ΖΥΜΩΣΗ ΤΥΡΟΓΑΛΑΚΤΟΣ ΑΠΟ ΕΛΕΥΘΕΡΑ ΚΑΙ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ kefir ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ.

Transcript

1 ΖΥΜΩΣΗ ΤΥΡΟΓΑΛΑΚΤΟΣ ΑΠΟ ΕΛΕΥΘΕΡΑ ΚΑΙ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ kefir ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ: ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ. Α. Γκολφινόπουλος, Μ. Σουπιώνη, Μ. Κανελλάκη και Α.Α. Κουτίνας Οµάδα Βιοτεχνολογίας Τροφίµων, Τοµέας Χηµικών Εφαρµογών, Χηµικής Ανάλυσης και Χηµείας Περιβάλλοντος, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Πατρών, 265 Πάτρα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα εργασία σκοπό έχει τη µελέτη της επίδρασης του ph στο ρυθµό πρόσληψης της λακτόζης από ελεύθερα ή ακινητοποιηµένα σε γλουτένη και απολιγνινοποιηµένα κυτταρινούχα υλικά κύτταρα kefir, κατά τη ζύµωση του τυρογάλακτος. Τυρόγαλα είναι το παραπροϊόν της τυροκοµίας το οποίο περιέχει πρωτεΐνες, λιπίδια και κυρίως υδατάνθρακες (λακτόζη ~5%). Το kefir είναι µια σύνθετη καλλιέργεια αποτελούµενη από µίγµα ζυµοµυκήτων και γαλακτικών βακτηρίων. Ζύµες και µύκητες συνυπάρχουν σε µια συµβιωτική σχέση και είναι υπεύθυνα για τη ζύµωση της λακτόζης του γάλακτος και του τυρογάλακτος. Τα πειράµατα έγιναν σε ph 4, 5, 5,5, 6, 6,5 και σε θερµοκρασία 3 C. Ο ρυθµός πρόσληψης της λακτόζης µετρήθηκε µε την προσθήκη στο τυρόγαλα λακτόζης επισηµασµένης µε άνθρακα-14. Τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι η ζύµωση του τυρογάλακτος από ακινητοποιηµένα σε γλουτένη και απολιγνινοποιηµένα κυτταρινούχα υλικά κύτταρα kefir ήταν ταχύτερη σε σύγκριση µε τη ζύµωση από ελεύθερα κύτταρα και στην περίπτωση των απολιγνινοποιηµένων κυτταρινούχων υλικών η ζύµωση διαρκούσε 7,2 ώρες ενώ στην περίπτωση της γλουτένης διαρκούσε 15 ώρες. WHEY FERMENTATION BY FREE AND IMMOBILIZED kefir CELLS AT VARIOUS CONDITIONS: COMPARATIVE STUDY A. Golfinopoulos, M. Soupioni, M. Kanellaki and A. A. Koutinas Food Biotechnology group, Section of Analytical, Environmental and Applied Chemistry, Department of Chemistry University of Patras, 265 Patras, GREECE ABSTRACT The present work aims on determining ph effect on lactose uptake rate by free kefir cells or immobilized ones, on delignified cellulosic materials and gluten pellets during whey fermentation. Whey is the liquid by-product of cheese production containing proteins, fats and mainly carbohydrates (lactose~5%). Kefir is a mixed culture consisting of various yeasts and lactic acid bacteria. Yeasts and lactic acid bacteria co-exist in a symbiotic association and are responsible for lactose fermentation of milk and whey. The experiments were conducted at various ph values such as 4, 5, 5.5, 6 and 6.5 under 3 C temperature. Lactose uptake rate was measured by adding 14 C-labelled lactose in whey. Results illustrated that whey fermentation by kefir cells immobilized on gluten pellets and delignified cellulosic materials, was faster compared to free cells and in case of delignified cellulosic materials, fermentation time was found 7.2 h, while in case of gluten pellets fermentation time was 15 h.

