ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ. Επίδραση θερµικά ξηρανθεισών αρχικών καλλιεργειών στην ωρίµανση σκληρών τυριών ΚΑΤΕΧΑΚΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Επίδραση θερµικά ξηρανθεισών αρχικών καλλιεργειών στην ωρίµανση σκληρών τυριών ΚΑΤΕΧΑΚΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, M.Sc. ΠΑΤΡΑ 2010

2

3 «Στους γονείς µου οφείλω το ζην στον διδάσκαλό µου το ευ ζην» Μ. Αλέξανδρος

4

5 Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την εξεταστική επιτροπή δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα (Ν. 5343/1932, άρθρο 202)

6

7 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κουτίνας Αθανάσιος, Καθηγητής (Επιβλέπων Τµήµα Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών) Κανελλάκη Μαρία, Καθηγήτρια (Μέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Τµήµα Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών) Σουπιώνη Μαγδαληνή, Επίκουρος Καθηγήτρια (Μέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Τµήµα Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών) Κοντοµηνάς Μιχαήλ, Καθηγητής (Τµήµα Χηµείας Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων) Κωµαΐτης Μιχαήλ, Καθηγητής (Τµήµα Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων Γεωπονικού Πανεπιστηµίου Αθηνών) Μπεζιρτζόγλου Ευγενία, Καθηγήτρια (Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης ηµοκρίτειου Πανεπιστηµίου Θράκης) Μπεκατώρου Αργυρώ, Λέκτορας (Τµήµα Χηµείας Πανεπιστηµίου Πατρών)

8

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα ιδακτορική ιατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Χηµείας του Πανεπιστηµίου Πατρών. Θέµα της διατριβής ήταν η επίδραση θερµικά ξηρανθεισών αρχικών καλλιεργειών στην ωρίµανση σκληρών τυριών. Στο πρώτο µέρος γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση και προσδιορίζονται οι στόχοι της ιδακτορικής ιατριβής. Στο δεύτερο µέρος περιγράφονται τα υλικά και οι µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν ενώ στη συνέχεια παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα και αναφέρονται τα κυριότερα συµπεράσµατα της διατριβής. Στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής βοήθησαν πολλοί και αξιόλογοι άνθρωποι µε τους οποίους είχα την τύχη να συναναστραφώ και να συνεργαστώ. Θα ήθελα λοιπόν να τους ευχαριστήσω για την υλική και ηθική στήριξη που µου παρείχαν. Καταρχήν θέλω να ευχαριστήσω τον επιβλέποντά µου, Καθηγητή κ. Αθανάσιο Κουτίνα, για την καθοδήγηση και την εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό µου καθ όλη την περίοδο της παραµονής µου στο Εργαστήριο. Η συµβολή του στην υλοποίηση της διατριβής, από την ανάθεση του θέµατος µέχρι την ολοκλήρωσή της, υπήρξε καθοριστική. Τις θερµότερές µου ευχαριστίες θέλω επίσης να απευθύνω στην Καθηγήτρια κ. Μαρία Κανελλάκη και στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαγδαληνή Σουπιώνη, µέλη της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για την επιστηµονική και ανθρώπινη υποστήριξή τους κατά τη διάρκεια της διδακτορικής µου εργασίας. Ακόµη, ευχαριστώ τα υπόλοιπα µέλη της Επταµελούς Επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Μιχαήλ Κοντοµηνά, τον Καθηγητή κ. Μιχαήλ Κωµαΐτη, την Καθηγήτρια κ. Ευγενία Μπεζιρτζόγλου και τη Λέκτορα κ. Αργυρώ Μπεκατώρου, για τις πολύτιµες συµβουλές και υποδείξεις τους, για το ενδιαφέρον τους καθώς και για τη συµβολή τους στην τελική µορφή του κειµένου. Ευχαριστώ πολύ την γαλακτοβιοµηχανία ΑΒΙΓΑΛ Α.Ε. για τη συνεργασία και τη διάθεση των πρώτων υλών που χρησιµοποίησα στην έρευνά µου. Τη Γενική Γραµµατεία Έρευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ) για τη χρηµατοδότησή µου στο πλαίσιο του προγράµµατος ΠΕΠ υτικής Ελλάδας

