ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ Σνκέαο Γελεηηθήο, Βηνινγίαο θπηηάξνπ Καη Αλάπηπμεο

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΒΗΟΛΟΓΗΑ Σνκέαο Γελεηηθήο, Βηνινγίαο θπηηάξνπ Καη Αλάπηπμεο Επκώζεηο ζε νηθηαθό ςπγείν κε ηε ρξήζε ζεξκηθά μεξακέλσλ θπηηάξσλ ζαθραξνκύθεηα αθηλεηνπνηεκέλσλ ζε δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν θαη απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΡΟΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΠΟΤΓΧΝ ΓΗΠΛΧΜΑΣΗΚΖ ΔΡΓΑΗΑ ( edu/toms_fungi/dec2002. html) Γξακκέλνπ Αιεμάλδξα Φνηηήηξηα βηνινγίαο ( ΠΑΣΡΑ, Φεβξνπάξηνο 2011

2 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ Δπραξηζηίεο 6 Πεξίιεςε..7 Abstract.9 1.ΔΗΑΓΧΓΖ θνπόο εξγαζίαο Τπόζεζε έξεπλαο ύγρξνλε βηνηερλνινγία Γεληθά Βηνθαηαιύηεο Αιθννιηθή δύκσζε Πξώηεο ύιεο Θξεπηηθά πιηθά αθραξνκύθεηαο θαη ηέιερνο ΑΥΑΕ-1. Ηδηόηεηεο. Γηαηί επηιέρζεθε αθραξνκύθεηεο. Ηζηνξηθά Αλαπαξαγσγή Μνξθνινγία θαη ηαμηλόκεζε Γνκή Κπηηαξηθό ηνίρσκα ζαθραξνκύθεηα ύζηαζε ηέιερνο ΑΥΑΕ-1. Ηδηόηεηεο Κπηηαξηλνύρα πιηθά ππνζηξώκαηα Απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά Ληγλίλε Εειαηηλνπνηεκέλν άκπιν Άκπιν.18 2

3 1.6 Γηεξγαζίεο Αθηλεηνπνίεζε Τιηθά ππνζηξώκαηα-πξνππνζέζεηο Πξνππνζέζεηο γηα ηελ επηινγή θνξέα αθηλεηνπνίεζεο Σερληθέο αθηλεηνπνίεζεο Αξρέο κεζόδσλ Φπζηθέο κέζνδνη αθηλεηνπνίεζεο θπηηάξσλ Υεκηθέο κέζνδνη αθηλεηνπνίεζεο Δθαξκνγέο Δθαξκνγή παξαιιαγήο κεζόδσλ Πιενλεθηήκαηα-Μεηνλεθηήκαηα Γεληθά Πιενλεθηήκαηα ησλ κεζόδσλ Μεηνλεθηήκαηα ησλ κεζόδσλ Αθηλεηνπνίεζε θπηηάξσλ. Πιενλεθηήκαηα Δπίδξαζε αθηλεηνπνίεζεο ζηα θύηηαξα Απνιηγλνπνίεζε Εειαηηλνπνίεζε Θεξκηθή μήξαλζε Μέηξεζε ζαθράξσλ Υξήζε ππθλόκεηξνπ Αλαιπηηθέο κέζνδνη Μέζνδνο Kjeldahl Ηζηνξηθά Υξήζε ηεο κεζόδνπ Αξρή ηεο κεζόδνπ Αέξηα ρξσκαηνγξαθία (Gas chromatography, GC) Ηζηνξηθά Γεληθέο αξρέο κεζόδνπ αέξηνπ ρξσκαηνγξάθνπ ρεκαηηθή δηάηαμε ηεο ζπζθεπήο αέξηνπ ρξσκαηνγξάθνπ Αξρέο ιεηηνπξγίαο Τπνινγηζκόο ζπγθέληξσζεο νπζηώλ Παξαπξνηόληα Πηεηηθά παξαπξνηόληα αιθννιηθήο δύκσζεο θαη κεζαλόιε Σα θπξηόηεξα παξαπξνηόληα είλαη 1 εζηέξαο, 1 αιδεπδε θαη 3 αιθνόιεο.35 3

4 Αιθνόιεο Δζηέξεο Αθεηαιδεύδε Μεζαλόιε Τπνινγηζκόο πνζόηεηαο θαη ξπζκνύ παξαγσγήο αηζαλόιεο ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ ΤΛΗΚΑ Μηθξννξγαληζκνί Θξεπηηθό κέζν Απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά Άκπιν θξηζαξηνύ ζε ζθόλε Τπόζηξσκα αθηλεηνπνίεζεο ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΗ ΤΚΔΤΔ Aηκνθιίβαλνο ΜΔΘΟΓΟΗ Γηαηήξεζε κηθξννξγαληζκώλ αλαθαιιηέξγεηα Γηαδνρηθέο θαιιηέξγεηεο 40 Παξαζθεπή ζξεπηηθώλ Θξεπηηθό γηα βηνκάδα Θξεπηηθό γηα δπκώζεηο Αλάπηπμε βηνκάδαο ΑΥΑΕ Παξαζθεπή ππνζηξώκαηνο Παξαγσγή DCM Απνιηγλνπνίεζε Θεξκηθή μήξαλζε Παξαζθεπή δειαηηλνπνηεκέλνπ ακύινπ Παξαζθεπή βηνθαηαιύηε Σερληθή αθηλεηνπνίεζεο ΑΥΑΕ Αλάκημε δειαηηλνπνηεκέλνπ ακύινπ ζην απνιηγλνπνηεκέλν θπηηαξηλνύρν πιηθό Επκώζεηο Mέζνδνο ζηαηηθήο παξαηήξεζεο-ζιεθηξνληνγξαθίεο Αλαιύζεηο Μέζνδνο Kjeldahl Κηλεηηθή δπκώζεσλ κε κέηξεζε θαηαλάισζεο ζαθράξσλ Πξνζδηνξηζκόο ελώζεσλ ζηα δείγκαηα Πξνζδηνξηζκόο πηεηηθώλ κε GC-MS Υξσκαηνγξάθνο γηα ηα πηεηηθά παξαπξνηόληα Πεηξακαηηθή πνξεία Πξνζδηνξηζκόο κεζαλόιεο θαη αηζαλόιεο Υξσκαηνγξάθνο γηα ηηο αιθνόιεο-υαξαθηεξηζηηθά Πεηξακαηηθή πνξεία.46 4

5 3. ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ Γνθηκαζηηθέο δπκώζεηο Μέηξεζε αδώηνπ κε ηελ κέζνδν Kjeldahl Ζιεθηξνληνγξαθίεο Παξάιιειεο δπκώζεηο Πίλαθεο απνηειεζκάησλ Κηλεηηθέο παξάκεηξνη Πηεηηθά παξαπξνηόληα αιθννιηθήο δύκσζεο ΤΕΖΣΖΖ ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ 62 5

6 ΔΤΥΑΡΗΣΗΔ Δπραξηζηίεο εθθξάδνληαη ζηνλ επηζηεκνληθό ππεύζπλν Καζεγεηή ηνπ ηκήκαηνο Υεκείαο Πάηξαο θ. Α. Κνπηίλα γηα ηελ θαζνδήγεζε θαη ζρεδηαζκό ηεο παξνύζαο εξγαζίαο. Δπίζεο, επραξηζηώ ηα ππόινηπα κέιε ηεο εμεηαζηηθήο επηηξνπήο ηνπ ηκήκαηνο βηνινγίαο ηνλ Καζεγεηή θ. Υ. Γεσξγίνπ θαη ην Αλαπιεξσηή θαζεγεηή θ. Γ. Αγγειή γηα ηε ζπκκεηνρή ηνπο θαζώο θαη γηα ηηο παξαηεξήζεηο ζην πιαίζην ησλ δηνξζώζεσλ ηεο δηπισκαηηθήο κνπ εξγαζίαο. Σέινο, ζα ήζεια λα επραξηζηήζσ ζεξκά ην εξγαζηεξηαθό πξνζσπηθό Υεκείαο θαη ηερλνινγίαο ηξνθίκσλ γηα ηελ πνιύηηκε βνήζεηα πνπ κνπ πξνζέθεξε θαηά ηε δηεμαγσγή ησλ πεηξακάησλ. 6

7 ΠΔΡΗΛΖΦΖ Σα ηειεπηαία 30 ρξόληα ε βηνηερλνινγία ρξεζηκνπνηεί πιηθά πνπ πξνέξρνληαη από αλαλεώζηκεο θαη θπζηθέο πεγέο θαη έρεη εθαξκνγή ζηε ρεκεία ηξνθίκσλ. Πνιιά πεηξάκαηα δηεμάγνληαη κε ζηόρν ηε βειηίσζε ησλ ηερληθώλ θπηηαξηθήο αθηλεηνπνίεζεο. Ο λένο ηνκέαο ιέγεηαη ιεπθή βηνηερλνινγία. Δθηόο από ηε γεληθόηεξε εθαξκνγή ζηε ρεκεία πην ζπγθεθξηκέλα πεξηιακβάλεη επίζεο θαηλνύξηεο κεζόδνπο πξνθεηκέλνπ λα απμεζεί ν ξπζκόο αιθννιηθήο δύκσζεο. Υξεζηκνπνηνύληαη θύηηαξα, έλδπκα θαη νξγαλίδηα γηα ηελ θαηάιπζε κηαο ρεκηθήο αληίδξαζεο κε απνηέιεζκα λα επηηαρύλεηαη. ηελ παξνύζα εξγαζία έγηλε κειέηε δπκώζεσλ ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο ( ζηνπο 5 C, 15 C θαη 25 C. Ζ πεηξακαηηθή δηαδηθαζία ήηαλ κηα θαηλνηόκνο θαη ηξνπνπνηεκέλε κέζνδνο ζύκθσλα κε ηε νπνία ρξεζηκνπνηήζεθε έλαο βηνθαηαιύηεο. Παξαζθεπάζηεθε από ζεξκηθά μεξακέλα θαη αθηλεηνπνηεκέλα θύηηαξα Saccharomyces secerevisiae ελόο αιθννιαλζεθηηθνύ θαη θξπναλζεθηηθνύ ζηειέρνπο ( ΑΥΑΕ-1 ) θαη απν δπν δηαθνξεηηθά ππνζηξώκαηα. Ζ πεγή ησλ θπζηθώλ πιηθώλ ήηαλ ην μύιν (πξηνλίδη) θαη ην άκπιν θξηζαξηνύ ζε ζθόλε. Μεηά από απνιηγλνπνίεζε ην θαηεξγαζκέλν πξηνλίδη (18g) πξνζηέζεθε ζε πξνπαξαζθεπαζκέλν ππέξθνξν δηάιπκα ακύινπ θαη αλακίρζεθε καδί κε πνζόηεηα κηθξννξγαληζκνύ (10g) θαη ζξεπηηθνύ πιηθνύ (10mL) ζηνπο 40 C. Ύζηεξα απνζεθεύηεθε ζηνπο 15 C. Καη νη δπν θνξείο είλαη πνιπκεξή γιπθόδεο. Σα θύηηαξα εγθισβίζηεθαλ ζην gel πνιπκεξνύο θαη επίζεο αθηλεηνπνηήζεθαλ κε πξνζξόθεζε ζην απνιηγλνπνηεκέλν θπηηαξηλνύρν πιηθό. Σν ζξεπηηθό πιηθό είρε 12% αξρηθή ζπγθέληξσζε ζαθράξσλ ( γιπθόδεο/θξνπθηόδεο) κε απνηέιεζκα ε ππθλόηεηα λα είλαη 12 Be. Οη δπκώζεηο πξαγκαηνπνηήζεθαλ ζε νηθηαθό ςπγείν εθηόο από εθείλε πνπ έγηλε ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ. Ζ βηνκάδα αθηλεηνπνηεκέλσλ θπηηάξσλ εθηηκήζεθε έκκεζα κε ηε κέζνδν Kjeldahl. Ζ παξαηήξεζε ηεο κνξθνινγίαο ησλ θπηηάξσλ έγηλε κε ειεθηξνληθό κηθξνζθόπην ζάξσζεο θαζώο νδεγεί ζε ζπκπεξάζκαηα γηα ηε βησζηκόηεηα. Ζ θηλεηηθή ησλ δπκώζεσλ ππν ηε επίδξαζε ηεο ζεξκνθξαζίαο ππνινγίζηεθε κεηα από θαηαγξαθή ησλ κεηξήζεσλ 7