2 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στην Ελλάδα κατά την τελευταία τριακονταετία, έχει αυξηθεί σηµαντικά η ποσότητα του παραγόµενου τυρογάλακτος εξαιτίας της µεγάλης ανάπτυξης της τυροκοµίας. Υπολογίζεται ότι στην πατρίδα µας παράγονται ως παραπροϊόν της τυροκοµίας, 7. τόνοι τυρογάλακτος ετησίως, εκ των οποίων η µισή περίπου ποσότητα µένει αναξιοποίητη και απορρίπτεται σε ποτάµια, λίµνες ή άλλους υδάτινους αποδέκτες (Ζερφυρίδης, 21). Το απορριπτόµενο τυρόγαλα είναι σηµαντικός ρυπαντής του περιβάλλοντος λόγω των υψηλών τιµών: (i) Βιοχηµικά Απαιτούµενου Οξυγόνου (BOD) που ανέρχεται σε 4-7 g/l κατά τις πέντε πρώτες 5 ηµέρες και (ii) Χηµικά Απαιτούµενου Οξυγόνου (COD) που ανέρχεται σε 6-8 g/l (Μαρκαντωνάτος, 199), (Athanasiadis et al, 24). Το kefir είναι µια σύνθετη καλλιέργεια αποτελούµενη από µίγµα ζυµοµυκήτων (Kluyeveromyces, Candida, Saccharomyces, Pichia κ.λπ.), γαλακτικών και οξικών βακτηρίων (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc κ.λπ.), εγκλωβισµένων σε πλέγµα πολυσακχαριτών.(garrote et al., 1997), (Pintado et al., 1996). Αυτοί οι µικροοργανισµοί λειτουργούν σε µια συµβιωτική σχέση προκαλώντας γαλακτική και αλκοολική ζύµωση, µε αποτέλεσµα τη µετατροπή υδατανθράκων σε προϊόντα περισσότερο σταθερά όπως η αιθανόλη, το γαλακτικό οξύ και το προπιονικό οξύ. Την τελευταία δεκαετία έχει µελετηθεί διεξοδικά η δυνατότητα αξιοποίησης του τυρογάλακτος µε χρήση ελευθέρων ή ακινητοποιηµένων κυττάρων kefir σε κατάλληλους φορείς (Athanasiadis, et al., 1999), (Athanasiadis, et al., 2), (Athanasiadis, et al., 21), (Athanasiadis, et al., 25). Συνήθως, στις σχετικές µελέτες, η κινητική ζύµωσης της λακτόζης του τυρογάλακτος από το kefir παρακολουθείται έµµεσα, προσδιορίζοντας τη µεταβολή της συγκέντρωσης των προϊόντων σε διάφορες συνθήκες. Όµως, στην παρούσα εργασία, µε χρήση λακτόζης επισηµασµένης µε άνθρακα-14, µελετήθηκε η επίδραση του ph στο ρυθµό πρόσληψης της λακτόζης από ελεύθερα και ακινητοποιηµένα κύτταρα kefir κατά τη ζύµωση του τυρογάλακτος, µετρώντας άµεσα την ποσότητα της ραδιενέργειας των κυττάρων του kefir. Η αρχή της µεθόδου αυτής έγκειται στο γεγονός ότι η ραδιενεργός λακτόζη ακολουθεί µέσα στη βιοµάζα τις ίδιες µεταβολικές οδούς µε την µη ραδιενεργό. Η συγκεκριµένη µέθοδος έχει εφαρµοσθεί και πρόσφατα σε ερευνητικές προσπάθειες, όπου προσδιορίστηκε η ζυµωτική ικανότητα του kefir σε συνθετικά µέσα αλλά και σε τυρόγαλα µε τη µέτρηση της προσλαµβανόµενης ραδιενεργού λακτόζης από το kefir (Golfinopoulos et al., 29), (Golfinopoulos et al., 211). Επίσης, και στο παρελθόν µελετήθηκε επιτυχώς µε τον ίδιο τρόπο η ταχύτητα πρόσληψης της γλυκόζης από Saccharomyces cerevisiae κατά τη ζύµωση της µελάσας (Soupioni et al., 1998). Τελικός σκοπός αυτής της έρευνας, ήταν να εντοπισθούν οι καταλληλότερες συνθήκες για να επιτευχθεί η µέγιστη ταχύτητα πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος είτε από ελεύθερα ή από ακινητοποιηµένα κύτταρα kefir. Κατά συνέπεια να βρεθούν και οι συνθήκες για ολοκλήρωση της ζύµωσης σε λιγότερο χρόνο καθώς και για επίτευξη πλήρους απορρύπανσης του τυρογάλακτος. Στη συνέχεια µε βάση τα αποτελέσµατα είναι δυνατόν να γίνουν προτάσεις για την πιθανή αλλαγή παραµέτρων της ζύµωσης µε σκοπό την αύξηση της ταχύτητας αυτής και τη βελτίωση της παραγωγής χρήσιµων τελικών προϊόντων, όπως αιθανόλης και γαλακτικού οξέος.

