από φυτικούς οργανισμούς! Εργαστήριο Φυσικών Επιστημών 8 ου ΓΕΛ Πάτρας, Δεκέμβριος 2016 Καρβουντζή Ηλιάνα & Κούκη Μαριάνθη

Transcript

1 Απομόνωση DNA από φυτικούς οργανισμούς! Εργαστήριο Φυσικών Επιστημών 8 ου ΓΕΛ Πάτρας, Δεκέμβριος 2016 Καρβουντζή Ηλιάνα & Κούκη Μαριάνθη

2 Υλικά: Μικροσκόπιο και έτοιμο παρασκεύασμα 1. ανθρώπινων μεταφασικών χρωμοσωμάτων 2. μίτωση σε κύτταρα ακρορίζιου Κεδρέλαιο. Σύστημα προβολής διαφανειών. Φύλλα εργασίας. ένα κομμάτι από φυτικό οργανισμό περίπου 4g (νωπό βάρος). 15 ml διάλυμα εκχύλισης DNA. Ογκομετρικός σωλήνας των 10 ή 25 ml. (Για την παρασκευή 500 ml διαλύματος εκχύλισης DNA, που είναι αρκετό για 50 εκχυλίσεις, χρειαζόμαστε: 25 ml απορρυπαντικού πιάτων, 8 gr μαγειρικό αλάτι και 450 ml νερό 1 ml διαλύματος πεψίνης) 2

3 Υλικά: Ένας δοκιμαστικός σωλήνας σε υποστήριγμα. 1 μεγάλο γυάλινο χωνί + 1 διηθητικό χαρτί κομμένο σε τετράγωνα (5X5 cm περίπου) που θα λειτουργήσει ως φίλτρο. 1 γουδάκι πορσελάνης. Φιάλη με το διάλυμα εκχύλισης. Χρονόμετρο φωτογραφική μηχανή. Οινόπνευμα παγωμένο (φυλάσσεται στην κατάψυξη). Ένας αναδευτήρας (ξύλινο ραβδάκι). Μια γυάλινη κάψα για τη συλλογή των νουκλεϊκών οξέων. 3

4 Συντονισμός ομάδας! 1. Γνωριμία με τα διαθέσιμα υλικά στον πάγκο σας. 2. Τα φύλλα εργασίας είναι ατομικά και θα συμπληρωθούν σταδιακά κατά την πορεία του πειράματος. Δεν αποτελούν εξέταση αλλά οι σημειώσεις σας για την κατανόηση και την αποτύπωση των σταδίων του πειράματος. 3. Κάθε φορά που δίνεται ΟΔΗΓΙΑ από τον συντονιστή θα πρέπει όλοι να ακούμε προσεκτικά για να μη γίνουν λάθη κατά τα πειραματικά στάδια. 4. Κάθε φορά που εφαρμόζετε μια ΟΔΗΓΙΑ επιβάλλεται να ανταλλάσσετε απόψεις, αλλά αν είναι δυνατόν χαμηλόφωνα. 5. Μπορείτε να φωτογραφίζετε τα στάδια ώστε να έχετε υλικό για μια ομαδική παρουσίαση στο τέλος Ας ξεκινήσουμε με τα ερωτήματα 1 και 2 από το φύλλο εργασίας 4

5 ΟΔΗΓΙΑ 1η 1. Λιώνουμε (πολτοποιούμε) το υλικό μας, με το γουδάκι. 5

6 2. Στη συνέχεια ογκομετρούμε στον κύλινδρο 15 ml διαλύματος εκχύλισης DNA. Τα προσθέτουμε στο φυτικό υλικό και αναδεύουμε ήπια, 6

7 3. Αναδεύουμε ήπια το μίγμα για ένα λεπτό. Προσπαθούμε να μη δημιουργηθεί αφρός. Αναμονή για 6 λεπτά Επιστροφή στα φύλλα εργασίας Ερωτήματα 3,4,5,6 Μια μικρή βοήθεια??? 7

8 8

9 To DNA μέσα στον πυρήνα του κυττάρου είναι διπλωμένο (πακεταρισμένο) και προστατευμένο από πρωτεΐνες. Η πεψίνη (meat tenderizer) κόβει και απομακρύνει τις πρωτεΐνες από το DNA. ΧΡΟΝΟΣ ΓΙΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Αφού συμπληρώσετε τα αντίστοιχά ερωτήματα στο Φύλλο εργασίας διαβάζουμε την 2 η ΟΔΗΓΙΑ 9