10 Το Λέκτορα κ. Ιωάννη Κουρκουτά και τον ρ. Παναγιώτη Πανά για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους και τη βοήθειά τους στη συγγραφή των δηµοσιεύσεων. Οφείλω επίσης να ευχαριστήσω τους φίλους και συναδέλφους στο Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων για τη συµπαράσταση και τη σηµαντική βοήθεια που µου προσέφεραν. Ευχαριστώ µέσα από την καρδιά µου το σύζυγό µου ρ. Κωνσταντίνο Γιαννούλη για τη ψυχολογική στήριξη κατά τη διάρκεια της διδακτορικής µου εργασίας. Τον ευχαριστώ για την υποµονή και την κατανόηση που έδειξε, που µοιραζόταν τις συγκινήσεις και τη χαρά µου και που ήταν πάντα δίπλα µου σε ότι και αν συνέβαινε. Τέλος, πολλές ευχαριστίες θέλω να εκφράσω στους γονείς και την αδερφή µου για την απέραντη αγάπη και στήριξη που µου προσφέρουν. Οι αρχές που µου δίδαξαν και τα εφόδια που µου παρείχαν µε βοήθησαν να γίνω καλύτερος άνθρωπος και να πραγµατοποιήσω τα όνειρά µου.

11 Περιεχόµενα Κεφάλαιο 1. Εισαγωγή 1.1. Λειτουργικά τρόφιµα Προβιοτικοί µικροοργανισµοί και τρόφιµα Περιγραφή των προβιοτικών µικροοργανισµών Περιγραφή των πριβιοτικών ουσιών Κριτήρια επιλογής των προβιοτικών µικροοργανισµών Θετικές επιδράσεις των προβιοτικών µικροοργανισµών Μικροοργανισµοί των προϊόντων γάλακτος Λακτοβάκιλλοι (Lactobacillus spp.) Χρήση των λακτοβακίλλων στα τρόφιµα Ζύµες Χρήση των ζυµών στα τρόφιµα Αλληλεπιδράσεις ζυµών-βακτηρίων στα τρόφιµα Κεφίρ Ακινητοποίηση κυττάρων Υποστρώµατα ακινητοποίησης κυττάρων Τα ακινητοποιηµένα κύτταρα στα γαλακτοκοµικά προϊόντα Ξήρανση µικροοργανισµών Λυοφιλίωση Βιοµηχανική λυοφιλίωση Θερµική ξήρανση Παραδοσιακά Τυριά Μεταβολές των τυριών κατά την ωρίµανση Μικροοργανισµοί Η γλυκόλυση στην τυροκόµηση Η πρωτεόλυση στην τυροκόµηση Η λιπόλυση στην τυροκόµηση Αρχικές καλλιέργειες τυριών Κριτήρια επιλογής των αρχικών καλλιεργειών Άρωµα τυριών

12 1.13. Περιγραφή του GC/MS Κεφάλαιο 2. Στόχοι της διατριβής 2.1. Στόχοι της διατριβής Κεφάλαιο 3. Πειραµατικό µέρος 3.1. Υλικά Θρεπτικά υποστρώµατα και αντιδραστήρια Πρώτες ύλες Όργανα Μηχανολογικός εξοπλισµός pilot plant Μέθοδοι Παραγωγή βιοµάζας αρχικών καλλιεργειών Κεφίρ Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Lactobacillus helveticus Kluyveromyces marxianus Ακινητοποίηση αρχικών καλλιεργειών Αποµόνωση καζεΐνης Μέθοδος ακινητοποίησης µικροοργανισµών Ξήρανση αρχικών καλλιεργειών Λυοφιλίωση Ξήρανση µε θέρµανση Μικροβιολογικές αναλύσεις τυριών Χηµικές αναλύσεις τυριών Προσδιορισµός ph Προσδιορισµός υγρασίας Προσδιορισµός ολικού αζώτου Προσδιορισµός υδατοδιαλυτού αζώτου Προσδιορισµός συντελεστή ωρίµανσης

