ENZYMIKH ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 ENZYMIKH ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

2 Παγκόσμια αγορά των ενζύμων > 4 δις, 60% Ευρώπη 15% Β. Αμερική 15% Ιαπωνία >500 εταιρείες παραγωγής ενζύμων

3 EC 1 Οξειδοαναγωγάσες: Οξείδωση -αναγωγή EC 2 Μεταφοράσες (τρανσφεράσες): Μεταφορά ομάδας EC 3 Υδρολάσες: Υδρόλυση διάφορων δεσμών EC 4 Λυάσες: Πρόσθεση η αφαίρεση ομάδων EC 5 Ισομεράσες: Ισομερεíωση -Ενδομοριακή μεταφορά ομάδων EC 6 Λιγάσες: Σύνδεση δυο μορίων με ομοιοπολικούς δεσμούς Λυάσες 7% Ισομεράσες Λιγάσες 2% 1% Οξειδοαναγωγάσες 25% Υδρολάσες 60% Τρανσφεράσες 5% Λιπάσες

4 Η δράση ενός ενζύμου είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την πρωτεϊνική φύση, αν και υπάρχουν καταλυτικά βιομόρια που δεν είναι πρωτεϊνικά, όπως τα ριβόζυμα (καταλυτικά RΝΑ) και τα δεοξυριβόζυμα (μονόκλωνα DNA). Κυτόχρωμα C Λιπάση από Pseudomonas Οξειδάση της ξανθίνης από αγελαδινό γάλα Λακκάση από Trametes hirsute Τυροσινάση από B. megaterium Oξειδάση της γλυκόζης από A. niger

5 Πλεονεκτήματα βιοκαταλυτών έναντι των χημικών καταλυτών Υψηλή καταλυτική ικανότητα Εξειδίκευση Ήπιες συνθήκες αντίδρασης Περιβαλλοντικά φιλικοί καταλύτες

6 Α) Μεγάλη καταλυτική ισχύς: υψηλότερη ταχύτητα Ενεργό κέντρο

7 Β) Υψηλός βαθμός εξειδίκευσης ως προς την αντίδραση και το υπόστρωμα Σύμπλοκο ενζύμου υποστρώματος Σύμπλοκο ενζύμου προϊόντος υπόστρωμα προϊόν Ενζυμο Ενζυμο

8 Η εξειδίκευση ως πρoς τo υπόστρωμα μπορεί να είναι: - απόλυτη εξειδίκευση (το ένζυμο δρα μόνο σε ένα υπόστρωμα) -υψηλή εξειδίκευση (το ένζυμο δρα σε λίγα υπoστρώματα) -χαμηλή εξειδίκευση (το ένζυμο δρα σε ένα σχετικά μεγάλo αριθμό υπoστρωμάτων)

9 Η ικανότητά τους να καταλύουν με μεγάλη εξειδίκευση συγκεκριμένες αντιδράσεις, ελαχιστοποιεί την εμφάνιση παραπροϊόντων και παράπλευρων ανεπιθύμητων αντιδράσεων. Το γεγονός αυτό έχει ιδιαίτερη τεχνολογική σημασία. (η απομόνωση του προϊόντος διευκολύνεται).

10 Produkte 4 KLEINE MOLEKÜLE GROSSE BEDEUTUNG 4-3 Die Verfahren der Διαδικασία Vitamin B σύνθεσης 2 -Synthese της βιταμίνης Β 2 Kλασσικές μέθοδοι: Χημικές διαδικασίες (9 βήματα) Μοντέρνες μέθοδοι Bιοτεχνολογικές διαδικασίες Γλυκόζη Bιομάζα K-Aραβονικό Ca-Aραβονικό Ca-Ραβονικό Ριβονιλακτόνη Ριβόζη Ριβιτυλχιλιδίνη Θετικά Αύξηση όγκου παραγωγής 40% κόστος παραγωγής 30% λιγότερες εκπομπές CO 2 60% λιγότερη χρήση πρώτων υλών 95% λιγότερα απόβλητα Βιταμίνη B 2 Βιταμίνη B 2

11 Τα ένζυμα έχουν την ικανότητα να διακρίνουν συγκεκριμένα τμήματα στα μόρια των υποστρωμάτων (τοποεκλεκτικότητα-regiospecificity) ή να διακρίνουν οπτικά ισομερή (στερεοεκλεκτικότηταstrereospecificity).

12 ΟΗ (S) Λιμονένιο Γεύση λεμονιού COOH (R) Λιμονένιο Γέυση πορτοκαλιού ΟΗ COOH ΟΗ H NH 2 ΟΗ H NH 2 (S)-Dopa αντι Parkinson (R)-Dopa σοβαρές παρενέργειες Η βιολογική δραστικότητα, η τοξικότητα, η διάθεση, και ο μεταβολισμός, διαφέρουν σημαντικά για τον κάθε οπτικό αντίποδα ενός ρακεμικού φαρμάκου

13 Tα ένζυμα δρουν σε καθορισμένες και ήπιες συνθήκες T( O C)

14 Γ) Τα ένζυμα λειτουργούν σε ήπιες συνθήκες. Αυτό μειώνει σημαντικά το ενεργειακό κόστος, ενώ παράλληλα μειώνει το κόστος κατασκευής ειδικού εξοπλισμού που ανθεκτικού σε διαβρωτικά χημικά αντιδραστήρια και ακραίες συνθήκες αντίδρασης (ph, T, P). Τα ένζυμα είναι φιλικοί στο περιβάλλον καταλύτες και βέβαια βιοαποικοδομήσιμοι, σε αντίθεση με τους χημικούς καταλύτες.

15 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ: BIOMHXANIA ΤΡΟΦΙΜΩΝ & ΠΟΤΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ (εξειδικευμένα χημικά) ΣΤΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ

16 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗΝ ΥΦΑΝΤΟΥΡΓΙΑ - ΒΡΥΣΟΔΕΨΙΑ ΧΑΡΤΟΠΟΙΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ (π.χ συντήρηση έργων τέχνης)

17 ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ (βιοαισθητήρες, ELISA προσδιορισμοί, διαγνωστικά εργαλεία) Ένζυμα της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA (νουκλεάσες, λιγάσες κ.ά) ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ (βιοφίλτρα, αποδόμηση ρύπων, βιοκαύσιμα) ΣΤΗΝ IATΡΙΚΗ (θεραπευτική αντικατάσταση, θεραπευτικά εργαλεία)

18 Που βρίσκονται τα ένζυμα; Τα ένζυµα βρίσκονται υπό µορφή διαλύµατος µέσα ή έξω από τα κύτταρα ή καθηλωμένα σε κάποιες µεµβράνες. Τα ίδια ένζυµα δεν χρησιµοποιούνται σε όλη τη διάρκεια της ζωής ενός κυττάρου αλλά παράγονται και καταστρέφονται από το κύτταρο ανάλογα µε τις ανάγκες του.