8 πνπ έγηλαλ κε ππθλόκεηξν ζε ηαθηά ρξνληθά δηαζηήκαηα. Ζ παξαγσγηθόηεηα αηζαλόιεο θαη ε ζπγθέληξσζε κεζαλόιεο πνπ πεξηέρνληαλ ζηα δείγκαηα πξνζδηνξίζηεθαλ κε αέξηα ρξσκαηνγξαθία (κε αληρλεπηή θιόγαο, FID). Σέινο, ηα πηεηηθά παξαπξνηόηα ζπκπεξηιακβάλνκέλσλ ησλ αθεηαιδεύδε, νμηθνύ αηζπιεζηέξα, 1-πξνπαλόιε, ηζνβνπηαλόιε θαη ακπιηθώλ αιθνόιώλ πξνζδηνξίζηεθαλ κε ηελ ίδηα αλαιπηηθή κέζνδν, όπσο αλαθέξεηαη λσξίηεξα. 8

9 ABSTRACT The last 30 years biotechnology deals with materials that come from renewable and natural sources and apply to food chemistry especially alcoholic fermentation. A lot of experiments have taken place and the aim has been to improve methods of cell immobilization. There is a new section called white biotechnology. Besides general applications to chemistry, it also includes new methods in order to increase fermentation rate. It uses cells, enzymes or organells that catalyse a reaction and accelerates it as a result. In this study were examined fermentations in low (at 5 C, 15 C ) and room temperatures ( 25 C ). The experimental process was a novel modified method in which a biocatalyst was used. It was made of thermally-dried immobilized cells of an alcohol-resistant and cryotolerant stain of Saccharomyces cerevisiae ( AXAZ-1 ), (Argyriou, 1992) and two different supports. The natural materials came from wood (sawdust) and barley starch powder. Sawdust ( 18g )after delignification and drying added into oversaturated emulsion of prepared starch by dry impregnation method. For the immobilization 10mL of nutritional medium containing an amount (10g) of microorganism was mixed with the gel and at 40 C during its cooling. Then, it was stored at 15 C. Both of the carriers are glucose polymers. Cells were entrapted within the gel matrix and also immobilized by adsorption on delignified cellulosic materials. The nutritional medium contained 12% w/v initial concentration of sugars (glucose/fructose) and as a result 12 Be. Fermantations took place in simple fridge except from that at room temperature. The biomass of immobilized cells was estimated indirectly by Kjeldahl method. Scanning electron microscope was used for morphological observation that lead to conclusions about viability. Fermentation kinetics and effectiveness of temperature was performed by measuring Be density at various time intervals. Ethanol productivity and methanol concentration included into samples were determined by gas chromatography ( FID detector). 9

10 Finally, formation of volatile by-products including acetaldehyde, ethyl acetate, 1-propanol, isobutanol and amyl alcohols was determined by the same method analysis as mentioned above. 10

11 1. ΔΗΑΓΧΓΖ 1.1 θνπόο εξγαζίαο. Ζ παξνύζα εξγαζία έρεη σο αληηθείκελν ηελ παξαγσγή αηζπιηθήο αιθνόιεο ζε εξγαζηεξηαθή θιίκαθα κε ηε ρξήζε ζεξκηθά μεξακέλσλ πξώησλ πιώλ. απηό ην πιαίζην, πξαγκαηνπνηήζεθε έκκεζε εθηίκεζε ηεο παξαγόκελεο βηνκάδαο θπηηάξσλ κε ηε κέζνδν Kjeldahl. Υξεζηκνπνηήζεθε ην ειεθηξνληθό κηθξνζθόπην ζάξσζεο γηα ηελ παξαηήξεζε δεηγκάησλ βηνθαηαιύηε. Mειεηήζεθαλ νη θηλεηηθέο παξάκεηξνη ησλ δπκώζεσλ πνπ δηεμήρζεζαλ ζε νηθηαθό ςπγείν ζηηο ρακειέο ζεξκνθξαζίεο ησλ 5 C, 15 C θαη 25 C (ζεξκνθξαζία πεξηβάιινληνο). Ζ κέηξεζε ησλ αδύκσησλ ζαθράξσλ έγηλε κε ππθλόκεηξν. Δπίζεο, ππνινγίδεηαη ε παξαγσγηθόηεηα αηζαλόιεο ζε g/l/d θαη ε ζπγθέληξσζε κεζαλόιεο κε ηελ αλαιπηηθή κέζνδν ηεο αέξηαο ρξσκαηνγξαθίαο. Σέινο, κε ηε ίδηα κέζνδν αλαιύνληαη πνζνηηθά θαη πνηνηηθά ηα πηεηηθά παξαπξνηόληα πνπ παξάγνληαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αιθννιηθήο δύκσζεο. 1.2 Τπόζεζε έξεπλαο. Ζ βαζηθή ηδέα είλαη ε αλάπηπμε κηαο κεζόδνπ ηαρείαο παξαγσγήο αιθνόιεο πνπ από επίπεδν εξγαζηεξίνπ ζα κπνξεί λα ηξνπνπνηεζεί έηζη ώζηε λα εθαξκνζηεί ζε επίπεδν βηναληηδξαζηήξα. ηε κέζνδν απηή ρξεζηκνπνηείηαη έλαο βηνθαηαιύηεο. Λεηηνπξγεί ζαλ έλα θύηηαξν κε πόξνπο ζηελ επηθάλεηά ηνπ πνπ δξνύλ ζαλ αληιίεο γιπθόδεο από ην ζξεπηηθό ππόζηξσκα θαη ζπζζσξεύνπλ ζην εζσηεξηθό ηεο βηνκάδαο ην βηνκεηαηξέςηκν ζάθραξν. Ζ θαηλνηόκνο κέζνδνο ζα κπνξνύζε λα εθαξκνζηεί ζηελ νηλνπνίεζε. ε νηθηαθή θιίκαθα, παγθνζκίσο, ην ελδηαθέξνλ γηα παξαγσγή νίλνπ είλαη ειάρηζην ζε ζύγθξηζε κε ηελ έξεπλα ζε βηνκεραληθό επίπεδν. Ζ ηδέα παξαγσγήο νίλνπ ζε νηθηαθή θιίκαθα πνπ ζα ζπλδέεηαη κε ηελ βηνκεραλία θαζώο ζα αλαιάβεη ηελ παξαγσγή κηγκάησλ μεξώλ πξώησλ πιώλ θαη δπκώλ θαη ηελ ηππνπνίεζε ζε ζπζθεπαζία θαθέινπ θαίλεηαη λα έρεη πνιύ ελδηαθέξνλ εκπνξηθό θαη νηθνλνκηθό. Σα κίγκαηα είλαη εθηθηό λα κελ πεξηέρνπλ 11

12 ζπληεξεηηθά, ρξσζηηθέο θαη αξσκαηηθέο νπζίεο. Σν θόζηνο γηα ηνλ θαηαλαισηή ζα είλαη ρακειό. Ο ηξόπνο παξαζθεπήο ζα είλαη απιόο θαη νηθνλνκηθόο πνπ ζεκαίλεη όηη ζα απαηηείηαη κόλν ε πξνζζήθε ζπγθεθξηκέλεο πνζόηεηαο λεξνύ. Απαξαίηεην ζα είλαη έλα ππθλόκεηξν γηα ηελ παξαθνινύζεζε ηεο πνξείαο ηεο δύκσζεο θαη ηνλ πξνζδηνξηζκό πεξάησζήο ηεο. Ο ρξόλνο ηεο δύκσζεο ζα είλαη βέιηηζηνο θαη ν παξαγόκελνο νίλνο θαιήο πνηόηεηαο. 1.3 ύγρξνλε βηνηερλνινγία Γεληθά Ο ηνκέαο ηεο βηνηερλνινγίαο όπνπ ρξεζηκνπνηνύληαη βηνθαηαιύηεο θαη αιιάδεη ηελ κεζνδνινγία πνπ εθαξκνδόηαλ κέρξη ζήκεξα ζηε ρεκεία ( π.ρ. κε ηε ρξήζε ζηηο δπκώζεηο ) νλνκάδεηαη ιεπθή βηνηερλνινγία. Παγθνζκίσο βξίζθεηαη ζε εμέιημε, ελώ ηαπηόρξνλα ε αμηνπνίεζή ηεο είλαη θεξδνθόξα. Έρεη αλαθπξερζεί σο ε ζησπεξή επαλάζηαζε ( Ζ βηνηερλνινγία δηαθξίλεηαη ζε ηνκείο πνπ αληηπξνζσπεύνληαη από ρξώκαηα θαη εθαξκόδνληαη ζε άιινπο θιάδνπο εθηόο ηεο ρεκείαο : θόθθηλε, πξάζηλε θαη κπιέ βηνηερλνινγία. Ζ θόθθηλε θαη πξάζηλε βηνηερλνινγία έρνπλ ηαηξηθέο θαη αγξνηηθέο εθαξκνγέο αληηζηνίρσο. Ζ κπιε βηνηερλνινγία αλαθέξεηαη ζηε ρξήζε πξώησλ πιώλ πξνεξρόκελσλ από ηε ζάιαζζα γηα ηελ παξαγσγή πξνηόλησλ. ( Ηζηνξηθά ε αθηλεηνπνηεκέλε δύκε έρεη πξσηναλαθεξζεί ζην Ακβνύξγν ην 1892 από ηνλ Delbruck ζηελ 7 ε εκεξίδα δπζνπνίεζεο ζηε Γεξκαλία σο δεκέλε δύκε (Σζαθίξεο, 2005). Οη έξεπλεο ησλ αθηλεηνπνηεκέλσλ θπηηάξσλ μεθίλεζαλ πεξίπνπ πξηλ από 36 ρξόληα ζηηο αξρέο ηνπ Ζ αλάπηπμε ησλ ηερληθώλ έγηλε κε ηελ πξννπηηθή ηεο επηηπρνύο κεηάβαζεο ζηελ βηνκεραληθή θιίκαθα θαη ζα έθεξλε ξηδηθή αιιαγή ζηηο κεζόδνπο πνπ ήδε ρξεζηκνπνηνύληαλ γηα ζπλερόκελεο δπκώζεηο πςειήο παξαγσγηθόηεηαο. Υξήζε αθηλεηνπνηεκέλσλ θπηηάξσλ ζα γηλόληαλ ζηελ νηλνπνίεζε, δπζνπνίεζε, ζηελ παξαγσγή νξγαληθώλ νμέσλ θαη ακηλνμέσλ. 12

13 ( ) Ζ θιίκαθα ηεο πιήξνπο βηνκεραληθήο δηαδηθαζίαο ζπλάληεζε πνιιέο δπζθνιίεο σο πξνο ηελ επηινγή θνξέα αθηλεηνπνίεζεο θαη ηνλ ζρεδηαζκό βηναληηδξαζηήξσλ (Norton & D Amore, 1994). Αξγόηεξα, παξαηεξήζεθαλ ζεκαληηθέο αιιαγέο ζην κεηαβνιηζκό, ηε θπζηνινγία, ηε γελεηηθή ξύζκηζε θαζώο θαη ηε δπκσηηθή ηθαλόηεηα πνπ απνηέιεζαλ πιενλέθηεκα. Τπεξέρεη έλαληη ηεο ρεκηθήο θαηάιπζεο, γηαηί ε αύμεζε ηεο ηαρύηεηαο δελ επεξεάδεη ηε ζεξκνδπλακηθή ηεο αληίδξαζεο (Tyler J. et al. 2006). Οη βηνθαηαιύηεο κπνξνύλ λα ρξεζηκνπνηεζνύλ γηα ηελ βηνκεηαηξνπή ησλ ζαθράξσλ ζε αιθνόιε. ην πξόζθαην εξεπλεηηθό πεδίν έρεη απνδεηρζεί όηη απμάλνπλ ηε ηαρύηεηα κεηαηξνπήο ηνπ ζξεπηηθνύ ππνζηξώκαηνο ζε πξνηόλ, νπόηε πεξηζζόηεξα ζάθραξα αμηνπνηνύληαη ζε ιηγόηεξν ρξόλν. πλεπώο, επηηαρύλεηαη ν ξπζκόο νηλνπνίεζεο. Σα πιηθά ππνζηξώκαηα πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη είλαη κε ηνμηθά, θαηάιιεια γηα ηξόθηκα θαη αλάινγα κε ην ζρεδηαζκό ηεο ηερληθήο πνπ αθνινπζείηαη θαη ηε θύζε ησλ κηθξννξγαληζκώλ επηιέγνληαη ώζηε λα έρνπλ ζπγθεθξηκέλεο πξνδηαγξαθέο (πεγή πξνέιεπζεο, ζύζηαζε, δνκή, κεραληθέο ηδηόηεηεο) Βηνθαηαιύηεο. Οη βηνθαηαιύηεο είλαη έλδπκα, θύηηαξα ή νξγαλίδηα πνπ θαηαιύνπλ ηε βηνκεηαηξνπή ελόο ππνζηξώκαηνο ζε πξνηόλ. Απνηειεί έλα δπλακηθό ζύζηεκα θπηηάξσλ πνπ πνιιαπιαζηάδνληαη ζε έλαλ πεξηνξηζκέλν ρώξν θαη παξάγνπλ έλδπκα πνπ θαηαιύνπλ αληηδξάζεηο κε πςειή απόδνζε ζε πξνηόληα. Αθηλεηνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ είλαη ε δηαδηθαζία όπνπ ε ειεύζεξε θίλεζε ηνπο είηε πεξηνξίδεηαη ζε θάπνην πιηθό είηε ηα θύηηαξα θαζειώλνληαη ζην ππόζηξσκα. Οη βηνθαηαιύηεο θαζίζηαληαη αδηάιπηνη ζην λεξό. O Karel (1985) αλαθέξεη ηελ αθηλεηνπνίεζε ζαλ έλα θπζηθό πεξηνξηζκό ή ηε ηνπνζέηεζε άζηθησλ θπηηάξσλ ζε έλα ζπγθεθξηκέλν ρώξν κε δηαηήξεζε επηζπκεηήο θαηαιπηηθήο δξαζηεξηόηεηαο. 1.4 Αιθννιηθή δύκσζε. 13

