ζωικών πρωτεϊνών (Bajaj, 1994). Παρουσιάζουν, επίσης, σχετικά καλή διαλυτότητα τόσο σε ουδέτερο όσο και σε όξινο περιβάλλον η οποία επηρεάζεται από τη θερµοκρασία και το χρόνο θέρµανσης (Bajaj, 1994, Wolff, 1975). Η διαλυτότητά τους επηρεάζει και λειτουργικές ιδιότητες όπως είναι η συγκράτηση νερού και η γαλακτωµατοποιητική και η αφριστική τους ικανότητα (Zayas & Lin, 1989a, 1989b, 1989c). 17

38 1.5. Παραλαβή ελαιοσωµάτων από ελαιούχες πρώτες ύλες µε υδατική εκχύλιση Για την παραλαβή των ελαιοσωµάτων από τα ελαιούχα υποστρώµατα έχουν µέχρι σήµερα εφαρµοστεί δύο µέθοδοι. Η πρώτη περιλαµβάνει τη χρήση νερού και εκχύλιση σε ουδέτερο ή αλκαλικό ph ενώ η δεύτερη την ταυτόχρονη χρήση ενζύµων µε στόχο την αύξηση της απόδοσης της µεθόδου εκχύλισης. Ανεξάρτητα από τον τρόπο παραλαβής των ελαιοσωµάτων που εφαρµόζεται, η υδατική εκχύλιση οδηγεί σε ένα σύστηµα διασποράς ελαιοσωµάτων στο νερό δηλαδή γαλακτώµατος ελαίου/νερού, στη συνεχή φάση του οποίου περιέχονται και πρωτεΐνες που προκύπτουν από τη διαλυτοποίηση των συστατικών των πρωτεϊνικών σωµατιδίων που συνυπάρχουν στο φύτρο µε τα ελαιοσώµατα (Campbell et al., 2011, Huang, 1992, Tzen et al., 1992). Οι Huang et al., (1992), ήταν οι πρώτοι που µελέτησαν εκτενώς τη µέθοδο παραλαβής ελαιοσωµάτων από διάφορες ελαιούχες πρώτες ύλες µε τη χρήση υδατικών διαλυµάτων µε αλκαλικό ph. Η οµάδα αυτή τροποποίησε αρκετές φορές την τεχνική της παραλαβής, ανάλογα µε τους στόχους της εκχύλισης. Επειδή ο βασικός στόχος της έρευνας ήταν η µελέτη της κυτταρικής δοµής των ελαιούχων πρώτων υλών και ο τρόπος έκφρασης των πρωτεϊνών, αγνοήθηκε τόσο η απόδοση της µεθόδου εκχύλισης όσο και η φυσικοχηµική σταθερότητα των γαλακτωµάτων που παραλήφθηκαν. Μάλιστα σε ορισµένες παρεµβάσεις χρησιµοποιήθηκαν και αντιδραστήρια µη ασφαλή για παραλαβή συστατικών που προορίζονται για χρήση στην παρασκευή τροφίµων. Τροποποίηση της παραπάνω µεθόδου, προτάθηκε σχετικά πρόσφατα από τους Kapchie et al., Η ίδια ερευνητική οµάδα εξέλιξε στη συνέχεια την τεχνική αυτή, µελετώντας διεξοδικότερα τις συνθήκες και τα χαρακτηριστικά του προϊόντος (Kapchie, Towa, Hauck & Murphy, 2010, Kapchie et al., 2008, Towa et al., 2010). Σύµφωνα µε τη µέθοδο αυτή, η υδατική εκχύλιση των ελαιοσωµάτων υποβοηθείται µε την προσθήκη πρωτεασών. Η χρήση πηκτινολυτικών και κυτταρολυτικών ενζύµων δεν απέδωσε (Kapchie et al., 2010). Τα ένζυµα συµβάλλουν στη διάσπαση της δοµής των κυτταρικών τοιχωµάτων, διευκολύνοντας έτσι την απελευθέρωση των ελαιοσωµάτων. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα που δηµοσιεύονται από την παραπάνω ερευνητική οµάδα, η µέγιστη απόδοση παραλαβής του ελαίου που επιτεύχθηκε ήταν κοντά στο 97 %. Το κυριότερο πρόβληµα που εµφανίζεται κατά την εφαρµογή της µεθόδου αυτής είναι ότι το υδατικό σύστηµα διασποράς που παραλαµβάνεται, περιέχει σε µεγάλη 18

39 συγκέντρωση, εκτός από τα ελαιοσώµατα, και τις πρωτεΐνες που συνεκχυλίζονται, αλλά και µικρά τεµάχια που προέρχονται από τη δράση των ενζύµων στα δοµικά στοιχεία της πρώτης ύλης και τα οποία είναι δύσκολο να αποµακρυνθούν µε τις πλύσεις που ακολουθούν. Επίσης, η χρήση των ενζύµων, επιβαρύνει αρκετά το κόστος της εκχύλισης ενώ µπορεί να προκληθεί και µία µερική υδρόλυση των πρωτεϊνών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων µε αποτέλεσµα να είναι πιθανή η αποσταθεροποίηση του γαλακτώµατος που οδηγεί στην εµφάνιση σταγονιδίων µεγαλύτερου µεγέθους. Πρόσφατα, έχει προταθεί µία καινούρια τεχνική παραλαβής ενός γαλακτώµατος ελαιοσωµάτων (Nikiforidis, Karkani & Kiosseoglou, 2011). Η τεχνική αυτή βασίζεται στη συµπύκνωση µε την εφαρµογή υπερδιήθησης του αρχικού αραιού (1% w/w) γαλακτώµατος των ελαιοσωµάτων που παραλαµβάνεται κατά την εκχύλιση του φύτρου αραβοσίτου, σε ένα γαλάκτωµα µε συγκέντρωση σε λίπος 5% w/w Τα γαλακτώµατα στα συστήµατα των τροφίµων- εµβάµµατα σαλάτας Πολλά τρόφιµα αποτελούν συστήµατα διασποράς, κυρίως ελαίου/νερού (Damodaran, 2005). Ανάλογα µε το µέγεθος των σταγονιδίων του ελαίου, τη φύση της επιφανειακής τους µεµβράνης (Charcosset, Limayem & Fessi, 2004) και τις αλληλεπιδράσεις που λαµβάνουν χώρα ανάµεσα στα σταγονίδια, τρόφιµα µε την ίδια σύσταση µπορεί να εµφανίζουν πολύ διαφορετικά ρεολογικά αλλά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (Dickinson, 2003). Για την σταθεροποίηση των γαλακτωµάτων των τροφίµων στη βιοµηχανία, χρησιµοποιούνται συχνά µίγµατα γαλακτωµατοποιητών µικρού µοριακού βάρους σε συνδυασµό µε πρωτεΐνες ή µε µίγµατα διαφορετικών πρωτεϊνών (Bos & van Vliet, 2001). Οι πρωτεΐνες στα µικτά συστήµατα είναι δυνατό να λειτουργούν ταυτόχρονα ως γαλακτωµατοποιητές και σταθεροποιητές (Murray, 2002) τα δε χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων στην περίπτωση αυτή είναι δυνατό να εξαρτώνται από την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών της συνεχούς φάσης µε αυτές της διεπιφάνειας και από την ανταγωνιστική προσρόφηση στη διεπιφάνεια που είναι δυνατό να λάβει χώρα, ανάµεσα στα µόρια της πρωτεΐνης και του τασενεργού, όσο και ανάµεσα στα πρωτεϊνικά συστατικά του µίγµατος (Courthaudon, Dickinson & Dalgleish, 1991, Dickinson, 1986, Dickinson, Hunt & Dalgleish, 1991). 19

40 Μία πολύ γνωστή κατηγορία γαλακτωµάτων τροφίµων αποτελούν τα εµβάµµατα σαλάτας (Sikora et al., 2008). Στην οµάδα αυτή των προϊόντων ανήκουν οι µαγιονέζες, οι κρέµες σαλάτας και οι σάλτσες καρυκεύµατος (Saha & Bhattacharya, 2010). Σύµφωνα µε την αρµόδια επιτροπή (ADS, Association of Dressings and Sauces), η κατανάλωση των προϊόντων αυτών στην Αµερική, απέφερε το 2000 έσοδα της τάξης των 3,8 δισεκατοµµυρίων ευρώ, ενώ το 2010 τα κέρδη ήταν 5,3 δισεκατοµµύρια ευρώ. Τα µεγέθη αυτά υποδηλώνουν µία ετήσια αύξηση της τάξης του 3,9%. Η περιεκτικότητα των εµβαµµάτων σαλάτας σε γαλακτωµατοποιηµένο έλαιο ποικίλλει, από 0,5% έως 85%, µε αποτέλεσµα τα ρεολογικά χαρακτηριστικά των διαφόρων τύπων των προϊόντων να διαφοροποιούνται σηµαντικά από προϊόν σε προϊόν (Saha et al., 2010). Για παράδειγµα, οι µαγιονέζες θα πρέπει να µην περιέχουν έλαιο κάτω από ένα όριο και µάλιστα πολλές βιοµηχανίες παρασκευάζουν µαγιονέζες µε περιεκτικότητα σε έλαιο 80% w/w ή και µεγαλύτερο (Saha et al., 2010). Σύµφωνα επίσης µε τη νοµοθεσία, η µαγιονέζα πρέπει να περιέχει οξικό οξύ σε συγκέντρωση ίση ή µεγαλύτερη του 2,5% w/w και κρόκο αυγού σε υγρή µορφή ή σκόνη (Depree & Savage, 2001). Ο κρόκος του αυγού, εκτός από τις γαλακτωµατοποιητικές του ιδιότητες, προσδίδει στα προϊόντα αυτά τη γνωστή χαρακτηριστική γεύση και το απαλό κίτρινο χρώµα. Για την παρασκευή των άλλων εµβαµµάτων σαλάτας εκτός της µαγιονέζας δεν υπάρχει νοµοθεσία που να ορίζει τη συγκέντρωση του ελαίου (Xiong, Xie & Edmondson, 2000). Λόγω µάλιστα της απαίτησης της αγοράς για προϊόντα µε λιγότερες θερµίδες, παράγονται µάλιστα και εµβάµµατα µε χαµηλή και µε µηδενική σε ορισµένες περιπτώσεις περιεκτικότητα σε έλαιο (Ford, 2004). Τα ρεολογικά χαρακτηριστικά των εµβαµµάτων ποικίλουν από προϊόν σε προϊόν, ανάλογα µε τις προτιµήσεις των καταναλωτών. Για ορισµένα προϊόντα απαιτείται από τους καταναλωτές να είναι σχετικά λεπτόρευστα, ενώ άλλα είναι περισσότερο αρεστά όταν εµφανίζουν υψηλό ιξώδες (Hill, Mitchell & Sherman, 1995, McClements, 2003, Shama & Sherman, 1966). Εκτός όµως από τη µεταβολή του ιξώδους που µπορεί να προκύψει ως αποτέλεσµα της ρύθµισης της συγκέντρωσης του ελαίου, ανάλογες επιθυµητές µεταβολές στα ρεολογικά χαρακτηριστικά των εµβαµµάτων µπορούν να προκύψουν και µε τη µεταβολή του ιξώδους της συνεχούς φάσης µέσω της προσθήκης πολυσακχαριτών (da Fonseca et al., 2009). Η επίδραση των πολυσακχαριτών στο ιξώδες ενός γαλακτώµατος, τα µόρια των οποίων δεν προσροφούνται άµεσα στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου όπως αυτά των πρωτεϊνών, 20

41 είναι δυνατό να προκύψει και µέσω της ενίσχυσης των αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα σταγονίδια λόγω της εµφάνισης φαινοµένων οσµωτικής συσσωµάτωσης (Drakos & Kiosseoglou, 2008) Φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων Τα γαλακτώµατα είναι από φυσικοχηµική άποψη ασταθή συστήµατα και η κινητική σταθερότητά τους για ένα ορισµένο χρονικό διάστηµα είναι δυνατό να επιτευχθεί µε την προσθήκη σταθεροποιητών που µπορεί να είναι γαλακτωµατοποιητές ή/και παχυρευστοποιητές (Damodaran, 2005). Οι γαλακτωµατοποιητές, είναι τασενεργές ουσίες (ενώσεις που περιέχουν πολικές και µη πολικές περιοχές) που προσροφούνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων, προκαλούν µείωση της ελεύθερης ενέργειας και σχηµατίζουν προστατευτική µεµβράνη µε αποτέλεσµα τη σταθεροποίηση του γαλακτώµατος (Bergenstahl & Alander, 1997). Οι παχυρευστοποιητές είναι συστατικά που ενισχύουν τη σταθερότητα του γαλακτώµατος αυξάνοντας το ιξώδες της συνεχούς φάσης µε αποτέλεσµα να παρεµποδίζεται η κίνηση των σταγονιδίων (Leal-Calderon, Thivilliers & Schmitt, 2007). Οι πιο κοινοί γαλακτωµατοποιητές είναι οι πρωτεΐνες, φυτικής ή ζωικής προέλευσης, όπως αυτές των οσπρίων, του κρόκου του αυγού, του γάλακτος κ.α. (Dalgleish, 1997), ενώ ως παχυρευστοποιητές χρησιµοποιούνται κυρίως πολυσακχαρίτες όπως η ξανθάνη, το κόµµι guar, οι καραγεννάνες, οι πηκτίνες κ.α. (Benichou, Aserin & Garti, 2002). Αντίθετα, σε γαλακτώµατα νερού σε έλαιο είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ως γαλακτωµατοποιητές τα µόνο- και διγλυκερίδια και τα φωσφολιπίδια, όπως η λεκιθίνη (Kokini & van Aken, 2006, van Nieuwenhuyzen & Szuhaj, 1998). Τα γαλακτώµατα µπορεί να αποτελούν ως έχουν, τελικά προϊόντα. Τα ποτά µε κρέµα (cream liqueurs) (Heffernan, Kelly & Mulvihill, 2009, Muir, 1989) και οι κρέµες για καφέ (coffee creamers) (Golde & Schmidt, 2005, Singh, 2011) αποτελούν σχετικά απλά συστήµατα όπου η µόνη απαίτηση από τους καταναλωτές είναι να παραµένουν σταθερά κατά την αποθήκευσή τους µέχρι την κατανάλωση. Αντίθετα, ορισµένα γαλακτώµατα µπορεί να χρησιµοποιηθούν ως συστατικά για την ανάπτυξη συγκεκριµένης δοµής σε ορισµένα σύνθετα προϊόντα, όπως η γιαούρτη όπου τα σταγονίδια αλληλεπιδρούν µε άλλα συστατικά χωρίς το γαλάκτωµα να αποσταθεροποιείται κατά τη διαδικασία (Krzeminski, Grosshable & Hinrichs, 2011). Τέλος, τα σταγονίδια ενός γαλακτώµατος µπορεί να συµβάλλουν µε την παρουσία τους 21

42 στην ανάπτυξη νέων δοµών όπως αυτή του παγωτού, όπου το γαλάκτωµα αποσταθεροποιείται για να σχηµατιστεί η νέα δοµή του προϊόντος (Dalgleish, 2006) Ο ρόλος των πρωτεϊνών στα γαλακτώµατα Οι πρωτεΐνες, όπως έχει αναφερθεί, είναι οι πλέον διαδεδοµένοι γαλακτωµατοποιητές των τροφίµων διότι συµβάλλουν τόσο στο σχηµατισµό όσο και στη σταθεροποίηση των γαλακτωµάτων. Κατά το σχηµατισµό του γαλακτώµατος τα µόρια των πρωτεϊνών τοποθετούνται στη διεπιφάνεια ανάµεσα στη λιπαρή και την υδατική φάση (Dickinson, 1998). Τα προσροφηµένα µόρια στη συνέχεια ξεδιπλώνονται και αλληλεπιδρούν µεταξύ τους µε δεσµούς υδρογόνου, δεσµούς van der Waals, καθώς και µέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό µιας µεµβράνης µε ιξωδοελαστικά χαρακτηριστικά (Morris & Wilde, 1997). Στη µεµβράνη αυτή, µόνο ένα κλάσµα των τµηµάτων του προσροφηµένου πρωτεϊνικού µορίου βρίσκεται σε άµεση επαφή µε τη διεπιφάνεια, ενώ τα υπόλοιπα τµήµατα του µορίου εκτείνονται προς την υδατική φάση του συστήµατος, και η σταθερότητα του γαλακτώµατος εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό και από τη µηχανική αντοχή της µεµβράνης (Dickinson, 1992). Η φυσική δοµή του µορίου της πρωτεΐνης επηρεάζει και τον τρόπο της προσρόφησής του στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού. Οι µικρού µεγέθους γαλακτωµατοποιητές προσανατολίζονται µε τέτοιο τρόπο ώστε το υδρόφιλο τµήµα των µορίων να προεκτείνεται προς στην υδατική φάση και το υδρόφοβο προς τη φάση του ελαίου (Brash, 1996). Η διάταξη στη διεπιφάνεια ελαίουνερού µιας πρωτεΐνης µε ευέλικτη δοµή, όπως είναι η β-καζεϊνη, περιλαµβάνει τους συρµούς, που αποτελούν το τµήµα του µορίου το οποίο είναι σε επαφή µε τη διεπιφάνεια, καθώς και τους βρόγχους και τα ελεύθερα άκρα που εκτείνονται προς την υδατική φάση (Wong, Camirand, & Pavlath, 1996). Όσον αφορά τις σφαιροπρωτεΐνες, τα µόριά τους προσανατολίζονται µε τέτοιο τρόπο ώστε η επιφάνεια επαφής του υδρόφοβου τµήµατος της πρωτεΐνης µε τη διεπιφάνεια να είναι η µεγαλύτερη δυνατή (Damodaran, 2004). Οι σφαιροπρωτεΐνες, όπως η β- λακτογλοβουλίνη, χρησιµοποιούνται συχνά ως γαλακτωµατοποιητές λόγω της ικανότητάς τους να συµβάλλουν στην παρασκευή γαλακτωµάτων ελαίου σε νερό και να βελτιώνουν τη σταθερότητά τους (Dickinson, 1999, Fillery-Travis, Mills & Wilde, 2000). Οι πρωτεΐνες αυτές, λόγω του µικρού µεγέθους τους προσροφούνται ταχύτατα στην επιφάνεια του σταγονιδίου 22

43 µειώνοντας αρχικά τη διεπιφανειακή τάση ενώ στη συνέχεια αλληλεπιδρούν µεταξύ τους και σχηµατίζουν ένα πρωτεϊνικό φιλµ το οποίο αποτρέπει τη συσσωµάτωση και τη συγχώνευση των σταγονιδίων (Dickinson, 1999, Melzak et al., 2011). Τα µόρια των σφαιροπρωτεϊνών µετά από την προσρόφησή τους στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου έχουν την τάση να υφίστανται αλλαγές στη διαµόρφωση τους µε αποτέλεσµα να µειώνεται η σταθερότητα του γαλακτώµατος (Erni, 2011). Σε ένα υδατικό διάλυµα όλη η επιφάνεια του µορίου µιας σφαιροπρωτεΐνης που δεν προσροφάται, έρχεται αναγκαστικά σε επαφή µε τα µόρια του νερού. Στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού ενός γαλακτώµατος όµως, ένα µέρος της προσροφηµένης πρωτεΐνης έρχεται σε επαφή µε το νερό και το υπόλοιπο µε το έλαιο (Damodaran, 2005). Αυτή η διαφοροποίηση είναι ικανή να προκαλέσει τη µετουσίωση στην επιφάνεια των σταγονιδίων (Kim, Decker, & McClements, 2002). Λίγες ώρες µετά από την παρασκευή του γαλακτώµατος τα µόρια της πρωτεΐνης υφίστανται αλλαγές στη δοµή της ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι µη επιθυµητές µοριακές αλληλεπιδράσεις και να προκύψει ένα σταθερό γαλάκτωµα. Η προσρόφηση πρωτεϊνών µε ευέλικτη δοµή ευνοείται έναντι αυτής των σφαιροπρωτεϊνών. Στην περίπτωση του αυγού, οι πρωτεΐνες του λευκώµατος και οι λιβετίνες του κρόκου, λόγω της σχετικά συµπαγούς δοµής τους, δεν προσροφούνται τόσο αποτελεσµατικά όσο οι λιποπρωτεΐνες του κρόκου (Dickinson et al., 1991, Kiosseoglou, 2003). Επίσης, η β- λακτογλοβουλίνη εκτοπίζεται ανταγωνιστικά από τις λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας (LDL), λόγω της µεγαλύτερης ικανότητας διείσδυσης των λιποπρωτεϊνικών µορίων στην επιφάνεια των σταγονιδίων (Kiosseoglou, 2004, Le Denmat, Anton & Beaumal, 2000). Η ελαιοσίνη, πρωτεΐνη των ελαιοσωµάτων, που έχει περίπου το ίδιο µέγεθος µε την β- λακτογλοβουλίνη αλλά έχει ένα µεγαλύτερο υδρόφοβο τµήµα χρειάζεται λιγότερο χρόνο για να σταθεροποιήσει µία διεπιφάνεια, επιτυγχάνοντας πολύ χαµηλότερες τιµές επιφανειακής τάσης (Deleu, et al., 2010). Οι πρωτεΐνες, εκτός από την ικανότητά τους να συµβάλλουν στο σχηµατισµό και τη σταθεροποίηση ενός γαλακτώµατος, σε ορισµένες περιπτώσεις είναι δυνατό να οδηγήσουν και σε αποσταθεροποίησή του προκαλώντας συσσωµάτωση των σταγονιδίων (Dickinson, 2003). Για παράδειγµα, όταν προσροφηθεί η απαιτούµενη ποσότητα καζεΐνης στην επιφάνεια των σταγονιδίων, η περίσσεια της µη- προσροφηµένης πρωτεΐνης που βρίσκεται στην υδατική φάση µπορεί να προκαλέσει συσσωµάτωση των σταγονιδίων του γαλακτώµατος λόγω όσµωσης και αποσταθεροποίηση του γαλακτώµατος (Chen, Moschakis & Pugnaloni, 2006, Raikos, 2010). 23

44 Επίσης, η παρουσία στη συνεχή φάση ενός γαλακτώµατος των µη προσροφηµένων κόκκων (granules) του κρόκου του αυγού είναι δυνατό να προκαλέσει την αποσταθεροποίηση του γαλακτώµατος λόγω της συσσωµάτωσης των σταγονιδίων του ελαίου µέσω οσµωτικών φαινοµένων (Kiosseoglou, 2003) Ο ρόλος των πολυσακχαριτών στα γαλακτώµατα Οι πολυσακχαρίτες όπως και οι πρωτεΐνες συµβάλλουν στην ανάπτυξη της δοµής και, κατ επέκταση, στον καθορισµό των µηχανικών, φυσικοχηµικών και οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τροφίµων. Λειτουργούν ως παχυρευστοποιητές, σταθεροποιητές, πηκτωµατοποιητές, γαλακτωµατοποιητές, κατακρατητές υγρασίας κ.ά. (Tolstoguzov, 1991). Οι ιδιότητες αλλά και η αλληλεπίδραση ενός πολυσακχαρίτη µε τα άλλα συστατικά του συστήµατος, συνδέονται άµεσα µε τη µοριακή δοµή του (Moschakis, Murray & Dickinson, 2005). Η λειτουργική συµπεριφορά ενός πολυσακχαρίτη σε ένα γαλάκτωµα ποικίλει ανάλογα µε τη σύσταση και τη δοµή του µορίου του (Janes, Calvo, & Alonso, 2001). Μικρός αριθµός πολυσακχαριτών που απαντούν στη φύση, όπως το αραβικό κόµµι, που φέρει στο µόριό του ένα µικρό πρωτεϊνικό τµήµα, ή ορισµένα χηµικώς τροποποιηµένα άµυλα που φέρουν στο µόριό τους µη πολικές οµάδες, µπορούν να δράσουν ως γαλακτωµατοποιητές και να προσροφηθούν στην επιφάνεια των σταγονιδίων ενός γαλακτώµατος (Dickinson, 2006, Dickinson, 2009, Nakauma et al., 2008, Yadav et al., 2007). Οι περισσότεροι πολυσακχαρίτες, όµως, είναι κατά βάση υδρόφιλες ουσίες και εποµένως δεν εµφανίζουν καµία επιφανειοδραστικότητα. Οι πρωτεΐνες και οι πολυσακχαρίτες πολλές φορές συνυπάρχουν στα γαλακτώµατα των τροφίµων (Akhtar & Dickinson, 2007, Benichou, Aserin & Garti, 2007, O'Regan & Mulvihill, 2010). Ανάλογα µε τη φύση και τη συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη, η παρουσία του είναι δυνατό να επηρεάσει µε διαφορετικό τρόπο τη σταθερότητα αλλά και τις ρεολογικές ιδιότητες των γαλακτωµάτων (Dickinson, 1996, Dickinson & Euston, 1992). Χαµηλές συγκεντρώσεις πολυσακχαριτών στα συστήµατα των γαλακτωµάτων οδηγούν συνήθως σε οσµωτική συσσωµάτωση και σε αποσταθεροποίησή τους (Dickinson, 2003). Συνήθως, όµως, οι πολυσακχαρίτες προστίθενται στα γαλακτώµατα σε σχετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις µε στόχο την αύξηση του ιξώδους της συνεχούς φάσης και τη δηµιουργία τρισδιάστατου δικτυώµατος στο οποίο εγκλωβίζονται τα σταγονίδια του ελαίου, µε αποτέλεσµα να 24