13 Προσδιορισµός οξύτητας Προσδιορισµός σακχάρων και γλυκερόλης µε Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) Προσδιορισµός αιθανόλης µε Αέρια Χρωµατογραφία (GC) Ηµιποσοτικός προσδιορισµός πτητικών ενώσεων µε µικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME) - Αέρια Χρωµατογραφία/Φασµατοσκοπία Μάζας (GC/MS) Προετοιµασία δείγµατος ειγµατοληψία SPME Αεροχρωµατογραφικός διαχωρισµός των πτητικών συστατικών Ταυτοποίηση των πτητικών συστατικών Οργανοληπτική δοκιµασία Στατιστική επεξεργασία Παρασκευή σκληρών τυριών µε ξηρές αρχικές καλλιέργειες Κεφαλογραβιέρα Αρχικές καλλιέργειες Ανάλατο τυρί Παρασκευή σκληρών τυριών σε pilot plant Παραγωγή της βιοµάζας κεφίρ Ξήρανση της βιοµάζας κεφίρ Παρασκευή κεφαλογραβιέρας Συνθήκες ωρίµανσης ειγµατοληψία τυριών Αποτελέσµατα και συζήτηση Κεφάλαιο Παρασκευή σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια λυοφιλιωµένου κεφίρ Mικροβιολογικά χαρακτηριστικά Χηµικά χαρακτηριστικά Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων

14 Κεφάλαιο Παρασκευή σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια κεφίρ µετά από θερµική ξήρανση Mικροβιολογικά χαρακτηριστικά Χηµικά χαρακτηριστικά Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων. 104 Κεφάλαιο Παρασκευή σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια L. casei µετά από θερµική ξήρανση Μικροβιολογικά χαρακτηριστικά Χηµικά χαρακτηριστικά Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων..112 Κεφάλαιο Παρασκευή σκληρών τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. bulgaricus ή L. helveticus και K. marxianus µετά από θερµική ξήρανση Μικροβιολογικά χαρακτηριστικά των τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. bulgaricus και K. marxianus Χηµικά χαρακτηριστικά των τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. bulgaricus και K. marxianus Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. bulgaricus και K. marxianus Μικροβιολογικά χαρακτηριστικά των τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. helveticus και K. marxianus Χηµικά χαρακτηριστικά των τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. helveticus και K. marxianus Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. helveticus και K. marxianus Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων..124 Κεφάλαιο Παρασκευή και ωρίµανση ανάλατων σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια κεφίρ και L. bulgaricus µετά από θερµική ξήρανση

15 Μικροβιολογικά χαρακτηριστικά Χηµικά χαρακτηριστικά Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων Αξιολόγηση των καλλιεργειών Κεφάλαιο Παρασκευή σκληρών τυριών σε pilot plant Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων..143 Κεφάλαιο Επίδραση των αρχικών καλλιεργειών στα πτητικά συστατικά των σκληρών τυριών Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσµάτων Κεφάλαιο Συµπεράσµατα Παρασκευή σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια λυοφιλιωµένου κεφίρ Παρασκευή σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια κεφίρ µετά από θερµική ξήρανση Παρασκευή σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια L. casei µετά από θερµική ξήρανση Παρασκευή σκληρών τυριών µε µεικτή αρχική καλλιέργεια L. bulgaricus ή L. helveticus και K. marxianus µετά από θερµική ξήρανση Παρασκευή και ωρίµανση ανάλατων σκληρών τυριών µε αρχική καλλιέργεια κεφίρ και L. bulgaricus µετά από θερµική ξήρανση Παρασκευή σκληρών τυριών σε pilot plant Επίδραση των αρχικών καλλιεργειών στα πτητικά συστατικά των σκληρών τυριών Γενικό συµπέρασµα..158 Περίληψη Abstract..163 Κεφάλαιο 12 Βιβλιογραφία

