ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΜΙΡΤΑΖΑΠΙΝΗΣ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΤΗΣ ΕΠΙΔΕΡΜΙΔΑΣ ΔΗΜΗΤΡΑ ΤΣΕΡΚΑΚΗ - ΧΗΜΙΚΟΣ

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή 1 Ιστορική αναδρομή 1 Επιθυμητά χαρακτηριστικά διαδερμικών συστημάτων 3 Σχεδιασμός διαδερμικών συστημάτων 3 - Εξωτερική μεμβράνη 5 - Μεμβράνη στήριξης 6 - Διαπερατή μεμβράνη 6 - Πιεσο-ευαίσθητα συγκολλητικά 7 Δομή και λειτουργία του δέρματος 8 - Eπιδερμίδα 9 - Βασική στιβάδα 10 - Ακανθώδης στιβάδα 11 - Κοκκιώδης στιβάδα 11 - Διαυγής στιβάδα 12 - Κεράτινη στιβάδα 12 - Κυρίως δέρμα 14 - Υποδόριος ιστός 14 - Εξαρτήματα του δέρματος 15 Διαδερμική απορρόφηση 15 - Παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδερμική απορρόφηση ουσιών 15 - Βιολογικοί παράγοντες 16 - Φυσικοχημικοί παράγοντες 16 Διάχυση διαμέσου του δέρματος 16 Τρόποι αύξησης της διαδερμικής διαπερατότητας 20 - Ηλεκτροδιάτριση 20 - Ιοντοφόρεση 21 - Χρήση θερμοκρασίας 21 - Υπέρηχοι 22 - Μαγνητικό πεδίο 22 - Ραδιοσυχνότητες 22

3 - Ακτινοβολία laser 22 - Συσκευή μικροβελόνων 23 - Μεταβολή ιδιοτήτων κεράτινης στιβάδας 23 Μηχανισμοί δράσης επιταχυντών διαπερατότητας 24 Τεχνικές μέτρησης διαδερμικής διαπερατότητας 25 - Κύτταρα διάχυσης 25 - Τεχνική μικροδιάλυσης 28 - Τεχνική tape stripping 30 - Άλλες τεχνικές 31 - Φασματοσκοπικές τεχνικές 31 - Μοντέλο Saarbruecken 32 - Μέτρηση στο πλάσμα 33 Κριτήρια επιλογής υποψήφιων φαρμάκων 33 Πειραματικός σχεδιασμός 35 Μιρταζαπίνη 38 - Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά 38 - Φαρμακοδυναμικά χαρακτηριστικά 38 - Φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά 39 Σκοπός της μελέτης 40 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά 41 Συσκευές όργανα 42 Μέθοδοι 43 - Πειραματικός σχεδιασμός 43 - Φάσμα απορρόφησης υπεριώδους 44 - Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης 44 - Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων 45 - Πειράματα προσδιορισμού συμβατότητας των επιταχυντών διαπερατότητας με το φορέα 45 - Προσδιορισμός της διαλυτότητας κορεσμού 45 - Παρασκευή γελών 46 - Ποσοτικός προσδιορισμός γελών 47

4 - Προσδιορισμός διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα του δέκτη 47 - Πειράματα κυττάρων διάχυσης 47 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - Φάσμα υπεριώδους ορατού 49 - Αποτελέσματα πειραμάτων συμβατότητας 49 - Αποτελέσματα διαλυτότητας κορεσμού 50 - Αποτελέσματα παρασκευής γελών 52 - Αποτελέσματα ποσοτικοποίησης των γελών 53 - Αποτελέσματα διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα δέκτη 53 - Αποτελέσματα πειραμάτων διαπερατότητας 54 - Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων 61 - Ανάλυση της επίδρασης των επιταχυντών διαβατότητας στη διαδερμική διαπέραση της μιρταζαπίνης 65 - Υπολογισμός του επιθυμητού ρυθμού διαδερμικής διαπερατότητας (ΕΡΔΔ) 71 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 73 Περίληψη εργασίας στα ελληνικά 74 Περίληψη εργασίας στα αγγλικά 75 Παράρτημα 76 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 81

5 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι άνθρωποι εδώ και χιλιάδες χρόνια χρησιμοποιούν ουσίες τις οποίες εφαρμόζουν στο δέρμα τους και έχουν θεραπευτική δράση. Στη σύγχρονη εποχή μια πληθώρα σκευασμάτων είναι διαθέσιμα ώστε να αντιμετωπίσουν και να θεραπεύσουν τοπικά συμπτώματα. Τις τελευταίες δεκαετίες, η έρευνα για την επίτευξη συστηματικής δράσης των φαρμάκων, έχει επικεντρωθεί σε εναλλακτικές οδούς χορήγησης, που εμφανίζουν πλεονεκτήματα σε σχέση με τις συμβατικές οδούς, όπως είναι η από του στόματος και η ενδοφλέβια χορήγηση. Η διαδερμική χορήγηση φαρμάκων έχει αποδεχθεί ως μια τεχνολογία που προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλες μεθόδους χορήγησης φαρμάκων. Η χορήγηση του φαρμάκου γίνεται διαμέσου της κεράτινης στιβάδας και αυτό επιφέρει τα εξής πλεονεκτήματα : Συμμόρφωση του ασθενούς ειδικότερα σε περιπτώσεις όπου ο ασθενής αρνείται ή δεν μπορεί να καταπιεί Αποφυγή του φαινομένου πρώτης διόδου από το συκώτι με αποτέλεσμα να χορηγούνται μικρότερες δόσεις του φαρμάκου Μεγαλύτερη ευελιξία στον τρόπο χορήγησης Αποτελεί μία μη επεμβατική μέθοδο καθώς δεν χρησιμοποιούνται βελόνες, όπως συμβαίνει στην ενδοφλέβια ή υποδόρια χορήγηση μειώνοντας έτσι τον κίνδυνο μετάδοσης ασθενειών ειδικότερα σε αναπτυσσόμενες χώρες Τα θεραπευτικά επίπεδα στο αίμα παραμένουν εντός των θεραπευτικών ορίων λόγω της ελεγχόμενης αποδέσμευσης με αποτέλεσμα να μειώνεται η συχνότητα χορήγησης και να αυξάνεται η δράση του φαρμάκου Η απελευθέρωση του φαρμάκου σταματάει με την απομάκρυνση του διαδερμικού συστήματος 1,2,3. Η παγκόσμια αγορά διαδερμικών συστημάτων αναμένεται να φτάσει τα 31.5 δισεκατομμύρια δολάρια το ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Το πρώτο σύστημα διαδερμική χορήγησης για την αντιμετώπισης της ναυτίας με δραστική ουσία την σκοπολαμίνη εγκρίθηκε και κυκλοφόρησε στις Η.Π.Α. το Δέκα χρόνια αργότερα, τα διαδερμικά συστήματα χορήγησης της νικοτίνης αποδείχτηκαν τα πρώτα που έλαβαν την ευρύτερη αποδοχή του πληθυσμού. Σήμερα κυκλοφορούν 19 συστήματα διαδερμικής χορήγησης για φάρμακα όπως η οιστραδιόλη, λιδοκαίνη, σκοπολαμίνη, νιτρογλυκερίνη, κλονιδίνη, τεστοστερόνη, φαιντανύλη, νικοτίνη και συνδυασμοί φαρμάκων όπως η νορεθρινδόνη (σε συνδυασμό με οιστραδιόλη), λεβονοργεστρέλη (σε συνδυασμό με οιστραδιόλη).

6 Μεταξύ του ένα νέο σύστημα διαδερμικής χορήγησης εγκρινόταν κατά μέσο όρο κάθε 2,2 χρόνια. Υπολογίζεται ότι πάνω από ένα δισεκατομμύριο διαδερμικά συστήματα παρασκευάζονται κάθε χρόνο 2. Η αγορά διαδερμικών συστημάτων εισέρχεται σε νέα πεδία και απευθύνεται πλέον και στην αντιμετώπιση ασθενειών όπως η κατάθλιψη και η συμπτωματολογία Διάσπασης Ελλειματικής Προσοχής Υπερκινητικότητα (ΔΕΠ-Υ) 3. Σχήμα 1. Συνολικός αριθμός διαδερμικών φάρμακων που έχουν εγκριθεί από τον FDA, από το Σήμερα υπάρχουν 19 φάρμακα και συνδυασμοί φαρμάκων που χορηγούνται με διάφορες μεθόδους και έχουν εγκριθεί στις Ηνωμένες Πολιτείες. Τα δεδομένα ελήφθησαν από τον FDA Πορτοκαλί Βιβλίο63. Με την πάροδο των χρόνων και την εξέλιξη της τεχνολογίας τα διαδερμικά συστήματα κατηγοριοποιήθηκαν σε τρεις κατηγορίες γενιές. Πιο αναλυτικά : Τα συστήματα πρώτης γενιάς, πολλά από τα οποία παράγονται σήμερα, όπου η δραστική ουσία διαπερνά το δέρμα σε θεραπευτικά επίπεδα υπό τη μορφή γέλης. Τα συστήματα δεύτερης γενιάς, όπου απαιτείται επιτάχυνση στην ικανότητα των μορίων να διαπερνούν το δέρμα με αποτέλεσμα να διευρύνονται τα όρια στην επιλογή φαρμάκων κατάλληλα για διαδερμική χορήγηση. Τα συστήματα τρίτης γενιάς, τα οποία βρίσκονται σε ερευνητικό στάδιο, γίνεται χορήγηση μακρομορίων (π.χ. πρωτεΐνες, DNA) καθώς προκαλείται μεγαλύτερη διαταραχή της κεράτινης στιβάδας με καλύτερη διαδερμική απορρόφηση χωρίς να προκαλείται ζημιά στο βαθύτερο ιστό 2.

7 ΕΠΙΘΥΜΗΤΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΔΕΡΜΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ Τα ιδανικά χαρακτηριστικά που πρέπει να διαθέτει το τελικό προϊόν διαδερμικής χορήγησης φαρμάκου είναι τα εξής 4 : Χρόνος ζωής μέχρι 2 χρόνια Κατάλληλο μέγεθος (μικρότερο από 40 cm 2 ) Κατάλληλη συχνότητα χορήγησης (μία φορά την ημέρα μία φορά την εβδομάδα) Αισθητικά αποδεχτό (καθαρό, ωραίο χρώμα) Απλή συσκευασία (απλό περιτύλιγμα και απλά στάδια για την εφαρμογή του συστήματος από τον ασθενή) Εύκολη απομάκρυνση της απομακρυνόμενης εξωτερικής μεμβράνης (σε περιπτώσεις εφαρμογής από ηλικιωμένους ή παιδιά) Επαρκής συγκόλληση στο δέρμα (να μην αποκολλάται κατά τη διάρκεια της θεραπείας και να απομακρύνεται χωρίς να τραυματίζει το δέρμα) Να μην αφήνει κατάλοιπα στο δέρμα (σχηματισμός δακτυλίου γύρω από το σύστημα ή υπολείμματα μετά την απομάκρυνσή του) Να μην προκαλεί δερματικές αντιδράσεις (φωτο-ευαισθησία, φωτοτοξικότητα, ερύθημα, κάψιμο, φαγούρα κλπ) Να διατηρεί σταθερό τον επιθυμητό ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου κατά τη διάρκεια εφαρμογής του. ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΔΙΑΔΕΡΜΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ Τα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα είναι εύκαμπτες φαρμακοτεχνικές μορφές σε διάφορα σχήματα, που περιέχουν ένα ή περισσότερα δραστικά συστατικά και εφαρμόζονται σε ακέραιο δέρμα, με σκοπό τη συστηματική δράση του φαρμάκου, αφού αυτό περάσει το προστατευτικό φραγμό του δέρματος. Ένα διαδερμικό σύστημα αποτελείται από τα παρακάτω μέρη 5,6 : Σχήμα 2. Τυπικό διαδερμικό σύστημα Εξωτερική μεμβράνη προστατεύει την φαρμακοτεχνική μορφή κατά την αποθήκευση. Απομακρύνεται πριν την εφαρμογή. Δραστική ουσία διάλυμα ή διασπορά της δραστικής ουσίας βρίσκεται σε επαφή με την εξωτερική μεμβράνη

8 Πιεσο-ευαίσθητα συγκολλητικά συγκρατεί ενωμένα τα μέρη του διαδερμικού και το ίδιο το διαδερμικό στη επιφάνεια του δέρματος Διαπερατή μεμβράνη ελέγχει την αποδέσμευση του φαρμάκου στα συστήματα δεξαμενής Μεμβράνη στήριξης (backing film) προστατεύει το διαδερμικό σύστημα από διάφορους εξωτερικούς παράγοντες Επιταχυντές διαπερατότητας που αυξάνουν τη διαδερμική διαπερατότητα της δραστικής ουσίας. Τα διαδερμικά συστήματα ανάλογα με το που βρίσκεται η δραστική ουσία χωρίζονται σε ορισμένες κατηγορίες 5,6. Συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στιβάδα (drug in adhesive devices, single or multi-layer) Συστήματα μήτρας (matrix devices) Συστήματα δεξαμενής (reservoir devices) Συστήματα απελευθέρωσης ατμού Τα συστήματα στα οποία το φάρμακο ενσωματώνεται στην συγκολλητική στιβάδα (drug in adhesive devices) αποτελούνται από τη στιβάδα στήριξης (backing layer), την εξωτερική μεμβράνη (release liner) που απομακρύνεται πριν την εφαρμογή του συστήματος στο δέρμα και τη συγκολλητική στιβάδα όπου είναι ενσωματωμένο το φάρμακο (drug containing adhesive layer) και με τη βοήθεια της οποίας επιτυγχάνεται η προσκόλληση στο δέρμα. Χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τα απλά (single) και τα σύνθετα (multi layer). Σχήμα 3. Drug in adhesive device Τα συστήματα πολλαπλών επιστρώσεων ή σύνθετα είναι όμοια με τα απλά συστήματα όπου το φάρμακο είναι ενσωματωμένο στη συγκολλητική στιβάδα, με τη διαφορά ότι έχουν άλλη μια συγκολλητική στιβάδα, η οποία διαχωρίζεται από την προηγούμενη με κάποια μεμβράνη. (α) Σχήμα 4. (α) Μονή στιβάδα, (β) Πολλαπλές στιβάδες (β)

9 Τα συστήματα μήτρας (matrix devices) γενικά αποτελούνται από τη στιβάδα στήριξης (backing layer), την στιβάδα της μήτρας (matrix layer), τη συγκολλητική στιβάδα (adhesive layer) και την εξωτερική μεμβράνη (release liner). Η φαρμακευτική ουσία κατανέμεται ή ενσωματώνεται εντός της μήτρας, δηλαδή της μάζας πολυμερούς υλικού, και η αποδέσμευση της εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του φαρμάκου και της μήτρας. Σχήμα 5. Σύστημα μήτρας Τα συστήματα δεξαμενής (reservoir devices) αποτελούνται από τη στιβάδα στήριξης (backing layer), το τμήμα της δεξαμενής του φαρμάκου (drug-containing reservoir), τη διαπερατή μεμβράνη που ελέγχει το ρυθμό αποδέσμευσης (rate-controlling membrane), τη συγκολλητική στιβάδα (adhesive layer) και την εξωτερική μεμβράνη (release liner). Το φάρμακο στην δεξαμενή μπορεί να είναι υπό τη μορφή διαλύματος, εναιωρήματος, γέλης ή υπό μορφή διασποράς. Από την δεξαμενή το φάρμακο μεταφέρεται διαμέσου της πορώδους διαπερατής μεμβράνης στο σημείο απορρόφησης, δηλαδή στο δέρμα. Η αποδέσμευση της εξαρτάται από το υλικό της δεξαμενής που περιέχει το φάρμακο, τη διαπερατότητα και το πάχος της μεμβράνης και ακολουθεί κινητική μηδενικής τάξης. Σχήμα 6. Σύστημα δεξαμενής Τα διαδερμικά θεραπευτικά συστήματα, των οποίων ο τρόπος παρασκευής μπορεί να διαφέρει ανάλογα με το τελικό προϊόν, εμφανίζουν ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά τα οποία αναλύονται παρακάτω 4,7 : Εξωτερική μεμβράνη (Release liner) Αποτελεί το προστατευτικό φιλμ που προφυλάσσει το σύστημα κατά την αποθήκευση και απομακρύνεται πριν την εφαρμογή στο δέρμα. Ανεξαρτήτως του τύπου διαδερμικού συστήματος που θα επιλεγεί, η εξωτερική μεμβράνη θα πρέπει να είναι συμβατή και να μην αλληλεπιδρά με τα υπόλοιπα υλικά του συστήματος

10 ενώ θα πρέπει να μην απορροφά το φάρμακο ή τα άλλα έκδοχα καθώς βρίσκεται σε απευθείας επαφή με το διαδερμικό θεραπευτικό σύστημα. Μεμβράνη στήριξης (backing film) Πρωταρχική λειτουργία της μεμβράνης αυτής είναι να παρέχει προστασία στο διαδερμικό σύστημα καθ όλη τη διάρκεια ζωής του και κατά την εφαρμογή του στο δέρμα. Οι μεμβράνες αυτές πρέπει να πληρούν ορισμένες προϋποθέσεις οι οποίες είναι : Να είναι αδιαπέραστη από τη δραστική ουσία και από τους διάφορους επιταχυντές διαπερατότητας Να είναι χημικά συμβατές με τη δραστική ουσία, τα διάφορα έκδοχα, τους επιταχυντές διαπερατότητας και το συγκολλητικό Κατάλληλη ευκαμψία (flexibility), ελαστικότητα και αντοχή στην παραμόρφωση Σχετικά φθηνές Ικανότητα δημιουργίας συνθηκών εγκλεισμού Εξαιτίας της έμφασης που δίνεται στην χημική αντοχή των μεμβρανών μπορεί οι συνθήκες εγκλεισμού να προκαλέσουν ερεθισμό στο δέρμα όταν το διαδερμικό σύστημα χρησιμοποιείται για μεγάλο χρονικό διάστημα και το ίδιο το σύστημα να ξεκολλήσει. Τα υλικά που επιλέγονται είναι πολυμερή τα οποία πληρούν τις παραπάνω προϋποθέσεις. Συνήθως οι μεμβράνες αποτελούνται από ένα φιλμ πολυαιθυλενίου ή πολυεστέρα με ή χωρίς επικάλυψη αλουμινίου. Διαπερατή μεμβράνη Οι διαπερατές μεμβράνες απαντώνται στα διαδερμικά συστήματα πολλαπλών επιστρώσεων και τύπου δεξαμενής. Χρησιμοποιούνται κυρίως για τον έλεγχο του ρυθμού αποδέσμευσης του φαρμάκου. Στα συστήματα πολλαπλών επιστρώσεων, η μεμβράνη χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των επιμέρους επιστρώσεων και για να παρέχει μηχανική στήριξη. Τα υλικά που συνήθως επιλέγονται για τις μεμβράνες είναι φυσικά πολυμερή υλικά και είναι αναγκαίο να είναι συμβατά και με τα υπόλοιπα υλικά του διαδερμικού συστήματος καθώς σε πολλές περιπτώσεις βρίσκεται σε άμεση επαφή η μεμβράνη με τη συγκολλητική μεμβράνη ή τη μεμβράνη στήριξης. Μπορεί να είναι πορώδη ή συνεχή υλικά. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν μεμβράνες από πολυαιθυλένιο ή πολυπροπυλένιο. Στην δεύτερη κατηγορία ανήκουν μεμβράνες που αποτελούνται από πολυαιθυλένιο, διάφορες πολυουρεθάνες, πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο, πολυπροπυλένιο και συμπολυμερή EVA. Είναι προφανές ότι ο ρυθμός διαπέρασης του φαρμάκου εξαρτάται από τις φυικοχημικές ιδιότητες της κάθε μεμβράνης και του φαρμάκου 8,9.

