ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ

Transcript

1 ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ Χρήσιμοι όροι Αγενής πολλαπλασιασμός Κύτταρα Οφθαλμοί Θρεπτικό υπόστρωμα Έκφυτο ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 1

2 Ορισμοί Ιστοκαλλιέργεια είναι η τεχνική ανάπτυξης φυτικών κυττάρων, ιστών, οργάνων, λειτουργικών φυτών, σπόρων ή άλλων φυτικών μερών, που ονομάζονται έκφυτα, σε ελεγχόμενο περιβάλλον κάτω από ασηπτικές συνθήκες Η ιστοκαλλιέργεια αποτελεί κομμάτι της in-vitro καλλιέργειας Κάθε φυτό αποτελείται από τρία κύρια όργανα, την ρίζα, τον βλαστό και τα φύλλα το καθένα από τα οποία αποτελείται από διάφορους ιστούς που με τη σειρά τους αποτελούνται από κύτταρα Τύποι ιστών:επιδερμικοί επιδερμικοί, αγγειώδεις, μεριστωματικοί, ηθμώδεις κ.α. Εκτός από φυτικά κύτταρα μπορούν να καλλιεργηθούν και ζωικά, βακτηριακά ή μυκητιακά Η καλλιέργεια κυττάρων και ιστών βασίζεται στην ολοδυναμικότητα των κυττάρων. Κάθε φυτικό κύτταρο είναι δυνητικά «ολοδυναμικό» ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 2

3 Εφαρμογές της ιστοκαλλιέργειας Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Παραγωγή φυτών απαλλαγμένων από ιώσεις Έρευνα διαφόρων αναπτυξιακών, φυσιολογικών, κ.α. λειτουργιών Διατήρηση γενετικού υλικού Σωματική εμβρυογένεση Γενετική βελτίωση φυτών ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 3

4 Εφαρμογές ιστοκαλλιέργειας στην γενετική βελτίωση Καλλιέργεια γύρης (pollen culture) Σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Εμβρυοκαλλιέργεια Γενετικός μετασχηματισμός Παραγωγή απλοειδών και διπλοειδών φυτών Σωμακλωνική παραλλακτικότητα ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 4

5 Παράγοντες επιτυχίας ιστοκαλλιέργειας Φυτικό είδος Είδος εκφύτου Ηλικία Φωτισμός Θρέψη Υγρασία Παθολογία Χειρισμοί Μέγεθος εκφύτου ενδογενής εξωγενής ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 5

6 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Διαφορετικά ονομάζεται μικροπολλαπλασιασμός και είναι η τέχνη και η επιστήμη του πολλαπλασιασμού στο εργαστήριο Η διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Επιλογή φυτικού υλικού Επιλογή τμημάτων φυτικού υλικού Απολύμανση φυτικού υλικού που θα χρησιμοποιηθεί Παρασκευή των θρεπτικών υποστρωμάτων Χειρισμοί φυτικού υλικού Καλλογένεση/βλαστογένεση Ριζοβολία Εγκλιματισμός/σκληραγώγηση Μπορούν να ακολουθηθούν τέσσερις βασικοί μέθοδοι: Καλλιέργεια βλαστών Καλλιέργεια γονάτων Καλλιέργεια μη-μεριστωματικών ιστών διαμέσου (ή οχι) κάλλου Μη ζυγωτική εμβρυογένεση Σύντηξη πρωτοπλαστών για την δημιουργία σωματικών υβριδίων ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 6

7 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Θρεπτικά υποστρώματα Η σύνθεση του κάθε θρεπτικού υποστρώματος διαφοροποιείται και εξαρτάται από: Το είδος του προς ιστοκαλλιέργεια φυτικού ιστού Το στόχο Άλλο υπόστρωμα θα χρησιμοποιηθεί για ιστοκαλλιέργεια πατάτας και άλλο για ιστοκαλλιέργεια ορχιδέας. Επίσης άλλο υπόστρωμα θα χρησιμοποιηθεί αν θέλουμε να πάρουμε φυτάρια καπνού από κάλλο και άλλο αν θέλουμε τα φυτάρια καπνού της προηγούμενης περίπτωσης να ριζοβολήσουν ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 7