19 Προέλευση Ενζύμων Ζωικής Προέλευσης Φυτικής Προέλευσης Μικροβιακής Προέλευσης Λιπάση (πάγκρεας χοίρου, βιομηχανία καλλυντικών) Θρυψίνη (πάγκρεας μόσχου και χοίρου, επεξεργασία δέρματος) Αφυδρογονάσες (καρδιακό ή σκελετικό μυ θηλαστικών, διαγνωστική και αναλυτική επιστήμη) Παπαΐνη (Carica Papaya, ζυθοποιία) Οξαλοξική οξειδάση (ρίζες κριθαριού, προσδιορισμός οξαλοξικού οξέος) Υπεροξειδάση (ραφανίδα, ένζυμο δείκτης ενζυμικών αντιδράσεων) Περιοριστικά ένζυμα (διάφοροι μικροοργανισμοί, μοριακή βιολογία) Zωικής και φυτικής προέλευσης 8-10% της συνολικής παραγόμενης ποσότητας

20 ΕΝΖΥΜΑ ΑΠO ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Πλεονεκτήματα: Σταθερότητα και προβλεψιμότητα της απόδοσης του τελικού προϊόντος. Μεγάλη ταχύτητα ανάπτυξης των μικροοργανισμών Εύκολος καθαρισμός

21 Ένζυμα παραγόμενα από μικροοργανισμούς οι οποίοι φυσιολογικά αναπτύσσονται σε ακραίες συνθήκες θερμοκρασίας, ph, πίεσης και αλατότητας, Είναι δυνατή η καλλιέργεια βακτηρίων σε θερμοκρασία έως 105 ο C και πίεση έως 400 bar.

22 Ανίχνευση κατάλληλου μικροοργανισμού που θα παράγει το επιθυμητό ένζυμο σε μεγάλες ποσότητες & θα μπορεί να αναπτυχθεί σε βιοαντιδραστήρα

23 ένζυμα συνολικά 2500 χαρακτηρισμένα & απομονωμένα 200 εμπορική εφαρμογή Ανασταλτικός παράγοντας Υψηλό κόστος παραγωγής, απομόνωσης και καθαρισμού Αντιμετώπιση του προβλήματος Ανάπτυξη μικροοργανισμών Βιοπληροφορική Κλωνοποίηση και υπερέκφραση Ενζυμική Μηχανική

24

25 Κλωνοποίηση και υπερέκφραση Τεχνική κλωνοποίησης ανασυνδυασμένου DΝΑ Επιλογή πλασμιδιακού φορέα έκφρασης Επαγωγή υπερέκφρασης Αντίδραση συγκόλλησης PCR στο αντίστοιχο γένωμα Μετασχηματισμός Κυττάρων έκφρασης

26 H μεταγονιδιωματική ανάλυση είναι ένα νέο εργαλείο της Βιοτεχνολογίας, όπου οι δυνατότητες που προσφέρει η γονιδιωματική ανάλυση (η ανάλυση όλου του DNA ενός οργανισμού) εφαρμόζονται σε ολόκληρες βιοκοινότητες μικροβίων, παρακάμπτοντας την ανάγκη για απομόνωση και καλλιέργεια μεμονωμένων ειδών

27 Λαμβάνεται ένα δείγμα από ένα συγκεκριμένο περιβάλλον (όπως το έδαφος, το θαλασσινό νερό ή το ανθρώπινο στόμα) Ακολουθεί μαζική εξαγωγή DNA από όλα τα μικρόβια του δείγματος. (Η ανάλυση μπορεί να περιλαμβάνει εξαγωγή πρωτεϊνών ή RNA). Αφού γίνει εξαγωγή DNA από ένα δείγμα, ακολουθεί πρόσληψη και αντιγραφή του DNA. Δημιουργείται έτσι μία «βιβλιοθήκη» που περιέχει τμήματα των γονιδιωμάτων όλων των μικροβίων του δείγματος

28 Mελετά τα προϊόντα (π.χ ένζυμα) που μπορούν να παράγουν τα μικρόβια μίας βιοκοινότητας.

29 Επιλογή ενζύμου με βάση: 1) Το είδος εφαρμογής 2) Την εκλεκτικότητα 3) Την εξάρτηση της δραστικότητας και σταθερότητας από παράγοντες όπως το ph, τη θερμοκρασία το μέσο και γενικά τις συνθήκες δράσης 4) Το κόστος παραγωγής

30 Κατάταξη Ενζύμων με βάση τον όγκο παραγωγής και αγοράς Μεγάλου όγκου ή βιομηχανικά ένζυμα (industrial enzymes) Μικρού όγκου ή υψηλής προστιθέμενης αξίας ένζυμα (high added value enzymes) Εξωκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Χαμηλή καθαρότητα Μεγάλες ποσότητες παραγωγής Φθηνό κόστος παραγωγής και αγοράς Ενδοκυτταρικά ένζυμα (συνήθως) Υψηλή καθαρότητα Μικρές ποσότητες παραγωγής Ακριβό κόστος παραγωγής και αγοράς Αναλυτικά ένζυμα βιοαισθητήρες Διαγνωστικά ένζυμα Θεραπευτικά ένζυμα Ένζυμα της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA Ενζυμα εξειδικευμένων εφαρμογών

31 ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Από 11 μύκητες 4 ζυμομύκητες και 8 βακτήρια οι οποίοι έχουν χαρακτηρισθεί ασφαλείς. Βακτήρια των γενών Bacillus, Lactobacillus, και Streptomyces, κ καθώς και μύκητες των γενών Penicillium, Mucor και Rhizopus

32 Νομοθεσία και κανόνες ασφάλειας στην εφαρμογή των ενζύμων Ένζυμα από στελέχη μικροοργανισμών που έχουν χαρακτηρισθεί ασφαλή (generally recognized as safe, GRAS) Παρασκευή με καθορισμένες διαδικασίες ώστε να ικανοποιούνται κριτήρια ασφάλειας (good manufacturing practice, GMP) Τοξικολογικοί έλεγχοι ένζυμα παθογόνων μικροοργανισμών Αναλυτικά, θεραπευτικά και διαγνωστικά ένζυμα υψηλή καθαρότητα Εφαρμογή αυστηρών διεργασιών ποιοτικού ελέγχου (βιολογικές μετρήσεις) για την ανίχνευση ανεπιθύμητων προσμίξεων που μπορεί να προκαλέσουν ανοσολογικές ή ανοσοδιεγερτικές επιπλοκές

33

34 ΥΔΡΟΛΑΣΕΣ

35

36 Ένζυμα Εφαρμογές Λιπάσες, Εστεράσες Παραγωγή διατροφικών προϊόντων Παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων Παραγωγή εξειδικευμένων χημικών Τροποποίηση λιπών και ελαίων Παραγωγή σαπουνιών, καλλυντικών κ.ά Παραγωγή βιοκαυσίμων (βιοντήζελ) Απορρυπαντικά, κατεργασία δέρματος Πρωτεάσες, Αμιδάσες Παραγωγή διατροφικών προϊόντων Παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων Παραγωγή εξειδικευμένων χημικών Κατεργασία κρέατος, Απορρυπαντικά Αμυλάσες, Κυτταρινάσες Παραγωγή διατροφικών προϊόντων Υφαντουργία, Ζωοτροφές Παραγωγή βιοκαυσίμων (βιοαιθανόλη) Γλυκοζιδάσες Παραγωγή διατροφικών προϊόντων Παραγωγή εξειδικευμένων χημικών

37 Λιπάσες και εστεράσες Υδρόλυση εστερικών δεσμών α) 1,3 τόπo-ειδικευμένες λιπάσες. β) μη ειδικευμένες λιπάσες

