Απορρύπανση τυρογάλακτος με χρήση κεφίρ προς παραγωγή γαλακτικού οξέος

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ: ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΟΡΓΑΝΗΣ ΚΑΙ ΠΥΡΗΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Μ.Π.Σ. ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Απορρύπανση τυρογάλακτος με χρήση κεφίρ προς παραγωγή γαλακτικού οξέος Βλάχου Κυριακή Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Σουπιώνη Μαγδαληνή Πάτρα, 2015 i

2 SCHOOL OF NATURAL SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY DIVISION: PHYSICAL INORGANIC AND NUCLEAR CHEMISTRY MSc ENVIRONMENTAL ANALYSIS Abating whey organic load by kefir through lactic acid production Vlachou Kyriakh Supervisor: Soupioni Magdalini Patra, 2015 ii

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σουπιώνη Μαγδαληνή, Επίκουρος Καθηγήτρια (Επιβλέπουσα) Μπεκατώρου Αργυρώ, Επίκουρος Καθηγήτρια (Μέλος) Παπαευθυμίου Ελένη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια (Μέλος) iii

4 EXAMINATION COMMITTE Soupioni Magdalini, Assistant Professor (Supervisor) Bekatorou Argiro, Assistant Professor (Member) Papaefthymiou Eleni, Associated Professor (Member) iv

5 Στην ομάδα μου, Δ.Ι. v

6 ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ Στις μέρες μας, η προστασία του περιβάλλοντος σε συνδυασμό με την διαχείριση ολοένα και μεγαλύτερου όγκου βιομηχανικών αποβλήτων αποτελεί ένα ευαίσθητο θέμα παγκοσμίως. Στην Ελλάδα του 2015, μια χώρα που τα τελευταία χρόνια έχει πληγεί ανθρωπιστικά και οικονομικά, μεγάλος αριθμός ερευνητών εργάζεται με συνέπεια, συνέχεια και ανιδιοτέλεια προς αυτήν την κατεύθυνση. Σε αυτή τη βάση ολοκληρώνεται και η εκπόνηση της παρούσας διπλωματικής εργασίας στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών στην Περιβαλλοντική Ανάλυση του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η εργασία αυτή σε καμία περίπτωση δεν θα μπορούσε να ολοκληρωθεί εάν πλήθος κόσμου, εντός και εκτός του Πανεπιστημίου, δεν συνέδραμε προς αυτή την κατεύθυνση. Όσον αφορά στην ακαδημαϊκή κοινότητα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Τμήμα Χημείας που επιλέγοντάς με ως μεταπτυχιακή φοιτήτρια, μου έδωσε την ευκαιρία να συνεχίσω τις σπουδές μου στο αντικείμενο της Χημείας. Ιδιαιτέρως, ευχαριστώ την επιβλέπουσα, Καθηγήτρια κ. Μαγδαληνή Σουπιώνη που μου ανέθεσε το ανάλογο ερευνητικό έργο και στάθηκε πλάι μου ως επιστήμων αλλά και ως εκπαιδευτικός. Οφείλω να παραδεχτώ πως η καθοδήγηση, η ενθάρρυνση και η κατανόηση που μου παρείχε οδήγησαν σε μια πραγματικά άψογη συνεργασία. Στη συνέχεια ευχαριστώ, τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς επιτροπής τις κκ. Αργυρώ Μπεκατώρου και Ελένη Παπαευθυμίου που με τις γνώσεις αλλά και τις ιδέες τους βοήθησαν καταλυτικά σε αυτό το ερευνητικό έργο. Επιπρόσθετα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Ομότιμο Καθηγητή κ. Αθανάσιο Κουτίνα για τις πολύτιμες συμβουλές, σκέψεις και προτάσεις του. Μη εξαιρετέα, η κ. Χρυσή Καραπαναγιώτη που συνέβαλε παραγωγικά σε αυτήν τη μελέτη, παραχωρώντας μου το εργαστήριο της Χημείας Περιβάλλοντος και παρέχοντας πληθώρα συμβουλών και γνώσης. Τέλος, δεν θα μπορούσα να παραλείψω τους μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες από τα εργαστήρια της Πυρηνικής Χημείας και της Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων που κατά καιρούς συνεργαστήκαμε, επιλύοντας διάφορα ζητήματα κατά την διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας διαμορφώνοντας ένα λειτουργικό και ευχάριστο εργασιακό περιβάλλον. vi

7 Όσον αφορά στον κοινωνικό ιστό, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, που στήριξε και στηρίζει τις επιλογές μου, παρά τα όποια δικά της κόστη. Έναν ιδιαίτερο και ξεχωριστό ρόλο είχαν και οι σύντροφοί μου Κωνσταντίνος Στεφόπουλος, Γιάννης Σταματόπουλος, Δήμος Παπαδόπουλος, Ρωμανός Γαλάνης και ο νεότερος Θωμάς Μούστος που υπέμειναν τις πολύωρες υποχρεώσεις του ερευνητικού αυτού έργου, ενθαρρύνοντάς με να συνεχίσω ενώ ταυτόχρονα ανέλαβαν πλήθος υποχρεώσεων για να με διευκολύνουν. Τέλος, ευχαριστώ από καρδιάς όλους τους γνωστούς και φίλους που στάθηκαν στο πλευρό μου υλικά και ψυχολογικά. vii

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το τυρόγαλα, ως το κύριο απόβλητο της βιομηχανίας παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων, δημιουργείται καθημερινά κατά τόνους και αποτελεί ένα ευαίσθητο περιβαλλοντικό πρόβλημα. Λόγω του υψηλού κόστους επεξεργασίας του, πολλές μικρομεσαίες τυροκομικές επιχειρήσεις απορρίπτουν μεγάλες ποσότητες τυρογάλακτος απευθείας στους πλησιέστερους υγρούς αποδέκτες, προκαλώντας ευτροφισμό στα αντίστοιχα οικοσυστήματα. Το τυρόγαλα είναι σημαντικός ρυπαντής του περιβάλλοντος καθώς περιέχει υψηλή συγκέντρωση λακτόζης (4,8-5,3% w/w), που του προσδίδει υψηλό ρυπαντικό φορτίο. Τα τελευταία είκοσι χρόνια επιστημονική και βιομηχανική έρευνα έχουν εστιάσει στη διαχείριση και στην επεξεργασία του τυρογάλακτος μέσα από την ανάπτυξη αποτελεσματικών διαδικασιών βιομετατροπής της λακτόζης σε αιθανόλη, οξέα κ.ά., χημικές ουσίες, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρώτη ύλη για την παρασκευή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας και ενέργειας με ταυτόχρονη μείωση του ρυπαντικού του φορτίου. Η μικτή φυσική καλλιέργεια κεφίρ, αποτελείται κυρίως από γαλακτικά βακτήρια και ζύμες, τα οποία πραγματοποιούν στο τυρόγαλα ταυτόχρονα γαλακτική και αλκοολική ζύμωση προς παραγωγή αξιοποιήσιμων προϊόντων. Βιοτεχνολογικές τεχνικές, όπως η ακινητοποίηση κυττάρων κεφίρ σε πορώδη, κυτταρινούχα, αγροτοβιομηχανικά απόβλητα (μίσχους σταφυλιών, ριζίδια ή φλοιούς βύνης κ.ά.) έχουν επίσης αναπτυχθεί, βελτιώνοντας αποτελεσματικά το ρυθμό της ζύμωσης, μειώνοντας το κόστος και αξιοποιώντας πληθώρα βιομηχανικών αποβλήτων που είναι άφθονα, φθηνά, εύκολα διαθέσιμα και συχνά απορρίπτονται στο περιβάλλον. Επιπρόσθετα, η χρήση λακτόζης επισημασμένης με 14 C για την μελέτη του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος από τα κύτταρα του κεφίρ, βοηθά στην εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων για τη ζυμωτική ικανότητα των μικροοργανισμών και την ταχύτητα της ζύμωσης. Η παρούσα διπλωματική εργασία εξετάζει την παραγωγή γαλακτικού οξέος μέσω ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία ή όχι στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων [φλοιοί βύνης (brewer s spent grains; BSG, πριονίδι, μεσοκάρπιο πορτοκαλιού] ως πιθανών προωθητών της ζύμωσης. Η viii

9 παρασκευή γαλακτικού οξέος με ζύμωση τυρογάλακτος παρουσιάζει πλεονεκτήματα σε σχέση με τη χημική σύνθεσή αυτού, καθώς παράγεται οπτικά ενεργό, καθαρό γαλακτικό οξύ που αποτελεί πολύτιμη πρώτη ύλη στη χημική και φαρμακευτική βιομηχανία. Επίσης, μελετάται, ο ρόλος του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος από τα κύτταρα του κεφίρ στην ταχύτητα της ζύμωσης και ταυτόχρονα προσδιορίζεται το ποσοστό μείωσης του οργανικού φορτίου στο ζυμωμένο τυρόγαλα. Αρχικά, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες φυσικοχημικές συνθήκες (ph, θερμοκρασία) για τη ζύμωση της λακτόζης με κεφίρ, πραγματοποιώντας ζυμώσεις σε συνθετικό θρεπτικό μέσο λακτόζης (5% w/v λακτόζη) με 6 g κεφίρ, (i) σε διάφορες θερμοκρασίες (35, 37, 40 και 42 o C) με σταθερό ph 5,5 και (ii) σε ποικίλες τιμές ph (4,5, 5,5 και 7) και σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ζύμωση τυρογάλακτος με ελεύθερα κύτταρα κεφίρ, καθώς και η επίδραση στη ζύμωση αυτή της προσθήκης στο τυρόγαλα διαφόρων στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων σε ποικίλες ποσότητες (120, 140 και 160 g) με σταθερό ph 5,5 σε θερμοκρασία 37 o C. Επίσης, σε αρκετές ζυμώσεις προσδιορίσθηκε και ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ με χρήση λακτόζης επισημασμένης με 14 C και μέτρηση του ραδιοϊχνηθέτη σε υγρό απαριθμητή σπινθηρισμών. Η παραγωγή γαλακτικού οξέος και η κινητική των ζυμώσεων προσδιορίστηκαν με μέτρηση της συγκέντρωσης του γαλακτικού οξέος και του αζύμωτου σακχάρου σε τακτά χρονικά διαστήματα με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, (HPLC). Τα πτητικά παραπροϊόντα κατά τη ζύμωση μετρήθηκαν με χρήση αέριας χρωματογραφίας με φασματογράφο μάζας, (GC-MS). Το πορώδες της επιφάνειας των χρησιμοποιούμενων αποβλήτων ελέγχθηκε με χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM). Τέλος, για τη μελέτη μείωσης του οργανικού φορτίου του τυρογάλακτος, προσδιορίστηκε στην αρχή και στο τέλος των ζυμώσεων με τη μέθοδο Winkler και με την τυποποιημένη μέθοδο της HACH το Βιοχημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο (BOD 5 ) και το Χημικά Απαιτούμενου Οξυγόνο (COD), αντίστοιχα, του ζυμωμένου υγρού. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως ταχύτερες ζυμώσεις τυρογάλακτος (9 h) έλαβαν χώρα στους 37 ο C, σε ph 5,5, ενώ σημειώθηκε σημαντική βελτίωση της ταχύτητας ζύμωσης (μόνο 6-7 h) όταν 120 g BSG ή μεσοκαρπίου πορτοκαλιών προστέθηκαν στο υγρό της ζύμωσης. Στις ίδιες συνθήκες παρατηρείται ix

10 υψηλότερη παραγωγή γαλακτικού οξέος (~3,5 g/l) και μεγαλύτερο ποσοστό μείωσης του BOD 5 (~64%) και COD (~46%) του τυρογάλακτος. Επειδή τα στερεά απόβλητα που χρησιμοποιήθηκαν παρουσίαζαν έντονα πορώδη επιφάνεια συμπεραίνεται ότι η προωθητική τους ικανότητα πιθανώς να οφείλεται στην ακινητοποίηση των μικροοργανισμών πάνω σε αυτά κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Τελικά, ενώ η χρονική διάρκεια της ζύμωσης είναι αποδεκτή σε βιομηχανική κλίμακα, η αύξηση της συγκέντρωσης του γαλακτικού οξέος και του ποσοστού μείωσης του οργανικού φορτίου του τυρογάλακτος χρήζουν περαιτέρω εργαστηριακής έρευνας. Λέξεις κλειδιά: τυρόγαλα, κεφίρ, ρυθμός πρόσληψης λακτόζης, γαλακτικό οξύ, φλοιοί βύνης (BSG), μεσοκάρπιο πορτοκαλιού, πριονίδι, Βιοχημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο, Χημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο x

11 ABSTRACT Whey, the main liquid waste of the dairy industry, is produced in huge quantities daily and its disposal is a serious environmental problem. Due to the high processing cost large amounts of whey are disposed directly into the environment causing eutrophication. The main component of whey is lactose ( % w/v), responsible for its high organic load and pollution potential. Industrial and scientific research has been focusing mainly on the development of efficient fermentation processes for the conversion of lactose to lactic acid or ethanol as platform chemicals for other high value products and energy, as well as for the reduction of its polluting organic load. Especially, the mixed natural culture kefir, consisting of mainly lactic acid bacteria and yeasts, has been proposed for lactose conversion by lactic and alcoholic fermentation to produce various useful products. A fermentative means for lactic acid production has advantages over chemical synthesis, such as production of optically pure lactic acid could be produced, which is a very important raw material for chemical and pharmaceutical industries. Sustainable biotechnological techniques, such as immobilization of kefir cells on cheap, abundant and food grade agro-industrial cellulosic wastes (e.g. grape stalks, orange peels) have been developed to improve the efficiency and cost of whey fermentations. Such processes may have the additional benefit of utilizing wastes that are produced by the food industries too and effectively decreasing the costs and pollution caused by their disposal. The role of Lactose Uptake Rate (LUR) on lactic acid production during whey fermentation by kefir using 14 C-labeled lactose concludes usefully to the fermentation rate. The role of Lactose Uptake Rate (LUR) on lactic acid production during whey fermentation by kefir using 14 C-labeled lactose concludes usefully to the fermentation rate. Therefore, this work focused on whey fermentation by kefir for lactic acid production with and without addition of solid industrial wastes (e.g. brewer s spent grains (BSG), albedo, sawdust) as promoting materials. The role of LUR on lactic acid production was evaluated and the reduction of Biochemical Oxygen Demand (BOD 5 ) and Chemical Oxygen Demand (COD) was determined. xi

12 At the same frame, the role of LUR on lactic acid production has also been evaluated and finally, the reduction of Biochemical Oxygen Demand (BOD 5 ) and Chemical Oxygen Demand (COD) was determined. Specifically, batch fermentations of proper synthetic media (5% w/v lactose) were conducted by kefir cells at constant ph (5.5) and various temperatures (35, 37, 40 and 42 o C), as wells as at various ph values (4.5, 5.5 and 7) at constant temperature (37 o C). In a similar manner, batch whey fermentations were carried with kefir cells out in the presence of various amounts of solid industrial wastes (120, 140, 160 g), at ph 5.5 and 37 ο C. The lactose uptake rate of kefir cells was determined by liquid scintillation counter. The lactic acid production and fermentation kinetics were studied by determining lactic acid concentration and residual sugar at various time intervals by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Volatile products determined with Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC/MS). The surface of the solid industrial wastes was characterized by scanning electron microscopy (SEM). Finally, for the reduction of whey organic load, at the beginning and at the end of fermentation, BOD 5 and COD were measured by the Winkler method and HACH Method 8000 for water, wastes and seawater, respectively. The results showed that faster fermentation rate and lactic acid production were achieved at 37 ο C and ph 5.5, where the time for completion of fermentation was 9 h. The addition of 120 g of BSG or albedo led to a slight increase of fermentation rate and time (6-7 h) and lactic acid production (~3.5 g/l). Also, it led to BOD 5 and COD reduction of more than 64% and 46%, respectively. However, more experimental work is required on the optimization of whey fermentation parameters in order to achieve the highest lactic acid productivity at the lowest costs. Key words: whey, kefir, Lactose Uptake Rate (LUR), lactic acid, brewer s spent grains (BSG), albedo, sawdust, Biochemical Oxygen Demand (BOD 5 ), Chemical Oxygen Demand (COD) xii

13 Πίνακας περιεχομένων Αντί προλόγου...vi Περίληψη...viii Abstract...xi Πίνακας Περιεχομένων...xiii 1. Θεωρητικό μέρος Γάλα Υγρά απόβλητα τυροκομείων Περιβαλλοντικές επιπτώσεις των υγρών αποβλήτων τυροκομείων Τυρόγαλα Αξιοποίηση Τυρογάλακτος Κεφίρ Διαιτητική και θρεπτική αξία του κεφίρ Κόκκοι κεφίρ Μικροχλωρίδα καλλιέργειας του κεφίρ Λακτόζη Ζυμώσεις της λακτόζης Αλκοολική ζύμωση Γαλακτική ζύμωση......, Οξική ζύμωση Γαλακτικό οξύ Παρασκευή γαλακτικού οξέος Παρασκευή γαλακτικού οξέος με μικροοργανισμούς Χρήσεις γαλακτικού οξέος Αύξηση του ρυθμού ζύμωσης λακτόζης σε εργαστηριακή κλίμακα Πιθανοί προωθητές ζύμωσης λακτόζης τυρογάλακτος με κύτταρα κεφίρ Φλοιοί βύνης Brewers Spent Grains (BSG) Απόβλητα ξυλουργείου (Πριονίδι) Μεσοκάρπιο πορτοκαλιού Αντιδραστήρας διαλείποντος έργου Γενικές αρχές της χρήσης ιχνηθετών Παραδοχές στις μελέτες με ιχνηθέτες...38 xiii

14 Επισημασμένη λακτόζη με 14 C Υγρός απαριθμητής σπινθηρισμών Βιοχημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο, Biochemical Oxygen Demand (BOD) Χημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο, Chemical Oxygen Demand (COD) Σκοπός εργασίας Πειραματικό μέρος Αντιδραστήρια Όργανα και συσκευές Τυρόγαλα Κόκκοι κεφίρ Στερεά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα Ανάπτυξη κεφίρ σε στερεό συνθετικό θρεπτικό μέσο λακτόζης Ανάπτυξη κεφίρ σε υγρό συνθετικό θρεπτικό μέσο λακτόζης Παραλαβή βιομάζας Ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ Επίδραση θερμοκρασίας Επίδραση ph Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ Επίδραση θερμοκρασίας Επίδραση ph Υπολογισμός ενέργειας ενεργοποίησης, Εa Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία φλοιών βύνης (BSG) Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία αποβλήτων ξυλουργείου (πριονίδι) Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία μεσοκαρπίου του πορτοκαλιού Μελέτη του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης Ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης παρουσία λακτόζης επισημασμένης με 14 C Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία λακτόζης επισημασμένης με 14 C xiv

15 Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων και λακτόζης επισημασμένης με 14 C Χημικές Αναλύσεις Προσδιορισμός γαλακτικού οξέος Προσδιορισμός αζύμωτου σακχάρου Προσδιορισμός πτητικών παραπροϊόντων Προσδιορισμός του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης Προσδιορισμός Βιοχημικά Απαιτούμενου Οξυγόνου (BOD 5 ) Προσδιορισμός Χημικά Απαιτούμενου Οξυγόνου (COD) Στατιστική ανάλυση Λήψεις σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) Αποτελέσματα Συζήτηση Ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας σε σταθερό ph 5, Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας χωρίς διόρθωση ph Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στην ενέργεια ενεργοποίησης, Ε a Μελέτη επίδρασης του ph Μελέτη επίδρασης του ph στο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στην ενέργεια ενεργοποίησης, Ε a Μελέτη επίδρασης του ph Μελέτη επίδρασης του ph στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης Μελέτη επίδρασης της προσθήκης στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Μελέτη επίδρασης της προσθήκης ποσοτήτων φλοιών βύνης (BSG).93 xv

16 Μελέτη επίδρασης της προσθήκης ποσοτήτων στερεών αποβλήτων ξυλουργείου (πριονίδι) Μελέτη επίδρασης της προσθήκης ποσοτήτων από μεσοκάρπιο πορτοκαλιού Λήψεις με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης (SEM) Προσδιορισμός BOD 5 και COD Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Ξενόγλωσση Ελληνική Σύνδεσμοι xvi

17 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1

18 1.1 Γάλα Το γάλα θεωρείται από τα αρχαία χρόνια εξαιρετικό τρόφιμο για την ανθρώπινη υγεία και γι αυτό πολλά κείμενα αρχαίων Ελλήνων συγγραφέων αναφέρονται σε αυτό. Σύμφωνα με τον Ελληνικό Κώδικα Τροφίμων και Ποτών (Κ.Τ.Π., 1998) το γάλα ορίζεται ως: «το απαλλαγμένο από πρωτόγαλα προϊόν του ολοσχερούς, χωρίς διακοπή αρμέγματος υγιούς γαλακτοφόρου ζώου, που ζει και τρέφεται υπό υγιεινούς όρους και που δεν βρίσκεται σε κατάσταση υπερκόπωσης». Σύμφωνα με το FAO/WHO (1973), το γάλα είναι το φυσιολογικό έκκριμα του μαστού, που λαμβάνεται μετά από μία ή δύο αλμέξεις χωρίς να του προστεθεί τίποτε και προορίζεται για κατανάλωση σε υγρή μορφή ή για περαιτέρω επεξεργασία. Ενώ σύμφωνα με τον Κώδικα Γάλακτος των Η.Π.Α. (USDEW, 1953), γάλα είναι το έκκριμα του μαστού, το οποίο είναι απαλλαγμένο από πρωτόγαλα, λαμβάνεται με άμελξη μίας ή περισσοτέρων υγιών αγελάδων και περιέχει τουλάχιστον 3,15% λίπος και 8,25% στερεά συστατικά άνευ λίπους. Γενικότερα με τον όρο γάλα, χωρίς να συνοδεύεται με κάποιο επίθετο νοείται το γάλα που προέρχεται από αγελάδα, είναι νωπό, πλήρες, δεν έχει υποστεί αφυδάτωση ή συμπύκνωση και δεν περιέχει άλλες ουσίες που έχουν προστεθεί απ έξω (Μαντής, 2000). Παρόλα αυτά, υπάρχουν διάφορα είδη γάλακτος που ποικίλλουν ανάλογα με το ζώο από το οποίο προέρχονται (Πίνακας 1.1). Για κάθε άλλο είδος γάλακτος αναφέρεται και το ζώο προέλευσης αυτού, π.χ. γάλα κατσίκας, γάλα προβάτου, κ.ά. (Κουτίνας & Κανελλάκη, 2005). Το χρώμα του γάλακτος είναι άσπρο ή αχυροκίτρινο. Η ένταση σε χρώμα αλλά και η οσμή του, εξαρτάται από την περιεκτικότητα σε λίπος, το είδος του ζώου, την τροφή του, τις συνθήκες διαβίωσής του κ. ά. Από τους ίδιους παράγοντες καθορίζεται και η γεύση του γάλακτος, η οποία κυρίως είναι ελαφρώς γλυκιά. Η σύσταση του γάλακτος ποικίλλει αρκετά, ανάλογα με το είδος του ζώου, τη διατροφή, την υγιεινή του κατάσταση, την εποχή, κ.ά. Σε όλες τις περιπτώσεις το νερό είναι το κύριο συστατικό του γάλακτος σε ποσοστό 63-87%. 2

19 Πίνακας 1.1: Εκατοστιαία σύσταση του γάλακτος μερικών θηλαστικών (Επιστήμη και τεχνολογία του γάλακτος, 2009). Είδος Ολικά Λίπος Πρωτεΐνη Καζεΐνη Λακτόζη Τέφρα γάλακτος στερεά (%) (%) (%) (%) (%) (%) Αγελάδας 12,60 3,80 3,35 2,78 4,75 0,70 Κατσίκας 13,18 4,24 3,70 2,80 4,51 0,78 Προβάτου 17,00 5,30 6,30 4,60 4,60 0,80 Γυναίκας 12,57 3,75 1,63-6,98 0,21 Ένα μεγάλο μέρος από την παγκόσμια παραγωγή γάλακτος διατίθεται για την παραγωγή τυριού. Στην παγκόσμια αγορά κυκλοφορούν πολλά είδη τυριών, από διάφορα είδη γάλακτος, αγελαδινό, πρόβειο, γίδινο και με διάφορες τεχνολογίες παρασκευής τους. 1.2 Υγρά απόβλητα τυροκομείων Κατά τις διαδικασίες παραγωγής τυριού παράγονται μεγάλες ποσότητες υγρών αποβλήτων, η διαχείριση των οποίων αποτελεί μείζον περιβαλλοντικό πρόβλημα για πολλές περιοχές της Ελλάδας. Τα απόβλητα προέρχονται από τις διάφορες διεργασίες παρασκευής και διακίνησης των γαλακτοκομικών προϊόντων. Ο όγκος των παραγόμενων αποβλήτων εξαρτάται από το είδος της εγκατάστασης και από την παραγωγική διαδικασία που ακολουθείται και μπορεί να κυμαίνεται από 0,2 έως και 10 L ανά L επεξεργαζόμενου γάλακτος (Balannec et al., 2005). Η σύστασή τους ποικίλλει ανάλογα με τα προϊόντα που παράγονται και τις μεθόδους παραγωγής (Πίνακας 1.2). Συνίστανται κυρίως από αραιώσεις γάλακτος, παραπροϊόντα παραγωγής, λιπαντικά, απορρυπαντικά και αστικά λύματα (Μακρής κ. ά., 2001). Ανάλογα με τη σύστασή τους δύναται να προκαλέσουν 5 έως 15 φορές μεγαλύτερη ρύπανση από τα αστικά απόβλητα (Ανυφαντάκης, 2004). Τα απόβλητα αυτά χαρακτηρίζονται κυρίως από οργανικό φορτίο υψηλής συγκέντρωσης στερεών (BOD 5 =2300 mg/l, COD=4500 mg/l) και από σημαντικές 3

20 διακυμάνσεις του ph=4,4-9,5 (Makris et al., 2001). Η μέση περιεκτικότητα των αποβλήτων σε συστατικά που δύνανται να προκαλέσουν προβλήματα ρύπανσης παρουσιάζεται στον ακόλουθο πίνακα. Πίνακας 1.2: Μέση περιεκτικότητα των κύριων συστατικών των αποβλήτων (Ανυφαντάκης, 2004). Περιεχόμενη ουσία Περιεκτικότητα (mg/l) Πρωτεΐνες 350 Λίπη 309 Σάκχαρα 522 Άζωτο 76 Φωσφόρος 50 Χλώριο Περιβαλλοντικές επιπτώσεις των υγρών αποβλήτων τυροκομείων Η απόρριψη των αποβλήτων τυροκομείων σε ποτάμια, λίμνες και θάλασσες έχει ως αποτέλεσμα τον εμπλουτισμό του αποδέκτη με οργανικές ουσίες που αποτελούν θρεπτικό υπόστρωμα για την ανάπτυξη μικροοργανισμών. Η αποσύνθεση του οργανικού υποστρώματος γίνεται με ταυτόχρονη κατανάλωση οξυγόνου (Πίνακας 1.3). Τα προϊόντα που παράγονται κατά την αερόβια αποσύνθεση είναι διοξείδιο του άνθρακα, νερό, αμμωνία, θεϊκά και φωσφορικά άλατα. Με τη βοήθεια των αυτότροφων βακτηρίων Nitrosomonas και Nitrobacter η αμμωνία οξειδώνεται προς νιτρικά, οπότε όλη η οργανική ουσία που βιοαποδομείται μετατρέπεται σε ανόργανες ενώσεις Περιοριστικό παράγοντα κατά την διαδικασία της βιοαποδόμησης αποτελεί το οξυγόνο. Η περιεκτικότητα του καθαρού νερού κορεσμένου με οξυγόνο είναι περίπου 9 ppm, ενώ η συνήθης συγκέντρωση οξυγόνου στα νερά των ποταμών είναι 7 8 ppm. Απαιτείται δηλαδή το οξυγόνο 15 τόνων νερού για την πλήρη οξείδωση 1 kg πλήρους γάλακτος (Ζερφυρίδης κ. ά., 1988). Για να διατηρηθεί 4