10 4. Τοποθετούμε ένα χωνί σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα. 5. Βάζουμε μία γάζα ή/και διηθητικό χαρτί μέσα στο χωνί. 6. Ρίχνουμε το μίγμα του απορρυπαντικού με το πολτοποιημένο υλικό μας, στη γάζα και φιλτράρουμε το μίγμα μέσα στο σωλήνα ή σε ποτήρι ζέσεως. ΟΔΗΓΙΑ 1η 7. Ξεπλένουμε το γουδάκι με άλλα 10 ml διαλύματος εκχύλισης και φιλτράρουμε και αυτό το τελευταίο υγρό. Αναμονή για τη διήθηση του υλικού μας. Επιστροφή στα φύλλα εργασίας ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ 7,8 10

11 11

12 ΟΔΗΓΙΑ 3η 8. Προσθέτουμε με προσοχή το παγωμένο οινόπνευμα στο σωλήνα μέχρι να γεμίσει περίπου ως τη μέση και να σχηματίσει μία δεύτερη στοιβάδα πάνω από το φιλτραρισμένο υλικό, καθώς έχει μικρότερη πυκνότητα και επιπλέει σε αυτό. 12

13 9. Κρατάμε το δοκιμαστικό σωλήνα ακίνητο, στο ύψος των ματιών μας, χωρίς να τον μετακινούμε και παρατηρούμε τι συμβαίνει. Τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες κινούνται στον πυθμένα της υδάτινης στοιβάδας, ενώ τα νουκλεϊκά οξέα ανέρχονται από την υποκείμενη στοιβάδα, στη στοιβάδα της αιθανόλης. Τα νουκλεϊκά οξέα είναι αδιάλυτα στην αιθανόλη γι αυτό και τα διακρίνουμε σαν νέφος ΕΠΙΣΤΡΟΦΗ ΣΤΟ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΟΔΗΓΙΑ 4 η 13

14 Στα μικροσκόπια είναι τοποθετημένα έτοιμα παρασκευάσματα ανθρώπινου καρυότυπου προς παρατήρηση. Αυξήστε προοδευτικά τη μεγένθυνση των αντικειμενικών φακών. Παρατηρήστε τα χρωμοσώματα. ΟΔΗΓΙΑ 4η Προσθέστε κεδρέλαιο και παρατηρήστε στη μεγέθυνση Χ 100. Παρατηρήστε τα χρωμοσώματα. Επιστροφή στα φύλλα εργασίας Ερωτήματα 9,10. 14

15 ΟΔΗΓΙΑ 5η Χρησιμοποιώντας μία γυάλινη ή ξύλινη ράβδο, πλησιάζουμε τα νουκλεϊκά οξέα και στρέφοντας αργά τη ράβδο, τα τυλίγουμε γύρω της. 15

16 Τέλος απομακρύνουμε τη ράβδο από το υγρό (αιθανόλη). 16

17 Συλλέξατε το «νέφος» που σχηματίστηκε στη στιβάδα της αλκοόλης! Πως είμαστε σίγουροι ότι πρόκειται για νουκλεϊκά οξέα????? (ερώτημα 10 στο Φ.Ε.) 17

18 ΟΔΗΓΙΑ 6η Ένας τρόπος να διαπιστώσουµε αν η ουσία που αποµονώσαµε είναι πράγµατι DNA είναι να τη διαλύσουµε σε αντιδραστήριο διφαινυλαµίνης. Η αντιδραση διφαινυλαµίνης δεν είναι ειδική για το DNA αλλά για τις δεοξυριβόζες και δίνει µπλέ χρώµα. 18

19 Βιβλιογραφία Απομόνωση DNA, από Εργαστηριακός οδηγός Γ Λυκείου, 2000, από ( Δουρής, B., (1996), Κραββαρίτη, Λ., (2010), ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ KAI ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΑΘΗΝΑ 2015 Καββαδίας, Σπ., 2009, Εργαστηριακή απομόνωση DNA από φράουλες. Φύλλο εργασίας, 1ο ΓΕΛ Αργοστολίου Παλαιολόγου, Δ., Κατσαρέλη Ε., Παπανικολάου, Γ., 2015 Απομόνωση DNA, Κεφάλαιο 5, από Βάτσιος Ξ., 2012, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ), ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μαβίδης Μ., 2015, Απομόνωση Γενετικού Υλικού (DNA), από Dische, Z., 1955 New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal., 2: [PubMed] Patterson J., Mura C., 2013, Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples, J Vis Exp. (72): Published online, από: Stumpf, P., K., 1947, A colorimetric method for the estimation of deoxyribonucleic acid, από Burton, K., 1956, A Study of the Conditions and Mechanism of the Diphenylamine Reaction for the Colorimetric Estimation of Deoxyribonucleic Acid, Biochem., 62,

20 Ευχαριστίες Ευχαριστούμε τους μαθητές των τμημάτων ΓΘΣ1 και ΓΘΣ2 (σχολική χρονιά ) για τη συμμετοχή τους και την ευρυματικότητά τους στην εκτέλεση και παρουσίαση της εργαστηριακής αυτής άσκησης. 20