38 Βιομηχανία Γαλακτοκομικά προϊόντα Προϊόντα αρτοποιίας Κλωστοϋφαντουργία Βιομηχανία απορρυπαντικών Βιομηχανία χημικών Βιομηχανία φαρμάκων Βιομηχανία καλλυντικών Βιομηχανία καυσίμων Βιομηχανία χαρτιού Επεξεργασία αποβλήτων Σύνθεση βιοαισθητήρων Προϊόν ή εφαρμογή Ανάπτυξη παραγόντων βελτίωσης γεύσης Αύξηση του όγκου στο ψωμί Απομάκρυνση λιπαντικών ουσιών Απομάκρυνση λιπαρών λεκέδων Παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών Βοηθητικά πέψης Γαλακτοματοποιητές, προϊόντα ενυδάτωσης Παραγωγή βιοντήζελ Στον έλεγχο του χρώματος Απομάκρυνση υδρογονανθράκων Ανίχνευση λιπιδίων

39 Ταχύτητα αντίδρασης 4 Ενζυμική ενεργότητα λιπάση Λιπάση εστεράση Εστεράση Κινητική Michaelis Menten 0 0,0 1,0 2,0 3,0 0,0 0,5 1,0 2,0 [Υπόστρωμα] υγκέντρωση υποστρώματος Διεπιφανειακή ενεργοποίηση

40 Διεπιφανειακή ενεργοποίηση «Καπάκι»

41

42 α) ευρύ φάσμα εξειδίκευσης των λιπασών που επιτρέπει την τροποποίηση όχι μόνο φυσικών αλλά και συνθετικών υποστρωμάτων, β) η έκφραση των καταλυτικών τους ιδιοτήτων δεν απαιτεί την παρουσία συνενζύμων, γ) μεγάλος αριθμός λιπολυτικών ενζύμων που είναι εμπορικά διαθέσιμα (περίπου 70 λιπάσες είναι σήμερα διαθέσιμες),

43 ΒΙΟΝΤΗΖΕΛ Εστέρες λιπαρών οξέων με αλκοόλες όπως η μεθανόλη και η αιθανόλη

44 Τροποποίηση της σύστασης τριγλυκεριδίων OC 16:0 OC 18:1 OC 16:0 + 3 C 18:0 1,3-ειδικευμένη λιπάση εξάνιο OC 16:0 OC 18:1 OC 18:0 OC 18:0 + OC 18:1 + OC 18:0 3 C 16:0 κλάσμα φοινικέλαιου 1,3-διπαλμιτο-2-ελαϊκό τριγλυκερίδιο υποκατάστατο βουτύρο του κακάου Σύνθεση υποκατάστατου του βουτύρου του κακάο μέσω ενζυμικής μετεστεροποίησης που καταλύει μια 1,3-ειδικευμένη λιπάση σε εξάνιο

45 Βιολογικά απορρυπαντικά Ένζυμο Ενζυμική δράση Χρήση Πρωτεάσες Υδρόλυση πρωτεϊνών Έναντι ρύπων από αυγά, γάλα και σπανάκι Λιπάσες Υδρόλυση λιπών Έναντι ρύπων από λάδια, λίπη και καλλυντικά Κυτταρινάσες Υδρόλυση φυτικών Χρήση στον βιοεξευγενισμό των υφασμάτων πολυσακχαριτών όπως κυτταρίνη διατήρηση της απαλότητας και χρώματος των βαμβακερών υφασμάτων Αμυλάσες Υδρόλυση φυτικών Έναντι ρύπων από πατάτες, σοκολάτα πολυσακχαριτών όπως άμυλο ή γλυκίσματα

46

47 Βιολογικά απορρυπαντικά Ένζυμο ph χρήσης Θερμοκρασία Χρήσης ( ο C) Πρωτεάσες Λιπάσες Κυτταρινάσες Aμυλάσες

48

49

50

51 Ένζυμα στην επεξεργασία πολυσακχαριτών Ένζυμα που εμπλέκονται στην υδρόλυση γλυκοζιδικών δεσμών των φυσικών πολυσακχαριτών (άμυλο, κυτταρίνη, πηκτίνες και γλυκάνες) αμυλάσες, κυτταρινάσες, πηκτινάσες και γλυκανάσες H HO OH OH β-(1,4)-dγαλακτοσιδικός δεσμός H H H O OH H O HO H OH H O OH H OH H H ΛΑΚΤΟΖΗ β- ΓΑΛΑΚΤΟΣΙΔΑΣΗ ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ OH OH H HO H H H O OH H OH HO HO H OH H H H O OH H OH ΓΛΥΚΟΖΗ

52

53 Ένζυμα Εξειδίκευση Βιομηχανική εφαρμογή α και β-αμυλάσες Κυτταρινάσες Λακτάση β-γλυκανάσες Πηκτινάσες και πηκτινολυάσες α-1,4 γλυκοζιδικός δεσμός στο άμυλο β-1,4 γλυκοζιδικός δεσμός στην κυτταρίνη β-1,4 γλυκοζιδικός δεσμός στη λακτόζη β-1,3 και κυρίως β-1,4 γλυκοζιδικοί δεσμοί πολυσακχαριτών όπως οι β-γλυκάνες α-1,4 δεσμός μονάδων γαλακτουρονικού οξέος πηκτινών Παραγωγή γλυκαντικών ουσιών από άμυλο, ζυθοποιία, χαρτοποιία, υφαντουργία Παρασκευή προϊόντων φρούτων και λαχανικών, υφαντουργία, βιοεξευγενισμών υφασμάτων) κλπ. Προϊόντα γάλακτος και τυρογάλακτος Ζωοτροφές, ζυθοποιία, εκχύλιση χυμών Εκχύλιση και διαύγαση φρουτοχυμών, διαύγαση κρασιών

54 ΕΝΖΥΜΑ ΣΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ

55 Παραγωγή βιοαιθανόλης από κυτταρίνη μέσω της δράσης κυτταρινασών (cellulases)

56

57 Ένζυμα στην επεξεργασία του αμύλου Άμυλο Αμυλόζη 15-30% α 1-4 Αμυλοπηκτίνη 70-85% α 1-4, 1-6 Προϊόντα γλυκιάς γεύσης σιρόπια φρουκτόζης, γλυκόζης, δεξτρόζης και μαλτόζης, με εφαρμογή στην βιομηχανία τροφίμων και ποτών

58 Εφαρμογή στην υφαντουργία Αμυλάσες Aπομάκρυνση της κόλλας από τα υφάσματα (άμυλο) (η κόλλα εμποδίζει διαδικασίες όπως λεύκανση, βαφή)

59 Bιο-εξευγενισμός (bio-polishing) υφασμάτων φινίρισμα των υφασμάτων τύπου τζην (απομάκρυνση μικρο-ινιδίων). ΚΥΤΤΑΡΙΝΑΣΕΣ

60 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΣ ΣΤΑ ΥΦΑΣΜΑΤΑ Δράση κυτταρινάσης

61 Βιο-εξευγενισμός (bio-polishing) υφασμάτων Eπεξεργασία με: Αμυλάση Κυτταρινάση Λακκάση