11 Πιεσο-ευαίσθητα συγκολλητικά (Pressure Sensitive Adhesives, PSAs) Τα πιεσο-ευαίσθητα συγκολλητικά αποτελούν σημαντικά συστατικά των διαδερμικών συστημάτων γιατί εξασφαλίζουν επαρκή και κατάλληλη επαφή ανάμεσα στο χρησιμοποιούμενο θεραπευτικό σύστημα και το δέρμα, και έτσι ικανοποιούν μια σημαντική προϋπόθεση για την αποδέσμευση του φαρμάκου. Για να επιτευχθεί αυτός ο βαθμός συγκόλλησης, το υλικό που χρησιμοποιείται πρέπει να μπορεί να παραμορφώνεται με την ελάχιστη δυνατή πίεση και να μπορεί να παραμένει στην επιθυμητή θέση όταν η πίεση σταματήσει. Τα χαρακτηριστικά που πρέπει να διαθέτει ένα πιεσο ευαίσθητο συγκολλητικό είναι για να χρησιμοποιηθεί σε ένα διαδερμικό σύστημα είναι : Να μην προκαλεί ερεθισμό, ευαισθητοποίηση ή να διαταράσσει την φυσιολογική χλωρίδα του δέρματος Να είναι συμβατό με τα υπόλοιπα υλικά του συστήματος Να προσκολλάται σε διάφορους τύπους δέρματος Να παραμένει στο δέρμα καθ όλη τη διάρκεια της θεραπείας Να απομακρύνεται εύκολα χωρίς να τραυματίζει το δέρμα Να μην αφήνει κατάλοιπα μετά την απομάκρυνσή του Η τελική επιλογή ενός συγκολλητικού βασίζεται σε διάφορους παράγοντες, μεταξύ των οποίων η τεχνολογία του διαδερμικού συστήματος και οι φυσικοχημικές ιδιότητες του φαρμάκου. Έχοντας εξασφαλίσει τη χημική συμβατότητα μεταξύ όλων των υλικών, η επιλογή του υλικού γίνεται με βάση το ρυθμό διάχυσης του φαρμάκου και του επιταχυντή διαβατότητας από το συγκολλητικό προς την επιφάνεια του δέρματος. Επιπλέον τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του φαρμάκου θα καθορίσουν τον τύπο του συγκολλητικού. Κατά τη διαμόρφωση ενός συγκολλητικού, λαμβάνονται υπόψη τέσσερις παράγοντες: στιγμιαία προσκολλητικότητα (tack), πρόσφυση κατά την απομάκρυνση (peel adhesion), πρόσφυση του δέρματος, και η δύναμη συνοχής. Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται χωρίζονται ανάλογα με τη χημική τους σύσταση σε τρεις κατηγορίες 9,11 : Παράγωγα πολυισοβουτυλενίου Σιλικονούχα Πολυακρυλικά Γενικά τα παράγωγα πολυισοβουτυλενίου έχουν χαμηλό κόστος, παρουσιάζουν καλή προσκολλητικότητα σε μη πολικά υποστρώματα και εμφανίζουν καλή στιγμιαία προσκολλητικότητα (tack). Ωστόσο απαιτούνται πρόσθετες ουσίες προκειμένου να επιτευχθεί η επιθυμητή προσκολλητικότητα, ενώ επηρεάζονται από την παρουσία διαλυτών. Ακόμη επηρεάζονται από οξειδωτικούς παράγοντες και είναι ευπαθή στη θερμοκρασία, με αποτέλεσμα να αποικοδομούνται. Τέλος εμφανίζουν χαμηλή διαπερατότητα από το νερό και οξυγόνο 9.

12 Τα σιλικονούχα πολυμερή σε αντίθεση με τα υπόλοιπα δεν περιέχουν, πλαστικοποιητές, σταθεροποιητές, αντιοξειδωτικά, πλαστικοποιητές, καταλύτες, ή άλλες δυνητικά τοξικές ουσίες. Αυτά τα πρόσθετα δεν απαιτούνται επειδή τα σιλικονούχα συγκολλητικά είναι σταθερά σε ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών (-73 ο C έως +250 o C) και να εμφανίζουν την επιθυμητή προσκολλητικότητα. Οι ιδιότητες τους είναι δυνατό να τροποποιηθούν με την προσθήκη κατάλληλων μονομερών κατά τον πολυμερισμό. Τέλος παρουσιάζουν αντοχή στους διαλύτες και είναι διαπερατά από το νερό και το οξυγόνο. Σημαντικότερο μειονέκτημα τους είναι το υψηλό κόστος 9,10. Τα ακρυλικά πολυμερή χρησιμοποιούνται εκτεταμένα τα τελευταία χρόνια στην παραγωγή διαδερμικών συστημάτων. Τα ακρυλικά συγκολλητικά παρουσιάζουν πλεονεκτήματα έναντι των άλλων πολυμερών με παρόμοια χρήση. Γενικά έχουν αποδεκτό κόστος, καλή προσκολλητικότητα σε μη πολικές επιφάνειες, καλή στιγμιαία προσκολλητικότητα. Δεν προσβάλλονται εύκολα από τους χρησιμοποιούμενους διαλύτες και είναι ανθεκτικοί στην οξείδωση, τη θερμοκρασία και την υπεριώδη ακτινοβολία. Τα περισσότερα είναι διαφανή και δεν κιτρινίζουν κατά την έκθεση τους στο ηλιακό φως. Τέλος είναι αρκετά διαπερατά από το οξυγόνο και το νερό 9,10,11. ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Το δέρμα είναι το μεγαλύτερο όργανο του σώματος. Δεδομένου ότι είναι το όργανο που φέρνει σε επαφή του σώμα με το εξωτερικό περιβάλλον, χρησιμεύει ως ένα ζωντανό, προστατευτικό στρώμα που εμποδίζει την είσοδο ξένων χημικών ουσιών και μικροβίων, προλαμβάνει την απώλεια λόγω εξάτμισης υγρών του σώματος και προστατεύει από τη θερμότητα. Αν και το δέρμα είναι ένας αποτελεσματικός φραγμός, δεν είναι ένα πλήρεις και καθίσταται προφανές ότι είναι μια σημαντική πύλη για την είσοδο χημικών ουσιών στο σώμα. Ιστολογικά το δέρμα είναι ένα πολύπλοκο όργανο με πολλές στοιβάδες και ολικό πάχος 2-3 mm και καλύπτει περίπου μια επιφάνεια 2 m 2 και οφείλεται για το 10 20% του συνολικού βάρους του σώματος. Το δέρμα αποτελείται από τις εξής στοιβάδες όπως φαίνονται και στο παρακάτω σχήμα 12 : Την επιδερμίδα (epidermis) Το κυρίως δέρμα ή χόριο ή δερμίδα (dermis) Τον υποδόριο ιστό ή υπόδερμα (hypodermis) Ενσωματωμένα στην επιδερμίδα και στη δερμίδα, υπάρχουν διάφορα εξαρτήματα όπως οι θύλακες των τριχών, οι σμηγματογόνοι αδένες, οι ιδρωτοποιοί αδένες και ένα πολύπλοκο νευρικό δίκτυο.

13 Σχήμα 7. Τομή ανθρώπινου δέρματος Eπιδερμίδα Η επιδερμίδα στον άνθρωπο έχει πάχος 100 μm και αποτελείται από πολύστοιβο επιθήλιο. Δεν περιέχει αιμοφόρα αγγεία και αποτελείται κατά κύριο λόγο από κερατινοκύτταρα. Τα κερατινοκύτταρα διαφοροποιούνται προς κερατινοποιημένα κύτταρα (horny cells) καθώς μετακινούνται από το εσωτερικό προς την επιφάνεια, όπου και καταστρέφονται, με αποτέλεσμα να σχηματίζονται διακριτές στοιβάδες κυττάρων και με βάση δομικά κριτήρια, η επιδερμίδα μπορεί να υποδιαιρεθεί σε επιμέρους στρώσεις : Βασική στιβάδα (stratum basale) Ακανθώθη στιβάδα (stratum spinosum) Κοκκιώδη στιβάδα (stratum granulosum) Κεράτινη στιβάδα (stratum corneum) Μια επιπλέον στιβάδα, η διαυγής (stratum lucidum), μπορεί να διακριθεί στις παλάμες και τα πέλματα, μεταξύ της κοκκιώδους και της κεράτινης στιβάδας.

14 Σχήμα 8. Στιβάδες επιδερμίδας Εκτός από τα κερατινοκύτταρα η επιδερμίδα συμπεριλαμβάνει και διαφόρους τύπους δενδριτικών κυττάρων τα οποία είναι 13 : Τα κύτταρα του Langerman, τα οποία αποτελούν το 5 10% των κυττάρων της επιδερμίδας, είναι κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών, εμπλέκονται στις διαδικασίες αναγνώρισης αντιγόνων και στις διάφορες ανοσοποιητικές λειτουργίες του δέρματος Τα μελανοκύτταρα, είναι κύτταρα που συνθέτουν τη μελανίνη, χρωστική που είναι υπεύθυνη για το χρώμα του ανθρώπινου δέρματος. Αυτά τα κύτταρα που βρίσκονται δίπλα κύτταρα της βασικής στιβάδας και με την αντίδρασή τους με τα κερατινοκύτταρα δημιουργούν τα μελανοσώματα, οργανίδια τα οποία φέρουν την χρωστική αυτή Τα κύτταρα του Merkel, βρίσκονται στην επιδερμίδα, η λειτουργία τους είναι ακόμα άγνωστη αλλά πιστεύεται ότι έχουν νευροενδοκριννή λειτουργία στο δέρμα. Βασική στιβάδα Η βασική στιβάδα είναι το εσωτερικό επιδερμικό στρώμα, που αποτελείται από μια μονοστιβάδα κυττάρων. Τα κύτταρα της έχουν σχήμα κυβοειδές ή κυλινδρικό με τον επιμήκη άξονα τους κάθετο στη διαχωριστική επιφάνεια μεταξύ της επιδερμίδας και του κυρίως δέρματος. Είναι κύτταρα με ωοειδή ή επιμήκη πυρήνα, το κυτταρόπλασμα τους είναι πλούσιο σε ριβοσώματα, μιτοχόνδρια και λυσοσώματα ενώ συχνά περιέχουν και κοκκία μελανίνης, τα οποία μεταφέρονται από τα γειτονικά μελανοκύτταρα. Η έκταση και η κατανομή των κοκκίων μελανίνης σχετίζεται με το χρώμα του δέρματος. Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας συνδέονται μεταξύ τους και με τα υπερκείμενα ακανθώδη κύτταρα με μεσοκυτταρικές

15 (intercellular) γέφυρες ή δεσμοσώματα (desmosomes). Το κάθε δεσμόσωμα αποτελείται από δύο πλάκες σύνδεσης, μία σε κάθε άκρο, που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα των δύο κερατινοκυττάρων που συνδέονται. Στο κέντρο του δεσμοσώματος υπάρχει η μεσοκυτταρική ουσία συνένωσης (intercellular cement substance), που αναφέρεται επίσης ως γλυκοκάλυκας (glycocalyx), και περιέχει γλυκοπρωτεϊνες. Η μεσοκυτταρική ουσία συνένωσης έχει σύσταση γέλης με αποτέλεσμα να προσδίδει την απαραίτητη συνοχή μεταξύ των επιδερμικών κυττάρων αλλά παράλληλα να επιτρέπει την διέλευση υδρόφιλων ουσιών. Στη περιοχή της δερμο-επιδερμικής συμβολής τα κύτταρα της βασικής στιβάδας συνδέονται με τη βασική μεμβράνη με τροποποιημένα δεσμοσώματα, τα ημιδεσμοσώματα (hemidesmosomes). Στη βασική στιβάδα τα κύτταρα περιέχουν ενδιάμεσα ινίδια κερατίνης, που ονομάζονται τονοϊνίδια (tonofilaments). Τα τονοϊνίδια στο ένα άκρο τους συνδέονται με την πλάκα σύνδεσης ενός δεσμοσώματος ενώ το άλλο άκρο τους είναι ελεύθερο μέσα στο κυτταρόπλασμα κοντά στον πυρήνα. Τα τονοϊνίδια περιέχουν μικρές ποσότητες θείου με τη μορφή σουλφιδριλικών ομάδων. Στα κύτταρα της βασικής στιβάδας παρατηρείται έντονη μιτωτική δραστηριότητα 13,14. Ακανθώδης στιβάδα Τα κύτταρα της ακανθώδους στιβάδας βρίσκονται πάνω από τη βασική στιβάδα και διατάσσονται σε 5 10 στρώσεις. Έχουν σχήμα πολυεδρικό, με κεντρικό στρογγυλό πυρήνα και ροδόχροο κυτταρόπλασμα. Όσο πλησιάζουν προς την επιφάνεια, τα κερατινοκύτταρα αποκτούν πεπλατυσμένο σχήμα, με τον επιμήκη άξονα τους παράλληλο προς την επιφάνεια του δέρματος. Τα κύτταρα συνδέονται με μεσοκυτταρικές γέφυρες ενώ στα μεταξύ τους διαστήματα υπάρχουν ουδέτεροι και όξινοι βλεννοπολυσακχαρίτες (γλυκοσαμινογλυκάνες). Τα τονοϊνίδια στο κυτταρόπλασμα των κερατινοκυττάρων βρίσκονται με τη μορφή ινιδίων διαμέτρου 7 έως 8 nm. Ο αριθμός των τονοϊνιδίων αυξάνεται στο ανώτερο τμήμα της ακανθώδους στιβάδας 13,14. Κοκκιώδης στιβάδα Η κοκκιώδης στιβάδα αποτελείται από 2-3 σειρές πεπλατυσμένων, εμπύρηνων κυττάρων του και το κυτταρόπλασμά τους περιέχει κοκκία κερατοϋαλίνης και μικρά σωμάτια, τα σωμάτια Odland. Οι πρωτεΐνες που περιλαμβάνονται σε αυτούς τους κόκκους λειτουργούν στο σχηματισμό του εξωτερικού στρώματος των κυττάρων. Η κερατοϋαλίνη έχει αποδειχθεί ότι αποτελεί μία ενδοκυτταρική μήτρα που τυλίγει και ενισχύει τις ίνες της κερατίνης. Η κοκκιώδης στιβάδα αποτελεί τη «κερατογόνο ζώνη» της επιδερμίδας, στην οποία προετοιμάζεται η διάλυση του πυρήνα και των κυτταρικών οργανιδίων. Στην ανώτερη στιβάδα, το μεγαλύτερο μέρος του κυτταροπλάσματος των κυττάρων αποτελείται από αθροίσματα κοκκίων κερατοϋαλίνης και στενά διατεταγμένα τονοϊνίδια, με λίγα κυτταροπλασματικά οργανίδια. Η νέκρωση του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος δεν περιλαμβάνει τα κοκκία κερατοϋαλίνης και τα τονοϊνίδια, τα οποία ενώνονται και σχηματίζουν την κερατίνη της κεράτινης στιβάδας 13,14.

16 Διαυγής στιβάδα Η διαυγής στιβάδα, βρίσκεται κυρίως στο παχύ δέρμα στις παλάμες και τα πέλματα, αποτελείται από πολλά στρώματα των νεκρών, σαφώς πεπλατυσμένων, κερατινοκυττάρων τα οποία είναι εμπλουτισμένα σε κερατίνη 13. Κεράτινη στιβάδα Η κεράτινη στιβάδα έχει πάχος μm και αποτελείται από απύρηνα πεπλατυσμένα κύτταρα που έχουν χάσει, εκτός από τους πυρήνες τους, και όλα τα κυτταροπλασματικά όργανα και στοιχεία. Τα κύτταρα της κεράτινης στιβάδας είναι μεταβολικά ενεργά, μερικώς αφυδατωμένα και αποτελούνται κυρίως από νημάτια της πρωτεΐνης κερατίνης, ένα περίπλοκο σύμπλεγμα πρωτεϊνών στο οποίο απαντάται το αμινοξύ κυστίνη. Τα κύτταρα της κεράτινης στιβάδας περιβάλλονται από ένα σχηματισμό σταυρωτής σύνδεσης, τον περιφερικό «φάκελο» (peripheral envelope ) των κυττάρων, που είναι παχύς και αδιάλυτος σε σύγκριση με τη λιπιδική διπλοστιβάδα που περιβάλλει τα κύτταρα των άλλων στοιβάδων της επιδερμίδας. Ο περιφερικός «φάκελος» αποτελείται δύο ή περισσότερες πρόδρομες πρωτεΐνες. Τα κερατινοκύτταρα είναι τοποθετημένα κατά τέτοιο τρόπο ώστε η δομή της κεράτινης στιβάδας να είναι γνωστή ως «brick and mortar model». Σχήμα 9. Brick and mortar model Τα πεπλατυσμένα κερατινοποιημένα κύτταρα της κεράτινης στιβάδας με τον ανθεκτικό φάκελο που τα περιβάλλει αποτελούν τα «τούβλα» ( bricks ) και

