«IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΡΙΖΑΤΡΙΠΤΑΝΗΣ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΚΕΡΑΤΙΝΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΕΡΜΙΔΑΣ» ΤΡΑΝΤΖΑ ΣΟΦΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΉΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΣΤΗΝ «ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ» «IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΡΙΖΑΤΡΙΠΤΑΝΗΣ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΚΕΡΑΤΙΝΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ ΤΗΣ ΕΠΙΔΕΡΜΙΔΑΣ» ΤΡΑΝΤΖΑ ΣΟΦΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ 1

2 «Στον μπαμπά μου» ΑΘΗΝΑ,

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η συγκεκριμένη ερευνητική εργασία διεκπεραιώθηκε στα πλαίσια του προγράμματος μεταπτυχιακής ειδίκευσης με τίτλο «Βιομηχανική Φαρμακευτική». Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η in vitro μελέτη της διαπερατότητας της ριζατριπτάνης μέσω της κεράτινης στιβάδας της επιδερμίδας. Ο επιβλέπων καθηγητής ήταν ο επίκουρος καθηγητής κ. Παρασκευάς Δάλλας, σχολή Φαρμακευτική, τομέας Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστήμιο Αθηνών. Θα ήθελα να εκφράσω την αμέριστη ευγνωμοσύνη μου στον επιβλέποντα καθηγητή μου όχι μόνο για την διάθεση της συγκεκριμένης εργασίας, αλλά γιατί η συνεχή βοήθειά του, η ενθάρυνσή του και οι συνεχείς συμβουλές και παρατηρήσεις του ήταν το κλειδί για την ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω την αμέριστη ευγνωμοσύνη μου προς τους συναδέρφους κ.τσερκάκη Δήμητρα και κ.κουρέντα Αλέξανδρο για την συνεχή βοήθεια και ενθάρυνσή τους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου για την ενθάρυνσή τους για την ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Ειδικότερα, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην κ. Μαρία Βερτζώνη για την βοηθειά της και τις συμβουλές της. Αθήνα, Αύγουστος 2011 ΤΡΑΝΤΖΑ ΣΟΦΙΑ 3

4 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΔΑΛΛΑΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΦΕΝΤΑΚΗΣ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΡΕΚΚΑΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ A. Θεωρητικό μέρος...11 Κεφάλαιο I -Εισαγωγή...12 I.1.Εισαγωγή...12 Κεφάλαιο ΙΙ- Δομή και λειτουργία του δέρματος...13 II.1.Ιστορική αναδρομή...13 II.2. Δομή του δέρματος...14 ΙΙ.2.1. Επιδερμίδα...15 ΙΙ Κεράτινη στιβάδα...16 ΙΙ Ζώσα επιδερμίδα...17 II Βασική στιβάδα...17 II Ακανθωτή στιβάδα...18 ΙΙ Κοκκιώδης στιβάδα...18 ΙΙ.2.2. Κύτταρα και άλλες μορφές της επιδερμίδας...19 ΙΙ.2.3.Κύριως δέρμα ή χόριο...20 ΙΙ.2.4. Κερατινοποιήση- Προέλευση των λιπιδίων της κεράτινης στιβάδας...21 ΙΙ.3. Διαδερμική χορήγηση φαρμάκων...22 ΙΙ.4. Παράγοντες που επηρεάζουν την απορρόφηση των ουσιών διαμέσω του δέρματος...23 ΙΙ.4.1. Βιολογικοί παράγοντες...23 ΙΙ.4.2.Φυσικοχημικοί παράγοντες

6 ΙΙ.5. Διάχυση διαμέσου του δέρματος...24 ΙΙ.6. Κινητική της απορρόφησης μέσω του δέρματος...27 Κεφάλαιο ΙΙI-Διαδερμικά Θεραπευτικά Συστήματα...30 ΙΙΙ.1. Εισαγωγή...30 IIΙ.2. Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων σε σύγκριση με άλλες φαρμακοτεχνικές μορφές...32 ΙΙΙ.3. Απαιτήσεις διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων...33 ΙΙΙ.4. Μέρη των διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων και κατασκευή...34 ΙΙΙ.4.1. Συστήματα τύπου μήτρας (matrix devices)...35 ΙΙΙ.4.2. Συστήματα τύπου δεξαμενής (reservoir devices)...37 ΙΙΙ.4.3. Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (drug in adhesive devices)...39 ΙΙΙ.4.4.Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (πολλαπλών στρώσεων)( multilaminate drug in adhesive devices)...41 ΙΙΙ.5. Συστατικά των διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων...42 ΙΙΙ.5.1. Στιβάδα στήριξης (backing layer)...42 ΙΙΙ.5.2.Πολυμερή...43 ΙΙΙ.5.3.Μεβράνες που ρυθμίζουν το ρυθμό διαπέρασης του φαρμάκου...43 ΙΙΙ.5.4. Η συγκολλητική στιβάδα (drug containing adhesive layer ή PSA)...44 ΙΙΙ.5.5. Η εξωτερική μεμβράνη (release liner)...45 ΙΙΙ.6.Υποψήφιες δραστικές ουσίες για τα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα...45 ΙΙΙ.7. Μέθοδοι αύξησης της διαπερατότητας του δέρματος...46 ΙΙΙ.7.1. Χημικά μέσα αύξησης της διαπερατότητας- Επιταχυντές διαβατότητας...46 ΙΙΙ Μηχανισμοί δράσης επιταχυντών διαβατότητας

7 ΙΙΙ.7.2. Φυσικά μέσα αύξησης της διαπερατότητας...53 ΙΙΙ Θερμοκρασία...53 ΙΙΙ Υπέρηχοι...54 ΙΙΙ Ηλεκτρική ενέργεια...56 ΙΙΙ.8. In vivo τεχνικές διαδερμικής απορροφήσεως...58 ΙΙΙ.9. In vitro τεχνικές διαδερμικής απορροφήσεως...59 ΙΙΙ.9.1. Διαμέρισμα-δότης...61 ΙΙΙ.9.2. Ενδιάμεση μεμβράνη...61 ΙΙΙ.9.3. Διαμέρισμα-δέκτης...63 Κεφάλαιο IV- Ημικρανία και βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης...65 ΙV.1.Εισαγωγή- Ιστορικά στοιχεία...65 ΙV.2. Ημικρανία και μηχανισμός δράσης...66 IV.3. Τριπτάνια και βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης...67 IV.3.1. Εισαγωγή στα τριπτάνια- Μηχανισμός δράσης...67 IV.3.2. Βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης...68 IV Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά...68 IV Ονομασία κατά IUPAC...68 IV Μοριακός τύπος...69 IV Χημικός τύπος...69 IV Περιγραφή...69 IV Διαλυτότητα...69 IV Μοριακό βάρος...69 IV Log P

8 IV Σημείο τήξης...69 IV Χρόνος ημίσειας ζωής (t ½ )...69 IV Ενδείξεις...69 IV Δοσολογία...69 IV Τοξικότητα- Ανεπιθύμητες ενέργειες...70 IV Μηχανισμός δράσης...70 IV Φαρμακοκινητικά δεδομένα...70 IV Φαρμακοδυναμικά δεδομένα...71 IV.4. Πειραματικός σχεδιασμός...72 IV.5. Σκοπός της εργασίας...75 Β. Πειραματικό Μέρος...77 Κεφάλαιο VI- Μέθοδοι...78 VI.1.Υλικά...78 VI.2. Συσκευές και όργανα...78 VI.3. Μέθοδοι...80 VI.3.1. Πειραματικός σχεδιασμός...80 VI.3.2. Φάσμα απορροφήσεως υπεριώδους...81 VI.3.3. Υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC)...82 VI Κινητή φάση...82 VI Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης...83 VI.3.4. Πειράματα προσδιορισμού καταλληλότητας των επιταχυντών διαβητότητας με τον φορέα

9 VI.3.5. Προσδιορισμός της διαλυτότητας κορεσμού...84 VI.3.6. Παρασκευή των γελών...87 VI.3.7. Ποσοτικός προσδιορισμός των γελών...89 VI.3.8. Προσδιορισμός διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα του δέκτη (receptor solution)...89 VI.3.9. Πειράματα κυττάρων διάχυσης...90 Κεφάλαιο VIΙ- Αποτελέσματα...91 VII.1. Αποτελέσματα λήψης φάσματος υπεριώδους...91 VII.2. Αποτελέσματα πειραμάτων καταλληλότητας του φορέα...92 VII.3. Αποτελέσματα του προσδιορισμοού της διαλυτότητας κορεσμού...93 VII.4. Αποτελέσματα και αναλυτικές συνταγές των γελών...96 VII.5. Αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού των γελών...96 VII.6. Αποτελέσματα της διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα του δέκτη (receptor solution)...98 VII.7. Αποτελέσματα πειραμάτων κυττάρων διάχυσης

10 VII.8.Διερευνητική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (Exploratory Data Analysis) VII.9. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων VII.10.Eπίδραση των επιταχυντών διαβατότητας στη διαδερμική απορρόφηση του άλατος της ριζατριπτάνης VII.11.Υπολογισμός «διαφορικού» αποτελέσματος VΙI.12. Ανάλυση της επίδρασης των επιταχυντών διαβατότητας στη διαδερμική διαπέραση της ριζατριπτάνης VII.13. Υπολογισμός του επιθυμητού ρυθμού διαδερμικής διαπερατότητας (ΕΡΔΔ) VII.14.Συμπεράσματα VIII.1.ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΑ ΕΛΛΗΝΙΚΑ VIII.2.ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΓΓΛΙΚΑ VIII.3.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Βιβλιογραφία

11 A. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ωφελέειν, εỉ μη βλάπτειν Ιπποκράτης 11

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ I.1. Εισαγωγή Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών, διάφορες εξελίξεις στα φαρμακευτικά σκευάσματα και σε καινοτόμες τρόπους χορήγησης τους έχουν γίνει. Η κατανόηση για τη μεταφορά των φαρμάκων μεταξύ των διαφόρων ιστών έχει αυξηθεί. Έτσι, σημαντική έρευνα διεξήχθη κατά την διάρκεια των τελευταίων χρόνων και έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη διαφορετικών τεχνολογιών για την απλούστερη χορήγηση των φαρμάκων μέσω μη επεμβατικών οδών. Μια απο αυτές τις οδούς είναι η διαδερμική χορήγηση των φαρμάκων. Πιο συγκεκριμένα, η διαδερμική χορήγηση των φαρμάκων προσφέρει ποικίλα κλινικά οφέλη συγκριτικά με τις άλλες φαρμακοτεχνικές οδούς χορήγησης των φαρμάκων. Τα οφέλη αυτά μπορεί να αφορούν: 1 i) Την αποφυγή του φαινομένου της πρώτης διόδου. ii) Τη διατήρηση σταθερών επιπέδων του φαρμάκου στο αίμα για μεγάλο χρονικό διάστημα, εντός των θεραπευτικών ορίων. iii) Την βελτίωση της συμμόρφωσης του ασθενή λόγω της μείωσης της συχνότητας χορήγησης και έτσι την απλούστευση του θεραπευτικού σχήματος. iv) Τη μείωση των παρενεργειών Λόγω των παραπάνω πλεονεκτημάτων της χορήγησης μέσω του δέρματος, γίνεται εκτενής αναφορά στην δομή του δέρματος αλλά και στην μορφές των υπαρχόντων θεραπευτικών διαδερμικών συστημάτων με σκοπό την καλύτερη καταννόησή τους. 12

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ II ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ II.1.Ιστορική αναδρομή Διαδερμική είναι η οδός μέσω της οποίας τα ενεργά συστατικά μεταφέρονται μέσω του δέρματος για συστηματική χορήγηση. Χαρακτηριστικά παραδείγματα περιλαμβάνουν διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση ασθενειών καθώς και τοπικής εφαρμογής διαδερμικά συστήματα που χρησιμοποιούνται για αισθητικούς σκοπούς. Το πρώτο εμπορικά διαθέσιμο διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα εγκρίθηκε από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ το Δεκέμβριο του Αποτελούσε σύστημα διαδερμικής χορήγησης σκοπολαμίνης για την ασθένεια της ναυτίας. 2 Κατά την διάρκεια των τελευταίων 22 ετών περισσότερα από 35 διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα έχουν εγκριθεί από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ, τα οποία καλύπτουν μεγάλο αριθμό μορίων αλλά και συνδυασμό αυτών. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν το διαδερμικό σύστημα της φαιντανύλης (Durogesic, Duragesic ) για την καταπολέμηση του χρόνιου πόνου και τα πλέον διαδεδομένα διαδερμικά συστήματα αντισύληψης (συνδυασμός ενός προγεστεγόνου και της αιθυνυλοοιστραδιόλης) με αύξηση των αντισυλληπτικών επιλογών και τη μεγαλύτερη εξατομίκευση της αντισύληψης. 2 Για την καλύτερη καταννόηση της λειτουργίας των διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων γίνεται μια εκτενής αναφορά των δομών και της λειτουργίας του δέρματος. II.2. Δομή του δέρματος Ιστολογικά, το δέρμα αποτελεί ένα πολύπλοκο, πολύστιβο όργανο. Το δέρμα δεν είναι ένα απλό προστατευτικό κάλλυμα για το σώμα.αποτελεί ένα φραγμό ο οποίος παρεμβάλλεται ενεργά μεταξύ του οργανισμού και του περιβάλλοντος. Δεν ελέγχει μόνο την απώλεια πολύτιμων υγρών από το σώμα, αλλά παρεμποδίζει και την 13

14 διείσδυση βλαβερών ξένων ουσιών και της ακτινοβολίας ενώ προστατεύει και από τα μηχανικά χτυπήματα. Επίσης ρυθμίζει την απώλεια θερμότητας και μορφοποιεί τα λαμβανόμενα ερεθίσματα. 3 Η χημική σύσταση του δέρματος περιλαμβάνει: 3 1) Νερό 70% 2) Πρωτεϊνες 25,5% 3)Λιπίδια 2% 4) Ιχνοστοιχεία 0.5% 5) Λοιπά συστατικά 2,0% Όσον αφορά την δομή του δέρματος, αποτελείται από τρεις στιβάδες: την επιδερμίδα ή εξωτερική στιβάδα («epidermis»), τo χόριο («dermis») που αποτελεί την μεσαία στιβάδα και τέλος τον υποδόριο ιστό («subcutaneous tissue») που αποτελεί την κατώτερη στιβάδα του δέρματος. 3 Στο σχήμα 1 φαίνεται η βασική δομή και τα βασικά συστατικά του δέρματος: Σχήμα 1. Απεικόνιση των στιβάδων και των διαφόρων εξαρτημάτων του δέρματος. 14

15 ΙΙ.2.1. Επιδερμίδα Η επιδερμίδα (epidermis) αποτελεί το πιο λεπτό στρώμα του δέρματος, έχει το πάχος ενός φύλλου χαρτιού το οποίο ποικίλλει ανάλογα με το ανατομικό μέρος. Χαρακτηριστικά, στα βλέφαρα το πάχος της είναι περίπου 0.04 mm ενώ στα πέλματα και στις παλάμες περίπου 1.6 mm. 3 Η διαφορά της είναι χαρακτηριστική σε σχέση με το παχύτερο χόριο. Ο βασικός πληθυσμός των κυττάρων της επιδερμίδας δεν είναι ομοιογενής και περιλαμβάνει 4 είδη κυττάρων: τα κερατινοκύτταρα, τα μελανοκύτταρα, τα κύτταρα του Langerhans και τα κύτταρα του Merckel. Επίσης, περιέχει 4 στιβάδες κερατινοκυττάρων οι οποίες από το χόριο προς την εξωτερική στιβάδα της επιδερμίδας είναι, όπως αποκαλύπτει και το Σχήμα 1: η βασική στιβάδα (stratum basale), η ακανθωτή στιβάδα (stratum spinosum), η κοκκιώδης (stratum granulosum) και τέλος η κεράτινη στιβάδα (stratum corneum). 3 Τα κερατινοκύτταρα αποτελούν τον πλεον σημαντικό αριθμητικά κυτταρικό πληθυσμό της επιδερμίδας και το ονομά τους προέρχεται από την βασική λετουργία η οποία είναι η κερατινοποίηση. ΙΙ Κεράτινη στιβάδα Η κεράτινη στιβάδα ή stratum corneum αποτελείται από κύτταρα τα οποία ανάλογα με την ανατομική περιοχή σχηματίζουν διάφορο αριθμό σειρών κυττάρων όπως στην κοιλία και την πλάτη για να φτάσουν τις μερικές εκατοντάδες στην περιοχή του πέλματος. 3 Τα κύτταρα αυτά είναι απύρηνα, πεπλατυσμένα με εξαγωνική δομή πλάτους 0.3 μm και διαμέτρου περίπου 30 μm. 3 Η έκθεση στη υγρασία προκαλεί διόγκωση των κερατινοκυττάρων σε κάθετη κατεύθυνση. Τα κύτταρα αυτά αποτελούνται κύριως από τρεις πρωτεϊνες την κερατίνη, την φιλαγκρίνη και την ινβολουκρίνη. Κάθε κερατινοκύτταρο συνδέεται μηχανικά με τα γειτονικά του από δομές πρωτεϊνικών- καρφιών και δεσμοσωμάτων, οι οποίες συμβάλλουν στη συνοχή του στρώματος της κεράτινης στιβάδας. Τα μεσοκυττάρια λιπίδια παράγονται κυρίως από εξωκύττωση των μεμβρανωδών σωματιδίων και αποτελούνται από λιπιδικές διπλοστοιβάδες που έχουν την μορφή πεπλατυσμένων λιποσωμάτων, το οποίο εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της τελικής διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων. 3 15

16 Στο Σχήμα 2 φαίνεται το κυτταρόπλασμα της κεράτινης στιβάδας το οποίο έχει πλεόν αντικατασταθεί από κερατίνη και τα κυτταρικά τους όρια είναι πλέον ασαφή: Σχήμα 2. Κεράτινη στιβάδα της επιδερμίδας. ΙΙ Ζώσα επιδερμίδα Το στρώμα της επιδερμίδας ακριβώς κάτω από την κεράτινη στιβάδα αποκαλείται ζώσα επιδερμίδα. Η περιοχή αυτή της επιδερμίδας αποτελείται από τρεις στιβάδες: τη βασική στιβάδα (stratum germonativum), την ακανθωτή στιβάδα (stratum spinosum) και την κοκκιώδη στιβάδα (stratum granulosum). 3 II Βασική στιβάδα Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας βρίσκονται στις θηλές της επιφάνειας του χορίου ανάμεσα στις οποίες εκφύονται εκβλαστήσεις της επιδερμίδας και σχηματίζουν μια σειρά κυττάρων. Οι θηλές και οι εκβλαστήσεις αυτές συμβάλλουν 16

17 συχνά στην αύξηση της επιφάνειας του δερματο-επιδερμικού συνδέσμου και συνεπώς των τροφικών και μεταβολικών ανταλλαγών μεταξύ των δυο αυτών ιστών. 4 Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας έχουν κυβοειδές ή κυλινδρινό σχήμα με τον άξονα τους κάθετο μεταξύ της επιδερμίδας και του κυρίως δέρματος. Είναι εμπύρηνα κύτταρα και περιέχουν κοκκία μελανίνης τα οποία συχνά μεταφέρονται από γειτονικά μελανοκύτταρα. Συνδέονται μεταξύ τους με τα κύτταρα της ακανθώδους στιβάδας με μεσσοκυττάριες γέφυρες ή δεσμοσώματα. Το δεσμόσωμα αποτελείται από δύο πλάκες σύνδεσης, μία για στο κυτταρόπλασμα κάθε κυττάρου που συμμετέχει στο σύνδεσμο, ενώ στο κέντρο υπάρχει η μεσοκυττάρια ουσία που αναφέρεται ως γλυκοκάλυκας και αποτελείται κυρίως από γλυκοπρωτείνες. Η μεσοκυττάρια αυτή ουσία μοιάζει με γέλη και εξασφαλίζει τόσο τη συνοχή των επιδερμικών κυττάρων όσο και την διευκόλυνση της διέλευσης υδροφιλικών ουσιών. 3 Επίσης, στην βασική στιβάδα διαιρούνται τα κύτταρα της επιδερμίδας και περίπου το 50% αυτών μεταναστεύουν προς τις επιφανειακές στιβάδες και το υπόλοιπο 50% παραμένουν στη βασική στιβάδα για να πολλαπλασιαστούν. 3 Στο Σχήμα 3 φαίνονται τα κύτταρα της βασικής στιβάδας (basal cells) με τον άξονα κάθετο στην επιδερμίδα και διαφορετικά κατανεμημένα από τα κερατινοκύτταρα: Σχήμα 3. Κύτταρα της βασικής στιβάδας (basal cells). II Ακανθωτή στιβάδα Τα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας σχηματίζουν 3 ή 4 σειρές πολυεδρικών κυττάρων. Έχουν σχήμα πολυεδρικό με στρογγυλό πυρήνα και ροδόχροο 17

18 κυτταρόπλασμα. Πλησιάζοντας στην επιφάνεια του δέρματος τα κερατινοκύτταρα διαμορφώνουν πεπλατυσμένο σχήμα με τον επιμήκη άξονα παράλληλο στην επιφάνεια του δέρματος.τα κύτταρα συνδέονται μεταξύ τους με μεσοκυτταρικές γέφυρες και στα μεσοδιαστήματα υπάρχουν όξινοι βλενοπολυσακχαρίτες (γλυκοσαμινογλυκάνες). Στην περιφέρειά τους, στο μεσοκυττάριο χώρο φέρουν «αγκαθάκια» τα οποία είναι δεσμοσώματα στα οποία προσκολλώνται τονοϊνίδια ενδο-κυτταροπλασματικά. Οι σχηματισμοί αυτοί συμβάλλουν στην επικοικωνία μεταξύ των κυττάρων. 3,4 ΙΙ Κοκκιώδης στιβάδα Τα κύτταρα αυτής της στιβάδας είναι πεπλατυσμένα και το κυτταρόπλασμα τους έχει κοκκία κερατουαλίνης και μικρά σωμάτια που λέγονται σωμάτια του Οdland. 3 Φέρουν μια σκοτεινή ζώνη τριών σειρών κυττάρων τα οποία φέρουν κοκκία. Το πάχος της κοκκιώδους στιβάδας είναι ανάλογο με αυτό της κεράτινης στιβάδας. Εκεί που έχουμε λεπτή κεράτινη στοιβάδα το πάχος της ακανθώδους κυμαίνεται μεταξύ μιας και τριών στιβάδων, ενώ σε περιοχές που η κεράτινη στιβάδα είναι παχιά το πάχος της κοκκιώδους μπορεί να φτάσει και τα δέκα στρώματα. 3 Η κοκκιώδης στοιβάδα αποτελεί την κερατινογόνο ζώνη της επιδερμίδας όπου έχουμε την διάλυση των κυτταρικών οργανιδίων και του πυρήνα. Στην ανώτερη στοιβάδα το κυτταρόπλασμα αποτελείται κυρίως από αθροίσματα κοκκίων κερατουαλίνης και στενά διατεταγμένα τονοϊνίδια με λίγα κυτταροπλασματικά οργανίδια. 3,4 ΙΙ.2.2. Κύτταρα και άλλες μορφές της επιδερμίδας Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η επιδερμίδα αποτελείται από 4 μορφές κυττάρων. Ανάμεσα σε αυτές συγκαταλέγονται τα κύτταρα του Langerhans, τα οποία έχουν την ικανότητα απολεπίσεως και σχηματίζουν ένα δίκτυο δενδριτικών κυττάρων στο μέρος της ακανθωτής στιβάδας το οποίο βρίσκεται πάνω από την βασική. Ένα από τα χαρακτηριστικά στοιχεία των κυττάρων αυτών είναι η παρουσία ενός οργανιδίου που ονομάζεται κοκκίο του Birbeek και το οποίο θεωρείται σαν ειδικό κύτταρο, το οποίο 18

19 δρα στην παρουσία αντιγόνου ομοιάζοντας με τα μακροφάγα και ιδίως με τα δενδριτικά κύτταρα. 3,6 Άλλη μια σημαντική σειρά κυττάρων στην επιδερμίδα είναι τα κύτταρα του Merckel. Αν και η λειτουργία τους είναι ακόμα ελάχιστα γνωστή, είναι γνωστό ότι διαθέτουν κοκκία νευρο-εκκρινή, δεσμοσώματα και ίνες κερατίνης. Είναι επίσης εξακριβωμένο ότι παράγουν ουσίες οι οποίες δρουν σαν νευροδιαβιβαστές. 3,6 Βασική επίσης σειρά κυττάρων στην βασική στιβάδα της επιδερμίδας αποτελούν τα μελανοκύτταρα, κάποια από τα οποία υπάρχουν και στο όρια χορίου και επιδερμίδας και τα καθιστούν ικανά για αλληλεπίδραση με άλλες σειρές κυττάρων μέσα στα οποία συμπεριλαμβάνονται και τα κερατινοκύτταρα. Επίσης, χαρακτηριστική είναι η αντίδραση των μελανοκυττάρων με τα κερατινοκύτταρα (μεταφορά μελανοσωμάτων από τα μελανοκύτταρα στα κερατινοκύτταρα), η οποία θεωρείται μεγίστης σημασίας για τον προσδιορισμό της μελαχρώσεως του δέρματος. 6 Τέλος. μεγίστης σημασίας ρόλο φαίνεται να διαδραματίζει ο δερμo-επιδερμικός σύνδεσμος στη διείσδυση των μεγάλων πρωτεϊνών και των πεπτιδίων ποικίλλου μοριακού βάρους. Συγκεκριμένα ο δερμο-επιδερμικός σύνδεσμος αποτελείται από ένα σύμπλοκο στο οποίο συμμετέχει ένα μελανινοκύτταρο και κερατινοκύτταρα με τα οποία συνδέεται μέσω δενδριτών. 3 Τα κερατινοκύτταρα μπορούν να συνθέσουν ένα μεγάλο αριθμό βιολογικά ενεργών ουσιών, ορισμένες εκ των οποίων ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση ή ορισμένες βιολογικές λειτουργίες των μελανινοκυττάρων (π.χ ρύθμιση της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης των μελανινοκυττάρων). Τέτοιες ουσίες είναι οι αυξητικοί παράγοντες, όπως και η σύνθεση αυξητικών ορμονών και των νευροτροπινών κ.α. 3 ΙΙ.2.3.Κύριως δέρμα ή χόριο Το κύριως δέρμα ή χόριο είναι η περιοχή ακριβώς κάτω απο την επιδερμίδα. Το χόριο περιέχει το 20-40% του συνολικού νερού του οργανισμού και τα κύρια σωμάτια είναι ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα ιστών. Ένα μέρος του νερού που περιέχεται στο χόριο συγκρατείται από τις υδρόφιλες ιδιότητες των πρωτεογλυκανών και δευτερευόντως από τις ινώδεις πρωτεϊνες. 3 19