8 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται στην ιστοκαλλιέργεια αποτελούνται συνήθως από άλατα, βιταμίνες, αμινοξέα, ρυθμιστές ανάπτυξης, σάκχαρα, άγαρ ή gelrite και νερό Τα ανόργανα συστατικά χρησιμοποιούνται από τους ιστούς για την δημιουργία των δομικών στοιχείων, για την σύνθεση των οργανικών μορίων, σαν καταλύτες στις διάφορες βιοχημικές αντιδράσεις (ένζυμα) Το άζωτο, το θείο και ο φώσφορος είναι συστατικά των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων. Το μαγνήσιο και πολλά ιχνοστοιχεία σχηματίζουν χρήσιμες δομές με τα κυτταρικά οργανίδια και λειτουργούν σαν συμπαράγοντες στις καταλυτικές αντιδράσεις Το ασβέστιο και το βορικό οξύ εντοπίζονται κυρίως στα κυτταρικά τοιχώματα και το πρώτο επιτελεί σημαντική λειτουργία στην σταθεροποίηση των βιομεμβρανών Το κάλιο και το χλώριο παίζουν σημαντικό ρόλο στην οσμωτική ρύθμιση και για την ενεργοποίηση ενός μεγάλου αριθμού ενζύμων ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 8

9 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΑ ΟΡΜΟΝΕΣ ΜΑΚΡΟΣΤΟΙΧΕΙΑ Fe Cu Mn Co Mo B I Ni Cl Al Αυξίνες Κυτοκινίνες Γιββερελλίνες Αμπσισικό οξύ Αιθυλένιο Πολυαμίνες Γιασμονικό οξύ Mg Ca P S N K ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 9

10 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Τι εξασφαλίζει το υπόστρωμα; Μέσο ανάπτυξης και υποστήριξης στην περίπτωση της καλλιέργειας κυττάρων και της ιστοκαλλιέργειας αντίστοιχα Διαθεσιμότητα ανόργανων στοιχείων Διαθεσιμότητα οργανικών ενώσεων Διαθεσιμότητα νερού Διαθεσιμότητα ρυθμιστών ανάπτυξης Ασηπτικές συνθήκες ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 10

11 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Το πιο διαδεδομένο και ευρέως χρησιμοποιούμενο θρεπτικό μέσο είναι αυτό που ανέπτυξαν οι Murashige και Skoog το Περιέχει πηγή οργανικού άνθρακα (σουκρόζη) και μερικούς άλλους ρυθμιστές αύξησης (βιταμίνες κ.α.) Υπάρχουν πολλές παραλλαγές του παραπάνω βασικού πρωτοκόλλου ανάλογα με το φυτικό είδος. Για παράδειγμα για τον καπνό χρησιμοποιείται το παρακάτω: βιταµίνες: 2 mg/l Glycine 100 mg/l µυο-ινοσιτόλη 0,5 mg/l νικοτινικό οξύ 0,5 mg/l πυριδοξίνη-hcl 0,1 mg/l θιαµίνη HCl) Άλλα: 30 gr/l σουκρόζη 42 mgr/l εθυλεν-διάµινο-τετραοξικό οξύ (FeEDTA) μακροστοιχεία: 332,02 mg/l CaCl mg/l KH 2 PO mg/l KNO 3 180,54 mg/l MgSO mg/l NH 4 NO 3 ) μικροστοιχεία: 0,025 mg/l CoCl2 6H2O 0,025 mg/l CuSO4 5H2O 36,7 mg/l FeNaEDTA 6,2 mg/l H3BO3 0,83 mg/l KI 16,9 mg/l MnSO4 H2O 0,25 mg/l Na2MoO4 2H2O 8,6 mg/l ZnSO4 7H2O) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 11