17 παρέχουν στον δερματικό φραγμό. Βρίσκονται σε αλληλοεμπλεκόμενες δέσμες που ανανεώνονται από τις κατώτερες στοιβάδες του δέρματος κάθε περίπου δυο εβδομάδες. Τα λιπίδια που παρεμβάλλονται μεταξύ των κερατινοκυττάρων και είναι διατεταγμένα με τη μορφή λιπιδικών διπλοστιβάδων έχουν το ρόλο του «τσιμέντου» ( mortar ). Η σύγχρονη αυτή άποψη της δομής της κεράτινης στιβάδας διαφέρει από παλαιότερος στο γεγονός ότι είναι πλέον γνωστό ότι τα κερατινοκύτταρα συνδέονται μεταξύ τους με τα δεσμοσώματα, όπως φαίνεται στο σχήμα. Στο φραγμό του δέρματος εκτός από τα κερατινοκύτταρα και πιο συγκεκριμένα ο περιφερικός τους «φάκελος», σημαντικό ρόλο έχουν και τα λιπίδια που βρίσκονται στον παρακυττάριο χώρο. Η λειτουργία τους είναι να αντισταθμίζουν την απώλεια νερού και αλάτων από το δέρμα και να εμποδίζουν τη διείσδυση υδατοδιαλυτών ουσιών. Οι λιπιδικές διπλοστοιβάδες αποτελούνται από κεραμίδια (ceramides), ελεύθερες στερόλες (κυρίως χοληστερόλη) και ελεύθερα λιπαρά οξέα, με μικρότερες ποσότητες γλυκολιπιδίων, στερολικών εστέρων, τριγλυκεριδίων, θειϊκής χοληστερόλης και υδρογονανθράκων. Οι λιπιδικές διπλοστοιβάδες είναι δομημένες κατά τέτοιο τρόπο ώστε οι πολικές περιοχές να βρίσκονται στις εξωτερικές πλευρές της διπλοστιβάδας ενώ οι μη πολικές περιοχές να βρίσκονται στο εσωτερικό της. Η κεράτινη στιβάδα δεν περιέχει φωσφολιπίδια. Τα φωσφολιπίδια από τα κερατινοκύτταρα των βιώσιμων στρώματα διασπόνται από τις φωσφολιπάσες. Αυτό παράγει λιπαρά οξέα, τα οποία είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη ενός λειτουργικού φραγμού, και σε αυτό οφείλεται το όξινο ph της κεράτινης στιβάδας. Ο όξινος αυτός «μανδύας» προστατεύει την επιφάνεια του δέρματος από διάφορα επιβλαβή βακτήρια. Επιπλέον, η παρουσία μακριών υδρόφοβων αλυσίδων των λιπαρών οξέων έχει ως αποτέλεσμα η επιδερμίδα να είναι αδιάβροχη από το νερό. Νέα επιδερμικά κύτταρα παράγονται συνεχώς από τη βασική στιβάδα και μετακινούνται αργά προς τα επάνω μακριά από την πηγή οξυγόνου και τροφής. Όταν τελικά φτάνουν στην κεράτινη στιβάδα είναι πεπλατυσμένα και γεμάτα με κερατίνη. Στη συνέχεια τα κερατινοποιημένα κύτταρα απορρίπτονται από το δέρμα με ρυθμό μιας στιβάδας κυττάρων την ημέρα, μια διαδικασία που ονομάζεται desquamation. Η ανανέωση της επιδερμίδας από τα κύτταρα της βασικής στιβάδας έως τα κερατινοποιημένα κύτταρα, που αποπίπτουν συνεχώς, ποικίλει ανάλογα με την περιοχή. Έτσι είναι ταχύτερη (25 30 ημέρες) σε περιοχές συχνού τραυματισμού (π.χ. πέλματα), ενώ σε άλλες περιοχές είναι βραδύτερη (40 50 ημέρες). Ο χρόνος ανανέωσης της επιδερμίδας ελαττώνεται σημαντικά σε ορισμένα νοσήματα του δέρματος, ειδικά στην ψωρίαση. Στην κεράτινη στιβάδα οφείλεται η κυριότερη αντίσταση στην διείσδυση και διαπέραση ουσιών από το δέρμα 15, 16.

18 Κυρίως δέρμα ή χόριο ή δερμίδα Το χόριο είναι ανθεκτικός και ελαστικός ιστός που στηρίζει την επιδερμίδα και τη συνδέει με τον υποδόριο ιστό. Προστατεύει επίσης το σώμα έναντι των μηχανικών τραυματισμών. Το χόριο αποτελείται από ινοβλάστες, ινοκύτταρα, ίνες κολλαγόνου, ίνες ελαστίνης, ρετικουλίνη και θεμέλια ουσία. Στο χόριο επίσης εντοπίζονται τα εξαρτήματα του δέρματος, τα αιμοφόρα αγγεία και τα νεύρα. Οι ίνες κολλαγόνου αποτελούν το σημαντικότερο συστατικό του χορίου. Σχηματίζουν ένα πολύπλοκο και καλά δομημένο δίκτυο, το κολλαγόνο, ενώ υπάρχουν και με τη μορφή δεσμών. Οι ίνες ελαστίνης είναι παχύτερες στο κατώτερο τμήμα του χορίου, όπου και σχηματίζουν δέσμες ανάλογες με αυτές του κολλαγόνου, στην πλειοψηφία τους παράλληλες με την επιφάνεια του δέρματος. Οι ίνες ελαστίνης γίνονται λεπτότερες καθώς πλησιάζουν προς την επιδερμίδα. Η θεμέλια ουσία γεμίζει τα διαστήματα μεταξύ των ινών και των δεσμών κολλαγόνου. Περιέχει γλυκοσαμινογλυκάνες ή όξινους βλεννοπολυσακχαρίτες. Οι γλυκοσαμινογλυκάνες συνδέονται με τις πεπτιδικές αλυσίδες και σχηματίζουν συμπλέγματα που ονομάζονται πρωτεογλυκάνες. Το χόριο αποτελείται από δυο στοιβάδες, τη θηλώδη δερμίδα, που βρίσκεται κοντά στη δερμοεπιδερμική συμβολή, και τη δικτυωτή δερμίδα, μεταξύ θηλώδους ζώνης και υποδορίου ιστού. Η δικτυωτή δερμίδα αποτελείται από πυκνές δεσμίδες κολλαγόνων ινών με παρεμβαλλόμενες επιμήκεις ελαστικές ίνες, που συνήθως είναι παράλληλες προς την επιφάνεια του δέρματος. Σε αυτή την περιοχή υπάρχουν αιμοφόρα, λεμφικά αγγεία και νεύρα. Η θηλώδης δερμίδα περιέχει λιγότερο κολλαγόνο και ελαστίνη από τη δικτυωτή δερμίδα, αλλά περισσότερη θεμέλια ουσία. Οι ίνες του κολλαγόνου και της ελαστίνης έχουν μάλλον τυχαία διάταξη. Η θηλώδης δερμίδα περιέχει τριχοειδικά αγγεία, λεπτούς νευρικούς κλάδουςκαι νευρικές απολήξεις. Τα αιμοφόρα αγγεία του δέρματος φτάνουν μέχρι το χόριο και προέρχονται από τα μεγαλύτερα αγγεία του υποδορίου ιστού. Διακρίνονται δύο χαρακτηριστικά πλέγματα: ένα βαθύτερο αγγειακό πλέγμα, στην κατώτερη δικτυωτή δερμίδα, κοντά στο όριο αυτής με τον υποδόριο ιστό, και ένα επιφανειακό αγγειακό πλέγμα, στην άνω δικτυωτή δερμίδα κοντά στη συμβολή της με τη θηλώδη στιβάδα. Αγκύλες μικρών αγγείων από το επιφανειακό αγγειακό πλέγμα κατευθύνονται προς τη θηλώδη δερμίδα, με τριχοειδικά αγγεία τοποθετημένα κοντά στη βασική μεμβράνη της επιδερμίδας. Τα αγγεία δεν διαπερνούν την επιδερμίδα. Επίσης στο χόριο εντοπίζεται το νευρικό δίκτυο του δέρματος 13. Υποδόριος ιστός Ο υποδόριος ιστός αποτελείται, στο μεγαλύτερο μέρος του, από λιποκύτταρα και περιέχει τα κύρια αιμοφόρα αγγεία και νεύρα που επεκτείνονται και στο υπερκείμενο χόριο. Ο υποδόριος ιστός λειτουργεί ως θερμομονωτικό υλικό, ως

19 διαμέρισμα αποθήκευσης θρεπτικών ουσιών και ως απορροφητικό υλικό των δονήσεων. Εξαρτήματα του δέρματος Εξαρτήματα του δέρματος αποτελούν οι τρίχες, τα νύχια, οι σμηγματογόνοι αδένες, οι εκκρινείς ιδρωτοποιοί και οι αποκρινείς αδένες. ΔΙΑΔΕΡΜΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ Διαδερμική απορρόφηση ορίζεται η παθητική διάχυση των φαρμακευτικών ουσιών διαμέσου του δέρματος. Παρόλο που έχει επιτευχθεί σημαντική πρόοδος στη διερεύνηση των γνώσεων σχετικά με την απορρόφηση των φαρμάκων από το δέρμα, δεν υπάρχει ενιαία άποψη για το βασικό μηχανισμό της παραπάνω διαδικασίας. Περιγράφονται γενικά δύο οδοί εισόδου των φαρμάκων: η μεταξύ ή διαμέσου των κυττάρων της συνεχούς επιδερμίδας και διαμέσου των σμηγματογόνων αδένων, των ιδρωτοποιών αδένων και των θυλάκων των τριχών. Η οδός της διαδερμικής απορρόφησης εξαρτάται τόσο από το μηχανισμό μεταφοράς της ουσίας όσο και από τις φυσικοχημικές της ιδιότητες. Οι πολικές ουσίες διαχέονται με διαφορετικό μηχανισμό διαμέσου της κεράτινης στιβάδας από τις μη πολικές. Κατά την ενυδάτωση της κεράτινης στιβάδας, το νερό συσσωρεύεται γύρω από τα πρωτεϊνικά μόρια και οι πολικές ουσίες περνούν μέσα από αυτό το ακίνητο στρώμα νερού. Αντίθετα, τα μη πολικά μόρια διαχέονται διαμέσου ενός μη υδατικού, λιποειδικού στρώματος μεταξύ των πρωτεϊνικών μορίων. Τα στάδια που ακολουθούνται κατά την απορρόφηση ουσιών από το δέρμα περιλαμβάνουν τη διάχυση της ουσίας από το φορέα της προς την κεράτινη στιβάδα, τη μεταφορά διαμέσου της κεράτινης στιβάδας, διάχυση από το λιπόφιλο στρώμα προς την πιο υδατική ζώσα επιδερμίδα, μεταφορά σε όλη την επιδερμίδα και τέλος στην παραλαβή από τη δερματική μικροκυκλοφορία με επακόλουθη τη διανομή στη συστηματική κυκλοφορία. Το πιο βραδύ στάδιο στη διαδικασία αυτή, συνήθως, είναι το πέρασμα διαμέσου της κεράτινης στιβάδας, που προβάλλει και τη μεγαλύτερη αντίσταση στη διάβαση της ουσίας και έτσι περιορίζει και ελέγχει τη διαπερατότητα του φαρμάκου από το δέρμα. Η κεράτινη στιβάδα έτσι θεωρείται ότι είναι μια πυκνή ομοιογενής μεμβράνη που φυσιολογικά ακόμα και ενυδατωμένη αποτελεί μια εξαιρετικά αδιαπέραστη μεμβράνη. Παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδερμική απορρόφηση ουσιών Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδερμική απορρόφηση των φαρμάκων χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: Βιολογικοί παράγοντες Φυσικοχημικοί παράγοντες

20 Βιολογικοί παράγοντες Οι βιολογικοί παράγοντες οι οποίοι επηρεάζουν τη διαδερμική απορρόφηση είναι : Κατάσταση του δέρματος Ηλικία του δέρματος Δέρμα από διάφορες περιοχές του ίδιου είδους πειραματόζωου Δέρμα από διάφορα είδη Μεταβολισμός από το δέρμα Ροή του αίματος Φυσικοχημικοί παράγοντες Οι φυσικοχημικοί παράγοντες είναι: 17 Θερμοκρασία Συγκέντρωση του φαρμάκου (Η ποσότητα του φαρμάκου η οποία απορροφάται διαδερμικά στη μονάδα του χρόνου αυξάνεται αυξανόμενης της συγκέντρωσής του). Φυσικοχημικές ιδιότητες του φαρμάκου (σχήμα και μέγεθος του φαρμάκου, συντελεστής κατανομής, pη). Αλληλεπιδράσεις φαρμάκου δέρματος (η κεράτινη στιβάδα δρα σαν «αποθήκη» του δραστικού συστατικού). Φορέας του φαρμάκου (κινητήρια δύναμη της μεταφοράς των μορίων του φαρμάκου είναι η διαφορά στο θερμοδυναμικό μεταξύ φορέα και δέρματος). Διάχυση διαμέσου του δέρματος Η διάχυση μέσω του δέρματος, που ελέγχεται κυρίως από την ανώτατη στιβάδα, την κεράτινη στιβάδα, μπορεί να θεωρηθεί ως διάχυση μέσω μιας παθητικής μεμβράνης. Η ροή στη σταθερή κατάσταση (J) ενός φαρμάκου μέσω του δέρματος μπορεί να προσεγγιστεί από το δεύτερο νόμο Fick της διάχυσης : δ dt δ 2 C C = 2 (Εξίσωση 1) δχ όπου το c είναι η συγκέντρωση της ουσίας που διαχέεται, το Χ η διανυσματική συντεταγμένη που μετριέται κανονικά στο τμήμα που πρόκειται να έχουμε διάχυση, το D είναι ο συντελεστής διάχυσης, και το t είναι χρόνος. Με τις μελέτες διαπερατότητας των δερμάτων, οι ερευνητές συχνά, χρησιμοποιούν ένα in vitro πρωτόκολλο με μια μεμβράνη που στερεώνεται μεταξύ δύο διαμερισμάτων, ένα από τα οποία είναι η δεξαμενή που περιέχει το φάρμακο(ο χορηγός-δότης) και το άλλο διαμέρισμα που είναι το διαμέρισμα δέκτης και περιέχει ένα διάλυμα υποδοχής με σκοπό την επίτευξη συνθηκών δεξαμενής (ουσιαστικά μηδενική συγκέντρωση). Μετά από αρκετό χρόνο, η διάχυση σταθερής κατάστασης από τη

21 μεμβράνη επικρατεί. Υπό αυτούς τους όρους η παραπάνω εξίσωση (1) μπορεί να απλοποιηθεί στην εξής μορφή : dm dt DC O = (Εξίσωση 2) h όπου το m είναι η συσσωρευτική μάζα που περνά (διαχέεται) ανά μονάδα επιφάνειας του δέρματος μέσω της μεμβράνης σε χρόνο t, Co είναι η συγκέντρωση της ουσίας που πρόκειται να διαχυθεί στο πρώτο στρώμα της μεμβράνης στην επιφάνεια του δέρματος ερχόμενη σε επαφή με τον επιταχυντή διαπερατότητας, και το h είναι το πάχος των μεμβρανών. Δύο είναι οι βασικοί μηχανισμοί μεταφοράς μάζας που γίνεται εξαιτίας της τυχαίας μοριακής κίνησης των σωματιδίων μιας ουσίας. Η τάση προς διάχυση συνδυάζεται με μία βαθμίδα συγκέντρωσης. Η μελέτη της πορείας της διάχυσης γίνεται με εξέταση της ροής των μορίων μιας ουσίας διαμέσου πολυμερούς που λειτουργεί ως φράγμα. Η διέλευση της ύλης από μία μεμβράνη μπορεί να γίνει με απλή μοριακή δίοδο των σωματιδίων ή με μετακίνηση της ύλης διαμέσου των πόρων και διαύλων της μεμβράνης. Σε υλικά που δεν έχουν πόρους όπως στην προκειμένη περίπτωση το δέρμα, η μοριακή διάχυση των μορίων μέσω του δέρματος εξαρτάται από τη διαλυτότητα των δραστικών συστατικών που διέρχονται από την μεμβράνη (δέρμα). Όμως η μεταφορά των ουσιών διαμέσου του δέρματος μπορεί να γίνει με ποικίλους τρόπους : Παρακυττάρια μεταφορά μέσω της μεσοκυττάριας ουσίας της κεράτινης στιβάδας. Ενδοκυττάρια μεταφορά μέσω των κερατινοκυττάρων. Μέσω των εξαρτημάτων του δέρματος. 1. Μετακίνηση μέσω των θυλάκων των τριχών. 2. Μετακίνηση μέσω των σμηγματογόνων αδένων. 3. Μετακίνηση μέσω των ιδρωτοποιών αδένων του δέρματος. Στα περισσότερα πειράματα είναι δύσκολο να μετρήσει κανείς την C 0 αλλά τη Cο, που είναι η συγκέντρωση της διαχεόμενης ουσίας στο διαμέρισμα του δέκτη, που ενυδατώνει τη μεμβράνη και είναι συνήθως γνωστό. Οπότε οι Cο και Cο συσχετίζονται μέσω της σχέσης : C O =K.C 0. (Εξίσωση 3) Αντικατάσταση της εξίσωσης (3) στην (2) δίνει: dm DC. 0. P dt h ' = (Εξίσωση 4) Από την εξίσωση (4), που είναι η κλασική εξίσωση που χρησιμοποιείται για να αναλύσει τη διάχυση φαρμάκων μέσω του δέρματος μπορεί να φανεί ότι η ροή

22 (Dm/Dt) ελέγχεται κυρίως από το συντελεστή διάχυσης του φαρμάκου στην κεράτινη στιβάδα, τη διαλυμένη αποτελεσματική συγκέντρωση του φαρμάκου στο φορέα διάχυσης, το συντελεστή μερισμού μεταξύ της μορφοποίησης και της κεράτινης στιβάδας, καθώς και το πάχος της μεμβράνης. Αυτή η εξίσωση επεξηγεί μερικές από τις μεταβλητές που μπορούν να τροποποιηθούν κατά την εφαρμογή ενός επιταχυντή διαπερατότητας στο δέρμα. Η δυνατότητα μιας ουσίας, που βρίσκεται σε συγκεκριμένο φορέα, να διαπερνά λίγο ή πολύ την κεράτινη στιβάδα χαρακτηρίζεται από το συντελεστή διαπερατότητας (Κρ) που λαμβάνει υπόψη του ταυτόχρονα τους συντελεστές διαχύσεως (D) και κατανομής (p), όπως και το πάχος (h) της κεράτινης στιβάδας: Kρ = DCp. H (Εξίσωση 5) Η μονάδα μετρήσεως του Κρ είναι το cm\sec. Όπως ο νόμος του Fick στη σύλληψη του θεωρείται όμοιος του αντίστοιχου του Ohm, η αντίσταση στην απορρόφηση αντιστοιχεί στο αντίστροφο του συντελεστή διαπερατότητας. R = 1 = Κρ Κ K K ολικ ό (Εξίσωση 6) sc e d 1. e: η επιδερμίδα, 2. d : το χόριο (dermis), 3. Oπου sc:η κεράτινη στιβάδα, 4. Και R ολικό είναι η συνολική αντίσταση και ισούται με το άθροισμα των επιμέρους αντιστάσεων των δομών που σχηματίζουν το δέρμα.(κεράτινη στιβάδα, επιδερμίδα, χόριο). Επειδή όμως οι αντιστάσεις της επιδερμίδας και του δέρματος είναι αμελητέες συγκριτικά με αυτήν της κεράτινης στιβάδας, η συνολική αντίσταση του δέρματος ισούται με αυτή της κεράτινης στιβάδας. Κινητική της απορρόφησης μέσω του δέρματος ότης C1 έκτης Συγκέντρωση C2 H Φραγµός Σχήμα 10. Απεικόνιση της μεταφοράς του φαρμάκου διαμέσου ημιπερατής μεμβράνης.