16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Εισαγωγή

17 2

18 1.1. Λειτουργικά τρόφιµα Με τον όρο «λειτουργικά» (functional foods ή nutraceuticals), χαρακτηρίζουµε όλα εκείνα τα τρόφιµα τα οποία έχουν ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία επιπλέον της διατροφικής τους αξίας. Τα τρόφιµα αυτά είναι φυσικά, δηλαδή τρόφιµα της καθηµερινής µας διατροφής που δεν είναι γενετικά τροποποιηµένα, ή εµπλουτισµένα µε ωφέλιµα συστατικά όπως είναι οι βιταµίνες (Hasler, 1998; German et al., 1999; McLellan, 2000). Ο όρος λειτουργικά τρόφιµα ορίστηκε στην Ιαπωνία στα τέλη της δεκαετίας του Το ενδιαφέρον για τα λειτουργικά τρόφιµα αυξήθηκε σηµαντικά κατά τη δεκαετία του 1990 λόγω της µεγάλης ευαισθητοποίησης των λαών σε θέµατα υγείας αλλά και των νέων επιστηµονικών δεδοµένων που επικεντρώνουν το ενδιαφέρον στην κρίσιµη σχέση ανάµεσα στη δίαιτα και την υγεία. Οι καταναλωτές άρχισαν να βλέπουν τη διατροφή τους σαν µέσο όχι µόνο για να καλύψουν τις ανάγκες του οργανισµού για θρεπτικά συστατικά όπως οι βιταµίνες και τα ιχνοστοιχεία αλλά και για την πρόληψη από διάφορες ασθένειες που σχετίζονται κυρίως µε την ηλικία όπως είναι ο καρκίνος, οι καρδιαγγειακές παθήσεις, η οστεοπόρωση, η αρθρίτιδα και τα οφθαλµολογικά νοσήµατα (Hasler, 2000; Ashwell, 2001). Η στρατηγική για την έρευνα και την ανάπτυξη ενός λειτουργικού τροφίµου απαιτεί την απόδειξη της αλληλεπίδρασης µε συγκεκριµένες λειτουργίες στον ανθρώπινο οργανισµό, την κατανόηση του µηχανισµού δράσης του και την απόδειξη του αποτελέσµατος του λειτουργικού τροφίµου σε συγγενή βιολογικά συστήµατα. Για το σχηµατισµό µιας ορθής υπόθεσης είναι απαραίτητη η διεξαγωγή διατροφικών µελετών στον άνθρωπο (Roberfroid, 1998). ιάφορα συστατικά ζωικών ή φυτικών λειτουργικών τροφίµων βρίσκονται σε ερευνητικό στάδιο σε ότι αφορά το ρόλο των τροφίµων στην πρόληψη των ασθενειών και τη βελτίωση της υγείας. Ορισµένα τέτοια συστατικά είναι οι πολυφαινόλες (Klatsky et al., 1997; Sacco et al., 1999; Tjonneland et al., 1999), οι ισοφλαβόνες της σόγιας (Anderson et al., 1995) και τα καροτενοειδή (Giovannucci, 1999; Arab and Steck, 2000; Gale et al., 2001; Liu et al., 2001). Τα βακτήρια που χρησιµοποιούνται στα τρόφιµα σαν αρχικές καλλιέργειες παράγουν µε τη σειρά τους αρκετά από τα παραπάνω συστατικά. Για παράδειγµα, κάποια οξυγαλακτικά βακτήρια που χρησιµοποιούνται σαν αρχικές καλλιέργειες στο γιαούρτι, όπως ο Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus και ο Streptococcus thermophilus, µπορούν να παράγουν βιταµίνες, όπως το φολικό οξύ, αποτελώντας 3