12 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Δυο κυρίως φυτορρυθμιστικές ουσίες (ορμόνες) επηρεάζουν την διαφοροποίηση: Αυξίνες: Προάγουν την ανάπτυξη των ριζών (π.χ. ΙΑΑ, ΙΒΑ,ΝΑΑ ΝΑΑ) Κιτοκινίνες: Προάγουν την ανάπτυξη του βλαστού (π.χ. BAP) Γενικά, η αναλογία αυτών των δύο είναι που επηρεάζει το προς την ποια κατεύθυνση θα κινηθεί η ανάπτυξη, προς την ριζοβολία ή προς την διαφοροποίηση και την ανάπτυξη του βλαστού Αυξίνη > Κιτοκινίνη = Ριζογένεση Αυξίνη < Κιτοκινίνη = Βλαστογένεση Αυξίνη = Κιτοκινίνη = Ανάπτυξη κάλλου ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 12

13 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Γιατί χρησιμοποιούμε ιστοκαλλιέργεια για μικροπολλαπλασιασμό; Ένα έκφυτο μπορεί να δώσει μέχρι και μερικές χιλιάδες φυτά σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Αυτό ευνοεί τον γρήγορο πολλαπλασιασμό φυτικών ειδών για εμπορική εκμετάλλευση Χρησιμοποιώντας το έκφυτο δεν καταστρέφεται το μητρικό φυτό. Με τον τρόπο αυτό σπάνια και δύσκολα φυτά πολλαπλασιάζονται με ασφάλεια Όταν γίνει η εγκατάσταση της ιστοκαλλιέργειας, υπάρχει μια ροή στην προσφορά έτοιμων φυτών για μεγάλο χρονικό διάστημα Μπορούν να παραχθούν υγιή από ιούς φυτά, συνήθως με ιστοκαλλιέργεια κορυφαίων μεριστωμάτων Μπορούν να δημιουργηθούν τράπεζες συντήρησης ιστών Φυτικές καλλιέργειες σε εγκεκριμένα θρεπτικά μέσα είναι ευκολότερο να πάρουν άδεια εξαγωγής μιας και είναι υγιή και καταλαμβάνουν πολύ μικρό χώρο Η επιλογή στην γενετική βελτίωση γίνεται πιο εύκολα και πιο γρήγορα Τα φυτά από την ιστοκαλλιέργεια είναι «γνήσιοι κλώνοι» συγκρινόμενοι με τα σπορόφυτα ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 13

14 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 14

15 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) Όργανα απαραίτητα στην ιστοκαλλιέργεια/κυτταροκαλλιέργεια: Κλίβανος αποστείρωσης Θάλαμος νηματικής ροής ιστοκαλλιέργειας (Laminar flow hood) Λάμπα υπεριώδους ακτινοβολίας Νιστέρια Λαβίδες Τρυβλία petri ή σωληνάκια ή κουτιά ιστοκαλλιέργειας (τύπου magenta κ.α.) Αιθανόλη, χλωρίνη Μικρός καυστήρας Θερμοθάλαμος ελεγχόμενου περιβάλλοντος Συσκευή επώασης με ανάδευση ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 15

16 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 16

17 Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Οι τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας και φυτικής ιστοκαλλιέργειας αποτελούν ενδιαφέροντες παράγοντες για την βιομηχανική παραγωγή φυσικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένων και φαρμάκων Η βάση για την ιστο- και κυτταροκαλλιέργεια δευτερογενών μεταβολιτών έγκειται στο γεγονός ότι όλα τα κύτταρα ενός οργανισμού, ανεξάρτητα από την εξειδίκευσή τους, περιέχουν όλες τις γενετικές πληροφορίες για την σύνθεση τους ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 17

18 Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Από βιομηχανικής απόψεως, η παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω καλλιεργειών κυττάρων σε επωαστήρες αντί της παραλαβής από φυτικά τμήματα, προσφέρει διάφορα πλεονεκτήματα όπως: ανεξαρτησία από κλιματολογικούς παράγοντες συνεχή παροχή υλικού προς εκχύλιση δυνατότητα ρύθμισης της διαδικασίας το επιθυμητό προϊόν λαμβάνεται σαν κύριος μεταβολίτης Οι δευτερογενής μεταβολίτες που παράγονται από τα φυτά μπορεί να ανήκουν στις εξής κατηγορίες: αλκαλοειδή, τερπενοειδή, στεροειδή, ανθοκυανίνες, ανθρακινόνες, πολυφαινόλες κ.α. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 18