45 παρεµποδίζεται η κίνησή τους και να ενισχύεται µε τον τρόπο αυτό η σταθερότητα των γαλακτωµάτων έναντι της αποκορύφωσης (Moschakis et al., 2005, Robins, 1991). Χαρακτηριστικό παράδειγµα πολυσακχαρίτη µε ευρεία χρήση ως σταθεροποιητής τροφίµων αποτελεί η ξανθάνη (Becker et al., 1998). Η ξανθάνη είναι ένας ανιοντικός πολυσακχαρίτης που παράγεται βιοτεχνολογικά από τον αερόβιο µικροοργανισµό Xanthomonas campestris. Η προσθήκη ξανθάνης στα γαλακτώµατα σε χαµηλή σχετικά συγκέντρωση αυξάνει την ταχύτητα αποκορύφωσης, γεγονός που οφείλεται σε συσσωµάτωση των σταγονιδίων λόγω οσµωτικών φαινοµένων (Cao, Dickinson & Wedlock, 1990). Συχνότερα όµως, η ξανθάνη χρησιµοποιείται σε µεγαλύτερη σχετικά συγκέντρωση για τη σταθεροποίηση εµβαµµάτων σαλάτας και τη βελτίωση των ρεολογικών τους ιδιοτήτων (Kiosseoglou, 2004, Parker et al., 1995) Ανταγωνιστική προσρόφηση µεταξύ πρωτεϊνών και τασενεργών µικρού µοριακού βάρους σε διεπιφάνειες ελαίου-νερού. Στα συστήµατα πολλών τροφίµων που έχουν τη µορφή γαλακτώµατος, τα µόρια µιας πρωτεΐνης συχνά ανταγωνίζονται µε τα µόρια άλλων επιφανειοδραστικών συστατικών που συνυπάρχουν στο σύστηµα, όπως άλλες πρωτεΐνες ή χαµηλού µοριακού βάρους γαλακτωµατοποιητές, για την κατάληψη χώρου στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού (Dickinson, 2011). Σε γενικές γραµµές, η προσρόφηση µιας πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια ευνοείται, από θερµοδυναµική άποψη, έναντι αυτής µιας άλλης όταν εµφανίζει µεγαλύτερη ικανότητα να ελαττώνει την τιµή της διεπιφανειακής τάσης. Για το λόγο αυτό η προσρόφηση πρωτεϊνών µε ευέλικτη δοµή, όπως η β-καζεΐνη, ευνοείται έναντι αυτής των σφαιροπρωτεϊνών (Dickinson, 2001). Τα µόρια των σφαιροπρωτεϊνών όµως, όταν προσροφούνται πρώτα στη διεπιφάνεια, εκτοπίζονται πολύ δύσκολα από άλλες πρωτεΐνες, ιδιαίτερα όταν έχει παρέλθει επαρκώς µεγάλο χρονικό διάστηµα ώστε να ολοκληρωθεί πλήρως η προσρόφησή τους (Dickinson & Gelin, 1992). Μάλιστα µε την πάροδο του χρόνου είναι δυνατή η δηµιουργία µιας δοµής πλέγµατος λόγω αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα προσροφηµένα στη διεπιφάνεια µόρια των πρωτεϊνών, στην οποία µπορεί να συµβάλλουν και δισουλφιδικοί δεσµοί, όπως ακριβώς συµβαίνει κατά τη δηµιουργία µίας πηκτής (McClements, Monahan & Kinsella, 1993). Όταν η µερική προσρόφηση 25

46 πρωτεϊνών µε ευέλικτη δοµή µορίου, όπως η β-καζεΐνη, έχει ως αποτέλεσµα την εκτόπιση ενός αριθµού µορίων µιας ήδη προσροφηµένης σφαιροπρωτεΐνης, τα µόρια αυτά είναι δυνατό να παραµείνουν στην επιφάνεια του σταγονιδίου του ελαίου σε µία εξωτερική στοιβάδα προσρόφησης (Courthaudon et al., 1991, Dickinson, 1999, Dickinson, et al., 1991). Στα τρόφιµα, εκτός από τις πρωτεΐνες, χρησιµοποιούνται και µικρού µοριακού βάρους τασενεργά, τα οποία αναφέρονται συχνά στη βιβλιογραφία ως γαλακτωµατοποιητές (Bos, et al., 2001). Οι γαλακτωµατοποιητές διακρίνονται σε αυτούς που διευκολύνουν το σχηµατισµό του γαλακτώµατος και συµβάλλουν στη σταθερότητά του, σε αυτούς που τροποποιούν τη δοµή και τις ρεολογικές ιδιότητες των τροφίµων µέσω αλληλεπιδράσεων µε πολυσακχαρίτες ή µε πρωτεΐνες, και σε αυτούς που αλλάζουν τη µορφολογία των κρυστάλλων των λιπιδίων µετά από αλληλεπίδραση µε τις τριακυλογλυκερόλες (Kralova & Sjoblom, 2010). Τα µόρια των τασενεργών διευθετούνται σε µία διεπιφάνεια πολύ κοντά το ένα µε το άλλο παρέχοντας αποτελεσµατική κάλυψη της διεπιφάνειας (Emborsky, Cox & Chapman, 2011). Σε υψηλές συγκεντρώσεις, µπορούν να εκτοπίσουν µερικώς ή πλήρως τα µόρια πρωτεϊνών που βρίσκονται ήδη προσροφηµένα στη διεπιφάνεια (Dickinson, et al., 1991, Dickinson & Tanai, 1992). Στο Σχήµα 1.10, παριστάνεται ο τρόπος µε τον οποίο προσροφούνται σε µία διεπιφάνεια ελαίουνερού τα µόρια ενός χαµηλού µοριακού βάρους τασενεργού, µιας πρωτεΐνης µε ευέλικτη δοµή, και µιας σφαιροπρωτεΐνης. Σχήµα Τρόπος προσρόφησης διαφόρων τύπων επιφανειακώς ενεργών µορίων σε µία διεπιφάνεια ελαίου-νερού. Κατά σειρά από τα αριστερά προς τα δεξιά: τασενεργό, πρωτεΐνη µε ευέλικτη δοµή, και σφαιροπρωτεΐνη. Οι γαλακτωµατοποιητές φέρουν στο µόριό τους λιπόφιλες και υδρόφιλες οµάδες. Το υδρόφοβο (λιπόφιλο) τµήµα αποτελείται συνήθως από µία ή δύο αλειφατικές αλυσίδες που 26

47 µπορεί να είναι κορεσµένες ή όχι, ενώ το υδρόφιλο τµήµα παρουσιάζει µεγαλύτερη ποικιλία. Ανάλογα µε τη φύση της υδρόφιλης οµάδας, τα µικρού µοριακού βάρους τασενεργά διακρίνονται σε µη ιοντικά (π.χ Tween 40), σε ανιοντικά, και σε κατιοντικά. Ένας δεύτερος διαχωρισµός γίνεται µεταξύ φυσικών (µονοακυλογλυκερόλες, φωσφολιπίδια) και συνθετικών τασενεργών. Όταν η συγκέντρωση του τασενεργού σε ένα γαλάκτωµα ξεπεράσει µία ορισµένη κρίσιµη συγκέντρωση, εκτός των µονοµερών, σχηµατίζονται και µικκύλια (Zana, 2002). Η συγκέντρωση αυτή είναι γνωστή ως κρίσιµη συγκέντρωση σχηµατισµού µικκυλίου, CMC (critical micelle concentration). Σε συγκέντρωση µικρότερη της CMC, τα τασενεργά απαντούν στο γαλάκτωµα αποκλειστικά ως µονοµερή. Όση όµως ποσότητα τασενεργού προστεθεί πέραν της CMC, η συγκέντρωση των µονοµερών παραµένει ίδια, ενώ η δραστικότητά τους µεταβάλλεται ελάχιστα. Στο σηµείο αυτό δηλαδή η τιµή της επιφανειακής τάσης είναι ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του τασενεργού (Eastoe & Dalton, 2000). Η συγκέντρωση στην οποία σχηµατίζονται τα µικκύλια εξαρτάται από το µήκος της αλυσίδας του τασενεργού µορίου. Τα τασενεργά µικρού µοριακού βάρους έχουν µεγάλη ικανότητα σχηµατισµού δεσµών σε διεπιφάνειες υγρού/υγρού, όχι µόνο µεταξύ τους, αλλά και µε άλλα συστατικά, όπως ιόντα, πολυµερή ή µόρια άλλων τασενεργών. Την Επιστήµη των Τροφίµων, ενδιαφέρουν ιδιαίτερα οι αλληλεπιδράσεις των τασενεργών µε τις πρωτεΐνες σε διεπιφάνειες (Bos et al., 2001). Τα χαρακτηριστικά που καθιστούν µία πρωτεΐνη επιφανειακώς δραστική, δηλαδή η παρουσία στο µόριο υδρόφοβων και υδρόφιλων τµηµάτων, είναι υπεύθυνα και για την εµφάνιση αλληλεπιδράσεων µε µικροµοριακά συστατικά. Εκτός της ικανότητας που έχουν τα τασενεργά να σχηµατίζουν δεσµούς µε τις πρωτεΐνες, λόγω του µικρού µεγέθους τους και της επιφανειοδραστικότητας τους, µπορούν να αποµακρύνουν από τις διεπιφάνειες τα µόρια της πρωτεΐνης και να προσροφηθούν αυτά στη θέση τους, µε αποτέλεσµα να προκύπτουν χαµηλότερες τιµές επιφανειακής τάσης Η ανταγωνιστική αυτή προσρόφηση εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τη φύση των αλληλεπιδράσεων του τασενεργού µε τη πρωτεΐνη, τόσο στην υδατική φάση, όσο και στη διεπιφάνεια µε το έλαιο (Mackie, 2004). Σύµφωνα τους Defeijter και συνεργάτες (1987), σε σύστηµα που περιείχε µίγµα SDS (δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο) και β- καζεΐνη, διαπιστώθηκε ότι η επιφανειακή τάση παρέµεινε αµετάβλητη σε υψηλές συγκεντρώσεις του τασενεργού µε τιµές παρόµοιες µε αυτές, όταν στο σύστηµα υπήρχε µόνο SDS. Αυτό αποτελεί ένδειξη ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις, το SDS εκτόπισε πλήρως τα µόρια της β- καζεΐνης από την διεπιφάνεια. Σε χαµηλότερες συγκεντρώσεις του τασενεργού το σύστηµα ήταν 27

48 περισσότερο πολύπλοκο εφόσον, σύµφωνα µε τους ερευνητές, το διεπιφανειακό υµένιο περιείχε και µόρια της πρωτεΐνης σε αλληλεπίδραση µε τα µόρια του SDS (Mackie et al., 1999). Όταν στο σύστηµα υπάρχει ένα µη ιοντικό τασενεργό, όπως το Tween 40, το διάγραµµα της µεταβολής της επιφανειακής τάσης σε σχέση µε την συγκέντρωση του τασενεργού, παρουσιάζεται διαφοροποιηµένο (Miller et al., 2000). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα προϊόντα της αλληλεπίδρασης ανάµεσα στο τασενεργό και την πρωτεΐνη δεν είναι ιδιαίτερα επιφανειακώς ενεργά, γιατί το µη ιοντικό τασενεργό τείνει να αλληλεπιδρά µε το υδρόφοβο τµήµα της πρωτεΐνης (Dickinson et al., 1989). Η αλληλεπίδραση αυτή είναι δυνατόν να επηρεάσει και τη διαλυτότητα των πρωτεϊνών στην υδατική φάση, όταν αυτές εκτοπίζονται, όπως έχει αναφερθεί και από άλλους ερευνητές (Σχήµα 1.11) (Pugnaloni et al., 2004). Σχήµα Αλληλεπίδραση µη ιοντικών τασενεργών µορίων µε τα υδρόφοβα τµήµατα του µορίου µιας πρωτεΐνης (Pugnaloni et al., 2004). 28

49 Σχήµα Φωτογραφίες από ειδικό µικροσκόπιο µικτού προσροφηµένου υµενίου β-καζεΐνης/ Tween 40 σε επιφάνεια αέρα-νερού σε διάφορες τιµές επιφανειακής πίεσης (Mackie et al., 2001). Οι Mackie et al. (2001), µελέτησαν την αλληλεπίδραση του Tween 40 µε την β-καζεΐνη σε µία διεπιφάνεια αέρα-νερού. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 1.12, όταν η τιµή της επιφανειακής πίεσης που ασκείται είναι σχετικά χαµηλή, το διεπιφανειακό υµένιο αποτελείται κυρίως από πρωτεΐνη (a). Στο αρχικό αυτό στάδιο, η πρωτεΐνη καταλαµβάνει το 97,4% της επιφάνειας, ενώ παράλληλα εµφανίζονται στο πρωτεϊνικό υµένιο ορισµένα κενά (µαύρα στίγµατα), τα οποία αντιστοιχούν στις περιοχές στις οποίες απαντά το Tween 40. Όταν στη συνέχεια συµπιεσθεί το υµένιο (b), παρατηρείται ότι το ποσοστό της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια µειώνεται, λόγω της ανταγωνιστικής προσρόφησης του Tween 40, και τα κενά αυτά µεγαλώνουν. Το φαινόµενο αυτό συνεχίζεται όταν συµπιέζεται και άλλο το υµένιο, µε αποτέλεσµα η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια να γίνει ακόµα µικρότερη (c, d). Ανάλογα πειράµατα έγιναν µε άλλα συστήµατα πρωτεϊνών/τασενεργών και παρατηρήθηκε περίπου παρόµοια συµπεριφορά. Όπως προκύπτει σε γενικές γραµµές, τα µόρια των τασενεργών δεν αποµακρύνουν πλήρως τα µόρια των πρωτεϊνών από τη διεπιφάνεια κατά την ανταγωνιστική προσρόφηση, αλλά καταλαµβάνουν ορισµένες περιοχές της, ενώ οι πρωτεΐνες περιορίζονται στις υπόλοιπες. 29

50 Η έκταση της ανταγωνιστικής εκτόπισης των πρωτεϊνικών µορίων από αυτά των µικρού µοριακού βάρους τασενεργών εξαρτάται από τη φύση της πρωτεΐνης και πιο συγκεκριµένα από το λόγο υδρόφιλου/υδρόφοβου χαρακτήρα της και την ευελιξία του µορίου. Για παράδειγµα, κατά την προσθήκη Tween 40 σε γαλακτώµατα που σταθεροποιούνται µε υγρό κρόκο αυγού, η προσροφηµένη στην επιφανειακή µεµβράνη πρωτεΐνη του κρόκου αποµακρύνεται µόνο σε ποσοστό περίπου 20%. Πιθανότατα, τα πρωτεϊνικά µόρια που αποµακρύνονται είναι µόνον αυτά που είναι χαλαρά συνδεδεµένα µε την επιφάνεια του σταγονιδίου, ενώ τα υπόλοιπα αντιστέκονται στην εκτόπισή τους από τα µόρια του τασενεργού προφανώς λόγω της πολύ µεγάλης συνάφειάς τους µε τα συστατικά της διεπιφανειακής µεµβράνης (Nikiforidis & Kiosseoglou, 2007) Ρεολογικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων Ρεολογία είναι η επιστήµη που ασχολείται µε την επίδραση που έχει η εφαρµογή δυνάµεων στην παραµόρφωση και τη ροή των υλικών (McClements, 2003). Το µέγεθος των µεταβολών αυτών εξαρτάται από τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά του υλικού και µπορεί να δώσει σηµαντικά στοιχεία για τις ιδιότητές του (Mitchell, 1980). Η σταθερότητα πολλών γαλακτωµάτων, εξαρτάται από τα ρεολογικά χαρακτηριστικά των φάσεων που το αποτελούν. Για παράδειγµα, η αποκορύφωση ενός γαλακτώµατος επηρεάζεται και από το ιξώδες της συνεχούς φάσης (Pal, 2011). Τα αποτελέσµατα των ρεολογικών µετρήσεων χρησιµοποιούνται για να εξηγηθούν οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των συστατικών ενός γαλακτώµατος. Τα γαλακτώµατα είναι αρκετά πολύπλοκα τρόφιµα µε ρεολογικά χαρακτηριστικά που ποικίλουν, από αυτά των χαµηλού ιξώδους υγρών, όπως είναι το γάλα, έως αυτά των στερεών που εµφανίζουν πλαστική συµπεριφορά, όπως τα αλλαντικά µε υψηλό συντελεστή ελαστικότητας. Η δυνατότητα του ελέγχου των ρεολογικών χαρακτηριστικών ενός προϊόντος, εξαρτάται από την ποσοτική κατανόηση της σχέσης µεταξύ των ρεολογικών χαρακτηριστικών, της σύστασης και της µικροδοµής του. Σε γενικές γραµµές, το φαινοµενικό ιξώδες ενός γαλακτώµατος, µπορεί να περιγραφεί µε την εξής εξίσωση (McClements, 2004): 30

51 η = f(η 1, η 2,, r, w(h), τ) (2) όπου η 1 είναι το ιξώδες της συνεχούς φάσης, η 2 το ιξώδες της φάσης σε διασπορά, ο λόγος του όγκου της φάσης σε διασπορά, r η ακτίνα των σταγονιδίων, w(h) το δυναµικό του ζεύγους των σταγονιδίων και τ η εφαρµοζόµενη τάση διάτµησης. Η εξίσωση αυτή χρησιµοποιείται για να εξηγήσει τα ρεολογικά χαρακτηριστικά ενός γαλακτώµατος, σε σχέση µε παραµέτρους του συστήµατος, όπως για παράδειγµα η συγκέντρωση των σταγονιδίων, οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των σταγονιδίων και τα ρεολογικά χαρακτηριστικά της συνεχούς φάσης. Για την ακριβή έκφραση της σχέσης των ρεολογικών χαρακτηριστικών ενός κολλοειδούς και της σύστασης και της δοµής του, χρησιµοποιείται η εξίσωση του Einstein, που εκφράζει την µεταβολή του ιξώδους του γαλακτώµατος, σε σχέση µε το ιξώδες της συνεχούς φάσης και τη συγκέντρωση των σταγονιδίων, εφόσον αυτά είναι σφαιρικά: η= η 1 (1 + 2,5 ) (3) Σύµφωνα µε την εξίσωση αυτή, µία αύξηση της συγκέντρωσης των σταγονιδίων οδηγεί σε αύξηση του ιξώδους. Στην εξίσωση του Einstein µπορούν να προστεθούν και άλλες παράµετροι, ώστε να ληφθούν υπόψη οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των σταγονιδίων, η συγχώνευσή τους και η µη νευτώνεια συµπεριφορά της συνεχούς φάσης. Στο Σχήµα 1.13, παρουσιάζεται η µεταβολή του ιξώδους ενός γαλακτώµατος σε σχέση µε την αύξηση της συγκέντρωσης των σταγονιδίων και τη συσσωµάτωσή τους. Όταν δεν λαµβάνει χώρα συσσωµάτωση, η τιµή του συντελεστή ιξώδους αυξάνεται µέχρι µία ορισµένη τιµή συγκέντρωσης σταγονιδίων, όπου τα σταγονίδια βρίσκονται πολύ κοντά το ένα µε το άλλο. Η συγκέντρωση αυτή ονοµάζεται κρίσιµη συγκέντρωση σταγονιδίων (Φc) (Σχήµα 1.13). Τα γαλακτώµατα που έχουν συγκέντρωση σε έλαιο µεγαλύτερη από την κρίσιµη συγκέντρωση, τείνουν να παρουσιάζουν ιξωδοελαστική ρεολογική συµπεριφορά, όπως για παράδειγµα η µαγιονέζα. Στα γαλακτώµατα στα οποία έχει λάβει χώρα συσσωµάτωση, αυτή η απότοµη αύξηση του ιξώδους εµφανίζεται σε µικρότερες τιµές συγκέντρωσης σταγονιδίων, λόγω της δηµιουργίας ενός δικτυώµατος. Στην περίπτωση αυτή το ιξώδες των γαλακτωµάτων είναι πιο υψηλό, λόγω της µεγαλύτερης επίδρασης του κλάσµατος του όγκου της εν διασπορά φάσης. 31

52 40 30 Συσσωμάτωση Ιξώδες φ c Χωρίς Συσσωμάτωση 0 0,2 0,4 0,6 φ Σχήµα Μεταβολή του ιξώδους του γαλακτώµατος σε σχέση µε το κλάσµα της εν διασπορά φάσης (McClements, 2003). Ιξώδες Νευτώνια Ψευδοπλαστικά Ρυθμός διάτμησης Σχήµα Μεταβολή του φαινοµενικού ιξώδους γαλακτώµατος σε σχέση µε το ρυθµό διάτµησης κατά τη διάσπαση των συσσωµατωµάτων των σταγονιδίων. Όπως αναφέρθηκε και προηγουµένως, ένα γαλάκτωµα µε συσσωµατωµένα σταγονίδια παρουσιάζει υψηλότερη τιµή συντελεστή ιξώδους από ένα γαλάκτωµα που περιέχει τον ίδιο 32

53 αριθµό σταγονιδίων αλλά σε µεµονωµένη µορφή. Αυτό παρατηρείται διότι στα συσσωµατώµατα εγκλωβίζεται ορισµένη ποσότητα συνεχούς φάσης που έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση του λειτουργικού κλάσµατος όγκου. Το ίδιο φαινόµενο παρατηρείται και σε συσσωµατώµατα που παρουσιάζουν ανοιχτή δοµή (υψηλό ιξώδες) σε αντίθεση µε αυτά µε πιο κλειστή δοµή (χαµηλό ιξώδες) (Σχήµα 1.14). Στα γαλακτώµατα αυτά το ιξώδες µειώνεται µε την αύξηση του ρυθµού διάτµησης, κυρίως λόγω της καταστροφής των εσωτερικών δυνάµεων που συγκρατούν τα σταγονίδια και της διάσπασης των συσσωµατωµάτων (Dhaene & Mewis, 1994). Σχήµα Γραµµική ιξωδοελαστική περιοχή πηκτών (α) και διάγραµµα στο οποίο φαίνεται η έναρξη σχηµατισµού πηκτής κατά τη θέρµανση (β). 33

54 Στην περίπτωση όπου οι αλληλεπιδράσεις των σταγονιδίων των γαλακτωµάτων µε τις πρωτεΐνες της συνεχούς φάσης είναι αρκετά ισχυρές, είναι δυνατόν, το γαλάκτωµα να παρουσιάζει χαρακτηριστικά πηκτής. Στην περίπτωση αυτή, οι παράµετροι που προσδιορίζονται κατά την εφαρµογή των δοκιµών που προκαλούν µεγάλη παραµόρφωση ή ακόµα και διάσπαση της δοµής των πηκτών, είναι ο συντελεστής ελαστικότητας (Young s modulus), η τάση κατάρρευσης, η παραµόρφωση κατά την κατάρρευση και η ενέργεια κατάρρευσης (McClements, 2003). Οι µηχανικές αυτές παράµετροι των πηκτών είναι δυνατό να έχουν πρακτικό ενδιαφέρον όσον αφορά το χειρισµό, τον τεµαχισµό ή τη βρώση των προϊόντων. Στις δοκιµές µικρής παραµόρφωσης, συνήθως χρησιµοποιείται η τεχνική της δυναµικής ταλάντωσης (McClements, 2003) µε την καταγραφή των τιµών της G (ελαστική συνιστώσα ή συντελεστής αποθήκευσης), που αποτελεί το µέτρο της ενέργειας που αποθηκεύεται κατά την περιοδική εφαρµογή της δύναµης, της G (ιξώδης συνιστώσα ή συντελεστής ρευστότητας), που αποτελεί µέτρο της ενέργειας που χάνεται, και της tanδ (εφαπτοµένη απώλειας / loss tangent), όπου: (4) Οι µετρήσεις γίνονται µέσα στη γραµµική ιξωδοελαστική περιοχή, όπου οι τιµές της διατµητικής τάσης (stress) και της παραµόρφωσης (strain) συσχετίζονται γραµµικά και οι τιµές των συνιστωσών G και G είναι ανεξάρτητες από την τιµή της διατµητικής τάσης και της παραµόρφωσης (Σχήµα 1.15α). Ένα δείγµα µε τιµή G µεγαλύτερη από αυτήν του G συµπεριφέρεται ως ελαστικό σώµα (στερεό), ενώ ένα υλικό µε µεγαλύτερη τιµή G συµπεριφέρεται ως ιξώδες σώµα (υγρό). Σε ιδανικές συνθήκες σχηµατισµού πηκτής µε θέρµανση, από ένα υγρό διάλυµα πρωτεΐνης, πριν από τον σχηµατισµό πηκτής ισχύει G > G, επειδή το σύστηµα χαρακτηρίζεται ως ιξώδες. Μετά τον σχηµατισµό της πηκτής, όπου το σύστηµα χαρακτηρίζεται στερεό, ισχύει G > G (Σχήµα 1.15β). 34

55 Ρεολογικά χαρακτηριστικά εµβαµµάτων σαλάτας Παραδοσιακά για την παρασκευή των εµβαµµάτων σαλάτας, χρησιµοποιείται ο κρόκος του αυγού, τόσο λόγω των οργανοληπτικών του χαρακτηριστικών, όσο και λόγω των λειτουργικών του ιδιοτήτων (Rao, 1992). Οι πρωτεΐνες του κρόκου του αυγού παρουσιάζουν µεγάλη επιφανειοδραστικότητα, οπότε σταθεροποιούν τα σταγονίδια ελαίου των εµβαµµάτων σαλάτας, σχηµατίζοντας παράλληλα ένα δικτύωµα στη συνεχή φάση προσδίδοντας στα προϊόντα αυτού του τύπου τα επιθυµητά ρεολογικά χαρακτηριστικά. Η συγκέντρωση του υγρού κρόκου του αυγού που απαιτείται είναι συνήθως µεγαλύτερη του 2% w/w. Σηµαντική επίδραση στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των προσροφηµένων πρωτεϊνών σε γειτονικά σταγονίδια, αλλά και των πρωτεϊνών του κρόκου του αυγού στη συνεχή φάση παίζει και η παρουσία NaCl, λόγω µεταβολής των ηλεκροστατικών αλληλεπιδράσεων. Κατά την παρασκευή εµβαµµάτων σαλάτας χρησιµοποιείται συνήθως NaCl σε συγκέντρωση µεταξύ του 1 και 2% w/w (Rao, 1992). Εκτός από τον κρόκο αυγού, χρησιµοποιούνται και άλλοι γαλακτωµατοποιητές, µε κύριους στόχους τη µείωση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης και γενικότερα του διαιτητικού λίπους, την επίτευξη µεγαλύτερης µικροβιακής σταθερότητας αλλά και λόγω µικρότερου κόστους. Για τους παραπάνω λόγους, έχουν γίνει προσπάθειες αντικατάστασης µερικώς ή τελείως του κρόκου του αυγού από άλλα επιφανειοδραστικά υλικά και συστατικά που οδηγούν σε παρόµοια ρεολογικά χαρακτηριστικά. Μερικά από τα συστατικά αυτά είναι φυτικές πρωτεΐνες, όπως της σόγιας (Diftis et al., 2005, Rivas et al., 1983) και του λούπινου (Franco et al., 1998), ζωικές πρωτεΐνες όπως του γάλακτος (Dickinson et al., 1999) και του κρέατος (Imm & Regenstein, 1997) και γαλακτωµατοποιητές µικρού µοριακού βάρους (Partal et al., 1999). Πέρα από τη χρήση ενός γαλακτωµατοποιητή για τη σταθεροποίηση της διεπιφανειακής µεµβράνης των σταγονιδίων, είναι απαραίτητη ορισµένες φορές και η χρήση άλλων συστατικών που προσδίδουν επιθυµητά ρεολογικά χαρακτηριστικά. Για το λόγο αυτό χρησιµοποιούνται σε πολλές περιπτώσεις, µίγµατα των παραπάνω συστατικών µε πολυσακχαρίτες ή µε κρόκο αυγού (Mine & Keeratiurai, 2000, Raymundo et al., 1999). 35