21 όμως η ζωή στον αποδέκτη σε φυσιολογικά επίπεδα η συγκέντρωση του οξυγόνου δεν πρέπει να πέσει κάτω από τα 5 ppm. Επομένως 1 kg αποβλήτων τυροκομείου είναι δυνατόν να επηρεάσει τη συγκέντρωση του οξυγόνου σε νερό πολλαπλάσιο των 15 τόνων. Η έλλειψη του οξυγόνου δύναται να προκαλέσει την άμεση καταστροφή ενός υδροβιοτόπου. Σε επίπεδα συγκέντρωσης οξυγόνου κάτω των 5 ppm, οργανισμοί όπως τα ψάρια αδυνατούν να αναπαραχθούν και γενικά να πραγματοποιήσουν βασικές ζωτικές λειτουργίες. Αν η συγκέντρωση γίνει μικρότερη των 3 ppm οι οργανισμοί αυτοί πεθαίνουν λόγω ασφυξίας και αντικαθίστανται από αναερόβιους οργανισμούς. Κατά την αναερόβια αποσύνθεση η οργανική ουσία δεν οξειδώνεται πλήρως, ενώ πολλά από τα τελικά προϊόντα προκαλούν προβλήματα δυσοσμίας (Tchobanoglou, 1984). Πίνακας 1.3: Απαιτήσεις σε οξυγόνο για βιοαποδόμηση ουσιών που περιέχονται σε απόβλητα τυροκομείων (Ανυφαντάκης, 2004). Συστατικά Απαίτηση σε Ο 2 (kg O 2 / kg συστατικού) Λακτόζη 0,65 Γλυκόζη 0,66 Σακχαρόζη 0,73 Γαλακτικό οξύ 0,63 Πρωτεΐνες 1,03 Λίπη 0,89 Σάπωνες 1,43 Λοιπά συστατικά 0,65 Οι στερεές ουσίες ανάλογα με το βάρος τους είναι δυνατόν να επιπλέουν, να καθιζάνουν ή να αιωρούνται στη μάζα του νερού. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα λίπη και τα έλαια τα οποία, εκτός της ρύπανσης που προκαλούν λόγω της οργανικής τους σύστασης, επικαλύπτουν την επιφάνεια του νερού εμποδίζοντας την οξυγόνωση και τη διείσδυση του φωτός. Οι ουσίες που καθιζάνουν καταλήγουν 5

22 στον πυθμένα του αποδέκτη, όπου αποδομούνται αναεροβίως προκαλώντας δυσάρεστες οσμές και συνθήκες ακατάλληλες για τους αερόβιους μικροοργανισμούς. Στερεές ουσίες με πολύ μικρό μέγεθος αιωρούνται και θολώνουν το νερό, μειώνοντας έτσι τη διείσδυση του φωτός και το ρυθμό φωτοσύνθεσης των υδρόβιων μικροοργανισμών. Τα θρεπτικά συστατικά, όπως το άζωτο και ο φωσφόρος, ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των αλγών καθιστώντας το νερό ακατάλληλο για πόση και ύδρευση. Επιπλέον η αποσύνθεση των αλγών μειώνει το διαλυμένο οξυγόνο στο νερό. Σε περίπτωση που η θερμοκρασία των αποβλήτων είναι διαφορετική από την θερμοκρασία του περιβάλλοντος τα απόβλητα προκαλούν αλλαγή στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος (Tchobanoglou, 1984). Η θερμοκρασία των αποβλήτων είναι συνήθως μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία των νερών του αποδέκτη. Αν η θερμοκρασία ανέλθει πάνω από τους 30 ο C προκαλούνται προβλήματα σε βασικές λειτουργίες των ψαριών όπως η αναπαραγωγή, ενώ αν ξεπεράσει τους 38 ο C επιδρά δυσμενώς στο μικροβιακό οικοσύστημα του νερού. Όπως τα περισσότερα οργανικά απόβλητα έτσι και τα τυροκομικά αναδύουν δυσάρεστες οσμές οι οποίες προκαλούν κυρίως κοινωνικά προβλήματα όπως η υποβάθμιση της περιοχής, η μείωση του τουριστικού ενδιαφέροντος κ. ά. Όπου είναι απαραίτητο πρέπει να εγκαθίστανται συστήματα ελέγχου των οσμών (βιοφίλτρα, προσροφητές, συστήματα εξαερισμού) για τη μείωση της όχλησης της γύρω περιοχής (Makris et al., 2001). Απόβλητα που προέρχονται από τον καθαρισμό του εξοπλισμού των τυροκομείων είναι δυνατόν να περιέχουν ενώσεις όπως αλκάλια που έχουν τοξική δράση στους οργανισμούς των υδατικών οικοσυστημάτων. Στα τυροκομικά απόβλητα είναι δυνατόν να περιέχονται παθογόνοι μικροοργανισμοί όπως: Salmonella, Shigella, E. coli, Mycobacterium, ιοί (ηπατίτιδας, ρινοφαριγγίτιδας), αμοιβάδες και παράσιτα. Κατά τη βιολογική επεξεργασία των αποβλήτων καταστρέφονται τα περισσότερα παθογόνα εκτός των Salmonella και Mycobacterium, για τη θανάτωση των οποίων επιβάλλεται χλωρίωση πριν την αποβολή στον αποδέκτη. Σε συστήματα ενεργούς ιλύος οι ιοί 6

23 προσκολλώνται στα συσσωματώματα, ενώ οι αμοιβάδες καταναλώνουν μεγάλη ποσότητα των ωφέλιμων βακτηρίων (Mc Garrey et al., 2004). 1.3 Τυρόγαλα Σύμφωνα με τον κανονισμό 625/ το τυρόγαλα (Εικόνα 1) ορίζεται ως το υδαρές τμήμα του γάλακτος που λαμβάνεται μετά τον τεμαχισμό του τυροπήγματος κατά την τυροκόμηση ή κατά την παραγωγή καζεΐνης με τη χρήση οξέων, πυτιάς ή και φυσικοχημικών μεθόδων ( Επίσης, σύμφωνα με την απόφαση 97/80/ΕΚ το τυρόγαλα, ή ορός γάλακτος, ορίζεται ως το υπολειμματικό προϊόν που παράγεται κατά την παρασκευή τυριού ή καζεΐνης. Εικόνα 1: Τυρόγαλα Αποτέλεσμα της υψηλής παραγωγής φέτας στην Ελλάδα είναι η παραγωγή τόνων τυρογάλακτος ετησίως (Mallatos et al., 1994). Το τυρόγαλα περιλαμβάνει το 80 90% του συνολικού όγκου του γάλακτος που εισέρχεται στην παραγωγική διαδικασία και περιέχει περισσότερη από τη μισή ποσότητα των στερεών που βρίσκονται στο πλήρες γάλα (Πίνακας 1.4). Από αυτά σε μεγαλύτερη αφθονία (% w/v) απαντάται η λακτόζη (4,5-5), οι διαλυτές πρωτεΐνες (0,6-0,8), τα λιπίδια (0,4-0,5) και τα μεταλλικά άλατα (8-10 % του ξηρού εκχυλίσµατος), ενώ αποτελείται κατά 93% από νερό (Mishra et al., 2000). Τα μεταλλικά άλατα του 7

24 τυρογάλακτος είναι κυρίως χλωριούχο νάτριο και χλωριούχο κάλιο σε ποσοστό μεγαλύτερο του 50% και άλατα του ασβεστίου. Στο τυρόγαλα βρίσκονται και άλλα συστατικά σε πολύ μικρότερες αναλογίες, όπως γαλακτικό και κιτρικό οξύ, µη πρωτεϊνικές αζωτούχες ενώσεις όπως ουρία και ουρικό οξύ και βιταµίνες του συμπλέγματος Β (., 2009, 1996). Πίνακας 1.4: Φυσικοχημικές ιδιότητες τυρογάλακτος που προέρχεται από την παραγωγή τυριού φέτας (Phlipopoulos et al., 2001). Ιδιότητα Τυπική τιμή ph 6,32 Πυκνότητα 1029,2 kg/m 3 Ολικά στερεά 69,8 g/kg Πρωτεΐνες 13 g/kg Λίπη 0,3 g/kg Λακτόζη 50,7 g/kg Ασβέστιο (Ca) 356 mg/kg Φωσφόρος (P) 385mg/kg Μαγνήσιο (Mg) 93 mg/kg Κάλιο (K) 1154 mg/kg Νάτριο (Na) 434 mg/kg Χλώριο (Cl) 1246 mg/kg Το είδος του τυρογάλακτος που προκύπτει κάθε φορά, εξαρτάται από την παραγωγική διαδικασία και την καθίζηση της καζεΐνης και διακρίνεται είτε σε όξινο (ph <5) είτε σε βασικό (ph 6-7). Το όξινο συνήθως περιέχει λιγότερες πρωτεΐνες και χρησιμοποιείται πολύ περιορισμένα για βρώση λόγω της όξινης γεύσης του και της υψηλής περιεκτικότητας σε άλατα (Mawson, 1994). Το τυρόγαλα, διαθέτει ισχυρό ρυπαντικό φορτίο κυρίως λόγω της υψηλής συγκέντρωσης σε λακτόζη. Οι τιμές του σε Βιοχημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο (BOD 5 ) κυμαίνονται από ppm και σε Χημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο (COD) από ppm (Kosikowski, 1979). Όταν απορρίπτεται σε υδροφορείς δημιουργεί σημαντικές επιπτώσεις στον αντίστοιχο βιότοπο. Αποτελεί 8

25 επομένως, ένα σημαντικό περιβαλλοντικό πρόβλημα. Σημαντικά προβλήματα μπορεί να προκαλέσει σε μονάδες επεξεργασίας αστικών λυμάτων αν διοχετευτεί χωρίς προηγούμενη επεξεργασία. Υπολογίζεται ότι κατά μέσο όρο, ένα τυροκομείο που επεξεργάζεται 100 τόνους γάλακτος ανά ημέρα, παράγει τυρόγαλα που ρυπαίνει όσο τα απόβλητα μιας πόλης κατοίκων (Sienkiewicz et. al., 1990). Πολλές είναι οι περιπτώσεις όπου η απόρριψη τυρογάλακτος έχει απασχολήσει την κοινή γνώµη και έχει οδηγήσει σε έντονες διαμαρτυρίες έναντι των μονάδων και των αρµόδιων θεσµικών φορέων. Χαρακτηριστικό το παράδειγμα των επιπτώσεων σε έναν παραπόταµο του Πηνειού ποταµού (Εικόνα 2), ο οποίος δέχεται περίπου 700 τόνους τυρογάλακτος το χρόνο από τα 60 περίπου τυροκοµεία του νοµού Λάρισας. Εικόνα 2: Παραπόταμος του Πηνειού λευκός από τυρόγαλα Σήμερα, οι κανονισμοί απαγορεύουν τη διάθεση του τυρογάλακτος στους υδροφορείς, αλλά ακόμα και στο δίκτυο του βιολογικού καθαρισμού λόγω της σημαντικής επιβάρυνσης της λειτουργίας του τελευταίου εξαιτίας του υψηλού ρυπαντικού φορτίου του τυρογάλακτος. Προκειμένου λοιπόν να αναπτυχθούν ολοκληρωμένες λύσεις για το πρόβλημα του τυρογάλακτος, θα πρέπει αυτό να αντιμετωπιστεί όχι ως λύμα αλλά ως πόρος, για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας ή ενέργειας μειώνοντας ταυτόχρονα το υψηλό ρυπαντικό του φορτίο. 9

26 1.3.1 Αξιοποίηση Τυρογάλακτος Μέχρι το 1998, τόνοι τυρογάλακτος οδηγούνταν στην παραγωγή τυριών τυρογάλακτος (μυζήθρα, ανθότυρο, μανούρι), τόνοι χρησιμοποιούνταν ως ζωοτροφή και η υπόλοιπη ποσότητα ( τόνοι) απορρίπτονταν στο περιβάλλον. Το 1998 ξεκίνησε τη λειτουργία της η πρώτη μονάδα επεξεργασίας τυρογάλακτος ενώ σήμερα λειτουργούν τέσσερις μονάδες με δυνατότητα επεξεργασίας 1000 τόνων ημερησίως ( Περίπου ένα ποσοστό της τάξης του 50 % της παγκόσμιας παραγωγής τυρογάλακτος μετατρέπεται σε διάφορα προϊόντα διατροφής, με πιο κοινό προϊόν τη σκόνη τυρογάλακτος, η οποία χρησιμοποιείται κυρίως ως ζωοτροφή, αλλά και ως συστατικό ανθρώπινων τροφίμων (ανάλογα με την ποιότητα της), όπως για παράδειγμα παγωτών, σαλτσών, προψημένων προϊόντων κ.ά. Ένα άλλο σημαντικό τμήμα του τυρογάλακτος χρησιμοποιείται για την παραγωγή πολύτιμων προϊόντων με ζύμωση. Τέτοια προϊόντα είναι το γαλακτικό οξύ, η αιθανόλη, το βιοαέριο, τα οργανικά οξέα, τα αμινοξέα, οι βιταμίνες κ. ά. ( u m rã. al., 2010). Το τυρόγαλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης, ως θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη μικροοργανισμών (π.χ. γένη Kluyveromyces, Candida, Trichosporum, Torula), που δίνουν βιομάζα υψηλής βιολογική αξίας, με συγκέντρωση πρωτεΐνης που μπορεί να φτάσει μέχρι και 80% επί του ξηρού βάρους της βιομάζας, έπειτα από μόλις λίγες μέρες ζύμωσης. Η βιομάζα αυτή καλείται μονοκυτταρική πρωτεΐνη (Αγγελής, 2007). Οι ολοένα και αυξανόμενες πιέσεις από τις οικολογικές οργανώσεις, η ανεπτυγμένη περιβαλλοντική συνείδηση των νέων γενιών και η ανάγκη για αξιοποίηση όλων των φυσικών πόρων της Γης, καθιστά επιτακτική την εξεύρεση λύσης από την επιστημονική κοινότητα σε συνεργασία με τις βιομηχανίες γάλακτος. Η έρευνα για την αξιοποίηση και διαχείριση του τυρογάλακτος συνεχίζεται και συνεχώς ανακαλύπτονται νέοι τρόποι χρησιμοποίησής του. 10

27 1.4 Κεφίρ Σαν κεφίρ είναι γνωστό το ζυμούμενο παραδοσιακό προϊόν γάλακτος που παράγεται εδώ και αιώνες στις περιοχές κοντά στον Καύκασο. Είναι ένα ποτό παχύρευστο, αφρίζον, ξινό με ελαφρώς αλκοολική γεύση, το οποίο ασκεί ευεργετική δράση στον ανθρώπινο οργανισμό. Βελτιώνει καταστάσεις όπως η αναιμία, βοηθά σε ασθένειες του πεπτικού συστήματος, χρόνιες εντερίτιδες, ασθένειες νεφρών και συκωτιού, έχει διουρητικές ιδιότητες, υποβοηθά την ανάρρωση από διάφορες αρρώστιες, είναι ένα άριστο διαιτητικό προϊόν με πολύ χαμηλά λιπαρά και λίγες θερμίδες, αποτελεί ιδανικό προϊόν με υψηλή διατροφική αξία για όσους ασχολούνται με τον αθλητισμό και τα σπορ, με συχνή χρήση υποβοηθά στην καταπολέμηση της αρτηριοσκλήρυνσης και της υπέρτασης, βοηθά στην επαναφορά του εσωτερικού οικοσυστήματος μετά από θεραπεία με αντιβιοτικά, έχει αντικαρκινική δράση, ελαττώνει την αυξημένη χοληστερόλη του αίματος, ενώ λέγεται πως μπορεί να θεραπευτούν και να επουλωθούν εξανθήματα και εκζέματα τοποθετώντας κεφίρ επάνω στην πάσχουσα περιοχή. Παράγεται χωρίς πήγμα, με την προσθήκη κόκκων κεφίρ σε κατσικίσιο, αγελαδινό ή πρόβειο γάλα ή σε μίγμα τους (Wood et al., 1985 ; Koroleva, 1991). Η ζύμωση που γίνεται στο κεφίρ είναι γαλακτική και αλκοολική. Κύρια τελικά προϊόντα είναι το γαλακτικό οξύ (1%), η αιθανόλη (1-3%) και το διοξείδιο του άνθρακα, που του προσδίδει και την αφρώδη υφή. Παράλληλα παράγεται σε μικρές ποσότητες, μία ποικιλία από προϊόντα του μεταβολισμού της λακτόζης τα οποία συμβάλλουν στη διαμόρφωση του τελικού αρώματος. Τo ποτό κεφίρ, διαφέρει από τα υπόλοιπα προϊόντα ζύμωσης του γάλακτος στο ότι μετά τη ζύμωση είναι δυνατή η ανάκτηση των μικροοργανισμών με τη μορφή στερεού υποστρώματος Διαιτητική και θρεπτική αξία του κεφίρ Το ποτό κεφίρ είναι ένα φυσικό προβιοτικό. Σε αυτό περιέχονται ζωντανές δραστικές καλλιέργειες της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου, οι οποίες μπορούν να αποικίσουν στο έντερο του ανθρώπου με αποτέλεσμα να βοηθούν στην 11

28 αναγέννηση της χλωρίδας του, ιδιαίτερα ύστερα από χορήγηση αντιβιοτικών. Σαν γάλα που έχει υποστεί και γαλακτική και αλκοολική ζύμωση υπερτερεί για παράδειγμα έναντι της γιαούρτης η οποία έχει υποστεί μόνο γαλακτική ζύμωση παρουσιάζοντας έτσι μεγαλύτερο φάσμα ουσιών μεταβολισμού και εντονότερο βαθμό πρωτεόλυσης και λιπόλυσης. Το κεφίρ υπερέχει έναντι των άλλων όξινων προϊόντων γάλακτος ως προς την αντιβιοτική του δράση κατά μικροοργανισμών που εισέρχονται στον πεπτικό σωλήνα με τις τροφές και το νερό, λόγω της παρουσίας των βακτηρίων παραγωγής οξικού οξέος και των ζυμών που περιέχει. Επίσης, εμφανίζει έντονη υδρόλυση πρωτεϊνών, και επομένως υψηλή συγκέντρωση αμινοξέων και πεπτιδίων στο έντερο. Επιπλέον έχει αυξημένη ποσότητα βιταμινών Β (Ζερφυρίδης, 2001). Η μέση χημική σύσταση του ποτού έχει ως εξής: νερό 89,5%, λίπος 2%, λακτόζη 2%, πρωτεΐνες 4,8%, γαλακτικό οξύ 0,9% και αιθανόλη 0,8%. 1.5 Κόκκοι κεφίρ Σύμφωνα με θρύλους ο προφήτης Μωάμεθ έδωσε τους κόκκους των μικροοργανισμών κεφίρ στους ορθόδοξους χριστιανούς της περιοχής του Καυκάσου (Margulis, 1996). Μάλλον όμως δημιουργήθηκαν ως εξής: Το γάλα στην περιοχή του Καυκάσου φυλαγόταν σε ασκούς από κατσικίσιο δέρμα όπου γινόταν η ζύμωση. Καθώς το ζυμωμένο γάλα καταναλωνόταν, φρέσκο γάλα το αντικαθιστούσε και η ζύμωση συνεχιζόταν για πολλές εβδομάδες. Έτσι στα τοιχώματα του ασκού δημιουργούνταν μικρά σωματίδια πρωτεϊνικής φύσης, τα οποία με τον καιρό μεγάλωναν, με την προσθήκη νέων στρωμάτων πρωτεΐνης με σύγχρονη ενσωμάτωση από την μικροχλωρίδα ζύμωσης. Έτσι η μικροχλωρίδα βρίσκεται μέσα στον κόκκο εγκλωβισμένη σε ένα πλέγμα, το οποίο δένεται από πολυσακχαρίτες (Duitschaever et al.,1987). Οι κόκκοι κεφίρ (Εικόνα 3) μοιάζουν με μικρό κουνουπίδι μήκους 1-3 cm όταν είναι σε υγρή κατάσταση και με καστανούς σπόρους όταν είναι σε ξηρή μορφή. Έχουν κίτρινο-λευκό χρώμα, και παρουσιάζουν μια γλοιώδη αλλά σταθερή υφή (La Riviere et al., 1967; Kosikowski & Mistry 1997). 12

29 Εικόνα 3: Κόκκοι κεφίρ. Η καλλιέργεια, η οποία χρησιμοποιείται για την παρασκευή του ποτού κεφίρ, προέρχεται από κόκκους κεφίρ ή από μητρικές καλλιέργειες, οι οποίες προετοιμάζονται από κόκκους (Libudzisz et al., 1990). Μέχρι στιγμής δεν κατέστη δυνατόν να δημιουργηθούν κόκκοι από τα είδη των μικροοργανισμών που υπάρχουν μέσα σε αυτούς (Ζερφυρίδης, 2001).Οι κόκκοι κεφίρ παράγονται μόνο από άλλους κόκκους κατά την επώαση τους σε γάλα. Οι κόκκοι πολλαπλασιάζονται με τη μεταφορά τους καθημερινά σε φρέσκο γάλα και την επώασή τους για 20 h σε θερμοκρασία o C. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, οι κόκκοι θα έχουν αύξηση του βάρος τους περίπου κατά 25% (Halle et al., 1994). Προκειμένου να συντηρηθούν οι κόκκοι, αποξηραίνονται ή τοποθετούνται στην κατάψυξη ή στην ψύξη μέσα σε γάλα. με καθημερινές αλλαγές του (Pintado et al. 1996). Η αποθήκευση των κόκκων γίνεται στους -4 ο C, παρόλο που και σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (-80 ή -20 ο C) δεν παρουσιάζονται αλλαγές στην ζύμωση των κόκκων (Garrote et al., 1997). Τα τελευταία 25 χρόνια πολλοί ερευνητές χρησιμοποίησαν τη φυσική μικτή καλλιέργεια κεφίρ για τη ζύμωση της λακτόζης, παράγοντας ταυτόχρονα αξιοποιήσιμα προϊόντα, όπως αιθανόλη, γαλακτικό οξύ, προπιονικό οξύ κ. ά. (Athanasiadis et al., 2002; Kourkoutas et al., 2002 & 2005; Petsas et al., 2002; 13

30 Elezi et al., 2003; Harta et al., 2004; Plessas et al., 2005 & 2008; Dimitrellou et al., 2009; Papavasiliou et al., 2008) Μικροχλωρίδα καλλιέργειας του κεφίρ Η μικροχλωρίδα των κόκκων βρίσκεται σε μία δυναμική κατάσταση συμβίωσης, απόλυτα αρμονική (La Riviere et al., 1967), που αποτελείται από ζυμομύκητες, γαλακτικά και σε ορισμένες περιπτώσεις από οξικά βακτήρια. Αυτή η δυναμική κατάσταση συμβίωσης, είναι που καθιστά δύσκολη τη μελέτη των υπαρχόντων μικροοργανισμών στους κόκκους του κεφίρ. Παρόλα αυτά, είναι και αυτή που επιτρέπει στους κόκκους να διατηρούν την ομοιομορφία τους, με αποτέλεσμα η μικροβιολογική τους σύσταση να παραμένει σταθερή με το πέρασμα του χρόνου, ακόμη και μετά από έκθεση σε ανασταλτικούς παράγοντες, αντιβιοτικά ή αλλαγές στο είδος του γάλακτος. Τα είδη των μικροβίων και η σχέση μεταξύ τους διαφέρει από την επιφάνεια προς το κέντρο των κόκκων. Καθώς πλησιάζουμε προς το εσωτερικό των κόκκων οι ζυμομύκητες αυξάνονται σημαντικά, ενώ οι πληθυσμοί των βακτηρίων μειώνονται κατακόρυφα, μέχρι το κέντρο των κόκκων, όπου επικρατούν οι ζυμομύκητες (Botazzi et al., 1980). Συνεπώς, ο αριθμός των ζυμών στο τελικό προϊόν του κεφίρ είναι χαμηλότερος από αυτόν των κυττάρων των ζυμών που βρίσκεται στους κόκκους του (Farnworthetal., 2008), ενώ αυτός του γένους Leuconostoc παραμένει ο ίδιος (Clementietal., 1989). Η μικροχλωρίδα του κεφίρ είναι εγκλωβισμένη σε ένα πλέγμα εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών, κυριότερος από τους οποίους είναι η κεφιράνη (Σχήμα 1) που αποτελείται από διακλαδισμένες αλυσίδες D - γλυκόζης και D - γαλακτόζης σε αναλογία 1:1, ως αποτέλεσμα του μικροβιακού μεταβολισμού της λακτόζης του γάλακτος (La Riviere et al., 1967; Kooiman, 1968). Οι πολυσακχαρίτες παράγονται από τα γαλακτικά βακτήρια που βρίσκονται στο κέντρο των κόκκων και λόγω του υδρόφοβου χαρακτήρα τους, εμποδίζουν τη διάχυση των θρεπτικών συστατικών προς το κέντρο των κόκκων καθώς και των μεταβολικών προϊόντων από τους 14

31 μικροοργανισμούς του κέντρου των κόκκων προς το εξωτερικό (Marshall et al.,1984). Σχήμα 1: Δομή κεφιράνης Πιο συγκεκριμένα η μικροχλωρίδα των κόκκων περιέχει: Ζυμομύκητες Candida kefir, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Candida valida, Brettanomyces anomalus, Saccharomyces unisporous, Torulopsis holmii, Kluyveromyces marxianus, Torulopsis kefir, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces calsbergensis, Candida kefir, Saccharomyces kefir και Saccharomyces delbrueckii, Issatchenkia orientalis, Saccharomyces exiguous, Saccharomyces humaticus, Saccharomyces turicensis, Pichia fermentas, Candida holmii (Guzel - Seydim et al., 2011) Γαλακτικά βακτήρια Streptococcus lactis, Leuconostoc kefir, Lactobacilus acidophilus (La Riviere et al., 1967; Kooiman, 1968), Lactobacilus helveticus και Lactobacilus bulgaricus. Kwak, Lactobacilus brevis, Leuconostoc mesenteroides Streptococcus durans 15

32 (Rosi, 1978), Lactobacillus kefiranogranum και Lactobacillus parakefir (Takizawa, 1998). Από τα ομοζυμωτικά είδη απομονώθηκαν τα υποείδη tolerans, pseudoplantarum, rhamnosus του Lactobacillus casei, o Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, και Lactococcus durans. Από τα ετεροζυμωτικά είδη απομονώθηκαν οι Lactobacillus brevis, Lactobacillus viridescens Lactobacillus kefir, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lactis, Streptococcus salivarius, Leuconostoc mesenteroides και Leuconostoc dextranicum. Οξικά βακτήρια Acetobacter pasteurianus (Ottogali et al., 1973), Acetobacter aceti (Rosi et al., 1978), Acetobacter sp. (Garrote et al., 2001), Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, diacetylactis, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc paramesenteroides ( Guzel - Seydim et al., 2011). Έχει αποδειχθεί ότι οι ζύμες παίζουν σημαντικό ρόλο στην παρασκευή των ζυμούμενων γαλακτοκομικών προϊόντων, όπου μπορούν να παρέχουν θρεπτικά συστατικά όπως τα αμινοξέα και οι βιταμίνες, μεταβάλλουν το ph, παράγουν αιθανόλη και CO 2 (Viljoen, 2001). Οι ζύμες στο κεφίρ έχουν μελετηθεί λιγότερο από τα βακτήρια, παρόλα αυτά είναι φανερό ότι οι ζύμες στους κόκκους παρέχουν κατάλληλο περιβάλλον για την ανάπτυξη των βακτηρίων του κεφίρ. Συνοπτικά, θα μπορούσαμε να πούμε πως οι ζύμες που συμμετέχουν στη μικροχλωρίδα του κεφίρ ανήκουν στα γένη Kluyveromyces, Saccharomyces, Candida και Pichia ενώ τα γαλακτικά βακτήρια κυρίως στα Lactobacillus, Leuconostoc και Lactococcus. Γενικά τα γαλακτικά βακτήρια ( ) είναι περισσότερα από τις ζύμες ( ) και τα οξικά βακτήρια ( ) στους κόκκους κεφίρ αν και οι συνθήκες ζύμωσης μπορούν να επηρεάσουν αυτήν την σχέση (Koroleva, 1982; Garrote et al., 1998). Οι λακτοβάκιλλοι έχουν ευρύ φάσμα ειδών. Αυξάνουν το ιξώδες και επιπλέον τη σταθερότητα του κεφίρ (Irigoyen et al., 2005). Ο πληθυσμός τους 16