20 Οι συνδετικές ίνες του χορίου είναι διαφορετικά οργανωμένες σε 4 περιοχές του χορίου όπως το μέρος του χορίου γύρω από τα αγγεία, τα εξαρτήματα του δέρματος, το θηλώδες και το δικτυωτό χόριο, στις βασικές μεμβράνες και στα μέρη όπου το χόριο ενώνεται με το υπόδερμα. 3 Το θηλώδες χόριο συνίσταται από λεπτές ίνες κολλαγόνου, οι οποίες συνήθως είναι προσανατολισμένες προς την βασική μεμβράνη του δερματο-επιδερμικού συνδέσμου. Όμοια με το δίκτυο αυτό οι ελαστικές ίνες κατευθύνονται κάθετα προς τις θήλες του χορίου. Παρόμοιο δίκτυο ινών φέρεται γύρω από την βασική μεμβράνη της περιοχής γύρω από το τριχικό θυλάκιο. 3 Το δικτυωτό χόριο περιλαμβάνει ένα δίκτυο δεσμίδων ινών, κυματοειδές, του οποίου ο προσανατολισμός είναι παράλληλος προς την επιφάνεια της επιδερμίδας. Είναι διατεταγμένα σε διάφορα επίπεδα, ενωμένα μεταξύ τους με δεσμίδες ινών. Η πυκνότητα των δεσμίδων του μέσου χορίου είναι πιο μεγάλη από αυτή του κατώτερου χορίου. Καθεμία από τις δεσμίδες αποτελείται από μια ομάδα ινών ίδιας διαμέτρου, παράλληλων και μη διακλαδούμενων μεταξύ τους. Η άκρη μίας δεσμίδας αποτελείται από μικρές λεπτές υπομονάδες «ριγμένες» και κολλημένες σε μια γειτονική δέσμη ινών. 3 Οι δέσμες του κολλαγόνου περιβάλλονται από ένα δίκτυο ινών οι οποίες είναι τοποθετημένες μάλλον άναρχα. Η δομή και η τοποθέτηση αυτών των ινών ομοιάζει με τις ίνες ρετικουλίνης αποτελούμενες από κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ το οποίο είναι ενωμένο με γλυκοπρωτεϊνες. Τα συστήματα αυτά των ινών, κολλαγόνου και ελαστικών, έχουν σχέσεις πιο άμεσες από αυτές της απλής γειτνιάσεως. Η σχέση αυτή ανάμεσα στα διάφορα δίκτυα των ινών εξηγεί και την συνοχή του χορίου. Οι ίνες της ελαστίνης συμβάλλουν στην κυματοειδή μορφή των δεσμίδων του κολλαγόνου. 3 ΙΙ.2.4. Κερατινοποιήση- Προέλευση των λιπιδίων της κεράτινης στιβάδας Τα λιπίδια που γεμίζουν τον μεσοκυττάριο χώρο της κεράτινης στιβάδας, φαίνεται ότι παίζουν σπουδαίο ρόλο στην συνοχή των κερατινοκυττάρων και στη ρύθμιση της απολέπισης. Επίσης, τα λιπίδια αυτά έχουν το σημαντικό ρόλο των ρυθμιστών του 20

21 φραγμού της υδάτινης διαπερατότητας. Η απομάκρυνση των λιπιδίων με λιπόφιλους διαλύτες έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη διαδερμική απώλεια νερού ενώ το δέρμα εμφανίζεται ξηρό και εύθραυστο. Το φαινόμενο αυτό μαρτυρεί ότι η φυσιολογική λειτουργία του φραγμού επανέρχεται μετά από τοπική εφαρμογή των λιπιδίων. 6,7,8 Μια δεύτερη σημαντική ενέργεια στην επιδερμίδα των θηλαστικών αλλά και του ανθρώπου επιτελείται από τα κύτταρα κάθε στιβάδας της επιδερμίδας τα οποία αποτελούν κύτταρα σε διαφορετικό βαθμό διαφοροποίησης. Έτσι, το φαινόμενο που ονομάζεται κερατινοποίηση, αρχίζει όταν τα κύτταρα της βασικής στιβάδας διαιρούνται σε δυο θυγατρικά, εκ των οποίων το ένα παραμένει στη στιβάδα αυτή, ενώ το άλλο μεταναστεύει προς τις εξώτερες στιβάδες, αλλάζοντας σταδιακά, σύσταση, λειτουργία και μορφή. Τα ζώντα επιδερμικά κύτταρα παράγουν διάφορα προϊόντα ενώ διαφοροποιούνται: ινίδια κερατίνης, κοκκία κερατουαλίνης και μεμβρανώδη σωμάτια. Τα τελευταία εμφανίζονται αρχικά στα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας. Έχουν περιγραφεί σαν δισκίδια διαμέτρου 20 Å. 6,7,8 Τα δισκίδια αυτά αποτελούνται από λιπιδικές διπλοστιβάδες και έχουν την μορφή πεπλατυσμένων λιποσωμάτων. Κατά τα τελευταία στάδια της ζωής των επιδερμικών κυττάρων, στο επίπεδο της κοκκιώδους στιβάδας, τα μεμβρανώδη σωμάτια εξωθούνται στο μεσοκυττάριο χώρο όπου το περιεχόμενό τους αναδιατάσσεται σε ευρείες λιπιδικές στιβάδες. Οι σχηματισμοί αυτοί μπαίνουν ανάμεσα στα κύτταρα καταλαμβάνοντας τελείως τον μεσοκυττάριο χώρο. Το επιδερμικό κύτταρο παράλληλα χάνει όλα τα κυτταρικά οργανίδια και γεμίζει αποκλειστικά με ινίδια κερατίνης και κοκκία κερατουαλίνης. Το τελικό αποτέλεσμα της παραπάνω διαδικασίας είναι ο σχηματισμός της κεράτινης στιβάδας. 7,8 Στα σχήματα 4 και 5 φαίνεται η δομή μια υγιούς κεράτινης στιβάδας αλλά και το πόσο ευαίσθητη, παρόλα αυτά, παραμένει η επιδερμίδα: 21

22 Σχήμα 4.Τομή της υγιούς επιδερμίδας. Σχήμα 5. Υπερκερατινοποίηση. ΙΙ.3. Διαδερμική χορήγηση φαρμάκων Παρόλο που έχει επιτευχθεί σημαντική πρόοδος στη διερεύνηση των γνώσεων σχετικά με την απορρόφηση των φαρμάκων από το δέρμα, δεν υπάρχει ενιαία άποψη για το βασικό μηχανισμό της παραπάνω διαδικασίας. Περιγράφονται γενικά τρεις οδοί εισόδου των φαρμάκων: 1) η μεταξύ των κυττάρων της συνεχούς επιδερμίδας. 2) η διαμέσου των κυττάρων της συνεχούς επιδερμίδας. 3) και η διαμέσου εξαρτημάτων του δέρματος, όπως οι σμηματογόνοι και ιδρωτοποιοί αδένες και οι θύλακες των τριχών. Η είσοδος μιας ουσίας διαμέσω του δέρματος εξαρτάται τόσο από το μηχανισμό μεταφοράς της ουσίας όσο και από τις φυσικοχημικές της ιδιότητες. Οι πολικές ουσίες μεταφέρονται με διαφορετικό μηχανισμό διαμέσου της κεράτινης στιβάδας από τις μη πολικές. Κατά την ενυδάτωση της κεράτινης στιβάδας, το νερό συσσωρεύεται γύρω από τα πρωτεϊνικά μόρια και οι πολικές ουσίες περνούν μέσα από αυτό το ακίνητο στρώμα νερού. Σε αντίθεση, τα μη πολικά μόρια μεταφέρονται διαμέσου ενός μη υδατικού λιποειδικού στρώματος μεταξύ των πρωτεϊνικών μορίων. 10,11 22

23 Γενικά η διαπερατότητα από το δέρμα περιλαμβάνει τη διάλυση της ουσίας στο φορέα της, στη συνέχεια τη μεταφορά της διαλυμένης ουσίας από το φορέα στην επιφάνεια του δέρματος και τέλος τη διάβασή της διαμέσου των στιβάδων του δέρματος. Το πιο βραδύ στάδιο στη διαδικασία αυτή, συνήθως, είναι το πέρασμα διαμέσου της κεράτινης στιβάδας, που προβάλλει και τη μεγαλύτερη αντίσταση στη διάβαση της ουσίας και έτσι περιορίζει και ελέγχει τη διαπερατότητα του φαρμάκου από το δέρμα. Η κεράτινη στιβάδα έτσι θεωρείται ότι είναι μια πυκνή ομοιογενής μεμβράνη που φυσιολογικά ακόμα και ενυδατωμένη αποτελεί μια εξαιρετικά αδιαπέραστη μεμβράνη. 10 ΙΙ.4. Παράγοντες που επηρεάζουν την απορρόφηση των ουσιών διαμέσου του δέρματος Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδερμική απορρόφηση των φαρμάκων διακρίνονται στις παρακάτω κατηγορίες: 12 Βιολογικοί παράγοντες Φυσικοχημικοί παράγοντες ΙΙ.4.1. Βιολογικοί παράγοντες Οι βιολογικοί παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν τη διαδερμική απορρόφηση είναι οι εξής: 12 i. Κατάσταση του δέρματος. ii. Ηλικία του δέρματος. iii. Δέρμα από διάφορες περιοχές του ίδιου είδους πειραματοζώου. iv. Δέρμα από διάφορα είδη. v. Μεταβολισμός από το δέρμα. vi. Ροή του αίματος. ΙΙ.4.2.Φυσικοχημικοί παράγοντες 23

24 Οι φυσικοχημικοί παράγοντες είναι: 12 i. Θερμοκρασία. ii. Συγκέντρωση του φαρμάκου (Η ποσότητα του φαρμάκου η οποία απορροφάται διαδερμικά στη μονάδα του χρόνου αυξάνεται αυξανόμενης της συγκέντρωσής του). iii. Φυσικοχημικές ιδιότητες του φαρμάκου (σχήμα και μέγεθος του φαρμάκου, συντελεστής κατανομής, pη). iv. Αλληλεπιδράσεις φαρμάκου- δέρματος (η κεράτινη στιβάδα δρα σαν «αποθήκη» του δραστικού συστατικού). v. Φορέας του φαρμάκου (κινητήρια δύναμη της μεταφοράς των μορίων του φαρμάκου είναι η διαφορά στο θερμοδυναμικό μεταξύ φορέα και δέρματος). ΙΙ.5. Διάχυση διαμέσου του δέρματος Η διάχυση μέσω του δέρματος, που ελέγχεται κυρίως από την ανώτατη στιβάδα, την κεράτινη στιβάδα, μπορεί να θεωρηθεί ως διάχυση μέσω μιας παθητικής μεμβράνης. Η ροή στη σταθερή κατάσταση (J) ενός φαρμάκου μέσω του δέρματος μπορεί να προσεγγιστεί από το δεύτερο νόμο Fick της διάχυσης : 12 dt 2 C C 2 (Εξίσωση 1) όπου c είναι η συγκέντρωση της ουσίας που διαχέεται, Χ η διανυσματική συντεταγμένη που μετριέται κανονικά στο τμήμα που πρόκειται να έχουμε διάχυση, D είναι ο συντελεστής διάχυσης, και t είναι ο χρόνος. Με τις μελέτες διαπερατότητας των δερμάτων, οι ερευνητές συχνά, χρησιμοποιούν ένα in vitro πρωτόκολλο με μια μεμβράνη που στερεώνεται μεταξύ δύο διαμερισμάτων, ένα από τα οποία είναι η δεξαμενή που περιέχει το φάρμακο (ο χορηγός-δότης) και το άλλο διαμέρισμα που είναι το διαμέρισμα δέκτης και περιέχει ένα διάλυμα υποδοχής με σκοπό την επίτευξη συνθηκών δεξαμενής (ουσιαστικά μηδενική συγκέντρωση). Μετά από αρκετό χρόνο, 24

25 η διάχυση σταθερής κατάστασης από τη μεμβράνη επικρατεί. Υπό αυτούς τους όρους η παραπάνω εξίσωση (1) μπορεί να απλοποιηθεί στην εξής μορφή : 13 dm dt DC O (Εξίσωση 2) h όπου m είναι η συσσωρευτική μάζα που περνά (διαχέεται) ανά μονάδα επιφάνειας του δέρματος μέσω της μεμβράνης σε χρόνο t, Co είναι η συγκέντρωση της ουσίας που πρόκειται να διαχυθεί στο πρώτο στρώμα της μεμβράνης στην επιφάνεια του δέρματος ερχόμενη σε επαφή με την πηγή του επιταχυντή διαβατότητας, και h είναι το πάχος των μεμβρανών. Δύο είναι οι βασικοί μηχανισμοί μεταφοράς μάζας που γίνεται εξαιτίας της τυχαίας μοριακής κίνησης των σωματιδίων μιας ουσίας. Η τάση προς διάχυση συνδυάζεται με μία βαθμίδα συγκέντρωσης. Η μελέτη της πορείας της διάχυσης γίνεται με εξέταση της ροής των μορίων μιας ουσίας διαμέσου πολυμερούς που λειτουργεί ως φράγμα. Η διέλευση της ύλης από μία μεμβράνη μπορεί να γίνει με απλή μοριακή δίοδο των σωματιδίων ή με μετακίνηση της ύλης διαμέσου των πόρων και των διαύλων της μεμβράνης. Σε υλικά που δεν έχουν πόρους, όπως στην προκειμένη περίπτωση το δέρμα, η μοριακή διάχυση των μορίων μέσω του δέρματος εξαρτάται από τη διαλυτότητα των δραστικών συστατικών που διέρχονται από την μεμβράνη (δέρμα). 13,14 Στα περισσότερα πειράματα είναι δύσκολο να μετρήσει κανείς την C 0 αλλά τη Cο, που είναι η συγκέντρωση της διαχεόμενης ουσίας στο διαμέρισμα του δέκτη. Οπότε οι Cο και Cο συσχετίζονται μέσω της σχέσης : 13 C O =K.C 0. (Εξίσωση 3) Αντικατάσταση της εξίσωσης (3) στην (2) δίνει: dm D. C0. P dt h ' (Εξίσωση 4) 25

26 Από την εξίσωση (4), που είναι η κλασική εξίσωση που χρησιμοποιείται για να αναλύσει τη διάχυση φαρμάκων μέσω του δέρματος μπορεί να φανεί ότι η ροή (Dm/Dt) ελέγχεται κυρίως από το συντελεστή διάχυσης του φαρμάκου στην κεράτινη στιβάδα, τη διαλυμένη συγκέντρωση του φαρμάκου στο φορέα διάχυσης, το συντελεστή μερισμού μεταξύ της μορφοποίησης και της κεράτινης στιβάδας, καθώς και το πάχος της μεμβράνης. 13,14 Αυτή η εξίσωση επεξηγεί μερικές από τις μεταβλητές που μπορούν να τροποποιηθούν κατά την εφαρμογή ενός επιταχυντή διαβατότητας στο δέρμα. Η δυνατότητα μιας ουσίας, που βρίσκεται σε συγκεκριμένο φορέα, να διαπερνά λίγο ή πολύ την κεράτινη στιβάδα χαρακτηρίζεται από το συντελεστή διαπερατότητας (Κρ) που λαμβάνει υπόψη του ταυτόχρονα τους συντελεστές διαχύσεως (D) και κατανομής (p), όπως και το πάχος (h) της κεράτινης στιβάδας: 13 K D. Cp H (Εξίσωση 5) Η μονάδα μετρήσεως του Κρ είναι το cm\sec. Όπως ο νόμος του Fick στη σύλληψη του θεωρείται όμοιος του αντίστοιχου του Ohm, η αντίσταση στην απορρόφηση αντιστοιχεί στο αντίστροφο του συντελεστή διαπερατότητας. 13 R K K ό (Εξίσωση 6) sc e d 1. Ke: ο συντελεστής διαπερατότητας της επιδερμίδας, 2. Κd : ο συντελεστής διαπερατότητας του χορίου (dermis), 3. όπου Κsc: ο συντελεστής διαπερατότητας της κεράτινης στιβάδας, 4. Και R ολικό είναι η συνολική αντίσταση και ισούται με το άθροισμα των επιμέρους αντιστάσεων των δομών που σχηματίζουν το δέρμα (κεράτινη στοιβάδα,επιδερμίδα,χόριο). Επειδή όμως οι αντιστάσεις της επιδερμίδας και του δέρματος είναι αμελητέες συγκριτικά με αυτήν της κεράτινης στιβάδας, η συνολική αντίσταση του δέρματος ισούται με αυτή της κεράτινης στιβάδας. 26

27 ΙΙ.6.Κινητική της απορρόφησης μέσω του δέρματος Συγκέντρωση Δότης C1 C2 Δέκτης H Φραγμός Σχήμα 6. Απεικόνιση της μεταφοράς του φαρμάκου διαμέσου ημιπερατής μεμβράνης. Με βάση το παραπάνω σχήμα (6), αν υπολογίσουμε το εμβαδό της επιφάνειας s και to πάχος h του φραγμού που χωρίζει ένα πειραματικό κύτταρο διάχυσης (πχ.κύτταρο Franz) και υποθέτοντας ότι η συγκέντρωση του φαρμάκου που διαχέεται είναι στην πλευρά του φραγμού προς τον δότη C 1 και στην πλευρά του φραγμού προς τον δέκτη είναι C 2,τότε ο πρώτος νόμος του Fick γράφεται: 12,13,14 C1 2 J D dm sdt C h (Εξίσωση 7) Όπου C 1 -C 2 /h είναι κατά προσέγγιση η βαθμίδα συγκέντρωσης.οι συγκεντρώσεις C 1 και C 2 δεν είναι γνωστές μπορούν όμως να αντικατασταθούν με το γινόμενο του συντελεστή μερισμού Κ, επί τη συγκέντρωση από στην πλευρά του φραγμού προς τον δότη C d και επί τη συγκέντρωση προς την πλευρά του δέκτη Cr. Αυτό διότι ο συντελεστής κατανομής Κ δίνεται από τη σχέση: 12,13 C C C 2 k 1 d C r (Εξίσωση 8) 27

28 Από τις εξισώσεις 7 και 8 έχουμε: dm DSK( C Cr ) d dt h (Εξίσωση 9) Oταν έχουμε συνθήκες δεξαμενής όπως και επιδιώκουμε στις in vitro μελέτες διάχυσης φαρμάκων μέσω της κεράτινής στοιβάδας τότε στο διαμέρισμα του δέκτη ισχύει: 13 dm dt DSKC h d (Εξίσωση 10) dm dt PSC d (Εξίσωση 11) Όπου P=D.k/h είναι ο συντελεστής διαπερατότητας και έχει μονάδες ταχύτητας cm 2 /sec. 28

29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙI ΔΙΑΔΕΡΜΙΚΑ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΙΙΙ.1. Εισαγωγή Από τα πολύ παλιά χρόνια η χρησιμοποίηση διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων για θεραπευτικούς σκοπούς ήταν γνωστή και εφαρμόζονταν στην καθημερινή πρακτική. Το διαδερμικό σύστημα της μουστάρδας που εφάρμοζαν οι παλιές νοικοκυρές σε περιπτώσεις κρυολογημάτων και αναπνευστικής δυσχέρειας αποτελεί μία τέτοια περίπτωση. 15 Δημιουργούσαν μία αλοιφή με σκόνη από σπόρους μουστάρδας αναμεμειγμένους με ζεστό νερό την οποία άπλωναν σε ένα ύφασμα και με αυτό περιέδεναν τον ασθενή. Η υγρασία και η ζέστη του σώματος ενεργοποιούσε ένα ένζυμο (myrosin) που υπάρχει στην μουστάρδα και έτσι δημιουργούνταν μία ουσία (allyl-isothio-cyanate) η οποία ήταν ιδανική για να διαπεράσει το δέρμα. Ήταν δηλαδή λιπόφιλη, δραστική σε μικρή δόση και το μοριακό βάρος της ήταν 90 daltons. 15 Η δράση του διαδερμικού συστήματος διαρκούσε για όσο χρόνο ήταν δεμένο πάνω στον ασθενή. Πιο εξελιγμένο σύστημα θεωρήθηκε αυτό που περιείχε αρσενικό που χορηγούσαν για τη θεραπεία της σύφιλης πριν την ανακάλυψη της πενικιλλίνης. 15 Παρ όλα αυτά, υπήρχε πριν περίπου 50 χρόνια η άποψη από πολλούς επιστήμονες ότι το δέρμα είναι αδιαπέραστο για τις περισσότερες χημικές ουσίες και χρειάστηκαν οι εργασίες των Feldemann και Maibach για να αποδείξουν ότι ουσίες με μοριακό βάρος κάτω των 600 daltons και με κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες, όπως η λιποφιλικότητα, είναι δυνατόν να διαπεράσουν το φυσιολογικό δέρμα. 16 Τα ευρήματα αυτά άνοιξαν το δρόμο για την έρευνα της δυνατότητας χορήγησης φαρμάκων διαμέσου του δέρματος, είτε για τοπική, είτε για συστηματική δράση. Έτσι με τον όρο διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα (ΔΘΣ) νοείται σύστημα που εφαρμόζεται πάνω στο δέρμα με σκοπό να επιτευχθούν σταθερά επίπεδα του φαρμάκου μέσα στο θεραπευτικό εύρος της εκάστοτε θεραπευτικής ουσίας. 16 Μερικά παραδείγματα διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων φαίνονται στον Πίνακα 1: 29

30 Πινακας Ι. Εγκεκριμένα συστήματα διαδερμικής απορρόφησης από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (1998). Η διαδερμική χορήγηση αποτελεί μια ιδιαίτερα σημαντική οδό εισόδου του φαρμάκου στον οργανισμό αφού «μεταφέρει» ακριβή ποσότητα του φαρμάκου διαμέσου του δέρματος για συστηματική δράση. Παρόλα αυτά, η εφαρμογή της διαδερμικής χορήγησης περιορίζεται από διάφορους παράγοντες που έχουν να κάνουν με την δύσκολη διάχυση μεγάλων μορίων μέσω ανθεκτικών βιολογικών στιβάδων του οργανισμού. Γενικά, και κάτω από τις πιο ιδανικές συνθήκες, μόνο 1 mg φαρμάκου μπορεί να διαπεράσει 1 cm 2 επιφάνειας δέρματος μέσα σε 24 ώρες. 16 Φαρμακευτικές ουσίες οι οποίες έχουν σημείο τήξης πάνω από 150º C και μοριακό βάρος άνω των 500 daltons, μπορεί να μειώσουν τον παραπάνω αριθμό διαπέρασης κατά 10, ή και 100 φορές ή και ακόμα και περισσότερο

31 Έτσι, η διαδερμική χορήγηση αποτελεί όχι μόνο μια διαδικασία που πλεονεκτεί σε σχέση με άλλες διαδικασίες χορήγησης των φαρμάκων, αλλά πολλές φορές διαθέτει και μειονεκτήματα. IIΙ.2. Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα διαδερμικών θεραπευτικών συστημάτων σε σύγκριση με άλλες φαρμακοτεχνικές μορφές Το εξαιρετικό ενδιαφέρον και η αποδοχή που παρουσιάζουν τα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα οφείλεται στα ξεχωριστά πλεονεκτήματα που παρουσιάζουν έναντι των άλλων οδών χορήγησης. Μεταξύ άλλων περιλαμβάνουν: 16 Την αποφυγή του φαινομένου της πρώτης διόδου. Τη δυνατότητα ανάπτυξης σταθερού ρυθμού αποδέσμευσης που οδηγεί σε σταθεροποιημένη συγκέντρωση στο αίμα, πάντα σε αντιδιαστολή με την διακύμανση των επιπέδων στην χορήγηση μέσω άλλων οδών. Τη δυνατότητα παρασκευής φαρμακοτεχνικών μορφών με διάρκεια αποδέσμευσης 1-7 ημέρες. Την ύπαρξη σταθερότερων και λιγότερο δραστικών συνθηκών που επικρατούν στην peros χορήγηση. Την ευκολία χορήγησης καια απομάκρυνσης της φαρμακοτεχνικής μορφής. Όμως όπως κάθε φαρμακοτεχνική μορφή και η συγκεκριμένη τεχνολογία διαθέτει κάποια μειονεκτήματα όπως: Η πιθανότητα να υπάρξει τοπικός ερεθισμός στο σημείο της εφαρμογής. Στο μεγάλο κόστος της διαδερμικής τεχνολογίας (υλικά, διαλύτες, επιταχυντές). Για την καλύτερη καταννόηση της λειτουργίας των θεραπευτικών διαδερμικών συστημάτων γίνεται παρακάτω μια εκτενή αναφορά στις απαιτήσεις που πρέπει να έχει ένα διαδερμικό σύστημα απορρόφησης το οποίο κυκλοφορεί ήδη στην αγορά. 31

32 ΙΙΙ.3. Απαιτήσεις διαδερμικών συστημάτων απορρόφησης Οι απαιτήσεις που πρέπει να διαθέτει ένα διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα για να αποκαλείται «ιδανικό», μαζί με το περιεχομενό του φάρμακο και επιταχυντή διαβατότητας- έχουν ανασκοπηθεί με μεγάλη λεπτομέρεια. 16 Οι απαιτήσεις που αφορούν τα διαδερμικά συστήματα σαν προϊόντα βασίζονται σε κάποιες βιοφαρμακευτικές σταθερές του προϊόντος, στις φυσικές ιδιότητες της δοσολογικής μορφής, στις προτιμήσεις των καταναλωτών, στην συμμόρφωση των ασθενών που συχνά έχει να κάνει με την ευκολία της χρήσης του προϊόντος, στην ιατρική λογική, στην εξάλειψη των ανεπιθύμητων ενεργειών και ακολούθως: Στη διάρκεια μέχρι και 2 χρόνια. 2. Στο μικρού μεγέθους σύστημα διαδερμικής απορρόφησης (μέχρι 40 cm 2 ). 3. Στην κατάλληλη συχνότητα δόσης (πχ. μια φορά την ημέρα για μια φορά την εβδομάδα). 4. Στην απλή συσκευασία (πχ. ελάχιστος αριθμός πλαισίου προστασίας του συστήματος ή και βημάτων για την εφαρμογή του συστήματος). 5. Στην εύκολη αφαίρεση της μεμβράνης του διαδερμικού (για κατηγορίες ασθενών όπως τα παιδιά και οι ηλικιωμένοι). 6. Στην επαρκή προσκόλληση του διαδερμικού στο δέρμα (πχ. χωρίς την αφαίρεσή του κατά την διάρκεια των δόσεων και στην εύκολη αφαίρεση χωρίς τραυματισμό του δέρματος). 7. Στη μη εμφάνιση υπολειμμάτων (πχ. «ψυχρή ροή» γύρω από την άκρη του διαδερμικού στην αποθήκευση ή μετά την εφαρμογή στο δέρμα ή στην περιοχή κάτω από την εφαρμογή του διαδερμικού συστήματος όταν αφαιρεθεί). 8. Στην εμφάνιση μη αποδεκτών δερματικών αντιδράσεων (πχ. δερματίτιδα εξ επαφής, ευαισθητοποίηση του δέρματος, φωτοτοξικότητα, φωτοευαισθησία, ερύθημα, διαβροχή, φαγούρα, κάψιμο κλπ.). 9. Στη σταθερή βιοφαρμακευτική απόδοση (πχ. ακρίβεια των απαιτούμενης φαρμακοκινητικής και φαρμακοδυναμικής απόκρισης μεταξύ των ατόμων ή και στο ίδιο άτομο στη πάροδο του χρόνου). Πρακτικά, οι παραπάνω απαιτήσεις σπάνια μπορούν να επιτευχθούν, και συνήθεις απαιτήσεις είναι η αποτελεσματικότητα και η συμμόρφωση του ασθενούς. 32