23 Με βάση το σχήμα 10, αν υπολογίσουμε το εμβαδό της επιφάνειας s και to πάχος h του φραγμού που χωρίζει ένα πειραματικό κύτταρο διάχυσης και υποθέτοντας ότι η συγκέντρωση του φαρμάκου που διαχέεται είναι στην πλευρά του φραγμού προς τον δότη C 1 και στην πλευρά του φραγμού προς τον δέκτη είναι C 2,τότε ο πρώτος νόμος του Fick γράφεται: dm sdt C C = D 1 h 2 J = (Εξίσωση 7) Όπου C 1 -C 2 /h είναι κατά προσέγγιση η βαθμίδα συγκέντρωσης, dc/dt μέσα στο φραγμό και υποτίθεται ότι είναι σταθερή για να υπάρχει μία ψευδοστάσιμη κατάσταση. Οι συγκεντρώσεις C 1 και C 2 δεν είναι γνωστές μπορούν όμως να αντικατασταθούν με το γινόμενο του συντελεστή μερισμού Κ,επί τη συγκέντρωση από στην πλευρά του φραγμού προς τον δότη C d και επί τη συγκέντρωση προς την πλευρά του δέκτη Cr. Αυτό διότι ο συντελεστής κατανομής Κ δίνεται από τη σχέση: C C2 k= 1 = (Εξίσωση 8) C d C r Από τις εξισώσεις 7 και 8 έχουμε: dm DSK( C Cr = ) d dt h (Εξίσωση 9) Όταν έχουμε συνθήκες δεξαμενής όπως και επιδιώκουμε στις in vitro μελέτες διάχυσης φαρμάκων μέσω της κεράτινης στιβάδας τότε στο διαμέρισμα του δέκτη ισχύει: dm dt DSKC = h d (Εξίσωση 10) dm dt = PSC d (Εξίσωση 11) Όπου P=D.k/h είναι ο συντελεστής διαπερατότητας και έχει μονάδες ταχύτητας cm 2 /sec.

24 ΤΡΟΠΟΙ ΑΥΞΗΣΗΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΕΡΜΙΚΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το ανθρώπινο δέρμα αποτελεί έναν αποτελεσματικό και εκλεκτικό φραγμό στις διάφορες χημικές ουσίες. Η επιδερμίδα, και ειδικότερα η κεράτινη στιβάδα αποτελεί τον κύριο μηχανισμό ελέγχου. Με σκοπό επομένως την μεγιστοποίηση της ροής του φαρμάκου γίνονται προσπάθειες να παρακαμφθεί ο φραγμός αυτός. Οι σπουδαιότερες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για να βελτιωθεί η διαδερμική απορρόφηση των φαρμακευτικών ουσιών περιγράφονται στη συνέχεια. Η αύξησης της διαδερμικής διαπερατότητας γίνεται με διάφορες μεθόδους οι οποίες περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω. o Χρήση ηλεκτρισμού : ηλεκτροδιάτριση, ιοντοφόρεση o Χρήση θερμοκρασίας o Υπέρηχοι o Μαγνητικό πεδίο o Ραδιοσυχνότητες o Απομάκρυνση/παράκαμψη κεράτινης στιβάδας: ακτινοβολία laser, μικροβελόνες o Μεταβολή και τροποποίηση ιδιοτήτων κεράτινης στιβάδας : επιταχυντές διαπερατότητας Χρήση ηλεκτρισμού Ηλεκτροδιάτριση (electroporation) Η ηλεκτροφόρηση είναι ένα φαινόμενο που προκαλείται σε μια βιολογική επιφάνεια από την εφαρμογή μιας ηλεκτρικής ώθηση ικανής να δημιουργήσει πόρους στο εσωτερικό της λιπιδικής διπλοστιβάδας της κυτταρικής μεμβράνης. Ο ηλεκτρισμός ως μέθοδος βελτιστοποίησης της διαδερμικής απορρόφησης χρησιμοποιήθηκε πρώτη φορά πριν από 100 χρόνια. Στην ηλεκτροφόρηση γίνεται εφαρμογή παλμών υψηλής τάσης ( > 100 V ) ώστε να προκληθεί διαταραχή του δέρματος. Η εφαρμογή γίνεται για πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, συνήθως μερικά κλάσματα του δευτερολέπτου. Η αύξηση στη διαπερατότητα του δέρματος οφείλεται στην δημιουργία παροδικών πόρων κατά την ηλεκτροφόρηση. Η τεχνολογία αυτή εφαρμόζεται με επιτυχία για την αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος σε μόρια όπως πρωτεΐνες όπου το μοριακό βάρος ξεπερνά τα 7kDa 18, 19.

25 Σχήμα 11. Σύστημα ηλεκτροφόρησης Ιοντοφόρεση (iontophoresis) Με τη μέθοδο της ιοντοφόρεσης γίνεται εφαρμογή ρεύματος χαμηλής τάσης είτε απ ευθείας πάνω στο δέρμα είτε έμμεσα μέσω της φαρμακοτεχνικής μορφής. Η αύξηση στη διαπερατότητα του φαρμάκου με αυτή την τεχνική μπορεί να οφείλεται σε έναν ή σε συνδυασμό των παρακάτω μηχανισμών : Ηλεκτρο αποστροφή (για φορτισμένα διαλύματα) Ηλεκτρο όσμωση (για μη φορτισμένα διαλύματα) Ηλεκτρο διαταραχή (για φορτισμένα και μη διαλύματα) Οι παράμετροι που επηρεάζουν το σχεδιασμό ενός ιοντοφορετικού συστήματος διαδερμική χορήγησης είναι ο τύπος του χρησιμοποιούμενου ηλεκτροδίου, η ένταση του ρεύματος, το ph του συστήματος, η ύπαρξη κοινών ιόντων και η φύση της προς διαπέραση ουσίας. Έχουν γίνει αρκετές έρευνες σχετικά με την ιοντοφόρεση και υπάρχει πλούσια βιβλιογραφία. Έχει δειχθεί ότι ο συνδυασμός της ιοντοφόρεσης με την ηλεκτροφόρηση είναι πολύ πιο αποτελεσματικός στη διαδερμική μεταφορά συγκριτικά με τη χρήση καθεμιάς από τις τεχνικές ξεχωριστά. Οι περιορισμοί στα ιοντοφορετικά συστήματα περιλαμβάνουν την ένταση του ρεύματος που είναι ανεκτή και επιτρεπτή από τον ανθρώπινο οργανισμό (0.5 ma/cm 2 ) και η μη αντιστρεπτή φθορά που προκαλείται στο φραγμό της επιδερμίδας. Επίσης, δεν εμφανίζει αποτελέσματα στην ενίσχυση της διαπερατότητας μορίων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο των 7000 Da 18,19. Χρήση θερμοκρασίας (thermophoresis) Η θερμοκρασία του ανθρώπινου δέρματος διατηρείται με διάφορους μηχανισμούς στους 32 ο C. Μελέτες in vitro έδειξαν αύξηση της ροής 2 ως 3 φορές για 7-8 ο C αύξηση της θερμοκρασίας της επιφάνειας του δέρματος. Η αύξηση στη διαπερατότητα μετά την θερμική κατεργασία οφείλεται στην αύξηση της διάχυσης

26 του φαρμάκου στο φορέα και στην επιδερμίδα λόγω της αυξημένης διαλυτοποίησης των λιπιδίων. Έχει βρεθεί in vivo η αύξηση της διαπερατότητας ουσιών όπως η νιτρογλυκερίνη και η τεστοστερόνη λόγω της αύξησης της θερμοκρασίας. Δεν έχει αναφερθεί η μεταφορά μορίων λόγω θερμοκρασίας για μόρια με βάρος μεγαλύτερο από 500Da 18 Υπέρηχοι (ultrasound) Με την τεχνική αυτή εννοείται η χρήση υπερήχων για τη διαδερμική χορήγηση και συχνά αναφέρεται ως sonophoresis. Ο μηχανισμός στον οποίο οφείλεται η αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος περιλαμβάνει το σχηματισμό κοιλοτήτων αέρα ανάμεσα στα λιπίδια μεταξύ των κυττάρων με αποτέλεσμα την διαταραχή της κεράτινης στιβάδας. Οι παράμετροι που επηρεάζουν την απορρόφηση είναι η διάρκεια, η ένταση και η συχνότητα των υπερήχων. Συχνότητες μεταξύ 20 khz ως 16 MHz ενισχύουν την διαδερμική διαπερατότητα, παρ όλα αυτά καλύτερα αποτελέσματα παρατηρούνται για συχνότητες < 100 khz. Αναφέρεται στη βιβλιογραφία η μεταφορά μορίων με βάρος μέχρι 48 kda 18,19. Μαγνητικό πεδίο (magnetophoresis) Με τη μέθοδο αυτή εφαρμόζεται μαγνητικό πεδίο το οποίο δρα ως μια εξωτερική κινητήριος δύναμη στην ενίσχυση της διάχυσης ενός διαμαγνητικού διαλύματος διαμέσου του δέρματος. Η έκθεση του δέρματος στο μανγητικό πεδίο επιφέρει αλλοιώσεις στη δομή οι οποίες συνεισφέρουν στην αύξηση της διαπερατότητας. Μελέτες in vitro με την τεχνική αυτή έδειξαν αύξηση της ροής του βενζοϊκού οξέος, η οποία αυξανόταν με αύξηση της ισχύς του πεδίου 18. Ραδιοσυχνότητες Με τις ραδιοσυχνότητες το δέρμα εκτίθεται σε υψηλή εναλλασσόμενη συχνότητα ( ~ 100kHz), με αποτέλεσμα το σχηματισμό μικροκαναλιών, λόγω της θερμότητας που αναπτύσσεται, κατά παρόμοιο τρόπο με την ακτινοβολία laser. Ο ρυθμός της διαδερμικής χορήγησης ελέγχεται από τον αριθμό και το βάθος των μικροκαναλιών που σχηματίζονται 18. Απομάκρυνση ή παράκαμψη κεράτινης στιβάδας Ακτινοβολία laser Η ακτινοβολία laser χρησιμοποιείται συχνά για την θεραπεία δερματικών παθήσεων όπως η ακμή. Η άμεση και ελεγχόμενη έκθεση του δέρματος στην ακτινοβολία έχει ως αποτέλεσμα την κατάλυση της κεράτινης στιβάδας χωρίς να προκαλείται σημαντική βλάβη στα κατώτερα στρώματα της επιδερμίδας. Με τη μέθοδο αυτή έχει βρεθεί ότι ευνοείται η μεταφορά τόσο λιπόφιλων όσο και υδρόφιλων μορίων. Η έκταση της διαταραχής της κεράτινης στιβάδας ελέγχεται από παραμέτρους όπως το μήκος κύματος της ακτινοβολίας, η διάρκεια, η ενέργεια και ο αριθμός των παλμών και ο ρυθμός επανάληψης των παλμών 18.

27 Συσκευή μικροβελόνων Η συσκευή αυτή αποτελεί μία από τις πρώτες πατέντες στη διαδερμική χορήγηση φαρμάκων. Οι βελόνες αυτές με μήκος mm διαπερνούν την κεράτινη στιβάδα και την επιδερμίδα και εναποθέτουν το φάρμακο 18,19. Σχήμα 12. Σύστημα μικροβελόνων Μεταβολή και τροποποίηση ιδιοτήτων κεράτινης στιβάδας Στην κατηγορία αυτή ανήκουν χημικές ενώσεις οι οποίες αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως επιταχυντές διαβατότητας και αποτελούν την συχνότερη χρησιμοποιούμενη μέθοδο για την αύξηση της διαδερμικής διαπερατότητας. Οι ουσίες αυτές προκαλούν προσωρινή μεταβολή στη διάταξη των πρωτεϊνών και των λιπιδίων της κεράτινης στιβάδας. Η μεταβολή αυτή προκαλεί ανατρέψιμη μείωση στο φραγμό της κεράτινης στιβάδας. Για να μπορέσει μια ουσία να χρησιμοποιηθεί ως επιταχυντής διαβατότητας θα πρέπει να διαθέτει ορισμένες ιδιότητες 20 : Δεν πρέπει να είναι ερεθιστικός ή τοξικός για το δέρμα Κατά την απομάκρυνσή του από το δέρμα, θα πρέπει οι ιδιότητες φραγμού του δέρματος να επαναφέρονται πλήρως και γρήγορα Να έχει ωραία αίσθηση στο δέρμα και να είναι αισθητικά αποδεκτός Να είναι συμβατός με ευρεία κλίμακα εκδόχων και φαρμάκων Η δράση του να είναι ταχεία και η διάρκεια της να είναι προβλέψιμη και επαναλήψιμη Δεν πρέπει να εμφανίζει φαρμακολογική δράση στον οργανισμό Η δράση του να είναι μόνο προς μία κατεύθυνση, δηλαδή να διευκολύνει την απορρόφηση των φαρμάκων από τον οργανισμό και να μην επιτρέπει την έξοδο ουσιών από τον οργανισμό

28 Μηχανισμοί δράσης επιταχυντών διαβατότητας Οι επιταχυντές διαβατότητας, διευκολύνουν τη μεταφορά φαρμάκων στην επιδερμίδα μέσω διαφόρων πολύπλοκων μηχανισμών. Μπορούν να αλλοιώσουν και να τροποποιήσουν τη δομή της κερατίνης, επηρεάζουν τα δεσμοκύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη συνοχή των κερατινοκυττάρων, τροποποιούν τη λιπιδική δομή με αποτέλεσμα να μειώνεται η ιδιότητα του φραγμού της λιπιδικής διπλοστιβάδας και να αλλάζουν το συντελεστή κατανομής της κεράτινης στιβάδας ώστε το φάρμακο να διαχέεται ευκολότερα 21,22,23. Πιο αναλυτικά : Λιπιδική δράση : Οι επιταχυντές δρουν στη λιπόφιλη περιοχή της κεράτινης στιβάδας. Είναι γνωστό ότι διαταράσσουν την οργάνωση των λιπιδίων της κεράτινης στιβάδας με αποτέλεσμα να την καθιστούν πιο διαπερατή. Τα μόρια αυτά εισέρχονται στη λιπιδική διπλοστιβάδα και δημιουργούν μικρές κοιλότητες με αποτέλεσμα να αυξάνεται ο διαθέσιμος όγκος για τη διάχυση του φαρμάκου. Με το μηχανισμό αυτό δρουν η Azone, τα τερπένια, τα λιπαρά οξέα (π.χ. ολεϊκό οξύ), το DMSO και οι αλκοόλες. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις οι επιταχυντές αυτοί δεν αναμιγνύονται ομοιογενώς με τα λιπίδια αλλά σχηματίζουν ξεχωριστές περιοχές ανάμεσα στα λιπίδια ( pool domains). Πρωτεϊνική αλληλεπίδραση : Με αυτό το μηχανισμό, ουσίες όπως τα σουλφοξείδια και τα επιφανειοδραστικά αλληλεπιδρούν με την κερατίνη, των κερατινοκυττάρων με αποτέλεσμα να χαλαρώνουν την πυκνή δομή της και αυτό καθιστά την κεράτινη στιβάδα λιγότερο συμπαγή. Τα μόρια που εμφανίζουν τη δράση τους στις πρωτεΐνες μπορούν να μεταβάλλουν και τους δεσμούς των πεπτιδίων στη διπλοστιβάδα και να δημιουργούν κανάλια νερού ανάμεσα στα κερατινοκύτταρα διευκολύνοντας με τον τρόπο αυτό τη διάχυση του φαρμάκου. Αλλαγή του συντελεστή κατανομής : Πολλοί διαλύτες όταν εισέρχονται στην κεράτινη στιβάδα μεταβάλλουν τις ιδιότητές της καθώς μεταβάλλουν τη χημική ισορροπία με αποτέλεσμα να αυξάνουν την κατανομή ενός δεύτερου μορίου στην κεράτινη στιβάδα. Αυξάνοντας το συντελεστή κατανομής στην υδατική περιοχή μεταξύ των λιπιδικών διπλοστιβάδων αυξάνεται και η ικανότητα διάλυσης λιπόφιλων μορίων στο σημείο εκείνο με αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου. Μικρά πολικά μόρια όπως οι πυρρολιδόνες, η προπυλενογλυκόλη και η αιθανόλη, συσσωρεύονται στην κεράτινη στιβάδα και αυξάνουν την κατανομή του φαρμάκου ή ενός άλλου επιταχυντή, εμφανίζοντας συνεργιστική δράση. Είναι συχνό φαινόμενο να εμφανίζουν οι επιταχυντές διαβατότητας περισσότερους από ένα μηχανισμό δράσης. Πρακτικά λοιπόν, ουσίες που μεταβάλλουν τη διάταξη της λιπιδικής διπλοστιβάδας αυξάνουν και το συντελεστή κατανομής λιπόφιλων φαρμάκων. Επιπλέον, μπορούν να δρουν τόσο στις πρωτεΐνες όσο και στα λιπίδια όπως συμβαίνει στην περίπτωση του DMSO. Τέλος, μπορεί να εμφανίζουν συνεργιστική δράση όπως συμβαίνει για την προπυλενογλυκόλη σε συνδυασμό με το ολεϊκό οξύ. Οι κυριότερες κατηγορίες επιταχυντών είναι : η Αζόνη, τα σουλφοξείδια, οι πυρρολιδόνες, τα λιπαρά οξέα, οι αλκοόλες, η προπυλενογλυκόλη, τα

29 επιφανειοδραστικά, η ουρία, τα τερπένια, τα φωσφολιπίδια και οργανικοί διαλύτες σε υψηλές συγκεντρώσεις. ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΔΙΑΔΕΡΜΙΚΗΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ Ο προσδιορισμός του ρυθμού αποδέσμευσης της ουσίας από τη φαρμακοτεχνική μορφή αποτελεί σημαντικό κριτήριο τόσο για την ποιότητα όσο και για την ανάπτυξη κατάλληλης φαρμακοτεχνικής μορφής για την εκάστοτε δραστική ουσία. Είναι σημαντικό λοιπόν να μπορεί να προσδιοριστεί ο ρυθμός αυτός και για το λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί αρκετές τεχνικές μέτρησης της διαδερμικής διαπερατότητας οι οποίες μπορούν να πραγματοποιηθούν in vitro και in vivo 24. Κύτταρα διάχυσης Τα κύτταρα διάχυσης αποτελούν τη συνηθέστερη μέθοδο προσδιορισμού της διαπερατότητας in vitro 25. Όλοι οι τύποι κυττάρων διάχυσης εμφανίζουν ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά. Αποτελούνται από δύο διαμερίσματα, το ένα περιέχει το ενεργό συστατικό και το άλλο το διάλυμα δέκτη (receptor solution). Χωρίζονται μεταξύ τους με ένα κομμάτι δέρματος ή κάποια άλλη μεμβράνη. Το δέρμα που χρησιμοποιείται μπορεί να προέρχεται από τρωκτικά, προτιμώνται συνήθως άτριχα ποντίκια, ή από ερπετά (φίδια). Για χρόνια οι ερευνητές προσπαθούν να βρουν το κατάλληλο αντίγραφο του ανθρώπινου δέρματος για χρήση στα πειράματα διαδερμικής διαπερατότητας. Προς το παρόν για τη μέτρηση της διαπερατότητας χρησιμοποιείται ανθρώπινο δέρμα το οποίο προέρχεται από πλαστικές εγχειρήσεις ή από πτώματα. Μειονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι το πάχος του δέρματος διαφέρει κάθε φορά. Τα κύτταρα διάχυσης ανάλογα με την κατασκευή τους χωρίζονται σε δύο κατηγορίες τα static και τα flow through. Περαιτέρω τα static μπορούν να έχουν κάθετο ή οριζόντιο σχεδιασμό. Σχήμα 13. Κύτταρο κάθετου σχεδιασμού