33 αυξάνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας. Οι ομοζυμωτικοί μεσόφιλοι λακτόκοκκοι που υπάρχουν στο κεφίρ, παράγουν γαλακτικό οξύ με γρήγορο ρυθμό στα αρχικά στάδια. Οι ετεροζυμωτικοί μεσόφιλοι από την άλλη, συμβάλλουν στην γεύση και το άρωμα του κεφίρ (Ζερφυρίδης, 2001). Τα οξικά βακτήρια, παράγουν οξικό οξύ κατά τη ζύμωση του γάλακτος και παίζουν ρόλο στη συμβίωση των μικροοργανισμών του κεφίρ (Ζερφυρίδης, 2001). 1.6 Λακτόζη Η λακτόζη είναι ο σημαντικότερος υδατάνθρακας του γάλακτος και αποτελεί συστατικό όλων των γαλακτοκομικών προϊόντων. Το μεγαλύτερο ποσοστό της λακτόζης (4,5-5% w/v) του γάλακτος μεταφέρεται στο τυρόγαλα μετά την απομάκρυνση του τυροπήγματος, προσδίδοντας στο τυρόγαλα υψηλό οργανικό φορτίο. Είναι δισακχαρίτης που αποτελείται από ένα μόριο γλυκόζης και ένα γαλακτόζης, συνδεδεμένα με έναν β-1-4-ο-γλυκοσιδικό δεσμό (Σχήμα 2). Όπως όλα τα ανάγοντα σάκχαρα, η λακτόζη υπάρχει υπό μορφή δύο ανωμερών α και β. Στο σχηματικό τύπο της α-μορφής, η υδροξυλική ομάδα στον C 1 της γλυκόζης είναι cis στην υδροξυλική ομάδα του C 2 (προσανατολίζεται προς τα κάτω) (Δημητρέλλου, 2009). Σχήμα 2: Συντακτικός τύπος λακτόζης 17

34 Η λακτόζη υδρολύεται με τη βοήθεια του ενζύμου β - γαλακτοσιδάση σε γλυκόζη και γαλακτόζη. Σε αλκαλικό διάλυμα μπορεί να ισομερειωθεί σε λακτουλόζη. Με καταλυτική υδρογόνωση της λακτόζης παράγεται η λακτιτόλη, μια πολυαλκοόλη που χρησιμοποιείται ως γλυκαντική ουσία. Η λακτόζη δεν μπορεί να αξιοποιηθεί απευθείας από τον οργανισμό. Το έντερο εκκρίνει το ένζυμο λακτάση (β - γαλακτοσιδάση), που διασπά το μόριο της λακτόζης στα σάκχαρα γαλακτόζη και γλυκόζη, τα οποία μπορούν να απορροφηθούν από τον οργανισμό. Το ένζυμο λακτάση παράγεται και σε μεγάλη ηλικία εφόσον καταναλώνονται γαλακτοκομικά προϊόντα επιτρέποντας έτσι τη διάσπαση της λακτόζης. Είτε λόγω κληρονομικών παραγόντων είτε λόγω μακραίωνης απουσίας γαλακτοκομικών προϊόντων από τη διατροφή συγκεκριμένων πληθυσμών, είναι ενδεχόμενο σε πολλά άτομα να απουσιάζει το γονίδιο της λακτάσης. Υπολογίζεται ότι αυτό συμβαίνει περίπου στο 30% των Ευρωπαίων και σε πάνω από 70% του πληθυσμού της Ασίας, Αφρικής και Ωκεανίας. Το αποτέλεσμα είναι να δημιουργείται δυσανεξία στη λακτόζη, δηλαδή να μην μπορεί ο οργανισμός να πέψει το γάλα και να αφομοιώσει τη λακτόζη. Σε περίπτωση κατανάλωσης γάλακτος ή γαλακτοκομικών ειδών η δυσανεξία αυτή εκδηλώνεται με γαστρεντερικά συμπτώματα όπως κοιλιαλγίες, δυσφορία, πρήξιμο και έντονη δημιουργία αερίων. 1.7 Ζυμώσεις της λακτόζης Η διεργασία της ζύμωσης ορίζεται ως η διάσπαση οργανικών ενώσεων από μικροοργανισμούς κάτω από αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες. Αυτή η διάσπαση παράγει τελικά προϊόντα στα οποία περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι τύποι: Μικροβιακά κύτταρα π.χ. βακτήρια, ζύμες, μυκητιακά σπόρια. Μικροβιακά ένζυμα π.χ. ένζυμα πήξης του γάλακτος ή πυτιά, ανασυνδυαζόμενα μυκητιακά και βακτηριακά ένζυμα θρόμβωσης γάλακτος. Μικροβιακοί μεταβολίτες π.χ. αλκοόλες (αιθανόλη, βουτανόλη, 2, 3- βουτανοδιόλη, ισοπροπανόλη), χημικές ουσίες (εστέρας γαλακτικού οξέος, προπιονικός εστέρας, πρωτεΐνες, βιταμίνες, αντιβιοτικά) και καύσιμα (μεθάνιο). 18

35 Ανασυνδυαζόμενα προϊόντα (π.χ. ορμόνες) (Audic et al., 2003). Συγκεκριμένα κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, η λακτόζη του τυρογάλακτος μεταβολίζεται κατά κύριο λόγο είτε μέσω αλκοολικής ζύμωσης προς αιθανόλη, είτε μέσω γαλακτικής ζύμωσης προς γαλακτικό οξύ ανάλογα με τις συνθήκες της ζύμωσης Αλκοολική ζύμωση Αλκοολική ζύμωση είναι η ενζυματική μετατροπή της γλυκόζης και της φρουκτόζης σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Πραγματοποιείται μέσω της γλυκολυτικής οδού όπου και παράγεται πυροσταφυλικό οξύ. Η αιθανόλη σχηματίζεται από το πυροσταφυλικό οξύ, κυρίως στους ζυμομύκητες και μερικούς άλλους μικροοργανισμούς (Tadege et al., 1999). Το πρώτο βήμα είναι η αποκαρβοξυλίωση του πυροσταφυλικού, η οποία καταλύεται από την αποκαρβοξυλάση του πυροσταφυλικού, η οποία χρειάζεται ως συνένζυμο την πυροφωσφορική θειαμίνη. Αυτό το συνένζυμο προέρχεται από τη βιταμίνη θειαμίνη (Β 1 ) και συμμετέχει επίσης σε αντιδράσεις που καταλύονται από άλλα ένζυμα. Το δεύτερο βήμα είναι η αναγωγή της ακεταλδεΰδης σε αιθανόλη από το NADH, σε μια αντίδραση που καταλύεται από την αλκοολική αφυδρογονάση. Αυτή η πορεία αναγεννά NAD +. Το ενεργό κέντρο της αλκοολικής αφυδρογονάσης περιέχει ένα ιόν ψευδαργύρου, το οποίο είναι συντονισμένο με τα άτομα θείου δύο καταλοίπων κυστεΐνης και ένα άτομο αζώτου μιας ιστιδίνης. Το ιόν ψευδαργύρου πολώνει την καρβονυλική ομάδα του υποστρώματος για να ευνοήσει την μεταφορά ενός υδριδίου από το NADH. Το καθαρό αποτέλεσμα αυτής της αναερόβιας πορείας (Εξίσωση 1) είναι: C 6 H 12 O P i + 2 ADP + 2 H + 2 CH 3 CH 2 OH + 2CO 2 + 2ATP + 2 H 2 O (1) Συνοπτικά θα μπορούσαμε να πούμε πως η γλυκόλυση και η αλκοολική ζύμωση δεν είναι δύο διαφορετικοί μηχανισμοί. Η αλκοολική ζύμωση είναι συνέχεια της γλυκόλυσης, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 3. 19

36 Σχήμα 3: Αλκοολική ζύμωση Γαλακτική ζύμωση Η γαλακτική ζύμωση είναι επίσης αναερόβια διεργασία κατά την οποία το γαλακτικό οξύ σχηματίζεται από το πυροσταφυλικό οξύ σαν συνέχεια της γλυκολυτικής πορείας. Κατά τη ζύμωση των εξοζών (γλυκόζη, λακτόζη κ. ά.) από τα γαλακτικά βακτήρια ακολουθούνται δυο μεταβολικά μονοπάτια. Τα γαλακτικά βακτήρια είναι μια ομάδα Gram + βακτηρίων, βακίλλων ή κόκκων τα οποία πραγματοποιούν ζύμωση υδατανθράκων προς γαλακτικό οξύ με δύο τρόπους: είτε ετεροζυμωτικά, είτε ομοζυμωτικά. Στην ετεροζυμωτική γαλακτική ζύμωση (Σχήμα 4), τα γαλακτικά βακτήρια μετατρέπουν τη μισή περίπου ποσότητα του σακχάρου σε γαλακτικό οξύ και την άλλη μισή σε CO 2, αιθανόλη και οξικό οξύ. Τα βακτήρια αυτά χαρακτηρίζονται από την απουσία του ενζύμου αλδολάση, χρησιμοποιούν όμως τη μεταβολική οδό της φωσφοροκετολάσης που παράγει ακέτυλοφωσφορικό οξύ και 3-φωσφορογλυκεριναλδεΰδη. Το ακέτυλο-φωσφορικό οξύ, υπό αναερόβιες συνθήκες, 20

37 μετατρέπεται σε αιθανόλη, αντίδραση η οποία αναγεννά NAD + (Αγγελής, 2007). Στα ετεροζυμωτικά γαλακτικά βακτήρια, ανήκουν στελέχη των γενών Lactobacillus, Leuconostoc και Carnobacterium (Κοτζεκίδου - Ρούκα, 2000). Σχήμα 4: Ετεροζυμωτική γαλακτική ζύμωση Στην ομοζυμωτική γαλακτική ζύμωση (Σχήμα 5), τα ομοζυμωτικά γαλακτικά βακτήρια μετατρέπουν τα σάκχαρα, πρακτικά στο σύνολό τους, σε γαλακτικό οξύ. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η πλήρης μετατροπή ενός μορίου σακχάρου σε δυο 21

38 μόρια γαλακτικού οξέος. Χρησιμοποιούν το σύστημα PTS - γλυκόζης, κατά το οποίο το φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ είναι ο δότης της φωσφορικής ομάδας. Με τη διαδικασία αυτή, το πυροσταφυλικό οξύ μετατρέπεται σε γαλακτικό και ο μεταβολισμός αναφέρεται ως ομογαλακτική ζύμωση. Στα ομοζυμωτικά γαλακτικά βακτήρια, ανήκουν στελέχη των γενών Lactobacillus, Lactococcus, Streprococcus, Vagococcus και Pediococcus. (Κοτζεκίδου - Ρούκα, 2000). Σχήμα 5: Ομοζυμωτική γαλακτική ζύμωση 22

39 1.7.3 Οξική ζύμωση Η οξική ζύμωση είναι και αυτή μία αερόβια διεργασία. Τα οξικά βακτήρια ανήκουν στα υποχρεωτικά αερόβια γένη Acetobacter και Gluconobacter, που οξειδώνουν σάκχαρα, πολυαλκοόλες και αιθανόλη προς οξικό οξύ και άλλα παραπροϊόντα. Τα ηλεκτρόνια από τις οξειδωτικές αντιδράσεις μεταφέρονται κατευθείαν στην αναπνευστική αλυσίδα. Στα είδη του γένους Acetobacter ο κύκλος TCA είναι ενεργός σε αντίθεση με τα είδη του γένους Gluconobacter στα οποία δεν είναι λειτουργικός. Το Gl. Suboxydans μάλιστα δεν δύναται να ζυμώσει τη γλυκόζη ή άλλους υδατάνθρακες επειδή οι οδοί EMP και Entner - Doudoroff δεν είναι ενεργοί. Αντί αυτών χρησιμοποιεί υπό αερόβιες συνθήκες έναν τροποποιημένο κύκλο πεντοζών. Το ακέτυλο- Ρ που προκύπτει από τη διάσπαση της πεντόζης προς C 2 -C 3 μόρια οξειδώνεται προς CO 2 με σύγχρονη παραγωγή ενέργειας μέσω οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Αμφότερα τα γένη Acetobacter και Gluconobacter οξειδώνουν την αιθανόλη προς οξικό οξύ μέσω δύο μεμβρανικών αφυδρογονασών, της αλκοολικής αφυδρογονάσης και της αφυδρογονάσης της ακεταλδεΰδης (Εξίσωση 2): CH 3 CH 2 OH CH 3 CHO + 2H + CH 3 COOH + 2H + (2) Η βιομηχανική παραγωγή οξικού οξέος για χρήση του στη βιομηχανία τροφίμων πραγματοποιείται σε δύο στάδια. Κατ αρχήν παράγεται αιθανόλη μέσω ζύμωσης σακχάρων από τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae και εν συνεχεία η αιθανόλη μετατρέπεται υπό ελεγχόμενες συνθήκες σε οξικό οξύ από το βακτήριο A. Aceti. Το οξικό οξύ είναι το κυριότερο προϊόν μεταβολισμού των σακχάρων από το βακτήριο B.subtilis. Κατά τον πρωτογενή μεταβολισμό το πυροσταφυλικό μετατρέπεται σε οξικό, ενώ κατά το δευτεροταγή μεταβολισμό το οξικό παράγεται από βουτανοδιόλη (Αγγελής, 2007). 23

40 1.8 Γαλακτικό οξύ Το γαλακτικό οξύ ή 2-ύδροξυ-προπανικό οξύ ή α-υδροξυ-προπανικό οξύ είναι ένα καρβοξυλικό οξύ αναμίξιμο με το νερό και την αιθανόλη. Είναι χειρόμορφο μόριο και βρίσκεται σε δύο οπτικά ισομερείς μορφές, την D-μορφή και την L-μορφή (Σχήμα 6). Οι δύο μορφές έχουν όμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες αλλά η D δεν μπορεί να μεταβολιστεί από τον ανθρώπινο οργανισμό αντίθετα με την L μορφή (Ali, 2000). Σχήμα 6: Ισομερείς μορφές Γαλακτικού οξέος Το 1808 ο Τζονς Τζακόμπ Μπερζέλιους ανακάλυψε πως το γαλακτικό οξύ παράγεται στους μύες κατά τη διάρκεια της σύσπασής τους και η δομή του εξακριβώθηκε το 1873 από τον Γιοχάνες Γουΐσκενους. Το 1870 το γαλακτικό οξύ ανακαλύφθηκε από τον Σουηδό χημικό Carl Scheele, ο οποίος το απομόνωσε με απόσταξη από το ξινόγαλο από το οποίο ονομάστηκε και γαλακτικό. Το 1856 ο Luis Pasteur ανακάλυψε τους λακτοβάκιλλους και το ρόλο τους στην παραγωγή του γαλακτικού οξέος, το οποίο άρχισε να παράγεται για εμπορικούς σκοπούς από τη Γερμανική φαρμακευτική εταιρεία Boehringer Ingelheim το

41 1.8.1 Παρασκευή γαλακτικού οξέος Το γαλακτικό οξύ μπορεί να παρασκευαστεί είτε με χημική σύνθεση είτε βιοτεχνολογικά μέσω ζυμώσεων. Η χημική σύνθεση του γαλακτικού οξέος κατά κύριο λόγο βασίζεται στην υδρόλυση της λακτονιτρίλης από ισχυρά οξέα παράγοντας ένα μίγμα των δυο ισομερών του D και L. Αντίθετα, στο βιοτεχνολογικά παραγόμενο γαλακτικό οξύ με ζύμωση επικρατεί η μορφή του L - γαλακτικού οξέος, η οποία δεν είναι βλαβερή για τον ανθρώπινο οργανισμό όπως συμβαίνει με την D-μορφή (Holten et al., 1971; Datta et al., 1995). Σχεδόν στο σύνολό του, το γαλακτικό οξύ βιομηχανικά παρασκευάζεται με ζύμωση. Συνήθως χρησιμοποιούνται ομοζυμωτικοί μικροοργανισμοί και πλήθος υποστρωμάτων, όπως, τυρόγαλα, μελάσα, γλυκόζη κ. ά. Κατά τη βιοτεχνολογική παρασκευή του γαλακτικού οξέως χρησιμοποιούνται υποστρώματα χαμηλού κόστους, συνήθως απόβλητα άλλων βιομηχανιών, απαιτείται χαμηλή θερμοκρασία παραγωγής, όπως επίσης και μειωμένη κατανάλωση ενέργειας κατά τη ζύμωση των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Παρόλα αυτά η βιοτεχνολογική παραγωγή του γαλακτικού οξέως παρουσιάζει δύο κύρια μειονεκτήματα. Το πρώτο είναι η χρήση υποστρωμάτων με υψηλό κόστος, λόγω της χρήσης σακχάρων ως πηγή άνθρακα. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να επιλυθεί με τη χρήση φθηνών πρώτων υλών όπως η μελάσα, το άμυλο, η λιγνίνη, καθώς και γεωργικά απόβλητα, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα για ζυμώσεις που έχουν ως στόχο την παραγωγή γαλακτικού οξέως. Ωστόσο, τα περισσότερα από αυτά τα υλικά όπως το άμυλο και η λιγνίνη πρέπει να προεπεξεργάζονται μέσω φυσικοχημικών και ενζυματικών μεθόδων, αφού δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα στις ζυμώσεις (Okano et al., 2010). Το δεύτερο εμπόδιο για την παραγωγή γαλακτικού οξέος, είναι το απαιτούμενο κόστος. Σε αυτό συντελεί η αποστείρωση η οποία είναι απαραίτητη στη ζύμωση για παραγωγή γαλακτικού οξέως. Μικροοργανισμοί με βέλτιστη θερμοκρασία ζύμωσης ο C χρησιμοποιούνται συνήθως για τις βιομηχανικές εφαρμογές και ως εκ τούτου, είναι δύσκολο να αποφευχθεί η μόλυνση αν το μέσο δεν είναι αποστειρωμένο. Επίσης, ο διαχωρισμός και οι διεργασίες καθαρισμού μετά τη 25

42 ζύμωση μπορούν να αυξήσουν σημαντικά το κόστος της παραγωγής του γαλακτικού οξέος. Διάφοροι ερευνητές έχουν μελετήσει την αύξηση της απόδοσης στη ζύμωση για την παραγωγή γαλακτικού οξέως, όμως για να επιτευχθεί χρειάζονται περαιτέρω προσπάθειες (Chao et al., 2011). Εν κατακλείδι, η βιοτεχνολογική παραγωγή του γαλακτικού οξέος παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την χημική του σύνθεση, καθώς συχνά χρησιμοποιεί υποστρώματα πολύ χαμηλού ή ακόμα και μηδαμινού κόστους, όπως το τυρόγαλα, που αντί για απόβλητο μπορεί να θεωρηθεί πρώτη ύλη για την παρασκευή του γαλακτικού οξέος. Επιπλέον, απαιτεί λιγότερες πρώτες ύλες σε σχέση με την χημική σύνθεση, παράγει καθαρό L γαλακτικό οξύ και μπορεί να έχει σημαντικά μεγαλύτερη απόδοση και σαν τεχνική να συνεισφέρει στην μείωση της περιβαλλοντικής ρύπανσης Παρασκευή γαλακτικού οξέος με μικροοργανισμούς Οι μικροοργανισμοί που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή γαλακτικού οξέος, πρέπει να συνδυάζουν μια σειρά χαρακτηριστικών για να είναι βιομηχανικά ελκυστικοί: Υψηλή παραγωγικότητα για να μειώνεται ο χρόνος ζύμωσης Υψηλή μετατροπή για να μειώνεται το κόστος του αρχικού υδρογονάνθρακα Δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν φθηνά θρεπτικά συστατικά για να μειωθεί το κόστος συντήρησης Χαμηλή ποσότητα παραπροϊόντων για να αυξηθεί το επίπεδο καθαρότητας Υψηλή συγκέντρωση στο τελικό προϊόν για να μειωθεί το κόστος από διεργασίες εξάτμισης Οι μικροοργανισμοί θα πρέπει να είναι ανθεκτικοί στις μολύνσεις (Auras et al., 2010). Οι μικροοργανισμοί που μπορούν να παράγουν γαλακτικό οξύ χωρίζονται σε δυο ομάδες: Βακτήρια (π.χ. γένη όπως Lactobacillus και Streptococcus) 26

43 Μύκητες: Μπορεί να εμφανίσουν χαμηλή απόδοση γαλακτικού οξέως και σχηματισμό υποπροϊόντων όπως φουμαρικό οξύ και αιθανόλη. Η ποσότητα του γαλακτικού οξέος που παράγεται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης είναι ανάλογη προς την ποσότητα της διαθέσιμης λακτόζης. Εντούτοις, υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρωμάτων μπορούν να καθυστερήσουν τη μικροβιακή αύξηση και το ρυθμό παραγωγής του προϊόντος λόγω αύξησης της οσμωτικής πίεσης στο υγρό της ζύμωσης. Γι αυτό το λόγο πρέπει να καθορίζεται το υψηλότερο επίπεδο αρχικής συγκέντρωσης λακτόζης, το οποίο δε θα εμποδίζει τη μικροβιακή αύξηση κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η βιομηχανική ζύμωση του γαλακτικού οξέος μπορεί να περιοριστεί, από τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών, τα οποία απαιτούνται από τους μικροοργανισμούς για κυτταρική αύξηση και συντήρηση (Ghaly et al., 2004). Κάθε μικροοργανισμός που χρησιμοποιείται παρουσιάζει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματά, αλλά το Lactobacillius (που εμφανίζεται σε πολλές ζυμώσεις τροφίμων) και ο Rhizopus είναι τα πιο διαδεδομένα. Μερικά βακτήρια που μπορεί να χρησιμοποιηθούν είναι ο Lactococcus lactis, Lactobacillius helveticus, Lactobacillius casei, Lactobacillius amylophilus κ. ά Χρήσεις γαλακτικού οξέος Μία από τις πιο σημαντικές χημικές ενώσεις που έχουν χρήση στη βιομηχανία ως πρόσθετη ουσία για την παραγωγή τροφίμων είναι το γαλακτικό οξύ, το οποίο έχει χρήση και ως βιομηχανική χημική ουσία για να παραχθεί οξείδιο του προπυλενίου, βιοδιασπώμενα πολυγαλακτικά όξινα πολυμερή, γλυκόλη προπυλενίου ή ακρυλικές ίνες, καθιστώντας την αγορά του γαλακτικού οξέος πρωταρχικής σπουδαιότητας (Lunt, 1998). Ύστερα από κατάλληλη επεξεργασία (εστεροποίηση σε γαλακτικό αιθυλεστέρα) μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως πράσινος διαλύτης (Μαρούλης κ. ά., 2012). Το γαλακτικό οξύ χρησιμοποιείται επίσης και ως συντη-ρητικό (Ε270) κυρίως εναντίον των ζυμών και των μυκήτων στα τρόφιμα, ως οξινιστικό στον τομέα της κλωστοϋφαντουργίας και της φαρμακευτικής βιομηχανίας, καθώς και ως οξινιστικό σε σάλτσες, τουρσί, ποτά και 27

44 στη ζαχαροπλαστική για ρύθμιση του ph, σε καλλυντικά σκευάσματα, στην ιατρική σε χειρουργικά ράμματα κ. ά. (Salman et al., 2006; Ana et al., 2004; Parmjit et al., 2007). 1.9 Αύξηση του ρυθμού ζύμωσης λακτόζης σε εργαστηριακή κλίμακα Στη φύση, έχει παρατηρηθεί πως πολλοί μικροοργανισμοί αναπτύσσονται πάνω σε διάφορα είδη επιφανειών ή μέσα σε φυσικές δομές. Ακολουθώντας αυτό το παράδειγμα, ποικίλες βιοτεχνολογικές τεχνικές όπως η ακινητοποίηση κυττάρων έχουν μελετηθεί και αναπτύσσονται ώστε να βελτιωθεί ο ρυθμός ζύμωσης της λακτόζης από μικροοργανισμούς που έχουν την ικανότητα να ακινητοποιούνται σε κατάλληλα υποστρώματα. Η τεχνολογία ακινητοποιημένων κυττάρων και ενζύμων εφαρμόζεται συχνά σε διεργασίες βιομετατροπής σακχάρων όπως η λακτόζη. Η ακινητοποίηση κυττάρων ορίζεται ως ο φυσικός περιορισμός κυττάρων σε ένα συγκεκριμένο φορέα με διατήρηση της επιθυμητής καταλυτικής δράσης (Karel et al., 1985). Αυτή επιτελείται με διάφορους φορείς και επιτυγχάνεται με πολλούς τρόπους. Η ακινητοποίηση κυττάρων βασίζεται σε δύο στοιχεία, το φορέα ακινητοποίησης (ανόργανο, οργανικό, φυσικό ή συνθετικό μέσο) και τους βιοκαταλύτες. Ο όρος βιοκαταλύτης, αναφέρεται σε βιολογικές δομές που εμφανίζουν ενζυμική δραστηριότητα. Περιλαμβάνει από ένα απλό ένζυμο, έως ένα ζωντανό κύτταρο (μικροβιακό, φυτικό ή ζωικό) με το σύνολο των ενζύμων του (Fogarty et al., 1990). Ο ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης εκμεταλλεύεται τα φυσικά χαρακτηριστικά του υλικού στήριξης, ενώ διατηρεί τη βασική βιοχημική δραστηριότητα του ελεύθερου καταλύτη και βελτιώνει την αποδοτικότητά του (Rosevear et al., 1987). Οι τεχνικές ακινητοποίησης κυττάρων διακρίνονται σε φυσικές και χημικές. 28

45 Φυσικές τεχνικές: Προσκόλληση ή προσρόφηση σε στερεή επιφάνεια φορέα Εδώ τα κύτταρα προσκολλώνται στη επιφάνεια του φορέα μένοντας ακινητοποιημένα εκεί. Εγκλωβισμός σε πορώδες υλικό Τα κύτταρα δεν είναι ακριβώς ακινητοποιημένα πάνω σε έναν φορέα αλλά είναι ελεύθερα σε διάλυμα, περιορισμένα από τη δομή της ζελατίνης. (Bickerstaff, 1995 O Dr c, 1976). Συσσωμάτωση κυττάρων Η μέθοδος αυτή δεν απαιτεί φορέα ακινητοποίησης και περιορίζεται στην ικανότητα των κυττάρων να προσκολλώνται σε άλλα κύτταρα και να σχηματίζουν μεγάλες, τρισδιάστατες και πολύπλοκες δομές. Μηχανική συγκράτηση Αυτό το είδος ακινητοποίησης είναι ιδανικό όταν απαιτείται προϊόν ελεύθερο από κύτταρα και ελάχιστη μεταφορά διαφόρων ενώσεων (Park et. al., 2000). Χημικές τεχνικές: Ομοιοπολική σύνδεση Δημιουργείται ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ του ενζύμου και του φορέα ακινητοποίησης. Διαμοριακή σύνδεση Δημιουργείται ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ των μορίων του ενζύμου. Ανάλογα με τον αντιδραστήρα στον οποίο έχει γίνει η ακινητοποίηση, ο βιοκαταλύτης μπορεί να επανακτηθεί με φίλτρα (αντιδραστήρες στερεάς κλίνης), με φυγοκέντρηση (βιοαντιδραστήρες μιας παρτίδας) και με κατακρήμνιση (υγροαναδευόμενοι βιοαντιδραστήρες ρευστοστερεάς κλίνης). Κατά καιρούς έχουν προταθεί διάφοροι φορείς ακινητοποίησης, όπως ζελατίνη, πορώδη κεραμικά, μεμβρανικά φίλτρα, αγαρόζη, κ-καραγεννάνη και 29

46 κόμμι χαρουπιού (Sodini et al., 2002) πηκτές αλιγινικών αλάτων, απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά (Kourkoutas et al., 2004), πελλέτες γλουτένης (Kourkoutas et al., 2005), το ορυκτό κίσσηρη, ενεργός άνθρακας, χαλύβδινες σφαίρες, πολυολεφίνες και φυτικά πολυμερή (ίνες καλαμποκιού, άμυλο, κυτταρίνη), πελλέτες χιτοζάνης, κόκκοι βύνης, φυσικό καουτσούκ κ. ά. Πολλά πλεονεκτήματα έχουν αποδοθεί τα τελευταία χρόνια στη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων (Μποσνέα, 2009) όπως η μεγάλη λειτουργική σταθερότητα του ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη και η αντοχή στις συνθήκες ζύμωσης και αποθήκευσης. Τα ακινητοποιημένα κύτταρα προσφέρουν τη δυνατότητα για μεγάλες συγκεντρώσεις στους βιοαντιδραστήρες σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα. Αυτό σημαίνει μεγάλες ταχύτητες ζύμωσης, υψηλό ρυθμό παραγωγής προϊόντων, υψηλή απόδοση και μείωση του όγκου του αντιδραστήρα, πράγμα που οδηγεί σε μικρότερο κόστος επένδυσης και συνεχείς διεργασίες. Επιπλέον, επειδή τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα ακινητοποίησης της ζύμωσης είναι συνήθως βιομηχανικά απόβλητα, με την τεχνική αυτή επαναχρησιμοποιούνται, μειώνεται το κόστος διαχείρισής τους και η ρύπανση που δημιουργείται από την απόρριψή τους στο περιβάλλον. Σε ζυμώσεις με ακινητοποιημένα κύτταρα τα τελικά προϊόντα είναι απαλλαγμένα, έως ένα βαθμό, από ελεύθερα κύτταρα. Αυτό σημαίνει μειωμένες απαιτήσεις εξοπλισμού όπως π.χ. φυγοκεντρικού διαχωριστήρα καθώς και μειωμένες ανάγκες για την απομάκρυνση των κυττάρων από το τελικό προϊόν. Επίσης, υπάρχει η δυνατότητα αναγέννησης του βιοκαταλύτη και επαναχρησιμοποίησής του για εκτεταμένες περιόδους, αλλά και η δυνατότητα εύκολου διαχωρισμού του από τα προϊόντα Πιθανοί προωθητές ζύμωσης λακτόζης τυρογάλακτος με κεφίρ Τα υλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί προωθητές ζύμωσης τυρογάλακτος εμφανίζουν κυρίως τα παρακάτω χαρακτηριστικά (Μποσνέα, 2009): Μεγάλη ειδική επιφάνεια 30