33 ΙΙΙ.4. Μέρη των διαδερμικών συστημάτων απορρόφησης και κατασκευή Τα διαδεμικά συστήματα απορρόφησης (ΔΘΣ) αποτελούν εύκαμπτες φαρμακοτεχνικές μορφές, οι οποίες περιέχουν ένα ή περισσότερα δραστικά συστατικά και προορίζονται για εφαρμογή σε ακέραιο δέρμα, με σκοπό τη συστηματική δράση του φαρμάκου, αφού αυτό περάσει το προστατευτικό φραγμό του δέρματος. Ανάλογα με την τεχνολογία κατασκευής τους, τα ΔΘΣ, κατατάσσονται στις παρακάτω κατηγορίες (Σχήμα 7): 17,18,19,20,21,22 1. Συστήματα μήτρας (matrix devices). 2. Συστήματα δεξαμενής (reservoir devices). 3. Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στιβάδα (drug in adhesive devices). 4. Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (πολλαπλών στρώσεων)( multilaminate drug in adhesive devices) Σχήμα 7. Τύποι διαδερμικών συστημάτων απορρόφησης: 1) Συστήματα μήτρας (matrix devices), 2) Σύστημα δεξαμενής (reservoir devices), 3) Συστήμα στo οποίo το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (drug in adhesive devices), 4)Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (πολλαπλών στρώσεων)(multilaminate drug in adhesive devices). 33

34 ΙΙΙ.4.1. Συστήματα τύπου μήτρας (matrix devices) Τα διαδερμικά συστήματα τύπου μήτρας είναι παρόμοια με τα διαδερμικά συστήματα τύπου δεξαμενής (reservoir devices), αλλά έχουν δυο ξεχωριστά χαρακτηριστικά: 17,18,19 Το φάρμακο είναι ενσωματωμένο σε μια ημιστερεή μορφή. Δεν υπάρχει μεμβράνη που να ρυθμίζει το ρυθμό εξόδου του φαρμάκου. Παρόλα αυτά, όμοια με τα συστήματα δεξαμενής, το φάρμακο διατηρείται μέσα σε ένα διάλυμα ή σε ενιαιώρημα. Το υλικό του διαδερμικού που είναι υπεύθυνο για την συγκόλληση στο δέρμα ενσωματώνεται σε μια υπερκείμενη στιβάδα και δημιουργεί μια ομόκεντρη στιβάδα γύρω από το ημιστερεή δεξαμενή του φαρμάκου. Η μορφή αυτή των διαδερμικών συστημάτων είναι η πιο απλή από τους τέσσερις τύπους της διαδερμικής χορήγησης. Στην πιο βασική μορφή του, το διαδερμικό σύστημα αποτελείται από μια γέλη φαρμάκου η οποία έρχεται σε επαφή με το δέρμα μέσω μιας υπερκείμενης συγκολλητικής στιβάδας. Ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του μορίου του φαρμάκου και τα έκδοχα που χρησιμοποιούνται στην ημιστερεή «δεξαμενή» του φαρμάκου, μπορεί να αποβεί απαραίτητη η ύπαρξη μια αδιαπέραστης μεμβράνης με σκοπό την ελαχιστοποίηση τυχόν μεταφοράς του φαρμάκου ή και εκδόχων στην στιβάδα του συγκολλητικού. Παρόλα αυτά, σε ένα ολοκληρωμένο διαδερμικό σύστημα τύπου μήτρας, ούτε το φάρμακο αλλά ούτε και τα έκδοχα έρχονται σε επαφή με την στιβάδα του συγκολλητικού. Γι αυτό το λόγο, πολυπλοκότητες στη συνταγή που έχουν να κάνουν με αλληλεπίδρασεις φαρμάκου/συγκολλητικού και εκδόχων/συγκολλητικού είναι συνετό να αποφεύγονται. 16,17,18 Τα χαρακτηριστικά της απελευθέρωσης του φαρμάκου στα συστήματα τύπου μήτρας εξαρτώνται από τον σχεδιασμό της ημιστερεής «δεξαμενής». Δεν υπάρχει μεμβράνη στήριξης η οποία να λειτουργεί σαν στιβάδα αποδέσμευσης με αργό ρυθμό. Η αποδέσμευση του φαρμάκου από την ημιστερεή μήτρα γίνεται κατευθείαν στην επιφάνεια του δέρματος, όπου ο ρυθμός μεταφοράς ελέγχεται από την κεράτινη στιβάδα. Όπως και στους τέσσερις τύπους διαδερμικής χορήγησης, κάποιοι τύποι εκδόχων μπορούν να προστεθούν στην συνταγή του φαρμάκου και μπορούν να 34

35 τροποποιήσουν την λειτουργία της κεράτινης στιβάδας ως μεμβράνης, και έτσι να μεταβάλλλουν και τον ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου. 16,17,18 Όπως και στο διαδερμικό σύστημα τύπου δεξαμενής, έτσι και στον τύπο της μήτρας η διαμόρφωση της μήτρας συνεπάγεται συγκεκριμένα φυσικά χαρακτηριστικά. Το πιο σημαντικό από αυτά είναι το συνολικό μέγεθος του συστήματος τύπου μήτρας. Διαχωρισμός της συγκολλητικής στιβάδας από την ημιστερεή μήτρα απαιτεί ότι η συνολική επιφάνεια του διαδερμικού θα εκτείνεται πιο πέρα από την «περιοχή» της ημιστερεής μήτρας. Το πόσο εκτείνεται η συγκολλητική στιβάδα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το πάχος της ημιστερεής μήτρας εντός της κατασκευής. Όσο πιο παχύτερη είναι η μήτρα, τόσο πιο ευρεία πρέπει να είναι η συγκολλητική στιβάδα με σκοπό την επαρκή συγκόλληση στο δέρμα. Στο Σχήμα 8 φαίνεται ένα διαδερμικό σύστημα απορρόφησης τύπου μήτρας: Σχήμα 8. Διαδερμικό σύστημα απορρόφησης τύπου μήτρας. ΙΙΙ.4.2. Συστήματα τύπου δεξαμενής (reservoir devices) Ένα διαδερμικό σύστημα τύπου δεξαμενής χαρακτηρίζεται από τον εγκλεισμό ενός υγρού διαμερίσματος το οποίο περιέχει διάλυμα του φαρμάκου ή ενιαιώρημά του, το οποίο διαχωρίζεται από την ζώνη αποδέσμευσης από μια ημιπερατή μεμβράνη σε συνδυασμό με βιοπροσκολλητικό υλικό. Ο βιοπροσκολλητικός παράγοντας που είναι υπεύθυνος για την προσκόλληση στο δέρμα μπορεί να εισαχθεί σαν ένα συνεχές στρώμα ανάμεσα στην μεμβράνη του πολυμερούς και της ζώνης αποδέσμευσης (πχ. διαδερμικό σύστημα προσώπου) ή σαν μια ομόκεντρη επιφάνεια γύρω από τη μεμβράνη του πολυμερούς. Τα περισσότερα συστήματα διαδερμικής απορρόφησης τύπου δεξαμενής που κυκλοφορούν αυτή τη στιγμή στην αγορά είναι έτσι 35

36 σχεδιασμένα ώστε να φέρουν συγκολλητικό για την μεγιστοποίηση της επαφής με το δέρμα. 18,19,20 Η υγρή συνταγή του φαρμάκου μέσα σε ένα διαδερμικό σύστημα δεξαμενής είναι σχετικά απλή σε σχεδιασμό, δίνοντας την δυνατότητα μια «υγρής φάσης» μέσα στην οποία όλα τα έκδοχα και κάποια ποσότητα του φαρμάκου υπάρχουν. Το φάρμακο διατηρείται μέσα στην συνταγή σε μια κατάσταση πλήρους ή μερικής διαλυτοποίησης με την χρήση κατάλληλου υγρού φορέα. Το φάρμακο είναι εκλεκτικά διαπερατό στην στιβάδα του πολυμερούς και μεταφέρεται μέσω παθητικής διάχυσης μέσω της μεμβράνης του πολυμερούς προς το δέρμα. 19,20 Η σωστή επιλογή της μεμβράνης του πολυμερούς είναι κρίσιμη για την σωστή λειτουργία και κατασκευή ενός διαδερμικού συστήματος τύπου δεξαμενής. Τα χαρακτηριστικά διάχυσης του φαρμάκου στο διαδερμικό σύστημα καθορίζουν το ρυθμό με τον οποίο το φάρμακο αποδεσμεύεται από το διαδερμικό σύστημα. Η μεμβράνη του πολυμερούς πρέπει να επιδεικνύει εκλεκτική διαπερατότητα του φαρμάκου επί του μέσου «δεξαμενής». Σε μερικές περιπτώσεις η μεμβράνη του πολυμερούς μπορεί να σχεδιαστεί έτσι ώστε να επιτρέπει την δίοδο και στο φάρμακο και σε ένα ή περισσότερα έκδοχα της συνταγής, τα οποία έχουν εισαχθεί ως επιταχυντές διαβατότητας για να τροποποιήσουν την λειτουργικότητα της κεράτινης στιβάδας. Αφού η μηδενική κινητική αποδέσμευσης είναι χαρακτηριστική για τα διαδερμικά συστήματα τύπου δεξαμενής και βασίζεται στην διατήρηση μιας σταθερούς συγκέντρωσης φαρμάκου μέσα στα όρια του διαλύματος, η αποδέσμευση του φαρμάκου στα συστήματα τύπου δεξαμενής εξαρτάται από την φύση της συνταγής και των εκδόχων τα οποία χρησιμοποιούνται κάθε φορά στη συγκεκριμένη συνταγή. Η αποδοτικότητα της αποδέσμευσης ενός διαδερμικού συστήματος είναι ίση της ποσότητας του φαρμάκου που αποδεσμεύεται μέσα στην περίοδο χορήγησης και διαιρούμενη με το ολικό περιεχόμενο του διαδερμικού συστήματος. Χαρακτηριστικά είναι τα ποσοστά αποδοτικότητας για το ρυθμό της αποδέσμευσης των διαδερμικών συστημάτων τύπου δεξαμενής στις ΗΠΑ και κυμαίνοντα από 7% μέχρι 72%. Τα δυο αυτά ποσοστά αντιπροσωπεύουν τους ρυθμούς αποδέσμευσης των διαδερμικών συστημάτων Estraderm και Duragesic, τα οποία ήδη κυκλοφορούν στην κατανάλωση. 20,21 36

37 Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά των διαδερμικών συστημάτων τύπου δεξαμενής τα οποία χρειάζεται να τονιστούν είναι η πολυπλοκότητα των στιβάδων στο σύστημα που χρειάζονται για να επιτευχθεί το αποτέλεσμα που απαιτείται. Ένα τυπικό διαδερμικό σύστημα δεξαμενής (πχ. Transderm- Nitro ) αποτελείται από τις εξής στιβάδες: η ζώνη αποδέσμευσης, η υγρή στιβάδα δεξαμενής, η μεμβράνη του πολυμερούς, η στιβάδα του συγκολλητικού υλικού και η προστατευτική ζώνη αποδέσμευσης. Το αποτέλεσμα του συστήματος είναι ένα σύστημα λιγότερο αποδεκτό από τον καταναλωτή. Γι αυτό το λόγο, η ζώνη αποδέσμευσης, η μεμβράνη του πολυμερούς και οι συγκολλητικές στιβάδες εκτείνονται πέρα από τα όρια της υγρής στιβάδας δεξαμενής. Αυτός ο σχεδιασμός προσφέρει ένα είδος ομόκεντρης «σφραγίδας» στον υγρό φορέα αλλά παράλληλα επεκτείνει και το ολικό μέγεθος του διαδερμικού συστήματος. 20,21 Στο Σχήμα 9 φαίνεται ένα διαδερμικό σύστημα τύπου δεξαμενής: Σχήμα 9. Διαδερμικό σύστημα τύπου δεξαμενής. ΙΙΙ.4.3.Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (drug in adhesive devices) Τα συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στιβάδα αποτελούνται από τη στιβάδα στήριξης (backing layer), την εξωτερική μεμβράνη (release liner) που απομακρύνεται πριν την εφαρμογή του συστήματος στο δέρμα και τη συγκολλητική στιβάδα εντός της οποίας έχει ενσωματωθεί το φάρμακο (drug containing adhesive layer), με τη βοήθεια της οποίας επιτυγχάνεται η προσκόλληση στο δέρμα. 22,23 Στο Σχήμα 10 φαίνονται τα κυριότερα μέρη ενός διαδερμικού 37

38 θεραπευτικολυ συστήματος στο οποίο το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στιβάδα: Σχήμα 10. Κυριότερα μέρη διαδερμικού συστήματος στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στιβάδα. Επίσης τα παραπάνω συστήματα διαθέτουν το χαρακτηριστικό της έγκλεισης του φαρμάκου κατευθείαν στη στιβάδα του συγκολλητικού. Σε αυτά τα συστήματα το συγκολλητικό πληρεί την λειτουργία της βοήθειας της συγκόλλησης του διαδερμικού στο δέρμα και εξυπηρετεί και τον ρόλο του φορέα, ο οποίος περιέχει το φάρμακο και τα υπόλοιπα συστατικά κάτω από μια ενιαία υποστηρίζουσα ταινία. Τα συστήματα αυτά θεωρούνται ότι αποτελούν την εξέλιξη της τεχνολογίας στα διαδερμικά συστήματα απορρόφησης, συμπεριλαμβάνοντας στην κατηγορία αυτή 5 από τα 8 τελευταία διαδερμικά συστήματα που κυκλοφορούν στην αγορά (Testoderm, Climara, Habitrol, Nicoderm και Nicotrol ) των ΗΠΑ Τα διαδερμικά αυτά συστήματα περιέχουν έναν επιπλέον βαθμό πολυπλοκότητας στην συνταγή του φαρμάκου. Η εισαγωγή του φαρμάκου και των συστατικών απευθείας στην στιβάδα του συγκολλητικού απαιτεί όχι μόνο ότι το φάρμακο θα μπορεί να απελευθερωθεί από το σύστημα με ένα αναπαραγώγιμο τρόπο, αλλά και ότι τα χαρακτηριστικά του συγκολλητικού θα πρέπει να διατηρούνται καθόλη την διάρκεια της εφαρμογής του διαδερμικού συστήματος, όταν το φάρμακο και τα έκδοχα της συνταγής αρχίζουν και ελαχιστοποιούνται σε ποσότητα από το διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα. Επίσης, για να μπορεί να γίνει η έγκλειση αυτή του φαρμάκου και των υπόλοιπων συστατικών της συνταγής στη στιβάδα του συγκολλητικού, θα πρέπει ληφθούν υπόψιν όλες οι χημικές ιδιότητες του υλικού που πρόκειται να 38

39 χρησιμοποιηθεί ως συγκολλητικό και ξεχωριστά σε κάθε περίπτωση συνταγής. Αυτό το γεγονός καθιστά την κατηγορία αυτή των διαδερμικών συστημάτων ιδιαίτερα πολύπλοκη σε σχέση με τους υπόλοιπους τύπους Παρόλα αυτά όταν υπάρχει σωστός σχεδιασμός και κατασκευή του διαδερμικού συστήματος, ο τύπος αυτός των διαδερμικών συστημάτων διαθέτει κάποια φυσικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα διαδερμικά συστήματα τύπου μήτρας και δεξαμενής. Ανάμεσα σε αυτα είναι ότι αφού δεν απαιτεί την παρουσία συγκολλητικού επικαλύμματος ή ενός ομόκεντρου υγρού στρώματος, όπως στην περίπτωση των συστημάτων δεξαμενής, τότε σε αυτή την περίπτωση ο τύπος DIA μπορεί να δώσει την δυνατότητα μέγιστης χρησιμοποιήσης της επιφάνειας επαφής για την απελευθέρωση του φαρμάκου στο δέρμα. Ο τύπος αυτός του διαδερμικού συστήματος απορρόφησης «μεταφράζεται» σαν μια μικρή συνολική επιφάνεια του διαδερμικού συστήματος για ένα δεδομένο ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου. 23,24 Εκτός από το πλεονέκτημα της μέγιστης χρησιμοποίησης επιφάνειας, τα διαδερμικά συστήματα τύπου DIA είναι ιδιαίτερα βολικά κατά την εφαρμογή τους στην επιφάνια του δέρματος. Ένα τυπικό διαδερμικό σύστημα απορρόφησης είναι ιδιαίτερα λεπτό. Χαρακτηριστικά είναι τα παραδείγματα των Minitran (επίθεμα νιτρογλυκερίνης) όπου το πάχος τους δεν ξεπερνά τα 165 μm, όπως και το Nitro-Dur (επίθεμα νιτρογλυκερίνης), όπου επίσης το πάχος του δεν ξεπερνά τα 200 μm. Η κατάλληλη επιλογή στιβάδας στήριξης και συνταγής για το διαδερμικό σύστημα τύπου DIA μπορούν να αποτελέσουν τον κατάλληλο συνδυασμό για την δημιουργία ενός λεπτού και ιδιαίτερα βολικού επιθέματος. 23,24 Το μείζων πρόβλημα με τα διαδερμικά συστήματα DIA αποτελεί ίσως η διάρκεια της αποδέσμευσης του φαρμάκου. Η απελευθέρωση του φαρμάκου από ένα τέτοιο διαδερμικό τύπο ακολουθεί πρωτοταξική κινητική, που σημαίνει ότι είναι ευθέως ανάλογη με την συγκέντρωση του φαρμάκου στη συγκολλητική στιβάδα. Ενώ το φάρμακο απελευθερώνεται από το διαδερμικό σύστημα, η συγκέντρωση του φαρμάκου αρχίζει και μειώνεται, πάντα εξαρτώμενη από την φύση του διαδερμικού συστήματος. Εάν το διαδερμικό σύστημα περιλαμβάνει το φάρμακο στην μορφή εναιωρήματος ή χρησιμοποιεί πολυεπίπεδο σχέδιο διαδερμικής κατασκευής (πολλαπλών στρώσεων), η συγκέντρωση του φαρμάκου υπό διάλυση μέσα στην συνταγή του διαδερμικού θα επηρεαστεί πιο αργά. Παρόλα αυτά, σε καθεμιά από τις παραπάνω περιπτώσεις, διατηρώντας ένα σχετικά σταθερό ρυθμό την χορήγηση του φαρμάκου στον διαδερμικό αυτό τύπο είναι ένα γεγονός το οποίο θα έπρεπε να 39

40 αποδοθεί κατά την κλινική εκτίμηση της δημιουργίας του συστήματος. Μια λύση, βέβαια μερικώς, για την μειωμένη διάρκεια στην χορήγηση του φαρμάκου θα αποτελούσε η συνολική αύξηση του περιεχομένου του φαρμάκου στην συνταγή. Αλλά και πάλι η συγκεκριμένη ενέργεια θα είχε ως αποτέλεσμα μόνο τη δημιουργία ενός προϊόντος με μειωμένη αποτελεσματικότητα στην αποδέσμευση του φαρμάκου. 22,23,24 ΙΙΙ.4.4.Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στοιβάδα (πολλαπλών στρώσεων)( multilaminate drug in adhesive devices) Αυτή η κατηγορία των διαδερμικών συστημάτων απορρόφησης περιλαμβάνει είτε τη προσθήκη μιας μεμβράνης μεταξύ δυο διακριτών DIA στρωμάτων ή τη προσθήκη πολλαπλών στρωμάτων DIA κάτω από μια μονή στιβάδα στήριξης. Το φάρμακο βρίσκεται εντελώς ενσωματωμένο μέσα στο προσκολλητικό υλικό. Πάντα η απορρόφηση και ο έλεγχος του φαρμάκου γίνονται διαμέσου της ημιπερατής μεμβράνης η οποία εναλάσσεται μεταξύ των δυο ή περισσοτέρων στρωμάτων. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν το Transderm-Scop (δραστική ουσία: σκοπολαμίνη), το Deponit (δραστική ουσία: νιτρογλυκερίνη) και το Nicoderm (δραστική ουσία: νικοτίνη) τα οποία ανήκουν στα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα πολλαπλών στρώσεων. 23,24 ΙΙΙ.5. Συστατικά των διαδερμικών συστημάτων απορρόφησης Όπως έχει ήδη αναφερθεί ένα διαδερμικό θεραπευτικό συστήμα αποτελείται από τα εξής τμήματα: 17,18,19,20,21 1. τη στιβάδα στήριξης (backing layer) 2. την εξωτερική μεμβράνη (release liner) 3. τη συγκολλητική στιβάδα εντός της οποίας έχει ενσωματωθεί το φάρμακο (drug containing adhesive layer) Πιο αναλυτικά τα μέρη ενός διαδερμικού συστήματος έχουν ως εξής: 40

41 ΙΙΙ.5.1. Στιβάδα στήριξης (backing layer) Εξαρτώμενες από την κατηγορία των διαδερμικών συστημάτων, οι μεμβράνες στήριξης είναι είτε μη διαπερατού είτε διαπερατού χαρακτήρα και αποτελούν συνήθως παράγωγα συνθετικών πολυμερών (πχ. πολυεστέρας, πολυαιθυλένιο, χλωριούχο πολυβινυνιλιδίνιο (PVDC), πολυουρεθάνιο) ή παράγωγα φυσικών πολυμερών (πχ. βαμβάκι, μαλλί κλπ.). Επίσης μπορεί να μην έχουν πόρους ή να σχεδιάζονται με μικροπόρους (πχ. πολυπροπυλένιο ή πολυαιθυλένιο), ή ακόμα να κατασκευάζονται από μεγαλοπορώδη υλικά ή και χωρίς την ύπαρξη αυτών των υλικών. 25 Γενικά, οι στιβάδες στήριξης διαλέγονται από μια γκάμα υλικών τα οποία έχουν μη διαπερατό ή διαπερατό χαρακτήρα, πάντα εξαρτώμενα από την δραστική ουσία που πρόκειται να χρησιμοποηθεί στο διαδερμικό σύστημα. Μη διαπερατές στιβάδες στήριξης, όπως τα συνθετικά πολυμερή, έχουν σαν αποτέλεσμα την ενυδάτωση των εξωτερικών στρωμάτων της κεράτινης στιβάδας και μπορεί να οδηγήσουν σε διάλυση, σε προώθηση της βακτηριακής ανάπτυξης ή και σε μειωμένη συγκόλληση του διαδερμικού στο δέρμα με τη πάροδο του χρόνου. Ημιδιαπερατές στιβάδες στήριξης, όπως πολυουρεθάνιο ή πολυολεφινικά συμπολυμερή, επιτρέπουν να συμβεί μερική διάδοση νερού προς το δέρμα. Σε αντίθεση, μη διαπερατά υλικά και ινώδη υλικά, όπως είναι το βαμβάκι και οι πολυεστέρες, επιτρέπουν στο δέρμα να «αναπνέει» (πχ. προωθούν την διάχυση υδρατμών από την επιφάνεια του δέρματος), επίσης επιτρέπουν στα συστατικά και στις δραστικές ουσίες μέσω της υψηλής τάσης ατμών να εξατμιστούν από το διαδερμικό σύστημα. Όσον αφορά τις διαπερατές μεμβράνες στήριξης, τείνουν να προωθούν μεγαλύτερη εναπόθεση και ένα μεγαλύτερο ρυθμό διαπέρασης των δραστικών και μη δραστικών συστατικών από το δέρμα σε σύγκριση με τις μη διαπερατές μεμβράνες στήριξης. Η επιλογή της κατάλληλης στιβάδας στήριξης εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά της δραστικής ουσίας που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί εξαρτάται από την φύση της συγκολλητικής στιβάδας, από την διάρκεια του συγκολλητικής ικανότητας στο δέρμα όσο και από την ένδειξη του διαδερμικού συστήματος. Για παράδειγμα, οι διαπερατές μεμβράνες είναι η επιθυμητή επιλογή για την ενίσχυση των στερεοειδών στις χαμηλότερες στιβάδες της επιδερμίδας, για την θεραπεία διαφόρων φλεγμονών και δερματοπαθειών (πχ. διαδερμικά συστήματα Actiderm ή Condran ). Από την άλλη, πολυ λεπτές και μη διαπερατές στιβάδες στήριξης έχουν τα επιθυμητά 41

42 χαρακτηριστικά για προϊόντα αφαίρεσης κάλων αφού η δραστική ουσία θα πρέπει να απονεμηθεί μόνο στις εξωτερικές στιβάδες της κεράτινης στιβάδας. Επίσης, οι μη διαπερατές στιβάδες στήριξης εκτός από τα χαρακτηριστικά στα προϊόντα αφαίρεσης κάλων έχουν και προστατευτικό ρόλο. 21,22,25 ΙΙΙ.5.2.Πολυμερή Βιοπολυμερή υλικά τα οποία χρησιμοποιούνται σαν έκδοχα σε συνταγές των διαδερμικών συστημάτων τύπου μήτρας περιλαμβάνουν λιπόφιλα πολυμερή όπως πολυβινυλοχλωρίδιο (πχ σε διαδερμικά συστήματα όπως το Nitroglycerin Transdermal ), πολυμεθοξισιλάνιο (πχ Nitrodisc ), ή και υδρόφιλα πολυμερή όπως η πολυβινυλοπυρρολιδόνη ή η πολυβινυλοαλκοόλη (πχ Nitrodur ) ή και υδρογέλες βασισμένες σε υλικά όπως η ζελατίνη (πχ. Prostep ) ή πολυβινυλοπυρρολιδόνη και συνθέσεις πολυαιθανολικών οξειδίων (πχ. Nitropercuten TTS 22, 25 ). ΙΙΙ.5.3. Μεβράνες που ρυθμίζουν το ρυθμό διαπέρασης του φαρμάκου Οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται στα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα και ρυθμίζουν το ρυθμό διαπέρασης του φαρμάκου έχουν κυρίως εμπορικό χαρακτήρα και περιλαμβάνουν λεπτά, χωρίς πόρους φιλμ κατασκευασμένα από οξικό αιθυλβινυλεστέρα (πχ. Transderm-Nitro, Duragesic, Estraderm ), ή λεπτά, με μικρούς πόρους φιλμ κατασκευασμένα από πολυαιθυλένιο, τα οποία χρησιμοποιούνται σε διαδερμικά συστήματα πολλαπλών στρώσεων και τύπου δεξαμενής στερεής κατάστασης (πχ. Catapres - TTS) ή σε διαδερμικά συστήματα τύπου δεξαμενής αλλά υγρής κατάστασης. 20, 21 ΙΙΙ.5.4. Η συγκολλητική στιβάδα (drug containing adhesive layer ή PSA) Η κατηγορία των PSΑ αποτελεί ένα ξεχωριστό είδος βιο-συγκολλητικών υλικών, τα οποία μπορούν να έχουν συγκολλητική ικανότητα είτε για το ξηρό είτε για το ενυδατωμένο δέρμα, και χωριστά από την δραστική ουσία και αποτελούν ίσως ένα από τα πιο σημαντικά μέρη των διαδερμικών συστημάτων. Η συγκολλητική στιβάδα 42