3 2. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Συντήρηση και πολλαπλασιασµός κυττάρων kefir Το kefir που χρησιµοποιήθηκε ήταν εµπορικό προϊόν, που διατίθεται υπό µορφή κόκκων ή συσσωµατωµάτων (kefir grains). Η συντήρηση του γινόταν σε φρέσκο παστεριωµένο γάλα στους 2 ο C 4 ο C, το οποίο ανανεωνόταν κάθε επτά ηµέρες. Ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων του kefir γινόταν µε διαδοχικές ανακαλλιέργειες σε αποστειρωµένο θρεπτικό µέσο, το οποίο περιείχε λακτόζη 2%, yeast extract.4% (Fluka), (NH 4 ) 2 SO 4.1%, KH 2 PO 4.1% και MgSO 4.7H 2 O.5% (Merck 99,5%). Η όλη διαδικασία ολοκληρωνόταν σε θερµοθάλαµο στους 3 C και σε ph 5,5. Η παραγόµενη υγρή βιοµάζα kefir παραλαµβανόταν µε φυγοκέντρηση και γινόταν χρήση αυτής απευθείας στις επί µέρους ζυµώσεις. Μελέτη επίδρασης του ph στην κινητική της ζύµωσης Πραγµατοποιήθηκε σειρά ζυµώσεων τυρογάλακτος σε ph 4, 5, 5,5, 6, 6,5 και σε θερµοκρασία 3 C µε υγρή βιοµάζα kefir συγκέντρωσης 2,4 % w/v ή αντίστοιχης ποσότητας ακινητοποιηµένης είτε σε γλουτένη ή σε απολιγνινοποιηµένα κυτταρινούχα υλικά (DC). Στην αρχή κάθε ζύµωσης µικρή ποσότητα επισηµασµένης λακτόζης, (D-Glucose-1-14 C) προστίθετο στο τυρόγαλα. Για στατιστικούς λόγους κάθε ζύµωση γινόταν ταυτόχρονα τρεις φορές και το τελικό αποτέλεσµα ήταν ο µέσος όρος των τριών µετρήσεων. Προσδιορισµός επισηµασµένης λακτόζης Για τον προσδιορισµό της ταχύτητας πρόσληψης της λακτόζης από την καλλιέργεια του kefir, σε τακτά χρονικά διαστήµατα, 2 ml από το µίγµα της ζύµωσης διηθούνταν σε φίλτρο κυτταρίνης (,45 µm). Το φίλτρο µε το δείγµα των κυττάρων τοποθετούνταν σε γυάλινο φιαλίδιο µαζί µε 5 ml σπινθηριστικού µίγµατος Opti Fluor (Perkin Elmer). Η µέτρηση του 14 C της επισηµασµένης λακτόζης των κυττάρων γινόταν σε υγρό απαριθµητή σπινθηρισµών (PACARD-3255) συνδεδεµένο µε έναν APPLE-2 PC και το τελικό αποτέλεσµα εκφράσθηκε σε κρούσεις ανά γραµµάριο βιοµάζας και ανά ώρα [cpm/(g kefir.h)]. Προσδιορισµός αζύµωτων σακχάρων. Η παρακολούθηση της κινητικής της ζύµωσης γινόταν επίσης µε µέτρηση της αζύµωτης λακτόζης που απέµενε κατά τη διάρκεια της ζύµωσης του τυρογάλακτος. Ο προσδιορισµός των αζύµωτων σακχάρων λακτόζης, γλυκόζης και γαλακτόζης κατά την πορεία της ζύµωσης γινόταν σε τακτά χρονικά διαστήµατα µε υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Χρησιµοποιήθηκε χρωµατογράφος SHIMADZU LC-9A, µε στήλη Shimpack SCR-11N, 142/Β και ανιχνευτή δείκτη διάθλασης RID-6A. Ως κινητή φάση χρησιµοποιήθηκε υπερκάθαρο νερό παραγόµενο από κατάλληλη συσκευή (Synergy, Millipore S.A.) µε ταχύτητα ροής,8 ml/min, ενώ ως εσωτερικό πρότυπο χρησιµοποιήθηκε 1-butanol (,1% v/v). Ο θερµοστατούµενος θάλαµος ήταν SHIMADZU CTO-1A και διατηρούσε τη στήλη σε θερµοκρασία 6 ο C. Για κάθε µέτρηση ο όγκος του χρησιµοποιουµένου για την ανάλυση αραιωµένου και διηθηµένου δείγµατος ήταν 4 µl µε συγκέντρωση 1% v/v. Παρασκευή απολιγνινοποιηµένων κυτταρινούχων υλικών και ακινητοποίηση του kefir σε αυτά