19 έτσι υπόστρωµα για την παραγωγή εµπλουτισµένων γαλακτοκοµικών προϊόντων µε φολικό οξύ (Wouters et al., 2002). Επίσης, κάποια οξυγαλακτικά βακτήρια, όπως ο L. helveticus, προκαλούν διάσπαση των πρωτεϊνών του γάλακτος σε µικρού µοριακού βάρους πεπτίδια, µερικά από τα οποία είναι βιολογικά ενεργά και ονοµάζονται βιοπεπτίδια. Τα πεπτίδια αυτά έχουν συσχετιστεί µε τη βελτίωση της απορρόφησης µετάλλων, και ειδικότερα του ασβεστίου, στον γαστρεντερικό σωλήνα και την ενίσχυσή του ανοσοποιητικού συστήµατος (Meisel and Bockelmann, 1999) Προβιοτικοί µικροοργανισµοί και τρόφιµα Περιγραφή των προβιοτικών µικροοργανισµών Αρκετοί ωφέλιµοι µικροοργανισµοί είναι εγκατεστηµένοι στον γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου. Οι οργανισµοί FAO/WHO (2002) ορίζουν τα προβιοτικά ως ζωντανούς µικροοργανισµούς οι οποίοι όταν χορηγούνται σε κατάλληλες ποσότητες βελτιώνουν την υγεία του ξενιστή. Σύµφωνα µε τον Fuller (1989), προβιοτικό είναι ένα συµπλήρωµα διατροφής µε ζωντανά µικρόβια, το οποίο επιδρά θετικά στο ξενιστή ζώο, βελτιώνοντας τη µικροβιακή ισορροπία του εντέρου του. Σύµφωνα µε τους Huis in t Veld και Havenaar (1991) τα προβιοτικά ορίζονται ως απλές ή µεικτές καλλιέργειες ζωντανών µικροοργανισµών, οι οποίες όταν χορηγηθούν σε άνθρωπο ή σε ζώο επιδρούν θετικά βελτιώνοντας τις ιδιότητες της ενδογενούς τους µικροχλωρίδας. Σύµφωνα µε οµάδα επιστηµόνων υπό την αιγίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης (Salminen et al., 1998), ως «προβιοτικά» ορίζονται τα συστατικά των τροφίµων που αποτελούνται από ζωντανούς µικροοργανισµούς και δρουν ευεργετικά στην υγεία. Πρόσφατα, τα προβιοτικά χαρακτηρίστηκαν ως ζωντανοί µικροοργανισµοί που παρουσιάζουν αντοχή στις γαστρικές, χολικές και παγκρεατικές εκκρίσεις, προσκολλώνται στα επιθηλιακά κύτταρα και δηµιουργούν αποικίες στο έντερο του ανθρώπου (Del Piano et al., 2006). Έτσι, ο ορισµός των προβιοτικών άλλαξε από την αρχική του περιγραφή ως ζωντανή καλλιέργεια που επιδρά θετικά στην υγεία του ξενιστή επηρεάζοντας τη µικροβιακή ισορροπία του εντέρου του, και εξελίχτηκε στη συνέχεια µε το να συµπεριλαµβάνει και κλινικές επιδράσεις (Isolauri et al., 2004). Οι καλλιέργειες και το γάλα µε προβιοτικές ιδιότητες που έχουν υποστεί ζύµωση έχουν µια µακρά ιστορική διαδροµή. Στη Βίβλο υπάρχουν αρκετές αναφορές στα όξινα γάλατα, ενώ το 1908 ο Metchnikoff αναφέρεται στη διατροφή των 4