30 Σχήμα 14. Κύτταρο οριζόντιου σχεδιασμού Στα κύτταρα με οριζόντιο σχεδιασμό υπάρχει καλύτερη ανάδευση στα δύο διαμερίσματα. Η ανάδευση γίνεται με μαγνητικές ράβδους ανάδευσης κατάλληλου μεγέθους και αποτελεί σημαντικό πρόβλημα σε διάφορους τύπους κυττάρων. Ο στόχος σε ένα κύτταρο διάχυσης είναι η διατήρηση συνθηκών δεξαμενής, για το λόγο αυτό απαιτείται συνεχής ανάδευση ώστε να αποφεύγεται η συγκέντρωση φαρμάκου τοπικά. Έχει δειχθεί ότι με αύξηση της ανάδευσης μειώνεται το στρώμα που σχηματίζεται κάτω από τη μεμβράνη, το οποίο σχηματίζεται όταν η ανάδευση είναι ανεπαρκής, και αυξάνεται η διαπερατότητα. Τα κύτταρα που ανήκουν στους παραπάνω σχεδιασμούς εμφανίζουν ορισμένα πλεονεκτήματα : Είναι ευρύτατα διαδεδομένα Καλύτερος έλεγχος των συνθηκών του πειράματος Δυνατή η διεξαγωγή πειράματος άπειρης δόσης Μέθοδος είναι επαναλήψιμη Μειονέκτημα του σχεδιασμού αυτού είναι ότι η ανανέωση του διαλύματος του δέκτη (receptor solution) γίνεται από τον ερευνητή. Η άλλη κατηγορία των κυττάρων διάχυσης είναι τα κύτταρα flow through τα οποία θεωρείται ότι μιμούνται καλύτερα τις in vivo συνθήκες. Στα κύτταρα αυτά το διάλυμα του δέκτη ανανεώνεται συνεχώς για τη διατήρηση των συνθηκών δεξαμενής. Όπως συμβαίνει και στην προηγούμενη κατηγορία κυττάρων οι ατμοσφαιρικές συνθήκες του πειράματος (υγρασία) είναι ελεγχόμενες, ο κάθετος σχεδιασμός τους επιτρέπει την εναλλαγή της φύσης του φορέα, μπορούν να γίνουν διαδοχικές κατεργασίες με επιταχυντές ή να τοποθετηθεί φαρμακευτικά δραστική ουσία και είναι δυνατή η διεξαγωγή πειραμάτων άπειρης και πεπερασμένης δόσης. Επιπλέον, τα δείγματα παρουσιάζουν καλύτερη ομοιομορφία, το σύστημα δειγματοληψίας μπορεί να αυτοματοποιηθεί και το διάλυμα του δέκτη (receptor solution) ανανεώνεται αυτόματα μέσω αντλίας.

31 Μειονεκτήματα των κυττάρων flow through είναι ότι η ανάμιξη του διαλύματος του δέκτη είναι πολλές φορές ανεπαρκής και ανομοιογενής λόγω του μεγάλου όγκου του και σε πολλά τέτοια συστήματα εγκλωβίζονται φυσαλίδες αέρα κάτω από την επιφάνεια του δέρματος προκαλώντας έτσι αλλαγές στις μετρήσεις καθώς μειώνουν την ελεύθερη επιφάνεια διάχυσης. Επίσης, υδρόφοβα κυρίως φάρμακα απορροφούνται στις πλαστικές σωληνώσεις που χρησιμοποιούνται για τη συλλογή των αποβλήτων 25,26. Σχήμα 15. Κύτταρο διάχυσης flow - through Από όλους τους τύπους κυττάρων διάχυσης ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος είναι ο τύπος του κυττάρου Franz. Σχήμα 16. Κύτταρο Franz 27

32 Ο συγκεκριμένος τύπος κυττάρου εμφανίστηκε πρώτη φορά το 1975 και αποτελείται από ένα μικρό διαμέρισμα δότη και το δοχείο του δέκτη θυμίζει αλτήρα. Το διαμέρισμα του δέκτη συνδέεται με ένα κυλινδρικό σωλήνα που πλαταίνει στο σημείο όπου έρχεται σε επαφή με τη μεμβράνη. Το κεντρικό μέρος του κυττάρου βρίσκεται εμβαπτισμένο σε υδρόλουτρο σταθερής θερμοκρασίας. Το διαμέρισμα του δότη (επάνω μέρος) και μικρό μέρος του διαμερίσματος του δέκτη βρίσκονται σε επαφή με το περιβάλλον. Ο αρχικός σχεδιασμός του κυττάρου υπέστη μερικές αλλαγές όπως η προσθήκη του δακτυλίου «O ring» και το διαμέρισμα του δότη μπορεί να σφραγιστεί. Η ευρύτατη χρήση του κυττάρου Franz οφείλεται στο χαμηλό κόστος του, η συνολική διαδικασία δεν είναι χρονοβόρα και είναι επαναλήψιμη μέθοδος. Μειονεκτήματά του είναι η σχετικά κακή ανάμιξη του συνολικού όγκου του διαλύματος λόγω του στενού σχήματος του κυλίνδρου και είναι συχνός ο σχηματισμός ενός στρώματος κάτω από την επιφάνεια του δέρματος εξαιτίας της κακής ανάδευσης 27. Τεχνική μικροδιάλυσης Η τεχνική της μικροδιάλυσης είναι μία ημι-επεμβατική μέθοδος δειγματοληψίας για τη μέτρηση ενδογενών και εξωγενών διαλυτών στον εξωκυττάριο ιστό. Χρησιμοποιείται στην νευροφυσιολογία για την μελέτη του εγκεφάλου των πειραματόζωων για περισσότερα από 20 χρόνια. Από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 η τεχνική έχει προσαρμοστεί και για δερματολογική έρευνα 28. Η μικροδιάλυση είναι μια τεχνική η οποία μετρά την κατανομή μιας χημικής ουσίας που εφαρμόζεται στο δέρμα, στον εξωκυττάριο χώρο κάτω από το σημείο του δέρματος που εκτίθενται στην ουσία αυτή. Μπορεί να εφαρμοστεί in vitro, in vivo και ex vivo. Η αρχή της τεχνικής βασίζεται στην παθητική διάχυση μιας ουσίας σε όλη την επιφάνεια της ημιπερατής μεμβράνης του καθετήρα που εισάγεται στο χόριο παράλληλα στην επιφάνεια του δέρματος με αναισθησία ή χωρίς. Μέσω αντλίας εγχέεται από τον καθετήρα φυσιολογικό διάλυμα με ροή μl/min ώστε να παρομοιάζει τη ροή του αίματος και το οποίο έρχεται σε ισορροπία με το εξωκυττάριο υγρό των γύρω ιστών. Γίνεται ανταλλαγή ουσιών μικρότερων από τους πόρους της μεμβράνης καθώς το υγρό περνάει μέσα από τον καθετήρα. Η αρχή της μικροδιάλυσης συγκρίνεται με ένα τεχνητό αγγείο αίματος. Η ανταλλαγή ουσιών γίνεται σύμφωνα με το δεύτερο νόμο διάχυσης του Fick γιατί η συγκέντρωση μεταβάλλεται με το χρόνο. Η ταχύτητα με την οποία το σύστημα έρχεται σε ισορροπία είναι ανάλογη του ρυθμού διάχυσης της ουσίας στο μέσο, της επιφάνειας και της μεμβράνης που χρησιμοποιούμε. Τα δείγματα λαμβάνονται ανά τακτά χρονικά διαστήματα και αναλύονται 29,30.

33 Σχήμα 17. Προσομοίωση τεχνικής μικροδιάλυσης Κύριο χαρακτηριστικό της μικροδιάλυσης είναι η ικανότητα για συνεχή παρακολούθηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στους εξωκυττάριους ιστούς σε διάφορα τμήματα του σώματος. Η μέτρηση του φαρμάκου γίνεται πριν αυτό να εισέλθει στη συστηματική κυκλοφορία γι αυτό το λόγο η μέθοδος είναι κατάλληλη για τη μελέτη του μεταβολισμού του δέρματος 29,31. Στη μικροδιάλυση χρησιμοποιούνται δύο τύποι καθετήρα : ο γραμμικός (linear) και ο κάθετος (concentric). Ο γραμμικός τύπος καθετήρα χρησιμοποιείται περισσότερο γιατί είναι πιο λεπτός και η κατασκευή του είναι πιο απλή και λιγότερο δαπανηρή 31. Σχήμα 18. Κάθετος καθετήρας Σχήμα 19. Οριζόντιος καθετήρας

34 Μειονέκτημα της τεχνικής της μικροδιάλυσης είναι ότι η εισαγωγή του καθετήρα προκαλεί μικρή ζημιά στους ιστούς και σε ορισμένους ιστούς όπως ο εγκέφαλος, το συκώτι, η καρδιά και οι πνεύμονες η εισαγωγή του καθετήρα γίνεται χειρουργικά. Ένας ακόμα περιορισμός της μεθόδου είναι ότι εξαρτάται από την ταχύτητα ροής του υγρού και από την ευαισθησία της μεθόδου ανάλυσης. Όσο μειώνεται η συγκέντρωση του δείγματος και αυξάνεται η ροή η ανάλυση γίνεται με αναλυτικές τεχνικές υψηλής ευαισθησίας όπως HPLC, LG/MS/MS 32. Τεχνική tape stripping Η μέθοδος αυτή βασίζεται στον προσδιορισμό της ποσότητας διαφόρων χημικών στο εξωτερικό στρώμα της επιδερμίδας, την κεράτινη στιβάδα, η οποία θεωρείται ως το καθοριστικό εμπόδιο για την απορρόφηση από το δέρμα. Ο απλούστερος τρόπος μείωσης του φραγμού είναι με την απομάκρυνσή του. Η τεχνική περιλαμβάνει τη διαδοχική αφαίρεση μικροσκοπικών στρωμάτων (συνήθως 0,5 έως 1 mm) της κεράτινης στιβάδας. Γίνεται συνήθως με την τοποθέτηση μιας κολλητικής ταινίας επάνω στην επιφάνεια του δέρματος, η οποία πιέζεται ελαφρά για να εξασφαλιστεί μια καλή επαφή με το δέρμα και στη συνέχεια απομακρύνεται με μια απότομη ανοδική κίνηση. Συνήθως, η ποσότητα της κεράτινης στιβάδας που αφαιρείται δεν είναι γραμμικώς ανάλογη με το αριθμό των ταινιών που χρησιμοποιήθηκαν. Η διαδικασία είναι σχετικά ανώδυνη και μη επεμβατική, δεδομένου ότι απομακρύνονται μόνο τα νεκρά κύτταρα (κερατινοκύτταρα). Η επιδερμίδα ανταποκρίνεται ακαριαία για την αποκατάσταση του φραγμού της. Στη συνέχεια η ποσότητα που αφαιρέθηκε προσδιορίζεται με την κατάλληλη αναλυτική τεχνική. Αν και η τεχνική tape stripping φαίνεται να είναι απλή και εύκολη στην εφαρμογή, υπάρχουν ορισμένες παράμετροι που επηρεάζουν την ποσότητα των κερατινοκυττάρων που αφαιρούνται με μία μόνο ταινία. Αυτές είναι ο τρόπος που εφαρμόζεται η τεχνική, η ενυδάτωση του δέρματος, η συνοχή μεταξύ των κυττάρων (αύξηση του βάθους της κεράτινης στιβάδας), το σημείο εφαρμογής πάνω στο σώμα και οι ενδοατομικές διαφορές. Επίσης, σημαντική παράμετρος είναι η ίδια η ταινία που χρησιμοποιείται διότι ανάλογο την εταιρία, οι ταινίες διαφέρουν στο σχήμα, στο μέγεθος, στην επιφάνεια που μπορούν να καλύψουν, στη σύνθεση και στις προσκολλητικές ιδιότητες. Η μέθοδος αυτή βρίσκει εφαρμογή σε διάφορους τομείς όπως : η εκτίμηση της ιδιότητας φραγμού του δέρματος, η έρευνα σχετικά με την δερματοπαθολογία, η παρακολούθηση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων, η αξιολόγηση του δέρματος των ζώων ως υποκατάστατο του ανθρώπινου δέρματος κ.α. 29,31,33

35 Σχήμα 20. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας Άλλες τεχνικές Για την αξιολόγηση της in vitro διαδερμικής διαπερατότητας χρησιμοποιούνται και κάποιες ακόμα τεχνικές οι οποίες είναι : Φασματοσκοπικές τεχνικές Μοντέλο Saarbruecken Φασματοσκοπικές τεχνικές Στη μελέτη της in vivo και in vitro διαπερατότητας χημικών ουσιών εφαρμόζεται μια ποικιλία φασματοσκοπικών μεθόδων, η συντριπτική πλειοψηφία των οποίων βασίζεται στην ακτινοβολία υπερύθρου (IR) και στην φασματοσκοπία Raman. Το πιο σημαντικό πλεονέκτημα αυτών των τεχνικών είναι ότι είναι γρήγορες, μη επεμβατικές, και ορισμένες από αυτές μπορούν να παρέχουν σε πραγματικό χρόνο στοιχεία για τη διαπέραση ουσιών μέσω του δέρματος. Η υπέρυθρη φασματοσκοπία χρησιμοποιείται κυρίως σε συνδυασμό με το μετασχηματισμό Fourier γεγονός που βελτίωσε δραματικά την απόκτηση των φασμάτων με σχετικά λιγότερο θόρυβο, αυξημένη ευαισθησία και βελτιωμένη ανάλυση. Σήμερα, η τεχνική FTIR-ATR είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη τεχνική φασματοσκοπίας για τη μελέτη της κινητικής της διαπερατότητας και έχουν γίνει

36 εμπορικά διαθέσιμοι διάφοροι τύποι αναλυτικών συσκευών που βασίζονται στην φασματοσκοπία υπερύθρου. Σε αυτές τις συσκευές, μία δέσμη υπερύθρων εκπέμπεται μέσω ενός διαφανούς κρυστάλλου, ο οποίος είναι σε επαφή με το δείγμα δέρματος. Κατά τη διάρκεια της διέλευσης μέσα από το κρύσταλλο, η δέσμη της υπέρυθρης ακτινοβολίας διεισδύει στο δείγμα και ως αποτέλεσμα, το δέρμα απορροφά την εκπεμπόμενη ακτινοβολία σε συγκεκριμένες συχνότητες που αντιστοιχούν στο φάσμα απορρόφησης της προσδιοριζόμενης ουσίας. Η τεχνική εφαρμόζεται και απ ευθείας πάνω στο δέρμα και η διάχυση στην κεράτινη στιβάδα παρακολουθείται με αύξηση της απορρόφησης στο IR. Περιορισμός της μεθόδου αυτής είναι ότι εφαρμόζεται μόνο για ουσίες που είναι ενεργές στην υπέρυθρη ακτινοβολία 29,34. Σχήμα 21. Σχηματική απεικόνιση FTIR-ATR Μοντέλο Saarbruecken Αυτός ο τύπος κυττάρου θεωρείται ότι μιμείται καλύτερα τις in vivo συνθήκες, καθώς το ίδιο το δέρμα λειτουργεί ως δέκτης. Η απουσία διαλύματος δέκτη έχει ως αποτέλεσμα την αποφυγή της μη φυσιολογικής ενυδάτωσης του δέρματος 35. Σχήμα 22. Κύτταρο Saarbruecken 36

37 Μέτρηση στο πλάσμα Ο βαθμός απορρόφησης των χημικών ουσιών από το δέρμα μπορεί να αξιολογηθεί είτε αναλύοντας την αρχική ουσίας ή/και τον/τους μεταβολίτη/ες της στο πλάσμα, στον εκπνεόμενο αέρα, ή στα ούρα. Η ποσότητα που απορροφάται μπορεί να εκτιμηθεί μετρώντας τη συγκέντρωση ενός βιολογικού δείκτη ή με μέτρηση της ακτινοβολίας σε περίπτωση ραδιοσημασμένης ένωσης. Η ποσότητα μιας χημικής ουσίας που μετράται μετά από δερματική έκθεσης συγκρίνεται με μια γνωστή ποσότητα αναφοράς, για παράδειγμα, μετά από ενδοφλέβια χορήγηση ή μετά από εισπνοή. Συγκρίνοντας είτε τη συνολική εκκρινόμενη ποσότητα μιας χημικής ουσίας είτε την περιοχή κάτω από το προφίλ συγκέντρωσης στο διάγραμμα πλάσμα-χρόνου (AUC) και από τις δύο οδούς χορήγησης, μπορεί να υπολογιστεί η ποσότητα που απορροφάται διαδερμικά. Από την απορροφούμενη ποσότητα, την έκταση του δέρματος που εκτίθεται και την διάρκεια της έκθεσης, υπολογίζεται και ο μέσος ρυθμός διαδερμικής απορρόφησης με το χρόνο 29. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΥΠΟΨΗΦΙΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Τα τελευταία 30 χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στον τομέα της κατανόησης και λειτουργίας του δέρματος, που αποτελεί σημαντικότατο φραγμό στην είσοδο ουσιών στον ανθρώπινο οργανισμό. Έρευνες έχουν εφεύρει μαθηματικούς αλγόριθμούς που μπορούν να προβλέψουν την από του δέρματος διαπερατότητα, ώστε η φυσικοχημική συμβατότητα του φαρμάκου να ελέγχεται in silico πριν την υλοποίηση οποιουδήποτε πειράματος 37. Παρ όλη την ανάπτυξη και έρευνα η λίστα τον υποψηφίων φαρμάκων για διαδερμική χορήγηση δεν έχει διευρυνθεί και τα κριτήρια για την επιλογή παραμένουν τα ίδια. Η επιλογή ενός φαρμάκου υποψηφίου για διαδερμική χορήγηση βασίζεται στις φυσικοχημικές του ιδιότητες και στα φαρμακοκινητικά του χαρακτηριστικά 37,38,39. Κατ αρχάς, το φάρμακο θα πρέπει να διαθέτει κατάλληλη λιποφιλία ώστε να διαχυθεί και να εισέλθει από την κεράτινη στιβάδα, πρωτού περάσει στη συστηματική κυκλοφορία. Περνώντας την κεράτινη στιβάδα, το φάρμακο θα πρέπει να διαθέτει και υδρόφιλα στοιχεία ώστε να διαχυθεί στην ζώσα επιδερμίδα η οποία εμφανίζει μεγαλύτερη υδροφιλία σε σχέση με την κεράτινη στιβάδα. Ιδανικά το φάρμακο θα πρέπει να διαθέτει τόσο λιπόφιλα όσο και υδρόφιλα χαρακτηριστικά 38. Επιπλέον, πολύ σημαντικό ρόλο έχει το μέγεθος του μορίου, το οποίο προς το παρόν δεν πρέπει να ξεπερνάει τα 500 Da. Η ικανότητα διάχυσης της ουσίας μειώνεται εκθετικά όσο αυξάνεται ο μοριακός όγκος (και ως εκ τούτου, το μοριακό βάρος) επιβάλλοντας με αυτό τον τρόπο περιορισμό στο μέγεθος που χρειάζεται να διαθέτουν διάφορες ουσίες για την μεταφορά τους μέσω του δέρματος. Ο περιορισμός μπορεί να προβλεφθεί από μαθηματικά μοντέλα 37,39. Τα φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν τον βιολογικό χρόνο ημιζωής, τη συνολική κάθαρση από το σώμα, τα επιθυμητά επίπεδα του φαρμάκου στο αίμα σε σταθεροποιημένη κατάσταση (steady state).