43 θα πρέπει να δράσει κάτω από ένα μεγάλο εύρος συνθηκών (πχ. υψηλή έναντι χαμηλή υγρασία, θερμοκρασίες μεταξύ 0ºC και 40ºC, εφίδρωση κλπ) για να κρατήσει το διαδερμικό σύστημα σε οικείες συνθήκες με αυτές του δέρματος για περίοδο μεγαλύτερη των 7 ημερών. Οι τέσσερις τύποι συγκολλητικών στιβάδων, οι οποίες χρησιμοποιούνται εκτενώς στα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα (TTS) και στις τοπικές διαδερμικές φαρμακοτεχνικές μορφές (DTS), περιλαμβάνουν πολυακρυλικά, πολυδιμεθοξισιλάνια (σιλικονούχα) υλικά καθώς και υλικά με βάση το καουτσούκ και την kayara. Οι χημικές, φυσικές και ελαστικές ιδιότητες (πχ. ερπυσμός, διατμητική αντοχή, μέτρο ελαστικότητας) καθώς και κάποιες άλλες ιδιότητες (πχ. συγκολλητική ικανότητα, αποδέσμευση) επανεξετάζονται κάθε φορά στα υλικά τα οποία πρόκειται να χρησιμοποιηθούν σαν συγκολλητικές στιβάδες. 27,28 Πρόσφατα, υδρόφιλες συγκολλητικές συνθέσεις με τον όρο «υδρογέλες», οι οποίες κατασκευάζονται από υψηλού μοριακού βάρους πολυβινυλοπυρρολιδόνη και οξείδιο του πολυαιθυλενίου, έχουν δείξει ότι είναι συμβατές με πολλές δραστικές ουσίες και χρησιμοποιούνται σε μερικά διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα που ήδη κυκλοφορούν στην αγορά. Το συγκολλητικό υλικό θα πρέπει να κατέχει ικανή συγκολλητική ικανότητα προς το δέρμα όταν συντίθεται με δραστικές ουσίες και επιταχυντές για 24 ώρες και δεν θα πρέπει να προκαλεί ερεθισμό του δέρματος ή ευαισθητοποίηση. 27,28 Οι συγκολλητικές στιβάδες που χρησιμοποιούνται στις τοπικές φαρμακοτεχνικές μορφές για το δέρμα περιλαμβάνουν υλικά όπως το φυσικό καουτσούκ, πολυακρυλικά υλικά και συγκολλητικές στιβάδες βασιζόμενες στο πολυισοβουτυλενιο. Τα προϊόντα αυτά χρησιμοποιούνται για την αφαίρεση των κάλλων και των κονδυλωμάτων και συνδυάζονται με σαλικυλικό οξύ και συγκολλητικό υλικό με βάση το φυσικό καουτσούκ το οποίο είναι χρήσιμο για μικρής διάρκειας συγκόλληση στο πόδι. Τα παραπάνω υλικά, τα οποία βασίζονται στο φυσικό καουτσούκ, έχουν ήδη αντικατασταθεί από συνθετικά υποαλλεργικά συγκολλητικά υλικά, όπως πολυακρυλικά υλικά, πολυισοβουτυλένια και σιλικόνες. Για παράδειγμα, τα πολυακρυλικά υλικά χρησιμοποιούνται κυρίως σε τοπικής χρήσεως διαδερμικά συστήματα για την αναλγησία και σε προϊόντα τα οποία δεν χρειάζονται ιδιαίτερη βοήθεια για την συγκόλλησή τους στο δέρμα, συγκεκριμένα σε περιοχές οι οποίες δεν απαιτούν προσκόλληση του διαδερμικού συστήματος παρά μόνο ώρες. Τα ακρυλικά υλικά διαθέτουν έναν αριθμό από πλεονεκτήματα που 43

44 τα κατατάσσουν ως τα πιο χρήσιμα από τα υλικά που βασίζονται στο φυσικό καουτσούκ. Ανάμεσα σε αυτά τα πλεονεκτήματα θα μπορούσαν να αναφερθούν η ομοιόμορφη κατανομή του προϊόντος και η μικρότερη σε ένταση ευαισθητοποίηση του δέρματος. 28 ΙΙΙ.5.5. Η εξωτερική μεμβράνη (release liner) Οι εξωτερικές μεμβράνες χρησιμοποιούνται σε όλους τους τύπους των διαδερμικών συστημάτων και διαλέγονται ανάλογα με την συμβατότητά τους με τη συγκολλητική στιβάδα που χρησιμοποιείται στο συγκεκριμένο διαδερμικό σύστημα. Οι εξωτερικές μεμβράνες είναι συνήθως λεπτές, αδρανείς, μη διαπερατές, διαφανή ή αδιαφανή πολυεστερικά φιλμ τα οποία διαθέτουν μια λεπτή επικάλυψη στη μια όψη του διιαδερμικού ενός πολυμερούς ευαίσθητου στην υγρασία (πχ. σιλικόνη, φθοροσιλικόνη ή υπερφθοροκαρβόξυ υλικά). Η συγκεκριμένη στιβάδα προστατεύει τη στιβάδα του διαδερμικού που θα έρθει σε επαφή με το δέρμα μέχρι την στιγμή της χορήγησής του, αφαιρείται και απορρίπτεται. Το σχέδιο και ο τύπος της εξωτερικής μεμβράνης έχουν επιλεχθεί για να προστατεύσουν τη δραστική ουσία κατά τη διάρκεια της αποθήκευσής της και στο να επιτρέπουν την εύκολη αφαίρεσή της από τον ασθενή. 27,28 ΙΙΙ.6.Υποψήφιες δραστικές ουσίες για τα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα Οι περισσότερες δραστικές ουσίες δεν μπορούν να είναι υποψήφιες για να χρησιμοποιηθούν στα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα για διάφορους λόγους. Οι ουσίες οι οποίες είναι συμβατές και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαπέραση μέσω του δέρματος έχουν ήδη κυκλοφορήσει στο εμπόριο σε ολοκληρωμένα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα. Γενικά οι επιθυμητές φυσικοχημικές, βιοφαρμακευτικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες για μια ουσία υποψήφια για να εισαχθεί σε ένα σύστημα διαδερμικής απορρόφησης είναι: 16 Χαμηλή ημερήσια δοσολογία (πχ. κάτω από 20 mg/ημέρα). Μικρής διάρκειας χρόνος ημίσειας ζωής (πχ. 10 ώρες ή και λιγότερο). Χαμηλό μοριακό βάρος (πχ.λιγότερο από 400). 44

45 Χαμηλό σημείο βρασμού (πχ.λιγότερο αππό 200ºC). Υψηλή διαλυτότητα της ουσίας στα λιπίδια (πχ. συντελεστή κατανομής οκτανόλης/νερού (LogP) μεταξύ -1.0 και 4). Να μην δημιουργεί ερεθισμούς ή ευαισθητοποίηση του δέρματος. Χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα από το στόμα (να αποκλείει την αποδέσμευση εκ του στόματος). Μικρό θεραπευτικό εύρος (απαιτεί στενό έλεγχο των επιπέδων της ουσίας στο πλάσμα). Η παραπάνω λίστα δεν σημαίνει ότι και άλλες επιθυμητές ιδιότητες που δεν συμπεριλαμβάνονται παραπάνω δεν μπορούν να ισχύουν. Γενικά μόνο ορισμένες από τις παραπάνω ιδιότητες μπορεί να ισχύουν για ένα δραστικό συστατικό, άρα μια αποδεκτή ισορροπία θα πρέπει να βρεθεί προκειμένου να χρησιμοποιηθεί η ουσία για διαπέραση διαμέσω του δέρματος. Η υψηλή ημερήσια δόση, το μεγάλο μέγεθος του διαδερμικού συστήματος, ο ερεθισμός του δέρματος ή η ευαισθητοποίησή του αποτελούν τα πιο συνήθη εμπόδια τα οποία αποκλείουν τις περισσότερες υποψήφιες ουσίες από την εισαγωγή τους σε ένα διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα Η πλειοψηφία των ουσιών που χρησιμοποιούνται σε διαδερμικά συστήματα δεν μπορούν να αποδεσμευθούν για την θεραπεία συστηματικών ασθενειών, αλλά πολλές φορές μπορούν να μεταφερθούν τοπικά ή σε τοπικής δράσης διαδερμικά συστήματα κατευθείαν στον στόχο για την θεραπεία δερματολογικών περιπτώσεων, όπως τοπικές φλεγμονές ή πόνος. Η επιτυχία της σύνθεσης ενός τοπικού διαδερμικού συστήματος σε σχέση με ένα συστηματικής χορήγησης είναι μεγαλύτερη λόγω των λιγότερων προκλήσεων που έχει ο ερευνητής να αντιμετωπίσει. ΙΙΙ.7. Μέθοδοι αύξησης της διαπερατότητας του δέρματος Οι μέθοδοι αύξησης της διαπερατότητας μαι ουσίας διαμέσου του δέρματος περιλαμβάνουν: 29,30,31 1. Τη χρήση επιταχυντών διαβατότητας (χημικά μέσα αύξησης). 2. Τη χρήση θερμοκρασίας, υπερήχων ή ηλεκτρισμού (φυσικά μέσα αύξησης). 45

46 ΙΙΙ.7.1. Χημικά μέσα αύξησης της διαπερατότητας- Επιταχυντές διαβατότητας Η πιο διαδεδομένη μέθοδος για την αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος αποτελεί η χρήση των επιταχυντών διαβατότητας. Οι επιταχυντές αυτοί αποτελούν χημικές ουσίες οι οποίες βοηθούν τη μεταφορά της ουσίας μέσω του δέρματος. Η πρώτη τους ενέργεια είναι η εισχώρηση στο «διαμέρισμα του δέρματος», η αλληλεπίδρασή τους με διάφορα στοιχεία του δέρματος που βοηθούν στην κατασκευή του και τέλος η αναστρέψιμη και προσωρινή απόσπαση της ιδιότητας του φραγμού. 29,30,31 Για να επιτύχουν τα παραπάνω οι διάφοροι επιταχυντές διαβατότητας θα πρέπει να έχουν ορισμένα χαρακτηριστκά στοιχεία που θα τους δίνουν τη δυνατότητα να επιταχύνουν τη δράση τους στο δέρμα. Οι επιθυμητές αυτές ιδιότητες είναι: 29 Ο επιταχυντής διαβατότητας δεν θα πρέπει να επιδεικνύει φαρμακολογική δράση. Η επίδραση της δράσης του θα πρέπει να είναι άμεση, προβλέψιμη και αναστρέψιμη. Ως χημική ουσία θα πρέπει να είναι χημικά και φυσικά σταθερή. Ο επιταχυντής διαβατότητας θα πρέπει να είναι συμβατός με τα υπόλοιπα συστατικά της συνταγής. Το υλικό από το οποίο είναι κατασκευασμένος θα πρέπει να είναι άοσμο,άχρωμο και άγευστο. Ο μηχανισμός δράσης και ο μεταβολισμός του επιταχυντή θα πρέπει να είναι γνωστά. Η ουσία θα πρέπει να είναι χωρίς μεγάλο κόστος για να είναι διαθέσιμη σε εμπορικές συνταγές σε διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα. Οι ιδιότητες του φραγμού θα πρέπει να μειώνονται προς μια κατεύθυνση μόνο.αυτό σημαίνει ότι ενδογενή υλικά δεν θα πρέπει να χάνονται κατά την διάρκεια της διαδερμικής απορρόφησης. Ο παράγοντας που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί θα πρέπει να απλώνεται όμορφα επάνω στο δέρμα Ο παράγοντας θα πρέπει να έχει ένα μεγάλο βαθμό επιτάχυνσης της διαπερατότητας. Ο παράγοντας θα πρέπει να αποδεσμεύεται από τον οργανισμό. 46

47 ΙΙΙ Μηχανισμοί δράσης επιταχυντών διαβατότητας Η διαδικασία της διαπέρασης ενός φαρμάκου διαμέσου του δέρματος περιλαμβάνει τα παρακάτων στάδια: 29,32 Κατανομή του μορίου από τον φορέα στην κεράτινη στιβάδα. Διάχυση διαμέσου της κεράτινης στιβάδας. Μεταφορά από την κεράτινη στιβάδα στην επιδερμίδα. Διάχυση διαμέσου της επιδερμίδας. Τριχοειδή απορρόφηση. Από τις παραπάνω στάδια καταλαβαίνει κανείς ότι ο ρυθμός μεταφοράς του φαρμάκου διαμέσου του δέρματος εξαρτάται από την λιγότερο διαπερατή στιβάδα που είναι η κεράτινη στιβάδα. Γι αυτό εξέταζονται από τους ερευνητές οι διάφοροι μηχανισμοί με τους οποίους δρουν οι επιταχυντές διαβητότητας. 32 A. Λιπιδική αλληλεπίδραση: Ο τρόπος δράσης των λιπόφιλων επιταχυντών είναι βασισμένος στη λιπόφιλη περιοχή της κεράτινης στιβάδας. Η πιο αξιοσημείωτη ιδιότητά τους είναι η διαταραχή που προκαλούν μεταξύ των λιπιδικών διπλοστιβάδων. Οι επιταχυντές αυτοί μπορούν να προκαλέσουν λιπιδική διαλυτοποίηση, απόσπαση από τις διπλοστιβάδες και αύξηση της υγροποίησης. Πιο συγκεκριμένα, μπορούν να εισέλθουν στην λιπιδική περιοχή, να αυξήσουν την απορρόφηση του νερού ή να επηρεάσουν την ενδοκυτταρική απώλεια του νερού (TEWL). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα τερπένια, οι αλκανόλες, οι εστέρες, οι λιπόφιλες αμίνες, το Azone και τα παράγωγά του και μερικά μη ιονικά επιφανειοδραστικά τα οποία ενισχύουν την διαπέραση από το δέρμα κάποιων φαρμάκων με αυτό ή περισσότερους μηχανισμούς. B. Πρωτεϊνική αλληλεπίδραση: Επιταχυντές υδροφιλικής φύσεως είναι περισσότερο ενεργοί σε υδροφιλικές περιοχές. Αυτές ο ουσίες αντιδρούν με τις πρωτεϊνες της κεράτινης στιβάδας. Η δράση τους μπορεί να οφείλεται στη διαλυτοποίηση ορισμένων μερών των πρωτεϊνών, τις οποίες αποσπούν από τη μήτρα τους. Η αλληλεπίδρασή τους με τις πρωτεϊνες μπορεί να διασπά δεσμούς S- S, ελεύθερες θειολικές ομάδες, και τελικά να ενισχύει την κατακράτηση του 47

48 νερού, δράση η οποία αυξάνει τη διαπερατότητα των φαρμάκων. Οι συγκεκριμένοι επιταχυντές μπορεί επίσης να ανοίγουν τους διαύλους του νερού μεταξύ των κερατινοκυττάρων και έτσι να διευκολύνουν τη διάχυση. Επίσης μείωση της TEWL και μείωση της ικανότητας ενυδάτωσης μπορεί να συμβαίνει κατά την χρήση των επιταχυντών αυτών. Μικρής αλυσίδας αλκοόλες, διάφορα σουλφοξείδια, μερικά μερκαπτο- παράγωγα, ανιονικά και κατιονικά επιφανειοδραστικά και διαλκυλάμινο- εστέρες μπορεί να υπάγονται στην κατηγορία αυτή των επιταχυντών διαβατότητας. Γ. Αλλαγές κατανομής: Κάποιοι από τους επιταχυντές μπορεί να εμφανίσουν την ιδιότητά τους στο φορέα αυτό καθεαυτό. Διαλυτοποιούν τα δραστικά συστατικά της συνταγής ή αυξάνουν την θερμοδυναμική δραστηριότητα. Μια μείωση στον συντελεστή κατανομής φορέα/δέρμα του φαρμάκου μπορεί επίσης να αποτελεί λόγο για την συμπεριφορά τους. Κάποιοι μικρής αλυσίδας εστέρες, όπως ο οξικός αιθυλεστέρας, κάποιες κυκλοδεξτρίνες, αλκοόλες, Ν,Ν-διαίθυλ-m-τολουαμίδιο (DEET), διμεθυλ-σουλοφοξείδιο (DMSO), Azone, κατιονικά επιφανειοδραστικά ανήκουν στην παραπάνω κατηγορία επιταχυντών. Κάποιοι επιταχυντές διαβατότητας επιδεικνύουν συχνά περισσότερους από έναν μηχανισμούς. Για παράδειγμα, μπορεί να επιδεικύουν ταυτόχρονα λιπιδική αλληλεπίδραση και ικανότητα διαλυτοποίησης ή μετουσίωση των πρωτεϊνών. Ένας άλλος πιθανός συνδυασμός είναι η συνέργεια μεταξύ διαφόρων επιταχυντών και συνδιαλυτών. Ο πίνακας ΙΙ δείχνει τις κατηγορίες των επιταχυντών διαβατότητας και το που κατατάσσεται κάθε χημική ουσία: 48

49 Χημικές κατηγορίες επιταχυντών διαβατότητας Παραδείγματα ενώσεων που είναι επιταχυντές διαβατότητας από κάθε κατηγορία Τρόπος δράσης των επιταχυντών διαβατότητας ανάλογα με την χημική τους δομή. Σουλφοξείδια διμέθυλοσουλφοξείδιο δεκυλ-μεθυλοσουλφοξείδιο Ν-άρυλουλ-μινοσουλφοράνια, Ν-άρυλ-ίμινοσουλφοράνια Αλληλεπίδραση με τις πρωτεΐνες της ΚΣ (αλλαγή της δομής της κερατίνης από α-έλικα σε β- επιφάνεια). Σε συγκέντρωση >60% αλληλεπιδρά με τις πολικές κεφαλές των λιπιδίων της κεράτινης στοιβάδας σχηματίζοντας δεσμούς υδρογόνου λόγο της πολικής ομάδας S-O αντικαθιστώντας τα μόρια του νερού..εκχύλιση λιπιδίων, προαγωγή κατανομής Εστέρες κορεσμένων οξέων. isopropyl n-hexanoate, isopropyl n- decanoate,μυριστικός ισοπρόπυλεστέρας, παλμιτικός ισοπροπυλεστέρας,, οξικό βουτύλιο, οξικό μεθύλιο, methylvalerate, methylpropionate, diethyl sebacate, ethyl oleate Διαπερνούν την ΚΣ και αυξάνουν την κινητικότητα εντός των λιπιδίων, διαταράσσοντας τη δομή τους.[i] Προαγωγή κατά-νομής της ουσίας από το φορέα στο δέρμα Πολυόλες γλυκόλη, διπροπύλενογλυκόλη, γλυκερόλη, προπανοδιόλη, βουτενοδιόλη, πεντανοδιόλη εξανοτριόλη ουρία, διμέθυλακεταμίδιο Αύξηση της διαπερατότητας της κεράτινης στοιβάδας με μεταβολή του λόγου κατανομής της δραστικής ουσίας μεταξύ του φορέα στον οποίο είναι διαλυμένη και της κεράτινης στοιβάδας. Επιπλέον αυξάνει την διαλυτότητα των δραστικών συστατικών,αυξάνοντας με αυτό τον τρόπο τη θερμοδυναμική ενεργότητα και επομένως και την απορρόφηση. 49

50 Αμίδια Πυρολιδόνες Azone και παράγωγα αιθυλενογλυκόλη, διαιθυλενογλυκόλη, τριαιθυλενογλυκόλη, διπροπυλενογλυκόλη,γλυκερόλη,προπανοδιόλη, ουρία, διμέθυλακεταμίδιο, διαίθυλτολουαμίδιο, διμέθυλοφορμαμίδιο, διμέθυλ-οκταμίδιο διμέθυλ-δεκαμίδιο βιοδιασπώμενη κυκλική ουρία: l-αλκυλ-4-ιμιδαζολιδιν-2-όνη Παράγωγα πυρρολιδόνης: l-μέθυλ-2-πυρρολιδόνη, 2- πυρρολιδόνη, 1 -λάουριλ-2-πυρρολιδόνη, 1 - μέθυλ-4-κάρβοξυ-2-πυρρολιδόνη, l-έξυλ-4- κάρβοξυ-2-πυρρολιδόνη, l-λάουριλ-4-κάρβοξυ- 2-πυρρολιδόνη, l-μέθυλ-4-μέθοξυκαρβονυλ-2- πυρρολιδόνη, l-έξυλ-4-μέθοξυκαρβόνυλ-2- πυρρολιδόνη N-κυκλοέξυλοπυρρολιδόνη, W- διμέθυλάμινοπροπυλ-πυρρολιδόνη, W- κοκοάλκυλπυρρολιδόνη, /Vτολουάλκυλπυρρολιδόνη,Βιοδιασπώμενα παράγωγα πυρρολιδόνης κορεσμένοι εστέρες του(2-ύδροξυεθυλ)-2-πυρρολιδόνη Κυκλικά αμίδια: l-dodecylazacycloheptane-2-one Azone -αζόνη, 1 -geranylazacycloheptan-2-one, 1 -farnesylazacycloheptan-2-one, l- geranylgeranylazacycloheptan-2-one, l-(3,7- dimethyloctyl)azacycloheptan-2-one, l-(3,7,lltrimethyldodecyl)azacyclohaptan-2-one, 1 - geranylazacyclohexane-2-one, 1 - geranylazacyclopentan-2,5-dione, 1 - farnesylazacyclopentan-2-one Διαλυτικές ιδιότητες, απομάκρυνση κεραμιδίων ΚΣ. Απρωτικοί διαλύτες. Αυξημένη αποτελεσματικότητα για υδρόφιλα φάρμακα Είναι όμως αποτελεσματικά και σε υδρόφοβα μόρια και μάλιστα όσο μεγαλώνει το μοριακό βάρος τόσο αποτελεσματικότερα γίνονται., αυξάνοντας το συντελεστή διάχυσης στο κεράτινη στοιβάδα. Αλληλεπίδραση με τα λιπίδια της ΚΣ και δημιουργία κενών χώρων αποδιάταξη της λιπιδικής διπλοστοιβάδας με παρεμβολή μεταξύ των πολικών ομάδων των φωσφολιπιδίων. 34 Επιφανειοδραστικές ουσίες Δεξαμεθύλενολαουραμίδιο και τα παράγωγα του διαιθανολαμίνη,τριαιθανολαμίνη ανιονικά: λαουρικό νάτριο, λαουροθειικό νάτριο κατιονικά: βρωμιούχο κετυλτριμέθυλαμμώνιο,βρωμιούχο τετρακέτυλμέθυλ-αμμώνιο, χλωριούχο βενζαλκώνιο, octadecyltrimethylammonium chloride, χλωριούχο κετυλ-πυρριδίνιο, χλωριούχο δοδέκυλτριμεθυλ-αμμώνιο, χλωριούχο εξάκυλτριμέθυλ-αμμώνιο μη ιονικά: Poloxamer (231, 182, 184), Brij (30, 93, 96, 99), Span (20, 40, 60, 80, 85), Tween (20, 40, 60, 80), Myrj (45, 51, 52), Miglyol 840 χολικά άλατα,αμφοτερικές ενώσεις: Sodium cholate, sodium salts of taurocholic, glycholic, desoxycholic acids λεκιθίνη Ανιονικά. Αύξηση διαδερμικής απώλειας νερού, αλληλεπίδραση με κερατίνη, απομάκρυνση λιπιδίων Κατιονικά. Απομάκρυνση λιπιδίων, αλληλεπίδραση με κερατίνη. Μη ιονικά. Διαλυτοποίηση των λιπιδίων της ΚΣ. μέσω σχηματισμού λιπιδίων Μετουσίωση των πρωτεινών και λιποπρωτεινών της Κ.Σ.Γαλακτωματοποιούν το σμήγμα 50

51 Τερπένια Υδροκαρβονικά : D-λιμονένιο, ct-πινένιο, p- καρδένιο,αιθανόλη,ισοπροπυλική αλκοόλη Τα τερπένια με πολικές ομάδες είναι πιο αποτελεσματικά για υδρόφιλα φάρμακα και αυτά με μη πολικές ομάδες είναι πιο κατάλληλα για λιπόφιλα φάρμακα. 35 Αλκοόλες a-τερπινεόλη, τερπινέν-4-όλη, καρβόλη Βοηθούν τη διαπέραση με το να αυξάνουν το logp του φαρμάκου μέσα στο δ/μα που βρίσκονται με το περιεχόμενο Η 2 Ο της επιδερμίδας Κετόνες Carvone, pulegone, pipcritonc, μινθόλη Δημιουργούν υδατικές δεξαμενές μέσα στο κεράτινη στοιβάδα αυξάνοντας τη διατομή των υδάτινων καναλιών της επιδερμίδας και επιτρέποντας την αυξημένη διαπερατότητα των υδρόφιλων μορίων. Οξείδια Οξείδιο του κυκλοεξανίου, οξείδιο του λιμονένιου οξείδιο του α-πινένιου,οξείδιο του α- πινενίου, 1,8-κινεόλη. Μεταβολή του συντελεστή κατανομής μεταξύ κεράτινη στοιβάδα και φορέα του φαρμάκου. Έλαια Ylang ylang, άνισος, chenopodium, ευκάλυπτος Μεταβολή του συντελεστή κατανομής μεταξύ κεράτινη στοιβάδα και φορέα του φαρμάκου Αλκανοειδή /V-επτάνιο, N-οκτάνιο, N-εννεάνιο, W-δεκάνιο, /V-ενδεκάνιο, N-δωδεκάνιο, W-τριδεκάνιο, N- τετραδεκάνιο, N-εξαδεκάνιο. Με τις μακριάς αλύσου υδρογονανθρακικές αλυσίδες που περιέχουν παρεμβάλονται στα αλκυλ-άκρα των λιποπρωτεινών της διπλοστοιβάδας ιδιαίτερα για όσα αλκανοειδή έχουν αλυσίδες με παρόμοιο αριθμό υδρογονανθράκων με τα λιπίδια της κεράτινης στοιβάδας και εμποδίζουν τη δημιουργία δεσμών Van der Waals οπότε γεγονός που επιτρέπει την απλευθέρωση μεγαλύτερου μοριακού όγκου από την λιπιδική διπλοστοιβάδα. 51

52 Οργανικά οξέα Σαλικυλικό οξύ και σαλικιλικά (περιλαμβανομένου τα αίθυλ,προπυλενο,γλύκολο παράγωγα τους ), κιτρικό και σουκιννικό οξύ. Προαγωγή κατανομής και αύξηση κινητικότητας εντός των λιπιδίων της ΚΣ. Σχηματισμός ενός πιο λιπόφιλου ιονικού ζεύγους. Πίνακας ΙΙ.Κατηγορίες επιταχυντών διαβητότητας. ΙΙΙ.7.2. Φυσικά μέσα αύξησης της διαπερατότητας Τα φυσικά μέσα αύξησης περιλαμβάνουν: Την χρήση της θερμοκρασίας. 2. Την χρήση υπερήχων. 3. Την χρήση ηλεκτρικής ενέργειας. ΙΙΙ Θερμοκρασία Η χρήση της θερμοκρασίας και πιο συγκεκριμένα της θερμότητας για την βελτίωση της τοπικής αποδέσμευσης ενός φαρμάκου αποτελεί μια επιτυχημένη ενέργεια. Η θερμότητα είναι ένα είδος ενέργειας το οποίο περνά από το ένα σώμα στο άλλο λόγω της διαφοράς θερμοκρασίας μεταξύ αυτών. Μιλώντας με θερμοδυναμικούς όρους, η θερμότητα αποτελεί την εσωτερική ενέργεια ενός σώματος. Υψηλή θερμοκρασία σημαίνει αυξημένα επίπεδα εσωτερικής ενέργειας, το οποίο σημαίνει επιταχυνόμενη θερμική κίνηση και τελικά ένας υψηλός συντελεστής απορρόφησης του φαρμάκου. Η υψηλή θερμοκρασία ενός συστήματος, επίσης, επηρεάζει την κλίση της συγκέντρωσης του φαρμάκου μέσω της βελτίωσης της βραδείας κινητικής διαδικασίας της διάλυσης του φαρμάκου και αυξάνοντας τη διαλυτότητα του φαρμάκου στο διάλυμα του δότη (C d ). 31 Όσον αφορά τη χρήση της θερμοκρασίας για την αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος, θεωρείται δεδομένο ότι η εφαρμογή θερμότητας σε μια περιοχή του δέρματος, όπου εφαρμόζεται ένα τοπικό φάρμακο, θα αύξανε τη διαπερατότητα του 52