20 Βουλγάρων, η οποία περιλάµβανε γιαούρτι εµπλουτισµένο µε λακτοβάκιλλους, και τη συσχέτιζε µε την παράταση του χρόνου ζωής (Azizpour et al., 2009). Συνήθως, ως προβιοτικές καλλιέργειες χρησιµοποιούνται γαλακτικά βακτήρια, αλλά έχει ξεκινήσει σήµερα η χρήση και άλλων µικροοργανισµών όπως η ζύµη Saccharomyces boulardii. Μικροοργανισµοί που συνήθως χρησιµοποιούνται ως προβιοτικές καλλιέργειες δίνονται στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Είδη µικροοργανισµών που χρησιµοποιούνται ως προβιοτικά (Shortt, 1999). Λακτοβάκιλλοι Bifidobacteria Άλλα γαλακτικά Άλλοι µικροοργανισµοί βακτήρια Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium animalis Enterococcus Escherichia coli faecium Lactobacillus casei Bifidobacterium breve Saccharomyces boulardii Lactobacillus johnsonii Bifidobacterium infantis Clostridium butyricum Lactobacillus reuteri Bifidobacterium longum Lactobacillus rhamnosus Bifidobacterium adolescentis Lactobacillus salvarius Bifidobacterium lactis Lactobacillus plantarum Bifidobacterium bifidum Lactobacillus crispatus Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί είναι συνήθως ανθρώπινης προέλευσης και δεν είναι παθογόνοι. Είναι απαραίτητο να διατηρούν τη ζωτικότητά τους κατά τη διάρκεια των τεχνολογικών διεργασιών που υφίσταται το τρόφιµο αλλά και κατά τη διάρκεια της διέλευσής τους από το γαστρεντερικό σωλήνα. Επίσης, είναι επιθυµητή η ακινητοποίησή τους στο επιθήλιο του εντέρου, η ανταγωνιστική δράση έναντι των παθογόνων µικροοργανισµών καθώς και η ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικές ουσίες. Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί διατηρούνται ζωντανοί όταν βρίσκονται σε λυοφιλιωµένη µορφή καθώς και όταν εµβολιάζονται σε ζυµωµένα γαλακτοκοµικά προϊόντα. Η περισσότερο αποδεκτή µορφή χορήγησης των προβιοτικών µικροοργανισµών από τους καταναλωτές είναι αυτοί να περιέχονται σε ζυµωµένα τρόφιµα και αναψυκτικά, όπως ζυµωµένα προϊόντα γάλακτος (Lee and Salminen, 1995). Εκτός των γαλακτοκοµικών προϊόντων, εξετάζεται η προσθήκη προβιοτικών µικροοργανισµών σε τρόφιµα που δεν περιέχουν γάλα, όπως ειδικές τροφές για 5

21 βρέφη, παιδικές τροφές, χυµοί φρούτων που έχουν υποστεί ζύµωση, ζυµωµένα προϊόντα σόγιας και προϊόντα µε βάση τα δηµητριακά, όπως ζυµωµένα προϊόντα βρώµης. Σήµερα, τα προβιοτικά προϊόντα διευρύνουν διαρκώς το µερίδιό τους στην αγορά, κυρίως στις ανεπτυγµένες χώρες της Ευρώπης, της Ιαπωνίας, της Αυστραλίας και της Αµερικής. Στην Ευρώπη, ο τοµέας των γαλακτοκοµικών καταλαµβάνει το µεγαλύτερο µέρος στην αγορά των προβιοτικών. Τα προϊόντα µε τη µεγαλύτερη κατανάλωση είναι τα προβιοτικά γιαούρτια και τα προϊόντα γάλακτος που έχουν υποστεί ζύµωση. Μερικά από τα προβιοτικά τρόφιµα περιέχουν επιπλέον βιοενεργά συστατικά όπως φυτικές στανόλες και στερόλες που µειώνουν τα επίπεδα της χοληστερόλης (Hilliam, 1998) Περιγραφή των πριβιοτικών ουσιών Οι πριβιοτικές ουσίες (prebiotics) είναι τα µη πεπτόµενα συστατικά ενός τροφίµου, τα οποία επιδρούν θετικά στην υγεία του ξενιστή, τροποποιούν την ισορροπία της εντερικής µικροχλωρίδας και διεγείρουν επιλεκτικά την ανάπτυξη ή/και την δραστηριότητα ενός ή περισσοτέρων µικροοργανισµών του εντέρου (Grittenden, 1999; Klaenhammer, 2001; Manning and Gibson, 2004). Οι πριβιοτικές ουσίες τροποποιούν τη σύνθεση της µικροχλωρίδας του εντέρου, έτσι ώστε να ευνοηθεί η ανάπτυξη των πιθανών προβιοτικών µικροοργανισµών και να αποτελέσουν την κύρια χλωρίδα (Roberfroid, 1998; Zimmer and Gibson, 1998). Επιπλέον αναστέλλουν την ανάπτυξη ανεπιθύµητων µικροοργανισµών (Grittenden, 1999). Ολιγοσακχαρίτες, όπως εκείνοι που περιέχουν µαννόζη, επιδρούν ευνοϊκά στην ανάπτυξη των προβιοτικών µικροοργανισµών και περιορίζουν την επιφάνεια ακινητοποίησης, που στην αντίθετη περίπτωση θα είχε καταληφθεί από παθογόνους µικροοργανισµούς, όπως η E. coli. Ως πριβιοτικές ουσίες χρησιµοποιούνται µε επιτυχία κυρίως ολιγοσακχαρίτες που περιέχουν φρουκτόζη. Είναι επίσης δυνατή η χρησιµοποίηση και άλλων ολιγοµερών από αλκοόλες συγκεκριµένων σακχάρων, η λακτουλόζη, η σόγια και η µαλτόζη καθώς και ολιγοσακχαρίτες που περιέχουν ξυλόζη, µαννόζη και γαλακτόζη (Gibson, 1998). Επιπλέον εξετάζεται το µέλι ως πριβιοτικό τρόφιµο για την ενίσχυση της ανάπτυξης των προβιοτικών µικροοργανισµών (Ustunol and Gandhi, 2001; Kajiwara et al., 2002; Macedo et al., 2008). Οι κυριότερες ουσίες που χρησιµοποιούνται ως πριβιοτικές παρουσιάζονται 6