56 Σχήµα Μεταβολή του ιξώδους ενός εµβάµµατος σαλάτας µε διαφορετική αναλογία κρόκου αυγού/καζεϊνικού νατρίου (0:8 έως 8:0). 0:8 ( ), 1:7 ( ), 2:6 ( ), 4:4 ( ), 5:1 ( ), 6:2 (+) και 8:0 (x) (Riscardo, Franco & Gallegos, 2003). Σχήµα Ρεολογικά χαρακτηριστικά ενός εµβάµµατος σαλάτας µε διαφορετική αναλογία κρόκου αυγού/καζεϊνικού νατρίου (0:8 έως 8:0). G : 0:8 ( ), 1:7 ( ), 2:6 ( ), 4:4 ( ), 5:1 ( ), 6:2 (+) και 8:0 (Ж), G : 0:8 ( ), 1:7 ( ), 2:6 ( ), 4:4 ( ), 5:1 ( ), 6:2 (x) και 8:0 (-)(Riscardo, Franco & Gallegos, 2003). 36

57 Στο Σχήµα 1.16, µπορεί να παρατηρήσει κανείς τις µεταβολές του ιξώδους ενός εµβάµµατος σαλάτας µε διαφορετικές αναλογίες σε πρωτεΐνες κρόκου αυγού και καζεϊνικού νατρίου, ενώ στο Σχήµα 1.17, παρουσιάζονται τα ρεολογικά χαρακτηριστικά του γαλακτώµατος, µετά από χρήση της τεχνικής της δυναµικής ταλάντωσης (Riscardo, Franco & Gallegos, 2003). Όπως προκύπει από τα διαγράµµατα αυτά, µε κατάλληλη αναλογία των δύο διαφορετικών πρωτεϊνών είνα δυνατό να παραχθούν εµβάµµατα σαλάτας µε παρόµοια ρεολογικά χαρακτηριστικά, µε αυτά όπου χρησιµοποιείται µόνο κρόκος αυγού. 37

58 ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Τα ελαιοσώµατα των πλούσιων σε έλαιο φυτικών πρώτων υλών, αποτελούνται από ένα πυρήνα, κυρίως τριακυλογλυκερολών, που καλύπτεται από µία µικτή µεµβράνη φωσφολιπιδίων και πρωτεϊνών, στις οποίες κυριαρχεί η ελαιοσίνη. Τα ελαιοσώµατα είναι δυνατό να εκχυλιστούν µε τη βοήθεια του νερού µε αποτέλεσµα να προκύπτει ένα φυσικό γαλάκτωµα, που περιέχει το έλαιο στη φυσική του µορφή. Το πλεονέκτηµα ενός τέτοιου γαλακτώµατος είναι ότι δεν απαιτείται η χρήση οργανικών διαλυτών για την εκχύλιση του ελαίου και ότι αποφεύγεται επίσης το αρκετά δαπανηρό από ενεργειακή άποψη στάδιο της οµογενοποίησης. Στην παρούσα εργασία, χρησιµοποιήθηκε ως πρώτη ύλη για την παραλαβή ελαιοσωµάτων το φύτρο αραβοσίτου, ο οποίος καλλιεργείται εκτενώς στην Ελλάδα. Το φύτρο αραβοσίτου διαχωρίζεται από το υπόλοιπο σπέρµα κατά την παραγωγή καλαµποκάλευρου και χρησιµοποιείται είτε για την παρασκευή αραβοσιτελαίου είτε ως ζωοτροφή. Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν αρχικά η εξέταση ενός αριθµού παραµέτρων που είναι δυνατό να επηρεάζουν την απόδοση της εκχύλισης του ελαίου από φύτρο αραβοσίτου, µε τη µορφή των ελαιοσωµάτων, και στη συνέχεια η εφαρµογή δύο διαφορετικών µεθόδων για την παραλαβή των ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε στόχο την παραπέρα µελέτη τους. Επειδή ο τρόπος παραλαβής των ελαιοσωµάτων ενδέχεται να επηρεάζει τη σύσταση της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων και συνεπώς τις φυσικοχηµικές τους ιδιότητες, ακολούθησε και συστηµατική µελέτη των δύο τύπων κρέµας ελαιοσωµάτων που παραλήφθηκαν. Ιδιαίτερη έµφαση δόθηκε στη διερεύνηση των χαρακτηριστικών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων και της φυσικοχηµικής τους σταθερότητας κατά την αποθήκευση τόσο της κρέµας όσο και γαλακτωµάτων που προέκυψαν µε αραίωση µε νερό. Τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων που προέκυψαν µε αραίωση της κρέµας, µελετήθηκαν επίσης και µετά την προσθήκη ενός πολυσακχαρίτη (ξανθάνη) ή ενός γαλακτωµατοποιητή µικρού µοριακού βάρους (Tween 80). Η γνώση των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων των δύο τύπων της κρέµας των ελαιοσωµάτων και των γαλακτωµάτων τους, αξιοποιήθηκε στη συνέχεια για την παρασκευή ενός τυπικού προϊόντος εµβάµµατος σαλάτας το οποίο µελετήθηκε ως προς τη σταθερότητά του αλλά και ως προς τα ρεολογικά του χαρακτηριστικά. 38

59 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Υλικά Ως πρώτη ύλη για την υδατική εκχύλιση των ελαιοσωµάτων χρησιµοποιήθηκε ένα προϊόν πλούσιο σε φύτρο αραβοσίτου (Zea Mays L.), που προοριζόταν για την παραλαβή αραβοσιτελαίου ή για κτηνοτροφική χρήση. Η προµήθειά του έγινε από την εταιρεία «Καρανίκας Αντ. Θ., Μύλοι Α.Ε.», Αλεξάνδρεια, Βέροια, όπου και διαχωρίζεται από το άλευρο του αραβοσίτου µε µηχανικό τρόπο. Για την εκχύλιση του λίπους από το φύτρο αραβοσίτου χρησιµοποιήθηκε πετρελαϊκός αιθέρας, σ.ζ ο C, της εταιρίας Riedel-de-Haën (Seelze, Germany). Για τη ρύθµιση της τιµής του ph χρησιµοποιήθηκαν, εκ περιτροπής, διαλύµατα τα οποία παρασκευάστηκαν µε πυκνό υδροχλωρικό οξύ (HCl) (Riedel-de-Haën, Seelze, Germany) και καυστικό νάτριο (NaOH) (Merck, Darmstadt, Germany). Για την αποκορύφωση των γαλακτωµάτων µε φυγοκέντρηση, χρησιµοποιήθηκε διάλυµα σακχαρόζης που παρασκευάστηκε µε σακχαρόζη (C 12 H 22 O 11 ) της εταιρείας Merck (Darmstadt, Germany). Για τον προσδιορισµό πρωτεΐνης κατά Kjeldahl χρησιµοποιήθηκαν θειικό κάλιο (K 2 SO 4 ) της εταιρίας Merck (Darmstadt, Germany), πυκνό θειικό οξύ εµπορίου (H 2 SO 4, 96-98%) και ένυδρος θειικός χαλκός (CuSO 4 5H 2 O) της εταιρίας Riedel-de-Haën (Seelze, Germany), διάλυµα καυστικού νατρίου (ΝaΟΗ, 40% w/v), πρότυπα διαλύµατα καυστικού νατρίου (ΝaΟΗ) 0,25 mol/l και θειικού οξέος (H 2 SO 4 ) 0,25 mol/l της εταιρίας Panreac Quimica (Barcelona, Spain). Για τον προσδιορισµό της πρωτεΐνης µε την τροποποιηµένη µέθοδο Lowry χρησιµοποιήθηκαν ανθρακικό νάτριο (Na 2 CΟ 3 ), τρυγικό οξύ (C 4 H 6 O 6 ), ένυδρος θειικός χαλκός (CuSO 4 5H 2 O) της εταιρίας Riedel-de-Haën (Seelze, Germany) και αντιδραστήριο Folin- Ciocalteu της εταιρίας Fluka Chemicals (Buchs, Switzerland). Για την ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS PAGE χρησιµοποιήθηκαν δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS) και 2-µερκαπτοαιθανόλη (C 2 H 6 OS) της εταιρίας Fluka Chemicals (Buchs, Switzerland), τρις-(υδροξυµέθυλο) αµινοµεθάνιο (Trisbase), γλυκίνη (C 2 H 5 NO 2 ), δείκτης κυανού της βρωµοφαινόλης (C 27 H 28 Br 2 O 5 S), ακρυλαµίδιο (C 3 H 5 NO), Ν,Ν -µεθυλενο-δισακρυλαµίδιο (C 7 H 10 N 2 O 2 ), υπερθειϊκό αµµώνιο τετραµεθυλενο αιθυλενοδιαµίνη (TEMED) και κυανούν Coomasie G

60 της εταιρίας Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), γλυκερόλη εµπορίου (C 3 H 5 (OH) 3 ), πρότυπο µίγµα πρωτεϊνών µε ευρύ φάσµα µοριακών βαρών (7-175 kda), Premixed Format P7708S της εταιρίας New England Biolabs (Massachusetts, USA), τριχλωροοξικό οξύ (C 3 HCl 3 O 2 ) της εταιρίας Riedel-de-Haën (Seelze, Germany) και µεθανόλη (CH 3 OH) και οξικό οξύ (CH 3 COOH) της εταιρίας Merck (Darmstadt, Germany). Για τη διάσπαση των συσσωµατωµάτων των σταγονιδίων του ελαίου στα γαλακτώµατα χρησιµοποιήθηκε δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS) και 2-µερκαπτοαιθανόλη (C 2 H 6 OS) της εταιρίας Fluka Chemicals (Buchs, Switzerland), Για τη συντήρηση των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκε νατραζίδιο (NaN 3 ) της εταιρίας Riedel-de-Haën (Seelze, Germany) και για τη µελέτη της σταθερότητάς τους χρησιµοποιήθηκε ξανθάνη από τον µικροοργανισµό xanthomonas campestris της εταιρείας Fluka Chemicals (Buchs, Switzerland), Tween 80 (µονοελαϊκή πολυοξυαιθυλενο σορβιτάνη) της εταιρείας TCI Development Co. Ltd (Shanghai) και υγρός κρόκος αυγού που παραλήφθηκε από αυγά του εµπορίου. Για τον προσδιορισµό του αριθµού υπεροξειδίων χρησιµοποιήθηκε ιωδιούχο κάλιο (99,5%) της Riedel de Haën (Seelze, Germany), θειοθειϊκό νάτριο (Na 2 S 2 O 3 ), διχλωριούχο βάριο (BaCl 2 2H 2 O) της Merck (Darmstadt, Germany) και θειϊκός σίδηρος (FeSO 4 7H 2 O) (99%), ανθρακικό νάτριο (Νa 2 CO 3 ), (99,8%) και τριχλωριούχος σίδηρος (FeCl 3 6H 2 O) (99,5%) της Panreac Quimica (Barcelona, Spain). Για την κατασκευή της καµπύλης αναφοράς µε υπεροξείδιο του κουµενίου (C 6 H 5 C(CH 3 ) 2 OOH), χρησιµοποιήθηκε κουµένιο της εταιρίας Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) Όργανα-Συσκευές Για την παρατήρηση των ελαιοσωµάτων στο φύτρο αραβοσίτου, χρησιµοποιήθηκε ειδικό µικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης, εκποµπής ηλεκτρονίων στους -122 o C (cryo-sem, Magellan 400, FEI, Eindhoven, the Netherlands) µε ειδική συσκευή προετοιµασίας του δείγµατος (MED 020/VCT 100, Leica, Vienna, Austria). Για την άλεση του φύτρου και την παραλαβή στη συνέχεια των ελαιοσωµάτων µε υδατική εκχύλιση χρησιµοποιήθηκε µύλος (Braun 4240, Germany), κόσκινο 0,8 mm mesh, 40

61 (Fritch, Germany), ζυγός ακριβείας µε τρία δεκαδικά ψηφία (Kern GmbH, Germany), µηχανικός αναδευτήρας RW 20.n (IKA Labortechnik, Germany), µε προπέλα Dayton D15 10 mm, ψηφιακό πεχάµετρο (Mettler Toledo MP 220, Germany), µπλέντερ (Braun 4240, Germany), ύφασµα τυροκοµίας µεγάλου πορώδους για διήθηση, και φυγόκεντρος (Firlabo SV11, France). Για τον προσδιορισµό του οργανικού αζώτου χρησιµοποιήθηκε αυτόµατη συσκευή προσδιορισµού αζώτου (Kjeldahl Gernhardt, Germany) και για τον προσδιορισµό της πρωτεΐνης µε την τροποποιηµένη µέθοδο Lowry, χρησιµοποιήθηκε φασµατοφωτόµετρο (Ηeλios ε, Thermo Spectronic, USA). Για τον προσδιορισµό του λίπους και της υγρασίας της κρέµας των ελαιοσωµάτων, χρησιµοποιήθηκαν αντιστοίχως, συσκευή Soxhlet και πυριαντήριο (T5042, Heraeus, Germany). Για την ποιοτική εκτίµηση της σύστασης των πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων σε επιµέρους πρωτεΐνες χρησιµοποιήθηκε συσκευή ηλεκτροφόρησης P8-DS-1 Dual Gel 10x10 cm (Owl Vertical Electrophoresis Systems, Thermoscientific, New York, USA) σε συνδυασµό µε τροφοδοτικό ηλεκτροφόρησης ST1006T (Apelex, France). Η επεξεργασία των ηλεκτροφορηµάτων έγινε µε τη βοήθεια λογισµικού πυκνοµετρικής σάρωσης Gel-Pro Analyzer (v 3, Media Cybernetics, USA), ώστε να εκτιµηθεί µε µεγαλύτερη ακρίβεια το µοριακό βάρος των επιµέρους πρωτεϊνικών υποµονάδων που αντιστοιχούσαν σε κάθε ζώνη. Για τη φωτογράφηση των ηλεκτροφορηµάτων χρησιµοποιήθηκε ψηφιακή φωτογραφική µηχανή Kodak DSC-W90 (NY, USA) και θάλαµος φωτογράφησης Reprostar 3 (Camag, Switzerland). Για τον προσδιορισµό του µεγέθους των ελαιοσωµάτων και των συσσωµατωµάτων τους χρησιµοποιήθηκε αναλυτής µεγέθους σταγονιδίων Mastersizer 2000, Malvern Instruments, UK, οπτικό µικροσκόπιο (Zeiss, West Germany) και µικροσκόπιο µε δυνατότητα λήψης φωτογραφιών, (Zeiss, West Germany). Σε ορισµένες περιπτώσεις τα γαλακτώµατα διασπάστηκαν πριν τη µέτρηση µε συσκευή υπερήχων UP100H (Hielscher, Germany). Για την µέτρηση του ζ-δυναµικού της επιφάνειας των σταγονιδίων των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκε συσκευή µέτρησης ζ-δυναµικού Laser Zee Meter Model 501 (Pen Kem, Inc, Bedford Hills, NY, USA) που έφερε µικροσκόπιο Nikow (Optiphot, Japan) και οθόνη Phillips, (Germany). Πριν τη µέτρηση, τα συσσωµατώµατα των γαλακτωµάτων διασπάστηκαν µε συσκευή υπερήχων UP100H (Hielscher, Germany). Για την ανάµιξη των γαλακτωµάτων µε διαλύµατα γνωστής συγκέντρωσης ξανθάνης και Tween 80 ή µε κρόκο αυγού, χρησιµοποιήθηκε µαγνητικός αναδευτήρας, SMT 150, (Bioline 41

62 Scientific, Greece) µε ραβδοειδείς µαγνήτες 0,5-3 cm. Για τη µελέτη των ρεολογικών χαρακτηριστικών των γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας, χρησιµοποιήθηκε ρεόµετρο περιστροφής Physica MCR 300 (Physica Messtechnic GmbH, Stuttgard, Germany) µε σύστηµα οµόκεντρων κυλίνδρων διαµέτρων 0,42 και 0,47 mm και λογισµικό US200 V Το λουτρό ρύθµισης θερµοκρασίας ήταν της Paar Physica µε αισθητήρα Tez 150P/MCR ακριβείας ± 0,1 ο C Μέθοδοι Υδατική εκχύλιση των ελαιοσωµάτων από το φύτρο. Σε πρώτη φάση πραγµατοποιήθηκε µία σειρά από προκαταρκτικά πειράµατα µε στόχο τον εντοπισµό των παραµέτρων εκείνων που επηρέαζαν περισσότερο την απόδοση της εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρο. Όπως διαπιστώθηκε, οι παράµετροι αυτές ήταν το µέγεθος των κόκκων του αλεσµένου φύτρου, η τιµή του ph εκχύλισης και ο αριθµός των διαδοχικών εκχυλίσεων της πρώτης ύλης µε το νερό. Με βάση τα προκαταρκτικά στοιχεία που προέκυψαν ακολούθησαν: α) δοκιµές εκχύλισης µετά από περιορισµένη άλεση της πρώτης ύλης ή µετά από εκτεταµένη άλεσή της σε κόκκους µε µέγεθος µικρότερο από 0,8 mm, β) δοκιµές εκχύλισης όλων των προηγούµενων δειγµάτων σε τρείς διαφορετικές τιµές ph (3,6 και 9), γ) εφαρµογή µίας, δύο ή τριών διαδοχικών δοκιµών εκχύλισης για κάθε δείγµα. Πιο αναλυτικά, αρχικά το φύτρο υποβλήθηκε σε άλεση για 45s µε τη βοήθεια ειδικού µύλου και το άλευρο που προέκυψε κοσκινίστηκε µε κόσκινο που έφερε οπές µε διάµετρο 0,8 mm. Το κλάσµα του αλεύρου που έµεινε στο κόσκινο και αυτό που παραλήφθηκε µετά την κοσκίνιση, καθώς επίσης και ένα τρίτο δείγµα µη αλεσµένου φύτρου, αναµίχθηκαν µε απιονισµένο νερό σε αναλογία 1:5 w/v. Τα αιωρήµατα αναδεύτηκαν µε µηχανικό αναδευτήρα για 2 h µε συνεχή ρύθµιση της τιµής του ph στο 3, το 6 ή το 9 και στη συνέχεια παρέµειναν στο ψυγείο για ένα βράδυ. Την επόµενη µέρα ακολούθησε έντονη ανάδευση για 45 s σε µπλέντερ και διήθηση µε τη βοήθεια ηθµού που αποτελούνταν από τριπλό ύφασµα µεγάλου πορώδους. Το στερεό υπόλειµµα της διήθησης που παρέµεινε στον ηθµό αναµίχθηκε ξανά µε απιονισµένο νερό σε αναλογία 1:5 w/v, ρυθµίστηκε η τιµή του ph και αναδεύτηκε µε µηχανικό αναδευτήρα για 2 42

63 h. Στη συνέχεια ακολούθησε η ίδια διαδικασία όπως και προηγουµένως. Αναµίχθηκε δηλαδή το αιώρηµα για 45 s µε τη βοήθεια του µπλέντερ και διηθήθηκε µε ηθµό από τριπλό πανί µεγάλου πορώδους. Το στερεό υπόλειµµα παραλήφθηκε από τον ηθµό και υποβλήθηκε ξανά σε εκχύλιση. Στο τέλος της κάθε δοκιµής εκχύλισης, πραγµατοποιούνταν µετρήσεις της συγκέντρωσης του ελαίου που παρέµενε στο φύτρο (CV% = 4,2%, n = 7) για τον έµµεσο υπολογισµό της απόδοσης εκχύλισης του ελαίου µε τη µορφή των ελαιοσωµάτων. Το διήθηµα που παραλαµβανόταν από τον ηθµό και αποτελούσε το υδατικό εκχύλισµα των ελαιοσωµάτων υποβάλλονταν σε φυγοκέντρηση στα 3000 g για 15 min, για την καταβύθιση και αποµάκρυνση τυχόν στερεών σωµατιδίων µικρού µεγέθους που προέρχονταν από το άλευρο του φύτρου. Το διήθηµα µετά την αποµάκρυνση των σωµατιδίων του αλεύρου του φύτρου αποτελούσε ένα αραιό αιώρηµα ελαιοσωµάτων σε διασπορά σε ένα υδατικό διάλυµα πρωτεϊνών του φύτρου οι οποίες συνεκχυλίζονται µε τα ελαιοσώµατα, δηλαδή ένα γαλάκτωµα ελαίου στο νερό. Για την αξιοποίηση για παραπέρα χρήση του αραιού αυτού εκχυλίσµατος των ελαιοσωµάτων ήταν απαραίτητο να αποµακρυνθεί ένα µεγάλο µέρος του νερού και αυτό επιτεύχθηκε µε την αποκορύφωση των ελαιοσωµάτων του γαλακτώµατος και την παραλαβή τους µε τη µορφή κρέµας Παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε ισοηλεκτρική συσσωµάτωση και φυγοκέντρηση. Για την παραλαβή των ελαιοσωµάτων µε τη µορφή κρέµας από το υδατικό εκχύλισµα, ρυθµίστηκε η τιµή του ph του αιωρήµατος στο 5 και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 4000 g για 30 min. Συλλέχθηκε στη συνέχεια η υπερκείµενη κρέµα, προστέθηκε µε ανάδευση σε απιονισµένο νερό σε αναλογία 1:5 w/v, ρυθµίστηκε η τιµή του ph στο 9 και αναδεύτηκε µε µηχανικό αναδευτήρα για 1 h. Στη συνέχεια ρυθµίστηκε η τιµή του ph πάλι στο 5 και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 4000 g για 30 min (Σχήµα 2.1). Στην τελική κρέµα (κρέµα Ι.Σ) που παραλήφθηκε προστέθηκε νατραζίδιο (0,01% w/v) και προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα της κρέµας σε υγρασία, λίπος και ολική πρωτεΐνη. 43

64 Άλευρο Φύτρου Αιώρημα Αλεύρου ph=9 Ανάμιξη Απιονισμένο Νερό (1:5) Απιονισμένο Νερό (1:5) ph=9 Ανάδευση Αιώρημα Αλεύρου με ελαιοσώματα Ιζημα Διήθηση Διήθημα: Αιώρημα ελαιοσωμάτων Ιζημα Φυγοκέντρηση Απιονισμένο Νερό (1:5) ph=9 Ανάδευση Ορός Γαλάκτωμα ελαιοσωμάτων Κρέμα Ελαιοσωμάτων (Ι.Σ.) ph=5 Φυγοκέντρηση Σχήµα 2.1. ιάγραµµα ροής για την παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από φύτρο αραβοσίτου µε ισοηλεκτρική συσσωµάτωση (κρέµα Ι.Σ) 44

65 Άλευρο Φύτρου Αιώρημα Αλεύρου ph=9 Ανάμιξη Απιονισμένο Νερό (1:5) Απιονισμένο Νερό (1:5) ph=9 Ανάδευση Αιώρημα Αλεύρου και Ελαιοσώματα Ιζημα Διήθηση Διήθημα: Αιώρημα Ελαιοσωμάτων Ιζημα Φυγοκέντρηση Διάλυμα Σακχαρόζης (1:5) ph=9 Ανάδευση Ορός Γαλάκτωμα Ελαιοσωμάτων Κρέμα Ελαιοσωμάτων (Σ) Φυγοκέντρηση Προσθήκη Σακχαρόζης Σχήµα 2.2. ιάγραµµα ροής για την παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από φύτρο αραβοσίτου µε προσθήκη σακχαρόζης (κρέµα Σ) Παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε φυγοκέντρηση µετά από προσθήκη σακχαρόζης. 45

66 Για την παραλαβή κρέµας ελαιοσωµάτων παρουσία σακχαρόζης, στο αρχικό αιώρηµα προστέθηκε ορισµένη ποσότητα διαλύµατος σακχαρόζης, ώστε η τελική συγκέντρωση του αιωρήµατος σε σακχαρόζη να είναι 0,5 M. Η τιµή του ph ρυθµίστηκε στο 9 και µετά από ανάδευση µε µηχανικό αναδευτήρα για 1h, φυγοκεντρήθηκε το αιώρηµα στα 4000 g για 30 min. Στη συνέχεια συλλέχθηκε η υπερκείµενη κρέµα, προστέθηκε σε διάλυµα σακχαρόζης σε αναλογία 1:5 w/v, ώστε η τελική συγκέντρωση του αιωρήµατος σε σακχαρόζη να είναι 0,5 M, ρυθµίστηκε η τιµή του ph στο 9, αναδεύτηκε µε µηχανικό αναδευτήρα για 1 h και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 4000 g για 30 min (Σχήµα 2.2). Στην τελική υπερκείµενη κρέµα (κρέµα Σ) που παραλήφθηκε προστέθηκε νατραζίδιο (0,01% w/v) και προσδιορίστηκε η υγρασία, το λίπος και η πρωτεΐνη Προσδιορισµός της περιεκτικότητας της κρέµας σε λίπος, υγρασία και πρωτεΐνη. Ο προσδιορισµός της περιεκτικότητας της κρέµας των ελαιοσωµάτων σε πρωτεΐνη έγινε σύµφωνα µε τη µέθοδο Kjeldahl (Rao, 1992). Ορισµένη ποσότητα κρέµας ελαιοσωµάτων ζυγισµένη µε ακρίβεια, τοποθετήθηκε στη συσκευή καύσης Kjeldahl µαζί µε 20 ml πυκνoύ H 2 SO 4 (96-98%), 12 g K 2 SO 4 και 1 g CuSO 4 2H 2 O και ακολούθησε πέψη του µίγµατος σε ειδική συσκευή. Μετά το πέρας της πέψης, µεταφέρθηκε το δείγµα σε ειδική συσκευή απόσταξης, προστέθηκε περίσσεια πυκνού διαλύµατος ΝaΟΗ (40%, w/v) και στη συνέχεια αποστάχθηκε η αµµωνία µε τη βοήθεια υδρατµών, η οποία συλλέχθηκε σε κωνική φιάλη µε 25 ml διαλύµατος H 2 SO 4 0,125 Μ. Η περίσσεια του οξέος ογκοµετρήθηκε µε διάλυµα ΝaΟΗ 0,25 mol/l, παρουσία δείκτη ερυθρού του µεθυλίου. Η εκατοστιαία περιεκτικότητα του δείγµατος σε ολικό άζωτο υπολογίστηκε µε βάση τον τύπο: % Ν = 1,4008 (Ν ο V ο Ν β V β ) / m, (5) όπου m η µάζα του δείγµατος σε g. Η επί τοις % περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη υπολογίστηκε µε πολλαπλασιασµό µε το συντελεστή 5,7 (CV% = 5,6%, n=5). Ο προσδιορισµός του λίπους στο φύτρο αραβοσίτου και στις κρέµες των ελαιoσωµάτων 46