47 Αδιάλυτα στο υγρό ζύμωσης, Κατάλληλα για τρόφιμα Ενεργές ελεύθερες ομάδες για τη σύνδεση των κυττάρων Μηχανική και θερμική σταθερότητα Δεν αλλοιώνονται από μικροοργανισμούς Χαμηλό κόστος Άφθονα στη φύση Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν φλοιοί βύνης (BSG), απόβλητα ξυλουργείου (πριονίδι) και μεσοκάρπιο πορτοκαλιού ως υποστρώματα που πιθανώς να προωθούν τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ μέσω ακινητοποίησης των κυττάρων κεφίρ πάνω σε αυτά Φλοιοί βύνης (BSG, Brewer s Spent Grains) Η ζυθοποιία παράγει σχετικά μεγάλες ποσότητες παραπροϊόντων και αποβλήτων, όπως είναι τα BSG και η μαγιά, που είναι και τα πιο κοινά (Κοψαχείλης, 2010). Τα BSG είναι ένα φθηνό, προσιτό και άφθονο παραπροϊόν της ζυθοποιίας, το οποίο παραμένει μετά το στάδιο της παραλαβής του ζυθογλεύκους με διήθηση και αποτελεί σχεδόν το 85% των συνολικών παραπροϊόντων. Οι φλοιοί βύνης (Εικόνα 4) είναι ένα λιγνοκυτταρινούχο υλικό, το οποίο κατά κύριο λόγο αποτελείται από κυτταρίνη, μη κυτταρινούχους πολυσακχαρίτες, κυρίως αραβινοξυλάσες, και λιγνίνη. Εικόνα 4: Φλοιοί βύνης (BSG) 31

48 Η χημική σύσταση των φλοιών βύνης (Πίνακας 1.5), ποικίλλει ανάλογα με την ποικιλία του κριθαριού, τη διαδικασία βυνοποίησης και ζυθοποίησης, αλλά και την ποιότητα και τον τύπο των πρόσθετων ουσιών, που χρησιμοποιούνται κατά τη διαδικασία παραγωγής μπύρας. Περιγράφεται γενικώς ως ένα λιγνοκυτταρινούχο υλικό πλούσιο σε διαιτητικές ίνες και πρωτεΐνες, σε ποσοστά 70% και 20% της σύστασής του, αντίστοιχα. Το κύριο συστατικό των διαιτητικών ινών είναι οι αραβινοξυλάνες, η λιγνίνη και η κυτταρίνη (Mussato, 2006). Πίνακας 1.5 : Χημική σύσταση δύο διαφορετικών ειδών BSG Σύσταση BSG a BSG b (% ξηρό βάρος) Κυτταρίνη 25,4 16,8 Αραβοξυλάνη 21,8 28,4 Λιγνίνη 11,9 27,8 Πρωτεΐνες 24,0 15,2 Λιπίδια 10,6 - Τέφρα 2,4 4,6 a (Kanauchi et al, 2001) b (Mussato and Roberto, 2005) Στα BSG υπάρχουν επίσης βιταμίνες, ιχνοστοιχεία και αμινοξέα. Τα ιχνοστοιχεία (Ca, C, Fe, Cu, Mg, P, Mn, K, Na) απαντώνται σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,5%. Οι βιταμίνες οι οποίες βρίσκονται σε επίπεδα ppm, είναι η βιοτίνη (0,1), η χολίνη (1800), το φολικό οξύ (0,2), η νιασίνη (44), η ριβοφλαμίνη (1,5), η θειαμίνη (0,7) και η πυριδοξίνη (0,7). Από τα αμινοξέα, σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις είναι η λευκίνη, η βαλίνη, η αλανίνη, η σερίνη, η γλυκίνη και το γλουταμινικό οξύ. 32

49 Απόβλητα ξυλουργείου (Πριονίδι) Μεγάλες ποσότητες βιομηχανικών αποβλήτων ξύλου στην Ελλάδα παραμένουν αναξιοποίητες και απορρίπτονται από τα ξυλουργεία στους χώρους διάθεσης αστικών αποβλήτων, αυξάνοντας με τον τρόπο αυτό το συνολικό τους όγκο και την περιβαλλοντική ρύπανση. Τα δομικά συστατικά του ξύλου, άρα και των αποβλήτων του (Εικόνα 5) είναι η λιγνίνη, η κυτταρίνη και κάποιες ημικυτταρίνες σε συνολικό ποσοστό (65-75 %w/w). Στο ξύλο περιέχονται επίσης (%w/w), άνθρακας (48-51), οξυγόνο (43-45), υδρογόνο (5-7), άζωτο (0,1-0,3) και ανόργανες ουσίες (0,2-0,6). Εικόνα 5: Απόβλητα ξυλουργείου (Πριονίδι) Η κυτταρίνη είναι η σπουδαιότερη και αφθονότερη οργανική ουσία που βρίσκεται στη φύση και το κυριότερο συστατικό του ξύλου (40-50% w/w). Είναι πολυσακχαρίτης πολυμοριακής δομής και η στοιχειώδης μονάδα δόμησης των μακρομορίων της γλυκόζης. Διακρίνεται σε κρυσταλλική κυτταρίνη που σχηματίζει κρυστάλλους και άμορφη κυτταρίνη. Ο βαθμός πολυμερισμού της κυτταρίνης στο ξύλο εκτιμάται πως είναι περίπου Οι ημικυτταρίνες απαντώνται στη φύση σχεδόν πάντοτε μαζί με την κυτταρίνη και τη λιγνίνη. Αποτελούνται από γλυκόζη, μαννόζη και ξυλόζη. Είναι οι πλέον υδρόφιλες ουσίες του ξύλου. Ο διαχωρισμός τους από την κυτταρίνη 33

50 βασίζεται στο ότι διαλύονται σε διάλυμα NaOH 17,5% w/v, ενώ η κυτταρίνη παραμένει αδιάλυτη. Η λιγνίνη είναι ουσία αρωματικής φύσης και βρίσκεται πάντοτε μαζί με την κυτταρίνη. Στο ξύλο παίζει τον ρόλο της συγκολλητικής ουσίας, είναι η πλέον υδρόφοβη ουσία του και πολύ ανθεκτική. Συγκεντρώνεται κυρίως στη μεσοκυττάρια στρώση, συγκρατεί τα μικροϊνίδια και βελτιώνει την αντοχή τους σε θλίψη. Είναι αδιάλυτη στους γνωστούς διαλύτες, δεν υδρολύεται, είναι άμορφη και μη κρυσταλλική ουσία. Οι ιστοί του ξύλου περιέχουν και χημικές ουσίες που δεν συμμετέχουν στη δομή των κυτταρικών τοιχωμάτων, τα εκχυλίσματα. Αυτά αποτίθενται στους κενούς χώρους και τις κυτταρικές κοιλότητες του ξύλου. Το ποσοστό τους είναι μικρό (0,5-2%) και είναι αυξημένο στις ρίζες και στους τραυματικούς ιστούς. Το ποσοστό των εκχυλισμάτων σε ξύλο τροπικών ειδών μπορεί να φτάσει μέχρι και 10-15%. Τα σπουδαιότερα εκχυλίσματα είναι τα τερεβινθέλαιο, αιθέρια έλαια, ρητινικά οξέα, ταννίνες, λιπαρά οξέα, πρωτεΐνες. Η μεσοκυττάρια στρώση του ξύλου αποτελείται κυρίως από λιγνίνη και ημικυτταρίνες, χωρίς καθόλου κυτταρίνη. Στο πρωτογενές τοίχωμα των κυτταρικών τοιχωμάτων στα αρχικά στάδια εξέλιξής του υπάρχει μόνο κυτταρίνη, ενώ στο στάδιο λιγνοποίησης αποτίθενται σημαντικά ποσά λιγνίνης. Στο δευτερογενές τοίχωμα συγκεντρώνεται κυρίως η κυτταρίνη και σημαντικό ποσοστό ημικυτταρινών. Στην κυτταρίνη οφείλεται η μεγάλη αντοχή του ξύλου σε εφελκυσμό παράλληλα προς τον κατά μήκος άξονα του κορμού. Η υψηλή αντοχή του ξύλου σε θλίψη, καθώς και η ελαστικότητά του, οφείλονται στην ύπαρξη της λιγνίνης στη μεσοκυττάρια στρώση. Η ιδιότητα του ξύλου να προσλαμβάνει υδρατμούς από την ατμόσφαιρα οφείλεται στα ελεύθερα υδροξύλια κυρίως των ημικυτταρινών, στα οποία οφείλεται επίσης και η ικανότητα να συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου με την λακτόζη του τυρογάλακτος, συμβάλλοντας στην επιτάχυνση της ζύμωσής της με κεφίρ. Τέλος, τα εκχυλίσματα επηρεάζουν το χρώμα, την οσμή και κυρίως την ανθεκτικότητα του ξύλου σε προσβολές από βακτήρια, μύκητες και έντομα (Μαντάνης, 2014). 34

51 Μεσοκάρπιο πορτοκαλιού Μορφολογικά το πορτοκάλι αποτελείται από δύο διακριτά μέρη: το περικάρπιο (φλούδα) και το ενδοκάρπιο (πούλπα), το οποίο είναι το εδώδιμο μέρος του. Το περικάρπιο χωρίζεται περαιτέρω στο εξωκάρπιο (flavedo) και το μεσοκάρπιο (albedo) (Iglesias et al., 2007). Στο εξωκάρπιο βρίσκονται οι χρωμοπλάστες και οι ελαιοθύλακες. Στους χρωμοπλάστες περιέχονται ευδιάλυτες χρωστικές ουσίες, όπως τα καροτενοειδή, οι οποίες είναι υπεύθυνες για το χρώμα του φρούτου. Οι ελαιοθύλακες περιέχουν έλαια τα οποία προστατεύουν το φρούτο από έντομα και μικροοργανισμούς. Το μεσοκάρπιο (Εικόνα 6) έχει λευκό χρώμα και σπογγώδη υφή. Σε αυτό υπάρχουν ουσίες, οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα του χυμού, πολλές φορές και αρνητικά εάν αναμειχθούν με αυτόν. Τέτοιες ουσίες είναι τα φλαβονοειδή, τα λεμονοειδή και η πηκτίνη. Το ενδοκάρπιο αποτελείται από επιμέρους τμήματα, τα οποία χωρίζονται από μεμβράνες. Μέσα σε αυτά περιέχονται οι θύλακες του χυμού, τα υπόλοιπα οργανίδια του φρούτου, όπως τα μιτοχόνδρια, ο πυρήνας και οι καρποί (seeds). Εικόνα 6: Μεσοκάρπιο πορτοκαλιού Το πορτοκάλι περιέχει τα εξής πολύ σημαντικά συστατικά: Οργανικά οξέα, τα οποία είναι υπεύθυνα για την οξύτητα, η οποία αποτελεί σημαντική παράμετρο για τον ποιοτικό έλεγχο του φρούτου. Το κιτρικό οξύ και το 35

52 μηλικό οξύ είναι τα κυριότερα οξέα του πορτοκαλιού. Υδατάνθρακες, οι οποίοι παίζουν σημαντικό ρόλο στη γεύση, την υφή και το χρώμα του πορτοκαλιού. Οι κυριότεροι υδατάνθρακες που περιέχονται στο πορτοκάλι είναι η γλυκόζη, η φρουκτόζη και η σακχαρόζη, των οποίων η συγκέντρωση εξαρτάται από την ποικιλία στην οποία ανήκει το φρούτο, την περιοχή προέλευσής του και τις καιρικές συνθήκες της περιοχής. Βιταμίνες, οι οποίες είναι οργανικές ενώσεις απαραίτητες για τη σωστή διατροφή και την υγεία του ανθρώπου. Η κυριότερη βιταμίνη που περιέχεται στο πορτοκάλι είναι το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), το οποίο αποτελεί σημαντική παράμετρο για την αποδοχή του φρούτου από τους καταναλωτές. Η περιεκτικότητα του ασκορβικού οξέος ποικίλλει και εξαρτάται από παράγοντες όπως η γεωγραφική περιοχή από όπου προήλθε το πορτοκάλι, το κλίμα, ο βαθμός ωρίμανσης του φρούτου και η ποικιλία στην οποία ανήκει. Επίσης, το πορτοκάλι περιέχει μικρές, αλλά σημαντικές ποσότητες βιταμινών Α και Β. Ανόργανα συστατικά, τα οποία στην πλειοψηφία τους είναι μεταλλικά στοιχεία με το κάλιο να βρίσκεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση και να αποτελεί το 70% αυτών. Στο πορτοκάλι περιέχονται, επίσης ασβέστιο, φωσφόρος, μαγνήσιο και άλλα στοιχεία, τα οποία είναι εξίσου σημαντικά. Τέλος, στοιχεία όπως ο σίδηρος, ο ψευδάργυρος, ο χαλκός και το ιώδιο, που περιέχονται στο πορτοκάλι σχετίζονται με ενζυμικά συστήματα που αφορούν στο μεταβολισμό του ανθρώπου. Λιπίδια είναι οργανικές ενώσεις διαλυτές μόνο σε οργανικούς διαλύτες. Τα λιπίδια που περιέχονται στο πορτοκάλι είναι κυρίως στεροειδή και αλειφατικά συστατικά. Αζωτούχες ενώσεις στις οποίες περιλαμβάνονται οι πρωτεΐνες, τα ένζυμα, τα ελεύθερα αμινοξέα και οι αμίνες. Η περιεκτικότητα των αζωτούχων ενώσεων εξαρτάται από την ποικιλία του πορτοκαλιού, το βαθμό ωρίμανσης και τις συνθήκες καλλιέργειας. Φαινολικές ενώσεις, οι οποίες συμβάλουν στο χρώμα και τη γεύση του πορτοκαλιού. Στο πορτοκάλι οι κυριότερες φαινολικές ενώσεις είναι οι φλαβανόνες. Αυτές βρίσκονται στους ιστούς του φρούτου ως γλυκοζίτες και με βάση τη βιβλιογραφία σχετίζονται με την πρόληψη χρόνιων ασθενειών. 36

53 Αρωματικές ενώσεις, οι οποίες είναι υπεύθυνες για το χαρακτηριστικό και ευχάριστο άρωμα του πορτοκαλιού και του χυμού του. Οι κυριότερες πτητικές αρωματικές ενώσεις που έχουν βρεθεί στο πορτοκάλι είναι αλδεΰδες, αλκοόλες, εστέρες, κετόνες και τερπένια (Niesperos et al., 1990) Αντιδραστήρας διαλείποντος έργου Ο αντιδραστήρας διαλείποντος έργου είναι ένα γυάλινο δοχείο το οποίο απογεμίζεται μέχρι και 90 % του ολικού όγκου του με σακχαρούχο διάλυμα και ακολουθεί προσθήκη επαρκούς ποσότητας καλλιέργειας ζύμης. Με το πέρας της ζύμωσης ο αντιδραστήρας αδειάζει, κατόπιν πλένεται και τέλος αποστειρώνεται. Οι αντιδραστήρες τέτοιου τύπου παρουσιάζουν πληθώρα πλεονεκτημάτων όπως: Σχετική απλότητα και χαμηλότερο κόστος εξοπλισμού Χαμηλότερο κίνδυνο μολύνσεων Μικρότερο κίνδυνο μετάλλαξης επιστροφής Ευελιξία στον προγραμματισμό της βιομηχανικής παραγωγής Μικρότερη ευαισθησία σε έκτακτα περιστατικά και διαταραχές Μικρότερο χρόνο μη παραγωγικών διαδικασιών Ομοιογενές προϊόν Ευκολότερο έλεγχο ρυθμού ανάπτυξης Αύξηση παραγωγικότητας διεργασιών επεξεργασίας προϊόντος Ο αντιδραστήρας διαλείποντος έργου όμως εμφανίζει τα εξής μειονεκτήματα: Μεγαλύτερο μέγεθος βιοαντιδραστήρων σε σχέση με άλλους Μείωση παραγωγικότητας λόγω χρόνου προσαρμογής Δυσκολότερη διατήρηση ασηπτικών συνθηκών Έλλειψη συμμόρφωσης με απαιτήσεις ποιότητας (ξεχωριστές παρτίδες) Πιθανή ελάττωση απόδοσης λόγω απώλειας προϊόντων Κάποια προϊόντα δεν παράγονται ικανοποιητικά Πιθανή διαφοροποίηση λόγω μεταβολής ρεύματος τροφοδοσίας 37

54 Υπάρχουν και άλλα είδη αντιδραστήρων όπως ο αντιδραστήρας συνεχούς λειτουργίας και ο αντιδραστήρας ημιδιαλείποντος έργου. Συνεκτιμώντας τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα του αντιδραστήρα διαλείποντος έργου μπορούμε να πούμε πως αυτός ο τύπος αντιδραστήρα είναι ικανός για τη ζύμωση του τυρογάλακτος με κεφίρ. Αυτός ο τύπος αντιδραστήρα χρησιμοποιείται για μεγάλες αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρου έχοντας ως αποτέλεσμα την υψηλότερη ωσμωτική πίεση με άμεση επίπτωση στη μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των βακτηρίων του κεφίρ γεγονός που διευκολύνει τη λήψη καλών αποδόσεων σε γαλακτικό οξύ Γενικές αρχές της χρήσης ιχνηθετών Οι ιχνηθέτες είναι υλικά που χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση μιας χημικής αντίδρασης ή μιας φυσικής διεργασίας ή ακόμη για τον προσδιορισμό της θέσης μιας ουσίας. Ραδιοϊχνηθέτες είναι χημικά είδη που περιέχουν ένα ραδιονουκλίδιο, η ραδιενέργεια του οποίου παρακολουθείται, προκειμένου να μελετηθεί μια διεργασία. Οι ραδιοϊχνηθέτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν, ποιοτικά, για την απλή παρακολούθηση της διεργασίας ή ποσοτικά για τον καθορισμό των ποσοτήτων των μη ραδιενεργών ειδών Παραδοχές στις μελέτες με ιχνηθέτες Η βασική ιδέα πίσω από τη χρήση ραδιοϊσοτόπων ως ιχνηθετών είναι ότι όλα τα ισότοπα ενός χημικού στοιχείου θα συμπεριφερθούν χημικά με τον ίδιο τρόπο. Στη πραγματικότητα αυτή η υπόθεση δεν είναι απόλυτα σωστή, αφού οι διαφορές στη μάζα των δύο ισοτόπων μπορούν να αλλάξουν την ισορροπία των αντιδράσεων (ισοτοπικό φαινόμενο). Το ισοτοπικό φαινόμενο στην ουσία βασίζεται στο γεγονός ότι η σταθερότητα ενός χημικού δεσμού εξαρτάται από τις δονήσεις των ατόμων οι οποίες συνδέονται άμεσα με τις μάζες των ισοτόπων. Η ανάλυση, στην προσπάθεια αποκρυπτογράφησης της πορείας χημικών αντιδράσεων, είτε πρόκειται για εργαστηριακές συνθήκες, είτε για ένα βιολογικό 38

55 σύστημα, είναι πιο απλή με ένα χημικό στοιχείο που αφήνει συνεχώς «ίχνη». Αυτή η δυνατότητα σε συνδυασμό με το μικρό κόστος, την απλότητα των τεχνικών αλλά και την εξαιρετική ευαισθησία (μπορούν να ανιχνευτούν, σε σχέση με τις συμβατικές μεθόδους, συγκεντρώσεις έως και μικρότερες) καθιστά τη χρήση ιχνηθετών εξαιρετικά σημαντική αν όχι τη μοναδική μέθοδο ανάλυσης και παρακολούθησης των βιολογικών συστημάτων. Ο κατάλληλος ιχνηθέτης για κάθε διεργασία διαφέρει, καθώς διαφορετικά χημικά στοιχεία αλλά και ενώσεις έχουν διαφορετικές μεταβολικές οδούς. Συνεπώς καταλήγουν σε διαφορετικά οργανίδια του κυττάρου ή του οργανισμού. Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι χημικές και φυσικές αλληλεπιδράσεις του ιχνηθέτη με το προς μελέτη σύστημα καθώς και των χημικών ειδών που είτε υπάρχουν λόγω προσμίξεων, είτε δημιουργούνται λόγω της ραδιενεργού διασπάσης. Ακόμη ο χρόνος υποδιπλασιασμού του ραδιονουκλιδίου πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσος με τη χρονική διάρκεια του πειράματος για να εξασφαλιστεί επαρκής ανίχνευση, αλλά και καλή στατιστική των μετρήσεων. Βέβαια ο χρόνος υποδιπλασιασμού δε μπορεί να είναι πολύ μεγάλος, γιατί θα είναι αναγκαία η χρήση μεγάλης ποσότητας του ιχνηθέτη για να υπάρξει ανίχνευση, με αποτέλεσμα το αυξημένο κόστος αλλά και το πρόβλημα διάθεσης των αποβλήτων. Επιπλέον το είδος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας ως προς την ενέργεια (μπορεί να προκαλέσει καταστροφή του δείγματος) και την διεισδυτική της ικανότητα (αν το δείγμα έχει μεγάλο πάχος ακτινοβολία -α και -β αποκλείονται) είναι ένας παράγοντας, που πρέπει να μελετηθεί στο σχεδιασμό ενός πειράματος (Ehmann & Vance, 1998). Ενώσεις που περιέχουν 14 C χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του μεταβολισμού σε βιολογικά συστήματα. Ανάλογα με την ένωση που έχει επισημανθεί με 14 C, αυτή θα έχει και διαφορετική τύχη ακολουθώντας το μεταβολικό μονοπάτι μέσα στο κύτταρο από την πρόσληψη έως τη χρήση της ως δομικού συστατικού του ίδιου του κυττάρου (Loveland et al., 2006). 39

56 Επισημασμένη λακτόζη με 14 C O ραδιοϊχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για την παρακολούθηση του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης είναι η λακτόζη επισημασμένη με 14 C, ο οποίος διασπάται με β - -διάσπαση (Εξίσωση 3). Σε αυτό το είδος διάσπασης ένα νετρόνιο μετατρέπεται σε πρωτόνιο με ταυτόχρονη εκπομπή ενός ηλεκτρόνιου και ενός αντινετρίνου : + β - + (3) Τη δυνατότητα αυτή έχουν τα ασταθή νουκλίδια που είναι πλούσια σε νετρόνια. Τα ηλεκτρόνια που εκπέμπονται από αυτή τη διάσπαση δεν έχουν διακεκριμένες τιμές ενέργειας, αλλά υπάρχει μια συνεχής κατανομή της ενέργειάς τους από Ε=0 μέχρι μια Ε max. Το αντινετρίνο είναι ένα αντιλεπτόνιο και εκπέμπεται επειδή τα λεπτόνια πρέπει να διατηρούνται σε μια αντίδραση. Τα σωματίδια β - έχουν μέτρια διεισδυτική ικανότητα. Οι χαρακτηριστικές σταθερές του 14 C είναι ο χρόνος ημιζωής t 1/2 = y και η σταθερά διάσπασης λ = 3,83x10-12 s Υγρός απαριθμητής σπινθηρισμών Ο υγρός απαριθμητής είναι ένα σύστημα μέτρησης κυρίως σωματιδίων-β και σωματιδίων-α. Τα βασικά τμήματα ενός υγρού απαριθμητή σπινθηρισμών είναι η θέση του δείγματος, ο φωτοπολλαπλασιαστής, ο προενισχυτής, ο ενισχυτής, το κύκλωμα σύμπτωσης και το καταγραφικό (Σχήμα 7). Το μέγεθος του παλμού που θα προέρχεται από τον φωτοπολλαπλασιαστή θα εξαρτάται από τον αριθμό των φωτωνίων που εκπέμπονται από τα μόρια του σπινθηριστή, ο οποίος με τη σειρά του θα εξαρτάται από την απόδοση με την οποία η ενέργεια διέγερσης του διαλύτη περνάει μέσα στο διάλυμα από το ένα μόριο στο άλλο. Η ενέργεια όμως που απορροφά ο διαλύτης εξαρτάται από την ενέργεια του σωματιδίου -β. 40

57 Σχήμα 7: Βασικά μέρη ενός υγρού απαριθμητή σπινθηρισμών Ο υγρός απαριθμητής σπινθηρισμών θεωρείται το καλύτερο σύστημα μέτρησης για νουκλίδια που εκπέμπουν χαμηλής ενέργειας σωματίδια -β όπως είναι το 3 Η, ο 14 C και το 35 S. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για νουκλίδια που εκπέμπουν σωματίδια-α και σωματίδια-β υψηλότερης ενέργειας. Σ ένα σύστημα υγρού απαριθμητή σπινθηρισμών ο κρυσταλλικός σπινθηριστής (συνήθως NaI) έχει αντικατασταθεί με διάλυμα μιας φθορίζουσας ουσίας π.χ. με 2,5 διφαινυλ-οξαζόλιο σε τολουόλιο ή κατάλληλο διαλύτη. Το διάλυμα αυτό ονομάζεται υγρό σπινθηριστικό μίγμα. Το ραδιενεργό δείγμα είναι διαλυμένο κατ ευθείαν στο σπινθηριστικό μίγμα ή προστίθεται σαν διάλυμα σε άλλον κατάλληλο διαλύτη. Το ραδιονουκλίδιο 14 C που χρησιμοποιήθηκε διασπάται εκπέμποντας σωματίδια-β. Η ενέργεια των σωματιδίων απορροφάται από τα μόρια του υγρού σπινθηριστή με αποτέλεσμα τη διέγερση και τον ιονισμό τους. Τα μόρια του σπινθηριστή αποδιεγειρόμενα εκπέμπουν ένα ή περισσότερα φωτόνια ορατής ακτινοβολίας τα οποία εισέρχονται στον φωτοπολλαπλασιαστή όπου δημιουργείται ηλεκτρικός παλμός ο οποίος ενισχύεται και καταγράφεται. Κατά τη μέτρηση με σύστημα υγρού σπινθηρισμού αντιμετωπίζουμε τα εξής προβλήματα: 41