19 Παραγωγή φαρμακευτικών και Παραδείγματα: άλλων χημικών ουσιών το αλκαλοειδές της ερυσιβώδους όλυρας από το μύκητα Claviceps purpurea (Clavicipitaceae) το αλκαλοειδές βερβερίνη από το Coptis japonica (Ranunculaceae). Χρησιμοποιείται κατά της διάρροιας ερυθρά χρωστική σικονίνη από το Lithospermum erythrorhizon (Boraginaceae). Χρησιμοποιείται σε δερματικές παθήσεις και αποτελεί συστατικό των crayons για τα χείλη Μειονέκτημα της μεθόδου θεωρείται το γεγονός ότι συνήθως οι ιστο- και κυτταροκαλλιέργειες σε κανονικές συνθήκες δεν αποδίδουν το ίδιο που θα απέδιδαν τα πλήρως ανεπτυγμένα φυτά. Το μειονέκτημα αυτό μάλλον οφείλεται στο ότι τα κύτταρα είναι αδιαφοροποίητα με αποτέλεσμα το προφίλ έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στα μονοπάτια βιοσύνθεσης των επιθυμητών ουσιών να διαφοροποιούνται ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 19

20 Παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών Μέθοδοι αυξήσεως της παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών Βελτιστοποίηση των θρεπτικών μέσων και των περιβαλλοντικών παραγόντων Επιλογή κυττάρων σειρών υψηλής αποδόσεως Χρήση επαγωγέων: μικροοργανισμοί, θέρμανση, ψύξη, απορρυπαντικά, άλατα βαρέων μετάλλων, υπεριώδης ακτινοβολία Καλλιέργεια οργάνων ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 20

21 Παραγωγή φυτών απαλλαγμένων από ιώσεις Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που έχουν να αντιμετωπίσουν όσοι ασχολούνται με την διακίνηση φυτικού υλικού είναι οι μολύνσεις από ιούς. Το πρόβλημα αποκτάει και ιδιαίτερη οικονομική σημασία όταν το φυτικό υλικό χρησιμοποιείται σαν μητρική καλλιέργεια στην γενετική βελτίωση Καθαρισμός μολυσμένων φυτών από τους περισσότερους ιούς. Αυτό γίνεται είτε με την ιστοκαλλιέργεια μεριστωματικών ιστών είτε με την μέθοδο της θερμοθεραπείας Ο λόγος για τον οποίο χρησιμοποιούνται τα ακραία μεριστώματα είναι γιατί οι περισσότεροι ιοί δεν έχουν την ικανότητα να περάσουν σε αυτά τα ακραία μεριστωματικά κύτταρα και να τα μολύνουν ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 21

22 Μαζική παραγωγή πανομοιότυπων φυτών (κλώνων) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 22

23 Έρευνα διαφόρων αναπτυξιακών, φυσιολογικών, κ.α. λειτουργιών Χωρίς την ιστοκαλλιέργεια θα ήταν αδύνατη η έρευνα πάνω στην αναπτυξιακή βιολογία των φυτών αλλά και γενικότερα. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 23

24 Διατήρηση γενετικού υλικού Υπάρχουν δύο τεχνικές που ακολουθούνται: 1. Η τεχνική της αργής αύξησης χαμηλή θερμοκρασία χαμηλός φωτισμός αναστολείς ανάπτυξης αφυδάτωση κ.α. 2. Κρυοσυντήρηση αρχικά ταχεία ανάπτυξη των κυττάρων για τη δημιουργία μικρών χυμοτοπίων επίτευξη εξαιρετικά χαμηλών θερμοκρασιών με ταχεία ψύξη (π.χ. με υγρό άζωτο, -196 C) αναστολή φυσιολογικών διεργασιών και κυτταρικής διαίρεσης χρησιμοποιούνται «κρυοπροστατευτικές» ουσίες π.χ.. PEG, DMSO, γλυκερόλη. Προστατεύουν από τη ζημιά που προκαλούν οι παγοκρύσταλοι ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 24