62

63 Εφαρμογή στην παρασκευή προϊόντων φρούτων Πηκτινολυτικά ένζυμα, αμυλάσες, ημικυτταρινάσες και κυτταρινάσες Τεμαχισμός καρπού Πηκτινάση, πηκτινεστεράση, πηκτινολυάση, κυτταρινάση Αποσάρθρωση ιστού Εξαγωγή χυμού, παστερίωση Αποπηκτινοποίηση, διαύγαση Πηκτινάση, πηκτινεστεράση, πηκτινολυάση, αμυλάση α) πηκτινεστεράσες υδρολύουν τους εστέρες της πηκτίνης β) πηκτινάσες και πηκτινολυάσες, υδρολύουν τους α-1,4- γλυκοζιδικούς δεσμούς που συνδέουν τις μονάδες του α-d-γαλακτουρονικού οξέος Διήθηση, συμπύκνωση τυποποίηση

64 Βιομηχανικές εφαρμογές οξειδοαναγωγικών ενζύμων Kαταλάση Η 2 Ο 2 Η 2 Ο + ½ Ο 2 Στην υφαντουργία κατά την εξουδετέρωση του Η 2 Ο 2 (λευκαντικό φυσικών ινών) Για την απαλλαγή υπολειμμάτων Η 2 Ο 2 το οποίο χρησιμοποιείται ως βακτηριοστατικό στο γάλα σε περιπτώσεις αδυναμίας συντήρησης τους.

65 Βιοαισθητήρες Ορισμός: Βιοαισθητήρας ονομάζεται μια αναλυτική συσκευή η οποία μετατρέπει μια βιολογική απόκριση σε ηλεκτρικό σήμα μεταδίδοντας πληροφορίες για μια ζωτική διαδικασία.

66 Βιοαισθητήρες Δείγμα (Αναλύτης) Βιοκαταλύτης Μετατροπέας Όργανο επεξεργασίας σήματος

67 Το βιολογικό σήμα είναι αποτέλεσμα μιας ή περισσοτέρων ενζυμικών αντιδράσεων που καταλύονται από ένα ή περισσότερα ένζυμα ακινητοποιημένα οε στερεό φορέα. ΣΗΜΑ: Μεταβολή κάποια χημικής ή φυσικής παραμέτρου στο βιολογικό σύστημα (όπως συγκέντρωση ιόντων, πρωτονίων, οξυγόνου, αερίων, μεταβολή θερμότητας κ.ά).

68 Οπτοηλεκτρονικοί Βιοαισθητήρες και Βιοενεργοποιητές στην Κλινική Βιοαισθητήρες Διάγνωση στην και Κλινική στην Βιοιατρική Διάγνωση και στην Βιοιατρική Οπτοηλεκτρονικός Βιοαισθητήρας Γλυκόζης: Βιοαισθητήρας Γλυκόζης: Ο Ο πρώτος βιοαισθητήρας που που κυκλοφόρησε στο κυκλοφόρησε εμπόριο στο εμπόριο Χρησιμοποιείται για για την την ανίχνευση της της γλυκόζης στο αίμα σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη Ο Ο ασθενής παίρνει ένα ένα δείγμα από από το το αίμα αίμα και το τοποθετεί μέσα στην συσκευή

69 Οξειδάσες Καταλύουν την οξείδωση υποστρωμάτων Απαγωγή δύο ατόμων Η από το υπόστρωμα δότη και μεταφορά σε Ο 2 Ένζυμα εξαρτώμενα από φλαβινο-προσθετικές ομάδες ΥΗ 2 + Ενζυμο-[FMN/FAD] + 1/2Ο 2 Y + Ενζυμο-[FMNH 2 /FADH 2 ] + Η 2 Ο Το μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) είναι ο τελικός αποδέκτης υδρογόνων ή ηλεκτρονίων Η 2 Ο ή Η 2 Ο 2

70 Oξειδάση της γλυκόζης- GOX Η GOX είναι ένα σημαντικό φλαβονοένζυμο που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της γλυκόζης σε φυσιολογικά υγρά και βιολογικά δείγματα. Καταλύει την οξείδωση της β-d-γλυκόζης σε D-γλυκονικό-1,5-λακτόνη και υπεροξείδιο του υδρογόνου, χρησιμοποιώντας μοριακό οξυγόνο σαν δέκτη ηλεκτρονίων. β-d-γλυκόζη δ-d-γλυκονο-1,5-λακτόνη

71 β-d-γλυκόζη δ-d-γλυκονο-1,5-λακτόνη

72 KYΨΕΛΕΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ Μία κυψέλη βιοκαυσίμων (fuel cell) είναι μία διάταξη ή οποία μετατρέπει χημική ενέργεια σε ηλεκτρική, μέσω της δράσης μικροοργανισμών ή ενζύμων. Ο βιοκαταλύτης μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να καταλύσει την παρασκευή απλούστερων καυσίμων, όπως είναι το υδρογόνο και το μεθάνιο, από πολυπλοκότερες βιοχημικές ενώσεις, όπως είναι τα σάκχαρα ( δευτερογενείς κυψέλες βιοκαυσίμων)

73 Σάκχαρα, έλαια ΑΦΥΔΡΟΓΟΝΑΣΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΛΑΚΚΑΣΗ Η 2 Ο Το ένζυμο (οξειδάση της γλυκόζης ή αφυδρογονάση της γλυκόζης) ακινητοποιείται στο ηλεκτρόδιο της ανόδου, όπου και οξειδώνεται το καύσιμο (γλυκόζη), ενώ ταυτόχρονα παράγονται ηλεκτρόνια. Στην κάθοδο ανάγεται το Ο 2 σε Η 2 Ο μέσω μιας αντίδρασης που καταλύεται από ένζυμα όπως η λακκάση ή η οξειδάση του ασκορβικού κ.ά

74 H χρήση των κυψελίδων βιοκαυσίμων δεν περιορίζονται μόνο στην παραγωγή ενέργειας, αλλά αξιοποιούνται επίσης ως εμφυτεύσιμες συσκευές, αισθητήρες, μικρο-τσιπ και φορητές συσκευές εφοδιασμού ενέργειας (μπαταρίες). Ex vivo χρήση: Φορητές συσκευές In vivo χρήση: Εκμετάλλευση βιοχημικών καυσίμων για παραγωγή ενέργειας σε ιατρικές συσκευές (π.χ βηματοδότης, βιοαισθητήρες κλπ)

75

76 Θεραπευτική αντικατάσταση ενζύμων. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ α-αντιθρυψίνη τροποποιημένη Μet358Val ώστε να είναι ανθεκτική σε Το ένζυμο υδρολύει την ελαστάση και έτσι ελέγχει τα Πνευμονικά νοσήματα (Κυστική ίνωση, βρογχίτιδα, εμφύσημα) οξειδωτικό περιβάλλον (π.χ σε καπνιστές) επίπεδά της Υδρολάση της Έλλειψη του ενζύμου οδηγεί σε αδυναμία μεταβολισμού της Φαινυλκετονούρια φαινυλαλανίνης φαινυλαλανίνης Παγκρεατικά ένζυμα (λιπάση πρωτεάση, Ενζυμα πέψης πρωτεϊνών, Ασθένειες του παγκρέατος αμυλάση, νουκλεάση) Παγκρεατίνη από χοίρο λιπών, πολυσακχαριτών Λακτάση Υδρόλυση της λακτόζης Δυσανεξία σε γαλακτοκομικά Απαμινάση αδενοσίνης Η έλλειψη του ενζύμου οδηγεί σε μη λειτουργικά Τ- και Β- κύτταρα Νόσος SCID Γενετικά κληρονομούμενη ανοσοανεπάρκεια Γύκοκερεβροζιδάση Τροποποιημένο ένζυμο Ηis495Arg με τροποιημένη υδατανθρακική περιοχή Το ένζυμο υδρολύει το γλυκοκερεραμίδιο η συσσώρευση του οποίου στα λυσοσώματα οδηγεί σε σοβαρές ασθένειες Νόσος του Gaucher (γενετική ασθένεια)