67 που παραλήφθηκαν, έγινε µε τη µέθοδο Soxhlet (Rao, 1992). Για το σκοπό αυτό ζυγίστηκε µε ακρίβεια ορισµένη ποσότητα δείγµατος, τοποθετήθηκε σε φύσιγγα και εκχυλίστηκε το λίπος µε τη βοήθεια πετρελαϊκού αιθέρα σε συσκευή Soxhlet για 5 h ή 12 h, ανάλογα µε τη φύση του δείγµατος. Ακολούθησε αποµάκρυνση των υπολειµµάτων του διαλύτη σε πυριαντήριο και η ποσότητα του λίπους υπολογίστηκε από τη µεταβολή του βάρους της σφαιρικής φιάλης της συσκευής (CV% = 4.9%, n=5). Ο προσδιορισµός της υγρασίας έγινε σταθµικά (Laemmli, 1970, Rao, 1992) µε ξήρανση µέχρι σταθερού βάρους, σε πυριαντήριο θερµοκρασίας 105 ο C, ποσότητας δείγµατος που ζυγίστηκε µε ακρίβεια (CV% = 6,1%, n=5) Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαµιδίου (SDS-PAGE). Η ποιοτική σύσταση του πρωτεϊνικού κλάσµατος της κρέµας (ή του αλεύρου φύτρου ή της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων) εκτιµήθηκε µε την εφαρµογή της ηλεκτροφόρησης SDS- PAGE (Laemmli, 1970). Για την παρασκευή του δείγµατος ηλεκτροφόρησης, ορισµένη ποσότητα δείγµατος διαλυτοποιήθηκε σε ρυθµιστικό διάλυµα εκχύλισης που περιείχε 50 mm Tris-HCl, 5 Μ ουρία, 1% w/v SDS και 4% w/v 2-µερκαπτοαιθανόλη. Μετά από ανάδευση για 30min σε θερµοκρασία δωµατίου, προστέθηκε ίσος όγκος ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης µε 125 mm Tris-HCl, 5 Μ ουρία, 1% w/v SDS, 20% w/v γλυκερόλη και 4% w/v 2-µερκαπτοαιθανόλη. Ακολούθησε βρασµός για 2 min και η εφαρµογή δύο κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του τελικού δείγµατος ηλεκτροφόρησης ήταν 2-3 mg/ml ρυθµιστικού διαλύµατος. Το σύστηµα της πηκτής της ηλεκτροφόρησης αποτελούνταν από την πηκτή διαχωρισµού (12,5% w/v σε ακρυλαµίδιο), όπου γίνεται ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών σε ζώνες, και από την πηκτή επιστοίβαξης (4,5% w/v σε ακρυλαµίδιο), που χρησίµευε για την συγκέντρωση όλων των πρωτεϊνών του δείγµατος σε µια ζώνη πάχους µερικών µm, ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο βαθµός διάχυσης. Για την παρασκευή της πηκτής διαχωρισµού χρησιµοποιήθηκε ορισµένος όγκος ενός διαλύµατος που περιείχε 6,6 ml διαλύµατος ακρυλαµίδιου (30% w/v ακρυλαµίδιο, 0,8% w/v Ν,Ν -µεθυλενο-δισακρυλαµιδίου), 4 ml διαλύµατος Tris-HCl (1,875 mol/l, ph 8,8), 0,2 ml διαλύµατος SDS (10%, w/v), 9 ml απιονισµένο νερό, 2 ml διαλύµατος υπερθειϊκού αµµωνίου (1% w/v), ως καταλύτης της αντίδρασης πολυµερισµού του ακρυλαµιδίου, και 30 µltemed, 47

68 ως εκκινητής. Το µίγµα αποχύθηκε σε ειδικό εκµαγείο, αποτελούµενο από δύο παράλληλες πλάκες, προς πολυµερισµό. Στην επιφάνεια του πολυµερισµένου ακρυλαµιδίου αποχύθηκε αντίστοιχο µίγµα για την παρασκευή της πηκτής επιστοίβαξης που περιείχε 0.8 ml διαλύµατος ακρυλαµίδιου (30% w/v ακρυλαµίδιο, 0,8% w/v Ν,Ν -µεθυλενο-δισακρυλαµιδίου), 1,2 ml διαλύµατος Tris-HCl (0.625 mol/l, ph 6,8), 0,2 ml διαλύµατος SDS (10%, w/v), 4 ml απιονισµένο νερό, 1 ml διαλύµατος υπερθειϊκού αµµωνίου (1% w/v), ως καταλύτης της αντίδρασης πολυµερισµού του ακρυλαµιδίου, και 15 µl TEMED, ως εκκινητής. Ακολούθησε εισαγωγή των δειγµάτων στην πηκτή επιστοίβαξης µε τη βοήθεια µικροσύριγγας και οι πλάκες τοποθετήθηκαν στην ειδική συσκευή, στην οποία προστέθηκε υδατικό ηλεκτρολυτικό διάλυµα που περιείχε γλυκίνη (1,44% w/v), Tris-HCl (0,3% w/v) και SDS (0,1% w/v). Η ένταση του τροφοδοτικού ρεύµατος ρυθµίστηκε στα 60 ma ενώ η συσκευή ψύχονταν µε τη διαβίβαση νερού βρύσης σε όλη τη διάρκεια της λειτουργίας της. Μετά το πέρας του διαχωρισµού των πρωτεϊνών του µίγµατος, η πηκτή βυθίστηκε για 15 min σε διάλυµα τριχλωροοξικού οξέος (12,5%, w/v) για την στερέωση των πρωτεϊνών και στη συνέχεια σε υδατοµεθανολικό διάλυµα χρώσης των ζωνών που αποτελούνταν από µεθανόλη (40%, v/v), κυανό του Coomasie G-250 (0,1% w/v) και οξικό οξύ (10% v/v). Ακολούθως, έγινε εµβάπτιση της πηκτής σε υδατικό διάλυµα που αποτελείτο από οξικό οξύ (10% v/v) και µεθανόλη (10% v/v), για τον αποχρωµατισµό των περιοχών της πηκτής που δεν υπήρχαν πρωτεΐνες. Οι πηκτές µε τα ηλεκτροφορήµατα φωτογραφήθηκαν σε ειδικό θάλαµο και η επεξεργασία τους έγινε µε λογισµικό πυκνοµετρικής σάρωσης ώστε να εκτιµηθεί µε µεγαλύτερη ακρίβεια το µοριακό βάρος των επιµέρους πρωτεϊνικών υποµονάδων που απαντούσαν σε κάθε ζώνη Παρασκευή γαλακτωµάτων µε βάση την κρέµα ελαιοσωµάτων ΙΣ. Με κατάλληλη αραίωση της κρέµας που παραλήφθηκε µε ισοηλεκτρική συσσωµάτωση παρασκευάστηκαν τα εξής γαλακτώµατα: α) γαλακτώµατα που περιείχαν 5, 10 ή 20% w/v έλαιο µε προσθήκη στην κρέµα κατάλληλης ποσότητας απιονισµένου νερού, β) γαλακτώµατα µε 10% w/v έλαιο και 0,1% w/v ξανθάνης µε αραίωση της κρέµας µε υδατικό διάλυµα ξανθάνης και γ) γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας που περιείχαν 20% w/v έλαιο, 2,5% w/v υγρό κρόκο αυγού και 1,5% w/v NaCl. Σε ορισµένα από τα γαλακτώµατα µεταβλήθηκε η τιµή του ph µε 48

69 προσθήκη µικρής ποσότητας αραιού διαλύµατος HCl ή NaΟΗ, ανάλογα µε τις ανάγκες του πειράµατος. Ειδικά στα γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας η ρύθµιση της τιµής του ph έγινε µε προσθήκη µικρής ποσότητας αραιού διαλύµατος οξικού οξέος Παρασκευή γαλακτωµάτων από την κρέµα ελαιοσωµάτων Σ. Γαλακτώµατα περίπου ανάλογα µε αυτά που περιγράφονται στην προηγούµενη παράγραφο παρασκευάστηκαν και µε κατάλληλη αραίωση της κρέµας που παραλήφθηκε µε τη βοήθεια σακχαρόζης. Πιο συγκεκριµένα, παρασκευάστηκαν τα εξής γαλακτώµατα: α) γαλακτώµατα που περιείχαν έλαιο 5,10, 20 ή 45% w/v µετά από προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας απιονισµένου νερού, β) γαλακτώµατα µε 10% w/v έλαιο και 0,1% w/v ξανθάνης, µε αραίωση της κρέµας µε υδατικό διάλυµα ξανθάνης, γ) γαλακτώµατα µε 5% w/v έλαιο και 0,5 έως 2,0% w/v Tween 80, µε κατάλληλη αραίωση της κρέµας µε διάλυµα Tween 80 και δ) γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας που περιείχαν 20 ή 45 % w/v έλαιο, 2,5% w/v υγρό κρόκο αυγού και 1,5% w/v NaCl. Ακολούθησε ρύθµιση της τιµής του ph των γαλακτωµάτων όπως περιγράφεται παραπάνω Μέτρηση της µέσης διαµέτρου των σταγονιδίων των γαλακτωµάτων. Για τη µέτρηση της κατανοµής του µεγέθους των ελαιοσωµάτων (ή των συσσωµατωµάτων τους) του γαλακτώµατος, αρχικά ορισµένη ποσότητα δείγµατος αραιώθηκε µε δεκαπλάσιο όγκο απιονισµένου νερού. Ακολούθησε απόχυση του αραιωµένου δείγµατος στο λουτρό του µετρητή µεγέθους σωµατιδίων Mastersizer 2000, ανάδευση για 1 min, µέτρηση του σκεδασµού µονοχρωµατικής ακτίνας laser ηλίου-νέου (λ = 632,8 nm) και υπολογισµός της κατανοµής του µεγέθους και της µέσης διαµέτρου των σταγονιδίων, d 3,2 και d 4,3 που δίνονται, αντίστοιχα, από τους τύπους: Σn i d 3 2 i /Σn i d i (µm) και Σn i d 4 i /Σn i d 3 i (µm), όπου n i είναι ο αριθµός των σταγονιδίων που έχουν διάµετρο d i (CV% = 2,2%, n=5). Οι παράµετροι των µετρήσεων ήταν: θερµοκρασία: 25 ο C, δείκτης διάθλασης της συνεχούς φάσης και του ελαίου: 1,33 και 1,46, αντίστοιχα, απορρόφηση της συνεχούς φάσης: 0, Εκτίµηση της σταθερότητας των γαλακτωµάτων κατά την αποθήκευση. 49

70 H εκτίµηση της σταθερότητας των γαλακτωµάτων έναντι της συσσωµάτωσης ή/και της συγχώνευσης των ελαιοσωµάτων κατά την αποθήκευση πραγµατοποιήθηκε µε µέτρηση του µεγέθους των συσσωµατωµάτων των ελαιοσωµάτων που σχηµατίζονται κατά την αποθήκευση των γαλακτωµάτων σε θερµοκρασία περιβάλλοντος ή συντήρησης (5 o C) για διάφορα χρονικά διαστήµατα. Προκειµένου να αξιολογηθεί η σταθερότητα των σταγονιδίων µόνο ως προς τη συγχώνευση η ίδια µέτρηση πραγµατοποιήθηκε και µετά από επεξεργασία υπό συνεχή ανάδευση αραιωµένου (1:10) δείγµατος των γαλακτωµάτων µε διάλυµα µίγµατος SDS (1% w/v) και 2- µερκαπτοαιθανόλης (0,3 % w/v) για 1 h. Η πλήρης διάσπαση των συσσωµατωµάτων µετά το πέρας της επεξεργασίας του αιωρήµατος για 1 h επιβεβαιώθηκε µε τη βοήθεια οπτικού µικροσκοπίου. Η σταθερότητα των γαλακτωµάτων έναντι της αποκορύφωσης (H%) αξιολογήθηκε µε παρατήρηση µε το χρόνο αποθήκευσης του ύψους του ορού που διαχωρίζεται στον πυθµένα ενός γυάλινου κυλινδρικού δοχείου διαστάσεων 1 cm (διάµετρος) x 6 cm (ύψος) στο οποίο τοποθετούνταν 10 ml γαλακτώµατος, και εκφράζεται ως: H% = 100H t /H o (6) όπου Η o το ύψος του δείγµατος στο δοχείο και Η t το ύψος του ορού σε χρόνο t. Η επαναληψιµότητα της µεθόδου εκφρασµένη ως συντελεστής µεταβλητότητας ήταν: CV% = 5,8%, n= Μέτρηση του ζ-δυναµικού της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων. Για τη µέτρηση της τιµής του ζ-δυναµικού, που σχετίζεται µε το φορτίο που φέρει η επιφάνεια των σταγονιδίων, ποσότητα δείγµατος αραιώθηκε µε υπερκαθαρό νερό σε αναλογία 1:500, v/v και η τιµή του ph στο αραιωµένο δείγµα ρυθµίστηκε, όταν αυτό ήταν απαραίτητο, στην αρχική τιµή ph του γαλακτώµατος. Τυχόν συσσωµατώµατα στα αραιωµένα δείγµατα, διασπάστηκαν µε την εφαρµογή υπερήχων για χρονικό διάστηµα 10 min, ώστε η µέτρηση της τιµής του ζ-δυναµικού να αντιπροσωπεύει το φορτίο της επιφάνειας των µεµονωµένων σταγονιδίων του γαλακτώµατος και όχι αυτό των συσσωµατωµάτων τους. 50

71 Το αραιωµένο γαλάκτωµα τοποθετήθηκε σε ειδική κυψελίδα, η οποία προσαρµόστηκε στην άνοδο και την κάθοδο της συσκευής ηλεκτροφόρησης και µε τη βοήθεια µικροσκοπίου που εστίαζε στην στατική στοιβάδα, παρατηρήθηκε η κίνηση των σταγονιδίων προς τα ηλεκτρόδια, κατά την εφαρµογή µίας διαφοράς δυναµικού 100 V. Η ταχύτητα των σταγονιδίων στο ηλεκτρικό πεδίο εξαρτάται από το ηλεκτρικό τους φορτίο. Εποµένως, από τη µέτρηση της ταχύτητάς τους υπολογίζεται και το ζ-δυναµικό της επιφανείας τους. Αυτό γίνεται µε τη βοήθεια ενός πρίσµατος που ρυθµίζεται από τον χρήστη να ακολουθεί την κίνηση των σταγονιδίων µε τέτοιο τρόπο ώστε τα σταγονίδια να παραµένουν, φαινοµενικά, ακίνητα στην οθόνη. Το όργανο υπολογίζει και δίνει απευθείας την τιµή του ζ-δυναµικού των σταγονιδίων. Για κάθε γαλάκτωµα πραγµατοποιήθηκαν τρεις τουλάχιστον µετρήσεις (CV% = 8,3%, n=5) Προσδιορισµός των επιφανειακών πρωτεϊνών των ελαιοσωµάτων που εκροφούνται λόγω ανταγωνιστικής προσρόφησης του Tween 80. Για να προσδιοριστούν οι πρωτεΐνες που εκροφούνται από την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων, λόγω ανταγωνιστικής προσρόφησης µε τον γαλακτωµατοποιητή χαµηλού µοριακού βάρους (Tween 80), παραλήφθηκε ο ορός και η κρέµα των γαλακτωµάτων µετά από φυγοκέντρηση στα g για 30 min. Ακολούθησε λυοφιλίωση του ορού και το ξηρό υπόλειµµα πλύθηκε µε ορισµένη ποσότητα ακετόνης, χλωροφορµίου και διαιθυλαιθέρα για να αποµακρυνθούν λιπίδια που τυχόν υπήρχαν στον ορό. Στη συνέχεια έγινε εφαρµογή της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης, τόσο στα προϊόντα αυτής της επεξεργασίας όσο και στις κρέµες των γαλακτωµάτων. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που εκροφήθηκε προσδιορίστηκε µε εφαρµογή της τροποποιηµένης τεχνικής Lowry (Markwell et al., 1978) στο ορό που παραλήφθηκε µε τον παραπάνω τρόπο (CV% = 4,8%, n=5). Η ποσότητα της προσροφηµένης πρωτεΐνης στην κρέµα υπολογίστηκε µε αφαίρεση της ποσότητας της πρωτεΐνης που υπήρχε στον ορό από την συνολική ποσότητά της στο γαλάκτωµα. 51

72 Το φορτίο πρωτεΐνης, Γs (mg/m 2 ) ανά µονάδα επιφάνειας υπολογίστηκε από την εξίσωση (Das & Chattoraj, 1983): (7) Όπου C i - C o είναι η διαφορά µεταξύ της αρχικής και της εκροφηµένης πρωτεΐνης ανά µονάδα όγκου του γαλακτώµατος (mg/ml), Φ είναι το κλάσµα του ελαίου στο γαλάκτωµα (Φ= 0,05) και S είναι η ολική επιφάνεια ελαίου του γαλακτώµατος (m 2 /ml ελαίου),που προκύπτει από την εξίσωση (Walstra, 1983): (8) Προσδιορισµός των διεπιφανειακών πρωτεϊνών των ελαιοσωµάτων στα γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας Για τον προσδιορισµό της ποιοτικής σύστασης των διεπιφανειακών πρωτεϊνών παρουσία του υγρού κρόκου αυγού, τα γαλακτώµατα αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C για 75 ηµέρες και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα g για 30 min. Η κρέµα που παραλήφθηκε διασπάρθηκε σε απιονισµένο νερό (1:5, v/v) και επαναλήφθηκε η φυγοκέντρηση στα g για 30 min. Στην τελική κρέµα που παραλήφθηκε εφαρµόστηκε η τεχνική της ηλεκτροφόρησης Μελέτη των ρεολογικών χαρακτηριστικών των γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας. Για τη µελέτη των ρεολογικών χαρακτηριστικών των γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας, πραγµατοποιήθηκαν µετρήσεις µε την εφαρµογή της τεχνικής δυναµικής ταλάντωσης, µε τη βοήθεια ενός ρεοµέτρου περιστροφής Physica MCR 300 που έφερε σύστηµα οµόκεντρων κυλίνδρων (εσωτερικής και εξωτερικής διαµέτρου 4,2 και 4,7 mm, αντίστοιχα). Ποσότητα όγκου περίπου 4 ml των γαλακτωµάτων προστέθηκε στον εξωτερικό κύλινδρο του 52

73 οργάνου και µετά την τοποθέτηση του εσωτερικού κυλίνδρου καλύφθηκε η εκτεθειµένη επιφάνεια του δείγµατος µε έλαιο σιλικόνης για να αποτραπεί η απώλεια υγρασίας. Οι µετρήσεις των ρεολογικών χαρακτηριστικών πραγµατοποιήθηκαν, µετά την παρέλευση 5 min για εξισορρόπηση στους 25 ο C. Για την εκτίµηση της επίδρασης της θέρµανσης στα ρεολογικά χαρακτηριστικά των γαλακτωµάτων, τα δείγµατα θερµάνθηκαν σταδιακά µε ρυθµό 3 o C / min, µέχρι τους 80 o C, παρέµειναν στη θερµοκρασία αυτή για 10 min, και κατόπιν ψύχθηκαν στους 25 o C µε τον ίδιο ρυθµό. Κατά τη διάρκεια της θερµικής ή µη σάρωσης καταγράφονταν συνεχώς από το όργανο συγκεκριµένες ιξωδοελαστικές παράµετροι (G, G, tanδ) υπό σταθερή παραµόρφωση (strain) γ = 0,1 %, τιµή η οποία βρισκόταν µέσα στην γραµµική ιξωδοελαστική περιοχή, και συχνότητα 1 Hz. Επιπλέον, καταγράφηκαν τα µηχανικά φάσµατα (frequency sweep), για περιοχή συχνοτήτων 0,1-50 Hz υπό σταθερή παραµόρφωση (strain) γ = 0,1 % Προσδιορισµός του αριθµού υπεροξειδίων του ελαίου του φύτρου αραβοσίτου. Για τον προσδιορισµό του αριθµού υπεροξειδίων του ελαίου του φύτρου αραβοσίτου, ήταν απαραίτητη η αποµόνωση αρχικά του ελαίου. Για την παραλαβή της λιπαρής φάσης, αναµίχθηκε ορισµένη ποσότητα αλεσµένου φύτρου αραβοσίτου, µε δεκαπλάσια ποσότητα οργανικού διαλύτη (διαιθυλαιθέρα). Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 20 min και παραλήφθηκε στη συνέχεια η υπερκείµενη οργανική φάση. Για την αποµάκρυνση του διαλύτη χρησιµοποιήθηκε περιστροφικός εξατµιστήρας κενού στους 40 o C. Μετά από την αποµάκρυνση και των ιχνών του διαλύτη µε διαβίβαση αζώτου, ζυγίστηκε 1 g του δείγµατος µε ακρίβεια 3 ου δεκαδικού σε εσµυρισµένη κωνική φιάλη, προστέθηκαν 30 ml διαλύµατος οξικού οξέος:χλωροφορµίου 3:2 (v/v) που είχε απαρεωθεί µε Ν 2 και ανακινήθηκε η κωνική µέχρι διάλυσης του δείγµατος. Ακολούθησε προσθήκη 1 ml κορεσµένου διαλύµατος ιωδιούχου καλίου και ακολούθησε ανάδευση για 1 min ακριβώς, και παραµονή στο σκοτάδι για 5 min. Aµέσως µετά προστέθηκαν 30,0 ml απιονισµένου νερού, 1 ml δείκτη αµύλου και τιτλοδοτήθηκε το δείγµα µε 0,002 Ν θειοθειϊκού νατρίου µέχρι να εξαφανιστεί το µπλε χρώµα. Για µεγαλύτερη ακρίβεια, έγινε ο προσδιορισµός και σε τυφλό δείγµα. Ο αριθµός υπεροξειδίων (meq υπεροξειδίων/1000 g δείγµατος) δίνεται από τον τύπο: (S-B) N 1000 / m (9) 53

74 Όπου Β, ο όγκος σε ml του θειοθειικού νατρίου που έχει καταναλωθεί για το τυφλό, S, ο όγκος σε ml του θειοθειικού νατρίου που έχει καταναλωθεί για το δείγµα, Ν, η κανονικότητα του διαλύµατος θειοθειικού νατρίου και m, το βάρος του δείγµατος σε g (CV% = 2,4%, n=5) Εκτίµηση της οξειδωτικής σταθερότητας του ελαίου στις κρέµες των ελαιοσωµάτων. Η πορεία της αυτοξείδωσης παρακολουθήθηκε µετά από τοποθέτηση ορισµένης ποσότητας κρέµας ελαιοσωµάτων µε συγκέντρωση ελαίου 20% σε ειδικά φιαλίδια µε πώµα σε ράφι του εργαστηρίου, στους 25 ο C. Ο αριθµός υπεροξειδίου µετρήθηκε για ένα µήνα, ανά 10 µέρες µε την ιωδιοµετρική µέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο , αλλά και µε τη µέθοδο του θειοκυανικού σιδήρου (ferric thiocyanate method) (Shantha & Decker, 1994) και την τροποποίησή της (Mancuso, McClements, & Decker, 2000). Ορισµένη ποσότητα κρέµας ελαιοσωµάτων διασπάρθηκε σε απιονισµένο νερό, ώστε η τελική συγκέντρωση σε έλαιο να είναι 10% και 0,2 ml του παραγόµενου γαλακτώµατος αναµίχθηκαν µε 9,8 ml µίγµατος ισοοκτανίου/2-ισοπρονανόλης και το δείγµα αναδεύτηκε σε vortex για 2-4 s. Ακολούθησε προσθήκη 50 µl διαλύµατος θειοκυανικού αµµωνίου, ανάµειξη για 2-4 s και προσθήκη στη συνέχεια 50 µl διχλωριούχου σιδήρου µε νέα ανάµιξη. Μετά την παρέλευση 5 min µετρήθηκε η απορρόφηση του διαλύµατος στα 510 nm. Οι µετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Σε κάθε σειρά µετρήσεων πραγµατοποιήθηκε και λευκός προσδιορισµός. Η ποσοτική έκφραση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη βοήθεια καµπύλης αναφοράς µε υπεροξείδιο κουµενίου. Για την κατασκευή της χρησιµοποιήθηκαν διαλύµατα κουµενίου διαφορετικής συγκέντρωση και 0,2 ml του κάθε διαλύµατος, αναµείχθηκαν µε 9,8 ml µίγµατος ισοοκτανίου/2-ισοπρονανόλης ώστε η τελική συγκέντρωση του κουµενίου να είναι από 2,5 έως 20 µμ. Τα διαλύµατα του διχλωριούχου σιδήρου και θειοκυανικού αµµωνίου που χρησιµοποιήθηκαν, παρασκευάθηκαν ως εξής: α). ιάλυµα διχλωριούχου σιδήρου: 0,08 g διχλωριούχου βαρίου ζυγίστηκαν και µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml που συµπληρώθηκε µε νερό µέχρι τη χαραγή ( ιάλυµα Α). 0,1 g θειικού σιδήρου ζυγίστηκαν και µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml που συµπληρώθηκε µε νερό µέχρι τη χαραγή ( ιάλυµα Β). Το ιάλυµα Α προστέθηκε 54