53 φαρμάκου από το δέρμα. Στο Σχήμα 11 φαίνεται το διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα που χρησιμοποιεί την θερμότητα ως μέσο αύξησης της διαπερατότητας: Σχήμα 11. Διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα που χρησιμοποιεί τη θερμότητα για την αύξηση της διαπερατότητας. Στο παραπάνω σχήμα η στιβάδα που λειτουργεί σαν «ασπίδα» (Σχήμα 11, 210), στο πίσω μέρος του διαδερμικού συστήματος, απομακρύνεται για να εκθέσει τη σκόνη του μετάλλου από το θάλαμο που δημιουργεί τη θερμότητα στον αέρα και το νερό. Αυτή η κίνηση προκαλεί εξώθερμη αντίδραση η οποία δίνει την απαραίτητη θερμότητα για να μαλακώσει το κερί, το οποίο λειώνει αργά, στο θάλαμο του φαρμάκου και έτσι διευκολύνει την απορρόφηση του φαρμάκου. 31 Παρόλη την χρήση της θερμότητας σαν μέσο αύξησης της διαπερατότητας στο δέρμα, μια μικρή μερίδα αναφορών υπάρχει, ειδικότερα στο μοντέλο της ασσυμετρικής θερμότητας. Αυτό μαρτυρεί ότι η εφαρμογή της θερμότητας έχει λάβει μικρής κατανόησης και η ιδιότητά της σαν τεχνική αύξησης της διαπερατότητας φαίνεται να έχει υπερεκτιμηθεί. ΙΙΙ Υπέρηχοι Οι υπέρηχοι αποτελούν ένα είδος ακουστικής δόνησης πολλαπλασιασμένο σε μια μορφή διαμήκων κυμάτων συμπίεσης σε συχνότητες πέρα από το ακουστικό φάσμα συχνότητας του ανθρώπου (πχ. συχνότητες πάνω από 20 khz). Αυτή η μορφή ενέργειας χρησιμοποιείται εκτενώς για ιατρικές διαγνώσεις και βρίσκει εφαρμογή και στη θεραπευτική, όπως η φυσιοθεραπεία. Η τεχνική αυτή (phonophoresis) ορίζεται 53

54 σαν την κίνηση των φαρμάκων μέσω άθικτου δέρματος και βασικών ιστών με την χρήση υπερήχων. Κλινικές εφαρμογές έχουν αποδείξει ότι η συγκεκριμένη τεχνική είναι ασφαλής για την αύξηση της διαπερατότητας των φαρμάκων και είναι επιθυμητή σε κλινικές εφαρμογές όταν χρησιμοποιείται με την κατάλληλη συχνότητα και με το κατάλληλο επίπεδο ενέργειας και διάρκειας. 31,33 Μετά από διάφορες υποθέσεις και προσπάθειες εξακρίβωσης, διατυπώθηκε ότι η τεχνική των υπερήχων διακόπτει το φραγμό της κεράτινης στιβάδας και αυξάνει την παρακυττάρια μεταφορά των φαρμάκων, πράγμα που αποτελεί τον μηχανισμό της τεχνικής αυτής. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το σαλικυλικό οξύ σαν φάρμακομοντέλο, διατυπώθηκαν τα εξής: 16,31,33 1. Όταν χρησιμοποήθηκε ενέργεια υπερήχων υψηλών συχνοτήτων, αυξήθηκε σημαντικά η διαδερμική διαπερατότητα του σαλικυλικού οξέος σε σύγκριση με την παθητική διάχυση του φαρμάκου χωρίς την εφαρμογή της phonophoresis. 2. Προκατεργασία του δέρματος με υπέρηχους μείωσε την λειτουργία του φραγμού τόσο ώστε η επακόλουθη αποδέσμευση του σαλικυλικού οξέος αυξήθηκε εν συγκρίσει με την παθητική διάχυση. 3. Η εφαρμογή των υπερήχων δεν επηρέασε την κινητική της αποδέσμευσης του σαλικυλικού οξέος από την γέλη που χρησιμοποιήθηκε. Μια τυπική πειραματική διάταξη για την εφαρμογή της in vitro phonophoresis φαίνεται στο σχήμα 12. Σχήμα 12. Σχηματική παράσταση εφαρμογής της phonophoresis. 54

55 O καθετήρας υπερήχων είναι ένα αισθητήριο όργανο που μετατρέπει την υψηλής συχνότητας εναλλασσόμενη τάση σε ακουστικές δονήσεις χρησιμοποιώντας ένα πιεζοηλεκτρικό κρύσταλλο. Η επικοινωνία του καθετήρα των υπερήχων με το διάλυμα του φαρμάκου στο διαμέρισμα του δότη, προσφέρει το μονοπάτι στην ενέργεια των υπερήχων να φτάσει και να διαπεράσει την στιβάδα του δέρματος. In vivo πειράματα συνήθως εκτελούνται με τον ίδιο τρόπο, με την εξαίρεση ότι οι παλλόμενοι υπέρηχοι και οι υπόλοιπες τεχνικές χρησιμοποιούνται συνήθως για να μειώσουν την δόση της ενέργειας των υπερήχων για την ελάχιστη βλάβη των ιστών. 31 ΙΙΙ Ηλεκτρική ενέργεια Η ηλεκτρική ενέργεια για την μεταφορά των φαρμάκων χρησιμοποιήθηκε πρώτη φορά το 1747 με in vivo πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιώντας ένα δοχείο Leyden, τη πιο απλή και ιδανική μορφή πυκνωτή για την αποθήκευση ηλεκτρικών ώσεων. Όταν διαπιστώθηκε ότι είναι μια δύσκολη ενέργεια για τα περισσότερα είδη φαρμάκων για να διαπεράσουν την στιβάδα του δέρματος μόνο με παθητική διάχυση, είτε για τα πρωτεϊνικα μόρια ή τα πεπτίδια η ενέργεια ήταν δύσκολη λόγω του μεγάλου μοριακού βάρους τους, η ανάγκη για την ανάπτυξη τεχνικών για την αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος έφερε την τεχνική της ιοντοφόρεσης στο προσκήνιο.31 Μια τυπική πειραματική διάταξη για την εφαρμογή της in vitro ιοντοφόρεσης φαίνεται στο σχήμα 13. Σχήμα 13.Τεχνική της ιοντοφόρεσης. 55

56 Ένα κομμάτι δέρματος παρεμβάλλεται μεταξύ των δυο διαμερισμάτων σε δυο πλαϊνά κύτταρα διάχυσης (κύτταρα Franz). Δυο αγώγιμα ηλετρόδια βυθίζονται στα διαλύματα του δότη και του υποδοχέα. Η πηγή της ενέργειας βρίσκεται συνδεδεμένη με τα ηλετρόδια με τις κατάλληλες πολικότητες, εξαρτώμενες από το ιόν του είδους της ουσίας που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί. Τα ηλεκτρόδια είναι κατασκευασμένα συνήθως από ευγενή μέταλλα, όπως η πλατίνα, βρωμίδιο ή χλωρίδιο του αργύρου. Η χρήση ηλεκτροδίων Αg/AgCl ή Αg/AgBr διαθέτει το πλεονέκτημα απέναντι στα ηλεκρόδια τα οποία κατασκευάζονται από πλατίνα, στο ότι η ηλεκτρόλυση του νερού αποφεύγεται, αλλά σαν συνέπεια, το ph του διαλύματος δεν αλλάζει. 31 Οι υπόλοιπες τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιούν ηλεκτρική ενέργεια είναι: 31 A. Ηλεκτρο-όσμωση: Αποτελεί παρόμοια τεχνική με αυτή της ιοντοφόρεσης σε επίπεδο πειραματικό. Όταν η μεταφορά ενός μη ιονικού φαρμάκου γίνεται, το διαμέρισμα του δότη γεμίζει με το διάλυμα του φαρμάκου, και το διάλυμα του ph και η ηλετρική πολικότητα των ηλεκτροδίων καθορίζονται έτσι ώστε το εφαρμοζόμενο ηλεκτρικό πεδίο καταλήγει σε μια κίνηση προς τα εμπρός από το υγρό στο δέρμα. Αν η δειγματοληψία των βιο-ουσιών είναι αντίθετη, τότε η διαδικασία αντιστρέφεται. Το περιεχόμενο του διαμερίσματος του δότη αναλύεται για την ουσία η οποία υπάρχει από την κίνηση του υγρού προς τα έξω. B. Ηλεκτροφόρηση: Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί ένα φαινόμενο στο οποίο η μεμβράνη ενός κυττάρου εκτίθεται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο μεγάλης έντασης και μπορεί προσωρινά να αποσταθεροποιηθεί, αλλά και να γίνει ιδιαίτερα διαπερατή σε εξωγενή μόρια του περιβάλλοντος μέσου. Η ηλετροφόρηση μπορεί να θεωρηθεί σαν μια τεχνική μικροσύρριγας και έχει χρησιμοποιηθεί για την μεταφορά πειραματκών υλικών σε απομονωμένα κύτταρα in vitro ή σε ορισμένες περιπτώσεις σε ζωντανά κύτταρα in vivo. Σε πείραμα που διενεργήθηκε στο MIT χρησιμοποιήθηκαν οι εξής συνθήκες ηλεκτροφόρησης: ένας παλμός με εκθετική καθυστέρηση εφαρμόστηκε κάθε 5 λεπτά για 1 ώρα.το ηλεκτρικό δυναμικό κυμαινόταν από 0 εως 500 volts. Βρέθηκε ότι μπορεί να υπήρχε ένα μεταβατικό σημείο στην εφραμογή των 100 volt, κάτω από το οποίο η αύξηση της διαπερατότητας ήταν αναστρέψιμη και πάνω από το οποίο τα φαινόμενα ήταν μερικώς αντιστρεπτά. 56

57 Γ. Αντιστρεπτή ιοντοφόρηση: Η ιοντοφόρηση με αντιστρεπτό χαρακτήρα αποτελεί τεχνική η οποία είναι μια ενδιαφέρουσα, πολυ σηματική εφαρμογή μιας μορφής ηλεκτρο-όσμωσης. Χρησιμοποείται κυρίως σε μη επεμβατικές δειγματοληψίες ουσιών. ΙΙΙ.8. In vivo τεχνικές διαδερμικής διαπερατότητας Οι κυριότερες τεχνικές διαδερμικής απορροφήσεως συνοψίζονται παρακάτω: 36,37 1. Εφαρμογή στην επιφάνεια του δέρματος: Η ουσία εφαρμόζεται στην επιφάνεια του δέρματος και η απώλειά της μετράται π.χ. με μετρητή Geiger (για ραδιενεργά παράγωγα). Εναλλακτικά μετράται το υπολειπόμενο φάρμακο στο διάλυμα ή το ΔΘΣ που εφαρμόζεται επί του δέρματος Παρατήρηση φυσιολογικής ή φαρμακολογικής αντίδρασης: Για φάρμακα που προκαλούν βιολογική απόκριση όταν φτάσουν στους ζωντανούς ιστούς. Η έναρξη και έκταση της απόκρισης (μεταβολή αρτηριακής πίεσης, εκδήλωση σπασμών, τοπική αγγειοσυστολή ή ερύθημα) δίνουν πληροφορίες για την πορεία της απορρόφησης. 3. Μέτρηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου σε βιολογικά δείγματα: Η ουσία εφαρμόζεται στην επιφάνεια του δέρματος και μετρούνται τα επίπεδά της στο αίμα (ή και σε ιστούς). Η έκταση της απορρόφησης συγκρίνεται με την απόλυτη βιοδιαθεσιμότητα της κατόπιν ενδοφλέβιας χορήγησης. Εναλλακτικά (έμμεση μέθοδος), μετρούνται τα επίπεδα του φαρμάκου στις εκκρίσεις. 4. Ιστολογικές μέθοδοι: Εντοπισμός των οδών διαπέρασης με τη λήψη μικροσκοπικών τομών δέρματος. Αυτό γίνεται με ραδιοεπισήμανση των ουσιών των οποίων μελετούμε την διαπερατότητα. Αυτό επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό και την κατανομή των ουσιών τοπικά, δηλαδή στην κεράτινη στοιβάδα, στην επιδερμίδα, στο κυρίως δέρμα ή στο υποδόριο λίπος. Παρόλα αυτά η χρήση χρωστικών, φθοριζουσών ή ραδοεπισημασμένων ουσιών δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της απορροφήσεως εκτός αν τα ίδια τα μόρια είναι χρωστικές ή 57

58 φθορίζουν, εξαιτίας της συχνής αποσπάσεως των χρωστικών από την εξεταζόμενη ουσία στο επίπεδο της ζώσας επιδερμίδας. 37 ΙΙΙ.9. In vitro τεχνικές διαδερμικής απορροφήσεως Η βασική in vitro τεχνική για τον υπολογισμό της διαδερμικής διαπερατότητας είαι η χρήση κυττάρων Franz με τα βασικά στοιχεία του (Σχήμα 14). 38,39 Σχήμα 14. Κύτταρο Franz (Franz cell). Ένα τυπικό κύτταρο Franz αποτελείται από το διαμέρισμα-δέκτη, το διαμέρισμα-δότη και την ενδιάμεση μεμβράνη. Στα Σχήματα 15 και 16 φαίνονται κάποιες φωτογραφίες των κυττάρων Franz και η σημερινή εξέλιξή τους. 58

59 Σχήμα 15. Παλαιότερος τύπος κυττάρου Franz. Σχήμα 16. Κύτταρο Franz σήμερα. Ανάμεσα στην λεγόμενη εξέλιξη των κυττάρων Franz συγκαταλέγονται και οι επιπλέον εισαγωγές για την χρήση είτε θερμότητας είτε ιοντοφόρησης (Σχήμα 17). Σχήμα 17. SES τύπος κυττάρου Franz. Ένα τύπου SES κύτταρο Franz είναι ένα πρότυπο κύτταρο Franz με επιπλέον θυρίδες για τη διάδοση μέσω των υποδοχέων του μέσου από το διαμέρισμα των υποδοχέων του κυττάρου. Όπως και με τα στατικά κύτταρα Franz, ροή μπορεί επίσης να προστεθεί στο διαμέρισμα του δότη, αν χρειαστεί

60 Ένα τυπικό πείραμα περιλαμβάνει το διαμέρισμα- δότη όπου το φάρμακο μεταφέρεται μέσω μιας μεμβράνης στο διάλυμα του δέκτη. Το φάρμακο τοποθετείται με την μορφή γέλης στο διαμέρισμα-δότη και παρατηρείται η διαπερατότητά του μέσω της μεμβράνης που τοποθετείται κάτω από το διαμέρισματου δότη. Το διάλυμα του δέκτη αναλύεται με κατάλληλη τεχνική (HPLC) και ένα διάγραμμα κατασκευάζεται με το συνολικό ποσό του φαρμάκου που διαπερνά την μεμβράνη. Η ροή (J) υπολογίζεται από το διάγραμμα της σταθεροποιημένης κατάστασης ή από το γραμμικό τμήμα της ροής, με την μέτρηση του χρόνου υστέρησης που χρειάζεται για να φτάσει στην σταθεροποιημένη κατάσταση.η ροή έχει μονάδες μg/cm 2.hr. 38,39 ΙΙΙ.9.1. Διαμέρισμα-δότης Το διαμέρισμα- δότης μπορεί να ποικίλλει, εξαρτώμενο από το αν η δόση του φαρμάκου αποδεσμεύεται, είναι πεπερασμένη ή άπειρη. Σε μια τοπική φαρμακοτεχνική μορφή όπου μια σχετικά πεπερασμένη δόση τοποθετείται στην πλευρά του δέρματος και ενώ ο διαλύτης εξατμίζεται, η διάχυση περιορίζεται είτε από την ποσότητα του φαρμάκου στην επιφάνεια του δέρματος, ή από την παρουσία του επιταχυντή διαβατότητας, ή τέλος από την συγκέντρωση του φαρμάκου στο διαλύτη του που είναι η κινητήρια δύναμη για την διαπέραση μέσω της στιβάδας του δέρματος. Με λίγα λόγια η συγκέντρωση του φαρμάκου φτάνει μέχρι ένα μέγιστο και στη συνέχεια ελαττώνεται. 38 Αν το διαμέρισμα-δότης καλυφθεί, ώστε να αποφευχθεί η εξάτμιση των διαλυτών και λοιπών πτητικών συστατικών, η δόση θεωρείται άπειρη και το σύστημα χαρακτηρίζει τα ΔΘΣ παρά τα τοπικά προϊόντα. Στο δότη τοποθετείται διάλυμα, ημιστερρεή φαρμακοτεχνική μορφή ή ΔΘΣ και καλύπτεται. Το περιεχόμενο φάρμακο βρίσκεται σε συγκέντρωση ίση με τη διαλυτότητα κορεσμού (θερμοδυναμική ενεργότητα ίση με 1), προκειμένου τα αποτελέσματα να είναι επαναλήψιμα τουλάχιστον στις αρχικές μελέτες, όπου και συγκρίνονται διαλύτες ή και επιταχυντές για την επίδρασή τους πάνω στη διαπερατότητα μιας ουσίας. 38,39 60

61 ΙΙΙ.9.2. Ενδιάμεση μεμβράνη Το δεύτερο συστατικό ενός κυττάρου διάχυσης είναι η στιβάδα του δέρματος ή οποιαδήποτε άλλη μεμβράνη, συστατικά τα οποία παίζουν ρόλο στη διαπερατότητα της ουσίας. Η στιβάδα τπυ δέρματος είτε είναι ζωϊκή, είτε ανθρώπινη, είτε μεμβράνη πολυμερούς.οι διαφορές μεταξύ των ζωϊκών και των ανθρώπινων μεμβρανών αντλούν την πηγή τους στα εξής: α) ποικιλομορφία στην ιστολογία μεταξύ του ζωϊκού και ανθρωπίνου δέρματος β) μεταβολή μεταξύ των διαφορετικών ζωϊκών δερμάτων, περιλαμβάνοντας διαφορές και σε διαφορετικούς τύπους φαρμάκων. 39,40,41 Το δέρμα αυτό μπορεί να είναι πλήρους πάχους (full thickness), δηλαδή επιδερμίδα και χόριο, ή διαιρεμένου πάχους (split thickness), που προέρχεται από πλήρες δέρμα με θερμική, χημική ή ενδημική επεξεργασία και περιλαμβάνει μόνο επιδερμικούς ιστούς. Η χρήση του δεύτερου πλεονεκτεί στο ότι αντανακλά επακριβώς το φραγμό από άποψη πάχους. Το πρώτο μπορεί να χρησιμοποιηθεί όταν το δέρμα του ζώου από το οποίο προέρχεται είναι πολύ λεπτό. 40,41 Προτιμότερη από άποψη φυσιολογίας είναι η χρήση ανθρώπινου δέρματος. Συνήθως χρησιμοποιείται δέρμα από πλάτη, κοιλιακή χώρα ή μηρούς προερχόμενο από αυτοψίες ή μειωτικές πλαστικές επεμβάσεις. Ωστόσο η διαθεσιμότητά του είναι περιορισμένη. Για το λόγο αυτό συχνά επιλέγονται ζωικές ή τεχνητές μεμβράνες. 40 Οι κυριότεροι τύποι ζωϊκών μεμβρανών που χρησιμοποιούνται είναι κυρίως χοίρειο δέρμα γιατί είναι ο πλησιέστερος τύπος δέρματος που ομοιάζει με το ανθρώπινο. Επίσης χρησιμοποιείται δέρμα άτριχων ποντικών αν και είναι γενικά λεπτότερο από το ανθρώπινο. Θα έπρεπε επίσης να τονιστούν οι διαφορές που υπάρχουν μεταξύ των διαφορετικών ζωϊκών μεμβρανών που οφείλονται κυρίως στην διαφορετική διαπερατότητα σε σχέση με το ανθρώπινο δέρμα. Το γεγονός αυτό, δημιουργεί την εντύπωση ότι το ζωϊκό δέρμα αποτελεί μια ριψοκίνδυνη επιλογή για την χρήση του σε κλινικές μελέτες σε σχέση με το ανθρώπινο δέρμα. 40,41 Μια άλλη μορφή μεμβρανών αποτελούν τα πολυμερή και οι τεχνητές μεμβράνες. Το κύριο μειονέκτημα των παραπάνω μεμβρανών είναι ότι δεν έχουν καμία ιστολογική ομοιότητα με αυτή του ανθρωπίνου δέρματος. Σε αυτές τις μεμβράνες δεν υπάρχει η διπλοστιβάδα η οποία να βρίσκεται διαεσπαρμένη στην πρωτεϊνική περιοχή, όπως υπάρχει στο ανθρώπινο δέρμα. Από την άλλη, οι μεμβράνες αυτές είναι ιδιαίτερα 61

62 αναπαραγώγιμες και δεν κατέχουν την βιολογική ποικιλομορφία που συναντάται στις ζωϊκές και ανθρώπινες μεμβράνες. Παρόλα αυτά, τα αποτελέσματα που δίνουν δεν είναι σε καμία περίπτωση ανακυκλώσιμα και ότι θα μπορούσε να περιμένει κανείς να δει σε μελλοντικά in vivo πειράματα. 40,41 Έτσι ενώ μερικές μεβράνες μπορούν να χρησιμοποηθούν για αρχικά πειράματα διαπερατότητας, καμία από τις παραπάνω επιλογές δεν μπορεί να δώσει μια συνολική εικόνα για την πραγματική διαπερατότητα μιας ουσίας ή μια εικόνα για τα μελλοντικά in vivo πειράματα μιας ουσίας. ΙΙΙ.9.3. Διαμέρισμα-δέκτης Το διαμέρισμα δέκτης των κυττάρων διάχυσης πληρείται με διάλυμα φυσιολογικού ορού ή διάλυμα φωσφορικών (ph 7.4) σε θερμοκρασία 36ºC, παρέχοντας μια θερμοκρασία της τάξης των 30-32ºC στην επιφάνεια του δέρματος, η θερμοκρασία του δέρματος σε in vivo συνθήκες. Αν και οι δυο μεριές των διαλυμάτων του δότη και του δέκτη διατηρηθούν σε θερμοκρασία των 36ºC, τότε η θερμοκρασία της στιβάδας του δέρματος θα είναι μεγαλύτερη από αυτή που κανονικά συναντάται στην κεράτινη στιβάδα. Πολλές φορές αντιβιοτικές ουσίες εισάγονται στο διάλυμα του δέκτη για να σταθεροποιήσουν τον διαδερμικό ιστό και να μειώσουν την ενζυματική υποβάθμιση ουσιών όπως η εστραδιόλη. 42 Η διατήρηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στο διάλυμα του δέκτη διατηρείται κάτω της διαλυτότητας κορεσμού έτσι ώστε η απαιραίτητη σταθεροποιημένη κατάσταση να υπάρχει. Όσο η συγκέντρωση του φαρμάκου στο διάλυμα του δότη πλησιάζει την διαλυτότητα κορεσμού, τότε η συγκέντρωση ή η κινητήριος δύναμη μηδενίζονται και η ροή παύει. Για την διατήρηση της κατάλληλης χαμηλής συγκέντρωσης στο διάλυμα του δότη σε κύτταρα τα οποία θεωρούνται στατικά και όπου το διάλυμα δεν κυκλοφορεί στο δέρμα, τότε το διάλυμα του δότη ανανεώνεται συχνά. Σε ορισμένες περιπτώσεις στο διάλυμα του δότη εισάγονται ουσίες οι οποίες αυξάνουν τη διαλυτότητα του φαρμάκου. Σε αυτές τις ουσίες συγκαταλέγονται διάφορες αλκοόλες, προπυλενογλυκόλη, πολυαιθυλενογλυκόλη και επιφανειοδραστικά, τα οποία εισέρχονται για να αυξήσουν την διαλυτότητα του 62

63 φαρμάκου και να διατηρήσουν μια σταθεροποοημένη κατάσταση στη ροή όταν στα πειράματα εισαχθούν και οι επιταχυντές διαβατότητας. 31 Στη συνέχεια ακολουθεί εκτενής αναφορά στην ουσία που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί αλλά και στα χαρακτηριστικά της. 63

64 ΚΕΦΑΛΑΙΟ IV ΗΜΙΚΡΑΝΙΑ ΚΑΙ ΒΕΖΟΪΚΟ ΑΛΑΣ ΤΗΣ ΡΙΖΑΤΡΙΠΤΑΝΗΣ ΙV.1. Εισαγωγή- Ιστορικά στοιχεία Η ημικρανία βρίσκεται στην 19 η θέση από τον οργανισμό WHO σε σχέση με ασθένειες που δεν μπορούν να ταξινομηθούν στην κατηγορία της Λειτουργίας, Αναπηρίας και της Υγείας, αρχών της Διεθνούς Εταιρείας Κεφαλαλγίας (IHS). 43 Η αθροιστική διάρκεια των επεισοδίων της ημικρανίας σε μελέτη της Αμερικανικής Εταιρείας Ημικρανιών (Επικράτηση και Μελέτη Πρόληψης) αναφέρθηκε στο 43% των γυναικών και στο 18% των ανδρών. 43 Η απώλεια του παραγωγικού χρόνου εργασίας λόγω του πόνου από πονοκέφαλο το 2002 στις ΗΠΑ και ήταν 19.6 δισεκατομμύρια δολάρια. Παρά τον επιπολασμό και την εξουθενωτική φύση αυτής της διαταραχής, η ημικρανία ακόμη υποδιαγιγνώσκεται και δεν αντιμετωπίζεται πλήρως. 39 Από τη δεκαετία του 1860, κατά την έλευση των εργοταμινών, οι ημικρανίες ήταν πιθανό να οφειλόταν στην αγγειοδιαστολή ως πρωταρχικό μηχανισμό. Τη δεκαετία του 1930 και 1940, οι Graham και Woolf έδειξαν στοιχεία που αποδείκνυαν ότι η τρυγική εργοταμίνη μείωνε τις δονήσεις του εξωτερικού καρωτιδικού σύστηματος και θεωρήθηκε ότι αυτός ήταν ο μηχανισμός της ημικρανίας και της συνακόλουθου πόνου. Οι εργοταμίνες ήταν ο στυλοβάτης της θεραπείας μέχρι το 1991, όταν η σουματριπτάνη εισήχθη σε όλο τον κόσμο (εκτός από τις ΗΠΑ, όπου ξεκίνησε το 1993). 44 Η σουματριπτάνη ανακαλύφθηκε από τον Patrick Humphrey του Ηνωμένου Βασιλείου, ο οποίος έψαχνε για ένα αγγειοσυσταλτικό που θα διέγειρε τους κατάλληλους υποδοχείς της σεροτονίνης και είχε κάποιες από τις ιδιότητες των εργοαμινών χωρίς τις ίδιες συστηματικές ανεπιθύμητες ενέργεις και την μακροχρόνια αγγειοσυστολή