25 Σωματική εμβρυογένεση Υπο κανονικές συνθήκες τα φυτά αναπαράγονται διαμέσου του σχηματισμού ζυγωτικών εμβρύων. Ο σχηματισμός τους ξεκινάει με την διαίρεση του ζυγωτού μέσα στην ωοθήκη μέχρι την διαφοροποίηση των κυττάρων για των σχηματισμό των νέων οργάνων που τελικά θα δώσουν το νέο φυτάριο. Εναλλακτικά τα φυτάρια μπορούν να σχηματιστούν από σωματικά κύτταρα. Αυτή η διαδικασία η οποία διαφέρει από την φυσική, ονομάζεται σωματική εμβρυογένεση. Όλα τα φυτάρια που θα προέλθουν από την διαδικασία αυτή θα έχουν το ίδιο γενετικό προφίλ. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 25

26 Σωματική εμβρυογένεση Ενκαψιδιωμένα σωματικά έμβρυα Φυτικά μέρη που προορίζονται για σωματική εμβρυογένεση Σωματικά έμβρυα που σχηματίζονται από την καλλιέργεια φυτικών τμημάτων Ενκαψιδιωμένα σωματικά έμβρυα ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 26

27 Γενετική βελτίωση φυτών καλλιέργεια γύρης (Pollen culture) Επειδή οι γυρεόκοκκοι είναι απλοειδής τα φυτά που θα αναγεννηθούν από την ιστοκαλλιέργεια θα είναι και αυτά με την σειρά τους απλοειδή Εάν τροποποιήσουμε απλοειδή φυτά μπορούμε στην συνέχεια να τα μετατρέψουμε σε διπλοειδή, με την χρήση κατάλληλων χημικών ουσιών (π.χ. κολχικίνη). Τα φυτά που θα προέλθουν θα είναι διπλοειδή και ομόζυγα Με τον τρόπο αυτό μπορούμε να παράγουμε καθαρές σειρές σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η μέθοδος έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε διάφορα φυτικά είδη π.χ. σε είδη της οικογένειας των σολανωδών (Solanaceae) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 27

28 Γενετική βελτίωση φυτών καλλιέργεια γύρης (Pollen culture) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 28

29 Γενετική βελτίωση φυτών σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Οι πρωτοπλάστες δημιουργούνται με την αποδόμηση των κυτταρικών τοιχωμάτων μετά την εφαρμογή κατάλληλων ενζύμων Ευαίσθητο σύστημα, εργαζόμαστε προσεκτικά Οι πρωτοπλάστες για να συντηχθούν πρέπει να υποβοηθηθούν: Με την εφαρμογή υψηλής τάσης εναλλασσόμενου ρεύματος Με χρήση του χημικού παράγοντα polyethylene glycole (PEG) Με προσθήκη ιόντων ασβεστίου σε υψηλές τιμές ph Τα κύτταρα-υβρίδια που δημιουργούνται περιέχουν τους πυρήνες και των δυο μητρικών φυτών. Τα φυτά που θα προέλθουν από την αναγέννηση αυτών των διπύρηνων κυττάρων θα περιέχουν χαρακτηριστικά και από τα δυο μητρικά φυτά Δημιουργία νέων ειδών Μεταφορά και ενσωμάτωση χαρακτηριστικών από το ένα είδος στο άλλο πράγμα που είναι αδύνατο να γίνει με άλλο τρόπο ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 29

30 Γενετική βελτίωση φυτών σωματικά υβρίδια-σύντηξη πρωτοπλαστών Πιθανό αποτέλεσμα από την σύντηξη δυο διαφορετικών πρωτοπλαστών = χλωροπλάστης σύντηξη = μιτοχόνδριο = πυρήνας ετεροκάρυο cybrid υβρίδιο υβρίδιο cybrid ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 30