77 Τα ένζυμα ως θεραπευτικά μέσα. ΕΝΖΥΜΑ ΔΡΑΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ DNAάση (Κλωνοποιημένη ανθρώπινη δεοξυρυβονουκλεάση Ι) σε εισπνεόμενη μορφή Υδρολύει το DNA της βλέννας στους πνεύμονες Κυστική ίνωση (συσσώρευση πηκτής βλέννας στους πνεύμονες) L-ασπαραγινάση Εξωγενής χορήγηση Το ένζυμο μετατρέπει την L-ασπαραγίνη σε L-ασπαραγινικό και έτσι μειώνει την L-ασπαραγίνη που είναι απαραίτητο αμινοξύ για τον πολλαπλασιασμό των Λεμφοκυτταρική λευχαιμία καρκινικών κυττάρων τα οποία, σε αντίθεση με τα υγιή, δεν μπορούν να συνθέσουν το αμινοξύ αυτό Θρομβολυτικά ένζυμα Μη πρωτεολυτικές πρωτεΐνες όπως η στρεπτοκινάση και Θρομβόλυση (Τα ένζυμα μετατρέπουν το πλασμινογόνο σε πλασμίνη η οποία λύει Θρομβολυτική θεραπεία σταφυλοκινάση. Πρωτεολυτικά ένζυμα όπως η ουροκινάση και ο ιστικός ενεργοποιητής του πλασμινογόνου Η σερονοπρωτεάση ancord το ινώδες των θρόμβων) Δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) Καταλάση Η SOD καταλύει τη μετατροπή σουπεροξειδικών ριζών (Ο - 2 ) σε Η 2 Ο 2. Οι ρίζες σουπεροξειδίου προξενούν κυτταρικές βλάβες καθώς προσβάλουν τα ακόρεστα λιπαρά των μεμβρανών. Η καταλάση μετατρέπει το Η 2 Ο 2 σ ε Η 2 Ο Πρόληψη καταστροφής ιστών από οξειδωτικής καταπόνηση

78 Aνάκτηση Βιοτεχνολογικών Προϊόντων Η διαδικασία απομόνωσης και καθαρισμού ενός βιοτεχνολογικού προϊόντος είναι γνωστή με τον όρο κάθετη επεξεργασία (downstream process) Bιοτεχνολογικά προϊόντα: Kύτταρα, Πρωτεΐνες & Ενζυμα Mεταβολίτες και τελικά μεταβολικά προϊόντα (π.χ αμινοξέα, αντιβιοτικά, βιοπολυμερή κ.ά.)

79 Συγκέντρωση στη πηγή (g/l) Νερό 10 Νερό Αιθανόλ Αυξητικ Αυξητική Πενικιλλίνη Εμβόλιο 10 1 η Πενικιλλίν ή ορμόνη ηπατίτιδας η ορμόνη Εμβόλιο Β 10-1 Μικροβιακές ηπατίτιδας Β πρωτεάσες ές πρωτεάσες Οξειδάση 10-3 Οξειδάση της Μονοκλωνι Μονοκλωνικά Ινσουλίνη της γλυκόζης κά αντισώματα νη 10-5 αντισώματα Παράγοντας Παράγοντας VIII VIII Tιμή πώλησης ( /Kg) Σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης ενός βιοτεχνολογικού προϊόντος στην αρχική του πηγή (πριν τον καθαρισμό του) συναρτήσει της τιμής πώλησής του

80 ΟΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΘΕΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΕΞΑΡΤΩΝΤΑΙ 1) Eπιθυμητό βαθμό καθαρότητας είδος εφαρμογής του προϊόντος αυτού. 2) Φύση και το μέγεθος 3) Ευαισθησία σε παράγοντες όπως το ph, η θερμοκρασία & η ιοντική ισχύς του διαλύματος. Βασικός στόχος: η ελαχιστοποίηση των σταδίων και η διατήρηση υψηλών αποδόσεων

81 ΑΡΧΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ ΣΤΑΔΙΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΣΤΑΔΙΟ 1 ΣΤΑΔΙΟ 2 ΣΤΑΔΙΟ 3 ΣΤΑΔΙΟ 4 ΣΤΑΔΙΟ 5 ΤΕΛΙΚΟ ΠΡΟΪΟΝ

82 Απομόνωση/καθαρισμός ενζύμων Στάδια Σχετική ποσότη τα Ενεργότητα (%) Ειδική ενεργότητα Συνολικό κόστος Κόστος ανά βάρος Κόστος ανά δραστικότητα

83 ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ & ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Κατάλληλη δοκιμασία (assay) προσδιορισμού δραστικότητας Ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης (UV, φθορισμός, ειδικές αντιδράσεις) Ειδική δραστικότητα Ενζυμική δραστικότητα Unit (U) Eιδική ενζυμική δραστικότητα Unit/mg πρωτεΐνης

84 Απορρόφηση στα 280 nm

85 Το ένζυμο β-d-γλυκοζιδάση βρίσκεται στο διάλυμα Α με συγκέντρωση 5 mg/ml και δραστικότητα 100 Units/ml και στο διάλυμα Β με συγκέντρωση 2 mg/ml και δραστικότητα 50 Units/ml. Σε ποιο διάλυμα η ειδική δραστικότητα του ενζύμου είναι μεγαλύτερη;

86 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ (ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ) Ενδοκυτταρικά Προσδεδεμένα σε μεμβράνες Εξωκυτταρικά

87 Mέθοδοι ανάκτησης και καθαρισμού ενζύμων Οργανισμός (Πηγή πρωτεΐνης) Ανιούσα Επεξεργασία (Έκφραση πρωτεΐνης) Κατιούσα Επεξεργασία (Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνης) Καθαρό Πρωτεϊνικό Παρασκεύασμα

88 Κατιούσα Επεξεργασία Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμός Στερεών και Υγρών Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Τελικό Στάδιο Μορφοποίηση Προϊόντος

89 ΔΙΑΦΟΡΟΠΟIΗΣΗ ΩΣ ΠΡΟΣ ΤΗΝ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Στόχος η ανάκτηση της μέγιστης δυνατής ποσότητας του ενζύμου στη δραστική του μορφή. Ποιοι παράγοντες διαφοροποιούνται μετά τη διάρρηξη των κυττάρων; ph, θερμοκρασία, συγκέντρωση Ο 2, παρουσία μεταβολιτών, δράση πρωτεολυτικών ενζύμων Διάρρηξη (λύση) των κυττάρων Μηχανικές και μη μηχανικές τεχνικές.