38 Αναλυτικότερα, τα επιθυμητά χαρακτηριστικά ενός φαρμάκου υποψήφιο για διαδερμική χορήγηση είναι : Μικρό μοριακό βάρος (<500 Da) ώστε να μπορεί να διαπεράσει την κεράτινη στιβάδα Υψηλή λιπιδική διαλυτότητα ώστε να εμφανίζει καλή διαλυτότητα και στα λιπόφιλα και στα υδρόφιλα μέρη της επιδερμίδας. Εκφράζεται με το συντελεστή κατανομής οκτανόλης/νερού και παίρνει τιμές -1< logp < 6 ώστε να επιτυγχάνεται υψηλός συντελεστής διαπερατότητας Χαμηλό σημείο τήξης (<200 o C) ώστε το φάρμακο να έχει καλή διαλυτότητα στο δέρμα, διότι φάρμακα με πολύ υψηλό σημείο τήξης δεν εμφανίζουν καλή διαλυτότητα ούτε σε υδατικά ούτε σε λιπαρά διαλύματα Χαμηλή ημερήσια δόση (< 20mg/ημερησίως) ώστε να απαιτείται μικρή ποσότητα φαρμάκου για να επιτευχθούν τα θεραπευτικά επίπεδα στο αίμα και κατ επέκταση όσο το δυνατό μικρότερο μέγεθος φαρμακοτεχνικής μορφής Μικρό χρόνο ημι-ζωής (t ½ <24 ώρες), το οποίο απαιτεί συχνότερη χορήγηση και χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα κάτι το οποίο δηλώνει εκτεταμένο φαινόμενο πρώτης διόδου Να μην προκαλεί τοπικά ερεθισμό ή αλλεργία στην περιοχή εφαρμογής Εκτός των παραπάνω χαρακτηριστικών, για την τελική επιλογή ενός φαρμάκου για διαδερμική χορήγηση λαμβάνονται υπόψη και άλλα φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά όπως 40 : Η ολική από του σώματος κάθαρση (Cl τ ) Η συγκέντρωση στο πλάσμα σε κατάσταση steady state (C ss ) Η διαλυτότητα στο νερό στους 25 o C (C water ) (σε σχέση με το ph) Χημική δομή Σταθερά ιονισμού Κ α (pk α = -logk α ) Γνωστές χημικές ασυμβασίες Γνωστές «οδοί» αποικοδόμησης Τοξικότητα του φαρμάκου Υγροσκοπία Στην πράξη δεν είναι δυνατό να ικανοποιούνται όλες οι προϋποθέσεις ταυτόχρονα και όσο το δυνατό στόχος είναι η ουσία να διαθέτει όσο γίνεται περισσότερα από αυτά τα χαρακτηριστικά.

39 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ 41,42,43 Ο πειραματικός σχεδιασμός είναι ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο στον εντοπισμό των παραγόντων εκείνων που επηρεάζουν τα χαρακτηριστικά ποιότητας του τελικού προϊόντος ή της διαδικασίας που μελετάμε και θέλουμε να έχουμε κάτω από στατιστικό έλεγχο. Αν ήταν να δώσουμε έναν ορισμό στη διαδικασία του πειραματικού σχεδιασμού, θα οριζόταν ως μια προσέγγιση σύμφωνα με την οποία μεταβάλλοντας με κατάλληλο τρόπο τις τιμές των παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία ή το αποτέλεσμα της και μπορούμε να καθορίσουμε κατά πόσο οι τιμές αυτών των μεταβλητών και με ποιο τρόπο επηρεάζουν την απόκριση. Με λίγα λόγια ο πειραματικός σχεδιασμός μας βοηθάει στην σχεδίαση των κατάλληλων πειραμάτων, ώστε να βρούμε τις μεταβλητές εκείνες που επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος σε σημαντικό βαθμό και με ποιο τρόπο η μεταβολή των τιμών των μεταβλητών αυτών αντανακλά σε μεταβολή της ποιότητας του τελικού προϊόντος, καταναλώνοντας συγχρόνως τους ελάχιστους δυνατούς πόρους τόσο σε άψυχο όσο και σε έμψυχο δυναμικό. Τα σπουδαιότερα βήματα τα οποία χρησιμοποιούνται για τον σχεδιασμό ενός πειράματος είναι: Περιγραφή του προβλήματος και του στόχου του πειράματος Ανάλυση και επεξεργασία των υπαρχόντων δεδομένων πάνω στο συγκεκριμένο θέμα Επιλογή των παραγόντων που θα μελετηθούν, καθώς και των επιπέδων τους Επιλογή της εξαρτημένης μεταβλητής Επιλογή κατάλληλης τακτικής πειραματικού σχεδιασμού Διεξαγωγή του πειράματος Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του πειράματος Τελικά συμπεράσματα Τα πειράματα πραγματοποιούνται προκειμένου να μελετηθούν διεργασίες ή συστήματα. Γενικά ως διεργασία μπορεί να θεωρηθεί ο συνδυασμός διαφόρων μηχανών, μεθόδων, ανθρώπων που τελικά μετατρέπουν το αρχικά εισαγόμενα στοιχεία (input), για παράδειγμα πρώτες ύλες, σε εξερχόμενο αποτέλεσμα (output), με ένα ή περισσότερα μετρήσιμα χαρακτηριστικά (responses). Μερικοί από τους παράγοντες που επηρεάζουν τη διεργασία είναι ελεγχόμενοι (controllable) σε αντίθεση με άλλους, που είναι μη ελεγχόμενοι (uncontrollable). Η διαδικασία είναι ο προδιαγεγραμμένος τρόπος, η σειρά βημάτων που ακολουθούνται για την επιτέλεση μιας δραστηριότητας. Τα μετρούμενα χαρακτηριστικά ή ιδιότητες μιας διαδικασίας (όπως απόδοση, ιξώδες.) συχνά αναφέρονται και ως εξαρτημένες μεταβλητές (response variables). Όλα τα παραπάνω αποτυπώνονται στο παρακάτω σχήμα.

40 Ελεγχόµενοι παράγοντες x 1 x 2... x p Εισερχόµενα ιεργασία Εξερχόµενα... z 1 z 2 Μη ελεγχόµενοι παράγοντες z q Σχήμα 23. Παράσταση μιας διεργασίας. Ένας σημαντικό παράδειγμα πειραματικού σχεδιασμού αποτελεί η τεχνική του παραγοντικού σχεδιασμού, η οποία είναι αυτή που χρησιμοποιείται συχνότερα, διότι επιτρέπει την ταυτόχρονη μεταβολή των παραγόντων της διεργασίας. Με τον τρόπο αυτό, επιτυγχάνεται ο προσδιορισμός της κύριας επίδρασης (main effect) ενός παράγοντα στην απόκριση, αλλά και η πιθανή αλληλεπίδραση (interaction) των παραγόντων μεταξύ τους. Μία ιδιαίτερη κατηγορία πειραμάτων παραγοντικού σχεδιασμού είναι τα πειράματα διαχωρισμού παραγόντων (screening experiments), με τα οποία γίνεται επιλογή των παραγόντων που έχουν πραγματική επίδραση στη διεργασία και που η επίδραση τους είναι αναμφίβολα διακριτή από το θόρυβο υποβάθρου (background noise). Οι παράγοντες από τους οποίους μπορεί να εξηγηθεί το μεγαλύτερο ποσοστό της μεταβλητότητας της υπό μελέτη διεργασίας ονομάζονται σημαντικοί (significant) σε αντίθεση με τους μη σημαντικούς παράγοντες. Όταν τα δεδομένα δεν είναι επαρκή για τον έλεγχο της σημαντικότητας με στατιστικά κριτήρια, προτιμώνται οι όροι «ενεργός» και «μη ενεργός παράγοντας» (active και nonactive factor). Η απλούστερη περίπτωση είναι αυτή κατά την οποία μελετάται η επίδραση του παράγοντα Π 1, που μπορεί να λάβει δύο επίπεδα, Α και Β, στην απόκριση Υ. Επιδιωκόμενος στόχος είναι να εξεταστεί εάν η μεταβολή στην απόκριση του συστήματος οφείλεται στην αλλαγή των επιπέδων του παράγοντα (διαφορικό αποτέλεσμα, differential effect). Η εκτίμηση της επίδρασης του παράγοντα Π 1 μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: Ως προς μία πραγματική κατάσταση αναφοράς (μοντέλο κατάστασης αναφοράς, reference state model). Ως προς μία υποθετική κατάσταση αναφοράς (μοντέλο παρουσίας-απουσίας, presence-absence model).

41 Η σχηματική απεικόνιση των μοντέλων πραγματικής κατάστασης αναφοράς και υποθετικής κατάστασης αναφοράς φαίνεται στο Σχήμα 21. Y Μοντέλο Μοντέλο Β β 1,Β/Α β 0 β 0 β 1,Α β 1,Β Υποθετική κατάσταση αναφοράς Κατάσταση αναφοράς Α Σχήμα 24: Σχηματική απεικόνιση των μοντέλων πραγματικής κατάστασης αναφοράς και υποθετικής κατάστασης αναφοράς. Έτσι, αν το επίπεδο Α του παράγοντα Π 1 θεωρηθεί το επίπεδο αναφοράς, το μοντέλο μπορεί να γραφεί: Y = β ο + ε Y = β ο + β 1,Β/Α + ε παράγοντας Π 1 στην κατάσταση Α παράγοντας Π 1 στην κατάσταση Β όπου β ο σταθερά (η πραγματική ή θεωρητική απόκριση) και ε το (τυχαίο) πειραματικό σφάλμα, με μέση τιμή μηδέν. Έτσι, ο όρος β 1,Β/Α περιγράφει την επίδραση στην απόκριση κατόπιν μεταβολής της κατάστασης του Π 1 από την κατάσταση Α στη Β. Το μοντέλο αυτό εισάγει μια αδικαιολόγητη ασυμμετρία ανάμεσα στα δύο επίπεδα, καθώς η επιλογή του ενός από τα δύο επίπεδα ως κατάσταση αναφοράς είναι αυθαίρετη. Και αυτό διότι η επιλογή του επίπεδου εκείνου που διαλέγουμε ως κατάσταση αναφοράς δεν στηρίζεται σε αντικειμενικά κριτήρια αλλά σε υποκειμενικά.

42 ΜΙΡΤΑΖΑΠΙΝΗ Χημική ονομασία: 1,2,3,4,10,14b-hexahydro-2-methylpyrazino [2,1-a] pyrido [2,3-c] benzazepine Μοριακός τύπος: C 17 H 19 N 3 Συντακτικός τύπος: Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά Η μιρταζαπίνη, έχει μοριακό βάρος , είναι ασθενής βάση (pka 7.1), και είναι πρακτικά αδιάλυτη στο νερό και στο εξάνιο. Είναι διαλυτή στην άνυδρη αλκοόλη, τον αιθέρα, στη μεθανόλη, στο τολουόλιο και στο ακετονιτρίλιο. Η ουσία έχει σημείο τήξεως ο C και ο συντελεστής κατανομής του φαρμάκου σε σύστημα οκτανόλης νερού στους 25 ο C είναι 2.9. Η μιρταζαπίνη είναι χειρόμορφο φάρμακο και κυκλοφορεί ως μίγμα των δύο εναντιομερών R(+) S(-) σε αναλογία 50:50. Είναι φωτοευαίσθητη ουσία και πρέπει να προστατεύεται από το φως 44. Φαρμακοδυναμικά χαρακτηριστικά Η μιρταζαπίνη είναι ένα τετρακυκλικό αντικαταθλιπτικό διπλής δράσης που επηρεάζει τόσο την νοραδρενεργική όσο και την σεροτονινεργική νευροδιαβίβαση μέσω του προσυναπτικού άλφα-2 ανταγωνισμού, το οποίο το καθιστά μοναδικό μεταξύ των διαφόρων αντικαταθλιπτικών. Έχει χαμηλή τοξικότητα και απευθύνεται σε ασθενείς με μέτρια προς βαριά κατάθλιψη. Η σεροτονινεργική νευροδιαβίβαση εκφράζεται μέσω των 5-ΗΤ υποδοχέων επειδή η μιρταζαπίνη είναι ένας μετασυναπτικός σεροτονινεργικός 5-ΗΤ2 και 5-ΗΤ3 ανταγωνιστής. Επιπλέον, η μιρταζαπίνη έχει μικρή συγγένεια με τους 5-ΗΤ1 υποδοχείς και έχει πολύ αδύναμες αντιχολινεργικές και ισταμινικές (H1) ανταγωνιστικές ιδιότητες. Η μικρή αυτή συγγένεια με αυτούς τους κεντρικούς και περιφερικούς υποδοχείς μπορεί να εξηγήσει γιατί εμφανίζει παρόμοιο θεραπευτικό προφίλ με τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά φάρμακα ή με τους αναστολείς της σεροτονίνης.

43 Είναι εκλεκτικός ανταγωνιστής των προσυναπτικών α2 αυτουποδοχέων και α2- ετεροϋποδοχέων που ελέγχουν την απελευθέρωση της νορεπινεφρίνης και της σεροτονίνης και εκεί οφείλεται και η δράση της. Κατ αυτόν τον τρόπο διευκολύνεται η απελευθέρωση της συναπτικής νορεπινεφρίνης 45,46. Η μιρταζαπίνη παρουσιάζει ταχεία βελτίωση των συμπτωμάτων της κατάθλιψης, με ελάχιστες αντιχολινεργικές ανεπιθύμητες ενέργειες, ούτε και με ανεπιθύμητες ενέργειες που συνδέονται με τη σεροτονίνη όπως ναυτία, κεφαλαλγία, άγχος, ανησυχία, νευρικότητα ή σεξουαλική δυσλειτουργία. Ο ανταγωνισμός των 5-HT3 υποδοχέων βοηθά στην αντιμετώπιση του εμετού που προκαλείται από νευροπαθητικό πόνο και σε ορισμένες περιπτώσεις ασθενών με καρκίνο 46,47. Να σημειωθεί ότι τα εναντιομερή της μιρταζαπίνης παρουσιάζουν εκλεκτική δράσης στους υποδοχείς. Τέλος, εκτός από την αρχική δραστική ουσία, φαρμακολογική δράση εμφανίζει και ο ενεργός μεταβολίτης διμεθυλ-μιρταζαπίνη. Έχει βρεθεί όμως ότι είναι 3 4 φορές λιγότερο δραστικός σε σχέση με την μιρταζαπίνη 54. Φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά Η μιρταζαπίνη απορροφάται εύκολα από το γαστρεντερικό σωλήνα μετά την από του στόματος χορήγησή της και η βιοδιαθεσιμότητά της δεν φαίνεται να επηρεάζεται από την ύπαρξη τροφής στο στομάχι. Η μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα, περίπου 40 ng/ml επιτυγχάνεται μετά από 1,8 ώρες μετά από δόση 15mg. Ακολουθεί γραμμικό φαρμακοκινητικό μοντέλο για θεραπευτικές δόσεις από mg/ml 45,49,54. Η απόλυτη βιοδιαθεσιμότητα μετά από ενδοφλέβια χορήγηση 3,5 mg είναι περίπου 50% λόγω του μεταβολισμού πρώτης διόδου από το ήπαρ και δεν διαφέρει σημαντικά από την απόλυτη από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα μετά από χορήγηση 15 mg φαρμάκου για επτά μέρες 50. Ο χρόνος υποδιπλασιασμού t ½, μετά από του στόματος χορήγηση κυμαίνεται από ώρες, με τις γυναίκες όλων των ηλικιών να εμφανίζουν σημαντικά μεγαλύτερο χρόνο υποδιπλασιασμού από τους άντρες (37 ώρες για τις γυναίκες, 26 ώρες για τους άντρες) (Remeron TM Product Information). Η σταθεροποιημένη κατάσταση επιτυγχάνεται σε 4 6 μέρες. Η δέσμευση της μιρταζαπίνης από τις πρωτεΐνες του πλάσματος είναι περίπου 85% σε ένα εύρος συγκεντρώσεων μεταξύ mcg/ml. Ο όγκος κατανομής κατά τη διάρκεια 11 ημερών με χορήγηση πολλαπλών δόσεων ήταν 107 ± 42 l και σε σταθεροποιημένη κατάσταση ο συνολικός όγκος κατανομής ήταν 339±125 l/kg ή κατά μέσο όρο 4.5 l/kg σωματικού βάρους 45. Η μιρταζαπίνη μεταβολίζεται κυρίως στο ήπαρ. Σημαντικότερες οδοί βιομετατροπής είναι διμεθυλίωση και η υδροξυλίωση. Η απομάκρυνση του φαρμάκου και των μεταβολιτών του γίνεται κυρίως από τα ούρα (έως 75%) και σε μικρότερο ποσοστό από τα κόπρανα (έως 15%), με το μεγαλύτερο ποσοστό απομάκρυνσης να εμφανίζεται τις τρεις με τέσσερις πρώτες μέρες. Η συνολική κάθαρση που καθορίστηκε μετά από ενδοφλέβια χορήγηση είναι 31 l/h 45,51.