31 Γενετική βελτίωση φυτών εμβρυοκαλλιέργεια Μελέτες ανάπτυξης ενδοσπερμίου Διάσωση εμβρύου που προήλθε από διασταύρωση μεταξύ διαφορετικών ειδών (διειδική) ή και διαφορετικών γενών Γίνεται σε περιπτώσεις που ο βελτιωτής δεν βρίσκει επιθυμητά χαρακτηριστικά ανάμεσα στα φυτά του ίδιου είδους και καταφεύγει σε άλλα είδη και γένη Όσο πιο κοντά, εξελικτικά, βρίσκονται τα είδη τόσο πιο πολλές πιθανότητες υπάρχουν να πετύχει μια διασταύρωση Το έμβρυο που προορίζεται για εμβρυοκαλλιέργεια πρέπει να συλλεχθεί στο κατάλληλο αναπτυξιακό στάδιο, έτσι ώστε να είναι σε θέση να αναπτυχθεί παραπέρα αλλά και να μην έχει πέσει σε λήθαργο ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 31

32 Γενετική βελτίωση φυτών εμβρυοκαλλιέργεια ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 32

33 Γενετική βελτίωση φυτών γενετικός μετασχηματισμός Ο γενετικός μετασχηματισμός δεν θα ήταν δυνατός χωρίς την ανάπτυξη της ιστοκαλλιέργειας, επειδή οι διαδικασίες της γενετικής μηχανικής απαιτούν την αναγέννηση ολόκληρων φυτών από μοναδικά κύτταρα ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 33

34 Γενετική βελτίωση φυτών σωμακλωνική παραλλακτικότητα Αν και η ιστοκαλλιέργεια θεωρείται ότι παράγει πιστά αντίγραφα του μητρικού υλικού, δημιουργείται παραλλακτικότητα Αυτή η παραλλακτικότητα ονομάζεται σωμακλωνική παραλλακτικότητα και στις περισσότερες περιπτώσεις είναι επιγενετική, δηλαδή είναι ασταθής και δεν μεταβιβάζεται στις επόμενες γενιές Έχει δημιουργηθεί μεθοδολογία για την επιλογή φυτικών κυττάρων με ανώτερα χαρακτηριστικά Η εύρεση του σωστότερου τρόπου επιλογής είναι καίριο χαρακτηριστικό. Συνήθως συνδυάζεται με μεταλλαξογόνους παράγοντες (ακτίνες α-βγ-χ, υπεριώδης ακτινοβολία κ.α.) Με τον τρόπο αυτό έχουν δημιουργηθεί ποικιλίες ανθεκτικές σε ιούς, ασθένειες, αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες κ.α. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 34

35 Γενετική βελτίωση φυτών σωμακλωνική παραλλακτικότητα Αφετηρία κάθε προγράμματος γενετικής βελτίωσης αποτελεί η εύρεση διαφοροποιήσεων μεταξύ φυτικών ειδών ως προς το επιθυμητό χαρακτήρα ή διαφορετικά μεταλλαγών, οπότε το φαινόμενο της σωμακλωνικής παραλλακτικότητας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιλογή ανώτερων χαρακτήρων Εφαρμογή φυσικού ή χημικού μεταλλαξογόνου Κυτταροκαλλιέργειες (συνήθως διάλυμα αλλά μπορεί να πετύχει και κάλλο) Εφαρμογή του παράγοντα επιλογής με βάση τον οποίο θα γίνει η επιλογή των ανώτερων χαρακτηριστικών (χρειαζόμαστε μικρό επιβίωσης) πολύ ποσοστό Η ιδέα είναι να εντοπιστούν μοναδικά κύτταρα από ολόκληρη την ιστοκαλλιέργεια Αναγέννηση φυτών από τα κύτταρα που επιβίωσαν ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 35

36 Γενετική βελτίωση φυτών σωμακλωνική παραλλακτικότητα ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 36