65 ΙV.2. Ημικρανία και μηχανισμός δράσης Η ημικρανία χαρακτηρίζεται από πονοκεφάλους που είναι παλλομένοι ή κυμαινόμενοι, συχνά μονόπλευρη (μονομερής), και συχνά σχετίζεται με ναυτία, έμετο, φωτοφοβία (ευαισθησία στο φως) και φωνοφοβία (ευαισθησία στον ήχο). 43 Αν και τα εξαιρετικά πολύπλοκα φυσιολογικά γεγονότα που οδηγούν σε μια κρίση ημικρανίας δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητά, η τρέχουσα βιβλιογραφία δείχνει ότι η ημικρανία μπορεί να είναι μια κληρονομική φυσιολογική δυσλειτουργία των ανατομικών μερών του εγκεφάλου και ότι κατά την πρώτη εκδήλωσή της θεωρείται ότι ομοιάζει στην φλοιώδη κατάθλιψη. 43 Επιπλέον, όλες οι πάσχοντες από ημικρανία φαίνεται να αναπτύσσουν ενεργοποίηση των τριδύμων οδών περιφερικά και στη συνέχεια σε κεντρικό επίπεδο, αν η νόσος εξελίσσεται χωρίς αποτελεσματική θεραπεία. Σε αυτή την περίπτωση, υπάρχει συμμετοχή των διαφόρων δομών του στελέχους, όπως είναι ο τρίδυμος ουραίος πυρήνας, που οδηγεί σε ενεργοποίηση του αυτόνομου, κεντρική ευαισθητοποίηση, αλλοδυναμία και αύξηση του πόνου, με πιθανή δυσλειτουργία του θαλάμου και των δομών του φλοιού. 43 Η τρίδυμη οδός περιλαμβάνει στοιχεία από αλγοϋποδοχείς σε στενή προσέγγιση προς τις αρτηρίες και τις φλέβες που βρίσκονται στο δέρμα, τους μυς του πρόσωπου και του λαιμού, το περιόστεο και την ενδοκρανιακή σκληρά μήνιγγα και τα ιγμόρεια. Αυτοί οι αλγοϋποδοχείς μεταδίδουν σήματα πόνου στο τρίδυμο γάγγλιο, κατά μήκος του πρώτου τμήματος του τριδύμου νεύρου, και στη γέφυρα. Αυτά τα νεύρα συνάπτονται με τους δεύτερης τάξης νευρώνες στον ουραίο πυρήνα του τριδύμου της γέφυρας και του μυελού, από όπου η κεντρική ευαισθητοποίηση εμφανίζεται σε ορισμένους ασθενείς. Τα σήματα αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνάπτονται με τον τρίτης τάξης νευρώνα στο θάλαμο και στον εγκεφαλικό φλοιό όπου η αντίληψη του πόνου συμβαίνει. Ποκίλλες χημικές ουσίες απελευθερώνονται από το περιφερικό άκρο του πρώτου τμήματος του πέμπτου κρανιακού νεύρου, που βρίσκεται σε στενή προσέγγιση με τα αιμοφόρα αγγεία, και μπορεί επίσης να απελευθερωθούν κεντρικά στο εγκεφαλικό στέλεχος. Οι ουσίες που απελευθερώνονται περιλαμβάνουν πεπτίδια που σχετίζονται με την καλσιτονίνη, (CGRP), τη νευροκινίνη-a και την ουσία Ρ, οι οποίες προκαλούν την απελευθέρωση των φλεγμονωδών κυτοκινών από τα τοπικά μαστοκύτταρα. Οι φλεγμονώδεις αυτές 65

66 ουσίες στη συνέχεια διεγέιρουν τους αλγοϋποδοχείς, στέλνοντας σήματα πόνου πίσω στο εγκεφαλικό στέλεχος. Το πεπτίδιο CGRP έχει βρεθεί να είναι αυξημένο σε φλεβική εκροή κατά τη διάρκεια της ημικρανίας και επεισοδίων συμπλέγματος. 45 IV.3. Τριπτάνια και βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης IV.3.1. Εισαγωγή στα τριπτάνια-μηχανισμός δράσης Οι τριπτάνες αποτελούν φαρμακευτικές μορφές που μπορούν να λαμβάνονται υποδόρια, από το στόμα ως δισκία, κάψουλες, ή ως γρήγορης διάλυσης δισκία, ή ενδορινικά ως σπρέι. Η πρώτη τριπτάνη, η σουματριπτάνη, εισήχθη στην αγορά το Επί του παρόντος, 7 τριπτάνες είναι διαθέσιμες στις Ηνωμένες Πολιτείες (Πίνακας ΙΙΙ). 46 Από τον Ιούνιο του 2003, η από του στόματος μορφή δισκίων της σουματριπτάνης αντικαταστάθηκε από μια μορφή δισκίου ταχείας απελευθέρωσης (RT Technology), που σχεδιάστηκε για να διευκολύνει την έγκαιρη απελευθέρωση της σουματριπτάνης στην κυκλοφορία του αίματος. 45,46,47 Πίνακας ΙΙΙ. Μορφές τριπτανίων που κυκλοφορούν στην αγορά. 66

67 Όσον αφορά το μηχανισμό δράσης τους, οι τριπτάνες είναι ανταγωνιστές των υποδοχέων της σεροτονίνης (5-HT) 1B και 5-HT1D (που βρίσκονται σε αιμοφόρα αγγεία και προσυναπτικά στα αισθητήρια νεύρα, αντίστοιχα). Οι τριπτάνες είναι γνωστό ότι δρουν με τρεις βασικούς τρόπους: περιφερική αναστολή της απελευθέρωσης των CGRP και της ουσίας Ρ από προσαγωγές ίνες του τριδύμου νεύρου, διαφοροποίηση των νευρώνων δεύτερης τάξης κεντρικά στην τρίδυμη περιοχή, συμπεριλαμβανομένων του ουραίου πυρήνα του τριδύμου και το θάλαμου, και, τέλος, αγγειοσυστολή. 44 Η κρανιακή αγγειοσύσπαση αναφέρεται ως βασικός μηχανισμός για διάφορους λόγους. Ο πιο σημαντικός είναι ότι ότι η τροποποίηση του αγγειακού τόνου δεν είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική θεραπεία της ημικρανίας. Παρόλα αυτά, η αγγειοσύσπαση συνεχίζει να είναι ο πιο ευρύς και γνωστός μηχανισμός των τριπτανών. Επιπλέον, οι αλλαγές στο μεταβολισμό της σεροτονίνης έχουν επίσης αναφερθεί ότι μπορεί να διεγείρουν την αλγαισθησία και μια μορφή νευρογενούς φλεγμονής. Έτσι, οι τριπτάνες θεωρείται ότι αυξάνουν τη διέγερση των υποδοχέων της σεροτονίνης. 44 IV.3.2. Βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης Το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης κυκλοφορεί σε δισκία με την εμπορική ονομασία Maxalt (rizatriptan benzoate) και σε δισκία που αποσυντίθεται γρήγορα στο στόμα (Maxalt ODT ), διαθέσιμα για την από του στόματος χορήγηση, σε περιεκτικότητες των 5 και 10 mg (που αντιστοιχεί σε 7,265 mg ή 14,53 mg του βενζοϊκού άλατος, αντίστοιχα). Κάθε συμπιεσμένο δισκίο περιέχει τα ακόλουθα αδρανή συστατικά: μονοϋδρική λακτόζη, μικροκρυσταλλική κυτταρίνη, προζελατινοποιημένο άμυλο, οξείδιο του σιδήρου (κόκκινο), και στεατικό μαγνήσιο. 49 IV Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά IV Ονομασία κατά IUPAC: N,N-dimethyl-5-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)- 1Hindole-3-ethanamine monobenzoate.48 67

68 IV Μοριακός τύπος: C 15 H 19 N 5 C 7 H 6 O 2 IV Χημικός τύπος: Σχήμα 18. Βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης. IV Περιγραφή: Το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης είναι ένα λευκό έως υπόλευκο, κρυσταλλικό στερεό. 49 IV Διαλυτότητα: Διαλυτό στο νερό σε περίπου 42 mg ανά ml (εκφρασμένη ως ελεύθερη βάση), στους 25 C. 48 IV Μοριακό βάρος: IV Log P: IV Σημείο τήξης: º C 48 IV Χρόνος ημίσειας ζωής (t ½ ): 2-3 ώρες 48 IV Ενδείξεις Το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης ενδείκνυται για την οξεία θεραπεία της ημικρανίας σε ενήλικες. Δεν προορίζεται για την προφυλακτική θεραπεία της ημικρανίας ή για χρήση στην αντιμετώπιση της ημιπληγικής ημικρανίας. 50 IV Δοσολογία Εφάπαξ δόσεις των 5 και 10 mg δισκίων του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης ή της μορφής των δισκίων που αποσυντίθενται πιο γρήγορα στο στόμα θεωρούνται 68

69 αποτελεσματικά για την οξεία θεραπεία της ημικρανίας σε ενήλικες. Η επιλογή της δόσης θα πρέπει να γίνεται σε εξατομικευμένη βάση, σταθμίζοντας το πιθανό όφελος της δόσης των 10 mg με τον δυνητικό κίνδυνο για αυξημένες ανεπιθύμητες ενέργειες. 49 IV Τοξικότητα- Ανεπιθύμητες ενέργειες Τα συμπτώματα της υπερδοσολογίας περιλαμβάνουν ζάλη, λιποθυμία, καρδιακά και κυκλοφοριακά προβλήματα, υψηλή αρτηριακή πίεση, απώλεια του ελέγχου του εντέρου και της ουροδόχου κύστης, αργό καρδιακό παλμό και έμετο. 49 IV Μηχανισμός δράσης Τρεις διαφορετικές φαρμακολογικές δράσεις έχουν αναφερθεί σχετικά με την δράση της ριζατριπτάνης στην αντιμετώπιση της ημικρανίας: (1) διέγερση των προσυναπτικών 5-HT1D υποδοχέων, η οποία χρησιμεύει για την αναστολή της αγγειοδιαστολής στη μήνιγγα και της φλεγμονής (2) την άμεση αναστολή της διεγερσιμότητας των πυρήνων των κυττάρων του τριδύμου μέσω αγωνισμού του 5- HT1B /1D υποδοχέα στο εγκεφαλικό στέλεχος και (3) αγγειοσυστολή των μηνίγγων, της σκληράς μήνιγγας, του εγκεφαλικό στελέσχους, ως αποτέλεσμα του αγγειακού αγωνισμού με τον 5-HT1B υποδοχέα. 47 IV Φαρμακοκινητικά δεδομένα Σύμφωνα με στοιχεία που λαμβάνονται από έρευνες που έγιναν για τπν υπολογισμό ορισμένων φαρμακοκινητικών παραμέτρων στο βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης, κάποιες από τις φαρμακοκινητικές παραμέτρους της ριζατριπτάνης έχουν ως εξής (Πίνακας IV): 48,49,50,51 69

70 Φαρμακοκινητικές παράμετροι Βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης (Rizatriptan benzoate) Τ ½ (h) 2.2 Cmax (ng/ml) 19.8 (23.6) α Tmax (h) 1.4 (1.4) Cl(ml/min) 396 (112) F (%) 47 α Η τιμή μέσα στη παρένθεση αντiστοιχεί με την τυπική απόκλιση (SD) Πίνακας IV. Φαρμακοκινητικές παράμετροι μετά από χορήγηση 10 mg βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης. IV Φαρμακοδυναμικά δεδομένα Στον Πίνακα V συνοψίζονται κάποια από τα φαρμακοδυναμικά δεδομένα του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης, όπως η σύνδεση με τις πρωτεϊνες και η απορρόφησή της. 50,51,52,53 Φαρμακοδυναμικά δεδομένα Απορρόφηση: Μεταβολισμός: Βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης Tαχεία απορρόφηση μετά την από στόματος χορήγηση. Η βιοδιαθεσιμότητα είναι 45%. 50 Η λήψη τροφής δεν έχει καμία επίδραση στη βιοδιαθεσιμότητα. Ωστόσο, η χορήγησή του φαρμάκου με τα τρόφιμα θα καθυστερήσει κατά 1 ώρα το χρόνο επίτευξης της μέγιστης συγκέντρωσης στο πλάσμα. Ο ρυθμός απορρόφησης δεν επηρεάζεται από την παρουσία ενός επεισοδίου ημικρανίας. 50,51 Η ριζατριπτάνη μεταβολίζεται από αναστολείς του ισοενζύμου της μονοαμινοξειδάσης Α (ΜΑΟ-Α) σε ανενεργό ινδολο οξικό οξύ. Επιπλέον, διαμορφώνονται διάφοροι άλλοι αδρανείς 70

71 μεταβολίτες. Ο ενεργός μεταβολίτης,νmonodesmethyl rizatriptan, με φαρμακολογική δράση παρόμοια με αυτή της μητρικής έχει εντοπιστεί και σε μικρές συγκεντρώσεις (14%) στο πλάσμα. Εκτεταμένο το φαινόμενο της πρώτης διόδου μέσω οξειδωτικής απαμίνωση από την μονοαμινο-οξειδάση-α (ΜΑΟ-Α) στην N- monodesmethyl-rizatriptan (ενεργός μεταβολίτη). 5 Οδός αποβολής: Περίπου το 14% της από του στόματος δόσης απεκκρίνεται στα ούρα σαν αμετάβλητο άλας ενώ το 51% απεκκρίνεται ως ινδολο-οξικό μεταβολίτη, δείχνοντας ουσιαστικό μεταβολισμό πρώτης διόδου. Όγκος κατανομής: 140 L για τους άνδρες 110 L για τις γυναίκες Σύνδεση με πρωτεϊνες: 14% Πίνακας V. Φαρμακοδυναμικά δεδομένα της βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης. IV.4. Πειραματικός σχεδιασμός 56, 57, 58, 59 Ο πειραματικός σχεδιασμός είναι ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο στον εντοπισμό των παραγόντων εκείνων που επηρεάζουν τα χαρακτηριστικά ποιότητας του τελικού προϊόντος ή της διαδικασίας που μελετάμε και θέλουμε να έχουμε κάτω από στατιστικό έλεγχο. Αν ήταν να δώσουμε έναν ορισμό στη διαδικασία του πειραματικού σχεδιασμού, θα οριζόταν ως μια προσέγγιση σύμφωνα με την οποία μεταβάλλοντας με κατάλληλο τρόπο τις τιμές των παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία ή το αποτέλεσμα της, μπορούμε να καθορίσουμε κατά πόσο οι τιμές αυτών των μεταβλητών και με ποιο τρόπο επηρεάζουν την απόκριση. Με λίγα λόγια ο πειραματικός σχεδιασμός μας βοηθάει στην σχεδίαση των κατάλληλων πειραμάτων, ώστε να βρούμε τις μεταβλητές εκείνες που επηρεάζουν 71

72 την ποιότητα του προϊόντος σε σημαντικό βαθμό και με ποιoν τρόπο η μεταβολή των τιμών αυτών των μεταβλητών αντανακλά σε μεταβολή της ποιότητας του τελικού προϊόντος, καταναλώνοντας συγχρόνως τους ελάχιστους δυνατούς πόρους τόσο σε άψυχο όσο και σε έμψυχο δυναμικό. Τα σπουδαιότερα βήματα τα οποία χρησιμοποιούνται για τον σχεδιασμό ενός πειράματος είναι: Περιγραφή του προβλήματος και του στόχου του πειράματος. Ανάλυση και επεξεργασία των υπαρχόντων δεδομένων πάνω στο συγκεκριμένο θέμα. Επιλογή των παραγόντων που θα μελετηθούν, καθώς και των επιπέδων τους. Επιλογή της εξαρτημένης μεταβλητής. Επιλογή κατάλληλης τακτικής πειραματικού σχεδιασμού. Διεξαγωγή του πειράματος. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του πειράματος. Τελικά συμπεράσματα. Τα πειράματα πραγματοποιούνται προκειμένου να μελετηθούν διεργασίες ή συστήματα. Γενικά ως διεργασία μπορεί να θεωρηθεί ο συνδυασμός διαφόρων μηχανών, μεθόδων, ανθρώπων, που τελικά μετατρέπουν το αρχικά εισαγόμενα στοιχεία (input), για παράδειγμα πρώτες ύλες, σε εξερχόμενο αποτέλεσμα (output), με ένα ή περισσότερα μετρήσιμα χαρακτηριστικά (responses). Μερικοί από τους παράγοντες που επηρεάζουν τη διεργασία είναι ελεγχόμενοι σε αντίθεση με άλλους, που είναι μη ελεγχόμενοι. Η διαδικασία είναι ο προδιαγεγραμμένος τρόπος, η σειρά βημάτων που ακολουθούνται για την επιτέλεση μιας δραστηριότητας. Τα μετρούμενα χαρακτηριστικά ή ιδιότητες μιας διαδικασίας (όπως απόδοση, ιξώδες.) συχνά αναφέρονται και ως εξαρτημένες μεταβλητές (response variables). Όλα τα παραπάνω αποτυπώνονται στο Σχήμα 19: 72

73 Ελεγχόμενοι x 1 x 2 παράγοντες... x p Εισερχόμενα Διεργασία Εξερχόμενα... z 1 z 2 Μη ελεγχόμενοι παράγοντες z q Σχήμα 19. Παράσταση μιας διεργασίας. Ένας σημαντικό παράδειγμα πειραματικού σχεδιασμού αποτελεί η τεχνική του παραγοντικού σχεδιασμού, η οποία είναι αυτή που χρησιμοποιείται συχνότερα, διότι επιτρέπει την ταυτόχρονη μεταβολή των παραγόντων της διεργασίας. Με τον τρόπο αυτό, επιτυγχάνεται ο προσδιορισμός της κύριας επίδρασης (main effect) ενός παράγοντα στην απόκριση, αλλά και η πιθανή αλληλεπίδραση (interaction) των παραγόντων μεταξύ τους. Μία ιδιαίτερη κατηγορία πειραμάτων παραγοντικού σχεδιασμού είναι τα πειράματα διαχωρισμού παραγόντων (screening experiments), με τα οποία γίνεται επιλογή των παραγόντων που έχουν πραγματική επίδραση στη διεργασία και που η επίδραση τους είναι αναμφίβολα διακριτή από το θόρυβο υποβάθρου (background noise). Οι παράγοντες από τους οποίους μπορεί να εξηγηθεί το μεγαλύτερο ποσοστό της μεταβλητότητας της υπό μελέτη διεργασίας ονομάζονται σημαντικοί (significant) σε αντίθεση με τους μη σημαντικούς παράγοντες. Όταν τα δεδομένα δεν είναι επαρκή για τον έλεγχο της σημαντικότητας με στατιστικά κριτήρια, προτιμώνται οι όροι «ενεργός» και «μη ενεργός παράγοντας» (active και non-active factor). Η απλούστερη περίπτωση είναι αυτή κατά την οποία μελετάται η επίδραση του παράγοντα Π 1, που μπορεί να λάβει δύο επίπεδα, Α και Β, στην απόκριση Υ. 73

74 Επιδιωκόμενος στόχος είναι να εξεταστεί εάν η μεταβολή στην απόκριση του συστήματος οφείλεται στην αλλαγή των επιπέδων του παράγοντα (διαφορικό αποτέλεσμα, differential effect). Η εκτίμηση της επίδρασης του παράγοντα Π 1 μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: Ως προς μία πραγματική κατάσταση αναφοράς (μοντέλο κατάστασης αναφοράς, reference state model). Ως προς μία υποθετική κατάσταση αναφοράς (μοντέλο παρουσίας-απουσίας, presence-absence model). Η σχηματική απεικόνιση των μοντέλων πραγματικής κατάστασης αναφοράς και υποθετικής κατάστασης αναφοράς φαίνεται στο Σχήμα 20. Y Μοντέλο κατάστασης αναφοράς Μοντέλο Β β 1,Β/Α β 0 β 1,Α Υποθετική κατάσταση αναφοράς β 1,Β β 0 Κατάσταση αναφοράς Α Σχήμα 20: Σχηματική απεικόνιση των μοντέλων πραγματικής κατάστασης αναφοράς και υποθετικής κατάστασης αναφοράς. Έτσι, αν το επίπεδο Α του παράγοντα Π 1 θεωρηθεί το επίπεδο αναφοράς, το μοντέλο μπορεί να γραφεί: Y = β ο + ε Y = β ο + β 1,Β/Α + ε παράγοντας Π 1 στην κατάσταση Α παράγοντας Π 1 στην κατάσταση Β 74

75 όπου β ο σταθερά (η πραγματική ή θεωρητική απόκριση) και ε το (τυχαίο) πειραματικό σφάλμα, με μέση τιμή μηδέν. Έτσι, ο όρος β 1,Β/Α περιγράφει την επίδραση στην απόκριση κατόπιν μεταβολής της κατάστασης του Π 1 από την κατάσταση Α στη Β. Το μοντέλο αυτό εισάγει μια αδικαιολόγητη ασυμμετρία ανάμεσα στα δύο επίπεδα, καθώς η επιλογή του ενός από τα δύο επίπεδα ως κατάσταση αναφοράς είναι αυθαίρετη. Και αυτό διότι η επιλογή του επίπεδου εκείνου που διαλέγουμε ως κατάσταση αναφοράς δεν στηρίζεται σε αντικειμενικά κριτήρια αλλά σε υποκειμενικά. IV.5. Σκοπός της εργασίας Η χορήγηση της ριζατριπτάνης από την διαδερμική οδό θα μπορούσε να επιλύσει σημαντικά προβλήματα της από του στόματος χορήγησης του φαρμάκου αυτού. Επιπλέον, θα διευκόλυνε την συμμόρφωση των ασθενών στην θεραπεία, λόγω της άρνησης της κατάποσης των δισκίων, η μορφή ενός διαδερμικού θεραπευτικού συστήματος καθίσταται ευκολότερη για την λήψη και την συμμόρφωση αυτής. Η ριζατριπτάνη διαθέτει τα επιθυμητά φυσικοχημικά και φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά για μελέτη της απορρόφησης διαμέσω του δέρματος. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η αξιολόγηση της διαδερμικής διαπερατότητας του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης ως πρώτο βήμα για την ανάπτυξη ενός διαδερμικού συστήματος με επιθυμητό ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου. Σε αυτά τα πλαίσια μελετήθηκε η επίδραση ορισμένων παραγόντων όπως το είδος και η συγκέντρωση του επιταχυντή διαβατότητας στη διαδερμική διαπέραση του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης. Για την εκπλήρωση του παραπάνω στόχου χρησιμοποιήθηκε ασσύμετρος παραγοντικός σχεδιασμός, ο οποίος επιτρέπει: Την αναγνώριση των σημαντικών παραγόντων που εμπλέκονται στην διαδικασία, καθώς και τις πιθανές αλληλεπιδράσεις τους επί της απόκρισης. Την εκτίμηση της σχετικής επίδρασης των παραγόντων στη διαδικασία, μέσω του «διαφορικού» αποτελέσματος κάθε παράγοντα ως προς μια μέση τιμή. 75

76 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η συνάντηση των δύο προσωπικοτήτων είναι όπως το ζευγάρωμα χημικών ουσιών. Εάν υπάρχει η παραμικρή αντίδραση, και τα δυο αλλάζουν Καρλ Γιάνγκ 76

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ VI ΜΕΘΟΔΟΙ VI.1.Υλικά Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την ολοκλήρωση της εργασίας ήταν τα εξής: Βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης (Rizatriptan benzoate) Lot (Pharmathen, Greece) Καυστικό νάτριο (NaOH) Lot 6498 για ανάλυση (Merck, Germany) Ακετονιτρίλιο (Acetonitrile) βαθμού HPLC Lot (Fisher, UK) Μεθανόλη (Methanol) βαθμού HPLC Lot (Fisher, UK) Αιθανόλη 95% Κινεόλη (Cineole) Lot 102H2510 (Sigma Aldrich, Γερμανία) Μενθόλη (Menthol) Lot 110H0454 (Sigma Aldrich, Germany) Τερπινεόλη (Terpineole) Lot 12H2610 (Sigma Aldrich, Germany) Λαουροκαπράμη (Azone ) Lot CHP (Chem pacific, USA) Ν μέθυλο-πυρρολιδόνη (NMP) ( ELTON, Greece) Sodium di-hydrogen Phosphate-2 hydrate (NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O) Lot (Panreac, Barcelona) Γλυκερίνη 85% Lot O (Fagron) Αζίδιο του νατρίου (Sodium Azide) Lot 120H0031 (Sigma Aldrich, Germany) Klucel HF Lot 8572 (Hercules, USA) Νερό βαθμού HPLC και απιονισμένο Μεμβράνη δέρματος 77

78 VI.2. Συσκευές και όργανα Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω: Ηλεκτρονικός ζυγός: Mettler Toledo AT 261, Delta Range (Mettler, Switzerland) Περιστροφική συσκευή εξάτμισης υπό κενό με υδατόλουτρο: Βüchi Rotavapor R-2000 (Βüchi Labotechnik, Switzerland) Υδατόλουτρο υπερήχων: Branson Sonicator 5200 (Branson, U.S.A.) Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού:uv/vis Pharma spec spectrophotometer Shimadzu, με λογισμικό U.V Probe ver 2.10 shimadzu corporation). Συσκευή διήθησης υπό κενό: Millipore Φίλτρα για τη συσκευή διήθησης υπό κενό Millipore: Durapore Membrane filters, 0.45 μm HV Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (HPLC), που περιλαμβάνει: 1. Αντλία υψηλής πιέσεως Spectra System P1000 (Spectra PHysics, U.S.A.) 2. Αυτόματο δειγματολήπτη (auto sampler) Spectra System AS1000 (Spectra PHysics, U.S.A.) 3. Ανιχνευτή υπεριώδους - ορατού Spectra System 2000 (Thermo Separation Products, U.S.A.) ρυθμισμένο σε λ max = 281 nm. 4. Μονάδα ελέγχου του συστήματος από ηλεκτρονικό υπολογιστή Spectra System SN 4000 (Thermo Separation Products, U.S.A.) 5. Ηλεκτρονικό υπολογιστή (Thermo Quest, Inc., U.S.A.) με λογισμικό Chromquest, Version 5.1 (ThermoQuest, U.K.). 6. Στήλη Inertsil ODS- 3V, 250mm Χ 4.6 mm, 5m (China) Κλίβανος: WT binder (Germany) Περιστρεφόμενος δίσκος: Fischer Scientific, U.S.A. Φυγόκεντρος: Sigma 202 MK (Sigma, Germany) Σύριγγες διήθησης: IPAS 5cc (Italy) 78

79 Ηθμοί: FP Vericel TM, FP-450, 13 mm, 0.45 μm (Gelman Sciences, Michingan, U.S.A.) Περιστρεφόμενος αναδευτήρας: SBS - Roller (SBS, Spain) Τροποποιημένα κύτταρα του Franz (Crown Glass, Somerville, U.S.A.), με εμβαδόν ανοίγματος cm 2 και όγκο διαμερίσματος δέκτη ml. Μεμβράνη πολυαιθυλενίου CoTran 9720 (3M, St. Paul, USA). Υδατόλουτρο: Edmund Bühler D-7400 (Tübingen, Germany). Μαγνητική πλάκα ανάδευσης Cimarec 3, (Thermolyne, U.S.A.) VI.3. Μέθοδοι VI.3.1. Πειραματικός σχεδιασμός Για τη μελέτη της διαδερμικής διαπερατότητας του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης επιλέχθηκε ο ασσύμετρος παραγοντικός σχεδιασμός. Οι παράγοντες που επιλέχθηκαν ήταν το είδος του επιταχυντή διαβητότητας και η συγκέντρωση του φαρμάκου. Ο παράγοντας «είδος επιταχυντή διαβητότητας» μελετήθηκε σε πέντε επίπεδα, τα οποία ήταν τα εξής: λαουροκαπράμη (Azone ), μινθόλη, τερπινεόλη, κινεόλη και Ν- μεθυλο- πυρρολιδόνη. Η επιλογή των επιταχυντών διαβητότητας έγινε με βάση την χαρακτηριστική ομάδα στη οποία ανήκουν. Ο δεύτερος παράγοντας, η «συγκέντρωση» του επιταχυντή διαβητότητας μελετήθηκε σε τρια επίπεδα: 0, 5 και 10% (o/o). Η επιλογή των παραγόντων βασίστηκε στο γεγονός ότι οι συγκεντρώσεις αυτές απαντώνται συχνά στα διαδερμικά συστήματα απορρόφησης. Οι παράγοντες και τα επίπεδα του παραγοντικού σχεδιασμού ο οποίος συμβολίζετα με , συνοψίζονται στον πίνακα VI. 79