14 Ζ αιθννιηθή δύκσζε επηηειείηαη από ηελ νκάδα ησλ ζαθραξνκπθήησλ πνπ έρνπλ ηελ ηθαλόηεηα ζε αλαεξόβηεο ζπλζήθεο λα πξνθαινύλ δπκώζεηο πδαηαλζξάθσλ κε πξνηόληα ηελ αηζπιηθή αιθνόιε θαη ην δηνμείδην ηνπ άλζξαθα. Απνηειεί ηε βάζε ηεο νηλνινγίαο. Ζ δηαδηθαζία ηεο αιθννιηθήο δύκσζεο ζπκβνιίδεηαη κε ηε βηνρεκηθή αληίδξαζε : Επκάζε C₆H₁₂O₆ > 2 CH₃CH ₂OH + 2 CO₂ + 40 kcal Με ηε δπκσηηθή δηαδηθαζία ηα απιά δάθραξα ηνπ ηύπνπ C₆H₁₂O₆ δηαζπώληαη ζε αηζαλόιε θαη εθιπόκελν αέξην CO₂. Ζ αληίδξαζε θαηαιύεηαη από ηε δπκάζε έλα κίγκα ελδύκσλ πνπ ζπληίζεληαη από ηα θύηηαξα ηεο δύκεο. Σα αλαγσγηθά δπκώζηκα ζάθραξα είλαη νη εμόδεο D(+) γιπθόδε θαη D(-) θξνπθηόδε. Ζ αληίδξαζε είλαη ελδνθπηηαξηθή. Πξαγκαηνπνηείηαη από ηα θύηηαξα ηεο δύκεο απνπζία ειεύζεξνπ νμπγόλνπ κε απνηέιεζκα ηελ παξαγσγή ελέξγεηαο θαη κε ζηόρν ηελ αλαγέλλεζε NAD+. Σα ζηάδηα ηεο αιθννιηθήο δύκσζεο ζπλνπηηθά είλαη: 1. δηάζπαζε Δμόδεο (6C) ηξηόδεο (3C) 2. αθπδξνγόλσζε 3. απνθαξβνμπιίσζε Σξηόδεο (3C) ππξνζηαθπιηθό νμύ αθεηαιδεύδε 4.αλαγσγή αηζπιηθή αιθνόιε. Έλα άιιν ζεκαληηθό ραξαθηεξηζηηθό είλαη όηη ε δύκσζε είλαη εμώζεξκε. Καηά ηε δηάξθεηα ηεο ε ζεξκνθξαζία ηνπ γιεύθνπο απμάλεηαη. Δίλαη έλα απνηέιεζκα πνπ έρεη επίπησζε ζηελ πνηόηεηα ηνπ πξνηόληνο. 14

15 Ζ ρξήζε θξπναλζεθηηθνύ ζηειέρνπο επηηξέπεη ηε δηεμαγσγή δπκώζεσλ ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο ζε ςπγείν, νπόηε ε πνηόηεηα ηνπ παξαγόκελνπ νίλνπ αλακέλεηαη λα είλαη πςειόηεξε. Δηθόλα 1. Γηάγξακκα κεηαβνιηθήο ξνήο κνλνπάηη δηάζπαζεο ηεο γιπθόδεο, πνξεία Embden-Meyerhoff (γιπθόιπζε) σο ηκήκα ηνπ ζπλνιηθνύ κεηαβνιηθνύ ράξηε. ( 1.5 Πξώηεο ύιεο Θξεπηηθά πιηθά. ηελ Διιάδα σο πξώηεο ύιεο ρξεζηκνπνηνύληαη ζαθραξνύρνη θαξπνί όπσο ε ζηαθίδα κε θύξηα πεγή ηελ γιπθόδε θαη ν ρπκόο ζηαθπιηνύ(βαζηιείνπ.,2007). Σα θύξηα ζάθραξα πνπ δπκώλνληαη από ηηο δύκεο είλαη ε γιπθόδε θαη ε θξνπθηόδε. ηελ παξνύζα εξγαζία ρξεζηκνπνηήζεθε κίγκα γιπθόδεο θαη θξνπθηόδεο 15

16 πεξηεθηηθόηεηαο πνπ πξνζνκνηάδεη ηνπ γιεύθνπο Σαθραξνκύθεηαο θαη Σηέιερνο ΑΦΑΕ-1. Ιδηόηεηεο. Γηαηί επηιέρζεθε Σαθραξνκύθεηεο. Ιζηνξηθά. Ο ζαθραξνκύθεηαο ρξεζηκνπνηείηαη ζηε δπζνπνίεζε, νηλνπνίεζε θαη αξηνπνηία. Δίλαη ν πην θαιά κειεηεκέλνο κηθξννξγαληζκόο. Δίλαη αληηθείκελν κειεηώλ βαζηθήο έξεπλαο θαη ζύζηεκα κνληέιν ηνπ επθαξπσηηθνύ θπηηάξνπ ζηε βηνινγία. Ζ νλνκαζία ηνπ είδνπο S.serevisiae ηνπ γέλνπο Saccharomyces εηζήρζε πξώηα από ηνλ Meyen ηo Δπίζεκα θαζηεξώζεθε ην 1870 από ηνλ Rees. Ο Hansen ην 1888 αλαθέξεη ην ζαθραξνκύθεηα σο δύκε κπύξαο (Viljoen B.C. et al. 2004) Αλαπαξαγωγή. Δίλαη κνλνθύηηαξνο θαη κνλνπύξελνο κηθξννξγαληζκόο. Αλαπαξάγεηαη αγελώο κε εθβιάζηεζε κε δεκηνπξγία πνιύπιεπξσλ ζπγαηξηθώλ θπηηάξσλ, ησλ εθβιαζηεκάησλ (ςεπδνκπθήιην). Δγγελώο αλαπαξάγεηαη κε αζθνζπόξηα. Από έλα + θαη έλα πθήο άηνκν πξνθύπηεη κεηά από ζπλέλσζε έλα δπγσηό. Δμειίζζεηαη ζε έλα δηπινεηδή αζθό. Ο ππξήλαο ηνπ αζθνύ δηαηξείηαη κεησηηθώο ζε 4 απινεηδείο ππξήλεο. Πεξηέρεη ζπλήζσο 4 ζθαηξίδηα αζθνζπνξίσλ (Viljoen B.C. et al ). Δίλαη ραξαθηεξηζηηθό όηη ηα απινεηδή θύηηαξα θαη ν δπγσηόο κπνξνύλ λα πνιιαπιαζηαζηνύλ εμίζνπ κε εθβιάζηεζε Μνξθνινγία θαη ηαμηλόκεζε. Σα θύηηαξα είλαη ζθαηξνεηδή ή νβάι ή θπιηλδξηθά. Δκθαλίδνληαη κε ρξώκα βνπηπξώδεο έσο ειαθξώο θξέκ ελώ ε επηθάλεηα είλαη ιεία θαη πιαηηά. Ζ ηαμηλόκεζε έρεη ππνζηεί πνιιέο αιιαγέο. Σν 1970 αλήθαλ 41 είδε ζην γέλνο. Με ηελ γελεηηθή αλάιπζε ην 85 πεξηιάκβαλε 4 ζρεηηδόκελα είδε. Μεγάιεο νκάδεο ζηειερώλ πξνηάζεθαλ ην 1990 αλαγλσξίδνληαλ 7 είδε κε 130 ζπλώλπκα θαη ππννείδε. Ζ αλαιπηηθή κέζνδνο DNA-DNA πβξηδνπνίεζεο δηαθξίλεη ην ζύλνιν ζε 4 θύξηα είδε: S.bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus θαη S. pastorianus ( ήηαλ γλσζηό σο S. sensus stricto). ήκεξα δηαθξίλνληαη ζε 16 είδε κε 95 ζπλώλπκα. Οη ραξαθηήξεο- θιεηδηά γηα ηελ ζπζηεκαηηθή θαηάηαμή ηνπο είλαη ην ζξεπηηθό ππόζηξσκα, ε πεγή ληηξηθώλ, ε 16

17 ζεξκνθξαζία αύμεζεο ηα ζπλέλδπκα (απαηηνύκελν ην Q₆) θαη ηα παξαγόκελα πξνηόληα (Viljoen B.C. et al ). Σν θπηηαξηθό ηνίρσκα ηνπ ζαθραξνκύθεηα είλαη θπξίσο πνιπζαθραξηδηθό θαη ζπλεπώο ε επηθάλεηά ηνπ είλαη πδξόθηιε. Πίλαθαο 1. πζηεκαηηθή θαηάηαμε. Βαζίιεην Φύιν Τπόθπιν Κιάζε Σάμε Οηθνγέλεηα Γέλνο Δίδνο Μύθεηεο Αζθνκύθεηεο Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae Γνκή. Ζ δνκή ελόο θπηηάξνπ ζαθραξνκύθεηα απνηειείηαη από θπηηαξόπιαζκα, έλα ππξήλα, ελδνπιαζκαηηθό δίθηπν, ππνθπηηαξηθά νξγαλίδηα, θπηηαξηθή κεκβξάλε θαη ην θπηηαξηθό ηνίρσκα. Δηθόλα 2. Γνκή θπηηάξνπ ζαθραξνκύθεηα. ( 17