90 ΣΤΑΔΙΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Διάρρηξη Κυττάρων Μη Μηχανικές Τεχνικές Ωσμωτικό σοκ Αλκαλική λύση (ph 11-12,5) Χρήση επιφανειοδραστικών ή τασιενεργών ενώσεων (Tween, Triton) Μηχανικές Τεχνικές Εφαρμογή υπερήχων Εφαρμογή υψηλής πίεσης Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους Οργανικοί διαλύτες (τολουόλιο, ακετόνη) Ενζυμική λύση (λυσοζύμη)

91 Μηχανικές τεχνικές λύσης των κυττάρων Εφαρμογή υπερήχων. Ηχητικά κύματα (ν>20 ΚHz) Μηχανικός θρυμματισμός των κυττάρων και ιστών. Σε εργαστηριακή κλίμακα γίνεται με λυοτρίβηση των κυττάρων παρουσία σφαιριδίων υάλου ή αλουμίνας ή σε κυλινδρικούς θαλάμους που φέρουν περιστρεφόμενο άξονα

92 Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Εφαρμογή υψηλής πίεσης French Press Cell Press Η διαδικασία εφαρμόζεται σε βιομηχανική κλίμακα. Η μέθοδος είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στη διάρρηξη βακτηριακών κυττάρων

93 Μηχανικές Τεχνικές διάρηξης κυττάρων Μηχανικός θρυμματισμός με κόκκους Glass beads

94 Μη μηχανικές τεχνικές λύσης των κυττάρων Περιλαμβάνουν φυσικές, χημικές και ενζυμικές διεργασίες. Ωσμωτικό σοκ. Λύση κυττάρων με τοιχώματα μειωμένης μηχανικής αντοχής. Επώαση σε διάλυμα σακχαρόζης 20-25% w/v συρρίκνωσή λόγω απώλειας νερού. Ακολουθεί η επώασή τους σε νερό, στους 4 ο C, οπότε και διαρρηγνύονται. Θερμική επεξεργασία. Εφαρμογή μόνο στην περίπτωση θερμοανθεκτικών προϊόντων Επεξεργασία των κυττάρων με αλκαλικό διάλυμα (ph για 20 min). Επεξεργασία με ένζυμα λυσοζύμη, γλυκανάσες σε συνδυασμό με πρωτεάσες μείωση της δομικής σταθερότητας του κυτταρικού τοιχώματος Χρήση επιφανειακά ενεργών ουσιών (Τriton, Tween). Διαλυτοποίηση των λιπιδίων & λιποπρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης αυξάνοντας την διαπερατότητά της

95 H επιλογή των μεθόδων εξαρτάται από το είδος των κυττάρων Μηχανικές μέθοδοι Μη μηχανικές μέθοδοι Μικροβιακά κύτταρα Εφαρμογή υπερήχων Ομογενοποίηση με υψηλή πίεση Μηχανικός θρυμματισμός Ωσμωτικό σοκ Θερμικό σοκ Χρήση επιφανειοενεργών, οργανικών διαλυτών, αλκαλικού διαλύματος Εφαρμογή ενζύμων Ζωικοί ιστοί Ομογενοποίηση Φυτικοί ιστοί Επεξεργασία με εκχυμωτή υπό ψύξη Κονιορτοποίηση υπό ψύξη Εφαρμογή ενζύμων

96 Αρχικό Στάδιο Διαχωρισμού Στερεών και Υγρών Φυγοκέντρηση Ίζημα : Ενδοκυτταρικές, μεβρανικές πρωτεΐνες Υπερκείμενο : Εξωκυτταρικές πρωτεΐνες Φυγοκέντρηση σε ειδικά δοχεία Φυγοκέντρηση συνεχούς ροής

97 Στάδιο Χαμηλού Καθαρισμού Κατακρήμνιση με οργανικούς διαλύτες Κατακρήμνιση σε υδατικά διφασικά συστήματα Θερμική Επεξεργασία Κατακρήμνιση με άλατα Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων (πολυαιθυλενιμίδιο, θειική στρεπτομυκίνη, βρωμιούχο κετυλο τριμεθυλαμμώνιο, πρωταμίνη, δεοξυριβονουκλεάση)

98 Κατακρήμνιση Με προσθήκη αλάτων π.χ (ΝΗ 4 ) 2 SΟ 4 αποτέλεσμα υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, Για την ενυδάτωση των ιόντων του άλατος συμμετέχουν τόσο τα ελεύθερα μόρια νερού όσο και «δεσμευμένα» μόρια νερού από την επιφάνεια των πρωτεϊνών και ιδιαίτερα από το περιβάλλον υδρόφοβων περιοχών της επιφάνειάς τους.

99 Κατακρήμνιση με προσθήκη οργανικών διαλυτών Η προσθήκη πολικών οργανικών διαλυτών όπως η ακετόνη, η αιθανόλη, οδηγεί σε μείωση της διηλεκτρικής σταθεράς του διαλύματος η οποία οδηγεί σε ανάπτυξη ισχυρότερων ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ αντίθετα φορτισμένων πρωτεϊνικών μορίων με αποτέλεσμα την κατακρήμνισή τους

100 Κατακρήμνιση με προσθήκη πολυμερών Χρησιμοποίηση πολυμερών μεγάλου μοριακού βάρους π.χ PEG, ΜΒ Σε βιομηχανικό επίπεδο, χρησιμοποιούνται φορτισμένα πολυμερή (πολυηλεκτρολύτες) τα οποία σχηματίζουν σύμπλοκα ηλεκτροστατικής φύσης με τις πρωτεΐνες οδηγώντας στην καθίζησή τους.

101 Κατακρήμνιση με μεταβολή του ph (στο ισοηλεκτρικό σημείο) Το pi μιας πρωτεΐνης είναι 7. Σε ph=5 η πρωτεΐνη τι φορτία θα αναπτύξει;

102 R + NH 3 C COOH + H + NH H R C COO R NH 2 C - COO H H H ΘΕΤΙΚΑ ΦΟΡΤΙΣΜΕΝΟ ΧΩΡΙΣ ΦΟΡΤΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΑ ΦΟΡΤΙΣΜΕΝΟ ph=1 ph=7 ph=11 Διπολικό ιόν

103 pka Τελική καρβοξυλομάδα Ασπαραγινικό γλουταμινικό -COOH -COOH - COO + H + 3,1 - COO + H + 4,4 Ιστιδίνη H 2 C + HN NH H 2 C N + H + 6,5 NH Τελική αμινομάδα Κυστεϊνη + -NH 3 -NH 2 + H + 8,0 -SH - -S + H + 8,5 Τυροσίνη OH O + H + 10,0 Λυσίνη + -NH 3 -NH 2 + H + 8,0 Αργινίνη HN + NH 2 NH CH HN CH + H + 12,0 NH 2 NH 2

104 Κατακρήμνιση με μεταβολή του ph (στο ισοηλεκτρικό σημείο) ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ

105 μεμβράνη κλπ) Στάδιο χαμηλού καθαρισμού Απομάκρυνση νουκλεϊκών οξέων Κατακρήμνιση, ενζυμική υδρόλυση Απομάκρυνση μέρους πρωτεϊνών Απομάκρυνση πρωτεϊνών Τελικός καθαρισμός Κατακρήμνιση με άλατα ή οργανικούς διαλύτες Κατανομή σε διφασικό σύστημα υγρού-υγρού Στάδιο υψηλού καθαρισμού Υγρή χρωματογραφία στήλης (μοριακού ηθμού, ιοντοανταλλαγής, συγγένειας, υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων) Μορφοποίηση τελικού προϊόντος Συμπύκνωση, σταθεροποίηση, συσκευασία, ποιοτικός έλεγχος Υπερδιήθηση, Κατακρήμνιση, Λυοφίληση