80 Επίπεδα Είδος επιταχυντή διαβητότητας Συγκέντρωση του επιταχυντή διαβητότητας 1 Λαουροκαπράμη 0,5,10% 2 ΝΜP 0,5,10% 3 Μινθόλη 0,5,10% 4 Τερπινεόλη 0,5,10% 5 Κινεόλη 0,5,10% Πίνακας VI. Παραγοντικός σχεδιασμός. Ο αριθμός των συνταγών των κυττάρων διάχυσης που προκύπτουν με τον παραπάνω πειραματικό σχεδιασμό είναι έντεκα, σύμφωνα με το υποστηρικτικό πρόγραμμα πειραματικού σχεδιασμού που χρησιμοποιήθηκε (Design Expert version 8.0.6, Stat Ease Inc, Mineapolis, USA). VI.3.2. Φάσμα απορροφήσεως υπεριώδους Προκειμένου να πραγματοποιηθεί ανάλυση των δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή υπεριώδους ορατού, είναι απαραίτητο οι μετρήσεις να πραγματοποιηθούν στο μήκος κύματος που αντιστοιχεί στη μέγιστη απορρόφηση της ουσίας (λmax), για δύο λόγους: α) για την επίτευξη μέγιστης ευαισθησίας και β) την ελαχιστοποίηση της μεταβολής των απορροφήσεων εξαιτίας μικρών μεταβολών του μήκους κύματος κατά τη διάρκεια των μετρήσεων, αφού στο λmax παρατηρείται πλατό του φάσματος απορρόφησης. Για το σκοπό αυτό διεξήχθηκε πείραμα λήψης φάσματος υπεριώδους σε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού (Shimatzu spectrophotometer) της δραστικής ουσίας. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκε μητρικό διάλυμα βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης συγκεντρώσεως 1 mg/ml, ζυγίζοντας g άλατος σε 100 ml ακετονιτριλίου σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη. Στη συνέχεια έγινε αραίωση του μητρικού διαλύματος αφού θεωρήθηκε αρκετά συμπυκνωμένο ως διάλυμα για να χρησιμοποιηθεί σαν διάλυμα μέτρησης στο φασματοφωτόμετρο. Η αραίωση έγινε παίρνοντας 1 ml από το μητρικό διάλυμα σε 10 ml κινητής φάσης (Διάλυμα φωσφορικών/ακετονιτρίλιο/μεθανόλη σε αναλογία 80:10:10). 80

81 Στην αρχή εισήχθηκε σε κυψελίδα χαλαζία πάχους 1 cm (No 6030-UV, Hellma, Γερμανία) διάλυμα κινητής φάσης που χρησιμοποιήθηκε σαν τυφλό για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου. Μετά το μηδενισμό έγινε μέτρηση με το αραιωμένο μητρικό διάλυμα από τα 600 μέχρι τα 200 nm για τη διαπίστωση των μέγιστων κορυφών απορρόφησης της δραστικής ουσίας. VI.3.3. Υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) Για την ανάλυση των δειγμάτων του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης χρησιμοποιήθηκε κατάλληλα τροποποιημένη χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως η οποία περιλάμβανε τα παρακάτω στοιχεία (Πίνακας VII): 60 Υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) Είδος στήλης 250mm Χ 4.6 mm Inertsil ODS- 3V, 5m Κινητή φάση Buffer (ph 6.5)/ACN/MeOH σε αναλογία 80:10:10 Ροή 1.0 ml/min Μήκος κύματος 281 nm Όγκος δείγματος 50 μl Θερμοκρασία Περίπου 20ºC Πίνακας VII. Συνθήκες χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως για τη ριζατριπτάνη. VI Κινητή φάση Για τη δημιουργία 1 L κινητής φάση ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: Αρχικά παρασκευάστηκε το διάλυμα των φωσφορικών. Ζυγίστηκαν 7.8 g NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O (Τα g που των διφωσφορικού νατρίου που ζυγίστηκαν υπολογίσθηκαν με βάση το ΜΒ της ένωσης), τα οποία στη συνέχεια εισήχθησαν σε ποτήρι ζέσεως του 1 L το οποίο περιείχε 800 ml H 2 O βαθμού HPLC και αναδεύτηκαν με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα. Στην συνέχεια έγινε ρύθμιση του ph μέχρι το 81

82 6.5 με τη βοήθεια διαλύματος ΝαOH 1Ν και ειδικού πεχαμέτρου. Το διάλυμα, μετά την ρύθμιση του ph, εισήχθηκε σε ογκομετρική φιάλη του 1 L και προστέθηκε H 2 O βαθμού HPLC μέχρι την χαραγή. 800 ml από αυτό το διάλυμα αναδεύτηκαν στους υπέρηχους με 100 ml ακετονιτριλίου βαθμού HPLC και 100 ml μεθανόλης βαθμού HPLC και διηθήθηκαν με κατάλληλα φίλτρα. VI Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης Για την επιβεβαίωση της μεθόδου αναλύσεως παρασκευάστηκαν διαφόρων συγκενρώσεων πρότυπα διαλύματα του φαρμάκου ως εξής: Αρχικά παρασκευάστηκε μητρικό διάλυμα βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης συγκεντρώσεως 0.1 μg/ml. Αυτό έγινε ζυγίζοντας 0.01 g της δραστικής ουσίας και διαλύοντάς τα σε 100 ml ακετονιτριλίου βαθμού HPLC σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη με τη βοήθεια υπερήχων για 2 λεπτά. Μετά την παρασκευή του μητρικού διαλύματος (διάλυμα Α), έγιναν αραιώσεις παίρνοντας 100 μl, 300 μl, 500 μl, 700 μl,1 ml και 3 ml με τη βοήθεια κατάλληλων πιπετών σε 10 ml κινητής φάσης παίρνοντας συγκεντρώσεις 1, 3, 5, 7, 10 και 30 μg/ml. Στη συνέχεια εισήχθησαν μέσα σε κατάλληλα φιαλίδια και η μέθοδος αναλύθηκε με χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (ΗPLC). Στο πρότυπο διάλυμα των 10 μg/ml έγιναν περαιτέρω αραιώσεις παίρνοντας για άλλη μια φορά 100, 300, 500 και 700 μl σε 10 ml κινητής φάσης σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη (συγκεντρώσεις 0.1 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.7 μg/ml και 1 μg/ml αντίστοιχα). Στη συνέχεια εισήχθησαν όπως τα παραπάνω φιαλίδια και αναλύθηκαν όπως και τα παραπάνω δείγματα. VI.3.4. Πειράματα προσδιορισμού καταλληλότητας των επιταχυντών διαβητότητας με τον φορέα Για την παρασκευή των φορέων του φαρμάκου, οι οποίοι ήταν υδαταλκοολικές γέλες, προηγήθηκε στάδιο εκτίμησης του κατάλληλου φορέα. Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό, τα επίπεδα του παράγοντα «είδος του επιταχυντή διαβατότητας» έφταναν μέχρι και το 10 % (ο/ο). Επομένως ο φορέας πρέπει να περιέχει την ανάλογη ποσότητα, ώστε να αρκεί για τη διαλυτοποίηση 10% (ο/ο) του επιταχυντή διαβατότητας. 82

83 Για την παρασκευή του φορέα δημιουργήθηκε 1 L διαλύματος αιθανόλης 95º/γλυκερίνης/ Η 2 Ο απιονισμένου σε αναλογία 60:15:25 σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη. Στη συνέχεια 9 ml από το διάλυμα του φορέα εισήχθησαν σε φιαλίδια (bickers) και στη συνέχεια εισήχθηκε με κατάλληλη πιπέτα 1 ml από τους παρακάτω επιταχυντές διαβητότητας: λαουροκαπράμη (Azone ), N- μέθυλο-πυρρολιδόνη (NMP), λιμονένιο, μινθόλη, κινεόλη, τερπινεόλη. Στη συνέχεια αναδεύτηκαν με τη βοήθεια κατάλληλου μαγνητικού αναδευτήρα για να διαλυθούν πλήρως και αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Τελικά πραγματοποιήθηκε η εξακρίβωση πλήρους ή μη διάλυσης του επιταχυντή στον επιλεγμένο φορέα. VI.3.5. Προσδιορισμός της διαλυτότητας κορεσμού Το βήμα πριν τη δημιουργία των γελών του φαρμάκου ήταν ο προσδιορισμός των διαλυτοτήτων κορεσμού στον φορέα και στον κάθε επιταχυντή διαβητότητας σε ποσοστό που καθορίζεται από τον επιλεγόμενο πειραματικό σχεδιασμό (σε ποσοστό 0, 5 ή 10% ο/ο). Στη συνέχεια δίνονται κάποιες λεπτομέρειες σχετικά με τις ομάδες στις οποίες ανήκει ο κάθε επιταχυντής διαβητότητας. Αιθέρια έλαια και τερπένια (μινθόλη, τερπινεόλη, κινεόλη): Τα αιθέρια έλαια και τα τερπένια είναι πτητικές, αρωματικές ουσίες που απαντώνται σε πολλά λουλούδια και φυτά. Αυτοί οι παράγοντες έχουν χρησιμοποιηθεί για πολλά χρόνια ως γευστικά ανάλογα σε φάρμακα. Τα τερπένια είναι ελπιδοφόροι, κλινικά αποδεκτοί επιταχυντές διαβητότητας του δέρματος λόγω της χαμηλής συστηματικής τοξικότητας, της υψηλής δραστηριότητας ως επιταχυντές και των λιγοστών δερματικών ερεθισμών σε χαμηλές συγκεντρώσεις (1-5%). Οι πιο δημοφιλείς των τερπενίων στις περισσότερες φαρμακευτικές εφαρμογές είναι η μινθόλη. Η μινθόλη θεωρείται ασφαλές παράγωγο (GRAS) από τον Οργανισμό Φαρμάκων και Τροφίμων της Αμερικής (FDA) και χρησιμοποιείται ως έκδοχο σε εισπνευστικές και μαλακτικές φαρμακοτεχνικές μορφές. 35 Τα τερπένια έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν τις παραμέτρους της διαδερμικής διαπερατότητας για ένα μεγάλο αριθμό φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένων τόσο των λιπόφιλων όσο και των υδρόφιλων ενώσεων. Η επίδραση των τερπενίων στις ιδιότητες φραγμού του δέρματος έχει αποδοθεί στην ικανότητά τους να επηρεάζουν τη μεσοκυττάρια περιοχή της κεράτινης στιβάδας. 83

84 Ωστόσο, αυτή η διαταραχή των λιπιδίων βρέθηκε να είναι τελείως αναστρέψιμη και προκάλεσε χαμηλό δερματικό ερεθισμό. Οι φυσικές και οι GRAS ενώσεις, όπως τα τερπένια έχουν μεγάλη εφαρμογή σε φαρμακευτικές μορφές ως επιταχυντές διαβητότητας του δέρματος. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι παρουσιάζουν χαμηλή τοξικότητα, διατηρώντας παράλληλα τη δυνατότητα να αυξάνουν τη διείσδυση των υδρόφοβων και υδρόφιλων μορίων των φαρμάκων. 35 Στην παρούσα εργασία έχουν επιλεγεί τρία τερπένια για να διαπιστωθεί ή όχι η ικανότητά τους για αύξηση της διαπέρασης του άλατος της ριζατριπτάνης από το δέρμα. Στον Πίνακα VIII φαίνονται τα τερπένια που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και οι χημικές τους δομές. 35 Είδος του επιταχυντή διαβατότητας Χημική δομή του επιταχυντή διαβατότητας CH 3 Κινεόλη (Cineole) O H3 C CH 3 Mινθόλη (Menthol) CH 3 (Z) Τερπινεόλη (Terpineole) H 2 C CH 3 Πίνακας VIII. Χημικοί τύποι των τερπενίων που χρησιμοποιήθηκαν. Λαουροκαπράμη (Αzone ) και παράγωγά της: Η Λαουροκαπράμη (Azone )είναι γνωστό ότι παρουσιάζει σημαντικές εφαρμογές σαν επιταχυντής διαβητότητας σε χαμηλές συγκεντρώσεις και για τις δυο κατηγορίες φαρμάκων, υδρόφιλα και υδρόφοβα, και είναι ένα από τους λίγους επιταχυντές που έχουν χρησιμοποιηθεί 84

85 εμπορικά και σε ευρεία κλίμακα. Θερμιδομέτρησεις διαφορικής σάρωσης έχουν δείξει ότι η λαουροκαπράμη επηρεάζει τις δομές των λιπιδίων της κεράτινης στιβάδας. Επιπλέον, φέρεται να μειώνει τις θερμοκρασίες μετάβασης μεταξύ των διπλοστιβάδων των λιπιδίων και να προκαλεί το σχηματισμό μιας υγρής φάσης με επακόλουθο την αύξηση της ρευστότητας των λιπιδίων. 34 Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιείται η λαουροκαπράμη και η χημική της δομή φαίνεται στον Πίνακα VIIII. Είδος του επιταχυντή διαβατότητας Λαουροκαπράμη (Azone ) Χημική δομή του επιταχυντή διαβατότητας O N Πίνακας VIIII. Χημική δομή λαουροκαπράμης. Πυρρολιδόνες: H πυρρολιδόνη και τα παράγωγά της φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν και με την κερατίνη και με τα λιπίδια του δέρματος. Διαθέτουν αυξημένη αποτελεσματικότητα ως επιταχυντές διαβητότητας για τα υδρόφιλα φάρμακα Είναι όμως αποτελεσματικά και σε υδρόφοβα μόρια και μάλιστα όσο μεγαλώνει το μοριακό βάρος τόσο αποτελεσματικότερα γίνονται., αυξάνοντας το συντελεστή διάχυσης στην κεράτινη στοιβάδα. 33 Στην συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιείται η Ν-μέθυλο- πυρρολιδόνη (ΝΜΡ) λόγω της υψηλής υδροφιλικότητας του άλατος της ριζατριπτάνης. Ο χημικός της τύπος φαίνεται τον Πίνακα Χ. 85

86 Είδος του επιταχυντή διαβατότητας Ν- μέθυλο-πυρρολιδόνη (ΝΜΡ) Χημική δομή του επιταχυντή διαβατότητας Πίνακας Χ. Χημική δομή Ν- μέθυλο- πυρρολιδόνης (NMP). Μετά την σύντομη αναφορά στο μηχανισμό δράσης και σε κάποια χαρακτηριστικά των επιταχυντών διαβητότητας που χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία, έγινε η παρακάτω διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων. 5 ml διαλύματος, που περιείχε εννίοτε και ανάλογα με την ποσότητα του επιταχυντή διαβητότητας (0 ή 5 ή 10% ο/ο), 4.5 ml ή 4.75 ml του φορέα (αιθανόλη/γλυκερίνη/η 2 Ο 60:15:25) εισήχθησαν σε κάθε φιαλίδιο. Το παραπάνω διάλυμα αναδεύτηκε μέχρι της πλήρους διαλύσεως του επιταχυντή και στη συνέχεια εισήχθηκε περίσσεια της δραστικής ουσίας μέχρι το κάθε διάλυμα να γίνει υπέρκορο, πάντα υπό συνεχή ανάδευση. Στη συνέχεια τα δείγματα εισήχθησαν σε κλίβανο στη θερμοκρασία στους 25º C για 24 ώρες. Ύστερα από παραμονή των δειγμάτων εντός κλιβάνου για 24 ώρες, τα υπέρκορα διαλύματα φυγοκεντρήστηκαν στις 8000 στροφές στους 25º C για 10 λεπτά το καθένα. Στη συνέχεια έγινε αραίωση των φυγοκεντρημένων δειγμάτων και ανάλυσή τους με υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC). Κάθε φορέας παρασκευάστηκε τρεις φορές. VI.3.6. Παρασκευή των γελών Η παρασκευή των γελών έγινε, όπως και στην περίπτωση των διαλυτοτήτων κορεσμού, με εισαγωγή σε κάθε φιαλίδιο του φορέα που επιλέχθηκε (αιθανόλη/γλυκερίνη/νερό 60:15:25) και του επιταχυντή διαβητότητας σε ποσοστό καθοριζόμενο από τον επιλεγμένο πειραματικό σχεδιασμό. Αφού έγινε ανάδευση των συστατικών με μαγνητικό αναδευτήρα, στη συνέχεια έγινε εισαγωγή της δραστικής ουσίας σε ποσότητα που καθορίστηκε στο 90% της διαλυτότητας κορεσμού του κάθε 86

87 επιταχυντή. Το βήμα αυτό έγινε με σκοπό να περιοριστεί η δυνανότητα καθίζησης ιζήματος κατά την διάρκεια σχηματισμού της γέλης.αφού έγινε πλήρης διάλυση της δραστικής ουσίας με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα, έγινε εισαγωγή κατάλληλου ποσοστού υδροξυπροπυλοκυτταρίνης (Klucel HF), ο οποίος αποτέλεσε παράγοντα σχηματισμού των γελών. Ο παράγοντας αυτός εισήλθε σε ποσοστό 1,25% ο/ο σε κάθε φιαλίδιο. Κατόπιν ακολούθησε ανάδευση με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα και μετά ανάδευση σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα μέχρι τον ορατό σχηματισμό των γελών. Στο Πίνακα ΧΙ φαίνονται οι συνταγές των γελών και κάποια χαρακτηριστικά τους που παρατηρήθηκαν κατά την παρασκευή τους και με τη πάροδο 1 μηνός από τη παρασκευή τους: Αριθμός συνταγής Επιταχυντής Χρώμα γέλης 1 Χωρίς επιταχυντή Υποκίτρινο 2 Λαουροκαπράμη 5% Κίτρινο 3 Λαουροκαπράμη 10% Κίτρινο 4 Ν-μεθυλο-πυρρολιδόνη (ΝΜΡ) Κίτρινο 5% 5 Ν-μεθυλο-πυρρολιδόνη (ΝΜΡ) Κίτρινο 10% 6 Μινθόλη 5% Κίτρινο 7 Μινθόλη 10% Κίτρινο 8 Τερπινεόλη 5% Κίτρινο 9 Τερπινεόλη 10% Κίτρινο 10 Κινεόλη 5% Κίτρινο 11 Κινεόλη 10% Κίτρινο Πίνακας ΧΙ. Συνταγές και χαρακτηριστικά γελών. Μετά την πάροδο 1 μηνός και την παραμονή των γελών σε θερμοκρασία δωματίου (25º C) σε ερμητικά κλειστό ερμάριο για αποφυγή της επαφής τους με το φως του ηλίου και την υγρασία, δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή στο ορατό χρώμα της κάθε συνταγής. 87

88 VI.3.7. Ποσοτικός προσδιορισμός των γελών Μετά την παρασκευή των γελών έγινε ανάλυση με σκοπό να αποδειχθεί η πραγματική ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που περιείχε η κάθε συνταγή. Γι αυτό το σκοπό 250 μl από κάθε φιαλίδιο μεταφέρθηκαν με κατάλληλη πιπέτα σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και διαλύθηκαν με ακετονιτρίλιο HPLC βαθμού μέχρι την χαραγή.τα διαλύματα έμειναν υπό συνεχή ανάδευση με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα για 12 ώρες με σκοπό την καλύτερη εκχύλιση του φαρμάκου μέσα στο διαλύτη (ακετονοτρίλιο). Στη συνέχεια έγινε περαιτέρω αραίωση με μεταφορά 1 ml του προηγούμενου διαλύματος σε ογκομετρική φιάλη των 20 ml και διάλυση με κινητή φάση μέχρι την χαραγή (1:8000). Στη συνέχεια ακολούθησε ανάλυση των δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) με ταυτόχρονο σχηματισμό καμπύλης αναφοράς και προσδιορισμό της πραγματικής ποσότητας του φαρμάκου που υπήρχε σε κάθε φιαλίδιο. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση της πραγματικής τιμής με την θεωρητική εισερχόμενη ποσότητα του φαρμάκου. VI.3.8. Προσδιορισμός διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα του δέκτη (receptor solution) Πριν την αρχή του πειράματος διάχυσης, παρασκευάστηκε το διάλυμα του δέκτη με σκοπό τον προσδιορισμό της διαλυτότητας κορεσμού στο συγκεκριμένο διάλυμα. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκε διάλυμα δέκτη που περιείχε διάλυμα NaH 2 PO 4 X 2 H 2 O (η ποσότητα σε g των φωσφορικών που πρέπει να ζυγιστεί εξαρτάται κάθε φορά από το ΜΒ της ουσίας). Στη συνέχεια το ph του διαλύματος ρυθμίστηκε με διάλυμα NaOH 0.1 N μέχρι να φτάσει 7.4. Ακολούθως, προστέθηκε αζίδιο του νατρίου 0,02%. (Η συγκέντρωση αυτή σημαίνει ότι για κάθε 500 ml ρυθμιστικού διαλύματος προστίθενται 0,1 g αζιδίου του νατρίου). Παρόμοια και σε διαφορετική ογκομετρική φιάλη, παρασκευάστηκε το ίδιο διάλυμα με ταυτόχρονη εισαγωγή στο τέλος του παράγοντα Τween 40 με σκοπό τον προσδιορισμό της διαλυτότητας κορεσμού με την εισαγωγή ενός επιφανειοδραστικού παράγοντα για αύξηση της διαλυτότητας. Έτσι, σε κάθε φιαλίδιο προστέθηκαν 10 ml από το κάθε διάλυμα και μετά της πλήρης διαλυσεως του αζιδίου προστέθηκε το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης σε περίσσεια και με συνεχή ανάδευση. Για κάθε διάλυμα 88

89 παρασκευάστηκαν 3 φιαλίδια. Τα παρασκευάσματα εισήχθησαν σε κατάλληλο κλίβανο στους 37º C για 24 ώρες. Μετά το πέρας των 24 ωρών, έγινε φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις 8000 στροφές για 10 λεπτά το καθένα σε θερμοκρασία 25º C. Στη συνέχεια τα φυγοκεντρημένα δείγματα αναλύθηκαν με τη βοήθεια υγρής χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως (HPLC) και με την ανάπτυξη κατάλληλης καμπύλης αναφοράς σε μήκος κύματος 281 nm. VI.3.9. Πειράματα κυττάρων διάχυσης Τα πειράματα των κυττάρων διάχυσης πραγματοποιήθηκαν με την χρήση των κυττάρων Franz καθέτου τύπου όπως ήδη έχει αναφερθεί στην παράγραφο ΙΙΙ.8., με επιφάνεια διάχυσης 0,636 cm 2 και όγκο 6,275 ml. Η κατασκευή τους περιλαμβάνει την χρήση σκοτεινόχρωμης υάλου με σκοπό την προστασία φωτοευαίσθητων ουσιών αν και η βιβλιογραφία δεν παρέχει δεδομένα που να μαρτυρούν την ευαισθησία του άλατος της ριζατριπτάνης στο φως. 46,47,48,49 Τα κύτταρα Franz αποτελούνται από δυο διαμερίσματα, το διαμέρισμα του δότη και το διαμέρισμα του δέκτη. Ανάμεσα στα δυο διαμερίσματα υπάρχει η επιδερμίδα, ένας δακτύλιος από teflon, η προς εξέταση γέλη που περιέχει την δραστική ουσία και μια λεπτή μεμβράνη πολυαιθυλενίου CoTran 9720 (3M). Το σύστημα συγκρατείται στη θέση του με την βοήθεια μεταλλικού σφικτήρα (Τhomas scientific ). Το δέρμα που χρησιμοποιήθηκε προήλθε από το ίδιο ανατομικό μέρος από τον ίδιο δότη και φυλασσόταν στο ψυγείο στους C.O διαχωρισμός της επιδερμίδας από το χόριο έγινε με τη βοήθεια της θερμοκρασίας. (heat separation technique), όπως περιγράφηκε από τον Klingman. Πιο συγκεκριμένα το δέρμα απομακρύνθηκε από τον καταψύκτη μέχρι να πάρει θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στην συνέχεια εμβαπίστηκε σε υδατόλουτρο που περιείχε ύδωρ στους 60±1 0 C για ένα λεπτό.υπό αυτές τις συνθήκες (χαλαρώνουν) οι δεσμοί μεταξύ της επιδερμίδας και του χορίου και είναι ευκολότερος ο διαχωρισμός τους.έτσι η επιδερμίδα απομακρύνθηκε από το κυρίως δέρμα με την βοήθεια λαβίδων. Στην συνέχεια απλώθηκε σε φύλλο αλουμινίου και μέχρι να χρησιμοποιηθεί φυλάχθηκε στον καταψύκτη στους C. O δακτύλιος από Teflon χρησιμοποιήθηκε για να συγκρατηθεί η γέλη σταθερή στη θέση της δηλαδή στην επιφάνεια διάχυσης.το υλικό αυτό είναι σκληρό και αδρανές και επομένως κατάλληλο για το σκοπό που χρησιμοποιείται. 89

90 Στη συνέχεια «στήθηκαν» τα κύτταρα Franz. Αρχικά, στο κάθε κύτταρο δεν εσωκλείσθηκε ποσότητα γέλης αφού παράμειναν 24 ώρες στη συσκευή με σκοπό την παραμονή τους μέχρι το διάλυμα στο διαμέρισμα να έρθει στη σωστή θερμοκρασία. Για κάθε συνταγή πραγματοποιήθηκαν 5 κύτταρα Franz με σκοπό την μείωση της μεταβλητότητας του ερευνητή. Σε κάθε κύτταρο Franz μετά το πέρας των 24 ωρών τοποθετήθηκαν 100 μl από κάθε συνταγή και καλύφθηκαν με κατάλληλο μέγεθος μεμβράνης πολυαιθυλενίου CoTran H λεπτή μεμβράνη πολυαιθυλενίου χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να μην επιτραπεί η εξάτμιση των πτητικών συστατικών των γελών. Πιθανή απώλεια των πτητικών συστατικών των συνταγών στις συνθήκες του πειράματος, όπως θερμοκρασία 32±0,5 0 C, αλλά και η συνολική διάρκεια του (3 μέρες), θα είχε ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της σύστασης των γελών και θα οδηγούσε σε λάθος αποτελέσματα. Το διαμέρισμα δέκτης περιέχει το δ/μα δέκτη δηλαδή υδατικό δ/μα με αζίδιο του νατρίου 2% που διατηρείται στους 32±0,5 0 C προκειμένου να προσομοιωθεί η θερμοκρασία του σώματος σε in vivo συνθήκες. Ο έλεγχος θερμοκρασίας γίνεται με την χρήση υδατόλουτρου. Επιπλέον για να εξασφαλιστεί ομοιογενής κατανομή των μορίων του φαρμάκου στο διάλυμα δέκτη, χρησιμοποιούνται μαγνήτες (Fischer Scientific), οι οποίοι περιστρέφονται με την βοήθεια μαγνητικής πλάκας ανάδευσης. Τα δείγματα από κάθε κύτταρο διάχυσης λαμβάνονται σε προκαθορισμένα διαστήματα δηλαδή στις 6, 12, 24, 48 και 72 ώρες από την έναρξη του πειράματος. Κατά τη δειγματοληψία αφαιρείται όλο το περιεχόμενο του δ/ματος του δέκτη και στη συνέχεια αναπληρώνεται με το ίδιο δ/μα που διατηρείται στους 32±0,5 0 C (εξασφαλίζονται με αυτόν τον τρόπο η διατήρηση συνθηκών δεξαμενής). 90