18 Κπηηαξηθό ηνίρωκα ζαθραξνκύθεηα Σύζηαζε. Σν θπηηαξηθό ηνίρσκα είλαη πδξόθηιν. Απνηειεί ην 30% ηνπ μεξνύ βάξνπο ηνπ θπηηάξνπ. πλίζηαηαη από πνιπζαθραξίηεο (πεξίπνπ 85%) θαη πξσηείλεο ( πεξίπνπ 15%). Ζ καλλόδε θαη ε Ν-αθεηπινγιπθνδακίλε αληηπξνζσπεύνπλ έλα κεγάιν πνζνζηό. Έλα κηθξό πνζνζηό απνηειείηαη απν ρηηίλε θαη ζπκβάιιεη ζηελ θπηηνθίλεζε. Ζ εζσηεξηθή ζηηβάδα απνηειείηαη από γιπθάλεο θαη ρηηίλε θαη ε εμσηεξηθή από καλλνπξσηείλεο (Lesage G. et al., 2006) Σηέιερνο ΑΦΑΕ-1. Ιδηόηεηεο. ηελ παξνύζα εξγαζία επηιέρζεθε ην ζηέιερνο AXAZ-1 ηνπ είδνπο Saccharomyces cerevisiae. Φέξεη ζε κέγηζην βαζκό ηδηόηεηεο ζε ζύγθξηζε κε άιια ζηειέρε. Δίλαη αιθννιαλζεθηηθό θαζώο έρεη ηελ ηθαλόηεηα λα δπκώλεη ζε ζπλζήθεο πςειώλ ζπγθεληξώζεσλ αιθνόιεο πνπ ζεσξνύληαη ηνμηθέο γηα ηηο δύκεο. Δίλαη θξπναλζεθηηθό δηόηη επηβηώλεη ζε πνιύ ρακειέο ζεξκνθξαζίεο. Δίλαη ςπρξόθηιν θαζώο πξνηηκά ςπρξά πεξηβάιινληα γηα λα αλαπηύζζεηαη ( αλαπηύζζεηαη κεηαμύ 5-18 C, ( Παπαληθνιάνπ Β., 2006) θαη δηαηεξεί ηδαληθή ελδπκηθή ιεηηνπξγηθόηεηα αιθννιηθήο δύκσζεο αθόκα θαη ζε πνιύ ρακειέο ζεξκνθξαζίεο όπνπ ζπλήζσο ηα έλδπκα θξπζηαιιώλνληαη θαη απελεξγνπνηνύληαη. Δρεη απνκνλσζεί από ηελ κηθξνρισξίδα Διιεληθώλ ακπειώλσλ (Argiriou, 1992). Μεηά από κηα ζεηξά πεηξακάησλ έρεη θξηζεί σο ην πην θαηάιιειν ζηέιερνο γηα δπκώζεηο ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο θάησ ησλ 5 C (Σ. Argyriou, S. K.Kana et al., 1996). To ζηέιερνο AXAZ-1 έδσζε 17,6% v/v αιθνόιε κε αξρηθή ππθλόηεηα 16 Be ζε επαλαιακβαλόκελεο δπκώζεηο θαηά παξηίδεο. Σν ηειηθό Be ήηαλ 6.0 κε πξώηε ύιε ηε ζηαθίδα (Σ. Argyriou, S. K.Kana et al., 1996). Απνδείρζεθε όηη δπκώλεη πην γξήγνξα θαη ζε ππθλέο ζπγθεληξώζεηο ζαθράξσλ ε κηα άιιε έξεπλα ε δύκε αθηλεηνπνηήζεθε ζε θίζζηξε, ζθαηξίδηα γινπηέλεο θαη απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά. Σν ππόζηξσκα κεηώλεη ηελ αξρηθή ελέξγεηα ελεξγνπνίεζεο ηεο δύκσζεο. Υξεζηκνπνηήζεθε ρπκόο ζηαθπιηνύ. ηνπο -2 C έδσζε 10% v/v ζε 155 κέξεο κε αξρηθή ππθλόηεηα 11.5 Be ( T.Argiriou, S. Voliotis et al. 1996). Σν γεληθό ζπκπέξαζκα ήηαλ ε αύμεζε ηνπ ξπζκνύ βηνκεηαηξνπήο θαη ηεο ζπγθέληξσζεο αιθνόιεο ζην ηειηθό πξνηόλ ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο. 18

19 1.5.3 Κπηηαξηλνύρα πιηθά ππνζηξώκαηα Απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά Ληγλίλε. Ζ ιηγλίλε βξίζθεηαη ζην 25% πεξίπνπ ηνπ δεπηεξνγελνύο θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο ηνπ μύινπ. Πξνζηαηεύεη ην μύιν από ηελ ελδπκηθή απνηθνδόκεζε ησλ κπθήησλ. Δπίζεο, έρεη ζηεξηθηηθό θαη κεηαθνξηθό ξόιν γηα ηα ζηνηρεία όπνπ κεηαθηλείηαη ην λεξό. Δηθόλα 3. ηηβάδεο δεπηεξνγελνύο θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο. (Ζ εηθόλα είλαη επγεληθή πξνζθνξά ηεο Roberta Farell γηα ην site ) Οη μπιώδεηο ηζηνί εθηόο από ιηγλίλε ζπλίζηαληαη θαη από πεξίπνπ 27% εκηθπηηαξίλε θαη 44% θπηηαξίλε. Δηθόλα 4. Δθαηνζηηαία ζύζηαζε μπιώδνπο ηζηνύ. 19

20 Ζ ιηγλίλε ζπλδέεηαη κε ηα κηθξνηλίδηα θπηηαξίλεο. Απνζεθεύεηαη ζηα θπηηθά θπηηαξηθά ηνηρώκαηα θαηά ηε δηάξθεηα ηεο δεπηεξνγελνύο θαηά πάρνο αύμεζεο. Ζ ιηγλνπνίεζε δεκηνπξγεί μπιώδε ηνηρώκαηα θαη γη απηό είλαη αλζεθηηθά. Δηλαη πεξηζζόηεξν πδξόθνβε γηαηί ηα πνιπζαθραξηδηθά ζπζηαηηθά ησλ θπηηαξηθώλ ηνηρσκάησλ είλαη ζε πςειό βαζκό πδξόθηια. ( ssing_the_basics_01_chemistry)/ Ζ αθξηβήο δνκή ηεο δελ έρεη απνζαθεληζηεί. Ζ ιηγλίλε είλαη έλα νξγαληθό πνιπκεξέο θαηλπιν-πξνπαλνεηδώλ κνλάδσλ κε πνηθίινπο δεζκνύο C-C θαη C-O ζε κηα πνιύπινθε δνκή. Οη ππνκνλάδεο ζπλδένληαη ηπραία κεηαμύ ηνπο ζρεκαηίδνληαο έλα ηξηζδηάζηαην αζύκκεηξν δίθηπν. Δηθόλα 5. Πηζαλή δνκή ιηγλίλεο. ( ) 20

21 ρήκα 1. ηεξενδνκή ηνπ κνλνκεξνύο θπηηαξίλεο. ( asics_01_chemistry)/ Εειαηηλνπνηεκέλν άκπιν Άκπιν. Ζ βηνκεραλία έρεη ζηξαθεί πξνο αλαλεώζηκεο πεγέο πιηθώλ εηζάγνληαο θπζηθά πνιπκεξή πνπ είλαη άθζνλα ζηε θύζε. Πεγέο πινύζηεο ζε άλζξαθα, παγηδεπκέλν ζε πιέγκαηα καθξνκνξίσλ απνηεινύλ ε θπηηαξίλε, ην άκπιν θαη ε ρηηίλε ( Most Starch.asp). Σν άκπιν είλαη πνιπκεξέο ηεο γιπθόδεο απνηειείηαη από ακπιόδε θαη ακπινπεθηίλε. Ζ ακπιόδε έρεη α(1 4) γιπθνδηδηθνύο δεζκνύο θαη ν πνιπζαθραξίηεο είλαη επζεία αιπζίδα. Ζ ακπινπεθηίλε έρεη α(1 4) θαη α(1 6) δεζκνύο θαη δηαθιαδηδόκελε δνκή. Γηεπζεηνύληαη αθηηλσηά ζε ζηηβάδεο θαη ζρεκαηίδνπλ θόθθνπο. 21

22 ρήκα 2. Γνκή ακύινπ. ( 1.6 Γηεξγαζίεο Αθηλεηνπνίεζε Υιηθά ππνζηξώκαηα-πξνππνζέζεηο Πξνππνζέζεηο γηα ηελ επηινγή θνξέα αθηλεηνπνίεζεο. Γηα ηελ παξαγσγή θξαζηνύ έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί νξγαληθά, αλόξγαλα, θπζηθά πιηθά θαη ζπζηήκαηα κεκβξαλώλ. Σν πξηνλίδη πθίζηαηαη κηθξή επεμεξγαζία. (Παπαληθνιάνπ Β. 2006) Σα πιηθά επηιέγνληαη κε βάζε ζπγθεθξηκέλεο πξνππνζέζεηο ( Freeman 1984; Martin; 1991). 22

23 1. Να έρνπλ πνιιέο ιεηηνπξγηθέο αληηδξώζεο νκάδεο πνπ αληηδξνύλ κε ηα θπηηαξηθά ηνηρώκαηα θαη κεγάιε επηθάλεηα. 2. Να είλαη εύθνιν ζηε ρξήζε, νηθνλνκηθό θαη λα είλαη δπλαηό λα αλαθηάηαη. 3. Σα αθηλεηνπνηεκέλα θύηηαξα λα θαζίζηαληαη βηώζηκα θαη ιεηηνπξγηθά ζηαζεξά γηα κεγάιν ρξνληθό δηάζηεκα. 4. Σν πιηθό ζα πξέπεη λα έρεη νκνηνγελή δηαπεξαηή πθή ώζηε ηα ζξεπηηθά πιηθά, ηα παξαγόκελα πξνηόληα θαη ηα αέξηα λα πεξλνύλ κε απιή δηάρπζε. 5. Θα πξέπεη λα είλαη κεραληθά, ρεκηθά, βηνινγηθά θαη ζεξκηθά ζηαζεξό, λα αληέρεη ζηε δξάζε ελδύκσλ, ηελ σζκσηηθή πίεζε θαη δηαιύηεο. 6. Σν ππόζηξσκα ζα πξέπεη λα άθζνλν, θαηάιιειν γηα ηξόθηκα, θαη πνηνηηθό. 7. Ζ βηνινγηθή δξαζηεξηόηεηα δελ πξέπεη λα επεξεάδεηαη από ηε δηαδηθαζία αθηλεηνπνίεζεο Τερληθέο αθηλεηνπνίεζεο Αξρέο κεζόδωλ Φπζηθέο κέζνδνη αθηλεηνπνίεζεο θπηηάξωλ. Πξνζξόθεζε ( adsorption or attachment ) Πξνζθέξεη πνιύ ήπηα κέζνδν ( ελώ ρξεζηκνπνηείηαη επξύηαηα. Υαξαθηεξίδεηαη σο αζηαζήο κέζνδνο. Παξάγνληεο πνπ πεξηνξίδνπλ ηελ απνηειεζκαηηθόηεηα ηεο κεζόδνπ είλαη ε αλαζηξέςηκε θύζε ζύλδεζεο ( όηαλ απνθιίλνπλ νη ζπλζήθεο ηνπ πδαηηθνύ κέζνπ. Κνηλό παξάγνληα κε ηελ κέζνδν εγθισβηζκνύ πεξηιακβάλεη ν πεξηνξηζκόο ηεο ρσξεηηθόηεηαο ηνπ θνξηώκαηνο θαη ε απνθόιιεζε ηεο βηνκάδαο πνπ θαηαιήγεη ζηελ 23

24 θηλεηή θάζε. Ζ θόξησζε είλαη εκπεηξηθή θαη έρεη θαζνξηζηεί κε βάζε ην θξηηήξην όηη ε δηάκεηξνο ησλ πόξσλ πξέπεη λα είλαη ιίγν κεγαιύηεξε από ηηο δηαζηάζεηο ησλ κηθξννξγαληζκώλ (Klein J. et al., 1990). Σα πιηθά πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη είλαη ζπλήζσο πνξώδε θαη αδξαλή. Μηα θιίζε ζξεπηηθώλ εγθαζίζηαηαη ζην κέζν θαη ηα θύηηαξα θαζώο είλαη θαζεισκέλα θαη πην θνληά ζηελ ύιε κηα ηδαληθή πνζόηεηα ζξεπηηθώλ εθηίζεηαη ζηελ επηθάλεηά ηνπο. Μεξηθνί κηθξννξγαληζκνί ζπλδένληαη κε κε εηδηθνύο δεζκνύο, ραιαξά ή κε αληηδξάζεηο κε δπλάκεηο van der Waals ή πδξνγόλνπ θαη απνζπλδένληαη εύθνια. Μπνξεί λα θύηηαξα λα ζπλδένληαη κε πην ηζρπξέο ειεθηξνζηαηηθέο δπλάκεηο ζπγθεθξηκέλα κε ηνληηθνύο δεζκνύο αλάινγα κε ην ππόζηξσκα θαη ηα θύηηαξα. Παγίδεπζε ζε δηθηπσηά πνιπκεξή (entrapment ) Σα θύηηαξα εγθιείνληαη κέζα ζε κηα ηξηζδηάζηαηε ύιε ( θαηά ηελ ζηεξενπνίεζε ελώ έρνπλ θάπνην βαζκό ειεύζεξεο θίλεζεο κεηαμύ ησλ δηαθέλσλ ηνπ πιηθνύ. Ζ δηάρπζε ελώζεσλ έρεη δηπιή θαηεύζπλζε κεηαμύ δηαιύκαηνο θαη βηνθαηαιύηε. Οξγαληθά πνιπκεξή είλαη δηαζέζηκα γηα λα εγθισβίζνπλ θύηηαξα, όπσο θπηηαξίλε, θ-θαξαγελάλε, άγαξ/αγαξόδε, θνιιαγόλν, πνιπνπξεζάλε θαη πνιπαθξπακίδε. (Trevan, 1980 ; Mattiason 1983a, Brodelius 1985, Scott 1987 ). Τπάξρνπλ παξάγνληεο πεξηνξηζκνύ ηεο κεζόδνπ. Σν κνξηαθό βάξνο είλαη πεξηνξηζηηθό γηα ηα ζξεπηηθά θαη ην πξνηόλ (δελ απνηειεί κείδνλ πξόβιεκα γηα ηα πδαηηθά ζπζηήκαηα). Ζ θέξνπζα ηθαλόηεηα ή ε θόξησζε ηεο ύιεο κε θύηηαξα είλαη πεξηνξηζκέλεο ( Kuhn 1988, Kuhn and Pfister, 1989). Ζ δηαδηθαζία παγίδεπζεο ησλ θπηηάξσλ κεηώλεη ηελ βησζηκόηεηα όηαλ ρξεζηκνπνηνύληαη πνιπαθξηιακίδε ή πνιπνπξεζάλε γη απηό ν πνιπκεξηζκόο μεθηλά ηερλεηά π.ρ. κε ππεξηώδε αθηηλνβνιία (Mattiason, 1983b). Πεξηιακβάλεη ηελ παγίδεπζε εληόο ηνπ δηθηπσηνύ πνιπκεξνύο. Ο θνξέαο είλαη πδξόθηινο θαη ζπλήζσο πξνθαιείηαη ν πνιπκεξηζκόο ηνπ κεηά ηελ αλάκημε κε ην βηνθαηαιύηε. Υξεζηκνπνηνύληαη ηα πιηθά : θνιιαγόλν, πνιπαθξηιακίδην, θηηξηθή θπηηαξίλε, άκπιν, αγαξόδε, θαξαγελάλε θαη αιγηληθό αζβέζηην. Δγθισβηζκόο ζε κηθξνθάςνπιεο ( encapsulation) 24