37 Γενετική βελτίωση φυτών σωμακλωνική παραλλακτικότητα Επιτυχίες της σωμακλωνικής παραλλακτικότητας Ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα Παραγωγή συγκεκριμένων αμινοξέων (π.χ. λυσίνη στο ρύζι) Αντοχή σε αβιοτικές καταπονήσεις (π.χ. σε αυξημένη αλατότητα ή θερμοκρασία) Αντοχή σε ασθένειες Αποδοτική διαδικασία ελέγχου σωμακλωνικής παραλλακτικότητας Η αναλογία απόδοσης μπορεί να είναι μικρότερη από 1:800, δηλαδή στα 800 κύτταρα (ή περισσότερα) το 1 να υποστεί διαφοροποίηση Οι περισσότερες μεταλλαγές είναι υπολειπόμενες Πρέπει να ελεγχθούν οι επόμενες γενιές για να είμαστε σίγουροι Τα φυτά πρέπει να καταλήξουν να είναι ομόζυγα ως προς το χαρακτηριστικό Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και απλοειδή φυτά Απαιτούνται πολύ μεγάλοι πληθυσμοί για την εύρεση της επιθυμητής μεταλλαγής Χρειάζεται εντατική εργασία ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 37

38 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 38

39 Φυτά Lisianthus σε μέσο ριζοβολίας ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 39

40 Φυτά Cyclamen persicum σε θερμοθάλαμο Ελεγχόμενη ριζοβολία Στάδιο σκληραγώγησης φυτών σε πλήρως ελεγχόμενους θαλάμους, πριν από την έξοδό τους στο εμπόριο ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 40

41 Ιστοκαλλιέργεια Asparagus (σπαράγγια) ανθέων Μόλυνση φυτών από μύκητα Zantedeschia ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 41

42 Έκφραση GUS σε συγκεκριμένους ιστούς του άνθους της φράουλας με χρήση υποκινητή που κλωνοποιήθηκε από την πετούνια Έκφραση του gus γονιδίου κάτω υπό το έλεγχο του υποκινητή NTM19. Με τον υποκινητή αυτό η έκφραση του γονιδίου περιορίζεται στα μικροσπόρια του άνθους του Brassica napus (λάχανο) Ιστοκαλλιέργεια 2n γύρης ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 42

43 Κύτταρο: Η μικρότερη δομική μονάδα των ζωντανών οργανισμών η οποία λειτουργεί ανεξάρτητα. Αποτελείται από ένα ή περισσότερους πυρήνες, κυτόπλασμα και οργανίδια. Όλες αυτές οι δομές περικλείονται από μια ημιδιαπερατή κυτταρική μεμβράνη Πρωτοπλάστης: Η ζωντανή μονάδα του κυττάρου, που αποτελείται από τον πυρήνα και το κυτόπλασμα που περιορίζονται από την κυτταρική μεμβράνη. Δημιουργούνται με την απομάκρυνση των κυτταρικών τοιχωμάτων μετά την δράση ενζύμων που τα αποδομούν Ολοδυναμικότητα (totipotency): Η ικανότητα που έχουν σχεδόν τα περισσότερα ζωντανά φυτικά κύτταρα, διαφοροποιημένα ή όχι να αναγεννούν ένα φυτό, όταν απομονώνονται και καλλιεργούνται σε ένα κατάλληλο μέσο. Ιστός: Σύμπλεγμα όμοιων κυττάρων που είναι οργανωμένα να εκτελούν μια ή περισσότερες λειτουργίες Κλώνοι: Μια ομάδα οργανισμών ή κυττάρων που έχουν προέλθει από ένα μόνο άτομο με αγενή αναπαραγωγή και είναι γενετικώς πανομοιότυπα ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 43

44 Οργανογένεση: Η διαδικασία με την οποία αναπτύσσονται δομές που παρουσιάζουν μορφή και/ή λειτουργία όμοια με αυτήν συγκεκριμένου οργάνου Εμβρυογένεση: Η διαδικασία με την οποία αναπτύσσονται έμβρυα ή σαν έμβρυα δομές από σωματικά κύτταρα (σωματική εμβρυογένεση) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ - ΙΣΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ 44