106 Διαχωρισμός βιοτεχνολογικών προϊόντων με χρωματογραφία Κατανομή των συστατικών του μίγματος μεταξύ μιας κινητής υγρής και μιας στατικής φάσης Oμοιόμορφα σωματίδια συνήθως σφαιρικής μορφής με μηχανική χημική και βιολογική σταθερότητα

107 Χρωματογραφία Διαχωρισμός με βάση Αποκλεισμού μεγέθους ή μοριακού ηθμού-μοριακής διήθησης - Gel filtration Ιοντοανταλλαγής Ion exchange Υδρόφοβη Hydrophobic Συγγένειας Affinity Συγγένειας με ακινητοποιημένα ιόντα μετάλλου Μέγεθος και σχήμα Ηλεκτροστατικά φορτία Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις Εκλεκτική σύνδεση σε άλλα μόρια Εκλεκτική σύνδεση στα ιόντα μετάλλου

108 Υλικό Εμπορική ονομασία Χρωματογραφική τεχνική Αγαρόζη Βio-Gel Ηi Trap Συγγένειας και ιοντοανταλλαγής Sepharose CL Sepharose HP Δεξτράνη Sephadex Mοριακής διήθησης Κυτταρίνη Sephacel Whatman TM Cellufine Ιοντοανταλλαγής Πολυακρυλαμίδιο BioGel P Mοριακής διήθησης Συμπολυμερές Sephacryl Mοριακής διήθησης πολυακρυλαμιδίου/δεξτράνης Συμπολυμερές αγαρόζης/δεξτράνης Superdex Mοριακής διήθησης Συμπολυμερές Ultrogel AcA Mοριακής διήθησης αγαρόζης/πολυακρυλαμιδίου Πολυσακχαριτικό πήκτωμα HyperD Συγγένειας και ιοντοανταλλαγής Αρωματικοί πυρήνες Πολυστυρένιο/διβινυλοβενζένιο Poros Συγγένειας και ιοντοανταλλαγής Διοξείδιο του πυριτου/δεξτράνη Spherodex Iοντοανταλλαγής

109 Η έκλουση των συστατικών του μίγματος επιτυγχάνεται είτε με ισοκρατικό τρόπο είτε με διαβάθμιση -gradient H σύσταση της υγρής φάσης μεταβάλλεται συνεχώς Ο διαχωρισμός των συστατικών εξαρτάται από το χρόνο κατακράτησης στη στήλη Ανίχνευση πρωτεϊνών με φασματοσκοπικές τεχνικές (π.χ 280 nm, Bradford, Lowry)

110 Στάδιο Υψηλού Καθαρισμού Fast protein liquid chromatography FPLC

111

112 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΑΘΑΡΟΤ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣ

113 Xρωματογραφία διαπερατότητας ή αποκλεισμού ή μοριακού ηθμού Μοριακή δήθηση gel filtration Εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα για τη γρήγορη απομάκρυνση μικρομοριακών ενώσεων από το πρωτεϊνικό διάλυμα H συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυμα δεν μπορεί να είναι πολύ υψηλή (10-30 mg/ml).

114 Διαχωρισμός με χρωματογραφία στήλης σε πηκτή (gel) Μόρια μικρού ΜΒ Μόρια μεσου ΜΒ Μόρια μεγάλου ΜΒ Διάμετρος πόρου 100μm Πορεία έκλουσης Στήλη με υλικό πλήρωσης πολυσακχαρίτες: δεξτράνη, αγαρόζη

115 άλας πρωτεΐνη

116

117 Διαχωρισμός με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Κυτταρίνη ή αγαρόζη + CH 2 CH 2 NH C 2 H 5 C 2 H 5 Διαιθυλοαμινοαιθυλο (DEAE) ομάδα Κυτταρίνη ή αγαρόζη CH 2 C O - O Kαρβοξυμεθυλο (CM) ομάδα + Θετικά φορτισμένη πρωτεΐνη - Αρνητικά φορτισμένη πρωτεΐνη

118 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ - Ιοντοανταλλάκτες: Ανάλογα με το είδος των φορτισμένων ομάδων διακρίνονται σε κατιοντοανταλάκτες και ανιοντοανταλλακτές Σε ph διαλύματος < pi: Το συνολικό φορτίο του ενζύμου είναι θετικό. Προσροφάται σε αρνητικά φορτισμένο κατιοντοανταλλάκτη (cation exchanger) Σε ph διαλύματος > pi: Το συνολικό φορτίο του ενζύμου είναι αρνητικό. Προσροφάται σε θετικά φορτισμένο ανιοντοανταλλάκτη (anion exchanger)

119 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Χαρακτηριστική ομάδα (συμβολισμός) Kaτιοντοανταλλάκτης Χημικός τύπος Μεθυλοκαρβοξυλική (CM) -ΟCH 2 COO - Oρθοφωσφορική (P) -O-PO 3 H - Mεθυλοσουλφονική (S) -ΟCH 2 SO - 3 Προπυλοσουλφονική (SP) -Ο(CH 2 ) 3 SO3 - Ανιοντοανταλλάκτης Αιθυλαμίνη (ΑΕ) -OCH 2 CH 2 NH + 3 Διαιθυλοαιθυλαμίνη (DEAE) -OCH 2 CH 2 NH + (CH 2 CH 3 ) 2 Διαιθυλο(2-υδροξυπρόπυλο) αιθυλαμίνη (QAE) -CH 2 CH 2 N + (CH 2 CH 3 ) 2 CH 2 CH(OH)CH 3

120 προσρόφηση Έκλουση Η έκλουση γίνεται: με αύξηση της συγκέντρωσης άλατος (NaCl) με μεταβολή του ph

121 Σε διάλυμα με ph 7.0 υπάρχουν 3 πρωτεΐνες (Α, Β, Γ) που θέλετε να διαχωρίσετε με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Η πρωτεΐνη Α έχει μοριακό βάρος Da και ισοηλεκτρικό σημείο pi 6.5, η πρωτεΐνη Β έχει μοριακό βάρος Da και ισοηλεκτρικό σημείο pi 8.5, η πρωτεΐνη Γ έχει μοριακό βάρος Da και ισοηλεκτρικό σημείο pi 5.5. Με ποια σειρά πιστεύεται ότι η θα εκλουθούν από τη χρωματογραφική στήλη.