75 αργά και µε ανάδευση στο ιάλυµα Β. Στη συνέχεια προστέθηκαν 0,4 ml 10 N υδροχλωρικού οξέος. Μετά από παραµονή το υπερκείµενο υγρό διαχωρίστηκε µε σιφώνιο από το θειικό βάριο που καταβυθίστηκε. β) ιάλυµα θειοκυανικού αµµωνίου: 3 g θειοκυανικού αµµωνίου ζυγίστηκαν και µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 10 ml που συµπληρώθηκε µε νερό µέχρι τη χαραγή Παρατήρηση του φύτρου αραβοσίτου µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο σάρωσης (cryo- SEM). Μέρος του φύτρου αραβοσίτου, τοποθετήθηκε σε ειδική βάση και επικολλήθηκε µε χρήση ειδικής κόλλας άνθρακα (Leit- C, Neubauer Chemicalien, Germany) και στη συνέχεια ψύχθηκε µε τη χρήση υγρού αζώτου. Το δείγµα τοποθετήθηκε στη συνέχεια σε µεγαλύτερη βάση (Leica) ώστε να βρίσκεται συνεχώς υπό ψύξη µε τη βοήθεια υγρού αζώτου. Η ειδική βάση ψύχθηκε στη συνέχεια στους -93 C στην ειδική συσκευή προετοιµασίας του δείγµατος, όπου και τεµαχίστηκε σε µικρότερα µέρη και αποξηράνθηκε για 23 min στους - 93 C στα 1,3 x 10-6 m bar. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε ειδική µεµβράνη πάχους 4 nm (Tungsten), η οποία διατηρούταν στην ίδια θερµοκρασία και τοποθετήθηκε στο πεδίο εκποµπής του µικροσκοπίου σάρωσης στους -122 C στα 4 x 10-7 m-bar. Η ανάλυση έλαβε χώρα µε εκποµπή ηλεκτρονίων στα 2 kv, 13 pa. Όλες οι εικόνες καταγράφηκαν ψηφιακά Στατιστική ανάλυση. Όλα τα πειράµατα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και στα αποτελέσµατα έγινε στατιστική επεξεργασία µε One-Way ANOVA, µε τη βοήθεια λογισµικού SPSS v.8.0. Το επίπεδο εµπιστοσύνης ήταν 95%. Οι στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων διαπιστώθηκαν µε τη µέθοδο LSD. 55

76 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 3.1. Παρατήρηση των ελαιοσωµάτων στο φύτρο αραβοσίτου, µε ειδικό µικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης α β γ δ Σχήµα 3.1. Φωτογραφία φύτρου αραβοσίτου µετά από ενυδάτωση για 1 ηµέρα (α), για 2 ηµέρες (β), και ηλιόσπορου µετά από ενυδάτωση για 1 ώρα µε µεγέθυνση 7000 φορές (γ) και φορές (δ), µε ηλεκτρονική µικροσκοπία σάρωσης (cryo-sem). 56

77 Η παρατήρηση των ελαιοσωµάτων του φύτρου αραβοσίτου επιλέχτηκε να γίνει µε το συγκεκριµένο µικροσκόπιο, σε πολύ χαµηλή θερµοκρασία, γιατί δεν απαιτείται καµιά άλλη κατεργασία, οπότε µειώνεται η πιθανότητα µεταβολών στο δείγµα, κυρίως συγχωνεύσεων ανάµεσα στα ελαιοσώµατα, µε αποτέλεσµα αυτά να εµφανίζουν µεγαλύτερο σχετικά µέγεθος σε σχέση µε το πραγµατικό. Στη βιβλιογραφία χρησιµοποιείται συνήθως µία διαφορετική τεχνική, η οποία απαιτεί είτε θέρµανση του δείγµατος, κατά την προκατεργασία, ή εφαρµογή υψηλών πιέσεων (Lu et al., 2010, Wu, et al., 2010). Η ευκρίνεια του συγκεκριµένου οργάνου είναι καλύτερη όταν το δείγµα έχει αυξηµένη υγρασία, οπότε το φύτρο του αραβοσίτου, το οποίο αρχικά είχε υγρασία 7% w/w, ενυδατώθηκε για 1 ηµέρα Σχήµα 3.1 (α) και στη συνέχεια για 2 ηµέρες Σχήµα 3.1 (β). Στις εικόνες µπορεί να παρατηρήσει κανείς ένα κύτταρο του ιστού του φύτρου αραβοσίτου, µέσα στο οποίο βρίσκονται τα ελαιοσώµατα, τα οποία εµφανίζονται µε πιο σκούρο χρώµα. Στο Σχήµα 3.1 (α) είναι δύσκολο να ξεχωρίσει κανείς τη διεπιφάνεια µεταξύ των γειτονικών ελαιοσωµάτων, γεγονός που πιθανώς να οφείλεται στην µικρή περιεκτικότητα σε υγρασία. Όταν το δείγµα ενυδατώθηκε και για δεύτερη ηµέρα, τα διαφορετικά ελαιοσώµατα άρχισαν να ξεχωρίζουν (Σχήµα 3.1.β). Για να ενισχυθεί η υπόθεση της επίδρασης της υγρασίας, έγινε προσπάθεια παρατήρησης των ελαιοσωµάτων και σε µία πρώτη ύλη ελαιοσωµάτων µε µεγαλύτερη συγκέντρωση σε υγρασία, όπως ο ηλιόσπορος (Σχήµα 3.1.γ). Στην εικόνα αυτή είναι περισσότερο διακριτή η διεπιφάνεια µεταξύ των ελαιοσωµάτων, ακόµα και µετά από ενυδάτωση για µία µόνο ώρα, κάτι που γίνεται περισσότερο αντιληπτό µε αύξηση της ανάλυσης (Σχήµα 3.1.δ). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το µέγεθος των ελαιοσωµάτων του φύτρου του αραβοσίτου είναι πολύ µικρότερο από αυτό των ελαιοσωµάτων του ηλιόσπορου Υδατική εκχύλιση των ελαιοσωµάτων από το φύτρο. Ορισµένες από τις παραµέτρους που είναι πιθανό να επηρεάσουν την απόδοση της υδατικής εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρο είναι η αναλογία διαλύτη/υποστρώµατος, ο βαθµός άλεσης του φύτρου, ο χρόνος εκχύλισης, ο αριθµός των εκχυλίσεων, η ένταση της µηχανικής ανάµιξης, και, τέλος, οι φυσικοχηµικές συνθήκες της εκχύλισης (ph, παρουσία αλάτων, θερµοκρασία κλπ). Από τα αποτελέσµατα προκαταρκτικών δοκιµών προέκυψε ότι ο βαθµός άλεσης του φύτρου, η τιµή του ph και ο αριθµός των διαδοχικών εκχυλίσεων είχαν την 57

78 µεγαλύτερη επίδραση στην απόδοση της εκχύλισης και για το λόγο αυτό µελετήθηκαν στη συνέχεια πιο διεξοδικά. Ο υπολογισµός της απόδοσης της εκχύλισης έγινε έµµεσα, µε βάση τη διαφορά του λίπους που παρέµενε στο φύτρο στο τέλος κάθε σταδίου της εκχύλισης από το αρχικό λίπος του φύτρου. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, και οι τρείς παράµετροι που επιλέχθηκαν για µελέτη είχαν µια σηµαντική επίδραση στην απόδοση της εκχύλισης των ελαιοσωµάτων. Ο συνδυασµός των παραµέτρων που είχε την µικρότερη απόδοση ήταν η εκχύλιση του φύτρου ως είχε, χωρίς δηλαδή να έχει προηγηθεί άλεση, η ρύθµιση της τιµής του ph στο 3, και η εφαρµογή ενός µόνο σταδίου εκχύλισης. Ο συνδυασµός αυτός είχε ως αποτέλεσµα την παραλαβή από το φύτρο µόνο του 56,8% w/w του λίπους. Αντίθετα, η µεγαλύτερη απόδοση που παρατηρήθηκε ήταν 95,3% w/w και επιτεύχθηκε µε την εφαρµογή τριών διαδοχικών κύκλων εκχύλισης σε άλευρο φύτρου µε µέγεθος σωµατιδίων µικρότερο από 0,8 mm, και τιµή ph 9. Η σηµαντική επίδραση που είχε ο βαθµός άλεσης του φύτρου στην απόδοση, οφείλεται προφανώς στην µεγάλη αύξηση κατά την άλεση της επιφάνειας των στερεών σωµατιδίων του φύτρου που έρχονται σε επαφή µε το υδατικό µέσο εκχύλισης. Μεγαλύτερη επιφάνεια σηµαίνει αύξηση της πιθανότητας του υδατικού µέσου να έρθει σε επαφή µε τα ελαιοσώµατα και συνεπώς µεγαλύτερη πιθανότητα µετακίνησής τους προς την υδατική φάση, λόγω διαλυτοποίησης της υδρόφιλης επιφάνειάς τους στο νερό. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του Πίνακα 3.1, φαίνεται ότι ο βαθµός άλεσης του φύτρου είναι ο παράγοντας που επηρεάζει περισσότερο την απόδοση της εκχύλισης, σε σχέση µε την τιµή του ph ή τον αριθµό των διαδοχικών εκχυλίσεων που εφαρµόζονται. Μάλιστα, όταν το µέγεθος των κόκκων του αλεύρου ήταν µικρότερο των 0,8 mm, η απόδοση της εκχύλισης ήταν πολύ µεγάλη, ειδικά για την περίπτωση συγκεκριµένων συνδυασµών τιµών ph και αριθµού εκχυλίσεων. Σε αυτό το σηµείο θα πρέπει να τονιστεί ότι η εφαρµογή ενός ακόµα µεγαλύτερου βαθµού άλεσης στο φύτρο παρατηρήθηκε ότι έχει αρνητικές επιπτώσεις στο εκχύλισµα των ελαιοσωµάτων. Πιο συγκεκριµένα, στην περίπτωση του πολύ αλεσµένου φύτρου παρατηρήθηκε µία ανεπιθύµητη αύξηση του µεγέθους των ελαιοσωµάτων στο εκχύλισµα που παραλαµβάνονταν η οποία είναι πολύ πιθανό να σχετιζόταν µε την µερική καταστροφή της προστατευτικής µεµβράνης που απαντά στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων, λόγω των τριβών που αναπτύσσονται κατά την άλεση και την συνακόλουθη αύξηση της θερµοκρασίας. 58

79 Πίνακας 3.1. Επίδραση του βαθµού άλεσης, της τιµής ph και του αριθµού των διαδοχικών εκχυλίσεων στην απόδοση της µεθόδου της υδατικής εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρο. sample ph number of extractions Yield (%)* a 67.6 c,d f,g Whole germ b,c 80.1 f,g g,h,i c,d,e 77.6 f h,i,j a,b 70.9 d,e g,h Germ flour (> 0.8 mm) d,e 84.8 g,h,i,j 87.4 h,i,j,k f 86.5 h,i,j j,k,l b,c 73.3 e i,j,k,l Germ flour (< 0.8 mm) f,g 89.1 j,k,l 91.6 k,l f,g 92.6 l,m m *Οι εκθέτες της στήλης αφορούν τιµές που διαφέρουν σηµαντικά σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95% (p=0.05). 59

80 Οι πιθανές µεταβολές στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων αναµένεται, στη συνέχεια, να οδηγήσουν σε συγχώνευσή τους όταν βρεθούν στο νερό και αρχίσουν να συγκρούονται µεταξύ τους, είτε στο στάδιο της παραλαβής τους από το υπόστρωµα ή κατά την εφαρµογή της φυγοκέντρησης που απαιτείται για την αποµάκρυνση ξένων σωµάτων και την παραλαβή της κρέµας. Για το λόγο αυτό, προσδιοριζόταν το µέγεθος των ελαιοσωµάτων στα διάφορα εκχυλίσµατα που παραλαµβάνονταν µε βάση τους παραπάνω συνδυασµούς των παραµέτρων της εκχύλισης προκειµένου να διαπιστωθεί ότι δεν υπήρχαν αξιοσηµείωτες διαφορές µεταξύ των γαλακτωµάτων όσον αφορά το µέγεθος των σταγονιδίων τους. Αναφορικά µε την τιµή του ph εκχύλισης, η µεγαλύτερη απόδοση παρατηρήθηκε σε τιµή ph 9 ενώ η µικρότερη σε τιµή ph 3, ανεξάρτητα από τον βαθµό άλεσης ή τον αριθµό των διαδοχικών εκχυλίσεων που εφαρµόζονταν. Σύµφωνα µε τους Tzen και συνεργάτες (1992), η επιφάνεια των ελαιοσωµάτων που παραλαµβάνονται από το φύτρο αραβοσίτου φέρει µικρότερο συνολικό ηλεκτρικό φορτίο σε τιµές ph κοντά στο 6. Για το λόγο αυτό η απόδοση της εκχύλισης στο ph 6 αναµενόταν να είναι µικρότερη σε σχέση µε αυτήν σε τιµή ph 3, κάτι όµως που δεν παρατηρήθηκε. Αντίθετα, η απόδοση της µεθόδου εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρο φαίνεται, σύµφωνα µε τα δεδοµένα του Πίνακα 1, ότι ήταν σε γενικές γραµµές σηµαντικά µεγαλύτερη σε ασθενώς όξινες παρά σε όξινες συνθήκες εκχύλισης. Το φαινόµενο αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην αλληλεπίδραση των επιφανειακών πρωτεϊνών των ελαιοσωµάτων µε άλλες πρωτεΐνες που συνεκχυλίζονται από το φύτρο µε αποτέλεσµα την πιθανή µεταβολή του τελικού επιφανειακού ηλεκτρικού φορτίου της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων. Αναφορικά µε την επίδραση του αριθµού των διαδοχικών εκχυλίσεων στην απόδοση της µεθόδου, διαπιστώθηκε ότι ο αριθµός των διαδοχικών εκχυλίσεων εµφάνισε τη µεγαλύτερη επίδρασή του όταν η τιµή του ph ρυθµίζονταν στην όξινη περιοχή. Αντίθετα, σε τιµές ph 6 ή 9, ειδικά όταν είχε προηγηθεί εκτεταµένη άλεση του φύτρου (<0,8mm), ο αριθµός των διαδοχικών εκχυλίσεων είχε µικρότερη επίδραση στην απόδοση της εκχύλισης των ελαιοσωµάτων. Με βάση τα παραπάνω προκύπτει ως συµπέρασµα ότι ο συνδυασµός των παραµέτρων που οδηγεί σε µεγαλύτερη απόδοση εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το φύτρο αραβοσίτου ήταν: κατάτµηση του φύτρου προς άλευρο µε µέγεθος κόκκων µικρότερου των 800 µm και εφαρµογή τριών διαδοχικών εκχυλίσεων σε τιµή ph κοντά στο 9. Τα δεδοµένα αυτά 60

81 αξιοποιήθηκαν στη συνέχεια σε όλες τις εκχυλίσεις των ελαιοσωµάτων του φύτρου που ακολούθησαν µε στόχο τη µελέτη των φυσικοχηµικών τους ιδιοτήτων και την αξιοποίησή τους στην παρασκευή γαλακτωµάτων Παραλαβή των ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα µε τη µορφή κρέµας. Για την παραλαβή των ελαιοσωµάτων από το µητρικό εκχύλισµα εφαρµόστηκαν δύο µέθοδοι. Και οι δύο βασίζονταν στην αποκορύφωση των ελαιοσωµάτων και στην παραλαβή τους µε τη µορφή κρέµας. Η πρώτη µέθοδος αναπτύχθηκε από το εργαστήριό µας και περιλάµβανε την ισοηλεκτρική συσσωµάτωση των πρωτεϊνών του εκχυλίσµατος και των ελαιοσωµάτων και την αποκορύφωση στη συνέχεια των ελαιοσωµάτων µε φυγοκέντρηση (Partal et al., 1999). Η δεύτερη µέθοδος παραλαβής εφαρµόζεται ευρύτατα από τους ερευνητές και βασίζεται στην φυγοκέντρηση του εκχυλίσµατος µετά την προσθήκη σακχαρόζης που επιτρέπει την αποκορύφωση των µικρού µεγέθους ελαιοσωµάτων λόγω της αύξησης της διαφοράς των πυκνοτήτων ανάµεσα στις δύο φάσεις του γαλακτώµατος (Partal et al., 1999). Η συνδυασµένη απόδοση των µεθόδων εκχύλισης και παραλαβής των ελαιοσωµάτων µε τη µορφή κρέµας (κρέµα ΙΣ) που προέκυψε µε την εφαρµογή της πρώτης µεθόδου ήταν 75,5%. Η απώλεια κατά την παραλαβή της κρέµας ενός κλάσµατος των ελαιοσωµάτων του µητρικού εκχυλίσµατος οφείλοταν πιθανότατα στις διαδοχικές πλύσεις της κρέµας µε το νερό και τη ρύθµιση της τιµής του ph στο 5 που ακολουθούσε (Σχ. 3.1). Η απόδοση αυτή είναι από τις µεγαλύτερες που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία (Iwanaga et al., 2007), αφού κατά την εφαρµογή των σταδίων εκχύλισης των ελαιοσωµάτων από το αρχικό υπόστρωµα, της αποµάκρυνσης στη συνέχεια ξένων σωµάτων, και την παραλαβή τους, τέλος, από το εκχύλισµα, αναµένονται σηµαντικές απώλειες. H δεύτερη µέθοδος παραλαβής των ελαιοσωµάτων µε τη µορφή κρέµας (κρέµα Σ) εµφάνισε µικρότερη απόδοση, η οποία ήταν κοντά στο 65%. Η µικρότερη αυτή απόδοση, οφείλεται προφανώς στις µεγαλύτερες απώλειες των ελαιοσωµάτων κατά τις πλύσεις, αφού η µη συσσωµάτωση των ελαιοσωµάτων µε µικρό µέγεθος, όπως συνέβαινε στην προηγούµενη περίπτωση, δεν επέτρεπε την αποκορύφωσή τους κατά την φυγοκέντρηση. Πιθανολογείται ότι η εφαρµογή υψηλότερης ταχύτητας φυγοκέντρησης, θα βελτίωνε την απόδοση. Η Kapchie και συνεργάτες, (2008), ανέφεραν ότι σηµαντική αύξηση της απόδοσης παραλαβής των ελαιοσωµάτων από σπέρµατα σόγιας, στην περίπτωση διάσπασης των 61

82 κυτταρικών τοιχωµάτων του σπέρµατος µε τη βοήθεια µηχανικής ή ενζυµικής κατεργασίας. Όπως αναφέρεται από τους παραπάνω ερευνητές, η επεξεργασία των σπερµάτων µε ένζυµα, σε συνδυασµό µε την εφαρµογή τριών διαδοχικών σταδίων εκχύλισης, είχε ως αποτέλεσµα να επιτευχθεί απόδοση 84,6%, ενώ µε εφαρµογή της συµβατικής µεθόδου παραλήφθηκε µόνο το 45% του συνολικού ελαίου της σόγιας. Στην εργασία αυτή όµως, δεν αναφέρεται αν η επεξεργασία µε ένζυµα, οδήγησε και σε µία ανεπιθύµητη αύξηση του µέσου µεγέθους των ελαιοσωµάτων, που θα είχε ως αποτέλεσµα την αποσταθεροποίηση του γαλακτώµατος των ελαιοσωµάτων κατά την αποθήκευση ή την επεξεργασία Σύσταση και φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ Η σύσταση της κρέµας που παραλήφθηκε από το υδατικό εκχύλισµα των ελαιοσωµάτων µε τη µέθοδο της ισοηλεκτρικής συσσωµάτωσης ήταν: υγρασία 65,2% w/w, λίπος 26,2% w/w και ολική πρωτεΐνη (Ν x 5,7) 6,2% w/w. Η αναλογία της µάζας λίπους προς πρωτεΐνη ήταν περίπου 5:1, µία τιµή που είναι σχεδόν παρόµοια µε αυτήν της κρέµας ελαιοσωµάτων που παραλήφθηκε από σπέρµατα σόγιας µε εφαρµογή της συµβατικής µεθόδου ανάκτησης των ελαιοσωµάτων δηλαδή µε προσθήκη σακχαρόζης στο εκχύλισµα των ελαιοσωµάτων και φυγοκέντρηση (Iwanaga et al., 2007). Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία (Tzen et al., 1993), η περιεκτικότητα των ελαιοσωµάτων σε ελαιοσίνη, που αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη της επιφανειακής τους µεµβράνης, κυµαίνεται από 1,5 έως 3,5%, ανάλογα µε την πηγή παραλαβής. Πιο συγκεκριµένα, η ελαιοσίνη στα ελαιοσώµατα που προέρχονται από φύτρο αραβοσίτου αποτελεί το 1,5% περίπου του συνολικού τους βάρους, ενώ στα ελαιοσώµατα από ηλιόσπορους η συγκέντρωση της ελαιοσίνης είναι πολύ µεγαλύτερη (περίπου 8%). Οι µεγάλες διαφορές που αναφέρονται για τη συγκέντρωση της ελαιοσίνης αλλά και αυτήν της συνολικής πρωτεΐνης των ελαιοσωµάτων που παραλαµβάνονται από διαφορετικές πηγές είναι πολύ πιθανό να οφείλονται στην συνεκχύλιση µαζί µε τα ελαιοσώµατα και µέρους των αποθηκευτικών πρωτεϊνών. Οι τελευταίες ενώ απαντούν σε διαφορετικές περιοχές στο εσωτερικό των ελαιούχων πρώτων υλών σε σχέση µε τα ελαιοσώµατα, και εποµένως αποκλείεται η µεταξύ τους επαφή, είναι δυνατό όταν βρεθούν στο νερό να αλληλεπιδράσουν µε την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων και να παραληφθούν µε την κρέµα. 62

83 Σχήµα 3.2. Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE των πρωτεϊνών της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ (διαδροµή 1) και ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 2) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας. Στο Σχήµα 3.2 δίνεται το ηλεκτροφόρηµα του πρωτεϊνικού κλάσµατος της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ. Οι πρωτεΐνες που αντιστοιχούν σε µοριακά βάρη των 16 και 17 kda, είναι πιθανώς ελαιοσίνες που αποτελούν ενδογενή συστατικά της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων. Από το ηλεκτροφόρηµα προκύπτει επίσης ότι στην κρέµα των ελαιοσωµάτων απαντούν και ορισµένες άλλες πρωτεΐνες µε µοριακό βάρος αρκετά µεγαλύτερο από αυτό της ελαιοσίνης. Σύµφωνα µε την ανάλυση του ηλεκτροφορήµατος µε ειδικό πρόγραµµα που υπολογίζει τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης µε βάση την πυκνότητα της κάθε ζώνης, οι ελαιοσίνες αποτελούν το 37% περίπου των πρωτεϊνών της κρέµας των ελαιοσωµάτων. Οι άλλες πρωτεΐνες µε µοριακό βάρος που κυµαίνεται από 23 µέχρι 67 kda είναι πιθανό να αντιστοιχούν σε αλβουµίνες και γλοβουλίνες του φύτρου του αραβοσίτου (Bajaj, 1994) και συνεκχυλίζονται µε τα ελαιοσώµατα. Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία (Parris, et al., 2006), οι πρωτεΐνες αυτές που διαλυτοποιούνται σε αλκαλικό περιβάλλον, αποτελούν το 25% περίπου των συνολικών πρωτεϊνών του φύτρου του αραβοσίτου και ανήκουν στην οµάδα των γλουτελινών. Στο φύτρο αραβοσίτου απαντώνται επίσης και πρωτεΐνες που ανήκουν στην οµάδα των προλαµινών 63

84 (ζεΐνη), οι οποίες όµως είναι διαλύτες στο νερό µόνο παρουσία αλκοόλης, και εποµένως δεν αναµένεται να συνεκχυλιστούν µε τα ελαιοσώµατα και τις διαλυτές στο αλκαλικό περιβάλλον πρωτεΐνες του φύτρου. Η απουσία ζωνών στο ηλεκτροφόρηµα που αντιστοιχούν στις υπόλοιπες πρωτεΐνες της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων εκτός της ελαιοσίνης, δηλαδή της καλαιοσίνης και της στερελαιοσίνης οφείλεται προφανώς στο γεγονός ότι απαντούν σε πολύ µικρή συγκέντρωση και επικαλύπτονται στο ηλεκτροφόρηµα από εξωγενείς πρωτεΐνες µε παρόµοια µοριακά βάρη. Οι εξωγενείς πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην κρέµα ΙΣ είναι πολύ πιθανό να είναι στενά συνδεδεµένες µε την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων µε αποτέλεσµα να επηρεάζουν τις φυσικοχηµικές τους ιδιότητες. Όγκος % ,01 0,10 1,00 10,00 100, ,00 Μέγεθος σταγονιδίων (µm) Σχήµα 3.3. Επίδραση της αποθήκευσης της κρέµας ΙΣ στην κατανοµή του µεγέθους των ελαιοσωµάτων. ( ) Κρέµα ΙΣ µετά από αποθήκευση για 1 ηµέρα και µηχανική διασπορά σε νερό, ( ) κρέµα ΙΣ µετά από αποθήκευση για µία ηµέρα και διασπορά σε νερό µε εφαρµογή υπερήχων, ( ) κρέµα αποθηκευµένη για 25 ηµέρες και µηχανική διασπορά σε νερό, ( ) κρέµα αποθηκευµένη για 25 ηµέρες και διασπορά σε νερό µε εφαρµογή υπερήχων. Το µέσο µέγεθος (d 3.2 ) των σταγονιδίων που µετρήθηκε στην κρέµα ΙΣ ήταν 0,30 µm. Το ίδιο περίπου µέσο µέγεθος αναφέρεται και για ελαιοσώµατα που εκχυλίστηκαν από σπέρµατα σόγιας (Iwanaga, et al., 2007) ή από ηλιόσπορους (Iwanaga et al., 2007). Από την παρατήρηση της κατανοµής του µεγέθους των σταγονιδίων (Σχήµα 3.3), διαπιστώνεται ότι το µεγαλύτερο 64