25 Απνηειεί κέζνδν κεραληθήο ζπγθξάηεζεο. πγθξηηηθά κε ηηο άιιεο κεζόδνπο δηαηεξεί ην δηαιπηό κηθξνπεξηβάιινλ γύξσ από ηε βηνκάδα παξά ηηο θπζηθέο ή ρεκηθέο δπλάκεηο πνπ απαηηνύληαη γηα ηελ αθηλεηνπνίεζε ( Klei et al.1995 ). Τπεξληθά ηα πξνβιήκαηα πνπ αληηκεησπίδνπλ νη άιιεο κέζνδνη. ε απηή ηε δηαδηθαζία ε ζπκβαηηθή κέζνδνο ζρεκαηηζκνύ αζβεζηηναιγηληθώλ ζθαηξηδίσλ αληηζηξέθεηαη. Μπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί ρισξηνύρν αζβέζηην ζε έλα δηάιπκα αιγηληθνύ λαηξίνπ θαη θύηηαξα. Ακέζσο ζρεκαηίδεηαη εκηπεξαηή κεκβξάλε ζηελ επηθάλεηα ηνπ κηθξνελπδαησκέλνπ ζηαγνληδίνπ κε ηνληηθέο αιιειεπηδξάζεηο (klei 1983, 1986 ). H πάρπλζε ησλ ηνηρσκάησλ, ην κέγεζνο ησλ πόξσλ, ην θνξηίν ηεο επηθάλεηαο θαη ε κεραληθή αληίζηαζε ηεο κηθξνθάςνπιαο κεηαβάιινληαη κε ρξήζε ζπκπαξάγνληα ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξώζεηο ( Tampion and Tampion, 1987, Park and Chang, 2000) Φεκηθέο κέζνδνη αθηλεηνπνίεζεο. Οκνηνπνιηθή ζύλδεζε (covalent attachment). Απνηειεί κέζνδν πξνζθόιιεζεο (πξνζξόθεζεο) ζε επηθάλεηα. Δπηηπγράλεηαη κε αιιειεπίδξαζε δξαζηηθώλ νκάδσλ ηνπ ππνζηξώκαηνο θαη ηεο θπηηαξηθήο επηθάλεηαο. Οκαδνπνίεζε ή ζπκπνιπκεξηζκόο (δηακνξηαθή ζύλδεζε) ( aggregation-cross-linking). Μεξηθνί κηθξννξγαληζκνί θαη ζπγθεθξηκέλα ζηειέρε δπκώλ έρνπλ ηελ ηάζε λα νκαδνπνηνύληαη θαη λα ζρεκαηίδνπλ ζπζζσκαηώκαηα. Ζ παξαγσγή εμσθπηηάξηαο ύιεο (πνιπκεξώλ ελώζεσλ, EPS ) θαη ε δεκηνπξγία ζπζζσκαησκάησλ κε απνηέιεζκα έγθιεηζηα θύηηαξα πεξηιακβάλεη έλα θπζηθό κεραληζκό. Αλάινγα κε ηνπο κηθξννξγαληζκνύο θαη ηα εμσπνιπκεξή πνπ παξάγνπλ ε βηνκάδα εκθαλίδεηαη ηζρπξά ζπλδεδεκέλε κε θαιή ηθαλόηεηα πξνζθόιιεζεο ζε θνξέα, όπσο ζηα κεζαληνβαθηήξηα ή αζζελώο. Ο ζρεκαηηζκόο βηνκάδαο ζπζζσκαηώκαηνο πνηθίιιεη κεηαμύ κηθξννξγαληζκώλ π.ρ. κεζαληνβαθηήξηα παξάγνπλ ηζρπξά ζπλδεδεκέλε βηνκάδα θπηηάξσλ κε θαιή ηθαλόηεηα θαζήισζεο ζε ζύγθξηζε κε θύηηαξα πνπ ζπλδένληαη αζζελώο. Σερλνινγία ζπκβαηηθήο ζύλδεζεο ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα απμήζεη ην βαζκό ζπζζσκάησζεο ( Brodelius, 1985 ). 25

26 Τπάξρνπλ θαη πεξηνξηζηηθνί παξάγνληεο. Οη πδαηηθέο ζπλζήθεο κπνξεί λα επέκβνπλ αξλεηηθά ζην ζρεκαηηζκό ζπζζσκαησκάησλ θαη δηακνξηαθώλ ζπλδέζεσλ θαη λα θηλεηνπνηήζνπλ ηα θύηηαξα. πλδπαζκνί κεζόδσλ Δίλαη δπλαηόλ λα ρξεζηκνπνηεζνύλ ζπλδπαζκνί ησλ πξναλαθεξόκελσλ κεζόδσλ γηα ηελ αθηλεηνπνίεζε θπηηάξσλ θαη ελδπκηθώλ ζπζηεκάησλ. Σα ππνζηξώκαηα πξέπεη λα είλαη ζπκβαηά (αληηδξάζεηο ζύλδεζεο). Entrapment Attachment or adsorption Aggregation or Cross-linking Encapsulation ( Pilkington et al. 1998) Δηθόλα 6. Μέζνδνη αθηλεηνπνίεζεο. 26

27 1.6.3 Δθαξκνγέο Δθαξκνγή παξαιιαγήο κεζόδωλ. ηελ παξνύζα εξγαζία αλαπηύρζεθε κηα κέζνδνο αθηλεηνπνίεζεο θπηηάξσλ κε ππόζηξσκα ην δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν θαη απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά. Απνηειεί ζπλδπαζκό κεζόδσλ παγίδεπζεο θαη πξνζξόθεζεο. Σα ππνζηξώκαηα είλαη πδξόθηια. Απνηεινύληαη από πνιπκεξή γιπθόδεο. Σα θύηηαξα παγηδεύνληαη ζην δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν ην νπνίν ηαπηόρξνλα ηα ζπγθξαηεί ζε κεγάιν βαζκό ζηελ αδηάιπηε θάζε. πγρξόλσο, θαηαιακβάλνπλ ζέζεηο ζηα θελά ηνπ απνιηγλνπνηεκέλνπ θπηηαξηλνύρνπ πιηθνύ θαη θαζειώλνληαη. Ζ εθηίκεζε αθηλεηνπνίεζεο είλαη εκπεηξηθή θαη ε επηηπρία ηεο κεζόδνπ εμαξηάηαη από ηε δηάκεηξν ησλ πόξσλ θαη ηελ αθηίλα ησλ θπηηάξσλ ηεο δύκεο.( Klein et al., 1990). Απνπζία ιηγλίλεο δεκηνπξγνύληαη θελέο ζέζεηο θαζήισζεο ησλ θπηηάξσλ. Σα πνιπκεξή από ηα νπνία ζπλίζηαηαη ηειηθώο ην κίγκα ππνζηξσκάησλ αθηλεηνπνίεζεο είλαη ε θπηηαξίλε, ε εκηθπηηαξίλε θαη ην άκπιν Πιενλεθηήκαηα-Μεηνλεθηήκαηα Γεληθά Πιενλεθηήκαηα ηωλ κεζόδωλ. Αλαθύθισζε ηνπ βηνθαηαιύηε θαη επαλαρξεζηκνπνίεζε. ( Αύμεζε ηεο ζηαζεξόηεηαο, ελεξγόηεηαο ησλ ελδύκσλ θαη εθιεθηηθόηεηαο ππνζηξσκάησλ (Βαζηιείνπ. 2007). Δπθνιόηεξε αλάθηεζε πξνηόλησλ δηόηη βξίζθνληαη ζηελ δηαιπηή θάζε θαη δελ αλακηγλύνληαη κε ην πξνηόλ. ( Υξήζε ζε ζπζηήκαηα ζπλερνύο ιεηηνπξγίαο. 27

28 Μεηνλεθηήκαηα ηωλ κεζόδωλ. Πεξηνξηζκνί ιόγσ δηάρπζεο. ( Μεγάιε κε θαηαιπηηθή κάδα. Πηζαλή απώιεηα δξαζηηθόηεηαο Αθηλεηνπνίεζε θπηηάξωλ. Πιενλεθηήκαηα. Σα αθηλεηνπνηεκέλα θύηηαξα εκθαλίδνπλ κεγάιε ιεηηνπξγηθή ζηαζεξόηεηα θαη αληνρή ( Kourkoutas Y. et al )ζην πεξηβάιινλ δύκσζεο γεγνλόο πνπ απνδίδεηαη ζηνλ πξνζηαηεπηηθό ξόιν ηνπ ππνζηξώκαηνο αθηλεηνπνίεζεο. Σα αθηλεηνπνηεκέλα θύηηαξα είλαη ζε ππθλέο ζπγθεληξώζεηο ζηελ επηθάλεηα ηνπ ππνζηξώκαηνο ζε ζύγθξηζε κε ηα ειεύζεξα πνπ θαηαλέκνληαη νκνηόκνξθα ζην δηάιπκα. Απμάλεηαη ν ξπζκόο θαηαλάισζεο ζαθράξσλ. ε βηναληηδξαζηήξεο κπνξνύλ λα ρξεζηκνπνηεζνύλ ζε κεγάιεο ζπγθεληξώζεηο. πλεπώο, αλακέλεηαη πςειή απόδνζε θαη κείσζε ηνπ θόζηνπο κε κείσζε ηνπ όγθνπ ηνπ βηναληηδξαζηήξα.(βαζηιείνπ., 2007) Δίλαη εθηθηέο νη δπκώζεηο ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο κε πξνηόληα βειηησκέλεο πνηόηεηαο θαη νξγαλνιεπηηθνύ ραξαθηήξα Μεηώλεηαη ην θόζηνο θαζαξηζκνύ ηνπ πξνηόληνο από ηα αθηλεηνπνηεκέλα θύηηαξα θαζώο δελ αλακηγλύνληαη κε ην ηειηθό πξνηόλ Δπίδξαζε αθηλεηνπνίεζεο ζηα θύηηαξα. Ζ αθηλεηνπνίεζε επηδξά ζηα θύηηαξα κε επεξγεηηθό ηξόπν. 1. Παξαηεξείηαη αιιαγή ζηε κνξθνινγία ησλ παγηδεπκέλσλ θπηηάξσλ. (Melzoch et al., 1994, Norton and D amore1994, Μalone et, al.,1995). 2. Γηαηεξνύληαη θαιύηεξα όηαλ απνζεθεύνληαη. 28