58 1) Οι ενέργειες των σωματιδίων-β είναι πολύ μικρότερες από τη συνήθη περιοχή ενεργειών της ακτινοβολίας-γ 2) Οι υγροί σπινθηριστές έχουν πολύ μικρότερη απόδοση στις μετρήσεις απ ότι οι κρυσταλλικοί σπινθηριστές 3) Οι φωτοπολλαπλασιαστές παράγουν θερμικό θόρυβο. Δηλαδή θερμιονικά ηλεκτρόνια που εκπέμπονται από την φωτοκάθοδο και η πρώτη δύνοδος του φωτοπολλαπλασιαστή δεν μπορεί να τα διακρίνει από εκείνα που προέρχονται από την αλληλεπίδραση ενός φωτονίου με την φωτοκάθοδο. Κάθε ένα από τα θερμιονικά ηλεκτρόνια δίνει στην έξοδο ένα μικρό παλμό που δεν μπορεί να διακριθεί από παλμούς του ίδιου ύψους που οφείλονται στο δείγμα. Το πρώτο πρόβλημα δεν μπορεί να αντιμετωπιστεί γιατί δεν μπορούμε να αλλάζουμε τις ενέργειες των σωματιδίων-β. Για να αντιμετωπιστεί το δεύτερο πρόβλημα δοκιμάστηκε μεγάλος αριθμός σπινθηριστών και διαλυτών προκειμένου να βρεθεί το πιο ευαίσθητο σύστημα. Έτσι, αν και κανένα δεν είναι τόσο ευαίσθητο όσο ένας κρυσταλλικός σπινθηριστής, εν τούτοις χρησιμοποιούνται μερικά πολύ επιτυχημένα συστήματα. Το τρίτο πρόβλημα, ο θερμικός θόρυβος που έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση του background αντιμετωπίζεται με δύο τρόπους. Ο πρώτος τρόπος περιλαμβάνει ψύξη του φωτοπολλαπλασιαστή. Έτσι όλα σχεδόν τα όργανα έχουν ψυγείο μέσα στο οποίο είναι ο φωτοπολλαπλασιαστής, το δείγμα και οι προενισχυτές. Όσο μικρότερη είναι η θερμοκρασία του φωτοπολλαπλασιαστή, τόσο μικρότερος είναι ο θερμικός θόρυβος. Η θερμοκρασία των -8 ο C θεωρείται η καλύτερη θερμοκρασία για τη μείωση του θερμικού θορύβου. Μικρότερη θερμοκρασία δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιατί θα παγώσει το διάλυμα του υγρού σπινθηριστή. Ο δεύτερος τρόπος αντιμετώπισης του θερμικού θορύβου είναι η χρήση δύο φωτοπολλαπλασιαστών που συνδέονται με ένα κύκλωμα σύμπτωσης. Έτσι κάθε σπινθηρισμός που παράγεται μέσα στο διάλυμα του υγρού σπινθηριστή ανιχνεύεται ταυτόχρονα και από τους δύο φωτοπολλαπλασιαστές. Οι παλμοί που παράγονται από κάθε φωτοπολλαπλασιαστή ενισχύονται και τροφοδοτούν το κύκλωμα σύμπτωσης. Το κύκλωμα σύμπτωσης απορρίπτει κάθε παλμό ο οποίος δεν φτάνει ταυτόχρονα με ένα παλμό από τον άλλο φωτοπολλαπλασιαστή. Οι παλμοί λόγω θερμικού 42

59 θορύβου είναι τυχαίοι. Έτσι ο αριθμός των παλμών θορύβου από τον ένα φωτοπολλαπλασιαστή που φθάνει στο κύκλωμα σύμπτωσης ταυτόχρονα με ένα από τον άλλο φωτοπολλαπλασιαστή είναι πολύ μικρός Βιοχημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο Biochemical Oxygen Demand (BOD) Σαν Βιοχημική Απαίτηση Οξυγόνου (BOD) ορίζεται η ποσότητα του οξυγόνου που απαιτείται για τη βιοχημική αποικοδόμηση οργανικών ουσιών σε ένα δείγμα νερού. Ο προσδιορισμός του BOD είναι μια εμπειρική μέθοδος κατά την οποία σε προκαθορισμένες εργαστηριακές συνθήκες προσδιορίζουμε τη σχετική απαίτηση σε οξυγόνο αποβλήτων, ρεόντων και ρυπασμένων υδάτων. Όμως κατά τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο συγχρόνως μετράμε και το οξυγόνο που απαιτείται για την οξείδωση ανόργανων συστατικών όπως S 2-, Fe 2+ και το οξυγόνο που απαιτείται για την οξείδωση ανηγμένων μορφών αζώτου (απαίτηση αζώτου). Μετρήσεις BOD στις περιπτώσεις που περιλαμβάνεται και η απαίτηση αζώτου γενικά δεν είναι χρήσιμες. Γι αυτό χρησιμοποιούνται ουσίες που εμποδίζουν την οξείδωση αμμωνίας. Ένα τέτοιο αντιδραστήριο είναι η 2-χλωρο,6-τριχλωρομέθυλο πυριδίνη. Η μέθοδος προσδιορισμού συνίσταται στην τοποθέτηση ενός δείγματος νερού σε αεροστεγή φιάλη και στην επώαση του δείγματος παρουσία μικροοργανισμών κάτω από ειδικές συνθήκες και για ορισμένο χρόνο. Το διαλυμένο οξυγόνο μετρείται πριν και μετά την επώαση και το BOD είναι η διαφορά του περιεχόμενου οξυγόνου που υπολογίσαμε μεταξύ αρχικού και τελικού δείγματος. Συνήθως τα απόβλητα περιέχουν ουσίες που απαιτούν οξυγόνο περισσότερο από αυτό που υπάρχει σε κορεσμένο με οξυγόνο νερό γι αυτό η αραίωση των δειγμάτων που προέρχονται από απόβλητα είναι συνήθως απαραίτητη πριν την επώαση για να εξισορροπηθεί η απαίτηση σε οξυγόνο με το προσφερόμενο από το διάλυμα. 43

60 Τα βακτηρίδια για να αναπτυχθούν χρειάζονται τροφή, όπως άζωτο, φωσφόρο και μεταλλικά στοιχεία τα οποία προσθέτουμε στο νερό της αραίωσης. Επίσης, στο νερό της αραίωσης προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε το ph του δείγματος κατά την επώαση να είναι κατάλληλο για την ανάπτυξη των βακτηριδίων. Πλήρης σταθεροποίηση του δείγματος απαιτεί κάποιο χρόνο επώασης. Διεθνώς έχει οριστεί αυτός ο χρόνος σε 5 d. Η μέθοδος επίσης περιλαμβάνει: (α) Έλεγχο του νερού αραίωσης. Προς τούτο το νερό αραίωσης επωάζεται για 5 ημέρες στους 20 ο C. Εάν έχει εμβολιαστεί με μικροοργανισμούς ελέγχεται για την ποιότητά του μετρώντας την κατανάλωση σε οξυγόνο από ένα γνωστό οργανικό μίγμα, συνήθως γλυκόζης - γλουταμινικού οξέος. (β) Ένα τυφλό πείραμα για το νερό αραίωσης το οποίο διεξάγεται συγχρόνως με την κυρίως μέτρηση. Η χημική μέθοδος (Μέθοδος Winkler) προσδιορισμού του BOD, βασίζεται στην οξείδωση των ιόντων Mn 2+ από το διαλυμένο οξυγόνο σε αλκαλικό περιβάλλον, σύμφωνα με τις αντιδράσεις (4) και (5): Mn OH - Mn(OH) 2 (4) 4Mn(OH) 2 + 2O 2 4MnO(OH) 2 (5) Η ποσότητα του Μn που οξειδώθηκε προσδιορίζεται ιωδομετρικά σύμφωνα με τις αντιδράσεις (6) και (7): MnO(OH) 2 + 2I - + 6H + Mn 2+ + I 2 + 3H 2 O (6) 2- I 2 + 2S 2 O 3 2I S 4 O 6 (7) 44

61 1.15 Χημικά Απαιτούμενο Οξυγόνο Chemical Oxygen Demand (COD) Το χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (COD) δίνει την ποσότητα του οξυγόνου που καταναλώνεται για τη χημική οξείδωση των οργανικών ενώσεων, που περιέχονται σε ένα δείγμα νερού. Το COD, όπως και το BOD, είναι σημαντικές παράμετροι ελέγχου της ρύπανσης των νερών. Οι τιμές COD, δε συνδέονται άμεσα με τις τιμές BOD, αλλά έμμεσα και εμπειρικά όταν πρόκειται για δείγματα σταθερής σύνθεσης. Σε αυτή την περίπτωση, είναι δυνατό με βάση τις τιμές COD να εκτιμήσουμε τις τιμές του BOD. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία για τον έλεγχο του οργανικού φορτίου δειγμάτων, τα οποία περιέχουν τοξικές ουσίες και επομένως δεν είναι δυνατός ο προσδιορισμός του BOD. Ο προσδιορισμός του COD γίνεται γρήγορα, σε τρεις περίπου h, γεγονός σημαντικό για ένα γρήγορο έλεγχο του οργανικού φορτίου λυμάτων-αποβλήτων. Όπου η σύσταση των αποβλήτων και λυμάτων είναι περίπου παρόμοια, υπάρχει παράλληλα και σταθερή σχέση ανάμεσα στις τιμές BOD και COD. Στις περιπτώσεις αυτές, ο προσδιορισμός του COD χρησιμοποιείται και για την εκτίμηση της τιμής του BOD. Μεγάλες τιμές COD και πολύ μικρές τιμές BOD, δείχνουν την παρουσία τοξικών ουσιών στα δείγματα. Το νερό στις περιπτώσεις αυτές χαρακτηρίζεται ως νεκρό νερό. Μικρές τιμές COD και μεγάλες τιμές TOC (Συνολικού Οργανικού Άνθρακα) οφείλονται στην παρουσία οργανικών ουσιών που δεν οξειδώνονται. Η προτιμούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό του COD, είναι η οξείδωση των οργανικών ουσιών σε ζέον μίγμα K 2 Cr 2 O 7 H 2 SO 4 που περιέχει θειϊκό άργυρο, λόγω της μεγάλης οξειδωτικής ισχύος του αντιδραστηρίου, της δυνατότητας εφαρμογής της μεθόδου στην πλειονότητα των δειγμάτων και της εύκολης διαδικασίας εφαρμογής της. Οι οργανικές ενώσεις οξειδώνονται σύμφωνα με την αντίδραση (8): 45

62 Οργανική ύλη + Cr 2 O H + + Ag + + θέρμανση CO 2 + H 2 O + Cr 3+ (8) Η περίσσεια των διχρωμικών ογκομετρείται με πρότυπο διάλυμα εναμμωνίου θειϊκού σιδήρου με δείκτη φεροΐνη, μετά τη ψύξη του διαλύματος και αραίωση με απεσταγμένο νερό. Ο δισθενής σίδηρος αντιδρά με τα διχρωμικά σύμφωνα με την αντίδραση (9) : 6Fe 2+ + Cr 2 O H + 6Fe Cr H 2 O (9) Το τέλος της ογκομέτρησης διαπιστώνεται από την αλλαγή του κίτρινου χρώματος της περίσσειας των διχρωμικών σε πράσινο του Cr 3+ και στη συνέχεια σε ερυθροκαστανό, λόγω της συμπλοκοποίησης της περίσσειας του Fe 2+ με τη φαινανθρολίνη. Τα BOD 5 και COD περιλαμβάνονται στις παραμέτρους για τις οποίες έχουν τεθεί ανώτατες επιτρεπτές τιμές προκειμένου τα λύματα - απόβλητα να διατεθούν σε υδάτινους αποδέκτες. Οι τιμές διαφέρουν από αποδέκτη σε αποδέκτη και κυμαίνονται για το BOD 5 από 25 έως 40 mg/l και για το COD από 125 έως 160 mg/l (Εφημερίς της Κυβερνήσεως, 2010). 46

63 1. 16 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Το τυρόγαλα είναι το κύριο προϊόν της βιομηχανίας γάλακτος και παράγεται καθημερινά σε παγκόσμια κλίμακα κατά τόνους. Οι μεγάλες ποσότητες του παραγόμενου τυρογάλακτος σε συνδυασμό με το υψηλό κόστος επεξεργασίας του οδηγούν πολλές μικρομεσαίες τυροκομικές επιχειρήσεις στην ανεξέλεγκτη απόρριψή του στους πλησιέστερους υδάτινους αποδέκτες. Έχοντας υψηλό οργανικό φορτίο, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης σε λακτόζη, το τυρόγαλα απορριπτόμενο στο περιβάλλον καταστρέφει τα οικοσυστήματα προκαλώντας ευτροφισμό. Εργαστηριακή και βιομηχανική έρευνα έχει εστιάσει στην αξιοποίηση του τυρογάλακτος μέσω της αντιμετώπισής του όχι σαν ρυπαντή, αλλά σαν πρώτη ύλη για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας και ενέργειας. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η παραγωγή γαλακτικού οξέος από τυρόγαλα κατά τη ζύμωση αυτού με τη φυσική μικτή καλλιέργεια του κεφίρ. Προς τούτο, διερευνήθηκε ο ρόλος του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος (ΡΠΛ) από ελεύθερα κύτταρα κεφίρ, κατά την παραγωγή του οξέος, με ή χωρίς την προσθήκη διαφόρων φτηνών, στερεών αποβλήτων [φλοιοί βύνης (BSG), πριονίδι, μεσοκάρπιο πορτοκαλιού] ως πιθανών προωθητών της ζύμωσης. Η διερεύνηση της μείωσης του οργανικού φορτίου του τυρογάλακτος αποτελεί ζητούμενο και μελετάται επίσης. Απώτερος σκοπός της εργασίας είναι η εύρεση μιας μεθόδου που θα είναι γρήγορη, εύκολη, φθηνή και άρα μη απαγορευτική για τις μικρομεσαίες επιχειρήσεις, που θα μειώνεται το οργανικό φορτίο του τυρογάλακτος, ενώ ταυτόχρονα θα παράγεται καθαρό γαλακτικό οξύ έχοντας πλήθος εφαρμογών στην βιομηχανία. 47

64 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 48

65 2.1 Αντιδραστήρια KH 2 PO 4 (Μ.Β.=136,09 g/mol), E. Merck (99,5%) MgSO 4 7H 2 O (Μ.Β.=246,48 g/mol), E. Merck (>99%) (NH 4 ) 2 SO 4 (Μ.Β. =132,13 g/mol), E. Merck (99,5%) TCA (M.B. = g/mol), E. Merck(>99%) Yeast extract, Fluka Άγαρ, E. Merck Αιθανόλη 75% v/v Απιονισμένο νερό Γάλα αγελάδας πλήρες (ΦΑΓΕ) Διάλυμα ραδιενεργής λακτόζης [D-glucose-1-14 C], (ARC 0466 lactose 0.1 mci/ml) Διάλυμα NaOH 6M Διάλυμα τρυγικού οξέος 7% w/v Λακτόζη, 1. CHEM-LAB για συνθετικό θρεπτικό μέσο 2. FLUKA για HPLC Μεσοκάρπιο πορτοκαλιού (βαλέντσια), (Super market Κρόνος) Μικτή καλλιέργεια κεφίρ από το εμπόριο Πριονίδι (ξυλουργείου από διάφορα ξύλα) Σπινθηριστικό μίγμα OPTI FLUOR (Perkin Elmer) Στερεά απόβλητα ζυθοποιείου (AMSTEL, Αχαΐα) Τυρόγαλα (Αγροτικός Συνεταιρισμός Καλαβρύτων, Αχαΐα) Υπερκάθαρο νερό αγωγιμότητας 18,2 ΜΩ 2.2 Όργανα και συσκευές Αέριος χρωματογράφος με φασματογράφο μάζας, GC/MS, (Shimadzu GC-17A, MS QP5050) Αναλυτικός ζυγός ακριβείας (Sartorius, ακρίβειας ±0,01) 49

66 Αυτόκαυστο Sitran Γυάλινοι κύλινδροι για τη μέτρηση της πυκνότητας (σε ο Be) Επωαστικός θάλαμος (0-70 ο C) τύπου ISCO FTD-250 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης, SEM, (JEOL model JSM-6300) Ηλεκτρονικό phμετρο Metrohm Θερμόμετρα (0-100 ο C) Κωνικές φιάλες (250 ml, 1 L, 2 L) Λύχνος Bunsen Μικροπιππέτες Labmate ml και 0,5-5 ml Ογκομετρικοί κύλινδροι διαφόρων χωρητικοτήτων Πλαστικά φιαλίδια Πυκνόμετρα κλίμακας ο Be Συσκευή καθαρισμού νερού (Synergy, Millipore S.A. Τριβλία petri Υγρός απαριθμητής σπινθηρισμών, (PA CARD-3255) Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης, HPLC (Shimadzu LC-9A, στήλη SHIM-PACK SCR-101N, ανιχνευτής δείκτη διάθλασης RID-6A) Φαρμακευτικός ζυγός Ψυχόμενη φυγόκεντρος SIGMA 3K Τυρόγαλα Το τυρόγαλα που χρησιμοποιήθηκε στο σύνολο των πειραμάτων παράχθηκε στον Αγροτικό Συνεταιρισμό Καλαβρύτων. Ήταν υποπροϊόν της επεξεργασίας πρόβειου ή αιγοπρόβειου γάλακτος με μικρό ποσοστό κατσικίσιου για παραγωγή φέτας. Η παραλαβή του γινόταν αφού αφαιρούνταν μέρος των πρωτεϊνών αλβουμίνης και γαλακταλβουμίνης (για την παραλαβή μυζήθρας) και διατηρούνταν σε πλαστικά δοχεία στο ψυγείο μέχρις ότου χρησιμοποιηθεί. Το τυρόγαλα αυτό περιείχε περίπου 4,8-5% λακτόζη, 0,4% πρωτεΐνες, λίγα λίπη και άλατα και το ph του ήταν περίπου 6,0-6,5. Η 50

67 θερμοκρασία συντήρησης του τυρογάλακτος ήταν οι -20 ο C και για τους σκοπούς του πειράματος αποψυχόταν σε θερμοκρασία δωματίου. 2.4 Κόκκοι κεφίρ Κατά την διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας χρησιμοποιήθηκαν κόκκοι κεφίρ του εμπορίου. Οι κόκκοι συντηρήθηκαν σε πλήρες, φρέσκο, αγελαδινό γάλα στους 4 ο C. Το γάλα αποχυνόταν κάθε 7 d. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν ανακαλλιέργεια του μικροοργανισμού εμβολιάζοντας, με αποστειρωμένο σε φλόγα λύχνου, μικροβιολογικό κρίκο ποσότητα των κόκκων σε στερεό θρεπτικό συνθετικό μέσο λακτόζης (Παράγραφος 2.6). 2.5 Στερεά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα Λιγνοκυτταρινούχα, πορώδη στερεά απόβλητα στα οποία ακινητοποιήθηκε κεφίρ όταν προστεθούν στο τυρόγαλα φαίνεται να αυξάνουν το ρυθμό της ζύμωσης της λακτόζης αυτού από το κεφίρ (Soupioni et al., 2013). Προς τούτο έγινε χρήση 3 διαφορετικών στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων ως πιθανών προωθητών της ζύμωσης του τυρογάλακτος με κεφίρ χάριν απλότητας. Στο τυρόγαλα προστέθηκαν φλοιοί βύνης (BSG), μεσοκάρπιο πορτοκαλιού και πριονίδι. Η προμήθεια των BSG έγινε από το εργοστάσιο της Αθηναϊκής Ζυθοποιίας, Βιομηχανική Περιοχή Πατρών, ενώ τα πορτοκάλια και το πριονίδι από τοπικά καταστήματα. Για την παραλαβή του μεσοκαρπίου (άσπρο τμήμα πορτοκαλιού), πορτοκάλια πλύθηκαν, στεγνώθηκαν και τους αφαιρέθηκε το πορτοκαλί τμήμα της φλούδας. Το μεσοκάρπιο τεμαχίσθηκε σε στρογγυλά κομμάτια διαμέτρου 1,5 cm με φελλοτρυπητήρα και αποθηκεύτηκε όπως και τα BSG στους -20 o C. Τα BSG και το πριονίδι έχοντας μικρή διάμετρο χρησιμοποιήθηκαν ως είχαν κατά την προμήθεια. Πριν από κάθε χρήση τα 3 στερεά απόβλητα αποψύχονταν και αφήνονταν σε ποσότητα υπερκάθαρου νερού για 1 d ώστε να εκχυλιστούν ουσίες που πιθανώς θα παρεμπόδιζαν τη ζύμωση. 51

68 2.6 Ανάπτυξη κεφίρ σε στερεό συνθετικό θρεπτικό μέσο λακτόζης Η ανάπτυξη της στερεής καλλιέργειας κεφίρ πραγματοποιήθηκε σε στερεό συνθετικό θρεπτικό μέσο με την ακόλουθη σύσταση: Λακτόζη, 4% w/v Yeast extract, 0,4% w/v (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1% w/v KH 2 PO 4, 0,1% w/v MgSO 4 x 7H 2 O, 1% w/v Άγαρ, 2% w/v Τα συστατικά διαλύθηκαν σε απιονισμένο νερό με τελικό ph διαλύματος 5,5. Στη συνέχεια το θρεπτικό μέσο αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C και πίεση 1,5-2 atm. Όταν ψύχθηκε ελαφρώς μεταφέρθηκε σε τριβλία petri όπου και στερεοποιήθηκε. Ο εμβολιασμός του κεφίρ έγινε με μικροβιολογικό κρίκο αποστειρωμένο σε φλόγα λύχνου και τα τριβλία αφέθηκαν σε θερμοθάλαμο στους 30 ο C για 2 ημέρες προς επώαση. 2.7 Ανάπτυξη κεφίρ σε υγρό συνθετικό θρεπτικό μέσο λακτόζης Με το πέρας της επώασης, ποσότητα κεφίρ εμβολιάστηκε με μικροβιολογικό κρίκο σε 250 ml αποστειρωμένου, συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης της ανωτέρω σύστασης (Παράγραφος 2.6) χωρίς την προσθήκη άγαρ. Ακολούθησε επώαση σε θερμοθάλαμο στους 30 ο C για 24 h με αερόβια διεργασία μέσω παροχής φιλτραρισμένου αέρα από αντλία. Στη συνέχεια ακολούθησε εκ νέου επώαση στις ίδιες συνθήκες, με μεταφορά της αναπτυγμένης υγρής καλλιέργειας σε 1 L αποστειρωμένου συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης. 52

69 2.8 Παραλαβή βιομάζας Η παραλαβή της βιομάζας έγινε με φυγοκέντρηση στις 4500 στροφές στους 30 ο C για 10 min. Παραλαμβάνονταν περίπου 40 g υγρής βιομάζας/2 L συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης. Η βιομάζα συντηρούνταν στο ψυγείο στους 4 ο C έως 2 d. 2.9 Ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ Επίδραση θερμοκρασίας Σε τρεις κωνικές φιάλες των 500 ml τοποθετήθηκαν 250 ml συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης της παρακάτω σύστασης: Λακτόζη, 5% w/v Yeast extract, 0,4% w/v (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1% w/v KH 2 PO 4, 0,1% w/v MgSO 4 x 7H 2 O, 1% w/v Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν η θερμοκρασία μειώθηκε έως τη θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκαν 6 g κυττάρων κεφίρ σε κάθε φιάλη και το ph ρυθμίστηκε στο 5,5 με τη βοήθεια τρυγικού καλίου 7% w/v καθώς το αρχικό ph ήταν περίπου 6. Στη συνέχεια οι αντιδραστήρες τοποθετήθηκαν σε θερμοθάλαμο στους 35 ο C και η διαδικασία επαναλήφθηκε και για θερμοκρασίες 37, 40 και 42 ο C, χωρίς παροχή αέρα. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα Baume ( ο Βe), φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια στην κατάψυξη για τις περαιτέρω χημικές αναλύσεις και ρυθμιζόταν το ph στο 5,5 με την προσθήκη NaOH 6 M. 53

70 2.9.2 Επίδραση ph Σε τρεις κωνικές φιάλες των 500 ml τοποθετήθηκαν 250 ml συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης της παρακάτω σύστασης: Λακτόζη, 5% w/v Yeast extract, 0,4% w/v (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1% w/v KH 2 PO 4, 0,1% w/v MgSO 4 x 7H 2 O, 1% w/v Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν η θερμοκρασία μειώθηκε έως τη θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκαν 6 g κυττάρων κεφίρ σε κάθε φιάλη. Στη συνέχεια το ph ρυθμίστηκε στο 4,5 και οι αντιδραστήρες αφέθηκαν σε θερμοθάλαμο στους 37 o C απουσία αέρα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε και για τιμές ph 5,5 και 7. Το ph ρυθμιζόταν με την προσθήκη τρυγικού καλίου 7% w/v ή με την προσθήκη NaOH 6 Μ ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες, ώστε να διατηρείται σταθερό στην εκάστοτε επιθυμητή τιμή. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα ο Βe και φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια στην κατάψυξη για τις περαιτέρω χημικές αναλύσεις Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ Επίδραση θερμοκρασίας Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml τυρογάλακτος. Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν επήλθε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκαν 6 g κεφίρ σε κάθε κωνική και το ph ρυθμίστηκε στο 5,5 με την προσθήκη τρυγικού καλίου 7% w/v, καθώς το αρχικό ph του τυρογάλακτος ήταν 6,5. Το σύστημα αφέθηκε για να πραγματοποιηθεί η ζύμωση σε θερμοθάλαμο, όπου η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 35 ο C απουσία αέρα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε και για θερμοκρασίες 37, 40 και 42 ο C. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα ο Βe, φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια στην κατάψυξη για τις 54

71 περαιτέρω χημικές αναλύσεις και ρυθμιζόταν το ph στο 5,5 με την προσθήκη NaOH 6 M Επίδραση ph Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml τυρογάλακτος. Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν επήλθε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκαν 6 g κεφίρ σε κάθε κωνική, το ph ρυθμίστηκε στο 4,5 και οι αντιδραστήρες αφέθηκαν προς ζύμωση σε θερμοθάλαμο στους 37 ο C απουσία αέρα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε και για τιμές ph 5,5 και 7. Το ph ρυθμιζόταν με την προσθήκη τρυγικού καλίου 7% w/v ή με την προσθήκη NaOH 6 Μ ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες ώστε να διατηρείται σταθερό στην εκάστοτε επιθυμητή τιμή. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα ο Βe και φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια στην κατάψυξη για τις περαιτέρω χημικές αναλύσεις Υπολογισμός ενέργειας ενεργοποίησης, Εa Ο υπολογισμός της ενέργειας ενεργοποίησης, Ε a (kj/mol) των συστημάτων ζύμωσης (ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ, ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ) έγινε με τη χρήση της εξίσωσης Arrhenius: lndp/dt = ln(ax) E a /RT (Koutinas et al., 2012) όπου P: Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος (g/l) t: Ο χρόνος ζύμωσης (h) T: Η απόλυτη θερμοκρασία (K) A: Ο εκθετικός αριθμός κατά Arrhenius (1/h) R: Η παγκόσμια σταθερά των αερίων (kj/mol.k) X: H συγκέντρωση κυττάρων κεφίρ (g/l) 55

72 2.12 Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία φλοιών βύνης (BSG) Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml τυρογάλακτος. Σε αυτές προστέθηκαν 120 g BSG τα οποία όπως προαναφέρθηκε παρέμειναν προηγουμένως σε υπερκάθαρο νερό για 24 h ώστε να εκχυλιστούν ουσίες που πιθανώς να παρεμποδίζουν την ζύμωση. Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν επήλθε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκαν 6 g κεφίρ σε κάθε κωνική και το ph ρυθμίστηκε στο 5,5 με την προσθήκη τρυγικού καλίου 7% w/v, καθώς το αρχικό ph του τυρογάλακτος ήταν 6,5. Το σύστημα αφέθηκε για να πραγματοποιηθεί η ζύμωση σε θερμοθάλαμο, όπου η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 37 ο C απουσία αέρα και ανάδευσης. Η διαδικασία επαναλήφθηκε και για προσθήκες 140 και 160 g BSG αντίστοιχα. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα Βe, φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια στην κατάψυξη για τις περαιτέρω χημικές αναλύσεις και ρυθμιζόταν το ph στο 5,5 με την προσθήκη NaOH 6 M Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία αποβλήτων ξυλουργείου (πριονίδι) Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml τυρογάλακτος. Σε αυτές προστέθηκαν 120 g από πριονίδι τα οποία όπως προαναφέρθηκε επίσης παρέμειναν προηγουμένως σε υπερκάθαρο νερό για 24 h ώστε να εκχυλιστούν ουσίες που πιθανώς να παρεμποδίζουν την ζύμωση. Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν επήλθε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκαν 6 g κεφίρ σε κάθε κωνική και το ph ρυθμίστηκε στο 5,5 με την προσθήκη τρυγικού καλίου 7% w/v, καθώς το αρχικό ph του τυρογάλακτος ήταν 6,5. Το σύστημα αφέθηκε για να πραγματοποιηθεί η ζύμωση σε θερμοθάλαμο, όπου η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 37 ο C απουσία αέρα και χωρίς ανάδευση. Η διαδικασία 56