85 µέρος των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ εµφάνιζαν µέγεθος ακόµα µικρότερο από τη µέση τιµή ενώ µόνο ένα µικρό σχετικά κλάσµα του συνόλου των ελαιοσωµάτων είχαν µέγεθος κοντά στο 1 µm. ζ-δυναµικό (mv) ph Σχήµα 3.4. Επίδραση της τιµής του ph στο ζ-δυναµικό των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ Στο Σχήµα 3.4, φαίνεται η επίδραση της τιµής του ph στο ζ δυναµικό της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων. Το φορτίο της επιφάνειας προσέγγιζε τη µηδενική του τιµή στην περιοχή τιµών ph µεταξύ του 4,5 και του 5,0, ενώ η τιµή του ζ-δυναµικού ήταν +35 και -40 mv όταν η τιµή του ph ρυθµιζόταν, αντίστοιχα, στο 3 και το 7. Σύµφωνα µε τους Tzen και συνεργάτες (1992), το ζ-δυναµικό των ελαιοσωµάτων από φύτρο αραβοσίτου προσεγγίζει τη µηδενική του τιµή σε µία τιµή ph κοντά στο 6,2. Αντίθετα, σύµφωνα µε τους Iwanaga et al. (2007) η τιµή του ζ-δυναµικού των ελαιοσωµάτων από σπέρµατα σόγιας µηδενίζεται σε τιµές ph µεταξύ του 4,0 και του 4,5. Στην εργασία των Tzen και συνεργάτες (1992), αναφέρεται ότι το επιφανειακό φορτίο των ελαιοσωµάτων είναι δυνατό να επηρεάζεται από την παρουσία φωσφολιπιδίων στη διεπιφάνεια, αλλά και την υδρόλυση των τριακυλογλυκερολών προς λιπαρά οξέα, λόγω της παρουσίας ενζύµων. Επιπλέον, η προέλευση των ελαιοσωµάτων θα πρέπει να επηρεάζει σε κάποιο βαθµό το φορτίο της επιφάνειάς τους. Για να εξηγηθούν όµως οι διαφορετικές τιµές του ζ δυναµικού µε την τιµή του ph που βρέθηκαν στην παρούσα διατριβή, σε σχέση µε τις τιµές που αναφέρονται στις παραπάνω εργασίες, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη και ο σηµαντικός ρόλος που µπορεί να έχει η παρουσία στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων των εξωγενών πρωτεϊνών του ελαιούχου σπέρµατος. Εποµένως, ανάλογα µε τις συνθήκες της εκχύλισης και της παραλαβής 65

86 στη συνέχεια των ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα είναι πολύ πιθανό να διαφοροποιηθεί η σύσταση της επιφάνειάς τους σε πρωτεΐνες λόγω αλληλεπιδράσεων των εξωγενών πρωτεϊνών του εκχυλίσµατος µε τις ενδογενείς επιφανειακές πρωτεΐνες. Η αλληλεπίδραση αυτή και η έµµεση στην ουσία προσρόφηση στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων και άλλων πρωτεϊνών, πέραν αυτών που αποτελούν φυσικά συστατικά της επιφανειακής µεµβράνης, αναµένεται να επηρεάσει το φαινόµενο φορτίο της διεπιφάνειας. Η παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών στην κρέµα µπορεί να ενισχύσει την φυσική τάση των σταγονιδίων του ελαίου να αλληλεπιδρούν και να συσσωµατώνονται κυρίως κατά την αποθήκευση για µεγάλα χρονικά διαστήµατα. Μετά από αποθήκευση της κρέµας για 25 ηµέρες, τα ελαιοσώµατα σχηµάτισαν ισχυρά συσσωµατώµατα, τα οποία διατηρούνταν ακόµα και µετά την προσθήκη SDS και µηχανική ανάδευση στις 1400 rpm για 3 ώρες. Οι τιµές των µέσων διαµέτρων d 3.2 και d 4.3 παρουσίασαν µία µεγάλη αύξηση κατά τη διάρκεια των πρώτων 5 ηµερών αποθήκευσης, ενώ στη συνέχεια ο ρυθµός της αύξησης επιβραδύνθηκε (Σχήµα 3.5). d4,3 (µm) d3,2 (µm) t (Ηµέρες) Σχήµα 3.5. Μεταβολή κατά την αποθήκευση, των τιµών των µέσων διαµέτρων d 3,2 ( ) και d 4,3 ( ) των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ. Η συσσωµάτωση που παρατηρήθηκε ήταν προφανώς το αποτέλεσµα της ρύθµισης της τιµής του ph του εκχυλίσµατος των ελαιοσωµάτων σε τιµή κοντά στο 5 προκειµένου να διευκολυνθεί η παραλαβή τους µε τη µορφή κρέµας. Στην τιµή αυτή ph, το επιφανειακό 66

87 ηλεκτρικό φορτίο της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων είναι πολύ περιορισµένο µε αποτέλεσµα την προσέγγιση των ελαιοσωµάτων και την αλληλεπίδραση µεταξύ των επιφανειακών τους µεµβρανών που ήταν επόµενο να οδηγήσει στην εµφάνιση συσσωµατωµάτων µεγάλου µεγέθους (McClements, 2005). Η αλληλεπίδραση των ελαιοσωµάτων και η παραµονή τους σε άµεση επαφή για µεγάλο χρονικό διάστηµα είναι δυνατό να επιταχύνει και τα φαινόµενα συγχώνευσης δηλαδή τη µετατροπή των ελαιοσωµάτων σε σταγονίδια ελαίου µε µεγαλύτερο µέγεθος. Όπως φαίνεται όµως, στο Σχήµα 3.3, µετά από εφαρµογή υπέρηχων σε αιώρηµα στο νερό των ελαιοσωµάτων της κρέµας που αποθηκεύτηκε για µεγάλο χρονικό διάστηµα, η κατανοµή του µεγέθους των ελαιοσωµάτων ήταν παρόµοια µε αυτήν που αντιστοιχούσε σε αιώρηµα κρέµας ελαιοσωµάτων µετά από αποθήκευση µίας µόνον ηµέρας, η δε τιµή της µέσης διαµέτρου d 3,2 που προσδιορίστηκε ήταν 0,305 µm (η αντίστοιχη τιµή για το νωπή κρέµα ήταν 0,30 µm). Τα αποτελέσµατα αυτά δείχνουν ότι τα ελαιοσώµατα της κρέµας ΙΣ ήταν πολύ σταθερά ως προς τη συγχώνευση παρά το γεγονός ότι το ηλεκτρικό φορτίο που φέρουν στην επιφάνειά τους είναι πολύ περιορισµένο µε αποτέλεσµα να αλληλεπιδρούν πολύ έντονα µεταξύ τους σχεδόν σε όλη τη διάρκεια της αποθήκευσής τους. Η σταθερότητα αυτή προφανώς συνδέεται µε τις µηχανικές ιδιότητες και το πάχος της επιφανειακής µεµβράνης που αποτελείται σε πρώτο επίπεδο από τις ελαιοσίνες και τα φωσφολιπίδια, και σε ένα δεύτερο από εξωγενείς πρωτεΐνες του φύτρου που επικαλύπτουν την αρχική φυσική µεµβράνη των ελαιοσωµάτων, µέσω αλληλεπιδράσεων µε τα συστατικά της πρωτογενούς µεµβράνης, συνεισφέροντας µε αυτό τον τρόπο στη σταθερότητά τους. Λαµβάνοντας υπόψη ότι η σύσταση επί ξηρού της κρέµας σε έλαιο και πρωτεΐνη είναι, αντίστοιχα, 78 και 18% w/w, και ότι η µέση διάµετρος των µεµονωµένων ελαιοσωµάτων είναι 0,3 µm, υπολογίζεται ότι, µε βάση τους τύπους, (7) και (8), το επιφανειακό πρωτεϊνικό φορτίο είναι περίπου 12 mg/m 2. Στην περίπτωση µιας πρωτεϊνικής µονοµοριακής µεµβράνης το πρωτεϊνικό επιφανειακό φορτίο θα ήταν περίπου 1-2 mg/m 2. Αυτό σηµαίνει ότι ακόµα και στην περίπτωση που όλες οι εξωγενείς πρωτεΐνες που υπήρχαν στην κρέµα δεν ήταν σε επαφή µε την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων, το συνολικό πάχος της επιφανειακής µεµβράνης αναµένεται να είναι αρκετά µεγαλύτερο από αυτό που αντιστοιχεί σε µία µονοµοριακή πρωτεϊνική µεµβράνη. Αν ληφθεί υπόψη και το γεγονός ότι, µετά από πλύσεις των ελαιοσωµάτων της κρέµας µε διάλυµα ουρίας (9 Μ), για να αποµακρυνθούν οι εξωγενείς πρωτεΐνες, τα ελαιοσώµατα ήταν 67

88 πάρα πολύ ασταθή αφού η αποθήκευσή τους για µερικές µόνον ηµέρες, είχε ως αποτέλεσµα το διαχωρισµό των φάσεων και την εµφάνιση µιας ελαιώδους στοιβάδας στην επιφάνεια, µπορεί βάσιµα να υποστηριχθεί ότι η παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών στην κρέµα ΙΣ, ενώ αυµβάλλει στη µείωση της σταθερότητάς τους έναντι της συσσωµάτωσης, δεν επιτρέπει στη συνέχεια την αποσταθεροποίησή τους λόγω συγχώνευσης. Ενδιαφέρον παρουσιάζει και το γεγονός ότι η δοµή της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων, παρουσιάζει πολλές οµοιότητες µε αυτήν της µεµβράνης των σταγονιδίων του ελαίου γαλακτωµάτων που σχηµατίζονται και σταθεροποιούνται µε πρωτεΐνες του κρόκου του αυγού. Πιο συγκεκριµένα, στα γαλακτώµατα αυτά, η διεπιφάνεια αποτελείται από µόρια φωσφολιπιδίων και υδρόφοβων απολιποπρωτεϊνών. Επιπλέον, η επιφανειακή µεµβράνη των σταγονιδίων καλύπτεται και από ένα δεύτερο στρώµα µεγαλύτερου πάχους, το οποίο αποτελείται από λιγότερο επιφανειοδραστικά πρωτεϊνικά µόρια και από πρωτεϊνικά συσσωµατώµατα, τα οποία µπορεί να περιέχουν κολλοειδή σωµατίδια ή σφαιρικές υπερµοριακές δοµές (Lu et al., 2010, Raymundo et al., 1999). Ενώ η κρέµα των ελαιοσωµάτων είχε µία σχετικά χαµηλή περιεκτικότητα σε έλαιο (<30% w/w), και θα αναµενόταν να εµφανίζει µεγάλη αστάθεια ως προς την αποκορύφωση, κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε αφού δεν εντοπίστηκε σε όλη τη διάρκεια της αποθήκευσης κανένα ίχνος ορού στον πυθµένα του δοχείου του δείγµατος. Η µεγάλη σταθερότητα της κρέµας ως προς την αποκορύφωση θα πρέπει να αποδοθεί στην υψηλή συγκέντρωση των εξωγενών πρωτεϊνών στο σύστηµα σε συνδυασµό µε το µειωµένο φορτίο της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων. Όταν η τιµή του ph είναι κοντά στο ισοηλεκτρικό σηµείο, οι πρωτεΐνες τις διεπιφάνειας και οι πρωτεΐνες που σχηµατίζουν ένα στρώµα πάνω από αυτές, αλληλεπιδρούν µε τις πρωτεΐνες των γειτονικών ελαιοσωµάτων και σχηµατίζουν ένα πλέγµα που αποτελείται από τα σταγονίδια και τα µόρια των πρωτεϊνών που απαντούν στη συνεχή φάση. Η αλληλεπίδραση αυτή είναι πολύ πιθανό να οφείλεται σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις οι οποίες είναι πιο ισχυρές από τις απωστικές δυνάµεις µεταξύ των σταγονιδίων, και οδηγούν στο σχηµατισµό ενός δικτύου σταγονιδίων-πρωτεινικών µορίων που αντιστέκεται στη δύναµη της άνωσης που τείνει να ωθεί τα σταγονίδια να κινηθούν προς την επιφάνεια, µη επιτρέποντας µε αυτό τον τρόπο την αποβολή ορού από το σύστηµα και τον διαχωρισµό φάσεων κατά την αποθήκευση. Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν (Wu et al., 2010) και σε µοντέλα εµβάµµατος σαλάτας, τα οποία είχαν σταθεροποιηθεί µε τη χρήση πρωτεϊνών λούπινου. Τα γαλακτώµατα αυτά ήταν πολύ 68

89 σταθερά ως προς την αποκορύφωση, όταν η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο γαλάκτωµα ήταν µεγαλύτερη από ένα όριο. Η συµπεριφορά αυτή εξηγήθηκε µε βάση την υπόθεση ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης τα σταγονίδια αλληλεπιδρούν µεταξύ τους µε τη µεσολάβηση των πρωτεϊνικών µορίων µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός πλέγµατος που αντιστέκεται στην αποκορύφωση Σύσταση και φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά της κρέµας ελαιοσωµάτων Σ. Η εφαρµογή της µεθόδου της ισοηλεκτρικής συσσωµάτωσης για την παραλαβή των ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα, όπως περιγράφτηκε παραπάνω, είχε ως αποτέλεσµα την παραλαβή µαζί µε τα ελαιοσώµατα και ενός µεγάλου µέρους των πρωτεϊνών που συνεκχυλίστηκαν µε το νερό. Σε δεύτερη φάση έγιναν προσπάθειες για την παραλαβή από το εκχύλισµα µόνο των ελαιοσωµάτων χωρίς τις εξωγενείς πρωτεΐνες. Για να επιτευχθεί αυτό, η τιµή του ph του µητρικού γαλακτώµατος διατηρήθηκε στο 9, τιµή στην οποία τα ελαιοσώµατα φέρουν ισχυρό φορτίο και αποφεύγεται η συσσωµάτωσή τους και ο εγκλωβισµός των εξωγενών πρωτεϊνών που παραµένουν στο αρχικό εκχύλισµα. Επειδή, όµως, η παραλαβή των ελαιοσωµάτων στο αλκαλικό περιβάλλον ήταν αδύνατη µε την εφαρµογή φυγοκέντρησης, λόγω του πολύ µικρού µεγέθους τους, προηγήθηκε της φυγοκέντρησης η προσθήκη σακχαρόζης, µε σκοπό την αύξηση της πυκνότητας της συνεχούς φάσης µε συνέπεια την πιο αποτελεσµατικότερη αποκορύφωση των σταγονιδίων. Η υγρασία, το λίπος και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη της κρέµας ελαιοσωµάτων Σ που παραλήφθηκε µε φυγοκέντρηση µετά από προσθήκη σακχαρόζης ήταν, αντίστοιχα, 46,5, 43,8 και 1,6% w/w. Η µεγάλη διαφορά στην περιεκτικότητα της κρέµας Σ σε λίπος σε σχέση µε την κρέµα ΙΣ, µπορεί να αποδοθεί στη µικρότερη περιεκτικότητά της σε πρωτεΐνη, που επέτρεψε στα ελαιοσώµατα να προσεγγίσουν πιο κοντά το ένα µε το άλλο ώστε να προκύψει κατά τη φυγοκέντρηση µία περισσότερο συµπαγής κρέµα. Από την παρατήρηση της σύστασης των δύο τύπων κρέµας που παραλήφθηκαν από το εκχύλισµα µε διαφορετικούς τρόπους, διαπιστώνεται ότι οι κρέµες εµφάνιζαν επίσης µεγάλη διαφορά όσον αφορά στην αναλογία λίπους προς πρωτεΐνη. Πιο συγκεκριµένα, για την κρέµα ΙΣ ο λόγος λίπους/πρωτεΐνης είναι περίπου 3, ενώ για την κρέµα Σ είναι πολύ µεγαλύτερος (περίπου 30). Η πολύ µεγάλη περιεκτικότητα σε 69

90 πρωτεΐνη της κρέµας ΙΣ, όπως έχει ήδη αναφερθεί, οφείλεται στην παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών του φύτρου που συνεκχυλίστηκαν κατά την αλκαλική εκχύλιση και στη συνέχεια παραλήφθηκαν µε τα ελαιοσώµατα κατά την εφαρµογή του σταδίου της ισοηλεκτρικής συσσωµάτωσης. Αντίθετα, όταν η παραλαβή της κρέµας έγινε σε τιµή ph 9 και προσθήκη σακχαρόζης που ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση, το σύνολο των εξωγενών πρωτεϊνών πιθανολογείται ότι παρέµεινε στην υποκείµενη υδατική φάση. Αυτό επιβεβαιώνεται µε παρατήρηση των ηλεκτροφορηµάτων των πρωτεϊνών που παρουσιάζονται στο Σχήµα 3.6. Όπως προκύπτει από το ηλεκτροφόρηµα των πρωτεϊνών της κρέµας Σ, οι διαδοχικές πλύσεις µε διάλυµα σακχαρόζης σε pη 9 στις οποίες υποβλήθηκε η αρχική κρέµα οδήγησαν στην αποµάκρυνση πρακτικά όλων των εξωγενών πρωτεϊνών, ενώ στην τελική κρέµα παρέµειναν κυρίως αυτές που αντιστοιχούν σε µοριακά βάρη που κυµαίνονταν από 15 και 18 kd, δηλαδή οι ελαιοσίνες. Σχήµα 3.6. Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 1) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας, των πρωτεϊνών του φύτρου αραβοσίτου (διαδροµή 2), των πρωτεϊνών της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ (διαδροµή 3), και των πρωτεϊνών της κρέµας ελαιοσωµάτων Σ (διαδροµή 4). Εκτός από τις ελαιοσίνες οι οποίες είναι οι κύριες πρωτεΐνες της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων, στο ηλεκτροφόρηµα παρατηρείται και η παρουσία, σε χαµηλότερη συγκέντρωση, πρωτεϊνών µε µοριακό βάρος περίπου 24 kda, οι οποίες σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία θα πρέπει να αντιστοιχούν στις καλαιοσίνες, καθώς επίσης και πρωτεΐνες µε 70

91 µοριακό βάρος περίπου 50 kda, που αντιστοιχούν στις στερελαιοσίνες. Και οι τρείς αυτές κατηγορίες πρωτεϊνών αποτελούν φυσικά ενδογενή συστατικά της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων όπου και αλληλεπιδρούν στενά µε τα φωσφολιπίδια σχηµατίζοντας µία µικτή προστατευτική µεµβράνη, και για το λόγο αυτό δεν αποµακρύνθηκαν µε τις απλές πλύσεις των ελαιοσωµάτων µε το νερό (Frandsen et al., 2001, Kandhai, 2010, Tzen et al., 1993). Η παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών στην κρέµα ΙΣ, φαίνεται να επηρεάζει σε κάποιο βαθµό το ζ-δυναµικό της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων, αφού όταν οι πρωτεΐνες αυτές απουσίαζαν από την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων Σ το φορτίο της επιφάνειάς τους ήταν µεγαλύτερο (Σχήµα 3.7). Αυτό έχει ως αποτέλεσµα η επιφάνεια των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ να αποκτά µηδενικό συνολικό φορτίο σε υψηλότερη τιµή ph σε σχέση µε την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ. Μία άλλη διαφορά που παρουσίαζαν τα ελαιοσώµατα των κρεµών που παραλήφθηκαν από το µητρικό εκχύλισµα µε τις δύο µεθόδους που εφαρµόστηκαν ήταν το διαφορετικό µέγεθος των σταγονιδίων τους. Πιο συγκεκριµένα, το µέσο µέγεθος των ελαιοσωµάτων, d 3.2, της κρέµας ΙΣ ήταν περίπου 0,45 µm, ενώ η αντίστοιχη µέση τιµή για τα ελαιοσώµατα της κρέµας Σ ήταν κοντά στο 0,79 µm (Σχήµα 3.8). Η µέση διάµετρος, d 3.2, των ελαιοσωµάτων στο µητρικό εκχύλισµα ήταν 0,31 µm, γεγονός που σηµαίνει ότι η παραλαβή µε τη µορφή κρέµας των ελαιοσωµάτων από το εκχύλισµα οδήγησε σε µία αύξηση του µεγέθους τους που προφανώς οφειλόταν στις επαναλαµβανόµενες πλύσεις και φυγοκεντρήσεις που εφαρµόστηκαν κατά την παραλαβή τους και είχαν ως αποτέλεσµα τη µερική συγχώνευσή τους προς µεγαλύτερα. Ο µικρότερος βαθµός συγχώνευσης που παρατηρήθηκε στα σταγονίδια της κρέµας ΙΣ, µπορεί να αποδοθεί στην παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων που τα προστάτεψε έναντι της συγχώνευσης. Μάλιστα, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η κρέµα αυτή φαίνεται να είναι αρκετά σταθερή ακόµα και µετά την αποθήκευσή της για αρκετές µέρες, και όπως υποστηρίχθηκε, φαίνεται ότι η παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών συνεισφέρει στο πάχος της επιφανειακής µεµβράνης, εµποδίζοντας µε αυτό τον τρόπο τα σταγονίδια που έχουν προηγουµένως συσσωµατωθεί να έρθουν πιο κοντά και να συγχωνευθούν. 71

92 α 50 ζ-δυναµικό (mv) ph 50 αβ ζ-δυναµικό (mv) ph Σχήµα 3.7. Επίδραση της τιµής της ενεργού οξύτητας στο ζ-δυναµικό της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ (α) και ΙΣ (β), απουσία (γεµάτα σύµβολα) και παρουσία ξανθάνης (άδεια σύµβολα): ( ) κρέµα Σ, ( ) κρέµα Σ, 0,1% ξανθάνη, ( ) κρέµα ΙΣ, ( ) κρέµα ΙΣ, 0,1% w/w ξανθάνη. Στην περίπτωση της κρέµας Σ, η διεπιφανειακή µεµβράνη έχει πολύ µικρότερο πάχος, και για το λόγο αυτό ο βαθµός της συγχώνευσης των ελαιοσωµάτων κατά την παραλαβή τους από το εκχύλισµα ήταν µεγαλύτερος µε αποτέλεσµα το µέσο µέγεθος των ελαιοσωµάτων στην κρέµα αυτή να είναι µεγαλύτερο σε σχέση µε αυτό των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ. Παρόλα αυτά όµως, η επιφανειακή µεµβράνη που στην περίπτωση της κρέµας Σ αποτελείται µόνο από 72

93 τις φυσικές της πρωτεΐνες και τα φωσφολιπίδια, φαίνεται να είναι αρκετά ισχυρή ώστε να παρεµποδιστεί η εκτεταµένη συγχώνευση των ελαιοσωµάτων. Η αποθήκευση όµως της κρέµας Σ για µερικές µόνο µέρες είχε ως αποτέλεσµα την εµφάνιση στην κρέµα ενός µεγάλου αριθµού σταγονιδίων µε µεγάλο µέγεθος και µέση διάµετρο d 3.2 = 29,1 µm. Η τιµή αυτή είναι αρκετά µεγαλύτερη από την αντίστοιχη µέση διάµετρο που µετρήθηκε για την κρέµα ΙΣ, τα ελαιοσώµατα της οποίας, όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, και όπως φαίνεται και στο Σχήµα 3.8, παρέµειναν αρκετά σταθερά ακόµα και µετά από αποθήκευση για 15 µέρες. Σχήµα 3.8. Φωτογραφίες από µικροσκόπιο και στοιχεία για το µέσο µέγεθος των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ και ΙΣ, µετά την παραλαβή τους και την αποθήκευση. Η διαφορά όσον αφορά τη σταθερότητα των ελαιοσωµάτων στις δύο κρέµες γίνεται περισσότερη αντιληπτή από την παρατήρηση του Σχήµατος 3.9, στο οποίο παρουσιάζονται οι κατανοµές του µεγέθους των ελαιοσωµάτων του µητρικού εκχυλίσµατος των ελαιοσωµάτων και των ελαιοσωµάτων των δύο κρεµών µετά από αποθήκευση για 15 µέρες. Σύµφωνα µε το Σχήµα 3.9, η καµπύλη της κατανοµής µεγέθους των ελαιοσωµάτων της κρέµας έχει µετατοπισθεί σε 73

94 σχέση µε την κατανοµή των σταγονιδίων του φρέσκου αιωρήµατος των ελαιοσωµάτων, προς τα δεξιά. Αν συνδυάσει κανείς τα αποτελέσµατα αυτά µε τη σχετική φωτογραφία του Σχήµατος 3.8 και µε την κατανοµή του µεγέθους των σταγονιδίων του Σχήµατος 3.9, καταλήγει στο συµπέρασµα ότι η µετατόπιση αυτή οφείλεται κυρίως σε συσσωµάτωση των ελαιοσωµάτων και όχι σε συγχώνευσή τους. Όσον αφορά την κρέµα Σ, όπως φαίνεται από τη φωτογραφία του Σχήµατος 3.8, η πολύ µεγαλύτερη µετατόπιση της καµπύλης της κατανοµής µεγέθους των ελαιοσωµάτων προς τα δεξιά θα πρέπει να αποδοθεί όχι µόνον στη συσσωµάτωση αλλά κυρίως στη συγχώνευση των ελαιοσωµάτων που λαµβάνει χώρα κατά την αποθήκευση της συγκεκριµένης κρέµας Όγκος % ,01 0,10 1,00 10,00 100, ,00 Μέγεθος σταγονιδίων (µm) Σχήµα 3.9. Κατανοµή του µεγέθους των ελαιοσωµάτων του αρχικού εκχυλίσµατος ( ) και των ελαιοσωµάτων στις κρέµες ΙΣ ( ) και Σ ( ) µετά από αποθήκευση για 15 ηµέρες. Από τον υπολογισµό του επιφανειακού πρωτεϊνικού φορτίου των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ (Diftis, et al., 2005, Rivas, et al., 1983) διαπιστώνεται ότι αυτό είναι περίπου 4,8 mg/m 2. Η συγκέντρωση αυτή της πρωτεΐνης θα έπρεπε από µόνη της να επαρκούσε για την κάλυψη της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων µε µία µεµβράνη µεγαλύτερου πάχους από αυτό που αντιστοιχεί σε µία µονοµοριακή πρωτεϊνική µεµβράνη (Dickinson, 1999). Η µειωµένη σταθερότητα των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ σε σχέση µε αυτήν των σταγονιδίων ενός γαλακτώµατος που σταθεροποιείται µε κάποια πρωτεΐνη, είναι πιθανό να οφείλεται στο µικρό µέγεθος του µορίου της ελαιοσίνης και στο γεγονός ότι το µόριο της ελαιοσίνης λόγω του µεγάλου υδρόφοβου χαρακτήρα της πρωτεΐνης αυτής εκτείνεται κατά µήκος της επιφάνειας των 74