29 2007).. 3. Ζ δπκσηηθή ηνπο ηθαλόηεηα είλαη ζηαζεξή ζε δηαθπκάλζεηο ph ( Βαζηιείνπ. 4. Σν ελδνθπηηαξηθό ph κεηώλεηαη θαζώο απμάλεηαη ε δηαπεξαηόηεηα ζε Ζ+ θαη ην ΑΣP θαηαλαιώλεηαη πην γξήγνξα κε απνηέιεζκα ηελ αύμεζε ηεο δξαζηηθόηεηαο ησλ θηλαζώλ : θσζθσθξνπθηνθηλάζεο, εμνθηλάζεο θαη Ζ+ -ATPάζεο. Ζ 6- θσζθνξηθή γιπθόδε παξνπζηάδεη απμεκέλν ξπζκό ξνήο ελδνθπηηαξηθά κε ηειηθό απνηέιεζκα ηελ αύμεζε ηεο παξαγσγηθόηεηαο ( Βαζηιείνπ. 2007). 5. Απμάλεηαη ε δηαβαηόηεηα ηεο θπηηαξηθήο κεκβξάλεο κε ραξαθηεξηζηηθή ηελ παξνπζία πεξηζζόηεξσλ θνξεζκέλσλ ιηπαξώλ νμέσλ κε απνηέιεζκα ε αηζαλόιε λα απνκαθξύλεηαη ζην εμσηεξηθό ηαρύηεξα (Hilge-Rotman & Rehm 1991; Fumiet al., 1994) Απνιηγλνπνίεζε. Με ηελ απνιηγλνπνίεζε εμάγεηαη απνθιεηζηηθά ε ιηγλίλε από ηα θπηηαξηλνύρα πιηθά θαη ζηε ζέζε ηεο δεκηνπξγνύληαη θελά όπνπ πξνζξνθώληαη ηα παγηδεπκέλα ζε δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν θύηηαξα. Ζ απνκάθξπλζε ηεο ιηγλίλεο από ην πξηνλίδη επηηπγράλεηαη κεηά από θαηεξγαζία κε ζεξκό αξαηό δηάιπκα πδξνμεηδίνπ ηνπ λαηξίνπ ( Koutinas et al., 1981 ). Ζ ιηγλίλε απνκαθξύλεηαη γηαηί 1) είλαη πδξόθνβε θαη δελ ζπκβάιιεη ζηελ αθηλεηνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ, 2)δεκηνπξγνύληαη θελά θαη πόξνη απμάλνληαο ηελ εηδηθή επηθάλεηα ηνπ ππνζηξώκαηνο θαη 3) ηελ δπλακηθόηεηα ζέζεσλ αθηλεηνπνίεζεο. Με ηελ αθηλεηνπνίεζε ιόγσ δηεπζέηεζεο απμάλεηαη ε βηνδξαζηηθή επηθάλεηα ηνπ βηνθαηαιύηε θαη πξαγκαηνπνηείηαη θαηάιπζε ηεο δύκσζεο κε πςειόηεξε ηαρύηεηα. Σα θύηηαξα πνπ δηαηάζζνληαη ζηελ επηθάλεηα είλαη πεξηζζόηεξα θαζώο θαηαιακβάλνπλ κεγαιύηεξν εκβαδό απ όηη ηα ειεύζεξα πνπ είλαη δηάρπηα ζην δηάιπκα. Όζν κεγαιύηεξε είλαη ε επηθάλεηα επαθήο κε ηελ θηλεηή θάζε ηνπ δηαιύκαηνο ηόζν θαιύηεξε θαίλεηαη λα είλαη θαη ε ρξήζε ησλ ζξεπηηθώλ ζπζηαηηθώλ πνπ πεξηέρεη από ηα θύηηαξα. 29

30 Σν απνιηγλνπνηεκέλν θπηηαξηλνύρν πιηθό δελ δηαζπάηαη απν ηε δύκε θαζώο δελ παξάγεη θπηηαξηλάζεο έλδπκα πνπ δηαζπνύλ ηελ θπηηαξίλε Εειαηηλνπνίεζε. Σν δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν ρξεζηκνπνηείηαη ζε απηήλ ηελ εξγαζία σο θνξέαο ησλ θπηηάξσλ θαη είλαη πδξόθηιν πιηθό. Έρεη πξνέιεπζε πξώηεο ύιεο ην θξηζάξη θαη είλαη θεξώδεο. πγθξαηεί ηα θύηηαξα θνληά θαη ζπκβάιιεη ζηελ θαιύηεξε ζπλεθηηθόηεηα ηεο βηνθαηαιπηηθήο δνκήο ηνπ ζπζηήκαηνο. H δύκε θαηαβνιίδεη γιπθόδε, θξνπθηόδε, καιηόδε, γαιαθηόδε, καιηνηξηνδε θαη μπινπιόδε. Ο ζαθραξνκύθεηαο δελ παξάγεη ακπιάζεο πνπ ζα δηαζπνύζαλ ηνλ πνιπζαθραξίηε, όπνηε ε δνκή ηνπ δηαηεξείηαη. Πεξηιακβάλεη έλα ζύζηεκα παγίδαο κηθξννξγαληζκώλ πνπ πεξηθιείεη ηα θύηηαξα κέζα ζε gel. Καηαηάζζεηαη ζηηο ηερληθέο παγίδεπζεο. Σν άκπιν ρξεζηκνπνηείηαη επξέσο ζηε βηνκεραλία ηξνθίκσλ. Υξεζηκνπνηείηαη γηα θαιύηεξε ζπλεθηηθόηεηα θαζώο ζπκβάιιεη ζηε ζηαζεξνπνίεζε ηνπ βηνθαηαιύηε. Ζ επηινγή ηεο πεγήο ακύινπ εμαξηάηαη από ηα ραξαθηεξηζηηθά πνπ απαηηνύληαη όπσο ρξόλνο θαη ζεξκνθξαζία δειαηηλνπνίεζεο, ε πθή θαη ζηαζεξόηεηα ηνπ ηειηθνύ δηαιύκαηνο. Σα θξηηήξηα εμαξηώληαη από ηηο παξακέηξνπο : 1) Μέγεζνο θαη ζρήκα θόθθσλ, 2) ηελ αλαινγία ακπιόδεο θαη ακπινπεθηίλεο θαη από 3) ηε δνκή ησλ κνξίσλ πνιπζαθραξηηώλ Θεξκηθή μήξαλζε. ηελ παξνύζα εξγαζία ρξεζηκνπνηήζεθαλ δπν κέζνδνη μήξαλζεο γηα ζύγθξηζε ηνπ ρξόλνπ μήξαλζεο. Δίλαη κηα απνδεθηή δηεξγαζία ζπληήξεζεο ηξνθίκσλ θαη κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί θαη γηα ηηο δύκεο. Ζ ζπκβαηηθή μήξαλζε ζηνπο 100 C πξαγκαηνπνηήζεθε δηόηη ζε απηή ηε ζεξκνθξαζία πνπ είλαη ην ζεκείν δέζεσο ηνπ λεξνύ απνκέλεη κόλν ε μεξή βηνκάδα ησλ θπηηάξσλ γηα ηα ειεύζεξα θύηηαξα θαη ν μεξόο βηνθαηαιύηεο γηα ηελ αθηλεηνπνηεκέλε δύκε ζην ππόζηξσκα. Ζ ζεξκηθή μήξαλζε κε ξεύκα αέξα έγηλε ζηνπο 35 C. Πξνηηκάηαη απηή ε κέζνδνο θαζώο επηηπγράλεηαη κεγαιύηεξε βησζηκόηεηα θπηηάξσλ θαη πςειόηεξε ηαρύηεηα μήξαλζεο κε ζεκαληηθό θέξδνο ρξόλνπ. Με ηελ κέζνδν μήξαλζεο κεηώλεηαη ε ελεξγόηεηα ηνπ λεξνύ (aw). Αθαίξεζε ηεο 30

31 πγξαζίαο από ηα δείγκαηα ζεκαίλεη απνκάθξπλζε ηεο πνζόηεηαο ηνπ λεξνύ πνπ είλαη δηαζέζηκν γηα αληηδξάζεηο θαη αλάπηπμε παζνγόλσλ κηθξννξγαληζκώλ. Υξεζηκεύεη ηαπηόρξνλα θαη ζαλ κέζνδνο ζπληήξεζεο. 1.7 Μέηξεζε ζαθράξσλ Φξήζε ππθλόκεηξνπ Ζ κέζνδνο πνπ αθνινπζήζεθε γηα ηελ κέηξεζε ησλ ζαθράξσλ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο θάζε δύκσζεο ήηαλ ε κέηξεζε ηεο ππθλόηεηαο ησλ ζαθράξσλ πνπ απέκελαλ ζε ηαθηά ρξνληθά δηαζηήκαηα. Γηα ηελ εθηίκεζε ηεο ηαρύηεηαο δύκσζεο θαηαζθεπάζηεθε δηάγξακκα θηλεηηθήο δπκώζεσλ ζύκθσλα κε ηα απνηειέζκαηα ησλ κεηξνύκελσλ ησλ ζαθράξσλ. Ζ δηόξζσζε ηεο ππθλόηεηαο ησλ ζαθράξσλ πνπ κεηξήζεθε έγηλε κε ηε βνήζεηα ηνπ ηύπνπ : ηειηθό Be = κεηξνύκελν Be + (Γ * 0,045), όπνπ Γ= ζεξκνθξαζία κέηξεζεο ζεξκνθξαζία κπνκόκεηξνπ (20 C). Υξεζηκνπνηήζεθαλ ππθλόκεηξα βαζκνινγεκέλα ζε θιίκαθα ησλ 0-10 Be θαη 10-20Be. Γηα ην ππνινγηζκό ηεο ζπγθέληξσζε ζαθράξσλ, δεδνκέλνπ όηη πεξίπνπ 17g ζαθράξσλ ζην ιίηξν ρξεηάδνληαη γηα ηελ αύμεζε θαηά 1 Be, ηα ζάθραξα πνπ απνκέλνπλ πνιιαπιαζηάδνληαη επη 17 κε ην πξαγκαηηθό κπνκέ. 1.8 Αλαιπηηθέο κέζνδνη Μέζνδνο Kjeldahl Ιζηνξηθά Ο Γαλόο ρεκηθόο Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl αλέπηπμε ηε κέζνδν πξνζδηνξηζκνύ ηνπ αδώηνπ ζε δείγκαηα νξγαληθήο ύιεο. Υξεζηκνπνίεζε κηα εξγαζηεξηαθή ηερληθή πνπ νλνκάζηεθε κέζνδνο Kjeldahl. Παξνπζηάζηεθε ζηηο 7 Μαξηίνπ 1883 ζηε Danish chemical Society 31

32 ( Φξήζε ηεο κεζόδνπ. Ζ κέζνδνο Kjeldahl ρξεζηκνπνηείηαη γηα ην ππνινγηζκό ηεο βηνκάδαο αθηλεηνπνηεκέλσλ θπηηάξσλ ζε γξακκάξηα (g) πνπ πεξηέρεη ν βηνθαηαιύηεο. Δίλαη ε πνζόηεηα ησλ θπηηάξσλ πνπ κπνξεί λα ζπγθξαηήζεη ην ππόζηξσκα. Ζ πνζόηεηα αδώηνπ αληηζηνηρεί ζε εθείλν ην άδσην πνπ πεξηέρνπλ δεζκεπκέλν ζε πξσηείλεο ηα θύηηαξα. Ζ πνζόηεηα ηνπ ζξεπηηθνύ δηαιύκαηνο πνπ πξνζξνθάηαη ζην πιηθό αθηλεηνπνίεζεο ζεσξείηαη ακειεηέα θαζώο ην κεγαιύηεξν πνζνζηό ακκσληαθνύ αδώηνπ αθνκνηώλεηαη από ηα θύηηαξα Αξρή ηεο κεζόδνπ. Πεξηιακβάλεη ηελ πέςε ηνπ δείγκαηνο κε ππθλό H₂SO₄ πξνο CO₂, H₂O θαη ΝΖ₃. Ζ ΝΖ₃ απνδεζκεύεηαη κε 30% ΝαΟΖ από ην παξαγόκελν (ΝΖ₄)₂SO₄ θαη απνζηάδεη κε πδξαηκνύο ζηνλ ππνδνρέα πνπ πεξηέρεη πξόηππν δηάιπκα HCl 0,1Ν. Πξνζδηνξίδεηαη κε νγθνκέηξεζε ε πεξίζζεηα ηνπ πξόηππνπ δηαιύκαηνο κε NaOH θαη δείθηε ειηαλζίλεο. Από ηε ζηνηρεηνκεηξία ηεο αληίδξαζεο ππνινγίδεηαη ε πνζόηεηα ηνπ αδώηνπ επη ηνηο % Αέξηα ρξσκαηνγξαθία (Gas chromatography, GC) Ιζηνξηθά. Ο βνηαλνιόγνο Michael Tswett ην 1906 εηζήγαγε ηε κέζνδν θαη ηηο γεληθέο αξρέο ρξσκαηνγξαθίαο. Αθνινύζεζε ηε δηαδηθαζία ρξσκαηνγξαθίαο πξνζξξόθεζεο γηα λα απνκνλώζεη ηε ρισξνθύιιε θαη ηα θαξνηελνεηδή (ρξσζηηθέο ησλ θύιισλ) ύζηεξα από εθρύιηζε από θύιια γηα ηελ εμαγσγή κηγκάησλ ρξσζηηθώλ νπζηώλ. Ωο δηαιύηε ρξεζηκνπνίεζε πεηξειαηθό αηζέξα ελώ ε ζηήιε ήηαλ πιεξσκέλε κε ζθόλε θηκσιίαο. Οη θαζαξέο νπζίεο πνπ ηαπηνπνηήζεθαλ κηα πξνο κηα ζηελ έμνδν ηεο ζηήιεο ήηαλ έγρξσκεο (πξάζηλεο θαη θίηξηλεο) θαη γη απηό ε δηαδηθαζία νλνκάζηεθε ρξσκαηνγξαθία (>ρξώκα + γξάθσ). ήκεξα είλαη δπλαηή θαη ε πνζνηηθνπνίεζε ησλ θαζαξώλ νπζηώλ (Κινύξαο Γ., 2005) Γεληθέο αξρέο κεζόδνπ αέξηνπ ρξωκαηνγξάθνπ. Ζ κέζνδνο δηαρσξηζκνύ νπζηώλ από κίγκαηα απνηειείηαη από κηα θηλεηή θαη κηα ζηαηηθή θάζε. Σν είδνο ηεο ρξσκαηνγξαθίαο είλαη ε ρξσκαηνγξαθία ζηήιεο. Ζ θηλεηή θάζε ζπλίζηαηαη από ην αδξαλέο θέξνλ αέξην, ην Ν2, καδί κε αέξην κίγκα από αηκνύο ησλ 32