73 επαναλήφθηκε και για προσθήκες 140 και 160 g πριονιδιού αντίστοιχα. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα ο Βe, φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια για τις περαιτέρω χημικές αναλύσεις και ρυθμιζόταν το ph στο 5,5 με την προσθήκη NaOH 6 M Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία μεσοκαρπίου του πορτοκαλιού Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml τυρογάλακτος. Σε αυτές προστέθηκαν 120 g από μεσοκάρπιο πορτοκαλιού το οποίο όπως προαναφέρθηκε ήταν τεμαχισμένο σε στρογγυλά κομμάτια διαμέτρου 1,5 cm με φελλοτρυπητήρα και παρέμεινε σε υπερκάθαρο νερό για 24 h ώστε να εκχυλιστούν ουσίες, που πιθανώς να παρεμποδίζουν την ζύμωση. Οι φιάλες αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 ο C. Όταν επήλθε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκαν 6 g κεφίρ σε κάθε κωνική και το ph ρυθμίστηκε στο 5,5 με την προσθήκη τρυγικού καλίου 7% w/v, καθώς το αρχικό ph του τυρογάλακτος ήταν 6,5. Το σύστημα αφέθηκε για να πραγματοποιηθεί η ζύμωση σε θερμοθάλαμο, όπου η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 37 ο C απουσία αέρα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε και για προσθήκες 140 και 160 g μεσοκαρπίου αντίστοιχα. Κάθε δύο h μετριόταν η πυκνότητα ο Βe, φυλάσσονταν 5 ml δείγματος σε πλαστικά φιαλίδια στην κατάψυξη για τις περαιτέρω χημικές αναλύσεις και ρυθμιζόταν το ph στο 5,5 με την προσθήκη NaOH 6 M Μελέτη του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης Ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης παρουσία λακτόζης επισημασμένης με 14 C Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml αποστειρωμένου υγρού συνθετικού θρεπτικού μέσου (Παράγραφος 2.9), προστέθηκε 1 ml ραδιενεργής λακτόζης και πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις με 6 g κεφίρ σε: (α) σταθερό ph 5,5 και θερμοκρασίες 35, 37,40 και 42 ο C (β) 57

74 σταθερή θερμοκρασία 37 ο C και ph 4,5, 5,5 και 7. Σε τακτά χρονικά διαστήματα, λαμβάνονταν δείγματα των 5 ml τα οποία τοποθετούνταν σε πλαστικό φιαλίδιο φυγοκέντρησης. Ύστερα από φυγοκέντρηση στις 4500 στροφές για 15 min, παραλαμβανόταν η βιομάζα και έπειτα από ζύγιση σε αναλυτικό ζυγό αποθηκευόταν με 5 ml σπινθηριστικό μίγμα σε κατάλληλο φιαλίδιο ώστε να μετρηθεί το ποσό της ραδιενέργειας που έχει προσληφθεί από το κεφίρ στον υγρό απαριθμητή σπινθηρισμών Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία λακτόζης επισημασμένης με 14 C Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml αποστειρωμένου τυρογάλακτος, προστέθηκε 1 ml ραδιενεργής λακτόζης και πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις με 6 g κεφίρ σε: (α) σταθερό ph 5,5 και θερμοκρασίες 35, 37,40 και 42 ο C (β) σταθερή θερμοκρασία 37 ο C και ph 4,5, 5,5 και 7. Σε τακτά χρονικά διαστήματα, λαμβάνονταν δείγματα των 5 ml τα οποία τοποθετούνταν σε πλαστικό φιαλίδιο. Ύστερα από φυγοκέντρηση στις 4500 στροφές για 15 min, παραλαμβανόταν η βιομάζα και έπειτα από ζύγιση σε αναλυτικό ζυγό αποθηκευόταν με 5 ml σπινθηριστικό μίγμα σε κατάλληλο φιαλίδιο ώστε να μετρηθεί το ποσό της ραδιενέργειας που έχει προσληφθεί από το κεφίρ στον υγρό απαριθμητή σπινθηρισμών Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων και λακτόζης επισημασμένης με 14 C Σε 3 γυάλινες κωνικές φιάλες των 500 ml μεταφέρθηκαν 250 ml αποστειρωμένου τυρογάλακτος, προστέθηκε 1 ml ραδιενεργής λακτόζης και πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις με 6 g κεφίρ σε σταθερό ph 5,5 και στους 37 ο C με προσθήκη: (α) 120, 140 και 160 g BSG (β) 120, 140 και 160 g πριονιδιού (γ) 120, 140 και 160 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού. Σε τακτά χρονικά διαστήματα, λαμβάνονταν δείγματα των 5 ml τα οποία τοποθετούνταν σε πλαστικό φιαλίδιο. Ύστερα από φυγοκέντρηση στις 4500 στροφές για 15 min, παραλαμβανόταν η βιομάζα και έπειτα από ζύγιση σε 58

75 αναλυτικό ζυγό αποθηκευόταν με 5 ml σπινθηριστικό μίγμα σε κατάλληλο φιαλίδιο ώστε να μετρηθεί το ποσό της ραδιενέργειας που έχει προσληφθεί από το κεφίρ στον υγρό απαριθμητή σπινθηρισμών Χημικές Αναλύσεις Χημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στα δείγματά που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των ζυμώσεων και αποσκοπούσαν στον προσδιορισμό του γαλακτικού οξέος, των αζύμωτων σακχάρων, των πτητικών παραπροϊόντων και του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ. Επίσης, προκειμένου να διαπιστωθεί αν η προωθητική ικανότητα των προστιθέμενων στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων οφειλόταν στην ακινητοποίηση των κυττάρων του κεφίρ πάνω σε αυτά, έγινε έλεγχος αυτών σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) πριν και μετά τη ζύμωση Προσδιορισμός γαλακτικού οξέος Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος προσδιορίσθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) σε όργανο Jasco LC-2000 Series HPLC system (Jasco Inc., Japan) με τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Ιονταλλακτική στήλη Bio-rad Aminex HPX-87H ( mm i.d., 9 μm particle size), CO-2060 PLUS Αντλία PU-2089 Κινητή φάση N H 2 SO 4 Ταχύτητα ροής 0,6 ml /min Θερμοκρασία στήλης 50 ο C Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδου (210 nm) Οι διατάξεις με ανιχνευτές συστοιχιών διόδων, αποτελούν τους αποδοτικότερους φασματοφωτομετρικούς ανιχνευτές υπεριώδους. Τέτοιες διατάξεις προσφέρονται από πολλούς κατασκευαστές και με αυτές πραγματοποιείται συλλογή δεδομένων ενός πλήρους φάσματος σε χρόνο περίπου 1s. 59

76 Πριν από την ανάλυση σε κάθε δείγμα των 5 ml προστέθηκαν 0,6 ml διαλύματος τριχλωροοξικού οξέος TCA (40% w/v). Τα δείγματα παρέμειναν στο ψυγείο στους 4 o C για 24 h ώστε να γίνει αποπρωτεΐνωση. Στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις στροφές για 30 min στους 4 ο C και διήθηκαν σε φίλτρα διαμέτρου 0,2 μm (Prasanna et al., 2012). Όντας απολύτως διαυγή τοποθετήθηκαν στα ειδικά φιαλίδια του οργάνου προς ανάλυση Προσδιορισμός αζύμωτου σακχάρου Το αζύμωτο σάκχαρο προσδιορίσθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) με όργανο SHIMADZU LC-9A με τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: Στήλη Shim-pack, SCR-101 Κινητή φάση υπερκάθαρο νερό και διηθημένο νερό Ταχύτητα ροής 0,8 ml /min Θερμοκρασία στήλης 60 ο C Ανιχνευτής δείκτη διάθλασης (RID) Ο ανιχνευτής δείκτη διάθλασης αποτελείται από δυο διαφορετικά τμήματα. Το ένα τμήμα, από το οποίο διέρχεται ο διαλύτης, είναι το μισό μιας κυψελίδας και από το άλλο μισό διέρχεται το υγρό έκλουσης. Έχει το πλεονέκτημα ότι ανταποκρίνεται σχεδόν σε όλα τα υγρά έκλουσης. Είναι δηλαδή γενικός ανιχνευτής. Παρ όλα αυτά, είναι ιδιαίτερα ευπαθής στις αλλαγές της θερμοκρασίας. Επιπλέον, δεν έχει την ίδια ευαισθησία που έχουν οι περισσότεροι από τους υπόλοιπους ανιχνευτές. Για τον προσδιορισμό του σακχάρου του δείγματος, 0,25 ml δείγματος και 1,25 ml βουτανόλη-1 1 %v/v (ως εσωτερικό πρότυπο) φέρονταν σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και συμπληρώνονταν με υπερκάθαρο νερό έως τη χαραγή. Από το διάλυμα που προέκυπτε εισάγονταν 40 μl στο χρωματογράφο αφού πρώτα γινόταν διήθηση του δείγματος με φίλτρο πόρων διαμέτρου 0,2 μm και τα αποτελέσματα εξάγονταν με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης που είχε κατασκευαστεί με προσδιορισμούς σε υδατικά διαλύματα σακχάρων 1-50 g/l. 60

77 Προσδιορισμός πτητικών παραπροϊόντων Στην περίπτωση της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ παρουσία μεσοκαρπίου πορτοκαλιού προσδιορίστηκαν πτητικά παραπροϊόντα της ζύμωσης που πιθανά οφείλονται στο πορτοκάλι. Τα πτητικά αυτά συστατικά αναλύθηκαν με φασματογράφο μάζας συνδεδεμένο με αέριο χρωματογράφο SHIMADZU GC-17A, MS QP5050. Χρησιμοποιήθηκε τριχοειδής στήλη Supelco CO Wax m, 0,32 mm i.d, 0,25 μm πάχος film και φέρον αέριο ήλιο με ταχύτητα ροής 1,8 ml/min. Η θερμοκρασία του φούρνου προγραμματίστηκε αρχικά στους 40 ο C για 5 min και στη συνέχεια αυξήθηκε μέχρι τους 110 o C με ρυθμό 10 ο C/min, από τους 110 έως τους 180 ο C με ρυθμό 2 ο C/min, από τους 180 έως τους 250 ο C με ρυθμό 10 ο C/min και τέλος διατήρηση στους 250 ο C για 6 min. Το όργανο ρυθμίστηκε να λειτουργεί σε λειτουργία splitless (καθολική εισαγωγή δείγματος). Η θερμοκρασία της συσκευής έκχυσης ήταν 230 o C και του ανιχνευτή 250 ο C. Ο τρόπος λειτουργίας του φασματογράφου μάζας συνίσταται στην πρόσκρουση ηλεκτρονίων (electron impact mode) με ενέργεια ηλεκτρονίων ρυθμισμένη στα 70 ev και εύρος μάζας m/z Η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε συγκρίνοντας τους χρόνους έκλουσης και τα φάσματα μάζας των πτητικών ενώσεων με πρότυπα συστατικά, με δεδομένα φασματοσκοπίας μαζών από τις βιβλιοθήκες NIST107, NIST21 και SZTERP. Ακόμη υπολογίστηκε ο αριθμός Kovats Index (ΚΙ) και πραγματοποιήθηκε σύγκριση με αυτούς που αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Dimitrellou D. et al. 2009; Horne J. et al., 2005; Kopsahelis N. et al., 2009; Majcher M. et al., 2007; Plessas S. et al., 2007; Ximenita I. et al., 2009; Pal J. et al., 2007; Maggi F. et al., 2010; Chen D. et al., 2010; Kandylis P. et al., 2012, Aggelopoulos et al., 2012a) Προσδιορισμός του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης Για τον προσδιορισμό του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ όπως προαναφέρθηκε, φυγοκεντρήθηκαν 5 ml δείγματος τα οποία τοποθετήθηκαν σε πλαστικό φιαλίδιο φυγοκέντρησης. Στη συνέχεια ζυγίσθηκε η βιομάζα που παραλήφθηκε από τη φυγοκέντρηση, ώστε να μετρηθεί το 61

78 ποσό της ραδιενέργειας (cpm/g βιομ.h) που είχε προσληφθεί από το κεφίρ, στον υγρό απαριθμητή σπινθηρισμών. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε αφού προστέθηκαν στα φιαλίδια 5 ml από το σπινθηριστικό μίγμα OPTI FLUOR (Petrin Elmer) έτσι ώστε να καλυφθεί η βιομάζα και στην συνέχεια τοποθετήθηκαν στον υγρό απαριθμητή (PACARD-3255) συνδεδεμένο με καταγραφικό Προσδιορισμός Βιοχημικά Απαιτούμενου Οξυγόνου (BOD5) Ο προσδιορισμός του βιοχημικά απαιτούμενου οξυγόνου έγινε βάσει της τυποποιημένης μεθόδου Winkler (ιωδομετρική μέθοδος) για την εξέταση του νερού και των αποβλήτων. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: Απεσταγμένο νερό Διάλυμα θειικού μαγνησίου: 22,5 g MgSO 4.7H 2 O διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και αραιώθηκαν στο 1 L. Διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου: 27,5 g άνυδρου CaCl 2 διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και αραιώθηκαν στο 1 L. Διάλυμα χλωριούχου σιδήρου: 0,25 g FeCl 3.6H 2 O διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και αραιώθηκαν στο 1 L. Διάλυμα φωσφορικών: 8,5 g KH 2 PO 4,21,75 g K 2 HPO 4.2H 2 O, 33,4 g Na 2 HPO 4.7H 2 O και 1,7 g NH 4 Cl διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και αραιώθηκαν στο 1 L. Το ph αυτού του διαλύματος θα πρέπει να είναι 7,2. Διάλυμα θειικού μαγγανίου: 480 g MnSO 4.4H 2 O διαλύθηκαν σε 500 ml απεσταγμένο νερό. Το διάλυμα διηθήθηκε από χάρτινο ηθμό και προστέθηκε αποστεγμένο νερό μέχρι το 1 L. Αλκαλικό διάλυμα ιωδιούχων: 500 g NaOH διαλύθηκαν σε 500 ml απεσταγμένο νερό και 150 g KI διαλύθηκαν σε 200 ml απεσταγμένο νερό. Τα 2 διαλύματα αναμίχθηκαν όταν ψύχθηκαν. Σε 40 ml απεσταγμένο νερό διαλύθηκαν 10 g NaN 3 και το διάλυμα του NaN 3 προστέθηκε με συνεχή ανάδευση στο ψυχρό διάλυμα του NaOH και αραιώθηκε στο 1 L. Πυκνό θειϊκό οξύ 62

79 Διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου 0,025 Ν Διάλυμα αμύλου 1% w/v Νερό αραίωσης: Το νερό αραίωσης πριν την επώαση, αερίστηκε έντονα με διαβίβαση αέρα μέσω μιας αντλίας, για να κορεστεί σε οξυγόνο. Προστέθηκε 1 ml από κάθε ένα από τα αντιδραστήρια 2,3,4,5 για κάθε λίτρο απεσταγμένου νερού. Τα φωσφορικά προστέθηκαν ακριβώς πριν από τη χρήση του νερού αραίωσης. Πριν αρχίσει η ανάλυση επιβεβαιώθηκε ότι το νερό αραίωσης είναι έτοιμο για χρήση, δηλαδή πως το διαλυμένο οξυγόνο είναι πάνω από 8 mg/l. Επιπρόσθετα, για να γίνει έλεγχος του νερού αραίωσης, το είδους της καλλιέργειας και των συνθηκών ανάλυσης, παρασκευάστηκε ένα πρότυπο διάλυμα με 150 mg/l γλυκόζη. Ελήφθησαν 5 ml αυτού του διαλύματος, τα οποία προστέθηκαν σε φιάλη με νερό αραίωσης που περιείχε καλλιέργεια (φρέσκια λάσπη από βιολογικό καθαρισμό) και αφέθηκαν προς επώαση για 5 d. Το BOD 5 σύμφωνα με τη βιβλιογραφία (Καραπαναγιώτη, 2015) θα έπρεπε να είναι (220 ± 5) mg/l. Στη συνέχεια, σε κατάλληλες φιάλες BOD προστέθηκε ποσότητα εμβολιασμένου νερού αραίωσης. Έπειτα, προστέθηκε ποσότητα αραιωμένου τυρογάλακτος, οι φιάλες απογεμίστηκαν με προσοχή ενώ προστέθηκαν 2 ml διαλύματος θεϊκού μαγγανίου και 2 ml αλκαλικού διαλύματος ιωδιούχωναζιδίου. Τοποθετήθηκαν τα πώματα χωρίς να παγιδευτεί καμία φυσαλίδα αέρα και αφού αναδεύτηκαν προστέθηκε 2 ml H 2 SO 4 και αφέθηκαν σε σκοτεινό μέρος σε ηρεμία για 5min. Τα διαλύματα ογκομετρήθηκαν με διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου μέχρι το κίτρινο χρώμα. Τέλος, προστέθηκε 1 ml δείκτη αμύλου και η ογκομέτρηση ολοκληρώθηκε όταν εξαφανίστηκε το μπλε χρώμα. Για τον προσδιορισμό κάθε δείγματος αντιστοιχούσαν δυο φιάλες. Στη μια ο προσδιορισμός γινόταν άμεσα ενώ στην άλλη μετά από επώαση πέντε ημερών. Ο υπολογισμός του BOD 5 έγινε βάση του τύπου: BOD mg O 2 /L αποβλήτου = [(D 1 -D 2 )-(B 1 -B 2 )]*100 / % Συγκέντρωση Δείγματος D 1 =ΔΟ mg O 2 /L, πριν την επώαση D 2 =ΔΟ mg O 2 /L, μετά την επώαση Β 1 = ΔΟ mg O 2 /L,νερού διαλύσεως με καλλιέργεια πριν την επώαση Β 2 = ΔΟ mg O 2 /L, νερού διαλύσεως με καλλιέργεια μετά από 5 ημέρες 63

80 Προσδιορισμός Χημικά Απαιτούμενου Οξυγόνου (COD) Η μέτρηση του COD πραγματοποιήθηκε επίσης με μια τυποποιημένη μέθοδο της εταιρίας HACH. Σε έναν από τους κλειστούς ειδικούς τυποποιημένους δοκιμαστικούς σωλήνες προστέθηκαν υπό γωνία 45 ο με μία πιπέτα ακριβείας 2 ml απεσταγμένο νερό (τυφλό). Σε κάθε έναν από τους υπόλοιπους σωλήνες προστέθηκε ομοίως 2 ml αραιωμένου δείγματος (1/10) ζυμούμενου τυρογάλακτος. Οι σωλήνες τοποθετήθηκαν στην ειδική συσκευή HACH και αφέθηκαν για χώνεψη στους 150 ο C για 2 h. Αφού ψύχθηκαν μετρήθηκε η απορρόφηση του φωτός σε ειδικό μήκος κύματος στο φασματοφωτόμετρο της HACH, στο πρόγραμμα 430 COD LR με εύρος τιμών mg/l.για την επαλήθευση των μετρήσεων χρησιμοποιήθηκε πρότυπο διάλυμα γλυκόζης γνωστής συγκέντρωσης Στατιστική ανάλυση Κατά τη διάρκεια κάθε ζύμωσης η τυπική απόκλιση (SD) των καταγεγραμμένων τιμών για τα αζύμωτα σάκχαρα, τη συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος καθώς και το ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ υπολογίσθηκε με χρήση του software Origin 8, με τη βοήθεια του οποίου και σχεδιάστηκαν οι ανάλογες γραφικές παραστάσεις Λήψεις σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) Για να επιβεβαιωθεί η τυχόν ακινητοποίηση των κυττάρων κεφίρ πάνω στα στερεά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος στην οποία πιθανώς οφείλεται η προωθητική ικανότητα της προσθήκης αυτών στο τυρόγαλα, ελήφθησαν μικρογραφίες σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης πριν και μετά την προσθήκη αυτών στο υγρό της ζύμωσης. Γι αυτό το λόγο, τα απόβλητα ξηράνθηκαν σε φούρνο για 2 h στους 120 ο C. Στη συνέχεια καλύφθηκαν με χρυσό σε συσκευή επικαλύψεως Balzers SCD 004 για 10 min έτσι ώστε να αποκτήσουν αυξημένη αγωγιμότητα. Όλα τα δείγματα με ή χωρίς 64

81 τα ακινητοποιημένα κύτταρα μελετήθηκαν σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης τύπου JEOL model JSM

82 3. Αποτελέσματα Συζήτηση 66

83 3.1 Ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ Για τον προσδιορισμό των βέλτιστων φυσικοχημικών παραμέτρων κατά τη ζύμωση του τυρογάλακτος με κεφίρ, πραγματοποιήθηκαν αρχικά ζυμώσεις σε συνθετικό θρεπτικό μέσο λακτόζης καθορισμένης σύστασης σαν μοντέλο ζύμωσης. Η ζύμωση στο θρεπτικό αυτό μέσο που είναι λιγότερο πολύπλοκο αλλά παρόμοιο με το τυρόγαλα οδήγησε στα παρακάτω αποτελέσματα Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας σε σταθερό ph 5,5 Για την επίδραση της θερμοκρασίας στην κινητική της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ (Πίνακας 1) αλλά και στην παραγωγή του γαλακτικού οξέος (Πίνακας 2) πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις σε 250 ml συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με 6 g κεφίρ στους 35, 37, 40, 42 ο C σε σταθερό ph 5,5. Πίνακας 1. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και ph 5,5. Συγκέντρωση συνολικών σακχάρων (g/100ml) Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) 0 4,52 ± 0,30* 4,96 ± 0,30 4,71 ± 0,20 4,54 ± 0,20 2 3,84 ± 0,20 3,23 ± 0,30 3,46 ± 0,20 3,94 ± 0,20 4 3,19 ± 0,10 2,45 ± 0,20 2,75 ± 0,30 3,06 ± 0,30 6 2,71 ± 0,30 1,14 ± 0,30 2,01 ± 0,30 2,57 ± 0,30 8 2,06 ± 0,20 0,69 ± 0,20 1,24 ± 0,20 1,87 ± 0, ,89 ± 0,30 0,76 ± 0,10 1,12 ± 0, ,75 ± 0,20 0,85 ± 0, ,24 ± 0, ,95 ± 0,20 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 67

84 (g/100ml) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0, (h) 35 0 C 37 0 C 40 0 C 42 0 C Σχήμα 3.1 Επίδραση της θερμοκρασίας στη συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης καθορισμένης σύστασης με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου σε ph 5,5. Πίνακας 2. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και ph 5,5. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) ,23 ± 0,30* 0,57 ± 0,30 0,43 ± 0,20 0,34 ± 0,10 4 0,38 ± 0,20 1,03 ± 0,10 0,89 ± 0,30 0,59 ± 0,30 6 0,45 ± 0,30 1,35 ± 0,30 1,14 ± 0,20 0,81 ± 0,30 8 0,50 ± 0, ± 0,20 1,21 ± 0,30 0,90 ± 0, ,54 ± 0, ± 0,10 0,99 ± 0, ,60 ± 0,20 1,01 ± 0, ,63 ± 0, ,68 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 68

85 (g/l) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0, C 37 0 C 40 0 C 42 0 C 0,2 0, (h) Σχήμα 3.2 Επίδραση της θερμοκρασίας στην παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου σε ph 5,5. Ταχύτερη ζύμωση, όπως φαίνεται και στα Σχήματα 3.1 και 3.2 πραγματοποιήθηκε όταν η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 37 ο C. Στη θερμοκρασία αυτή η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 8 h, η συγκέντρωση της αζύμωτης λακτόζης είναι 0,69 g/100ml και αυτή του γαλακτικού οξέος ανέρχεται στα 1,49 g/l. Ακολουθούν οι θερμοκρασίες των 40 και 42 ο C με μεγαλύτερους χρόνους ζύμωσης (10, 11 h), μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αζύμωτων σακχάρων (0,76 και 0,85 g/100ml) και μικρότερες συγκεντρώσεις γαλακτικού οξέος (1,27 και 1,01 g/l). Τέλος, η λιγότερο ευνοϊκή για την συγκεκριμένη ζύμωση θερμοκρασία, φάνηκε να είναι αυτή των 35 ο C με αρκετά μεγαλύτερο χρόνο ζύμωσης, τις 13 h, μικρότερη παραγωγή γαλακτικού οξέος 0,68 g/l αλλά όχι σημαντικά διαφορετική συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων 0,95 g/100ml. Όπως έχει αναφερθεί, το κεφίρ είναι μια φυσική μικτή καλλιέργεια που αποτελείται κυρίως από γαλακτικά βακτήρια και ζύμες. Όσον αφορά στις ζύμες, η μεταβολική τους δραστηριότητα ευνοείται όταν η θερμοκρασία ανέρχεται στους 30 ο C (Golfinopoulos et al., 2011) ενώ των γαλακτικών βακτηρίων φαίνεται να ευνοείται σε αρκετά υψηλότερες θερμοκρασίες με 69

86 βέλτιστη αυτή των 37 ο C. Αυτό συμβαίνει διότι τα γαλακτικά βακτήρια είναι κυρίως μεσόφιλα (Κεσσανόπουλος, 2011) και παρουσιάζουν καλύτερη μεταβολική δραστηριότητα σε μεγαλύτερες θερμοκρασίες. Ενώ φαινομενικά η αύξηση της θερμοκρασίας στους 40 και 42 ο C θα έπρεπε να οδηγήσει και σε υψηλότερη συγκέντρωση γαλακτικού οξέος, λόγω της λειτουργίας κατά βάση των γαλακτικών βακτηρίων, αυτό δεν επιβεβαιώθηκε μιας και η θερμοκρασία ήταν αρκετά υψηλή για τη βέλτιστη λειτουργία του συνόλου των μικροοργανισμών του κεφίρ. Η θερμοκρασία των 35 ο C,παρόλο που είναι σχετικά κοντά σε αυτή των 37 ο C, περιόρισε τη λειτουργία των γαλακτικών βακτηρίων και πιθανά επέτρεψε τη λειτουργία κάποιων ζυμών. Άρα δικαιολογημένα παράχθηκε λιγότερο γαλακτικό οξύ σε σχέση με τις υπόλοιπες θερμοκρασίες, ενώ η συγκέντρωση των αζύμωτων σακχάρων κυμάνθηκε σε παρόμοια επίπεδα με τις υπόλοιπες θερμοκρασίες, μιας και η λακτόζη ζυμώθηκε σε γαλακτικό οξύ και πιθανώς σε αιθανόλη Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας χωρίς διόρθωση ph Οι ζυμώσεις επαναλήφθηκαν στις ίδιες θερμοκρασίες των 35, 37, 40 και 42 ο C σε 250 ml υγρό συνθετικό θρεπτικό μέσο με 6 g κεφίρ χωρίς όμως κατά τη διάρκεια της ζύμωσης να διορθώνεται το ph στην τιμή 5,5 (Πίνακας 3, Πίνακας 4). 70

87 Πίνακας 3. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες. Συγκέντρωση συνολικών σακχάρων (g/100ml) Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) 0 4,52 ± 0,30* 4,96 ± 0,30 4,71 ± 0,20 4,54 ± 0,20 2 4,02 ± 0,30 3,49 ± 0,30 3,62 ± 0,30 4,01 ± 0,30 4 3,35 ± 0,20 2,64 ± 0,30 2,89 ± 0,40 3,37 ± 0,20 6 2,96 ± 0,20 1,35 ± 0,20 2,27 ± 0,20 2,69 ± 0,20 8 2,37 ± 0,30 0,84 ± 0,20 1,46 ± 0,30 1,92 ± 0, ,04 ± 0,20 0,73 ± 0,20 0,76 ± 0,10 1,35 ± 0, ,89 ± 0,30 0,81 ± 0,20 1,08 ± 0, ,45 ± 0,20 0,96 ± 0, ,05 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 5,5 g/100ml 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0, (h) 35 0 C 37 0 C 40 0 C 42 0 C Σχήμα 3.3 Επίδραση της θερμοκρασίας στην συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου. 71

88 Πίνακας 4. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) ,40 ± 0,20 0,35 ± 0,10 0,30 ± 0,30 4 0,32 ± 0,20* 0,86 ± 0,20 0,74 ± 0,30 0,49 ± 0,20 6 0,43 ± 0,20 1,05 ± 0,20 0,80 ± 0,10 0,60 ± 0,30 8 0,51 ± 0, ± 0,30 0,85 ± 0,30 0,76 ± 0, ,53 ± 0,20 1,23 ± 0,30 0,94 ± 0,20 0,84 ± 0, ,56 ± 0,20 1,09 ± 0,20 0,91 ± 0, ,61 ± 0, ,64 ± 0,20 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 1,6 (g/l) 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0, C 37 0 C 40 0 C 42 0 C 0,2 0, Σχήμα 3.4 Επίδραση της θερμοκρασίας στην παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου. 72