95 σταγονιδίων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα να απουσιάζουν από την επιφανειακή µεµβράνη εκτεταµένα πολικά τµήµατα του µορίου που θα προεκτείνονταν προς την φάση του νερού και θα συνέβαλαν µε τον τρόπο αυτό στην ενίσχυση των πολυµερικών απωστικών δυνάµεων ανάµεσα σε γειτονικά σταγονίδια µε αποτέλεσµα την παρεµπόδιση της συγχώνευσής τους προς σταγονίδια µεγαλύτερου µεγέθους (McClements, 2004) Φυσικοχηµική σταθερότητα γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται µε αραίωση της κρέµας ελαιοσωµάτων ΙΣ. Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, η κρέµα ελαιοσωµάτων ΙΣ εµφανίζει πολύ µεγάλη σταθερότητα έναντι της αποκορύφωσης παρά την σχετικά χαµηλή περιεκτικότητά της σε ελαιοσώµατα γεγονός που αποδίδεται στην παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών του φύτρου. Με αραίωση της κρέµας µε νερό, παρασκευάστηκαν γαλακτώµατα µε συγκέντρωση ελαίου 5 και 10% w/w, και σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση πολύ µικρότερη σε σχέση µε την αρχική κρέµα (Σχήµα 3.10). 30 Όγκος ορού (%) Χρόνος (ώρες) Σχήµα Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ, µε περιεκτικότητα σε έλαιο 5% w/w (--- ) και 10% w/w ( ), και τιµή ph 6,5 ( ) ή 3,8 ( ). 75

96 Η σταθερότητα των γαλακτωµάτων, όπως αυτή καθορίζεται µε βάση το χρόνο αποθήκευσης που απαιτείται για να εµφανιστούν οι πρώτες ενδείξεις αποβολής ορού από το σύστηµα αλλά και µε βάση το τελικό ύψος του ορού, φαίνεται ότι επηρεάζεται σε κάποιο βαθµό από τη συγκέντρωση του ελαίου αλλά και την τιµή του ph του γαλακτώµατος. Πιο συγκεκριµένα, σε τιµή ph 6,5 απαιτήθηκε χρόνος λίγων µόλις ωρών από την έναρξη της αποθήκευσης για να γίνει αντιληπτή η εµφάνιση ορού στον πυθµένα του περιέκτη. Αντίθετα, σε τιµή ph 3,8, τα γαλακτώµατα εµφάνισαν πολύ µεγαλύτερη σταθερότητα αφού για την εµφάνιση του ορού χρειαζόταν χρόνος αποθήκευσης αρκετών ηµερών. Η αποκορύφωση των σταγονιδίων σε ένα αραιό σχετικά γαλάκτωµα επιταχύνεται όταν τα σταγονίδια αλληλεπιδράσουν µεταξύ τους και σχηµατίσουν συσσωµατώµατα µεγάλου µεγέθους τα οπoία σύµφωνα µε το νόµο του Stokes κινούνται ταχύτερα προς την επιφάνεια σε σχέση µε τα µεµονωµένα σταγονίδια (McClements, 2004). Στην περίπτωση των γαλακτωµάτων των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ η εξήγηση για τη διαφορά που παρατηρείται στην ταχύτητα αποκορύφωσης σε σχέση µε την τιµή του ph θα πρέπει εποµένως να αναζητηθεί στο βαθµό της συσσωµάτωσης που εµφανίζουν τα ελαιοσώµατα στο γαλάκτωµα κατά την αποθήκευση, σε σχέση µε την τιµή του ph και στο ρόλο των εξωγενών πρωτεϊνών. Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, τα αιωρήµατα ελαιοσωµάτων που προέρχονται από διαφορετικές πηγές, και ανεξάρτητα από την παρουσία ή µη εξωγενών πρωτεϊνών, εµφανίζουν µία τάση να συσσωµατωθούν και να αποκορυφωθούν στην ισοηλεκτρική περιοχή τιµών ph των πρωτεϊνών της επιφανείας τους. Για παράδειγµα, τα ελαιοσώµατα που παραλαµβάνονται από ηλιόσπορους και στη συνέχεια πλένονται µε διάλυµα ουρίας για την αποµάκρυνση των εξωγενών πρωτεϊνών του ηλιόσπορου από την επιφάνειά τους, συσσωµατώνονται έντονα σε µία περιοχή τιµών ph µε εύρος από 4,0 έως 6,6 (Fisk et al., 2008, Iwanaga et al., 2008). Σύµφωνα µε τους Iwanaga et al. (2007) η περιοχή αυτή για ελαιοσώµατα που παραλαµβάνονται από σπέρµατα σόγιας είναι ανάµεσα στις τιµές ph 3,0 και 6,0. Η µεγάλη αστάθεια των ελαιοσωµάτων ως προς την αποκορύφωση στη συγκεκριµένη περιοχή τιµών ph εξηγείται µε βάση το µικρό επιφανειακό ηλεκτρικό φορτίο που φέρουν τα ελαιοσώµατα στην επιφάνειά τους και το οποίο δεν επαρκεί για να αποτρέψει τη συσσωµάτωση των ελαιοσωµάτων κατά τις συγκρούσεις που λαµβάνουν χώρα ανάµεσα στα ελαιοσώµατα. Αντίθετα, σε τιµές ph πέραν των ορίων αυτών ή µετά την προσθήκη πηκτίνης, τα µόρια της οποίας αλληλεπιδρούν ηλεκτροστατικά µε την επιφάνεια αυξάνοντας έτσι το 76

97 επιφανειακό ηλεκτρικό της φορτίο, το γαλάκτωµα των ελαιοσωµάτων παρουσίαζε πολύ µεγαλύτερη σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση (Iwanaga et al., 2008). Σύµφωνα µε τα δεδοµένα του ζ δυναµικού (Σχήµα 3.4), το επιφανειακό ηλεκτρικό φορτίο των ελαιοσωµάτων του φύτρου σε τιµή ph 6,5 ήταν µεγαλύτερο σε σχέση µε το φορτίο σε τιµή ph 3,8. Θα αναµενόταν, εποµένως, τα γαλακτώµατα µε ph 6,5 να είναι περισσότερο σταθερά ως προς την αποκορύφωση ή τουλάχιστον να µην εµφανίζουν πολύ µεγαλύτερη αστάθεια σε σχέση µε τα γαλακτώµατα µε ph 3,8, ενώ παρατηρήθηκε ακριβώς το αντίθετο. Η πολύ µικρότερη τάση των ελαιοσωµάτων να συσσωµατώνονται στο όξινο ph από ότι στο ουδέτερο επιβεβαιώνεται και µε την παρατήρηση σύµφωνα µε την οποία ο ορός που διαχωρίστηκε στα γαλακτώµατα µε τιµή ph 3,8 περιείχε µεγάλο ποσοστό µεµονωµένων ελαιοσωµάτων µικρού µεγέθους τα οποία και αποκορυφώνονταν πολύ αργά. Από τα παραπάνω εξάγεται το συµπέρασµα ότι το φορτίο της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων παίζει έναν δευτερεύοντα ρόλο στη σταθεροποίησή τους ως προς τη συσσωµάτωση και την αποκορύφωσή τους στη συνέχεια κατά την αποθήκευση. Πιθανολογείται ότι η αλληλεπίδραση των εξωγενών πρωτεϊνών του φύτρου µε την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων µπορεί να εξαρτάται από την τιµή του ph, µε αποτέλεσµα να επηρεάζεται ανάλογα και η σταθερότητα των ελαιοσωµάτων. Όπως φαίνεται στη συνέχεια η παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών του φύτρου παίζει έναν σηµαντικό ρόλο στη σταθερότητα των ελαιοσωµάτων έναντι της αποκορύφωσης αφού η απουσία τους έχει ως αποτέλεσµα την ταχεία αποκορύφωση των ελαιοσωµάτων ανεξαρτήτως της τιµής του ph Επίδραση της προσθήκης ξανθάνης στη φυσικοχηµική σταθερότητα γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες ΙΣ και Σ. Τα γαλακτώµατα που παρασκευάστηκαν µε βάση τις κρέµες ΙΣ και Σ, µε αραίωσή τους µε απιονισµένο νερό και ρύθµιση της τιµής του ph, είχαν περιεκτικότητα σε έλαιο 5% w/w. Τα γαλακτώµατα µελετήθηκαν ως προς τη σταθερότητά τους κατά την αποθήκευση και µετά την προσθήκη ξανθάνης, ώστε η τελική συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη στο γαλάκτωµα, να είναι 0,1% w/w. Στο ιάγραµµα 3.11.β, φαίνεται ότι τα γαλακτώµατα που παρασκευάστηκαν µε βάση την κρέµα Σ ήταν πολύ ασταθή αφού αποκορυφώθηκαν πολύ γρήγορα κατά την αποθήκευση. 77

98 Πιο συγκεκριµένα, σε όλες τις τιµές ph η αποκορύφωση ξεκίνησε σχεδόν αµέσως µετά την αποθήκευσή των γαλακτωµάτων και ολοκληρώθηκε µετά την πάροδο µερικών µόνον ωρών. Όγκος ορού (%) Χρόνος (ώρες) α Όγκος ορού (%) Χρόνος (ώρες) β Σχήµα Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση γαλακτωµάτων από κρέµα ελαιοσωµάτων Σ (α) και ΙΣ (β), µε περιεκτικότητα σε έλαιο 5% w/w, και επίδραση της τιµής του ph, απουσία (γεµάτα σύµβολα) ή παρουσία (άδεια σύµβολα) ξανθάνης: (, ) ph 3, (, ) ph 4, (, ) ph 5, (, ) ph 6, (γεµάτο x, ανοικτό x) ph 7. Τα γαλακτώµατα που παρασκευάστηκαν µε βάση την κρέµα ΙΣ εµφάνισαν πολύ µικρότερο ρυθµό αποκορύφωσης σε σχέση µε αυτά της κρέµας Σ. Η πολύ µικρότερη 78

99 σταθερότητα των γαλακτωµάτων της κρέµας Σ µπορεί να εξηγηθεί µε βάση την παρουσία στην κρέµα, και εποµένως στο γαλάκτωµα, ελαιοσωµάτων µε µεγαλύτερη µέση διάµετρο σε σχέση µε τα γαλακτώµατα της κρέµας ΙΣ, σε συνδυασµό µε την απουσία από το σύστηµα των εξωγενών πρωτεϊνών του φύτρου οι οποίες εικάζεται ότι συµβάλλουν στη σταθερότητά του. Η µεγάλη επίδραση της τιµής του ph στο βαθµό αποκορύφωσης των γαλακτωµάτων της κρέµας ΙΣ οφείλεται πιθανώς στο ότι τα µόρια των οι εξωγενών πρωτεϊνών, ανάλογα µε το ph του περιβάλλοντος, αλληλεπιδρούν λιγότερο ή περισσότερο µεταξύ τους και µε τις πρωτεΐνες της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων, σχηµατίζοντας έτσι ένα είδος δικτυώµατος που επηρεάζει το ρυθµό µε τον οποίο κινούνται τα σταγονίδια προς την επιφάνεια (Moschakis, et al., 2005). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές οφείλονται κυρίως σε υδρόφοβους δεσµούς, που οδηγούν σε συσσωµάτωση των σταγονιδίων του ελαίου λόγω «γεφύρωσης». Οι δυνάµεις αυτές, σε συνέργεια µε τις ελκτικές δυνάµεις van der Waals ανάµεσα στα σταγονίδια οδηγούν προφανώς στο σχηµατισµό ενός σταθερότερου δικτυώµατος σε σχέση µε αυτό που δηµιουργείται στα γαλακτώµατα της κρέµας Σ (Suárez, 2006). Με την προσθήκη 0,1% w/w ξανθάνης, η σταθερότητα των γαλακτωµάτων της κρέµας Σ ενισχύθηκε σηµαντικά. Η βελτίωση της σταθερότητας των γαλακτωµάτων ήταν συνάρτηση της τιµής του ph, µε το γαλάκτωµα µε ph 6 να εµφανίζει τη µεγαλύτερη σταθερότητα. Στην περίπτωση των γαλακτωµάτων της κρέµας ΙΣ, η παρουσία της ξανθάνης είχε ως αποτέλεσµα την πλήρη σταθεροποίηση των γαλακτωµάτων µε αποτέλεσµα να µην εµφανίζεται ίχνος ορού στο σύστηµα έπειτα από αποθήκευση για πολύ µεγάλο χρονικό διάστηµα, ανεξάρτητα από την τιµή του ph (Σχήµα 3.11.β). Τα διαλύµατα της ξανθάνης παρουσιάζουν ένα αρκετά υψηλό ιξώδες, και µάλιστα σε συγκεντρώσεις στα γαλακτώµατα µεγαλύτερες από 0,1% w/w, ο πολυσακχαρίτης εµφανίζει µία πολύ ισχυρή σταθεροποιητική δράση, εγκλωβίζοντας τα σταγονίδια σε περιοχές µε πολύ µεγάλο ιξώδες (Hankin, et al., 1983, Moschakis, et al., 2005). Σε χαµηλές συγκεντρώσεις, η παρουσία της ξανθάνης είναι δυνατό να οδηγήσει σε αποσταθεροποίηση του γαλακτώµατος λόγω της εµφάνισης του φαινοµένου της οσµωτικής συσσωµάτωσης (Suárez, 2006). Η αποσταθεροποίηση ενός γαλακτώµατος σε αυτή την περίπτωση µπορεί να αποφευχθεί, αν τα µόρια του πολυσακχαρίτη αλληλεπιδράσουν µε τα προσροφηµένα στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου µόρια του γαλακτωµατοποιητή (πχ. µέσω ιοντικών αλληλεπιδράσεων µε τα προσροφηµένα µόρια της πρωτεΐνης). Η σταθερότητα 79

100 του συστήµατος αυξάνεται κυρίως, λόγω της ενίσχυσης των απωστικών πολυµερικών δυνάµεων µεταξύ των γειτονικών σταγονιδίων (McClements, 2005) ιξώδες (mpa.s) , Ρυθµός διάτµησης (s -1 ) Σχήµα Μεταβολή της τιµής του ιξώδους, σε σχέση µε το ρυθµό διάτµησης, γαλακτωµάτων 5% w/w σε έλαιο, µε τιµή ph 6, τα οποία παρασκευάζονται µε κρέµα Σ ( ) και ΙΣ ( ) που περιέχουν ξανθάνη 0,1% w/w, και ενός διαλύµατος ξανθάνης 0,1% w/w (x). 120 ιξώδες (mpa.s) ph Σχήµα Επίδραση της τιµής του ph στο ιξώδες (7,92 s -1 ) γαλακτωµάτων 5% w/w σε έλαιο της κρέµας Σ (µαύρη στήλη) και της κρέµας ΙΣ (γκρι στήλη), που περιέχουν ξανθάνη 0,1% w/w, και η τιµή του ιξώδους ενός διαλύµατος ξανθάνης 0,1% w/w (λευκή στήλη). 80

101 Στο Σχήµα 3.12, δίνονται οι τιµές για το ιξώδες γαλακτωµάτων µε ph 6 που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες Σ και ΙΣ, και περιέχουν ξανθάνη, και για ένα διάλυµα ξανθάνης µε συγκέντρωση 0,1% w/w. Απουσία ξανθάνης, και τα δύο γαλακτώµατα εµφάνισαν Νευτώνεια συµπεριφορά και η πολύ χαµηλή τιµή του ιξώδους τους δεν επέτρεψε τη µέτρησή του µε το ιξωδόµετρο Brookfield. Παρουσία πολυσακχαρίτη, οι τιµές του ιξώδους για τα δύο γαλακτώµατα και το διάλυµα της ξανθάνης ήταν παραπλήσιες. Η παρατήρηση αυτή µπορεί να οδηγήσει στο συµπέρασµα ότι η αύξηση του ιξώδους του γαλακτώµατος µε την προσθήκη του πολυσακχαρίτη, σε βαθµό που µπορεί να πραγµατοποιηθεί η µέτρησή του µε το ιξωδόµετρο, θα πρέπει να συνδέεται µε παρουσία των µορίων της ξανθάνης που σχηµατίζουν ένα ασθενές δίκτυο, η συνέχεια του οποίου δεν διακόπτεται από την παρουσία των ελαιοσωµάτων. Στο Σχήµα 3.13 παρουσιάζεται η επίδραση της τιµής του ph στο ιξώδες των γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται µε βάση τις δύο κρέµες, και µε συγκέντρωση ξανθάνης 0,1% w/w, καθώς επίσης και ενός διαλύµατος ξανθάνης 0,1% w/w. Σε τιµή ph 6 και 7, η τιµή του ιξώδους του γαλακτώµατος της κρέµας Σ διέφερε σε κάποιο βαθµό από αυτήν του γαλακτώµατος της κρέµας ΙΣ, αλλά και του ιξώδους του διαλύµατος της ξανθάνης, ήταν όµως της ίδιας τάξης µεγέθους. Σε τιµή ph 5 ή χαµηλότερη, η τιµή του ιξώδους των γαλακτωµάτων µειώθηκε δραµατικά, και βρέθηκε έξω από το εύρος µετρήσεων του οργάνου µε αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή η µέτρησή του. Στο όξινο περιβάλλον είναι πιθανό να µην ήταν δυνατή η πλήρης ανάπτυξη του δικτύου της ξανθάνης στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος, επειδή παρεµποδιζόταν από την παρουσία των ελαιοσωµάτων, χωρίς όµως να επηρεάζεται αρνητικά η σταθερότητα του γαλακτώµατος ως προς την αποκορύφωση, η οποία από ότι φαίνεται δεν σχετίζεται άµεσα µε το ιξώδες του συστήµατος (Σχήµα 3.11). Επίσης, όπως ήταν αναµενόµενο, η µεταβολή της τιµής του ph δεν είχε καµία επίδραση στο ιξώδες του διαλύµατος της ξανθάνης. Στο Σχήµα 3.7, φαίνεται η επίδραση της ξανθάνης στην τιµή του ζ-δυναµικού των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ. Ενώ σε τιµές ph µικρότερες του 5 η επιφάνεια των ελαιοσωµάτων έφερε θετικό φορτίο, η προσθήκη της ξανθάνης, είχε ως αποτέλεσµα την αντιστροφή του ηλεκτρικού φορτίου από θετικό σε αρνητικό. Αν ληφθεί υπόψη ότι το pka της ξανθάνης είναι κοντά στο 4 (Moede, 1974), η µεγάλη αυτή µεταβολή στην τιµή του ζ-δυναµικού που παρατηρείται µε την προσθήκη της ξανθάνης οφείλεται προφανώς στην αλληλεπίδραση των θετικά φορτισµένων ελαιοσωµάτων µε τα αρνητικά φορτισµένα µόρια του πολυσακχαρίτη. Η 81

102 ίδια αλληλεπίδραση, αλλά σε µικρότερο βαθµό παρατηρήθηκε και στην περίπτωση των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ (Σχήµα 3.7.β). Αυτό πιθανώς οφείλεται στην παρουσία των εξωγενών πρωτεϊνών, οι οποίες δεν επιτρέπουν την εκτεταµένη αλληλεπίδραση των µορίων της ξανθάνης µε τις πρωτεΐνες που απαντούν στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων. Η παρουσία όµως των µορίων του πολυσακχαρίτη ήταν αρκετή ώστε να αποτρέψει τη συσσωµάτωση των ελαιοσωµάτων και την αποκορύφωσή τους. Επιπλέον, η παρουσία των µορίων του πολυσακχαρίτη στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων, µέσω της αλληλεπίδρασής τους µε τα συστατικά της επιφανειακής µεµβράνης, συνέβαλε στην σταθεροποίηση των ελαιοσωµάτων έναντι της συσσωµάτωσης, λόγω της ενίσχυσης των πολυµερικών απώσεων ανάµεσα στα γειτονικά ελαιοσώµατα, και σταθεροποίησε το γαλάκτωµα ως προς την αποκορύφωση. Παρόµοια αποτελέσµατα βελτίωσης της σταθερότητας γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων από σπέρµα σόγιας µε την προσθήκη πηκτίνης αναφέρθηκαν πρόσφατα και από τους Iwanaga et al. (2008) Επίδραση της προσθήκης Tween 80 στα επιφανειακά χαρακτηριστικά και τη σταθερότητα γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται µε βάση την κρέµα Σ Μεταβολή του ζ-δυναµικού και της σύστασης των πρωτεϊνών. Όπως παρατηρήθηκε µε βάση τα αποτελέσµατα των πειραµάτων που προηγήθηκαν, η απουσία των εξωγενών πρωτεϊνών είχε ως αποτέλεσµα την περιορισµένη σταθερότητα ως προς τη συγχώνευση των ελαιοσωµάτων στα γαλακτώµατα της κρέµας Σ, σε σχέση µε αυτήν των γαλακτωµάτων της κρέµας ΙΣ. Προκειµένου να ενισχυθεί η φυσικοχηµική σταθερότητα των γαλακτωµάτων της πρώτης κατηγορίας, επιχειρήθηκε στη συνέχεια η προσθήκη στο γαλάκτωµα αυτό Tween 80. Οι γαλακτωµατοποιητές αυτής της οµάδας είναι σχετικά υδρόφιλοι γαλακτωµατοποιητές και έχουν την ικανότητα να προσροφούνται ανταγωνιστικά σε διεπιφάνειες ελαίου-νερού και να εκτοπίζουν τα µόρια σχετικά υδρόφιλων πρωτεϊνών όπως είναι, για παράδειγµα, οι πρωτεΐνες του ορού του γάλακτος (Dickinson & Tanai, 1992) ή να εκτοπίζουν από τη διεπιφάνεια ένα κλάσµα µόνο των σχετικά υδρόφοβων λιποπρωτεΐνών του 82

103 κρόκου του αβγού, οι οποίες επιδεικνύουν υψηλή τασενεργότητα (Nikiforidis & Kiosseoglou, 2007). Μία έµµεση αλλά σαφή ένδειξη της πιθανής προσρόφησης του γαλακτωµατοποιητή στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων αποτελεί η µεταβολή της τιµής του ζ δυναµικού των ελαιοσωµάτων, λόγω της ανταγωνιστικής εκτόπισης από τα µόρια του γαλακτωµατοποιητή ορισµένων πρωτεϊνικών συστατικών που φέρουν ηλεκτρικό φορτίο. Στο Σχήµα 3.14 φαίνεται η επίδραση της προσθήκης στο γαλάκτωµα του Tween 80 στην τιµή του ζ-δυναµικού της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων. Απουσία του γαλακτωµατοποιητή, η τιµή του ζ-δυναµικού ήταν περίπου -40 mv. Το σχετικά µεγάλο όµως επιφανειακό ηλεκτρικό φορτίο δεν ήταν αρκετό για να αποτρέψει την προσέγγιση των ελαιοσωµάτων και τη συγχώνευσή τους κατά την αποθήκευση. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η µειωµένη σταθερότητα των ελαιοσωµάτων έναντι της συγχώνευσης θα πρέπει να συνδέεται µε το γεγονός ότι το υδρόφιλο τµήµα του µορίου της κυριότερης πρωτεΐνης της επιφάνειάς τους, δηλαδή της ελαιοσίνης, είναι πολύ µικρού µήκους (Takahashi et al., 1934). Η ιδιαιτερότητα αυτή του µορίου της ελαιοσίνης σε σχέση µε το µόριο άλλων πρωτεϊνών µε µεγάλου µήκους υδρόφιλο τµήµα, είναι πολύ πιθανό να επηρεάζει αρνητικά την σταθεροποιητική της ικανότητα επειδή προφανώς το µέγεθος των πολυµερικών απώσεων ανάµεσα στα ελαιοσώµατα αναµένεται να είναι σχετικά περιορισµένο. Παρά, εποµένως, την ύπαρξη του σχετικά ισχυρού αρνητικού ηλεκτρικού φορτίου στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων αυτό δεν επαρκεί ώστε να αποτραπεί η συσσωµάτωση και στη συνέχεια η συγχώνευσή τους σε µεγαλύτερα. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 3.14, όταν η συγκέντρωση του Tween 80 στο γαλάκτωµα αυξάνεται σταδιακά, παρατηρείται µία µείωση του µεγέθους του επιφανειακού φορτίου που είναι πολύ πιθανό να σχετίζεται µε την ανταγωνιστική εκτόπιση ενός κλάσµατος των επιφανειακών πρωτεϊνών από τα µόρια του γαλακτωµατοποιητή. Για να ολοκληρωθεί η µεταβολή στο ηλεκτρικό φορτίο της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων, απαιτήθηκε χρόνος εξισορρόπησης 24 τουλάχιστον ωρών. Αντίθετα, µετά από χρόνο εξισορρόπησης µόλις 30 min, δεν παρατηρήθηκε καµία σηµαντική µεταβολή στην τιµή του ζ-δυναµικού, κάτι που υποδηλώνει ότι η διεργασία της εκτόπισης των επιφανειακών πρωτεϊνών από τα µόρια του γαλακτωµατοποιητή που προσροφούνται στη θέση τους λαµβάνει χώρα µε ιδιαίτερα χαµηλό ρυθµό. Σε συγκέντρωση Tween 80 1,0% w/w, η τιµή του ζ-δυναµικού της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων µειώθηκε κατά δέκα περίπου µονάδες και πρακτικά δε µεταβλήθηκε όταν η 83