33 ελώζεσλ. Ζ αθίλεηε θάζε απνηειείηαη από έλα πγξό κίγκα πξνζξνθεκέλν ζε έλα ζηεξεό ην νπνίν ηειηθώο παθεηάξεηαη ζηε ζηήιε. (Κινύξαο Γ., 2005). Καζώο ην θέξνλ αέξην δηαβηβάδεηαη θαη κεηαθηλείηαη κέζα ζηε ζηήιε νη ελώζεηο ζπγθξαηνύληαη είηε ιηγόηεξν είηε πεξηζζόηεξν από ηε ζηαηηθή θάζε. Ο ρξόλνο ζπγθξάηεζεο κηαο έλσζεο από ε ζηήιε, ν ρξόλνο πνπ ρξεηάδεηαη γηα λα θηάζεη ζην αληρλεπηή, είλαη ζηαζεξόο γηα δεδνκέλε ζεξκνθξαζία. Δμαξηάηαη άκεζα από ηε ζεξκνθξαζία. Ζ κέζνδνο ζηεξίδεηαη ζην ρξόλν ζπγθξάηεζεο κε απνηέιεζκα ηε δηαθνξεηηθή ηαρύηεηα έθινπζεο ησλ ελώζεσλ. Ζ ηαπηνπνίεζε νπζηώλ είλαη δπλαηή κε ηε ρξήζε ησλ δεδνκέλσλ ρξόλσλ ζπγθξάηεζεο κε ηα απνηειέζκαηα ησλ ρξόλσλ ζην δηάγξακκα θαηαγξαθήο. Μηα εζσηεξηθή πξόηππε νπζία ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηε ράξαμε γξακκήο βάζεο θαη αληρλεύεηαη πξώηε. Κάζε θνξπθή αληηζηνηρεί ζε κηα ζπγθεθξηκέλε νπζία. Οη θνξπθέο θαηαγξάθνληαη απηόκαηα από ην θαηαγξαθηθό θαζώο νη νπζίεο πεξλνύλ από ην αληρλεπηή Σρεκαηηθή δηάηαμε ηεο ζπζθεπήο αέξηνπ ρξωκαηνγξάθνπ. Ζ ζπζθεπή αέξηνπ ρξσκαηνγξάθνπ απνηειείηαη από κηα θηάιε κε ην Ν₂ ππν πίεζε, ηνλ εηζαγσγέα ηνπ δείγκαηνο, έλα θνύξλν κε ηε ζπεηξνεηδή ζηήιε, ηνλ αληρλεπηή ηνληζκνύ θιόγαο (Flame Ionization Detector, FID) θαη έλα θαηαγξαθηθό κεράλεκα.. ρήκα 3. Γηάγξακκα θαηαζθεπήο αέξηνπ ρξσκαηνγξάθνπ. ( Αξρέο ιεηηνπξγίαο. Σα ζπζηαηηθά ηνπ κίγκαηνο δηαρσξίδνληαη κε θαηαλνκή κεηαμύ κηαο πγξήο ζηαηηθήο 33

34 θαη κηαο αέξηαο θηλνύκελεο θάζεο κέζα ζηε ζηήιε. Δηζαγσγή δείγκαηνο ζηε ζηήιε. Σν δείγκα εηζάγεηαη κε κηθξνζύξηγγα ζηε βαιβίδα εηζαγσγήο ζηελ θνξπθή ηεο ζηήιεο. Ζ εηζαγσγή είλαη άκεζε. Όιν ην δείγκα πνπ εηζάγεηαη κε έλεζε εηζέξρεηαη ζηε ζηήιε (ιεηηνπξγία splitless). ηήιε πιεξώζεσο. Δίλαη έλαο κεηαιιηθόο ζσιήλαο πιεξσκέλνο κε θνθθώδεο αδξαλέο πιηθό επηθαιπκκέλν κε ιεπηή ζηηβάδα κε πηεηηθνύ πγξνύ, ην πξνζξνθεηηθό πιηθό. Ρύζκηζε θαη αλάιπζε δείγκαηνο. Ζ πίεζε ηνπ αεξίνπ ξπζκίδεηαη κε εηδηθέο βαιβίδεο θαη ξνόκεηξα. Σν δείγκα εμαηκίδεηαη θαη εμαεξώλεηαη. Οη ελώζεηο θαηαλέκνληαη θαη δηαρσξίδνληαη αλάινγα κε ην κνξηαθό βάξνο αλάκεζα ζηε θάζε ηνπ κε πηεηηθνύ πγξνύ θαη ηνπ θέξνληνο αεξίνπ πνπ παξαζέξλεη ηηο νπζίεο απηέο. Αληρλεπηήο. Σειηθά, νη ελώζεηο θαίγνληαη θαη ηνλίδνληαη ζηε θιόγα H₂-O₂ ζηνλ αληρλεπηή. Ζ αγσγηκόηεηα ησλ νπζηώλ αιιάδεη. Βαζίδεηαη ζηελ εμίζσζε: Οξγαληθή νπζία + Ζ₂ + Ο₂ CO₂ + H₂O + [θαηηνληα] + [αληόληα]+ + e ( Spoydes_proptyxiaka/ANAKOINVSEIS_DIDASKONTVN_gr/MPILIADERIS_ANAL YSI_TROFIMON/xromatografia2.pdf. ) Σα ηόληα ζπιιέγνληαη από ηα πνισκέλα ειεθηξόδηα θαη παξάγεηαη ξνή ξεύκαηνο πνπ εληζρύεηαη ζηνλ εληζρπηή θαη θαηαγξάθεηαη. Γηάγξακκα ρξσκαηνγξάθνπ. Ο δηαθνξεηηθόο δείθηεο ζθέδαζεο ηεο θάζε νπζίαο κεηαηξέπεηαη ζε κεηξήζηκε πιεξνθνξία ζηνλ θαηαγξαθέα. Καηαγξάθεη ην ζήκα πνπ δέρεηαη αλάινγα κε ηελ έληαζε αλίρλεπζεο, κε απνηέιεζκα ην ρξσκαηνγξάθεκα Υπνινγηζκόο ζπγθέληξωζεο νπζηώλ. Οη Cabezudo ( 1978) θαη Bakoyanis ( 1993) αλαθέξνπλ όηη ε θπξηόηεξε κέζνδνο πξνζδηνξηζκνύ πηεηηθώλ παξαπξνηόλησλ είλαη ε αέξηα ρξσκαηνγξαθία κε FID αληρλεπηή. Ο ρξόλνο πνπ ρξεηάδεηαη γηα ηε δεκηνπξγία θνξπθήο από ηελ εηζαγσγή ηνπ δείγκαηνο ρξεζηκνπνηείηαη γηα πνηνηηθό δηαρσξηζκό. Σν εκβαδόλ ηεο θνξπθήο 34

35 ρξεζηκνπνηείηαη γηα πνζνηηθή αλάιπζε θαη ζπγθξίλεηαη γηα ηνλ ππνινγηζκό ηεο ζπγθέληξσζεο. Υξεζηκνπνηνύληαη πδαηηθά δηαιύκαηα γλσζηώλ ζπγθεληξώζεσλ ησλ κεηξνύκελσλ ελώζεσλ. Πξνζδηνξίδνληαη κε ηε βνήζεηα πξόηππεο θακπύιεο αλαθνξάο. Ο ρξόλνο ζπγθξάηεζεο ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα αλαγλσξηζηεί ε θάζε νπζία. 1.9.Παξαπξνηόληα Πηεηηθά παξαπξνηόληα αιθννιηθήο δύκωζεο θαη κεζαλόιε Τα θπξηόηεξα παξαπξνηόληα είλαη 1 εζηέξαο, 1 αιδεπδε θαη 3 αιθνόιεο Αιθνόιεο. Οη αλώηεξεο αιθνόιεο έρνπλ πεξηζζόηεξα από 2 άηνκα άλζξαθα. ε πεξηεθηηθόηεηα είλαη ην 70 % ησλ ελώζεσλ πνπ επηδξνύλ αξλεηηθά ζην άξσκα (Βαζηιείνπ. 2007). Οη πην ζεκαληηθέο πνπ αληρλεύνληαη είλαη ε πξνπαλόιε -1, ε ηζνβνπηπιηθή αιθνόιε θαη νη ακπιηθέο αιθνόιεο (Bardi A. et al., 1997). Παξάγνληαη από ακηλνμέα θαη ζάθραξα. ρεκαηίδνληαη α-θεηνλνμέα πνπ απνθαξβνμπιηώλνληαη θαη αλάγνληαη ζε αιθνόιεο κε ηε βνήζεηα ελδύκσλ. Οη ακπιηθέο αιθνόιεο βξίζθνληαη ζε πνζόηεηα mg/L ζηνπο νίλνπο ( Rankin, B.C. et al., 1967) Δζηέξεο. Ο πην ζεκαληηθόο εζηέξαο είλαη ν νμηθόο αηζπιεζηέξαο πνπ πεξηιακβάλεηαη ζηα ζπζηαηηθά ησλ νίλσλ ( Rapp, A. 1986, Stashenko, H., 1992). Πξνέξρνληαη από ηε βηνζπλζεηηθή νδό ησλ ιηπηδίσλ. Σν παξαγόκελν αθεηπιν- CoA αιθννιύεηαη θαη παξάγεη νμηθό αηζπιεζηέξα σο έλδηάκεζν πξνηόλ. Θεηηθή επίδξαζε ζην άξσκα έρεη ζε ζπγθέληξσζε θάησ ησλ 200mg/L ( Yoshioka K. et al., 1984 ) Αθεηαιδεύδε. Ζ αθεηαιδεύδε είλαη ε πην ζεκαληηθή θαξβνλπιηθή έλσζε θαζώο βξίζθεηαη ζε κεγαιύηεξε πνζόηεηα ζε πνζνζηό 90% ησλ αιδεύδσλ ζηνπο νίλνπο (Nikanen L., 1986). ρεκαηίδεηαη από ηε απνθαξβνμπιίσζε ηνπ ππξνζηαθπιηθνύ νμένο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αιθννιηθήο δύκσζεο. ( Βαζηιείνπ., 2007). 35