4 Σε ποτήρι ζέσεως τοποθετούνταν 3 g πριονίδι και 3L NaOH 1% w/v και υποβάλλονταν σε βρασµό για 3 ώρες. Το πριονίδι στην συνέχεια εκπλενόταν εξαντλητικά µε ζεστό νερό για την αποµάκρυνση της λιγνίνης. Για την ακινητοποίηση 8 ml συνθετικού θρεπτικού µέσου περιεκτικότητας 12% λακτόζης ζυµώνονταν επί 12 ώρες µε 16 g kefir παρουσία 17 g απολιγνινοποιηµένων κυτταρινούχων υλικών. Παρασκευή γλουτένης και ακινητοποίηση του kefir σε αυτή Γινόταν ανάµειξη αλεύρου µε νερό και µάλαξη αυτού κάτω από νερό βρύσης για την αποµάκρυνση του αµύλου. Η υγρή γλουτένη τεµαχιζόταν σε σφαιρίδια διαµέτρου 1,5-2 cm και υποβαλλόταν σε θέρµανση στους 15 o C για 5 ώρες. Για την ακινητοποίηση 8 ml συνθετικού θρεπτικού µέσου περιεκτικότητας 12% λακτόζης ζυµώνονταν επί 12 ώρες µε 16 g kefir παρουσία 17 g γλουτένης. Προσδιορισµός βιοµάζας Για τον προσδιορισµό της παραγόµενης ποσότητας βιοµάζας kefir, σε τακτά χρονικά διαστήµατα αφαιρούνταν 5mL από το υγρό της ζύµωσης, γινόταν φυγοκέντρηση, απόχυση του υπερκειµένου υγρού και ζύγιση της βιοµάζας. 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η επίδραση του ph στην κινητική ζύµωσης των σακχάρων του τυρογάλακτος από ελεύθερα κύτταρα kefir φαίνεται στο Σχήµα 1. Όπως δείχνει το Σχήµα 1 η ζύµωση του τυρογάλακτος από ελεύθερα κύτταρα kefir ολοκληρώνεται ταχύτερα σε ph 5,5. Τα επόµενα ευνοϊκά ph για την ταχύτητα ζύµωση του τυρογάλακτος από το kefir είναι το 6 και το 5. Επίσης, από το Σχήµα 2 προκύπτει ότι ρυθµός πρόσληψης της λακτόζης είναι µεγαλύτερος σε ph 5,5 σε µια παράλληλη σχέση µε την ταχύτητα ζύµωσης των σακχάρων, γεγονός που οδηγεί στο συµπέρασµα ότι κατά τις µεταβολές του ph ο ρυθµός πρόσληψης της λακτόζης είναι ο κύριος παράγοντας που επηρεάζει την κινητική της ζύµωσης. Επιπλέον του ρυθµού πρόσληψης είναι γνωστό ότι οι µεταβολές του ph επηρεάζουν την υδρόλυση της λακτόζης, διότι επιδρούν στην δραστικότητα του ενζύµου λακτάση καθώς και στον ρυθµό ανάπτυξης της µικροχλωρίδας του kefir που ζυµώνει το δισακχαρίτη. Τα αποτελέσµατα συµφωνούν µε προηγούµενα ευρήµατα κατά την ζύµωση συνθετικών µέσων µε kefir (Golfinopoulos et al., 29). Τα Σχήµατα 3 και 4 δείχνουν ότι καταλληλότερο ph για τη ζύµωση του τυρογάλακτος από κύτταρα kefir ακινητοποιηµένα σε γλουτένη είναι το 5,5. Επιπλέον η ταχύτητα ζύµωσης της λακτόζης είναι πολύ µεγαλύτερη σε σχέση µε την ταχύτητα ζύµωσης από ελεύθερα κύτταρα kefir, γεγονός που οφείλεται στην µεγαλύτερη συγκέντρωση των ακινητοποιηµένων κυττάρων στην περιοχή που γίνεται η ζύµωση καθώς και στην µείωση της ενέργειας ενεργοποίησης Ε a (Bardi et al., 1996).