89 Όπως φαίνεται και στα Σχήματα 3.3 και 3.4 η μη διόρθωση του ph στο 5,5 μείωσε το ρυθμό της ζύμωσης του θρεπτικού μέσου από το κεφίρ μειώνοντας παράλληλα και την παραγωγή του γαλακτικού οξέος. Παρόλα αυτά και σε αυτή την μελέτη η βέλτιστη θερμοκρασία παρέμεινε αυτή των 37 ο C αλλά ο χρόνος ζύμωσης αυξήθηκε κατά 2 h φτάνοντας τις 10 h. Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος μειώθηκε ελαφρώς φτάνοντας τα 1,23 g/l και η αζύμωτη λακτόζη ανήρθε στα 0,73 g/100ml, ελαφρώς αυξημένη. Παρόμοια μείωση του ρυθμού της ζύμωσης παρατηρήθηκε και στις υπόλοιπες θερμοκρασίες. Γεγονός που πιστοποιεί πως η διόρθωση του ph στην τιμή 5,5 με προσθήκη τρυγικού οξέος ή NaOH δεν παρεμποδίζει τη ζύμωση αλλά αντιθέτως τη βοηθάει καθώς η ζυμωτική ικανότητα του κεφίρ φαίνεται να ευνοείται όταν το ph διατηρείται σταθερό στο 5,5 (Golfinopoulos et al., 2012) Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης Στη συνέχεια και για τις ίδιες συνθήκες μετρήθηκε ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης του συνθετικού θρεπτικού μέσου από το κεφίρ (Πίνακας 5). Πίνακας 5. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης συνθετικού θρεπτικού μέσου επισημασμένης λακτόζης με 14 C από το κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και σταθερό ph 5,5. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης [cpm/(g βιομ.h)] Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) ,69 ± 0,3000* 676,54 ± 0, ,19 ± 0, ,32 ± 0, ,65 ± 0, ,31 ± 0, ,31 ± 0, ,32 ± 0, ,74 ± 0, ,69 ± 0, ,78 ± 0,3 91,32 ± 0, ,59 ± 0,200 20,47 ± 0,300 33,65 ± 0,300 29,34 ± 0, ,14 ± 0,300 19,69 ± 0,100 25,96 ± 0, ,21 ± 0,200 21,24 ± 0, ,45 ± 0, ,41 ± 0,300 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 73

90 (cpm/g*h) (h) 35 0 C 37 0 C 40 0 C 42 0 C Σχήμα 3.5 Επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης από κεφίρ σε σχέση με το χρόνο σε ph 5,5. Όπως φαίνεται και από το Σχήμα 3.5 κατά τη διάρκεια της ζύμωσης του συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης είναι υψηλότερος κατά τις πρώτες 2 h της ζύμωσης με τις υψηλότερες τιμές να παρουσιάζονται όταν η θερμοκρασία 37 ο C [676,54 cpm/(g βιομ.h)]. Αυτό πρακτικά σημαίνει πως το κεφίρ μεταβολίζει την λακτόζη κυρίως τις πρώτες ώρες της ζύμωσης. Επίσης, από το Σχήμα 6 αλλά και από τον Πίνακα 5, παρατηρούμε πως οι επόμενες υψηλότερες τιμές του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης είναι αυτές σε θερμοκρασίες 40 και 42 ο C [514,19 και 490,32 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα]. Τέλος, η χαμηλότερη τιμή 315,69 cpm/(g βιομ.h) παρατηρήθηκε στους 35 ο C. Από όλα τα παραπάνω διαφαίνεται πως ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης του συνθετικού θρεπτικού μέσου από το κεφίρ είναι στενά συνδεδεμένος με την κινητική της ζύμωσης, όπως επιβεβαιώνεται και από άλλες μελέτες (Soupioni et al., 2013; Golfinopoulos et al., 2012). 74

91 ln(dp/dt) Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στην ενέργεια ενεργοποίησης, Εa -1,6-1,8-2,0-2,2-2,4-2,6-2,8-3,0 3,17 3,18 3,19 3,20 3,21 3,22 3,23 3,24 3,25 1/T*10 3 (K) Σχήμα 3.6 Επίδραση της θερμοκρασίας στην ενέργεια ενεργοποίησης, Ε a κατά την ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε σταθερό ph 5,5. Με τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος Origin υπολογίζεται από την κλίση της παραπάνω ευθείας (Σχήμα 3.6) y=13, ,89057.x, η ενέργεια ενεργοποίησης, Ε a παίρνοντας την τιμή 40,66 kj/mol Μελέτη επίδρασης του ph Για την επίδραση του ph στην κινητική της ζύμωσης (Πίνακας 6) 250 ml συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με 6g κεφίρ αλλά και στην παραγωγή του γαλακτικού οξέος (Πίνακας 7) πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις σε τιμές ph 4,5 5,5 και 7 και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. 75

92 Πίνακας 6. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε τιμές διάφορες τιμές ph και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων (g/100ml) Χρόνος ph = 4,5 ph = 5,5 ph = 7 ζύμωσης (h) 0 4,86 ± 0,30* 4,96 ± 0,30 4,79 ± 0,30 2 3,54 ± 0,20 3,23 ± 0,30 4,14 ± 0,30 4 3,04 ± 0,20 2,45 ± 0,20 3,86 ± 0,30 6 2,51 ± 0,30 1,14 ± 0,30 3,14 ± 0,30 8 2,02 ± 0,30 0,69 ± 0,20 2,71 ± 0, ,54 ± 0,30 2,14 ± 0, ,07 ± 0,30 1,69 ± 0, * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 1,25 ± 0,20 1,15 ± 0,20 5,5 (g/100ml) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0, (h) ph=4,5 ph=5,5 ph=7 Σχήμα 3.7 Επίδραση του ph στην συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου σε θερμοκρασία 37 ο C. 76

93 Πίνακας 7. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ σε διάφορες τιμές ph και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος ph = 4,5 ph = 5,5 ph = 7 ζύμωσης (h) ,29 ± 0,30 0,57± 0,30-4 0,44 ± 0,30 1,03 ± 0,10-6 0,57 ± 0,40 1,35 ± 0,30 0,24 ± 0,20 8 0,63 ± 0,30 1,49 ± 0,20 0,34 ± 0, ,89 ± 0,30 0,46 ± 0, ,11 ± 0,30 0,49 ± 0, * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 0,53 ± 0,30 0,57 ± 0,30 1,8 1,6 1,4 ph=4,5 ph=5,5 ph=7 (g/l) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, (h) Σχήμα 3.8 Επίδραση του ph στην παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου, σε θερμοκρασία 37 ο C. Η βέλτιστη τιμή ph και από άποψη χρονικής διάρκειας της ζύμωσης αλλά και από άποψη των συγκεντρώσεων αζύμωτων σακχάρων (Σχήμα 3.7) και γαλακτικού οξέος (Σχήμα 3.8) φάνηκε να είναι το 5,5. Στην τιμή αυτή η 77

94 ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 8 h, με 0,69 g/100ml αζύμωτη λακτόζη και παραγωγή γαλακτικού οξέος 1,49 g/l. Λιγότερο ευνοϊκή φάνηκε να είναι η τιμή ph 4,5 με χρόνο ζύμωσης τις 11 h, αζύμωτα σάκχαρα 1,07 g/100ml και συγκέντρωση γαλακτικού οξέος 1,11 g/l. Όσον αφορά στην τιμή 7 η παραγωγή του γαλακτικού οξέος δεν ευνοήθηκε ιδιαίτερα και ήταν μόλις 0,57 g/l όπως και η ταχύτητα της ζύμωσης που έφτασε τις 13 h. Γενικότερα φαίνεται πως ευνοϊκότερο περιβάλλον για το κεφίρ είναι αυτό για τιμή ph 5,5 (Golfinopoulos et al., 2011) Μελέτη επίδρασης του ph στο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης Στις ίδιες συνθήκες μετρήθηκε και ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης 250 ml συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης από 6 g κεφίρ (Πίνακας 8, Πίνακας 9). Πίνακας 8. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C κατά τη ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης με κεφίρ για διάφορες τιμές ph και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης (cmp/g βιομ.h) Χρόνος ph = 4,5 ph = 5,5 ph = 7 ζύμωσης (h) ,35 ± 0,2000* 676,54 ± 0, ,34 ± 0, ,41 ± 0, ,31 ± 0, ,67 ± 0, ,34 ± 0, ,69 ± 0, ,39 ± 0, ,15 ± 0, ,47 ± 0,300 48,36 ± 0, ,34 ± 0, ,39 ± 0, ,58 ± 0,200 30,48 ± 0, ,34 ± 0, ,47 ± 0,100 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 78

95 (cpm/g*h) (h) ph=4,5 ph=5,5 ph=7 Σχήμα 3.9 Επίδραση του ph στον ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης συνθετικού θρεπτικού μέσου λακτόζης από κεφίρ σε σχέση με το χρόνο σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Υψηλότερος ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης [676,54 cpm/(g βιομ.h)] όπως φαίνεται και στο Σχήμα 3.9 πραγματοποιήθηκε σε τιμή ph 5,5 τις 2 πρώτες ώρες της ζύμωσης ενώ ακολούθησαν χαμηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης σε ph 4,5 και 7 στα 459,35 και 259,34 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα. Γεγονός που πιστοποιεί και εδώ την αλληλεξάρτηση του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης με την κινητική της ζύμωσης. 3.2 Ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ Για τη διερεύνηση της μείωσης του οργανικού φορτίου του τυρογάλακτος και της παραγωγή γαλακτικού οξέος με ζύμωση αυτού με κεφίρ, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις ώστε να προσδιοριστούν οι βέλτιστες φυσικοχημικές συνθήκες της ζύμωσης. 79

96 3.2.1 Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας Για τη μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στην κινητική της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ (Πίνακας 9), στην παραγωγή γαλακτικού οξέος (Πίνακας 10) καθώς και πιθανών άλλων οργανικών οξέων πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις σε 250 ml τυρογάλακτος με 6 g κεφίρ στους 35, 37, 40, 42 ο C σε σταθερό ph 5,5. Επίσης, οι ίδιες ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν χωρίς διόρθωση του ph κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, ώστε να διαπιστωθεί εάν επηρεάζεται η ζύμωση από τη διόρθωση αυτή. Πίνακας 9. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και σταθερό ph 5,5. Συγκέντρωση συνολικών σακχάρων (g/100ml) Χρόνος 35 o C 37 o C 40 o C 42 o C ζύμωσης (h) 0 4,99 ± 0,20* 4,93 ± 0,10 4,87 ± 0,30 4,95 ± 0,20 2 4,35 ± 0,30 3,49 ± 0,20 4,14 ± 0,30 4,27 ± 0,30 4 3,98 ± 0,20 2,94 ± 0,30 3,75 ± 0,30 3,86 ± 0,30 6 3,53 ± 0,20 2,24 ± 0,20 3,21 ± 0,20 3,37 ± 0,20 8 3,04 ± 0,30 1,86 ± 0,30 2,67 ± 0,30 2,91 ± 0,30 9 2,84 ± 0,30 1,51 ± 0,10 1,93 ± 0,20 2,58 ± 0, ,13 ± 0,30 1,64 ± 0,30 2,10 ± 0, ,94 ± 0,20 1,72 ± 0, ,68 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 80

97 (g/100ml) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1, C 37 0 C 40 0 C 42 0 C 1, (h) Σχήμα 3.10 Επίδραση της θερμοκρασίας στη συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου. Πίνακας 10. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και σταθερό ph 5,5. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 35 o C 37 o C 40 o C 42 o C ζύμωσης (h) ,43 ± 0,20 0,38 ± 0,30 0,37 ± 0,20 4-0,78 ± 0,30 0,69 ± 0,20 0,64 ± 0,20 6 0,31 ± 0,20 0,94 ± 0,30 0,80 ± 0,30 0,78 ± 0,30 8 0,38 ± 0,30 1,14 ± 0,10 0,91 ± 0,10 0,86 ± 0, ± 0,30 1,22 ± 0,10 0,98 ± 0,30 0,92 ± 0, ,44 ± 0,30 1,06 ± 0,20 0,97 ± 0, ,48 ± 0,20 1,00 ± 0, ,51 ± 0,20 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 81

98 (g/l) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0, C 37 0 C 40 0 C 42 0 C 0,2 0, (h) Σχήμα 3.11 Επίδραση της θερμοκρασίας στην παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου σε ph 5,5. Διατηρώντας τις πειραματικές συνθήκες των μελετών της προηγούμενης παραγράφου (3.1.1) ίδιες, επαναλήφθηκαν οι ζυμώσεις με τυρόγαλα αντί για συνθετικό θρεπτικό μέσο παρόμοιας σύστασης με του τυρογάλακτος. Τα αποτελέσματα ήταν περίπου ανάλογα αν και οι ζυμώσεις τυρογάλακτος διαρκούσαν περισσότερο κατά 1 h σε σχέση με αυτές στο συνθετικό θρεπτικό μέσο. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι, το τυρόγαλα έχει πολυπλοκότερη σύσταση, άρα και περισσότερες ουσίες που πιθανόν να παρεμποδίζουν τη ζύμωση, σε σχέση με ένα θρεπτικό μέσο που είναι πλήρως ελεγχόμενο εργαστηριακά και ακριβώς καθορισμένης σύστασης. Ταχύτερη ζύμωση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 37 ο C και στην περίπτωση της ζύμωσης με τυρόγαλα, όπως φαίνεται και στα σχήματα 3.10 και Στη θερμοκρασία αυτή η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 9 h, η συγκέντρωση της αζύμωτης λακτόζης βρέθηκε 1,51 g/100ml και αυτή του γαλακτικού οξέος ανέρχεται στα 1,22 g/l. Ακολουθούν οι θερμοκρασίες των 40 και 42 ο C με μεγαλύτερους χρόνους ζύμωσης (11, 12 h αντίστοιχα), μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αζύμωτων σακχάρων (1,64 και 1,72 g/100ml 82

99 αντίστοιχα) και μικρότερες συγκεντρώσεις γαλακτικού οξέος (1,06 και 1,00 g/l αντίστοιχα). Τέλος η λιγότερο ευνοϊκή για την συγκεκριμένη ζύμωση θερμοκρασία φάνηκε να είναι αυτή των 35 ο C με αρκετά μεγαλύτερο χρόνο ζύμωσης, στις 14 h, μικρότερη παραγωγή γαλακτικού οξέος (0,51 g/l) αλλά όχι σημαντικά διαφορετική από τις υπόλοιπες θερμοκρασίες, συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων 1,68 g/100ml. Συγκρίνοντας όλα τα παραπάνω αποτελέσματα διαπιστώνεται πως η βέλτιστη θερμοκρασία ζύμωσης του τυρογάλακτος με κεφίρ είναι 37 ο C. Ένας παράγοντας που εξηγεί το φαινόμενό αυτό είναι ότι πολλά γαλακτικά βακτήρια που αποτελούν το 83% - 90% της μικροβιακής σύνθεσης των κόκκων του κεφίρ είναι μεσόφιλα (Κεσσανόπουλος, 2011; Simova et al., 2002). Επιπλέον, οι ζύμες οι οποίες αποτελούν το 10% - 17% του συνόλου της σύνθεσης του κεφίρ επιδεικνύουν τη μέγιστη ικανότητα να προκαλούν ζύμωση της λακτόζης στους 30 ο C (Golfinopoulos et al., 2012). Οπότε είναι λογικό στους 35 ο C, μια θερμοκρασία στην οποία λειτουργούν και οι ζύμες και κάποια από τα γαλακτικά βακτήρια να εμφανίζεται η μικρότερη συγκέντρωση γαλακτικού οξέος συγκριτικά με τις άλλες θερμοκρασίες και πιθανώς μικρό ποσό αιθανόλης. Με την αύξηση της θερμοκρασίας στους 40 και 41 ο C, όπως αναφέρθηκε και στην Παράγραφο 3.1., δεν αυξήθηκε η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος ούτε και ο χρόνος της ζύμωσης μιας και το κεφίρ δεν ευνοείται ιδιαίτερα σε αυτές τις θερμοκρασίες. Όλα τα παραπάνω δείχνουν πως η εξάρτηση της ταχύτητας ζύμωσης από τη θερμοκρασία επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες (Golfinopoulos et al., 2011). 83

100 Πίνακας 11. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος που προσδιορίστηκε με ογκομέτρηση, κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και σταθερό ph 5,5. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) ,5 ± 0, ,2 ± 0, ,0 ± 0,1 14 2,8 ± 0,1 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD Στην περίπτωση του προσδιορισμού του γαλακτικού οξέος με ογκομέτρηση (Πίνακας 11) επαληθεύεται πως η υψηλότερη συγκέντρωσή του επετεύχθη κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος στους 37 ο C και έφθασε στα 3,5 g/l. Η τιμή αυτή παρουσιάζει μεγάλη απόκλιση από αυτή που λήφθηκε με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας με υψηλή πίεση (HPLC) που ήταν 1,22 g/l. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από την ύπαρξη και άλλων ασθενών οργανικών οξέων στο υγρό της ζύμωσης εκτός από το αναμενόμενο γαλακτικό οξύ. Πίνακας 12. Συγκέντρωση ασθενών οργανικών οξέων κατά τη μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε ph 5,5. Χρόνος ζύμωσης (h) Θερμοκρασία ( ο C) Ηλεκτρικό οξύ (g/l) Κιτρικό οξύ (g/l) Γαλακτικό οξύ (g/l) ,46±0,10* 3,49±0,30 0,57±0, ,42±0,10 4,12±0,10 1,22±0, ,37±0,10 4,55±0,20 2,09±0, ,42±0,10 5,44±0,30 2,30±0,10 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD Κατά τη διάρκεια των παραπάνω ζυμώσεων (Πίνακας 12) παράχθηκαν επίσης ηλεκτρικό και κιτρικό οξύ. Το ηλεκτρικό οξύ είναι ενδιάμεσο προϊόν στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος (κύκλος του κιτρικού οξέος) και ενυπάρχει στο τυρόγαλα σε συγκέντρωση ~3,5 g/l ενώ φαίνεται πως η συγκέντρωσή του δεν επηρεάζεται από τις παραπάνω θερμοκρασίες κατά τη 84

101 ζύμωση του τυρογάλακτος. Η συγκέντρωση του κιτρικού οξέος φαίνεται να αυξάνει με την αύξηση της θερμοκρασίας γεγονός που οφείλεται στο μεταβολισμό πιθανώς παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος μέσω του κύκλου του κιτρικού οξέος σε κιτρικό Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης Στη συνέχεια και για τις ίδιες συνθήκες (Πίνακας 13) μετρήθηκε ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος από το κεφίρ. Πίνακας 13. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε διάφορες θερμοκρασίες και σταθερό ph 5,5. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης [cmp/(g βιομ.h)] Χρόνος 35 ο C 37 ο C 40 ο C 42 ο C ζύμωσης (h) ,34 ± 0,2000* 664,58 ± 0, ,03 ± 0, ,54 ± 0, ,14 ± 0, ,84 ± 0, ,69 ± 0, ,25 ± 0, ,25 ± 0, ,84 ± 0, ,38 ± 0,200 93,37 ± 0, ,36 ± 0,300 30,75 ± 0,200 40,54 ± 0,300 49,74 ± 0, ,96 ± 0,200 22,98 ± 0,200 34,68 ± 0,300 35,85 ± 0, ,85 ± 0,300 23,65 ± 0,400 28,47 ± 0, ,67 ± 0,400 23,84 ± 0, ,65 ± 0,200 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 85

102 (cpm/g*h) (h) 35 0 C 37 0 C 40 0 C 42 0 C Σχήμα 3.12 Επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε σχέση με το χρόνο σε σταθερό ph 5,5. Από το Σχήμα 3.12 φαίνεται πως ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης είναι υψηλότερος κατά τις πρώτες 2 h της ζύμωσης με μέγιστη τιμή τις 664,58 cpm/(g βιομ.h) στους 37 ο C. Άρα τις 2 πρώτες h της ζύμωσης έχουμε και τη μέγιστη μεταβολική δραστηριότητα του κεφίρ. Οι επόμενες υψηλότερες τιμές του ρυθμού πρόσληψης της λακτόζης εμφανίζονται στους 40 και 42 ο C και ανέρχονται σε 500,03 και 468,54 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα. Η χαμηλότερη τιμή του ρυθμού πρόσληψης εμφανίζεται στους 35 ο C αντιστοιχώντας σε 295,34 cpm/(g βιομ.h). Από όλα τα παραπάνω διαφαίνεται πως και στην περίπτωση της ζύμωσης με τυρόγαλα, ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ είναι στενά συνδεδεμένος με την κινητική της ζύμωσης (Soupioni et al., 2013; Golfinopoulos et al., 2012). 86

103 ln(dp/dt) Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας στην ενέργεια ενεργοποίησης, Εa -1,8-2,0-2,2-2,4-2,6-2,8-3,0-3,2-3,4-3,6 3,17 3,18 3,19 3,20 3,21 3,22 3,23 3,24 3,25 1/T*10 3 (K) Σχήμα 3.13 Επίδραση της θερμοκρασίας στη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε σταθερό ph 5,5. Η εξίσωση y=25, ,57465*x, δίνεται από την ευθεία του Σχήματος 3.13 και από την κλίση αυτής υπολογίζεται η ενέργεια ενεργοποίησης, Ε a που ανέρχεται στα 71,28 kj/mol, αρκετά υψηλότερη από αυτή που υπολογίστηκε κατά τη ζύμωση του υγρού συνθετικού θρεπτικού μέσου με κεφίρ. Το γεγονός αυτό δικαιολογεί και τη μεγαλύτερη διάρκεια της ζύμωσης στην προκειμένη περίπτωση αφού από το νόμο Arrhenius, k = Ae -Ea/RT, αυξανομένης της E a ελαττώνεται η σταθερά της ταχύτητας αντίδρασης και η ίδια η ταχύτητα Μελέτη επίδρασης του ph Για τη μελέτη επίδρασης του ph στην κινητική (Πίνακας 14) της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ αλλά και στην παραγωγή του γαλακτικού (Πίνακας 15) και άλλων ασθενών οργανικών οξέων (Πίνακας 16) πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις για τιμές ph 4,5, 5,5 και 7 και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. 87

104 Πίνακας 14. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ σε διάφορες τιμές ph και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων (g/100ml) Χρόνος ph = 4,5 ph = 5,5 ph = 7 ζύμωσης (h) 0 4,97 ± 0,20* 4,93 ± 0,30 4,85 ± 0,20 2 4,05 ± 0,30 3,49 ± 0,20 4,26 ± 0,20 4 3,51 ± 0,30 2,24 ± 0,20 3,99 ± 0,20 6 2,96 ± 0,20 1,86 ± 0,30 3,74 ± 0,20 9 2,24 ± 0,30 1,51 ± 0,20 3,17 ± 0, ,89 ± 0,30 2,84 ± 0, ,63 ± 0,20 2,47 ± 0, * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 2,05 ± 0,30 1,91 ± 0,20 (g/100ml) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, (h) ph=4,5 ph=5,5 ph=7 Σχήμα 3.14 Επίδραση του ph στη συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. 88

105 Πίνακας 15. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ σε διάφορες τιμές ph και σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος ph 4,5 ph 5,5 ph 7 ζύμωσης (h) ,26 ± 0,20* 0,43 ± 0,20-4 0,65 ± 0,30 0,78 ± 0,30-6 0,75 ± 0,20 0,94 ± 0,30 0,21 ± 0,30 8 0,87 ± 0,20 1,14 ± 0,10 0,32 ± 0,30 9 0,92 ± 0,20 1,22 ± 0,10 0,44 ± 0, ,09 ± 0,20 0,47 ± 0, ,11 ± 0,20 0,49 ± 0,20 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 0,51 ± 0,30 1,6 1,4 ph=4,5 ph=5,5 ph=7 (g/l) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, (h) Σχήμα 3.15 Επίδραση του ph στην παραγωγή γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. 89

106 Η μελέτη επίδρασης του ph, κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, όπως φαίνεται και στα Σχήματα 3.14 και 3.15 έδειξε ότι και σε αυτή την περίπτωση, η βέλτιστη τιμή ph είναι το 5,5. Στην τιμή αυτή η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 9 h, με εναπομείνασα 1,51 g/100ml αζύμωτη λακτόζη και παραγωγή γαλακτικού οξέος 1,22 g/l. Λιγότερο ευνοϊκή φάνηκε να είναι η τιμή ph 4,5 με χρόνο ζύμωσης τις 12 h, αζύμωτα σάκχαρα στα 1,63 g/100ml και συγκέντρωση γαλακτικού οξέος στο 1,11 g/l. Όσον αφορά στο ph 7, η παραγωγή του γαλακτικού οξέος δεν ευνοήθηκε ιδιαίτερα και ήταν μόλις 0,51 g/l ενώ και η ταχύτητα της ζύμωσης ελαττώθηκε και έφτασε τις 15 h. Τελικά, ακόμη και στους 37 ο C όπου ευνοείται η γαλακτική ζύμωση φαίνεται πως καλύτερο είναι το ph 5,5, όπως αποδείχθηκε και σε άλλες μελέτες, στις οποίες η θερμοκρασία κυμαινόταν σε χαμηλότερα επίπεδα (Golfinopoulos et al., 2011). Πίνακας 16. Επίδραση του ph στη συγκέντρωση ασθενών οργανικών οξέων κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C. Χρόνος ζύμωσης (h) ph Ηλεκτρικό οξύ (g/l) Κιτρικό οξύ (g/l) Γαλακτικό οξύ (g/l) 12 4,5 3,56 ± 0,30* 3,27 ± 0,20 1,11 ± 0,20 9 5,5 3,42 ± 0,10 4,12 ± 0,10 1,22 ± 0, ,33 ± 0,10 1,88 ± 0,00 0,51 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD Η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος παραμένει σχεδόν σταθερή κατά τη διάρκεια της ζύμωσης (~3,5 g/l) για τα ph 4,5 και 5,5. Σε ph 7 οι συγκεντρώσεις και των τριών οργανικών οξέων μειώνονται αισθητά. Αυτό συμβαίνει διότι σε ph 7 αφενός μεν δεν ευνοείται η μεταβολική δραστηριότητα του κεφίρ και αφετέρου η προσθήκη διαλύματος NaOH 6 M για τη διόρθωση του ph, πιθανώς προκάλεσε μερική εξουδετέρωση των ασθενών οργανικών οξέων. 90

107 3.2.5 Επίδραση του ph στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης Στις ίδιες συνθήκες μετρήθηκε και ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης (Πίνακας 17) του τυρογάλακτος από το κεφίρ. Πίνακας 17. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C από το κεφίρ για διάφορες τιμές ph σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης [cmp/(g βιομ.h)] Χρόνος ph 4,5 ph 5,5 ph 7 ζύμωσης (h) ,58 ± 0,3000* 664,58 ± 0, ,14 ± 0, ,69 ± 0, ,84 ± 0, ,66 ± 0, ,57 ± 0, ,84 ± 0, ,47 ± 0, ,25 ± 0, ,75 ± 0,200 56,14 ± 0, ,24± 0,300 22,98 ± 0,300 34,43 ± 0, ,24 ± 0,200 27,47 ± 0, ,47 ± 0,300 22,22 ± 0, ,24 ± 0,200 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 91

108 (cpm/g*h) (h) ph=4,5 ph=5,5 ph=7 Σχήμα 3.16 Επίδραση του ph στο ρυθμό πρόσληψης λακτόζης, επισημασμένης με 14 C από το κεφίρ σε σχέση με το χρόνο σε σταθερή θερμοκρασία 37 ο C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος. Όπως φαίνεται και από το Σχήμα 3.16, σε όλες τις περιπτώσεις οι υψηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης της λακτόζης πιστοποιήθηκαν τις πρώτες 2 h της ζύμωσης, όπου και υπήρξε υψηλή μεταβολική δραστηριότητα. Ο υψηλότερος ρυθμός πρόσληψης [664, 58cpm/(g βιομ.h)] αντιστοιχεί σε ph 5,5 ενώ ακολούθησαν χαμηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης σε ph 4,5 και 7 [459,35 και 676,54 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα]. Οι τιμές των ρυθμών πρόσληψης της λακτόζης επαληθεύουν τα συμπεράσματα που εξήχθησαν κατά τη μελέτη επίδρασης του ph στην ταχύτητα ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ, επιβεβαιώνοντας πως η βέλτιστη τιμή ph και θερμοκρασίας για αυτήν είναι 5,5 και 37 ο C, αντίστοιχα Μελέτη επίδρασης της προσθήκης στερεών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Βάσει της βιβλιογραφίας η ακινητοποίηση κυττάρων κεφίρ σε φλοιούς βύνης (BSG), στερεά απόβλητα ξυλουργείου (πριονίδι) κ. ά. αυξάνει την ζυμωτική τους ικανότητα. Έτσι, περαιτέρω μελέτη διεξήχθη ώστε να ελεγχθεί αν ο ρυθμός της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ, άρα και η παραγωγή γαλακτικού οξέος μπορούν να αυξηθούν με απλή προσθήκη των υλικών 92