36 ηα θξαζηά βξίζθεηαη ζπλήζσο ζε ζπγθέληξσζε mg/l ( Longo E., 1992). Μπνξεί λα θηάζεη θαη κέρξη 75mg/L ( Koutinas, A.A. and Pefanis St., 1992) Μεζαλόιε. Παξάγεηαη από ηε πδξόιπζε ηεο πεθηίλεο, ελόο πνιπζαθραξίηε κε ηε δξάζε ηνπ ελδύκνπ πεθηηλνκεζπιεζηεξάζε. PE Πεθηίλε + Ζ₂Ο κεζαλόιε + πεθηηθό νμύ ε ζπγθεληξώζεηο πνπ ππεξβαίλνπλ ηα επηζπκεηά όξηα είλαη ηνμηθή. Ζ ζπγθέληξσζε ζηνπο νίλνπο πνηθίιιεη από πεξίπνπ 60mg/L έσο 200 mg/l. (Βαζηιείνπ. 2007). ηoπο Γεξκαληθνύο νίλνπο ε ζπγθέληξσζε θπκαίλεηαη από mg/l ( Postel, W., 1972). ηα Γαιιηθά θξαζηά ην όξην είλαη από mg/l ( Reinhard, C., 1974) Υπνινγηζκόο πνζόηεηαο θαη ξπζκνύ παξαγωγήο αηζαλόιεο. Ζ αηζπιηθή αιθνόιε αληρλεύηεθε καδί κε ηελ κεζαλόιε ζηα ίδηα δείγκαηα. ηε ζεηξά αλίρλεπζεο εκθαλίδεηαη πξώηα ε αηζαλόιε θαη κεηά ε κεζαλόιε. Ζ κεηαηξνπή ζε αιθνόιε ππνινγίζηεθε ζύκθσλα κε ηελ εμίζσζε (αξρηθή ζπγθέληξσζε ζαθράξσλ-ηειηθή ζπγθέληξσζε ζαθράξσλ) / αξρηθή ζπγθέληξσζε ζαθράξσλ x 100. Ζ παξαγσγηθόηεηα ζε αιθνόιε ππνινγίδεηαη ζε g/d/l ζύκθσλα κε (g /24)/ζπλνιηθνί αιθννιηθνί βαζκνί x ρξόλνο δύκσζεο. Δξκελεύεηαη σο ν ξπζκόο παξαγσγήο αιθνόιεο. Πην απιά ππνινγίδεηαη ην πόζν γξήγνξα παξάγεη, ππν ηε επίδξαζε ηεο δηαθνξεηηθήο ζεξκνθξαζίαο, αιθνόιε ν βηνθαηαιύηεο ζε θάζε πεξίπησζε. 36

37 2. ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ 2.1. Τιηθά Επκνκύθεηαο ηνπ είδνπο Saccharomyces cerevisiae (ζηέιερνο AXAZ-1 ) πλζεηηθό ζξεπηηθό κέζν γιπθόδεο-θξνπθηόδεο (καθξνζηνηρεία) Απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά (DCM:Delignified cellulosic material ): πξηνλίδη Άκπιν θξηζαξηνύ ζε ζθόλε ( παξαγσγή GS: gelatinized starch ) Μαθξνζηνηρεία : (NH₄ )₂ SO₄ (0,1%), KH₂PO₄ ( 0,1% θαη πεγή Κ+ ), MgSO₄ 7H₂O ( 0,5% είλαη θαη ηρλνζηνηρείν ιόγσ ηνπmg²+ ) Ηρλνζηνηρεία (βηηακίλεο θαη απμεηηθνί παξάγνληεο) : εθρύιηζκα δύκεο (yeast extract) (0,4%) Απηνληζκέλν λεξό Κ₂SO₄, CuSO₄, ΝaΟΖ, π. HCl Μηθξννξγαληζκόο Υξεζηκνπνηήζεθε ην αιθννιαλζεθηηθό θαη θξπναλζεθηηθό ζηειέρνο ΑΥΑΕ-1 ηνπ ζαθραξνκύθεηα ηνπ είδνπο Saccharomyces cerevisiae, πνπ απνκνλώζεθε από ηελ κηθξνρισξίδα Διιεληθώλ ακπειώλσλ (Argyriou et al, 1992) Θξεπηηθό κέζν Γηα ην ζπλζεηηθό ζξεπηηθό πιηθό είλαη γλσζηή ε αθξηβήο ζύζηαζε ησλ ρεκηθώλ ελώζεσλ. Γηα ηε δηεμαγσγή ησλ δπκώζεσλ ρξεζηκνπνηήζεθε ζπλζεηηθό ζξεπηηθό κέζν 37

38 γιπθόδεο-θξνπθηόδεο (12%w/v) Απνιηγλνπνηεκέλα θπηηαξηλνύρα πιηθά (πξηνλίδη) Σν πξηνλίδη επεμεξγάζηεθε κε ζεξκό NaOH 1% γηα λα εμαρζεί ε ιηγλίλε. Καηά ζπλέπεηα, δεκηνπξγήζεθαλ ζέζεηο, όπνπ πξνζδέλνληαη θαη αθηλεηνπνηνύληαη ηα θύηηαξα. Δίλαη θζελό, άθζνλν θαη κε ηνμηθό πιηθό Άκπιν θξηζαξηνύ ζε ζθόλε Υξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ παξαζθεπή δειαηηλνπνηεκέλνπ ακύινπ πνπ είλαη έλα γαιάθησκα ππέξθνξνπ δηαιύκαηνο. Όηαλ ην άκπιν δηαιύεηαη ζε δεζηό λεξό δηεηζδύεη από ην εμσηεξηθό ζην εζσηεξηθό κέρξη ηα θνθθία λα ελπδαησζνύλ. Με ηελ ελπδάησζε νη δεζκνί πδξνγόλνπ κεηαμύ ακπιόδεο θαη ακπινπεθηίλεο ζπγθξαηνύλ πγξαζία θαη θάκπηνληαη. Με ηε δειαηηλνπνίεζε ηα δηνγθσκέλα θνθθία απμάλνπλ ηελ ηθαλόηεηα δηάιπζεο θαη ηε ζύλδεζε γηα λα ζρεκαηίζνπλ gel ( Υπόζηξωκα αθηλεηνπνίεζεο Υξεζηκνπνηείηαη απνιηγλνπνηεκέλν θπηηαξηλνύρν πιηθό θαη δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν. Σν δειαηηλνπνηεκέλν άκπιν ρξεζηκνπνηείηαη γηα λα επηηεπρζεί θαιύηεξε ζπλεθηηθόηεηα θαζώο ζπκβάιιεη ζηε ζηαζεξνπνίεζε. 2.2 Όξγαλα θαη ζπζθεπέο. Τθαζκάηηλν θίιηξν Κόζθηλν Αηκνθιίβαλνο Πνηήξη δέζεσο, έλα ηεκάρην καγλήηε, καγλεηηθόο αλαδεπηήξαο 38

39 Κσληθέο θηάιεο ( 300mL θαη 250mL ) Shaker πνιιώλ ζέζεσλ SELECTAROTABIT MOTOR ( U/min) Λπρλία Bόnsen Δηδηθή ζπζθεπή πέςεο, ζσιήλεο πέςεο θαη ζπζθεπή απόζηαμεο Αξαηόκεηξν Be ( ηεο θιίκαθαο 0-10 Be θαη Be ) Γπάιηλνη θύιηλδξνη γηα κέηξεζε ηνπ Be Φηαιίδηα θπγνθέληξεζεο, ςπρόκελε θπγόθεληξνο SIGMA3K12, BIOBLACK SCIENTIFIC πκβαηηθόο θνύξλνο ζηνπο 100 C, ζεξκνζάιακνο κε ξεύκα αέξα ζηνπο 35 C Υξσκαηνγξάθνο SHIMADZU GC-8A Ζιεθξνληθό κηθξνζθόπην ζάξσζεο SEM JEOL JSM-6300, ζπζθεπή επίζηξσζεο κε ρξπζό ( Fine coat ion sputter, JFC-1100) Αηκνθιίβαλνο (απηόθαπζην) Υξεζηκνπνηήζεθε ρύηξα πηέζεσο γηα ηε απνζηείξσζε ζξεπηηθώλ πιηθώλ. Δμαζθαιίδνληαη νη ζπλζήθεο πίεζεο 1,5 atm θαη αηκόζθαηξα θνξεζκέλνπ αηκνύ ζηε ζεξκνθξαζία 121 C Μέζνδνη Γηαηήξεζε ηωλ κηθξννξγαληζκώλ. Γηα ηε δηαηήξεζε ηνπ ζηειέρνπο εθαξκόδεηαη ε κέζνδνο ηεο αλαθαιιηέξγεηαο. Από 39

40 ζηεξεή θαιιηέξγεηα αλαπηπγκέλε ζε ηξπβιίν petri ιακβάλεηαη πνζόηεηα θπηηάξσλ κε θξίθν κηθξνβηνινγίαο, πνπ έρεη απνζηεηξσζεί ζε θιόγα ιύρλνπ, θαη εκβνιηάδεηαη θξέζθν ζξεπηηθό κέζν. Αθήλεηαη λα αλαπηπρζεί γηα 48h ζε ζεξκνζάιακν ζηνπο 30 C θαη απνζεθεύεηαη ζην ςπγείν ζηνπο 2-4 C. Ζ δηαδηθαζία επαλαιακβάλεηαη θάζε κήλα Παξαγωγή βηνκάδαο. Ζ παξαγσγή βηνκάδαο γίλεηαη κε δηαδνρηθέο θαιιηέξγεηεο ηνπ κηθξννξγαληζκνύ ζε πγξό ζξεπηηθό κέζν 4% w/v γιπθόδεο. Αξρηθά εκβνιηάδνληαη 5 ml πγξνύ κε πνζόηεηα από αλεπηπγκέλε ζηεξεή θαιιηέξγεηα. Μεηά από επώαζε ζε ζεξκνζάιακν ζηνπο 30 C γηα 48 h, γίλεηαη κεηάγγηζε ζε 50 ml πγξνύ. Αθνινπζεί επώαζε, απόρπζε ηνπ ππεξθεηκέλνπ θαη κεηαθνξά ησλ θπηηάξσλ πνπ έρνπλ αλαπηπρζεί ζε 500 ml πγξνύ, λέα επώαζε θπθνθέληξεζε θπηηάξσλ θαη κεηαθνξά ζε ηειηθό όγθν 2 L επώαζε θαη παξαιαβή ησλ θπηηάξσλ κε θπγνθέληξεζε Παξαζθεπή ζξεπηηθώλ Θξεπηηθό γηα παξαγωγή βηνκάδαο. Υξεζηκνπνηείηαη ζπλζεηηθό ζξεπηηθό πιηθό ηζνκνξηαθνύ κίγκαηνο 4 % w/v γιπθόδεο-θξνπθηόδεο ζε αλαινγίεο πξνζεγγηζηηθέο ηεο πεξηεθηηθόηεηαο ηνπ κνύζηνπ. Γηα ηελ θαιιηέξγεηα ησλ κηθξννξγαληζκώλ ρξεζηκνπνηήζεθε δηάιπκα 2L πνπ πεξηείρε 128 g/l γιπθόδεο, 128g/L θξνπθηόδεο, 14g/L MgSO₄ 7 H₂O(0,5%), 2 g/l KH₂PO₄ (0,1%), 2 g/l (NH₄)₂SO₄ (0,1%) θαη 8 g/l εθρύιηζκα δύκεο (0,4%) ( yeast extract). Σν εθρύιηζκα δύκεο πξνζηέζεθε κεηά από επαλαηώξεζε ζε απηνληζκέλν λεξό. Σν κίγκα παξαζθεπάζηεθε ζε θσληθή θηάιε ησλ 2L θαη απνζηεηξώζεθε ζε απηόθαπζην. Μεηά από απνζηείξσζε ηνπ ζηνκίνπ ηεο θσληθήο θηάιεο κε ιπρλία Bunsen ζθξαγίζηεθε κε parafilm γηα λα κελ έξρεηαη ζε επαθή κε ηνλ αέξα θαη ηνπνζεηήζεθε ζε ζπζθεπή αλάδεπζεο γηα 5 κέξεο ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ γηα επώαζε. Από ην δηάιπκα όγθνπ 2L αθνινύζεζε απόρπζε ηνπ ππεξθεηκέλνπ θαη κεηαθνξά ζε θηαιίδηα θπγνθέληξεζεο Θξεπηηθό γηα δπκώζεηο. Γηα ην ζηεξεό ζξεπηηθό πιηθό ησλ δνθηκαζηηθώλ δπκώζεσλ ρξεζηκνπνηήζεθαλ πνζόηεηεο ώζηε λα πξνζνκνηάδνπλ ζε ζξεπηηθό κνύζηνπ κε πεξηεθηηθόηεηα ζαθράξσλ 40