44 Η κάθαρση του φαρμάκου μπορεί να αλλοιωθεί σε περίπτωση ηπατικής ή νεφρικής ανεπάρκεια. Σε άτομα με ηπατική ανεπάρκεια ο χρόνος υποδιπλασιασμού βρέθηκε αυξημένος κατά 40%, η κάθαρση μειώθηκε κατά 33% και η AUC αυξήθηκε κατά 57% 45. Ο χρόνος υποδιπλασιασμού του φαρμάκου δεν βρέθηκε να επηρεάζεται από την ύπαρξη νεφρικής ανεπάρκειας 52. Ηλικιωμένα άτομα εμφανίζουν αυξημένη AUC συγκριτικά με άτομα νεαρότερης ηλικίας, παρ όλα αυτά δεν υπήρξαν διαφορές στην αποτελεσματικότητα μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών 53. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η αξιολόγηση in vitro της διαπερατότητας της μιρταζαπίνης διαμέσου της επιδερμίδας ως πρώτο βήμα για την ανάπτυξη ενός διαδερμικού συστήματος με επιθυμητό ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου, χρησιμοποιώντας πειραματικό σχεδιασμό. Σε αυτά τα πλαίσια μελετήθηκε η επίδραση συγκεκριμένων παραγόντων όπως το είδος και η συγκέντρωση του επιταχυντή διαπερατότητας στη διαπερατότητα της μιρταζαπίνης διαμέσου της επιδερμίδας. Η επιλογή της συγκεκριμένης ουσίας βασίστηκε στα φυσικοχημικά και φαρμακοκινητικά της χαρακτηριστικά. Πιο συγκεκριμένα το φάρμακο έχει ημερήσια δόση mg, μοριακό βάρος , συντελεστή κατανομής οκτανόλης/νερού 2.9, σημείο τήξης ο C και χρόνο ημιζωής ώρες. Τα χαρακτηριστικά αυτά αποτελούν ενδείξεις ότι υπάρχει δυνατότητα ανάπτυξης ενός διαδερμικού συστήματος μιρταζαπίνης.

45 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την ολοκλήρωση της εργασίας ήταν τα εξής: Mirtazapine, ΚΩΔ , Lot MZI , Π.Π.Ε Υδροξείοδιο του νατρίου (NaOH) Lot 6498 για ανάλυση (Merck, Germany) Ακετονιτρίλιο (Acetonitrile) βαθμού HPLC Lot (Fisher, UK) Triethylamin, Merck, Gehalt [GC]> 99%, MW g/mol, , S O phosphoric acid 85%, Merck, Gr for analysis Αιθανόλη 95% Κινεόλη (Cineole) Lot 102H2510 (Sigma Aldrich, Γερμανία) Μινθόλη (Menthol) Lot 110H0454 (Sigma Aldrich, Germany) Λαουροκαπράμη (Azone ) Lot CHP (Chem pacific, USA) N μεθυλο πυρρολιδόνη (NMP) ( ELTON, Greece) Λαουρικό οξύ, Sigma Aldrich, Lot. 54H0251, Germany, Europe, Sigma Grade % Λαουρική Αλκοόλη, Sigma Aldrich, Lot. 101H3486, Germany, Europe, Approx 99% GMO/Myverol, Eastman Kodak, Code 1099 Sodium di-hydrogen Phosphate-2 hydrate (NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O) Lot (Panreac, Barcelona) Γλυκερίνη 85% Lot O (Fagron) Αζίδιο του νατρίου (Sodium Azide) Lot 120H0031 (Sigma Aldrich, Germany) Klucel HF Lot 8572 (Hercules, USA) Νερό βαθμού HPLC και απιονισμένο Μεμβράνη δέρματος, Skin Bank, JN , Section PT, Νο 9

46 ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΟΡΓΑΝΑ Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω: Ηλεκτρονικός ζυγός: Mettler Toledo AT 261, Delta Range (Mettler, Switzerland) Περιστροφική συσκευή εξάτμισης υπό κενό με υδατόλουτρο: Βüchi Rotavapor R-2000 (Βüchi Labotechnik, Switzerland) Υδατόλουτρο υπερήχων: Branson Sonicator 5200 (Branson, U.S.A.) Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού:uv/vis Pharma spec spectrophotometer Shimadzu, με λογισμικό U.V Probe ver 2.10 shimadzu corporation) Συσκευή διήθησης υπό κενό: Millipore Φίλτρα για τη συσκευή διήθησης υπό κενό Millipore: Durapore Membrane filters, 0.45 μm HV Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (HPLC), που περιλαμβάνει: 1. Αντλία υψηλής πιέσεως Spectra System P1000 (Spectra PHysics, U.S.A.) 2. Αυτόματο δειγματολήπτη (auto sampler) Spectra System AS1000 (Spectra PHysics, U.S.A.) 3. Ανιχνευτή υπεριώδους - ορατού Spectra System 2000 (Thermo Separation Products, U.S.A.) ρυθμισμένο σε λ max = 290 nm. 4. Μονάδα ελέγχου του συστήματος από ηλεκτρονικό υπολογιστή Spectra System SN 4000 (Thermo Separation Products, U.S.A.) 5. Ηλεκτρονικό υπολογιστή (Thermo Quest, Inc., U.S.A.) με λογισμικό Chromquest, Version 5.1 (ThermoQuest, U.K.). 6. Στήλη BDS Hypersil C18, 250 x 4.6mm, 5μm Κλίβανος: WT binder (Germany) Περιστρεφόμενος δίσκος: Fischer Scientific, U.S.A. Φυγόκεντρος: Sigma 202 ΜΚ (Sigma, Germany) Ηθμοί: FP VericelTM, FP-450, 13 mm, 0.45 μm (Gelman Sciences, Michingan, U.S.A.) Περιστρεφόμενος αναδευτήρας: ΣΒΣ - Ρολλερ (ΣΒΣ, Σπαιν) Τροποποιημένα κύτταρα του Franz (Crown Glass, Somerville, U.S.A.), με εμβαδόν ανοίγματος cm2 και όγκο διαμερίσματος δέκτη ml. Μεμβράνη πολυαιθυλενίου CoTran 9720 (3Μ, Στ. Παθλ, ΘΣΑ). Υδατόλουτρο: Edmund Bühler D-7400 (Tübingen, Germany).

47 Μαγνητική πλάκα ανάδευσης Cimarec 3, (Thermolyne, U.S.A.) ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματικός σχεδιασμός Για τη μελέτη της διαδερμικής διαπερατότητας της μιρταζαπίνης επιλέχθηκε ο παραγοντικός σχεδιασμός. Οι παράγοντες που επιλέχθηκαν ήταν το είδος του επιταχυντή διαβατότητας και η συγκέντρωση του φαρμάκου. Ο παράγοντας «είδος επιταχυντή διαβατότητας» μελετήθηκε σε επτά επίπεδα, τα οποία ήταν: λαουροκαπράμη (Azone ), και Ν-μεθυλο- πυρρολιδόνη (NMP), κινεόλη, μινθόλη, λαουρικό οξύ, λαουρική αλκοόλη και ο μονοεστέρας της γλυκερόλης (GMO). Η επιλογή των επιταχυντών διαβατότητας έγινε με βάση την χαρακτηριστική ομάδα στη οποία ανήκουν. Ο μονοεστέρας της γλυκερόλης επιλέχτηκες γιατί οι άλλοι εστέρες που δοκιμάστηκαν δεν ήταν συμβατοί με το φορέα. Ο δεύτερος παράγοντας, η «συγκέντρωση» του επιταχυντή διαβατότητας μελετήθηκε σε τρία επίπεδα: 0, 5 και 10% (o/o). Επιλέχτηκαν αυτές οι συγκεντρώσεις γιατί από προηγούμενες μελέτες αυτά είναι τα συνήθη επίπεδα που μελετώνται στα διαδερμικά συστήματα απορρόφησης. Οι παράγοντες και τα επίπεδα του παραγοντικού σχεδιασμού ο οποίος συμβολίζεται με , συνοψίζονται στον πίνακα. Παράγοντας Είδος επιταχυντή Συγκέντρωση επιταχυντή Αζόνη 0% NMP 5% Επίπεδα Κινεόλη 10% Μινθόλη Λαουρικό οξύ Λαουρική αλκοόλη GMO Πίνακας I. Παραγοντικός σχεδιασμός. Ο αριθμός των συνταγών των κυττάρων διάχυσης που προκύπτουν με τον παραπάνω πειραματικό σχεδιασμό είναι δεκαπέντε, σύμφωνα με το υποστηρικτικό πρόγραμμα πειραματικού σχεδιασμού που χρησιμοποιήθηκε (Design Expert version , Stat Ease Inc, Mineapolis, USA). Φάσμα απορροφήσεως υπεριώδους Προκειμένου να πραγματοποιηθεί ανάλυση των δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή υπεριώδους ορατού, είναι απαραίτητο οι μετρήσεις να πραγματοποιηθούν στο μήκος κύματος που αντιστοιχεί στη μέγιστη απορρόφηση της ουσίας (λmax), για δύο λόγους: α) για την επίτευξη

48 μέγιστης ευαισθησίας και β) την ελαχιστοποίηση της μεταβολής των απορροφήσεων εξαιτίας μικρών μεταβολών του μήκους κύματος κατά τη διάρκεια των μετρήσεων, αφού στο λmax παρατηρείται πλατό του φάσματος απορρόφησης. Για το σκοπό αυτό ελήφθη φάσμα υπεριώδους σε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού (Shimatzu spectrophotometer) της δραστικής ουσίας. Παρασκευάστηκε μητρικό διάλυμα μιρταζαπίνης με συγκέντρωση 1 mg/ml, ζυγίζοντας g ουσίας σε 100 ml ακετονιτριλίου σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη. Στη συνέχεια έγινε αραίωση του μητρικού διαλύματος αφού θεωρήθηκε αρκετά πυκνό ως διάλυμα για να χρησιμοποιηθεί σαν διάλυμα μέτρησης στο φασματοφωτόμετρο. Η αραίωση έγινε παίρνοντας 1 ml από το μητρικό διάλυμα σε 100 ml κινητής φάσης. Αρχικά εισήχθηκε σε κυψελίδα χαλαζία πάχους 1 cm (No 6030-UV, Hellma, Γερμανία) διάλυμα κινητής φάσης που χρησιμοποιήθηκε σαν τυφλό για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου. Μετά το μηδενισμό έγινε μέτρηση με το αραιωμένο μητρικό διάλυμα από τα 600 μέχρι τα 200 nm για τη διαπίστωση των μέγιστων κορυφών απορρόφησης της δραστικής ουσίας. Υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) Για την ανάλυση των δειγμάτων της μιρταζαπίνης χρησιμοποιήθηκε κατάλληλα τροποποιημένη χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως η οποία περιλάμβανε τα παρακάτω στοιχεία (Πίνακας VII): 56 Υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) Είδος στήλης BDS Hypersil C x 4.6 mm, 5μm Κινητή φάση Η 2 Ο : ΑCN, 80 : 20 v/v, 0.3% TEA, ph=3 Ροή 1.0 ml/min Μήκος κύματος 290 nm Όγκος δείγματος 50 μl Θερμοκρασία Περίπου 20ºC Πίνακας II. Μέθοδος ανάλυσης Κινητή φάση Για τη δημιουργία 1 L κινητής φάση ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: Σε 900 ml Η 2 Ο βαθμού HPLC, προστίθενται 3 ml τριαιθυλαμίνης (ΤΕΑ) και ρυθμίζεται το ph στο 3 με ορθο-φωσφορικό οξύ. Το διάλυμα, μετά την ρύθμιση του ph, εισάγεται σε ογκομετρική φιάλη του 1 L και προστέθηκε H 2 O βαθμού HPLC μέχρι την χαραγή. Λαμβάνεται ποσότητα 800 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα και με ποσότητα 200 ml ακετονιτριλίου αναδεύονται στους υπερήχους και στη συνέχεια διηθούνται με κατάλληλους ηθμούς.

49 Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων Για την επιβεβαίωση της μεθόδου αναλύσεως παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα διάφορων συγκεντρώσεων ως εξής. Αρχικά παρασκευάστηκε μητρικό διάλυμα μιρταζαπίνης συγκέντρωσης 0.1 μg/ml. Ζυγίστηκαν 0.01 g δραστικής ουσίας και διαλύθηκαν σε 100 ml ακετονιτριλίου βαθμού HPLC σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη. Από το μητρικό διάλυμα της μιρταζαπίνης με κατάλληλες αραιώσεις παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα 1, 3, 5, 7, 10, 20 μg/ml. Στη συνέχεια από την αραίωση στα 10 μg/ml παρασκευάστηκε ακόμα μία σειρά πρότυπων διαλυμάτων με συγκεντρώσεις 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 μg/ml. Τέλος λαμβάνοντας κατάλληλη ποσότητα από το μητρικό διάλυμα έγινε αραίωση στο 1 μg/ml και έπειτα παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα με συγκεντρώσεις 40, 50, 60, 80, 100 ng/ml ώστε να διαπιστωθεί το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Το όριο ανίχνευσης ήταν τα 40 ng/ml. Πειράματα προσδιορισμού συμβατότητας των επιταχυντών διαπερατότητας με το φορέα Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό, τα επίπεδα του παράγοντα «είδος επιταχυντή διαπερατότητας» έφταναν μέχρι και το 10 % (ο/ο). Επομένως ο φορέας πρέπει να περιέχει την ανάλογη ποσότητα, ώστε να επαρκεί για τη διαλυτοποίηση του επιταχυντή σε συγκέντρωση 10% (ο/ο) Για την παρασκευή του φορέα παρασκευάστηκε διάλυμα αιθανόλης 95 ο /γλυκερίνης/ Η 2 Ο σε αναλογία 60:15:25 v/v σε κατάλληλη ογκομετρική φιάλη. Στη συνέχεια 9 ml του διαλύματος του φορέα μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια και στη προστέθηκε με κατάλληλη πιπέτα ποσότητα 1 ml από τους παρακάτω επιταχυντές : λαουροκαπράμη (Azone ), N- μέθυλο-πυρρολιδόνη (NMP), κινεόλη, μινθόλη, λαουρικό οξύ, λαουρική αλκοόλη, μονοεστέρας της γλυκερόλης (GMO). Τα διαλύματα που προέκυψαν αναδεύτηκαν και αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες ώστε να διαπιστωθεί η πλήρης ή μη διάλυση του επιταχυντή στον συγκεκριμένο φορέα. Προσδιορισμός της διαλυτότητας κορεσμού Για την παρασκευή των φορέων του φαρμάκου, οι οποίοι ήταν γέλες, προηγήθηκε ο προσδιορισμός της διαλυτότητας κορεσμού του φαρμάκου σε πρόδρομους φορείς, οι οποίοι είχαν την ίδια σύσταση με τις γέλες, αλλά δεν περιείχαν παράγοντα σχηματισμού γέλης (υδροξυ-προπυλοκυτταρίνη). Το περιεχόμενο των γελών, άρα και των πρόδρομων φορέων, σε επιταχυντή διαβατότητας καθορίστηκε από τον παραγοντικό σχεδιασμό και συνοψίζεται στον πίνακα : Φορέας ΕtOH/ γλυκερίνη/η2ο 5ml συνολικός όγκος Συγκέντρωση επιταχυντή διαβατότητας 5% ή 10% Συγκέντωση φαρμάκου Στη διαλυτότητα κορεσμού Πίνακας III. Σύνθεση γελών

50 Παρασκευάστηκε και διάλυμα χωρίς την προσθήκη επιταχυντή διαπερατότητας ώστε να αποτελεί το σημείο αναφοράς. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής : Σε συνολικό όγκο 5ml ανάλογα με την ποσότητα του επιταχυντή διαπερατότητας (0 ή 5 ή 10% ο/ο), εισήχθησαν 4.5 ml ή 4.75 ml του φορέα (αιθανόλη/γλυκερίνη/η 2 Ο 60:15:25) σε κάθε φιαλίδιο. Το παραπάνω διάλυμα αναδεύτηκε μέχρις ότου την πλήρη διάλυση του επιταχυντή και στη συνέχεια υπό συνεχή ανάδευση εισήχθηκε περίσσεια της δραστικής ουσίας έτσι ώστε να σχηματιστεί εναιώρημα. Στη συνέχεια τα δείγματα εισήχθησαν σε κλίβανο για 24 ώρες και σε θερμοκρασία 25 ο C. Ύστερα από παραμονή των δειγμάτων εντός κλιβάνου για 24 ώρες, στα υπέρκορα διαλύματα έγινε φυγοκέντρηση στις 8000 στροφές στους 25º C για 10 λεπτά το καθένα. Στη συνέχεια έγινε αραίωση των φυγοκεντρημένων δειγμάτων και ανάλυσή τους με υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC). Κάθε πρόδρομος φορέας παρασκευάστηκε τρεις φορές. Παρασκευή γελών Η παρασκευή των γελών έγινε όπως και στην περίπτωση των διαλυτοτήτων κορεσμού με εισαγωγή σε κάθε φιαλίδιο του φορέα που επιλέχθηκε (EtOH/γλυκερίνη/νερό 60:15:25) και του επιταχυντή διαπερατότητας σε ποσοστό καθοριζόμενο από τον επιλεγμένο πειραματικό σχεδιασμό. Αφού έγινε ανάδευση των συστατικών με μαγνητικό αναδευτήρα, στη συνέχεια έγινε εισαγωγή της δραστικής ουσίας σε ποσότητα που καθορίστηκε στο 90% της διαλυτότητας κορεσμού του κάθε επιταχυντή. Το βήμα αυτό έγινε με σκοπό να περιοριστεί η πιθανότητα καθίζησης ιζήματος κατά την διάρκεια σχηματισμού της γέλης. Αφού έγινε πλήρης διάλυση της δραστικής ουσίας με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα, έγινε εισαγωγή κατάλληλου ποσοστού υδροξυ-προπυλοκυτταρίνης (Klucel HF), ο οποίος αποτέλεσε τον παράγοντα σχηματισμού των γελών. Ο παράγοντας αυτός εισήλθε σε ποσοστό 1,25% ο/ο σε κάθε φιαλίδιο. Κατόπιν ακολούθησε ανάδευση με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα και μετά ανάδευση σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα μέχρι τον ορατό σχηματισμό των γελών. Ποσοτικός προσδιορισμός των γελών Μετά την παρασκευή των γελών έγινε ανάλυση με σκοπό να αποδειχθεί η πραγματική ποσότητα της μιρταζαπίνης που περιείχε η κάθε συνταγή. Κατάλληλη ποσότητα από κάθε φιαλίδιο μεταφέρθηκε σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και αραιώθηκε με ακετονιτρίλιο βαθμού HPLC μέχρι την χαραγή. Τα διαλύματα έμειναν υπό συνεχή ανάδευση με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα για 12 ώρες με σκοπό την καλύτερη εκχύλιση του φαρμάκου μέσα στο διαλύτη. Ακολούθησε περαιτέρω αραίωση και πραγματοποιήθηκε ανάλυση των δειγμάτων με υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως (HPLC) με ταυτόχρονο σχηματισμό καμπύλης αναφοράς και προσδιορισμό της πραγματικής ποσότητας του φαρμάκου που υπήρχε σε κάθε φιαλίδιο. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση της πραγματικής τιμής με την θεωρητική εισερχόμενη ποσότητα του φαρμάκου.