109 αυτών στο τυρόγαλα χωρίς να προηγηθεί η χρονοβόρα και πολύπλοκη διαδικασία της ακινητοποίησης. Για το σκοπό αυτό, προστέθηκαν στο τυρόγαλα διάφορες ποσότητες (120, 140 και 160 g) φλοιών βύνης, λιγνοκυτταρινούχου υλικού (πριονίδι) και μεσοκαρπίου πορτοκαλιού, ως πιθανοί προωθητές της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ Μελέτη επίδρασης της προσθήκης ποσοτήτων φλοιών βύνης (BSG) Παρακάτω παρουσιάζονται (Πίνακας 18, Σχήμα 3.17) τα αποτελέσματα για την κινητική της ζύμωσης τυρογάλακτος παρουσία BSG. Πίνακας 18. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ και προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων BSG σε ph 5,5 και 37 ο C. Συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων (g/100ml) Χρόνος 120 (g BSG) 140 (g BSG) 160 (g BSG) ζύμωσης (h) 0 4,42 ± 0,30* 5,10 ± 0,30 5,25 ± 0,20 2 2,94 ± 0,20 3,69 ± 0,40 4,26 ± 0,20 4 1,87 ± 0,20 2,66 ± 0,30 3,69 ± 0,30 6 1,19± 0,10 1,83 ± 0,30 2,84 ± 0,30 9 1,32 ± 0,20 2,26 ± 0, ,49 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD (g/100ml) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.17 Επίδραση της ποσότητας φλοιών βύνης (BSG) στη συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε ph 5,5 και 37 ο C. 93

110 Η συγκέντρωση γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζεται στον Πίνακα 19 και στο Σχήμα Πίνακας 19. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ και προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων BSG σε ph 5,5 και 37 ο C. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 120 (g BSG) 140 (g BSG) 160 (g BSG) ζύμωσης (h) ,36 ± 0,30* 1,01 ± 0,30 0,87 ± 0,30 4 2,14 ± 0,20 1,97 ± 0,20 1,24 ± 0,20 6 2,71 ± 0,10 2,18 ± 0,30 1,69 ± 0,20 9 2,54 ± 0,20 2,19 ± 0, ,42 ± 0,10 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD (g/l) 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0, (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.18 Επίδραση της προσθήκης διαφόρων ποσοτήτων φλοιών βύνης (BSG) στην παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου, σε ph 5,5 και 37 ο C. 94

111 Η προσθήκη των BSG φαίνεται να είχε θετική επίδραση στην κινητική της ζύμωσης του τυρογάλακτος με κεφίρ, διότι παρατηρήθηκε μείωση του χρόνου της ζύμωσης από τις 9 στις 6 h όταν 120 g BSG προστέθηκαν στο τυρόγαλα. Επίσης, παρουσία των BSG η παραγωγή του γαλακτικού οξέος υπερδιπλασιάστηκε φτάνοντας τα 2,71 από 1,22 g/l, ενώ η συγκέντρωση των αζύμωτων σακχάρων ελαττώθηκε στα 1,19 από 1,51 g/100ml. Ακολούθησε η προσθήκη 140 g BSG όπου ο χρόνος ζύμωσης έφθασε στις 9 h και η παραγωγή γαλακτικού οξέος στα 2,54 g/l ενώ με την προσθήκη 160 g BSG η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 10 h και το γαλακτικό οξύ που παράχθηκε ήταν 2,42 g/l. Κατά την προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων BSG κατά τη ζύμωση του τυρογάλακτος με κεφίρ φαίνεται πως ευνοήθηκε και η παραγωγή του κιτρικού οξέος (Πίνακας 20) φθάνοντας σε συγκέντρωση τα 6,81 g/l για την προσθήκη 160 g. Η υψηλή αυτή συγκέντρωση φαίνεται πως προήλθε από τη μετατροπή του ηλεκτρικού οξέος σε κιτρικό, γι αυτό έχει μειωθεί συγκριτικά και η συγκέντρωσή του από τα 3,5 g/l στα 2,72 g/l στην περίπτωση αυτή. Πίνακας 20. Συγκέντρωση ασθενών οργανικών οξέων κατά την προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων BSG σε ph 5,5 και 37 ο C. Χρόνος ζύμωσης (h) BSG (g) Ηλεκτρικό οξύ (g/l) Κιτρικό οξύ (g/l) Γαλακτικό οξύ (g/l) ,63 ± 0,00* 5,69 ± 0,20 2,71 ± 0, ,48 ± 0,30 6,15 ± 0,10 2,54 ± 0, ,72 ± 0,40 6,81 ± 0,00 2,42 ± 0,10 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD Τέλος, μετρήθηκε και ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος από το κεφίρ κατά τη διάρκεια των ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν παρουσία διαφόρων ποσοτήτων BSG (Πίνακας 21, Σχήμα 3.19) 95

112 Πίνακας 21. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C από κεφίρ κατά τη διάρκεια ζύμωσης τυρογάλακτος με προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων BSG σε ph 5,5 και 37 ο C. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης [cmp/(g βιομ.h)] Χρόνος 120 (g BSG) 140 (g BSG) 160 (g BSG) ζύμωσης (h) ,68 ± 0,2000* 647,35 ± 0, ,18 ± 0, ,53 ± 0, ,38 ± 0, ,54 ± 0, ,35 ± 0, ,21 ± 0, ,37 ± 0, ,45 ± 0, ,53 ± 0, ,24 ± 0,300 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD (cpm/g*h) (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.19 Επίδραση της προσθήκης φλοιών βύνης (BSG) στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης επισημασμένης με 14 C από κεφίρ, σε σχέση με το χρόνο σε ph 5,5 και 37 ο C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος. Σε όλες τις περιπτώσεις οι υψηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης της λακτόζης παρατηρήθηκαν τις πρώτες 2 h της ζύμωσης, όπου και υπήρξε υψηλή μεταβολική δραστηριότητα. Ο υψηλότερος ρυθμός πρόσληψης [702,68 cpm/(g βιομ.h)] αντιστοιχεί στην προσθήκη 120 g BSG, ενώ ακολούθησαν χαμηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης με την προσθήκη 140 ή 160 g BSG [647,35 96

113 και 624,18 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα]. Ειδικότερα και σε αυτή τη μελέτη φαίνεται πως ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ συνδέεται άμεσα με την κινητική της ζύμωσης Μελέτη επίδρασης της προσθήκης ποσοτήτων λιγνοκυτταρινούχου υλικού, πριονίδι (LCM) Στη συνέχεια παρουσιάζονται (Πίνακας 22, Σχήμα 3.20) τα αποτελέσματα για την κινητική της ζύμωσης 250 ml τυρογάλακτος με 6 g κεφίρ παρουσία διαφόρων ποσοτήτων λιγνοκυτταρινούχου υλικού (πριονίδι). Πίνακας 22. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ και προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων πριονιδιού (LCM) σε σταθερή τιμή ph 5,5 και θερμοκρασία 37 ο C. Συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων (g/100ml) Χρόνος 120 (g LCM) 140 (g LCM) 160 (g LCM) ζύμωσης (h) 0 5,06 ± 0,20* 4,89 ± 0,30 5,24 ± 0,30 2 3,94 ± 0,30 4,09 ± 0,20 4,41 ± 0,30 4 3,01 ± 0,30 3,57 ± 0,20 3,85 ± 0,20 6 2,17 ± 0,10 2,43 ± 0,20 2,79 ± 0,20 8 1,43 ± 0,10 1,82 ± 0,20 2,12 ± 0, ,53 ± 0,10 1,84 ± 0, ,68 ± 0,10 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 97

114 (g/100ml) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.20 Επίδραση της ποσότητας στερεών αποβλήτων ξυλουργείου στη συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε ph 5,5 και 37 ο C. Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζεται στον Πίνακα 23 και στο Σχήμα Πίνακας 23. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ και προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων πριονιδιού (LCM) σε ph 5,5 και 37 ο C. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 120 (g LCM) 140 (g LCM) 160 (g LCM) ζύμωσης (h) ,02 ± 0,30* 0,91 ± 0,20 0,34 ± 0,10 4 1,59 ± 0,30 1,34 ± 0,30 0,68 ± 0,30 6 2,06 ± 0,20 1,69 ± 0,20 0,71 ± 0,30 8 2,34 ± 0,10 1,87 ± 0,30 0,89 ± 0, ,04 ± 0,10 0,97 ± 0, ,20 ± 0,10 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 98

115 (g/l) 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.22 Επίδραση της προσθήκης διαφόρων ποσοτήτων πριονιδιού στην παραγωγή γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, σε ph 5,5 και 37 ο C. Η προσθήκη 120 g πριονιδιού επέδρασε θετικά στην κινητική της ζύμωσης του τυρογάλακτος με κεφίρ αφού παρατηρείται μείωση του χρόνου της ζύμωσης από τις 9 στις 8 h. Επίσης, παρουσία του πριονιδιού αυξήθηκε η παραγωγή γαλακτικού οξέος φτάνοντας στα 2,34 από 1,22 g/l, ενώ η συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων ελαττώθηκε στα 1,43 από 1,51 g/100ml. Ακολούθησε η προσθήκη 140 g πριονιδιού όπου ο χρόνος ζύμωσης έφτασε στις 10 h και η παραγωγή γαλακτικού οξέος στα 2,04 g/l ενώ με την προσθήκη 160 g πριονιδιού η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 12 h και το γαλακτικό οξύ που παράχθηκε ήταν 1,20 g/l. Η προσθήκη του πριονιδιού παρόλα αυτά, φαίνεται να παρουσιάζει μικρότερη προωθητική ικανότητα από αυτή των BSG κατά τη ζύμωση του τυρογάλακτος. Κατά την προσθήκη 160 g πριονιδιού φαίνεται πως ευνοήθηκε η παραγωγή του κιτρικού οξέος (Πίνακας 24) φτάνοντας στα 6,93 g/l. Η υψηλή 99

116 αυτή συγκέντρωση οφείλεται και σε αυτή την περίπτωση στην μετατροπή του ηλεκτρικού οξέος σε κιτρικό μέσω του κύκλου του κιτρικού οξέος. Πίνακας 24. Συγκέντρωση ασθενών οργανικών οξέων κατά την προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων πριονιδιού (LCM) σε ph 5,5 και 37 ο C. Χρόνος ζύμωσης (h) LCM (g) Ηλεκτρικό οξύ (g/l) Κιτρικό οξύ (g/l) Γαλακτικό οξύ (g/l) ,58 ± 0,10* 5,75 ± 0,20 2,34 ± 0, ,50 ± 0,20 6,84 ± 0,20 2,04 ± 0, ,15 ± 0,40 6,93 ± 0,30 1,20 ± 0,10 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD Τέλος μετρήθηκε και ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος από το κεφίρ κατά τη διάρκεια των ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν παρουσία διαφόρων ποσοτήτων πριονιδιού (Πίνακας 25, Σχήμα 3.23) Πίνακας 25. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C από κεφίρ κατά τη διάρκεια ζύμωσης τυρογάλακτος με προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων πριονιδιού (LCM) σε ph 5,5 και 37 ο C. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης [cmp/(g βιομ.h)] Χρόνος 120 (g LCM) 140 (g LCM) 160 (g LCM) ζύμωσης (h) ,32 ± 0,3000* 510,34 ± 0, ,98 ± 0, ,21 ± 0, ,17 ± 0, ,54 ± 0, ,36 ± 0, ,38 ± ,98 ± 0, ,32 ± 0,200 96,34 ± 0, ,47 ± 0, ,32 ± 0, ,14 ± 0, ,27 ± 0,200 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 100

117 (cpm/g*h) (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.22 Επίδραση της προσθήκης πριονιδιού στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης επισημασμένης με 14 C από κεφίρ, σε σχέση με το χρόνο σε ph 5,5 και 37 ο C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος. Σε όλες τις περιπτώσεις οι υψηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης της λακτόζης παρατηρήθηκαν τις πρώτες 2 h της ζύμωσης, όπου προφανώς υπήρξε και πολύ υψηλή μεταβολική δραστηριότητα. Ο υψηλότερος ρυθμός πρόσληψης [594,32 cpm/(g βιομ.h)] αντιστοιχεί στην προσθήκη 120 g πριονιδιού στο τυρόγαλα, ενώ ακολούθησαν χαμηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης με την προσθήκη 140 ή 160 g πριονιδιού [510,34 και 451,98 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα] (Πίνακας 25, Σχήμα 3.22). Οι τιμές πρόσληψης της λακτόζης για την περίπτωση της προσθήκης πριονιδιού είναι χαμηλότερες από αυτές της προσθήκης BSG γεγονός που πιστοποιεί πως η προωθητική ικανότητα των αποβλήτων ξυλουργείου είναι μικρότερη σε σχέση με αυτή των BSG. 101

118 Μελέτη επίδρασης της προσθήκης ποσοτήτων μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) Παρακάτω παρουσιάζονται (Πίνακας 26, Σχήμα 3,23) τα αποτελέσματα για την κινητική της ζύμωσης τυρογάλακτος παρουσία μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP). Πίνακας 26. Συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ και προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) σε ph 5,5 και 37 ο C. Συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων (g/100ml) Χρόνος 120 (g OP) 140 (g OP) 160 (g OP) ζύμωσης (h) 0 4,76 ± 0,20* 4,96 ± 0,20 4,86 ± 0,30 2 3,06 ± 0,30 4,05 ± 0,30 4,29 ± 0,30 4 2,14 ± 0,20 2,81 ± 0,20 3,75 ± 0,20 7 1,24 ± 0,20 2,07 ± 0,30 3,06 ± 0,30 9 1,31 ± 0,30 2,23 ± 0, ,49 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD 5,5 (g/100ml) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1, (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.23 Επίδραση της ποσότητας μεσοκαρπίου πορτοκαλιού στην συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων συναρτήσει του χρόνου κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε ph 5,5 και 37 ο C. 102

119 Η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου παρουσιάζεται στον Πίνακα 27 και στο Σχήμα Πίνακας 27. Συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος συναρτήσει του χρόνου της ζύμωσης τυρογάλακτος με κεφίρ και προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) σε ph 5,5 και 37 ο C. Συγκέντρωση γαλακτικού οξέος (g/l) Χρόνος 120 (g OP) 140 (g OP) 160 (g OP) ζύμωσης (h) ,28 ± 0,10* 0,97 ± 0,20 0,67 ± 0,30 4 2,09 ± 0,30 1,49 ± 0,30 1,14 ± 0,10 7 2,65 ± 0,10 2,01 ± 0,20 1,48 ± 0,30 9 2,39 ± 0,20 1,97 ± 0, ,18 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD (g/l) 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0, (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.24 Επίδραση της ποσότητας μεσοκαρπίου πορτοκαλιού στην παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ συναρτήσει του χρόνου, ph 5,5 και 37 ο C. Η προσθήκη 120 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού επέδρασε θετικά στην κινητική της ζύμωσης του τυρογάλακτος με κεφίρ αφού παρατηρείται μείωση 103

120 του χρόνου της ζύμωσης από τις 9 στις 7 h. Επίσης, παρουσία του μεσοκαρπίου πορτοκαλιού η παραγωγή γαλακτικού οξέος υπερδιπλασιάστηκε φτάνοντας στα 2,65 από 1,22 g/l, ενώ η συγκέντρωση αζύμωτων σακχάρων ελαττώθηκε στα 1,24 από 1,51 g/100ml. Ακολούθησε η προσθήκη 140 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού, όπου ο χρόνος ζύμωσης έφτασε στις 9 h και παραγωγή γαλακτικού οξέος στα 2,04 g/l, ενώ με την προσθήκη 160 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού η ζύμωση ολοκληρώθηκε σε 11 h και το γαλακτικό οξύ που παράχθηκε ήταν 2,18 g/l. Η προσθήκη μεσοκαρπίου πορτοκαλιού συγκρινόμενη με αυτήν των BSG και του πριονιδιού, φαίνεται να έχει ελαφρώς μικρότερη προωθητική ικανότητα σε σχέση με αυτή των BSG, αλλά αρκετά μεγαλύτερη από αυτή του πριονιδιού. Κατά την προσθήκη 160 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού στη ζύμωση του τυρογάλακτος με κεφίρ φαίνεται πως ευνοήθηκε η παραγωγή του κιτρικού οξέος (Πίνακας 28) φτάνοντας σε συγκέντρωση 6,67 g/l. Όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις προσθήκης, η υψηλή συγκέντρωση του κιτρικού οξέος φαίνεται να προήλθε από τη μετατροπή του ηλεκτρικού οξέος σε κιτρικό. Ειδικότερα, στην περίπτωση προσθήκης 160 g που μειώνεται η συγκέντρωσή του ηλεκτρικού οξέος από τα 3,5 g/l στα 2,72 g/l αυξάνεται αυτή του κιτρικού οξέος. Πίνακας 28. Συγκέντρωση ασθενών οργανικών οξέων κατά την προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων μεσοκαρπίου πορτοκαλιού σε σταθερή τιμή ph 5,5 και θερμοκρασία 37 ο C Χρόνος ζύμωσης (h) Μεσοκάρπιο πορτοκαλιού (g) Ηλεκτρικό οξύ (g/l) Κιτρικό οξύ (g/l) Γαλακτικό οξύ (g/l) ± 0,20* 5,57 ± 0,30 2,65 ± 0, ,64 ± 0,20 5,87 ± 0,20 2,39 ± 0, ,69 ± 0,20 6,67 ± 0,20 2,18 ± 0,30 * Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD Τέλος μετρήθηκε και ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης του τυρογάλακτος από το κεφίρ κατά τη διάρκεια των ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν παρουσία διαφόρων ποσοτήτων μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (Πίνακας 29, Σχήμα 3.25). 104

121 Πίνακας 29. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14 C από κεφίρ κατά τη διάρκεια ζύμωσης τυρογάλακτος με προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) σε ph 5,5 και 37 ο C. Ρυθμός πρόσληψης λακτόζης [cmp/(g βιομ.h)] Χρόνος 120 (g OP) 140 (g OP) 160 (g OP) ζύμωσης (h) ,38 ± 0,3000* 634,14 ± 0, ,37 ± 0, ,36 ± 0, ,35 ± 0, ,18 ± 0, ,17 ± 0, ,17 ± 0, ,39 ± 0, ,17 ± 0,300 99,47 ± 0, ,14 ± 0,200 *Μέση τιμή (N=3) συγκεντρώσεων SD (cpm/g*h) (h) 120g 140g 160g Σχήμα 3.25 Επίδραση της προσθήκης μεσοκαρπίου πορτοκαλιού στο ρυθμό πρόσληψης της λακτόζης επισημασμένης με 14 C από κεφίρ σε σχέση με το χρόνο σε ph 5,5 και 37 ο C κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος. Όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, οι υψηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης της λακτόζης παρατηρήθηκαν τις πρώτες 2 h της ζύμωσης, όπου και υπήρξε πολύ υψηλή μεταβολική δραστηριότητα. Ο υψηλότερος ρυθμός 105

122 πρόσληψης [700,38 cpm/(g βιομ.h)] αντιστοιχεί στην προσθήκη 120 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού, ενώ ακολούθησαν χαμηλότεροι ρυθμοί πρόσληψης με την προσθήκη 140 ή 160 g μεσοκαρπίου [634,14 και 600,37 cpm/(g βιομ.h) αντίστοιχα]. Ο ρυθμός πρόσληψης της λακτόζης από το κεφίρ, άμεσα συνδεδεμένος με την κινητική της ζύμωσης, επιβεβαιώνει και σε αυτή την περίπτωση προσθήκης, την παρόμοια προωθητική ικανότητα του μεσοκαρπίου πορτοκαλιού με τα BSG, παρουσιάζοντας παρόμοιες τιμές πρόσληψης της λακτόζης κατά τη διάρκεια της ζύμωσης του τυρογάλακτος. Γενικότερα παρατηρήθηκε ότι όταν τα τρία υλικά (BSG, LCM, OP) προστέθηκαν στο τυρόγαλα ξεχωριστά το καθένα, η παραγωγή του γαλακτικού οξέος αυξήθηκε σημαντικά και η κινητική της ζύμωσης του τυρογάλακτος με κεφίρ βελτιώθηκε αισθητά. Γεγονός που επαληθεύει την αρχική υπόθεση, δηλαδή την πιθανή προωθητική ικανότητα αυτών στη ζύμωση του τυρογάλακτος χωρίς προηγούμενη ακινητοποίηση του κεφίρ σε αυτά. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από τους δεσμούς υδρογόνου που δημιουργούνται μεταξύ της λακτόζης του τυρογάλακτος και των υδροξυλομάδων στην επιφάνεια των BSG, ευνοώντας την ταχύτερη βιομετατροπή της λακτόζης από το κεφίρ, το οποίο ταυτόχρονα εγκλωβίζεται στους πόρους της επιφάνειας των BSG και ακινητοποιείται (Prasanna et al. 2012; Koutinas et al. 2012). Επίσης, η μεγαλύτερη συγκέντρωση των ακινητοποιημένων κυττάρων κεφίρ στην περιοχή που γίνεται η ζύμωση καθώς και η μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης δικαιολογούν την προωθητική ικανότητα πορωδών, λιγνοκυτταρινούχων υποστρωμάτων σαν τα BSG (Brady et al., 1994). Τέλος, η προσθήκη μεγαλύτερης ποσότητας στερεών αποβλήτων (140 και 160 g) στο τυρόγαλα φάνηκε μάλλον να μειώνει την προωθητική τους ικανότητα, πιθανόν λόγω αυξημένης ωσμωτικής πίεσης στο υγρό της ζύμωσης, που επηρεάζει τη ζυμωτική ικανότητα των μικροοργανισμών του κεφίρ. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 30 κατά την προσθήκη 120 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού στη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ παρήχθησαν 25 ενώσεις, οι οποίες προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της αέριας χρωματογραφίας με φασματογράφο μάζας (GC-MS). 106

123 Πίνακας 30. Επίδραση της προσθήκης 120 g μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) στις συγκεντρώσεις πτητικών παραπροϊόντων κατά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ σε ph 5,5 και 37 ο C. Ένωση Συγκέντρωση (mg/l) Άρωμα Εστέρες Οξικός αιθυλεστέρας 23,4 Καραμέλα Βουτανοϊκός αιθυλεστέρας 2,5 Μπανάνα, φράουλα Εξανοϊκός αιθυλεστέρας 2,7 Τσίχλα, καραμέλα Οκτανοϊκός αιθυλεστέρας 30,8 Φρουτώδες, μέντα Εννεανοϊκός αιθυλεστέρας 1,1 Φρουτώδες, τριαντάφυλλο Δεκανοϊκός αιθυλεστέρας 2,1 Σταφύλι Βενζοϊκός αιθυλεστέρας 3,9 Χαμομήλι, σέλινο 9-αιθυλ-Δεκανοϊκός εστέρας 2,0 - Οξικός-2-φαινυλαιθυλεστέρας 190,7 Φρουτώδες Πεντανοϊκός αιθυλεστέρας 7,0 Πορτοκάλι, γρασίδι Σύνολο 266,2 Αλκοόλες Αιθανόλη 80,13-4-Οκτανόλη 0,7-1-Δεκανόλη 0,6 Λίπος 1-Δεκατριόλη 0,8 Μπαγιάτεμα Φαινυλαιθυλαλκοόλη 0,9 Φρουτώδες Σύνολο 83,13 Κετόνες Επτ-1-εν-3-όνη 14,3 Γεράνι 5-Εννεανόνη 97,3 - Σύνολο 111,6 Καρβοξυλικά οξέα Δεκανοϊκό οξύ 7,3 Πικάντικο, τυρί Δεκατετρανοϊκό οξύ 40,8 Ελαιώδες, κέρινο Σύνολο 48,1 Τερπένια β-πιπένιο 6,2 Γρασίδι, πεύκο 1,3,5-τριμεθυλ-βενζένιο 40,3 Βότανα Λεμονένιο 200,1 Εσπεριδοειδή, Λιναλοόλη 6,4 Μαϊντανός, λεμόνι Limonen-6-ol, pivalate 2,1 Εσπεριδοειδή β-τερπινεόλη 1,7 Πικάντικο, ξυλώδες Σύνολο 256,8 Διάφορες ενώσεις Διυδρο-κιτρονελόλη 8,3 Τριαντάφυλλο Βαλεντσένιο 40,9 Πορτοκάλι, πιπέρι Σύνολο 49,2 107

124 Πολλές εξ αυτών (10) είναι εστέρες με κύριο τον οξικό-2- φαινυλαιθυλεστέρα σε συγκέντρωση 190,7 mg/l, ο οποίος προέρχεται από βραδεία αντίδραση μεταξύ του οξικού οξέος που παράγεται από τα οξικά βακτήρια του κεφίρ και της φαινυλαιθυλαλκοόλης. Επίσης, παρήχθησαν 5 αλκοόλες με κύρια την αιθανόλη σε συγκέντρωση 80,13 mg/l η οποία προήλθε από αλκοολική ζύμωση που πραγματοποιήθηκε από τις ζύμες που περιέχονται στο κεφίρ. Από τις κετόνες που παρήχθησαν υψηλότερη συγκέντρωση έχει η 5-εννεανόνη φτάνοντας τα 97,3 mg/l, η οποία προέρχεται από την απελευθέρωση διαφόρων λιπαρών οξέων μέσω της λιπόλυσης τα οποία μέσω οξειδωτικής αποκαρβοξυλίωσης μετατρέπονται σε μεθυλ-κετόνες (Marth & Steele, 2001; Chen & Zhang, 2010). Τέλος, αρκετές ήταν και οι τερπενοειδείς ενώσεις με κυριότερο το λεμονένιο σε συγκέντρωση 200,1 mg/l. 3.3 Λήψεις με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης (SEM) Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης λήφθηκαν φωτογραφίες πριν και μετά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων που χρησιμοποιήθηκαν ως πιθανοί προωθητές ώστε να διαπιστωθεί εάν το κεφίρ ακινητοποιείται πάνω σε αυτά κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Στις Εικόνες 3.1, 3.3 και 3.3 φαίνονται σε μεγέθυνηση οι επιφάνειες των BSG, LCM και OP πριν τη ζύμωση αντίστοιχα. Εικόνα 3.1 Φωτογραφία φλοιών βύνης (BSG) πριν την προσθήκη σε τυρόγαλα, με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, (SEM), μεγέθυνση Χ

125 Εικόνα 3.2 Φωτογραφία πριονιδιού (LCM) πριν την προσθήκη σε τυρόγαλα με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, (SEM), μεγέθυνση Χ700 Εικόνα 3.3 Φωτογραφία μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) πριν την προσθήκη σε τυρόγαλα με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, (SEM), μεγέθυνση Χ700 Παρατηρείται ότι και τα τρία υλικά παρουσιάζουν έντονη πορώδη επιφάνεια, όπου δυνητικά τα κύτταρα του κεφίρ μπορούν να εγκλωβιστούν. Οι πόροι που περιέχουν τα υποστρώματα, τα καθιστούν κατάλληλα για να γίνει ακινητοποίηση του κεφίρ, μέσω της οποίας όπως εξηγήθηκε προηγουμένως, προωθείται η ζύμωση του τυρογάλακτος με κεφίρ. Στις Εικόνες 3.4, 3.5 και 3.6 φαίνονται οι επιφάνειες των BSG, LCM και OP αντίστοιχα, αφού έχει ολοκληρωθεί η ζύμωση με κεφίρ σε τυρόγαλα, όπου αυτά είχαν προστεθεί ξεχωριστά το καθένα. Είναι εμφανές ότι οι πόροι και των τριών υλικών έχουν σχεδόν καλυφθεί τελείως από κύτταρα κεφίρ, που επιβεβαιώνει την ακινητοποίησή τους κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. 109

126 Εικόνα 3.4 Φωτογραφία φλοιών βύνης (BSG) μετά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, (SEM), μεγέθυνση Χ700 Εικόνα 3.5 Φωτογραφία πριονιδιού (LCM) μετά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, (SEM), μεγέθυνση Χ700 Εικόνα 3.6 Φωτογραφία μεσοκαρπίου πορτοκαλιού (OP) μετά τη ζύμωση τυρογάλακτος με κεφίρ, με Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης, (SEM), μεγέθυνση Χ