5 Συνολικά σάκχαρα (g/1ml) ph 5 ph 5,5 ph 4 ph 6 ph 6, t (h) Σχήµα 1: Επίδραση του ph στην κινητική ζύµωσης των σακχάρων του τυρογάλακτος από ελεύθερα κύτταρα kefir 5 Ρυθµός πρόσληψης λακτόζης [cpm/(g biomass *h)] t (h) ph 4 ph 5 ph 5.5 ph 6 ph 6.5 Σχήµα 2: Επίδραση του ph στο ρυθµό πρόσληψης λακτόζης από καλλιέργεια kefir κατά τη ζύµωση τυρογάλακτος

6 6 Συνολικά σάκχαρα (g/1ml) ph4 ph5 ph5,5 ph6 ph6, t(h) Σχήµα 3: Επίδραση του ph στην κινητική ζύµωσης των σακχάρων του τυρογάλακτος από καλλιέργεια kefir ακινητοποιηµένη σε γλουτένη. 5 Ρυθµός πρόσληψης λακτόζης [cpm/(g * h)] t(h) ph 4 ph 5 ph 5,5 ph 6 ph 6,5 Σχήµα 4: Επίδραση του ph στο ρυθµό πρόσληψης λακτόζης από καλλιέργεια kefir κατά τη ζύµωση τυρογάλακτος ακινητοποιηµένη σε γλουτένη.

7 Συνολικά σάκχαρα (gr/1ml) ph4 ph5 ph5,5 ph6 ph6,5 5 1 t(h) Σχήµα 5: Επίδραση του ph στην κινητική ζύµωσης των σακχάρων του τυρογάλακτος από καλλιέργεια kefir ακινητοποιηµένη σε απολιγνινοποιηµένη κυτταρίνη. Ρυθµός πρόσληψης λακτόζης [cpm/(g * h)] 6 ph4 ph5 ph5,5 ph6 ph6, t(h) Σχήµα 6: Επίδραση του ph στο ρυθµό πρόσληψης λακτόζης από καλλιέργεια kefir κατά τη ζύµωση τυρογάλακτος ακινητοποιηµένη σε απολιγνινοποιηµένη κυτταρίνη.