91 ΚΕΦΑΛΑΙΟ VIΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ VIΙ..1. Αποτελέσματα λήψης φάσματος υπεριώδους Τα αποτελέσματα του φάσματος υπεριώδους για το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης φαίνονται στο Σχήμα 21: Σχήμα 21.Φάσμα υπεριώδους για το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης. Στο Σχήμα 21 μπορούμε να διαπιστώσουμε ότι η μέγιστη απορρόφηση του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης είναι στα 281 nm, γεγονός που συμφωνεί με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας ότι το φάρμακο απορροφά στα 281 nm. Αντίθετα, δεν υπάρχει καμία ένδειξη για απορρόφηση του άλατος στα 225 nm όπως η βιβλιογραφία 91

92 μαρτυρά. 60 Η χαμηλότερη απορρόφηση και σε αρνητικό αριθμό συμβαίνει σε περιοχή μήκους κύματος που δεν ξεπερνά τα 400 nm ( nm). VIΙ.2. Αποτελέσματα πειραμάτων καταλληλότητας του φορέα Τα παραπάνω πειράματα καταλληλότητας έδωσαν τα εξής αποτελέσματα: 1. Φορέας και λαουροκαπράμη Πλήρης διάλυση 2. Φορέας και Ν-μέθυλο πυρρολιδόνη Πλήρης διάλυση 3. Φορέας και τερπινεόλη Πλήρης διάλυση 4. Φορέας και λιμονένιο Λευκό μη διαυγές διάλυμα 5. Φορέας και μινθόλη Πλήρης διάλυση 6. Φορέας και κινεόλη Πλήρης διάλυση Τα αποτελέσματα έδειξαν μη συμβατότητα του λιμονένιου με τον φορέα, γεγονός που υπήρξε αποτρεπτικό για την χρησιμοποίησή του σαν επιταχυντή διαβητότητας. Για τους υπόλοιπους επιταχυντές δεν υπήρξε πρόβλημα διάλυσης γι αυτό και χρησιμοποιήθηκαν κανονικά στον πειραματικό σχεδιασμό και στη δημιουργία στη συνέχεια των γελών του φαρμάκου. VIΙ.3. Αποτελέσματα του προσδιορισμού της διαλυτότητας κορεσμού Οι αραιώσεις μετά την φυγοκέντρηση για τα φιαλίδια που δεν περιείχαν περίσσεια φαρμάκου έγιναν παίρνοντας 500 μl από το φυγοκεντρημένο διάλυμα σε 100 ml κινητής φάσης. Στη συνέχεια 2 ml από το παραπάνω διάλυμα αραιώνονταν περαιτέρω σε 20 ml κινητής φάσης σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη μέχρι την χαραγή (αραίωση 1:2.000). Για τα φιαλίδια που περιείχαν επιταχυντή διαβητότητας σε ποσοστό 10% ο/ο έγινε αραίωση 1:8000 (500 μl στα 20 ml κινητής φάσης και στη συνέχεια 0.5 μl στα 20 ml). Τέλος, για τα φιαλίδια με επιταχυντή διαβητότητας σε ποσοστό 5% ο/ο η αραίωση έγινε 1:10000 (500 μl στα 100 ml και στη συνέχεια 0.5 ml στα 25 ml κινητής φάσης. Για κάθε περίπτωση έγιναν 3 μετρήσεις για μείωση του σφάλματος. Η ανάλυση των τελικών δειγμάτων έγινε με υγρή χρωματογραφία 92

93 υψηλής αποδόσεως (HPLC) και παράλληλα διενεργήθηκε και καμπύλη αναφοράς από το ήδη υπάρχων μητρικό διάλυμα της ουσίας. Από την καμπύλη αναφοράς στη συνέχεια υπολογίσθηκε η διαλυτότητα κορεσμού τόσο στα φιαλίδια χωρίς επιταχυντή όσο και στα φιαλίδια με ποσοστό επιταχυντή 5 ή 10%. Ο Πίνακας ΧΙI δείχνει τα αποτελέσματα των διαλυτοτήτων κορεσμού. Επιταχυντής Διαλυτότητα κορεσμού (mg/ml) RSD % 1.Χωρίς επιταχυντή ± Azone 5% ± NMP 5% ± Τερπινεόλη 5% ± Μινθόλη 5% ± Κινεόλη 5% ± Αzone 10% ± NMP 10% ± Τερπινεόλη 10% 92.69± Μινθόλη 10% ± Κινεόλη 10% ± Πίνακας ΧΙI. Αποτελέσματα διαλυτοτήτων κορεσμού για τον κάθε επιταχυντή. Στο παρακάτω Σχήμα 22 φαίνονται με την σειρά του Πίνακα ΧΙI τα ποσοστά της διαλυτότητας κορεσμού για τον κάθε επιταχυντή: 93

94 Διαλυτότητα κορεσμού (mg/ml) Επιταχυντές διαβητότητας Σχήμα 22. Διάγραμματική παράσταση των διαλυτοτήτων κορεσμού. Από την διαγραμματική παράσταση των διαλυτοτήτων κορεσμού διαπιστώνεται ότι η διαλυτότητα κορεσμού στις συνταγές με επιταχυντή αυξάνεται δραστικά με εξαίρεση την συνταγή Νο 3, που περιέχει ΝΜΡ 5%, όπου δεν υπάρχει μεγάλη διαφορά από την διαλυτότητα κορεσμού της συνταγής χωρίς τη παρουσία επιταχυντή. Διαπιστώνεται επίσης μια αυξανόμενη διαλυτότητα κορεσμού στις συνταγές που περιέχουν τερπένια σαν επιταχυντές σε επίπεδο συγκέντρωσης επιταχυντή 5% (τερπινεόλη 5%>κινεόλη 5%> μινθόλη 5%). Η διαλυτότητα αυτή είναι χαμηλότερη για το επίπεδο συγκέντρωσης 10%. Επίσης είναι σημαντικό να αναφερθεί, ότι την μεγαλύτερη αύξηση στη διαλυτότητα κορεσμού κατέχει η τερπινεόλη 5%, ακολουθεί η κινεόλη στο 5% και η μινθόλη στο 5%. Η λαουροκαπράμη δείχνει να αυξάνει την διαλυτότητα κορεσμού σε σχέση με την διαλυτότητα κορεσμού της συνταγής χωρίς επιταχυντή (παρόμοια και στο 5% και 10%) αλλά όχι στο ποσοστό των τερπενίων. Για την καθεμία συνταγή διενεργήθηκε t-test (στατιστική ανάλυση σε επίπεδο σημαντικότητας 95%) σε σχέση με την συνταγή χωρίς επιταχυντή και διαπιστώθηκε ότι είναι στατιστικά σημαντικές εκτός από την συνταγή που περιείχε ΝΜΡ 5%. Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης φαίνονται στον πίνακα ΧΙΙI. 94

95 t-test σε επίπεδο σημαντικότητας 95% Χωρίς επιταχυντή vs λαουροκαπράμη 5% Χωρίς επιταχυντή vs ΝΜΡ 5% Χωρίς επιταχυντή vs τερπινεόλη 5% Χωρίς επιταχυντή vs μινθόλη 5% Χωρίς επιταχυντή vs κινεόλη 5% Χωρίς επιταχυντή vs λαουροκαπράμη 10% Χωρίς επιταχυντή vs ΝΜΡ 10% Χωρίς επιταχυντή vs τερπινεόλη 10% Χωρίς επιταχυντή vs μινθόλη 10% Χωρίς επιταχυντή vs κινεόλη 5% P value P<0.05 Ρ>0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 Πίνακας ΧΙΙI. T-test σε επίπεδο σημαντικότητας 95% για την διαλυτότητα κορεσμού. VIΙ.4. Αποτελέσματα και αναλυτικές συνταγές των γελών Οι συνταγές που παρασκευάστηκαν και τα ποσοστά τους φαίνονται αναλυτικά στον Πίνακα ΧΙV: Συνταγή Φορέας (αιθανόλη/γλυκερί νη/νερό) σε % ποσοστό Ποσότητα ουσίας (%) θεωρητική τιμή σε mg/ml Ποσότητα της ουσίας σε g Ποσοστό υδροξυπροπυλοκυτταρίνης (Klucel HF) Ποσότητα υδροξυπροπυλοκυτταρίνης σε g 1 60:15: :15: :15: :15: :15:

96 6 60:15: :15: :15: :15: :15: :15: Πίνακας ΧΙV. Συνταγές σχηματιζόμενων γελών για το βενζοϊκό άλας της ριζατριπτάνης. Οι παραπάνω επιταχυντές στις συνταγές και τα ποσοστά τους αναφέρονται με την ίδια σειρά στον Πίνακα ΧΙ. VIΙ.5. Αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού των γελών Τα αποτελέσματα που έδωσε ο ποσοτικός προσδιορισμός στην κάθε γέλη φαίνοντα στον Πίνακα ΧV: Συνταγή γέλης % πραγματική ποσότητα του φαρμάκου σε σχέση με την θεωρητική RSD % Πίνακας ΧV. Αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού των γελών. 96

97 % περιεκτικότητα Στο Σχήμα 23 φαίνονται οι συνταγές των γελών όπως είναι κατανεμημένες στον Πίνακα ΧV και το ποσοστό περιεκτικότητας σε άλας της ριζατριπτάνης Συνταγές γελών Σχήμα 23. Ποσοτικός προσδιορισμός των γελών της ριζατριπτάνης με την σειρά που παρουσιάζονται στον Πίνακα ΧΙV. Από το Σχήμα 23 και από τον Πίνακα ΧV οι περισσότερες από τις τιμές είναι μέσα στα όρια που θέτει η φαρμακοποιία ( %), αλλά υπάρχουν και τιμές όπως στις συνταγές 10, 11, που περιέχουν τον επιταχυντή κινεόλη σε ποσοστό 5 και 10 % αντίστοιχα, οι οποίες απέχουν από τα όρια της φαρμακοποιίας, έστω και σε μικρό ποσοστό (5%). Άρα συμπεραίνεται ότι σχεδόν όλες οι τιμές είναι κατάλληλες να χρησιμοποιηθούν σε πείραμα κυττάρων διάχυσης (ισχύει και για τις συνταγές της κινεόλης με τον φόβο πιθανής καθίζησης ιζήματος). VIΙ.6. Αποτελέσματα της διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα του δέκτη (receptor solution) Στον Πίνακα ΧVI φαίνονται τα αποτελέσματα και για τα δυο διαλύματα δέκτη της διαλυτότητας κορεσμού: 97

98 Διάλυμα δέκτη Διαλυτότητα κορεσμού σε mg/ml ± SD RSD % ± (με Τween 40) ± Πίνακας ΧVI. Αποτελέσματα διαλυτότητας κορεσμού για το διάλυμα του δέκτη (receptor solution). Σύμφωμα με τα αποτελέσματα του Πίνακα XVI, η διαλυτότητα κορεσμού της ριζατριπτάνης είναι ελάχιστα υψηλότερη στο διάλυμα χωρίς την προσθήκη του επιφανειοδραστικού παράγοντα, γεγονός λογικό δεδομένης της ευδιαλυτότητας του φαρμάκου στο νερό (42 mg/ml). Για αυτό το λόγο αποφασίστηκε η χρησιμοποίηση του διαλύματος στα πειράματα των κυττάρων διάχυσης χωρίς την προσθήκη του επιφανειοδραστικού παράγοντα. VΙΙ.7. Αποτελέσματα πειραμάτων κυττάρων διάχυσης Όπως έχει ήδη προαναφερθεί χρησιμοποήθηκε πειραματικός σχεδιασμός (ασσύμετρος παραγοντικός σχεδιασμός) με την παρουσία 2 παραγόντων, «είδος του επιταχυντή διαβητότητας» και «συγκέντρωση του επιταχυντή διαβητότητας». Ο πρώτος παράγοντας, «είδος επιταχυντή», μελετήθηκε σε 5 επίπεδα (λαουροκαπράμη, Ν-μεθυλο-πυρρολιδόνη, κινεόλη, μινθόλη, τερπινεόλη) και ο δεύτερος παράγοντας, «συγκέντρωση επιταχυντή», σε 3 επίπεδα (0%, 5%, 10%). Η εξαρτημένη μεταβλητή που μετρήθηκε κατά την διάρκεια του πειράματος ήταν η ποσότητα του βενζοϊκού άλατος της ριζατριπτάνης Q (μg/cm 2 ) ) που διαπερνούσε την επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας στις 24, 48 και 72 h από την έναρξη του πειράματος. Ο αριθμός των πειραμάτων που απαιτούνταν, προέκυψε από όλους τους δυνατούς συνδυασμούς όλων των επιπέδων όλων των παραγόντων. Χρησιμοποιήθηκαν πέντε κύτταρα για κάθε συνταγή. Στον Πίνακα ΧVII φαίνονται όλα τα αποτελέσματα από την ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που διαπερνούσε την επιδερμίδα στις 24, 48, 72 h. Στα Σχήματα 24 και 25 παριστάνεται γραφικά η αθροιστική ποσότητα τoυ άλατος της ριζατριπτάνης 98

99 (Q) που διαπερνούσε την επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας (μg/cm 2 ) σε συνάρτηση με τον χρόνο. Είδος % 24 ώρες 48 ώρες 72 ώρες Κωδικός συνταγής επιταχυντή διαβατότητας αναλογία επιταχυντή διαβατότητ ας Q (μg/cm 2 ) ±τυπική απόκλιση Q (μg/cm 2 ) ±τυπική απόκλιση Q (μg/cm 2 ) ±τυπική απόκλιση 1 Χωρίς επιταχυντή 0% 36,18±4,72 92,97±11,37 114,15±24,3 5 2 Λαουροκαπρά μη 5% 998,90±218, ,34±207, ,77±204,53 3 Λαουροκαπρά μη 10% 95,12±17,30 360,61±76,88 507,69±104, 94 4 Ν-μεθυλοπυρρολιδόνη 5% 22,46±1,68 45,28±7,09 54,21±6,39 (ΝΜΡ) 5 Ν-μεθυλοπυρρολιδόνη (ΝΜΡ) 10% 29,48±4,05 56,98±3,83 62,88±3,89 6 Μινθόλη 5% 174,96±33,61 583,55±90,18 695,05±131, 09 99

100 7 Μινθόλη 10% 454,26±78, ,42±117, ,32±205,66 8 Τερπινεόλη 5% 340,04±68,86 994,36±156, ,56±131,28 9 Τερπινεόλη 10% 431,27±64,87 914,29±93, ,70±141,44 10 Κινεόλη 5% 16,96±2,90 62,34±9,66 72,26±9,99 11 Κινεόλη 10% 180,81±28,27 436,24±54,80 624,61±106, 75 Πίνακας ΧVII. Αθροιστική ποσότητα άλατος της ριζατριπτάνης ανά μονάδα επιφάνειας Q (μg/cm 2 ) που διαπέρασε την ανθρώπινη επιδερμίδα στις 24,48 και 72 h από την έναρξη του πειράματος. 100

101 Permeability (μg/cm2) Time (hr) 80 NMP 5% Terpineole 5% Terpineole 10% Azone 5% Cineole 10% Menthol 10% No enhancer Azone 10% Menthol 5% NMP 10% Cineole 5% Σχήμα 24. Αθροιστική ποσότητα άλατος της ριζατριπτάνης Q (μg/cm 2 ) που διαπέρασε το δέρμα σε συνάρτηση με το χρόνο. 101

102 Q(μg/cm²) h 48 h 72 h Είδος επιταχυντή Σχήμα 25: Αθροιστική ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που διαπέρασε την ανθρώπινη επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας Q (μg/cm 2 ) στις 24,48 και 72 h από την έναρξη του πειράματος. 102

103 Είδος επιταχυντή Από τον Πίνακα ΧVII και το Σχήμα 25 της διαγραμματικής παράστασης της ριζατριπτάνης φαίνεται ότι ο επιταχυντής λαουροκαπράμη έχει επίδραση στην επιτάχυνση του άλατος από το δέρμα, κυρίως σε ποσοστό 5%. Ειδικότερα, η επιτάχυνση με τον παραπάνω επιταχυντή σε ποσοστό 5% δείχνει να έχει το καλύτερο αποτέλεσμα σε σχέση με τους υπόλοιπους επιταχυντές στις 24 και 48 ώρες. Αντίθετα στις 72 ώρες η λαουροκαπράμη δείχνει να έχει παρόμοιο ρυθμό αποδέσμευσης από το δέρμα με τους επιταχυντές τερπινεόλη σε ποσοστό 10% και μινθόλη σε ποσοστό 10%. Στο Σχήμα 26 φαίνεται η αθροιστική ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που διαπέρασε την ανθρώπινη επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας Q (μg/cm 2 ) τις πρώτες 24 ώρες ,00 200,00 400,00 600,00 800, , ,00 Q (μg/cm²) 24 ώρες Σχήμα 26. Αθροιστική ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που διαπέρασε την ανθρώπινη επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας Q (μg/cm 2 ) σε 24 ώρες. Από το παραπάνω διάγραμμα γίνεται καταννοητό πως η λαουροκαπράμη σε ποσοστό 5% (συνταγή Νο 2) ήταν ο επιταχυντής που έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα σε ποσοστό επιτάχυνσης σε σχέση με την γέλη αναφοράς (συνταγή Νο 1). Ακολούθησαν οι συνταγές Νο 10 και 11 και Νο 4 περιέχοντας μινθόλη και τερπινεόλη σε ποσοστό 10% και 5% σε σχέση πάντα με την γέλη αναφοράς. Στην συνέχεια ακολούθησαν οι συνταγές που περιέχουν κινεόλη 10% και μινθόλη 5% που δεν έχουν στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Αντίθετα, διαφαίνεται ότι κανένα θετικό αποτέλεσμα στην επιτάχυνση δεν επιφέρει ο επιταχυντής Ν-μεθυλο- 103

104 Είδος επιταχυντή πυρρολιδόνη (ΝΜΡ) σε ποσοστό 5 κα 10%. Η συνολική σειρά της διαβάθμισης σε ποσότητα επιτάχυνσης τις πρώτες 24 ώρες φαίνεται παρακάτω: Azone 5% > Μινθόλη 10% =Τερπινεόλη 10% =Τερπινεόλη 5% > Κινεόλη 10% =Μινθόλη 5% >Azone 10% > Χωρίς επιταχυντή > ΝΜΡ 10% > ΝΜΡ 5% > Κινεόλη 5% Στη συνέχεια ακολουθεί διαγραμματική παράσταση (Σχήμα 27) της αθροιστικής ποσότητας που διαπέρασε το δέρμα σε 48 ώρες Q(μg/cm²) 48 ώρες Σχήμα 27. Αθροιστική ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που διαπέρασε την ανθρώπινη επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας Q (μg/cm 2 ) σε 48 ώρες. Στο σχήμα 27 φαίνεται ότι η συνολική εικόνα της ποσότητας που διαπέρασε το δέρμα δεν άλλαξε με τον επιταχυντή λαουροκαπράμη (Azone ) σε ποσοστό 5% (Συνταγή Νο 2) να αυξάνει την επιτάχυνση σημαντικά σε σχέση με τους υπόλοιπους επιταχυντές. Έτσι, μετά την λαουροκαπράμη ακολούθησε η συνταγή με μινθόλη 10% μαζί με την τερπινεόλη 5%(συνταγή Νο 4) και την τερπινεόλη 10% (συνταγή Νο 9). Στη συνέχεια ακολούθησαν οι συνταγές κινεόλη 10% μαζί με την μινθόλη 10% χωρίς στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Ακολούθως αύξηση της ποσότητας της ριζατριπτάνης από το δέρμα, αλλά όχι στον ίδιο βαθμό με τις παραπάνω συνταγές, έδειξε και η συνταγή με τον επιταχυντή λαουροκαπράμη 10%. Καθόλου επιτάχυνση δεν παρατηρήθηκε στις 48 ώρες για τον επιταχυντή ΝΜΡ σε ποσοστό 5 και 10% και 104

105 Είδος επιταχιντή για την κινεόλη 5% (συνταγές Νο 3 και 8 αντίστοιχα). Η σειρά διαβάθμισης για τους επιταχυντές σε σχέση με την γέλη αναφοράς για τις 48 ώρες αναφέρεται παρακάτω: Azone 5% > Μινθόλη 10% =Τερπινεόλη 5% =Τερπινεόλη 10% > Κινεόλη 10% =Μινθόλη 5% >Azone 10% > Χωρίς επιταχυντή > Κινεόλη 5% >ΝΜΡ 10% > ΝΜΡ 5% Στη συνέχεια ακολουθεί διαγραμματική παράσταση (Σχήμα 28) της αθροιστικής ποσότητας που διαπέρασε το δέρμα σε 72 ώρες Q (μg/cm²) σε 72 ώρες Σχήμα 28. Αθροιστική ποσότητα του άλατος της ριζατριπτάνης που διαπέρασε την ανθρώπινη επιδερμίδα ανά μονάδα επιφανείας Q (μg/cm 2 ) σε 72 ώρες. Από το παραπάνω διάγραμμα μπορεί κανείς να παρατηρήσει ότι μετά το πέρας των 72 ωρών του πειράματος ο επιταχυντής Αzone (Συνταγή Νο 2) εμφανίζει αυτή τη φορά παρόμοια επιτάχυνση στην ποσότητα της ριζατριπτάνης με τον επιταχυντή μινθόλη 10%. Όμοια με τις 48 ώρες η ποσότητα της συνταγής Νο 4 (τερπινεόλη 5%) δεν εμφανίζει «μεγαλύτερο» αποτέλεσμα στην επιτάχυνση της ποσότητας της ριζατριπτάνης σε σχέση με την συνταγή της τερπινεόλης 10% (μη στατιστικά σημαντικές). Το ίδιο συμβαίνει και με τις συνταγές της κινεόλης 10% και μινθόλης 5% που ακολουθούν και δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Οι συνταγές Νο 3 και 8 που περιέχουν ΝΜΡ 5 και 10% αντίστοιχα συνεχίζουν να μην εμφανίζουν κανένα αποτέλεσμα στην επιτάχυνση της διαπερατότητας από το δέρμα σε σχέση με την συνταγή που δεν περιέχει καθόλου επιταχυντή (Συνταγή Νο 1). Το 105

106 ίδιο συμβαίνει και για την συνταγή της κινεόλης 5% (Συνταγή No 6) η οποία δείχνει να επιβραδύνει παρά να επιταχύνει την ποσότητα της ριζατριπτάνης που διαπερνά το δέρμα. Η σειρά διαβάθμισης για τους επιταχυντές σε σχέση με την γέλη αναφοράς για τις 72 ώρες αναφέρεται παρακάτω: Azone 5%= Μινθόλη 10% =Τερπινεόλη 10% =Τερπινεόλη 5% > Μινθόλη 5% = Κινεόλη 10% > Azone 10% > Χωρίς επιταχυντή > Κινεόλη 5% >ΝΜΡ 10% > ΝΜΡ 5% VIΙ.8. Διερευνητική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (Exploratory Data Analysis) H στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, καθώς και η χρήση κατάλληλων διαγραμμάτων ή γραφημάτων μας δίνει χρήσιμες πληροφορίες. Για αυτό το λόγο κατασκευάστηκαν θηκογράμματα χρησιμοποιώντας τις τιμές Q για κάθε κύτταρο (Box-Whisker plot diagramms). Το θηκόγραμμα είναι μια γραφική παράσταση που παριστάνει την κατανομή των δεδομένων και συγκεκριμένα αναπαριστά τη διάμεσο, τα τεταρτημόρια και την μέγιστη και ελάχιστη παρατήρηση του δείγματος. Το πρώτο, δεύτερο και τρίτο τεταρτημόριο αντιστοιχούν στο 25, 50 και 75% των παρατηρήσεων αντίστοιχα. Το δεύτερο τεταρτημόριο ταυτίζεται με τη διάμεσο τιμή και απεικονίζεται με μια γραμμή στο μέσο του θηκογράμματος, ενώ τo πρώτο και τρίτο τεταρτημόριο αντιστοιχούν στα άκρα του ορθογωνίου. Η διαφορά μεταξύ πρώτου και τρίτου τεταρτημόριου καλείται ενδοτεταρτημοριακό εύρος. 61 Τα διαγράμματα φαίνονται στα Σχήματα 29,30,31 για τις 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα. Τα θηκογράμματα κατασκευάστηκαν με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος PASW Statistics 18 (IBM, Αγγλία). 106

107 Σχήμα 29. Θηκόγραμμα για την ποσότητα που διαπέρασε το δέρμα Q στις 24 ώρες σε συνάρτηση με το είδος του επιταχυντή. Σχήμα 30. Θηκόγραμμα για την ποσότητα που διαπέρασε το δέρμα Q στις 48 ώρες σε συνάρτηση με το είδος του επιταχυντή. 107

108 Σχήμα 31. Θηκόγραμμα για την ποσότητα που διαπέρασε το δέρμα Q στις 72 ώρες σε συνάρτηση με το είδος του επιταχυντή. Τα θηκογράμματα κατασκευάστηκαν προκειμένου να εκτιμηθεί η θέση (location) και η διασπορά (variation) των τιμών. Πιο συγκεκριμένα από τα θηκογράμματα 1-3, για τις τιμές των 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα, φάνηκε ότι ο παράγοντας «είδος του επιταχυντή διαβατότητας» επηρέαζε τη διαπέραση από το δέρμα του άλατος της ριζατριπτάνης. Η μεγαλύτερη επιτάχυνση και αύξηση στις τιμές της διαπερατότητας παρατηρήθηκε με την συνταγή με επιταχυντή τη λαουροκαπράμη σε επίπεδο 5% και στις 24, 48 και 72 ώρες. Παρόμοιο αποτέλεσμα διαπερατότητας με την λαουροκαπράμη έδειξε στις 72 ώρες και η συνταγή με μινθόλη σε ποσοστό 10%. Μεγάλη διασπορά τιμών εκτός από την συνταγή της λαουροκαπράμης 5% έδειξαν και οι συνταγές της μινθόλης 10% και τερπινεόλης 10% με την εμφάνιση και κάποιων ακραίων τιμών στις δυο παραπάνω συνταγές. Κανένα αποτέλεσμα στην επιτάχυνση δεν έδειξαν οι συνταγές με ΝΜΡ 5 και 10% και η κινεόλη 5%. Στη συνέχεια ακολουθεί ο πίνακας ΧΙΙΙ με τον υπολογισμό των τιμών της ποσότητας διαπέρασης από το δέρμα Q(μg/cm²) στα τρία επιμέρους 24ωρα της διεξαγωγής του πειράματος των κυττάρων διάχυσης. 108