104 συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή αυξήθηκε πέραν αυτού του ορίου. Αυτό υποδηλώνει ότι σε αυτή την συγκέντρωση αποκαθίσταται κάποια ισορροπία ανάµεσα στα µόρια της πρωτεΐνης που εκροφούνται από την επιφάνεια και αυτά του τασενεργού που προσροφούνται στη θέση τους, και η οποία δεν ανατρέπεται από την αύξηση της συγκέντρωσης του γαλακτωµατοποιητή. -20 ζ-δυναµικό (mv) Tween 80 (% w/w) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του Tween 80 στο ζ-δυναµικό των γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων µε ph 6,8, µετά από αποθήκευση για ( ) 30 min ή για ( ) 1 ηµέρα. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται στο Σχήµα 3.15, η προσθήκη Tween 80 σε συγκέντρωση 1,5% w/w είχε ως αποτέλεσµα να εκτοπιστεί το 40% περίπου των πρωτεϊνών της επιφάνειας. Αξιοσηµείωτη ανταγωνιστική εκτόπιση των µορίων της επιφανειακής πρωτεΐνης λόγω της προσρόφησης του γαλακτωµατοποιητή παρατηρήθηκε και σε πολύ χαµηλές συγκεντρώσεις του Tween 80, αλλά το φαινόµενο ήταν πιο έντονο όταν η συγκέντρωση αυτή υπερέβαινε το 0,25% w/w. Σε συγκέντρωση µεγαλύτερη από 1,5% w/w, η ποσότητα της πρωτεΐνης που εκτοπιζόταν από την επιφάνεια δεν µεταβλήθηκε. Η αύξηση της συγκέντρωσης του Tween 80 οδήγησε στη σταδιακή µείωση της τιµής του επιφανειακού πρωτεϊνικού φορτίου (Γ s ), η οποία από την αρχική τιµή των 4,9 mg/m 2 µειώθηκε σε 3,2 mg/m 2, περίπου, για συγκέντρωση τασενεργού 2% w/w. Η µη αναµενόµενη αύξηση της τιµής του Γ s που παρατηρήθηκε σε συγκέντρωση Tween 80 0,25% w/w, πιθανώς να σχετίζεται µε την αύξηση του µεγέθους των ελαιοσωµάτων, λόγω της ταυτόχρονης µερικής 84

105 συγχώνευσης που παρατηρήθηκε και η οποία είχε ως αποτέλεσµα τη µείωση της συνολικής επιφάνειας των ελαιοσωµάτων στο σύστηµα. Η µείωση αυτή οδήγησε σε αύξηση της διαθέσιµης ποσότητας της πρωτεΐνης ανά µονάδα επιφάνειας. Όταν η συγκέντρωση του Tween 80 αυξήθηκε πέραν του ορίου αυτού, η συγχώνευση των ελαιοσωµάτων περιορίστηκε ενώ η πλεονάζουσα πρωτεΐνη εκτοπίστηκε στην υδατική φάση του γαλακτώµατος µε ταυτόχρονη µείωση του Γ s. Εκτοπισµένη πρωτεϊνη (% w/w) Tween (% w/w) Γ s (mg/m 2 ) Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης του Tween 80, στο ποσοστό της πρωτεΐνης που εκτοπίζεται από την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων ( ) και στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης που παραµένει στην επιφάνεια, Γs ( ). Από την παρατήρηση του Σχήµατος 3.16 προκύπτει ότι οι πρωτεΐνες της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων που εκτοπίζονται από τα µόρια του Tween 80 (0,5% w/w) είναι κυρίως στερελαιοσίνες και καλαιοσίνες (διαδροµή 3). Όταν η συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή αυξήθηκε σε 1,5% w/w, έλαβε χώρα περαιτέρω εκτόπιση µορίων της στερελαιοσίνης και της καλαιοσίνης µε ταυτόχρονη, όµως, περιορισµένης έκτασης εκτόπιση και ελαιοσίνης (διαδροµή 4). Στη διαδροµή 5, φαίνεται επίσης ότι µετά την προσθήκη του Tween σε συγκέντρωση 1,5% w/w, όλη η ποσότητα της στερελαιοσίνης είχε πρακτικά σχεδόν εκτοπιστεί από τη επιφάνεια, σε αντίθεση µε την ελαιοσίνη και την καλαιοσίνη που µεγάλο µέρος τους παρέµεινε στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων. Η επιλεκτική εκτόπιση των επιφανειακών πρωτεϊνών από τα µόρια του τασενεργού είναι πολύ πιθανό να οφείλεται στη διαφορετική µοριακή δοµή τους. Οι ελαιοσίνες είναι πρωτεΐνες 85

106 µικρού µοριακού βάρους µε µόριο που φέρει ένα αρκετά µεγάλο υδρόφοβο τµήµα το οποίο αποτελείται από µία αλληλουχία 70 περίπου αµινοξέων, και το οποίο προσανατολίζεται και αλληλεπιδρά µε τα λιπίδια των ελαιοσωµάτων (Frandsen et al., 2001). Η ισχυρή αυτή αλληλεπίδραση της ελαιοσίνης µε τα µόρια των τριακυλογλυκερολών, ίσως να είναι ο κυριότερος λόγος για τον οποίο δεν είναι εύκολη η ανταγωνιστική εκτόπιση της ελαιοσίνης από τα µόρια του τασενεργού. Τα µόρια της καλαιοσίνης και της στερελαιοσίνης, αντίθετα, εξαιτίας του µικρότερου µήκους του υδρόφοβου τµήµατός τους και του µεγαλύτερου υδρόφιλου τµήµατος σε σχέση µε το µόριο της ελαιοσίνης (Campling, 1991, Yan & Tsz, 1997), ήταν προφανώς δυνατό να εκτοπιστούν ευκολότερα από την επιφάνεια των ελαιοσωµάτων κατά την ανταγωνιστική προσρόφηση του τασενεργού Στερελαιοσίνη Στερελαιοσίνη Καλαιοσίνη Ελαιοσίνη Σχήµα Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 1) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας, των πρωτεϊνών της κρέµας Σ (διαδροµή 2), των πρωτεϊνών της επιφανείας των ελαιοσωµάτων που εκτοπίστηκαν λόγω της προσθήκης 0,5% w/w Tween (διαδροµή 3) και 1,5% w/w Tween (διαδροµή 4), και των πρωτεϊνών που παρέµειναν στην επιφάνεια µετά την προσθήκη 1,5% w/w Tween (διαδροµή 5). Η ανταγωνιστική αποµάκρυνση της πρωτεΐνης από µία διεπιφάνεια, λόγω της προσρόφησης ενός τασενεργού µικρού µοριακού βάρους, βασίζεται στην θεωρία της «δηµιουργίας της ανοµοιογενούς διεπιφάνειας» σύµφωνα µε την οποία τα πρώτα µόρια του µικρού µοριακού βάρους γαλακτωµατοποιητή που προσροφούνται σε µία πρωτεϊνική 86

107 διεπιφανειακή στοιβάδα τείνουν να διαχωρίζονται και να σχηµατίζουν µικρές διακριτές «νησίδες» του τασενεργού στην στοιβάδα. Όταν αυξηθεί η συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή στο σύστηµα και ακολουθήσει η προσρόφηση στη διεπιφάνεια και άλλων µορίων, η έκταση της περιοχής των «νησίδων» αυξάνεται µε αποτέλεσµα να ασκείται σταδιακά µία ολοένα και περισσότερο αυξανόµενη πίεση στην προσροφηµένη πρωτεΐνη που οδηγεί τελικά στην αποµάκρυνσή της από την διεπιφάνεια (Mackie, et al., 2003). Όπως παρατηρήθηκε από τους ερευνητές αυτούς, η προσρόφηση µορίων Tween σε µία διεπιφάνεια που σταθεροποιείται µε την παρουσία πρωτεϊνών γάλακτος, όπως η καζεΐνη ή οι πρωτεΐνες του ορού, έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό στη διεπιφάνεια διακριτών περιοχών που αποτελούνται είτε από µόρια Tween ή από µόρια πρωτεΐνης. Αν ληφθεί υπόψη ότι οι πρωτεΐνες των ελαιοσωµάτων είναι αρκετά πιο υδρόφοβες από τις πρωτεΐνες γάλακτος και ότι σχηµατίζουν στη διεπιφάνεια µαζί µε τα φωσφολιπίδια µία µονοµοριακή µεµβράνη, µπορεί να υποτεθεί ότι και στην περίπτωση των ελαιοσωµάτων είναι δυνατό να αναπτυχθούν στην επιφάνειά τους µε αρκετά βέβαια αργό ρυθµό, διακριτές περιοχές που αποτελούνται από προσροφηµένα µόρια Tween 80. Ο σχηµατισµός των «νησίδων» του γαλακτωµατοποιητή λαµβάνει χώρα παράλληλα µε τον περιορισµό των περιοχών που καταλαµβάνουν τα µόρια των επιφανειακών πρωτεϊνών και η διαδικασία αυτή ολοκληρώνεται όταν ένα ποσοστό της πρωτεΐνης που αγγίζει το 40% αποµακρύνεται από την επιφάνεια. Το κλάσµα της πρωτεΐνης που εκροφάται, όπως αναφέρθηκε παραπάνω αποτελείται από το σύνολο σχεδόν των στερελαιοσινών, από το µεγαλύτερο µέρος των καλαιοσινών και από ένα µικρό µέρος των ελαιοσινών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων. Ο πιθανός µηχανισµός εκτόπισης της πρωτεΐνης των ελαιοσωµάτων από τα µόρια του Tween 80, δίνεται σχηµατικά στο Σχήµα Σύµφωνα µε το µηχανισµό που προτείνεται, τα µόρια του Tween 80 εκµεταλλεύονται την παρουσία κάποιων κενών περιοχών στην επιφανειακή µεµβράνη, που είναι επόµενο να υπάρχουν λόγω της αδυναµίας των πρωτεϊνικών µορίων, σε αντίθεση µε τους µικρού µοριακού βάρους γαλακτωµατοποιητές, να προσανατολιστούν κατάλληλα και να καλύψουν αποτελεσµατικά όλα τα σηµεία της επιφάνειας. Τα µόρια του γαλακτωµατοποιητή προσροφούνται στα σηµεία αυτά και σχηµατίζουν σταδιακά περιοχές πλούσιες σε µόρια Tween 80, συµπιέζοντας µε αυτό τον τρόπο τα µόρια των πρωτεϊνών της επιφάνειας. Οι πρωτεΐνες που είναι ασθενέστερα συνδεδεµένες µε την επιφάνεια εκτοπίζονται πρώτες, ενώ όσο µεγαλώνει η συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή, σχηµατίζονται µεγαλύτερες «νησίδες» στη διεπιφάνεια, µετά από την εκτόπιση και ορισµένων ισχυρά 87

108 προσροφηµένων πρωτεϊνικών µορίων. Επειδή οι πρωτεΐνες που εκτοπίζονται είναι αρκετά υδρόφοβα µόρια, όταν εκροφηθούν και βρεθούν στην υδατική φάση, είναι πιθανό να αλληλεπιδράσουν µε τα υδρόφοβα τµήµατα των µορίων του Tween, όπως έχει αναφερθεί και για άλλες πρωτεΐνες (Mackie & Wilde, 2005), επιτρέποντας έτσι το σχηµατισµό ενός συστήµατος διασποράς της υδρόφοβης πρωτεΐνης στο νερό. Σχήµα Σχηµατική αναπαράσταση των πιθανών µεταβολών που λαµβάνουν χώρα στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων και στη φάση του νερού, λόγω ανταγωνιστικής προσρόφησης µε τα µόρια του Tween Φυσικοχηµική σταθερότητα των γαλακτωµάτων. Στο Σχήµα 3.18 φαίνεται η µεταβολή µε το χρόνο αποθήκευσης της µέσης διαµέτρου, d 32, των ελαιοσωµάτων των γαλακτωµάτων µε 5% w/w έλαιο, απουσία και παρουσία Tween 80. Απουσία γαλακτωµατοποιητή, το αρχικό µέσο µέγεθος των ελαιοσωµάτων που ήταν 0,84 µm, µετά την πάροδο µίας µόλις ηµέρας αποθήκευσης προσέγγισε τα 3 µm, ενώ µετά από παραµονή για 15 µέρες αυξήθηκε στα 30 µm. Η προσθήκη του Tween 80 σε συγκεντρώσεις που κυµαίνονταν από 0,5 έως 1,5% w/w είχε ως αποτέλεσµα τη σταδιακή βελτίωση της σταθερότητας των ελαιοσωµάτων έναντι της συγχώνευσης, και µάλιστα σε συγκέντρωση γαλακτωµατοποιητή 1,0% w/w ή µεγαλύτερη, το µέγεθος των ελαιοσωµάτων δεν µεταβλήθηκε κατά την αποθήκευση των γαλακτωµάτων για χρονικό διάστηµα 15 ηµερών. 88

109 35 30 d 32 (µm) Χρόνος (ηµέρες) Σχήµα Μεταβολή µε το χρόνο αποθήκευσης της µέσης διαµέτρου των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ µε 5% w/w έλαιο, ( ) απουσία ή παρουσία ( ) 0,5, (x) 0,75, (+) 1,0 και ( ) 1,5% w/w Tween 80. Ο βαθµός της σταθερότητας ενός γαλακτώµατος ελαίου-νερού εξαρτάται από την ισορροπία ανάµεσα στις ελκτικές και τις απωστικές δυνάµεις που αναπτύσσονται ανάµεσα στα σταγονίδια του ελαίου, όταν αυτά κινούµενα αρχίζουν να προσεγγίζουν το ένα το άλλο. Οι κυριότερες απωστικές δυνάµεις είναι οι ηλεκτροστατικές δυνάµεις που οφείλονται στην ύπαρξη οµοειδών φορτίων στην επιφάνεια των γειτονικών σταγονιδίων. Στη σταθερότητα συµβάλλουν και οι πολυµερικές απωστικές αλληλεπιδράσεις που συνδέονται µε την παρουσία στην επιφάνεια µακροµορίων, δηλαδή πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών. Οι ελκτικές αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα σταγονίδια αποδίδονται κυρίως σε δυνάµεις van der Waals και στην εµφάνιση φαινοµένων συσσωµάτωσης λόγω οσµωτικής. Μία άλλη κατηγορία ελκτικών αλληλεπιδράσεων που συµβάλλουν στην αποσταθεροποίηση ενός γαλακτώµατος είναι οι περιορισµένης εµβέλειας υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται µεταξύ των υδρόφοβων περιοχών πρωτεϊνών που απαντούν στην επιφάνεια των σταγονιδίων, όταν τα σταγονίδια έρθουν πολύ κοντά και οι επιφανειακές τους µεµβράνες αγγίζουν η µία την άλλη (McClements, 2004). Όταν σε γενικές γραµµές το µέγεθος των ελκτικών δυνάµεων υπερισχύει αυτού των εαπωστικών, λαµβάνει χώρα συσσωµάτωση των σταγονιδίων, η οποία ανάλογα µε το µέγεθος των δυνάµεων στο εσωτερικό της επιφανειακής µεµβράνης και τη µηχανική της αντοχή, µπορεί στη συνέχεια να οδηγήσει σε συγχώνευση των σταγονιδίων προς µεγαλύτερα. 89

110 Σύµφωνα µε τα δεδοµένα του Σχήµατος 3.15, το επιφανειακό πρωτεϊνικό φορτίο των ελαιοσωµάτων τείνει να αποκτήσει µία σχετικά σταθερή τιµή όταν η συγκέντρωση του Tween στο γαλάκτωµα υπερβαίνει το όριο του 0,75% w/w, γεγονός που µπορεί να σηµαίνει ότι στις συγκεντρώσεις αυτές η διαδικασία της προσρόφησης των µορίων του Tween στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων και η διαδικασία της ταυτόχρονης εκρόφησης των πρωτεϊνικών µορίων προσεγγίζουν µία κατάσταση ισορροπίας. Η νέα µικτή µεµβράνη που δηµιουργείται στη διεπιφάνεια, εικάζεται ότι θα πρέπει να παρουσιάζει µία δοµή µε µεγαλύτερη συνοχή, σε σχέση µε την δοµή της φυσικής διεπιφάνειας των ελαιοσωµάτων, αφού αντικαταστάθηκαν σε ορισµένες περιοχές της επιφάνειας ένας αριθµός ασθενώς προσροφηµένων πρωτεϊνικών µορίων από µόρια του τασενεργού µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό στο εσωτερικό της µεµβράνης µικτών περιοχών Tween-φωσφολιπιδίων οι οποίες είναι πιθανό να εµφανίζουν µεγαλύτερη συνοχή σε σχέση µε τις αρχικές δοµές που αντικατέστησαν. Η δοµή των µικτών διεπιφανειακών µεµβρανών τασενεργού-φωσφολιπιδίων έχει µελετηθεί διεξοδικά σε βιολογικές µεµβράνες (Hankin et al., 1983, Schurink, 2007, Suárez, 2006, Takahashi et al., 1934). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα των εργασιών αυτών, η προσρόφηση των µορίων τασενεργών, όπως το SDS και το παλµιτικο οξύ, σε διεπιφάνειες φωσφολιπιδίων επηρεάζει τη διάταξή των φωσφολιπιδίων στη µεµβράνη, λόγω τον αλληλεπιδράσεων τους µε τα µόρια του τασενεργού, οδηγώντας στην εµφάνιση περισσότερο συµπαγών δοµών. Στην περίπτωση των ελαιοσωµάτων, κατά την προσρόφηση του τασενεργού, σχηµατίζονται πιθανώς στην επιφάνειά τους περιοχές που είναι πλούσιες σε µόρια του τασενεργού, οι οποίες εναλλάσσονται µε περιοχές που αποτελούνται από φωσφολιπίδια και πρωτεϊνικά µόρια τα οποία είναι ισχυρά προσροφηµένα και παραµένουν στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων (Σχήµα 3.17). Η µεγάλη αύξηση που παρατηρείται στη σταθερότητα των γαλακτωµάτων, λόγω της παρουσίας του Tween, έχει προφανώς άµεση σχέση µε την αλλαγή της σύστασης και των χαρακτηριστικών της επιφανειακής µεµβράνης. Όταν δύο σταγονίδια ελαίου προσεγγίσουν πολύ το ένα το άλλο, ανάµεσα στις επιφανειακές τους µεµβράνες, και µε τη µεσολάβηση ενός λεπτού στρώµατος της συνεχούς φάσης, σχηµατίζεται ένα υµένιο, το οποίο ανάλογα µε το συνδυασµό των ελκτικών και των απωστικών δυνάµεων που επικρατούν µπορεί να είναι βραχύβιο και να υποστεί µία άµεση διάρρηξη ή να παραµείνει σταθερό για µεγάλο χρονικό διάστηµα (Kandhai, 2010). Όταν ένα µέρος των πρωτεϊνών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων αντικατασταθεί από µόρια του τασενεργού, η ένταση των απωστικών ηλεκτροστατικών δυνάµεων µεταξύ δύο 90

111 γειτονικών ελαιοσωµάτων αναµένεται να ελαττωθεί, αφού το µέγεθος του αρνητικού ηλεκτρικού φορτίου της επιφάνειας θα είναι µικρότερο, λόγω της ανταγωνιστικής αποµάκρυνσης των φορτισµένων πρωτεϊνικών µορίων. Από την άλλη, η παρουσία στην επιφάνεια των υδρόφιλων πολυοξυαιθυλενικών οµάδων του τασενεργού, αναµένεται να αυµβάλλει στην µείωση του υδρόφοβου χαρακτήρα της επιφάνειας, γεγονός που θα εξουδετερώσει σε κάποιο βαθµό τη συµβολή των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στις επιφανειακές µεµβράνες του υµενίου. Η ενίσχυση του υδρόφιλου χαρακτήρα της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων, λόγω της προσρόφησης των µορίων του τασενεργού, σε συνδυασµό µε την µεγαλύτερη συνοχή της επιφανειακής µεµβράνης, φαίνεται ότι εξουδετερώνει την αρνητική επίδραση που είχε η µείωση του ηλεκτρικού φορτίου, εξαιτίας της αποµάκρυνσης ενός κλάσµατος των επιφανειακών πρωτεϊνών, µε τελικό αποτέλεσµα την πολύ αποτελεσµατική σταθεροποίηση των ελαιοσωµάτων. Όγκος ορού % Χρόνος (ώρες) Σχήµα Σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση των γαλακτωµάτων ελαιοσωµάτων µε 5% w/w έλαιο, ( ) απουσία και παρουσία ( ) 0,5, ( ) 1,0, ( ) 1,5 και (x) 2,0% w/w Tween 80. Η σταθερότητα των ελαιοσωµάτων ως προς τη συγχώνευση, επηρέασε σε κάποια βαθµό και τη σταθερότητά των γαλακτωµάτων ως προς την αποκορύφωση (Σχήµα 3.19). Πιο συγκεκριµένα, ο χρόνος που απαιτήθηκε για την εµφάνιση ορού στον πυθµένα του περιέκτη ήταν συνάρτηση της συγκέντρωσης του Tween 80, προφανώς επειδή απουσία του τασενεργού ή σε σχετικά χαµηλές συγκεντρώσεις τασενεργού, η συγχώνευση των ελαιοσωµάτων προς σταγονίδια µεγαλύτερου µεγέθους είχε ως αποτέλεσµα την ταχύτερη αποκορύφωσή τους σε 91

112 σχέση µε αυτά που διατήρησαν το αρχικό τους µέγεθος. Στον χαµηλότερο ρυθµό της αποκορύφωσης των ελαιοσωµάτων παρουσία του τασενεργού θα πρέπει να συνέβαλε και η ικανότητα των προσροφηµένων µορίων του Tween 80 να προκαλούν την ελάττωση του υδρόφοβου χαρακτήρα της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων, µε αποτέλεσµα την πιθανή µείωση της τάσης τους να αλληλεπιδρούν και να σχηµατίζουν συσσωµατώµατα τα οποία αποκορυφώνονται ταχύτερα σε σχέση µε τα µεµονωµένα ελαιοσώµατα. Η προσθήκη όµως του τασενεργού δεν είχε κάποια επίδραση στη σταθερότητα όσον αφορά την τελική ποσότητα του ορού που αποβλήθηκε από το σύστηµα, αφού σε όλα τα γαλακτώµατα το ύψος του ορού µετά από 400 ώρες αποθήκευσης ήταν το ίδιο, ανεξάρτητα από την παρουσία ή µη του Tween Μελέτη γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες Σ και ΙΣ Σύσταση των πρωτεϊνών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων στα γαλακτώµατα. Στη Σχήµα 3.20, παρουσιάζονται τα ηλεκτροφορήµατα των πρωτεϊνών της επιφάνειας των ελαιοσωµάτων σε γαλακτώµατα που παρασκευάζονται µε βάση τις κρέµες Σ και ΙΣ, µε ή χωρίς την προσθήκη κρόκου του αυγού (2,5% w/w), µετά από αποθήκευσή τους για 75 µέρες.όπως προκύπτει από τη σύγκριση των ηλεκτροφορηµάτων των γαλακτωµάτων που παρασκευάζονται χωρίς κρόκο µε αυτά των γαλακτωµάτων που περιέχουν κρόκο, τα ηλεκτροφορήµατα και στις δύο περιπτώσεις ήταν πανοµοιότυπα, δηλαδή απουσίαζαν από τα γαλακτώµατα µε κρόκο κάποιες ζώνες ηλεκτροφόρησης που θα µπορούσαν να αποδοθούν στην παρουσία πρωτεϊνών του κρόκου, ανεξάρτητα από τον τύπο της κρέµας που χρησιµοποιήθηκε για την παρασκευή τους. Αυτό υποδηλώνει ότι κανένα από τα πρωτεϊνικά συστατικά του κρόκου του αυγού δεν κατάφερε να προσροφηθεί στην επιφάνεια των ελαιοσωµάτων, παρά το µεγάλο χρόνο της εξισορρόπησης που εφαρµόστηκε. H µεγάλη επιφανειοδραστική ικανότητα των συστατικών του κρόκου του αβγού συνδέεται κυρίως µε την παρουσία των λιποπρωτεϊνών και των φωσφολιπιδίων, που προέρχονται από τα µικκύλια LDL, και, δευτερευόντως, µε τις λιποπρωτείνες των κόκκων (HDL) και τις λιβετίνες του ορού. H τιµή της επιφανειοδραστικότητας επηρεάζεται από τη 92

113 συγκέντρωση του κρόκου, την τιµή του pη, την περιεκτικότητα σε χλωριούχο νάτριο, τη θερµοκρασία και την παρουσία οργανικών διαλυτών (Kiosseoglou, 2004). Οι χαµηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες, εξαιτίας της ικανότητας τους να προσεγγίζουν και να προσροφούνται πολύ γρήγορα στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου, κατά τη διάρκεια της γαλακτωµατοποίησης, προστατεύουν τα νεοσχηµατιζόµενα σταγονίδια από τη µεταξύ τους συγχώνευση. Αξιόλογη γαλακτωµατοποιητική δράση παρουσιάζουν, σύµφωνα µε τους Le Denmat et al. (2000) και οι κόκκοι του κρόκου, κυρίως όταν αποδιοργανώνεται η δοµή τους, λόγω της προσθήκης NaCl, µε αποτέλεσµα οι απολιποπρωτεΐνες που ελευθερώνονται να προσροφούνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων και να σχηµατίζουν στιβάδες µε πάχος πολύ µεγαλύτερο αυτού που σχηµατίζεται κατά την προσρόφηση µόνο των απολιποπρωτεϊνών του πλάσµατος (LDL). KDa Σχήµα Ηλεκροφόρηµα SDS-PAGE ενός πρότυπου δείγµατος πρωτεϊνών (διαδροµή 1) που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας, των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας ΙΣ (διαδροµή 2), των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ, µετά την προσθήκη του κρόκου του αυγού (διαδροµή 3), των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ (διαδροµή 4), και των πρωτεϊνών της επιφανειακής µεµβράνης των ελαιοσωµάτων της κρέµας Σ µετά την προσθήκη του κρόκου του αυγού (διαδροµή 5). H µεγάλη επιφανειοδραστικότητα ορισµένων λιποπρωτεϊνικών µορίων του κρόκου επιτρέπει την ανταγωνιστική προσρόφησή τους στις διεπιφάνειας, έναντι άλλων πρωτεϊνών, όπως είναι η σφαιροπρωτεΐνη β-λακτογλοβουλίνη ή οι περισσότερο ευέλικτες πρωτεΐνες της 93