8 Τέλος στα Σχήµατα 5 και 6 είναι εµφανές ότι η ζύµωση τυρογάλακτος από κύτταρα kefir ακινητοποιηµένα σε απολιγνινοποιηµένα κυτταρινούχα υλικά πραγµατοποιείται ταχύτερα σε µια περιοχή ph από 5 έως 5,5. Μάλιστα σε ph 5 η ζύµωση ολοκληρώνεται σε χρονικό διάστηµα µόλις 7,2 ωρών, χρόνος που είναι αποδεκτός από τις βιοµηχανίες. Είναι φανερό ότι τα κυτταρινούχα υλικά ως φορέας ακινητοποίησης των κυττάρων έχουν τα καλύτερα αποτελέσµατα στην κινητική της ζύµωσης του τυρογάλακτος από kefir. 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ως γενικό συµπέρασµα µπορεί να αναφερθεί ότι το kefir είναι κατάλληλο για τη ζύµωση της λακτόζης του τυρογάλακτος και ότι το ph ασκεί ισχυρή επίδραση στην κινητική των ζυµώσεων. Συγκριτικά σε σχέση µε την κινητική της ζύµωσης η ζυµώσεις που γίνονται µε ακινητοποιηµένα κύτταρα kefir πλεονεκτούν των ζυµώσεων µε ελεύθερα κύτταρα kefir. Tα καλύτερα αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν µε την χρήση κυττάρων kefir ακινητοποιηµένων σε απολιγνινοποιηµένα κυτταρινούχα υλικά και σε ph 5. Με τη ζύµωση αυτή επιτυγχάνεται: (α) Σηµαντική µείωση του ρυπαντικού φορτίου τυρογάλακτος, αφού το 8% του BOD 5 αυτού οφείλεται στη λακτόζη, (Ζερφυρίδης, 21). (β) Χρόνος αποδεκτός από τις βιοµηχανίες αφού η ζύµωση ολοκληρώνεται σε 7,2 ώρες. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Athanasiadis I., Boskou D., Kanellaki M., Koutinas A.A., 2. Effect of carbohydrate substrate on fermentation by Kefir yeast supported on delignified cellulosic materials. J. Agric. Food Chem., 49: Athanasiadis, I., Boskou, D., Kanellaki, M., Koutinas, A. A., 21. Effect of carbohydrate on fermentation by kefir yeast supported on delignified cellulosic materials. Food Chemistry, 49, Athanasiadis I., Boskou D., Kanellaki M., Koutinas A.A., Low temperature alcoholic fermentation by delignified cellulosic material supported cells of Kefir yeast. J. Agric. Food Chem., 47: Athanasiadis I., Paraskevopoulou A., Blekas G., and Kiosseoglou V., 24. Development of a Novel Whey Beverage by Fermentation with Kefir Granules. Effect of Various Treatments, Biotechnol. Prog. 2, Athanasiadis I., Koutinas A.A., Bekatorou, A., Ikonomopoulou M., Blekas G., 25. Kefir yeast technology: Scale- up in SCP production using milk whey, Biotechnology and Bioengineering, 89, Bardi E. P., Bakoyianis V., Koutinas A. A. & Kanellaki M., Room Temperature and Low Temperature Wine Making Using Yeast Immobilized on Gluten Pellets. Process Biochemistry, 31(5), Garrote G. L., Abraham A. G., De Antoni, G. L., Preservation of kefir grains, a comparative study. Lebensmittel Wissenschaft un Technologie, 3, 77 84

9 Golfinopoulos A., Papaioannou L., Soupioni M., Koutinas A. A., 29. Lactose uptake rate by kefir yeast using 14 C- labelled lactose to explain kinetic aspects in its fermentation. Bioresource Technology, 1, 21, Golfinopoulos A., Kopsahelis N., Tsaousi K., Koutinas A. A., Soupioni M., 211. Research perspectives and role of lactose uptake rate revealed by its study using 14C-labelled lactose in whey fermentation. Bioresource Technology, 12, Ζερφυρίδης Γ., Τεχνολογία προϊόντων γάλακτος. Τυροκοµία, 21, Εκδόσεις Γιαχούδη- Γιαπουλή. Θεσσαλονίκη. Μαρκαντωνάτος Γ., Επεξεργασία και διάθεση υγρών αποβλήτων, 199, Αθήνα Pintado, M. E., Lopes Da Silva, J. A., Fernades, P. B., Malcata, F. X., Hogg, T. A Microbiological and rheological studies on Portugese kefir grains. International Journal Food Science and Technology, 31, Soupioni, M., Polichroniadou, E., Τokatlidou, M., Kanellaki, M., Koutinas, A.A., Glucose uptake rate by Saccharomyces cerevisiae in the presence of promoters of alcoholic fermentation using 14 C- labelled glucose. Biotechnology Letters, 2(5),