51 Προσδιορισμός διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα του δέκτη (receptor solution) Τα πειράματα διάχυσης πραγματοποιούνται σε συνθήκες δεξαμενής. Για το λόγο αυτό πραγματοποιούνται πειράματα προσδιορισμού της διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα δέκτη. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής : Σε δύο ξεχωριστές ογκομετρικές φιάλες των 500 ml, ζυγίζεται και προστίθεται ποσότητα NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O (η ποσότητα σε g των φωσφορικών που πρέπει να ζυγιστεί εξαρτάται κάθε φορά από το ΜΒ της ουσίας) και ρυθμίζεται το pη στο 7.4. Έπειτα προστίθεται 0,02% αζίδιου του νατρίου (NaN 3 ), το οποίο δρα ως συντηρητικό. Σε μία εκ των φιαλών προστίθεται 1% v/v Tween 40, το οποίο αυξάνει τη διαλυτότητα του φαρμάκου ως επιφανειοδραστικό. Στη συνέχεια λαμβάνονται 10 ml διαλύματος, συνολικά τρία δείγματα για την κάθε συνταγή διαλύματος δέκτη, και προστίθεται σε κάθε ένα περίσσεια ποσότητας μιρταζαπίνης με συνεχή ανάδευση. Κατόπιν, τα διαλύματα εισάγονται σε κλίβανο όπου θα αναδεύονται σε σταθερή θερμοκρασία 25 ο C για 24 ώρες. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 8000 στροφές/min. Το υπερκείμενο υγρό μετά από κατάλληλη αραίωση αναλύεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), και με βάση την καμπύλη αναφοράς που προκύπτει από τα πρότυπα διαλύματα της μιρταζαπίνης γίνεται η ποσοτικοποίηση. Πειράματα κυττάρων διάχυσης Τα πειράματα διάχυσης πραγματοποιήθηκαν με την χρήση κυττάρων Franz καθέτου τύπου όπως ήδη έχει αναφερθεί στην παράγραφο ΙΙΙ.8., με επιφάνεια διάχυσης 0,636 cm 2 και όγκο 6,275 ml. Η κατασκευή τους περιλαμβάνει την χρήση σκοτεινόχρωμης υάλου με σκοπό την προστασία φωτοευαίσθητων ουσιών, όπως η μιρταζαπίνη. Τα κύτταρα Franz αποτελούνται από δυο διαμερίσματα, το διαμέρισμα του δότη και το διαμέρισμα του δέκτη. Ανάμεσα στα δυο διαμερίσματα υπάρχει η επιδερμίδα, ένας δακτύλιος από Teflon, η προς εξέταση γέλη που περιέχει την δραστική ουσία και μια λεπτή μεμβράνη πολυαιθυλενίου CoTran 9720 (3M).Το σύστημα συγκρατείται στη θέση του με την βοήθεια μεταλλικού σφικτήρα (Τhomas scientific ). Το δέρμα που χρησιμοποιήθηκε προήλθε από το ίδιο ανατομικό μέρος από τον ίδιο δότη και φυλασσόταν σε καταψύκτη στους C.O διαχωρισμός της επιδερμίδας από το χόριο έγινε με τη βοήθεια της θερμοκρασίας (heat separation technique), όπως περιγράφηκε από τον Klingman. Πιο συγκεκριμένα το δέρμα απομακρύνθηκε από τον καταψύκτη μέχρι να πάρει θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στην συνέχεια εμβαπίστηκε σε υδατόλουτρο που περιείχε νερό στους 60±1 0 C για ένα λεπτό. Υπό αυτές τις συνθήκες χαλαρώνουν οι δεσμοί μεταξύ της επιδερμίδας και του χορίου και είναι ευκολότερος ο διαχωρισμός τους. Έτσι η επιδερμίδα απομακρύνεται από το κυρίως δέρμα με την βοήθεια λαβίδων. Στην συνέχεια απλώθηκε σε φύλλο αλουμινίου και μέχρι να χρησιμοποιηθεί φυλάχθηκε στον καταψύκτη στους C.

52 O δακτύλιος από Teflon χρησιμοποιήθηκε για να συγκρατήσει τη γέλη σταθερή στην επιφάνεια διάχυσης. Το υλικό αυτό είναι σκληρό και αδρανές και επομένως κατάλληλο για το σκοπό που χρησιμοποιείται. Για κάθε συνταγή πραγματοποιήθηκαν 5 κύτταρα Franz με σκοπό την μείωση της μεταβλητότητας του ερευνητή. Αρχικά, στο κάθε κύτταρο δεν εσωκλείεται ποσότητα γέλης καθώς παραμένουν 24 ώρες στη συσκευή ώστε το διάλυμα στο διαμέρισμα να έρθει στη κατάλληλη θερμοκρασία 32±0,5 0 C. Σε κάθε κύτταρο Franz μετά το πέρας των 24 ωρών τοποθετήθηκαν 100 μl από την κάθε συνταγή και καλύφθηκαν με κατάλληλο μέγεθος μεμβράνης πολυαιθυλενίου CoTran Λεπτή μεμβράνη πολυαιθυλενίου χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να μην επιτραπεί η εξάτμιση των πτητικών συστατικών των γελών κατά τη διάρκεια του πειράματος (3 μέρες). Πιθανή απώλεια συστατικών θα είχε ως αποτέλεσμα την αλλοίωση της σύστασης των γελών και θα οδηγούσε σε λάθος αποτελέσματα. Το διαμέρισμα δέκτης περιέχει το διάλυμα δέκτη δηλαδή υδατικό διάλυμα με αζίδιο του νατρίου 2% που διατηρείται στους 32±0,5 0 C προκειμένου να προσομοιωθεί η θερμοκρασία του σώματος σε in vivo συνθήκες. Ο έλεγχος θερμοκρασίας γίνεται με την χρήση υδατόλουτρου. Επιπλέον για να εξασφαλιστεί ομοιογενής κατανομή των μορίων του φαρμάκου στο διάλυμα δέκτη, χρησιμοποιούνται μαγνήτες (Fischer Scientific), οι οποίοι περιστρέφονται με την βοήθεια μαγνητικής πλάκας ανάδευσης. Τα δείγματα από κάθε κύτταρο διάχυσης λαμβάνονται σε προκαθορισμένα διαστήματα δηλαδή στις 6, 12, 24, 48 και 72 ώρες από την έναρξη του πειράματος. Κατά τη δειγματοληψία αφαιρείται όλο το περιεχόμενο του διαλύματος του δέκτη και στη συνέχεια αναπληρώνεται με το ίδιο διάλυμα που διατηρείται στους 32±0,5 0 C ώστε να διατηρούνται οι συνθήκες δεξαμενής καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος.

53 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Φάσμα υπεριώδους ορατού Από το φάσμα υπεριώδους ορατού βρέθηκε ότι η μιρταζαπίνη απορροφά στα 290nm, όπως προτείνεται και στη βιβλιογραφία, επομένως το μήκος κύματος αυτό επιλέχθηκε για την ανίχνευση της μιρταζαπίνης σε όλα τα πειράματα. Σχήμα 25. Φάσμα υπεριώδους ορατού της μιρταζαπίνης Αποτελέσματα πειραμάτων συμβατότητας Προτού επιλεχθούν οι επιταχυντές διαβατότητας για τα πειράματα διαδερμικής διαπερατότητας, έγινε έλεγχος της συμβατότητάς τους με το φορέα. Έγινε έλεγχος

54 σε συνολικά εννιά επιταχυντές από τις κυριότερες κατηγορίες και έδωσαν τα εξής αποτελέσματα : 1. Azone : πλήρης διάλυση 2. Λαουρικό οξύ : πλήρης διάλυση 3. Ολεϊκό οξύ : λευκό ίζημα 4. Κινεόλη : πλήρης διάλυση 5. Μινθόλη : πλήρης διάλυση 6. NMP : πλήρης διάλυση 7. Λαουρική αλκοόλη : πλήρης διάλυση 8. GMO : πλήρης διάλυση 9. Methyl-laurate : διπλή στιβάδα 10. GML : διπλή στιβάδα Το ολεϊκό οξύ, το GML και το methyl-laurate απορρίφθηκαν λόγω ασυμβατότητας. Το GMO επιλέχθηκε από την κατηγορία των εστέρων γιατί οι άλλοι εστέρες που δοκιμάστηκαν δεν ήταν συμβατοί με το φορέα. Αποτελέσματα διαλυτότητας κορεσμού Ο προσδιορισμός της διαλυτότητας κορεσμού της μιρταζαπίνης έγινε για κάθε συνταγή που προέκυψε από τον πειραματικό σχεδιασμό και η οποία έχει περιγραφεί σε προηγούμενη ενότητα. Παρακάτω εμφανίζονται σε πίνακα τα αποτελέσματα. Επιταχυντής Διαλυτότητα κορεσμού RSD% mg/ml Χωρίς επιταχυντή 50,01 5,54 Azone 5% 80,43 8,12 NMP 5% 68,4 4,17 Cineole 5% 89,07 4 Menthol 5% 84,22 8,78 Lauric acid 5% 68,1 1,13 Lauryl alcohol 5% 69,15 2,57 GMO 5% 72,47 4,74 Azone 10% 61,17 6,42 NMP 10% 69,81 1,82 Cineole 10% 68,68 5,08 Menthol 10% 66,36 23,64 Lauric acid 10% 74,19 8,91 Lauryl alcohol 10% 58,33 2,65 GMO 10% 50,24 8,77 Πίνακας IV. Διαλυτότητα κορεσμού σε κάθε συνταγή Για κάθε μία από τις συνταγές διενεργήθηκε στατιστική ανάλυση με t-test σε επίπεδο σημαντικότητας 95% με τη συνταγή χωρίς επιταχυντή και βρέθηκε ότι η

55 συνταγή χωρίς επιταχυντή έχει στατιστικά χαμηλότερη διαλυτότητα κορεσμού συγκριτικά με τις υπόλοιπες συνταγές. Στατιστικά μη σημαντική διαφορά εμφανίζει μόνο με τη συνταγή GMO 10%. Επιπλέον, υψηλότερη διαλυτότητα κορεσμού με στατιστικά σημαντική διαφορά από τη συνταγή χωρίς επιταχυντή, εμφανίζει η συνταγή Cineole 5% (1,78 φορές). Συγκρίνοντας τα επίπεδα των συγκεντρώσεων 5% και 10% για κάθε ζευγάρι επιταχυντών δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές οι επιταχυντές : NMP, Μινθόλη και Λαουρικό οξύ. Τα παραπάνω συνοψίζονται στους παρακάτω πίνακες. Σύγκριση συνταγών Τιμή P Χωρίς επιταχυντή Azone 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή NMP 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Κινεόλη 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Μινθόλη 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Λαουρικό οξύ 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Λαουρική αλκοόλη 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή GMO 5% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Azone 10% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή NMP 10% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Κινεόλη 10% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Μινθόλη 10% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Λαουρικό οξύ 10% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή Λαουρική αλκοόλη 10% P <0.05 Χωρίς επιταχυντή GMO 10% P >0.05 Πίνακας V. T-test στη διαλυτότητα κορεσμού Σύγκριση συγκεντρώσεων επιταχυντών Τιμή P Azone 5% - Azone 10% P <0.05 NMP 5% - NMP 10% P >0.05 Κινεόλη 5% - Κινεόλη 10% P <0.05 Μινθόλη 5% - Μινθόλη 10% P >0.05 Λαουρικό οξύ 5% - Λαουρικό οξύ 10% P >0.05 Λαουρική αλκοόλη 5% - Λαουρική αλκοόλη 10% P <0.05 GMO 5% - GMO 10% P <0.05 Πίνακας VI. Ζεύγη επιταχυντών

56 Αποτελέσματα παρασκευής γελών Η ποσότητα του φαρμάκου που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των γελών αντιστοιχεί στο 90% της διαλυτότητας κορεσμού και φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Συνταγή Χωρίς επιταχυντή Ποσοστό φορέα (EtOH : Gly: H 2 O) Διαλυτότητα κορεσμού (mg/ml) Ποσότητα ουσίας σε g Ποσοστό υδροξυπρόπυλοκυτταρίνης % w/w 60:15:25 50,01 0,2256 1,25 Azone 5% 60:15:25 80,34 0,3618 1,25 NMP 5% 60:15:25 68,4 0,3078 1,25 Κινεόλη 5% 60:15:25 89,07 0,4004 1,25 Μινθόλη 5% Λαουρικό οξύ 5% Λαουρική αλκοόλη 5% 60:15:25 84,22 0,3797 1,25 60:15:25 68,1 0,3058 1,25 60:15:25 69,15 0,3108 1,25 GMO 5% 60:15:25 72,47 0,3264 1,25 Azone 10% 60:15:25 61,17 0,2703 1,25 NMP 10% 60:15:25 69,81 0,3138 1,25 Κινεόλη 10% Μινθόλη 10% Λαουρικό οξύ 10% Λαουρική αλκοόλη 10% 60:15:25 68,68 0,3095 1,25 60:15:25 66,36 0,2993 1,25 60:15:25 74,19 0,3341 1,25 60:15:25 58,33 0,2622 1,25 GMO 10% 60:15:25 50,24 0,2264 1,25 Πίνακας VII. Σύσταση γελών

57 Αποτελέσματα ποσοτικού προσδιορισμού των γελών Διαφορά C πραγματική mg/ml RSD% C αναμενόμενη mg/ml % Χωρίς επιταχυντή 49,83 6,4 45,01 110,71 Azone 5% 80,04 0,6 72,31 110,70 NMP 5% 64,02 0,3 61,56 104,00 Cineole 5% 80,24 19,16 80,16 100,10 Menthol 5% 89,93 0,60 75,80 118,64 Lauric acid 5% 72,22 2,96 61,29 117,83 Lauryl alcohol 5% 74,86 1,03 62,23 120,30 GMO 5% 79,82 1,37 65,22 122,39 Azone 10% 70,09 0,52 55,05 127,31 NMP 10% 80,23 0,31 62,83 127,70 Cineole 10% 78,14 1,67 61,81 126,41 Menthol 10% 79,41 1,31 59,72 132,97 Lauric acid 10% 79,14 0,74 66,78 118,51 Lauryl alcohol 10% 58,19 11,5 52,5 110,84 GMO 10% 55,12 4,49 45,22 121,89 Πίνακας VIII. Αποτελέσματα ποσοτικοποίησης Στη διάρκεια ενός μήνα από την παρασκευή των γελών παρουσιάστηκε αποσταθεροποίηση της γέλης στις συνταγές Azone 10% και Μινθόλη 10%. Αποτελέσματα διαλυτότητας κορεσμού στο διάλυμα δέκτη Έγινε προσδιορισμός διαλυτότητας κορεσμού σε δύο τύπους διαλύματος και τα αποτελέσματα του προσδιορισμού φαίνονται στον πίνακα. Διάλυμα Διαλυτότητα κορεσμού (mg/ml) RSD% 1 0,338 10,81 2 (παρουσία Tween) 0,660 4,40 Πίνακας IX. Συγκέντρωση διαλυμάτων δέκτη Επιλέχτηκε το διάλυμα δέκτη που περιείχε Tween καθώς στο συγκεκριμένο διάλυμα η συγκέντρωση του φαρμάκου που διαλύεται στο συγκεκριμένο διάλυμα δεν ξεπερνά το 10%, επικρατούν λοιπόν συνθήκες δεξαμενής.

58 Αποτελέσματα πειραμάτων διαπερατότητας Από τον πειραματικό σχεδιασμό προέκυψαν συνολικά 15 συνταγές για τους δύο παράγοντες που επιλέχθηκαν, «είδος επιταχυντή» και «συγκέντρωση». Η απόκριση του πειράματος ήταν η αθροιστική ποσότητα Q (μg/cm 2 ) που διαπερνούσε την επιδερμίδα στις 24, 48 και 72 ώρες. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα και στα σχήματα παριστάνεται γραφικά η αθροιστική ποσότητα μιρταζαπίνης που διαπέρασε την επιδερμίδα σε συνάρτηση με το χρόνο. Συνταγή Είδος επιταχυντή 1 Χωρίς επιταχυντή % αναλογία επιταχυντή Q 24 (μg/cm 2 ) ±RSD% Q 48 (μg/cm 2 ) ±RSD% Q 72 (μg/cm 2 ) ±RSD% 0% 278,76±15,41 827±10, ,93±9,35 2 Azone 5% 496,47±15,85 658,18±14,41 790,62±12,12 3 NMP 5% 299,02±18,08 621,92±9,00 757,89±7,04 4 Κινεόλη 5% 517,20±33,74 617,65±32,17 689,12±31,37 5 Μινθόλη 5% 660,96±10, ,19±11, ,47±10,85 6 Λαουρικό οξύ 7 Λαουρική αλκοόλη 5% 582,04±13, ,51±17, ,82±19,32 5% 750,22±13, ,35±13, ,96±11,50 8 GMO 5% 686,16±11, ,60±9, ,08±12,09 9 Azone 10% 246,08±21,06 368,92±19,45 475,14±11,06 10 NMP 10% 173,95±15,26 343,85±14,13 481,81±11,13 11 Κινεόλη 10% 592,80±17,97 730,89±19,36 795,60±19,11 12 Μινθόλη 10% 307,98±20,87 579,45±21,80 857,09±20,14 13 Λαουρικό οξύ 14 Λαουρική αλκοόλη 10% 324,21±15,78 649,74±14,99 966,17±14,63 10% 709,26±12, ,07±10, ,19±10,08 15 GMO 10% 440,05±26,32 913,99±24, ,35±24,79 Πίνακας X. Αθροιστική ποσότητα Q που διαπέρασε την επιδερμίδα

59 Σχήμα 26. Αθροιστική ποσότητα μιρταζαπίνης που διαπέρασε την επιδερμίδα σε συνάρτηση με το χρόνο 2500,00 Αθροιστική ποσότητα Q 2000, , ,00 500,00 24 hrs 48 hrs 72 hrs 0,00 Χωρίς επιταχυντή Azone 5% NMP 5% Cineole 5% Menthol 5% Lauric acid 5% Lauryl alcohol 5% GMO 5% Azone 10% NMP 10% Cineole 10% Menthol 10% Lauric acid 10% Lauryl alcohol 10% GMO 10% Σχήμα 27. Ραβδόγραμμα της αθροιστικής ποσότητας που διαπερνά την επιδερμίδα στις 24, 48 και 72 ώρες.