122 Με ποια σειρά πιστεύεται ότι, οι πρωτεΐνες του παραπάνω διαλύματος θα εκλουθούν από χρωματογραφική στήλη η οποία φέρει υλικό DEAE-Sephadex (-OCH 2 CH 2 NH + (CH 2 CH 3 ) 2 ) χρωματογραφία ιοντοανταλαγής. Το διάλυμα της κινητής φάσης θα έχει και αυτό ph 7.0

123 Χρωματογραφία συγγένειας affinity chromatography Yψηλός βαθμός καθαρότητας των ενζύμων και πρωτεϊνών Αδιάλυτος φορέας Πρωτεΐνη-στόχος ΣΥΝΔΕΣΗ ΕΚΠΛΥΣΗ Ομοιοπολικά συνδεδεμένος δεσμευτής Πρωτεΐνες Απομάκρυνση άλλων πρωτεϊνών ΕΚΡΟΦΗΣΗ

124 Δεσμευτής Εφαρμογή Συνθετικοί δεσμευτές DNA εκλεκτικής ή πολυεκλεκτικής αλληλουχίας Απομόνωση περιοριστικών ενδονουκλεασών Συνθετικές τριαζινο-χρωστικές (όπως το Cibacron blue 3GA) Συνθετικές βιομιμητικές χρωστικές Βιομηχανική εφαρμογή σε ένζυμα νουκλεοτιδίων, δεϋδρογονάσες, κινάσες κλπ. Εξειδικευμένοι δεσμευτές Λεκτίνες (όπως η κονκαναβαλίνη Α) Αναγνωρίζουν τη πολυσακχαριτική περιοχή γλυκοπρωτεϊνών Φαινυλαμινοβορικό οξύ Αναγνωρίζουν τη πολυσακχαριτική περιοχή γλυκοπρωτεϊνών ΙgG Αναγνωρίζει τμήμα της πρωτεΐνης Α.(από S. aureus) το οποίο μπορεί να συνδεθεί (μέσω της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA) σε πρωτεΐνες στόχους Μεταλλοχηλικά σύμπλοκα Δέσμευση πρωτεϊνών μέσω του ιμιδαζολίου της ιστιδίνης

125

126 Απομόνωση ετερόλογων πρωτεϊνών Ο επίτοπος 6His εμφανίζει εξαιρετικά υψηλή συγγένεια με μεταλλικά ιόντα όπως το Ni +2, Cu +2, Zn +2 με τα οποία σχηματίζει χηλικά σύμπλοκα. Την ιδιότητα αυτή την εκμεταλλευόμαστε για τον καθαρισμό ενζύμων με χρωματογραφία συγγένειας.

127 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ: ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΟΥ ΔΕΣΜΕΥΤΗ - Υδρόφοβοι Αυξάνεται Μειώνεται - Ομάδες ιοντοανταλλαγής α) το κόστος α) Η σταθερότης του δεσμευτή - Ενεργές χρωστικές β) Η διαχωριστική ικανότης - Συνενζυμα, ανάλογα υποστρωμάτων β) Ο ολικός αριθμός σταδίων απομόνωσης - Αντισώματα

128 Υδρόφοβη χρωματογραφία Βασίζεται στις ασθενείς αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ υδρόφοβων ομάδων του χρωματογραφικού φορέα με υδρόφοβες περιοχές στην επιφάνεια του πρωτεϊνικού μορίου Έκλουση μείωση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων η οποία επιτυγχάνεται μείωση της συγκέντρωσης του άλατος στο διάλυμα μείωση της θερμοκρασίας μείωση της πολικότητας του διαλύματος

129 Στη χρωματογραφία υδρόφοβων περιοχών οι υδρόφοβες ομάδες του φορέα (στατική φάση) αλληλεπιδρούν με τις υδρόφοβες ομάδες των αμινοξέων των βιομορίων. Ποια από τα παρακάτω αμινοξέα θα τα χαρακτηρίζατε υδρόφοβα.

130 Τελικό Στάδιο Μορφοποίησης Προϊόντος Απομάκρυνση μικρομοριακών ουσιών (π.χ υπερδιήθηση) Προσθήκη σταθεροποιητών ενζυμικής ενεργότητας (γλυκερόλη, άλατα, υπόστρωμα, αλβουμίνη ) ΛΥΟΦΥΛΙΩΣΗ Ποιοτικός έλεγχος πρωτεϊνών (ανάλογα με τις προδιαγραφές χρήσεις) Μορφοποίηση

131 Διήθηση Η αρχή της διήθησης βασίζεται στη διαφορά μεγέθους μεταξύ των πόρων του ηθμού (φίλτρου) και των προς διήθηση ουσιών

132 Διήθηση μέσω μεμβρανών Σωματίδια με μέγεθος μικρότερο από τους πόρους της μεμβράνης, διέρχονται υπό την επίδραση πίεσης ή και άλλης δύναμης; μέσα από τη μεμβράνη ενώ μεγαλύτερα σωματίδια κατακρατούνται και παραμένουν στο αρχικό υλικό.

133 Τεχνικές διαχωρισμού με βάση τη διήθηση μικροδιήθηση (microfiltration) η υπερδιήθηση (ultrafiltration)

134 Διεργασία Κατευθυντήρια δύναμη Εφαρμογές Μικροδιήθηση Υδροστατική πίεση Διαφορά πίεσης 0.5-2bar Συμπύκνωση βακτηρίων και ιών-διαχωρισμός κυττάρων Υπερδιήθηση Διαφορά πίεσης 2-10bar Διαχωρισμός βιομορίων Καθαρισμός ενζύμων Αφαλάτωση Αντίστροφη Ώσμωση Διαφορά πίεσης bar Συμπύκνωση φαρμακευτικών προϊόντων Παραγωγή λακτόζης Hλεκτροδιαπίδυση Διαφορά στο ηλεκτρικό πεδίο Καθαρισμός μικρών φορτισμένων ενώσεων όπως τα οργανικά οξέα Υπερεξάτμιση Διαφορά στη μερική πίεση ατμών Εκλεκτική απομάκρυνση διαλυτών (αιθανόλη) κατά τη ζύμωση Καθαρισμός διαλυτών από αζεοτροπικά μίγματα Υπερεκχύλιση Κατανομή μεταξύ φάσεων Εκχύλιση μικρών μορίων από υδατικά/οργανικά διαλύματα

135 Υπερδιήθηση Διάλυμα πρωτεΐνης Ημιπερατή μεμβράνη διήθημα

136

137 Διατήρηση μέσω λυοφιλίωσης (ξήρανση εν ψυχρώ) Το νερό αφαιρείται με εξάχνωση και όχι με εξάτμιση. Η διαδικασία περιλαμβάνει 3 στάδια: i) στάδιο ψύξης του διαλύματος της πρωτεΐνης (< 0 ο C), ii) στάδιο κύριας ξήρανσης σε θερμοκρασία π.χ. -40 ο C και σε χαμηλή πίεση iii) στάδια δευτερεύουσας ξήρανσης όπου η θερμοκρασία αυξάνεται σταδιακά στους 20 ο C. H λυοφιλίωση γίνεται συνήθως παρουσία λυοπροστατευτικών (π.χ σάκχαρα, αλβουμίνη) τα οποία βοηθούν στην προστασία της φυσικής δομής της πρωτεΐνης.

138

139 Σταθεροποίηση ενζύμων σταθερότητα αποθήκευσης, λειτουργική σταθερότητα Αύξηση της ενζυμικής σταθερότητας μέσω: Ακινητοποίησης σε κάποιο στερεό φορέα με φυσικές ή χημικές μεθόδους Πρωτεϊνικής μηχανικής (protein engineering), τροποποίηση της δομής των ενζύμων με ενζυμικές ή χημικές μεθόδους, καθώς και μεθόδους της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA Μηχανικής του μέσου (medium engineering), έλεγχος του περιβάλλοντος του ενζύμου και κατά συνέπεια των ιδιοτήτων του και της σταθερότητάς του με βάση τις φυσικοχημικές ιδιότητες του μέσου.