22 στον πίνακα 2 (Roberfroid, 2000; Probert et al., 2004; Grajek et al., 2005; Macedo et al., 2008). Πίνακας 2. Ουσίες και τρόφιµα που χρησιµοποιούνται ως πριβιοτικά. ισακχαρίτες Λακτουλόζη Λακτιτόλη Ολιγοσακχαρίτες Φρουκτοολιγοσακχαρίτες Γαλακτοολιγοσακχαρίτες Ολιγοσακχαρίτες της σόγιας Μη πεπτόµενοι ολιγοσακχαρίτες (ξυλοολιγοσακχαρίτες, ισοµαλτοολιγοσακχαρίτες, λακτοσουκρόζη, παλατινόζη) Πολυσακχαρίτες Ινουλίνη Οι πριβιοτικοί ολιγοσακχαρίτες µπορούν να παραχθούν µε τρεις διαφορετικούς τρόπους. (i) Με λήψη από φυτικές πρώτες ύλες, (ii) µε βιοτεχνολογική παραγωγή ή ενζυµική σύνθεση και (iii) µε ενζυµική υδρόλυση πολυσακχαριτών (Crittenden and Playne, 1996; Gulewicz et al., 2003). Πολλοί πριβιοτικοί ολιγοσακχαρίτες παράγονται σε βιοµηχανική κλίµακα και διατίθενται στην αγορά. Έχουν γίνει αρκετές έρευνες και έχουν δοθεί αρκετά διπλώµατα ευρεσιτεχνίας στον τοµέα αυτό (Crittenden and Playne, 1996). Στην πράξη, εφαρµόζεται συνήθως η συνδυασµένη χρήση προβιοτικών και πριβιοτικών συστατικών εξαιτίας της συνεργιστικής τους δράσης στα τρόφιµα. Έτσι δηµιουργούνται τα συµβιωτικά (synbiotics) προϊόντα τα οποία ωφελούν τον καταναλωτή µέσω της επιβίωσης και της εγκατάστασης επιλεγµένων ζωντανών µικροοργανισµών στο πεπτικό σύστηµα (Schrezenmeir and de Vrese, 2001) Κριτήρια επιλογής των προβιοτικών µικροοργανισµών ιαφορετικά είδη προβιοτικών µικροοργανισµών καθώς και διαφορετικά στελέχη του ίδιου είδους, έχουν χαρακτηριστικές ιδιότητες οι οποίες επηρεάζουν σηµαντικά την επιβίωσή τους στα τρόφιµα, τις ζυµωτικές και προβιοτικές τους ιδιότητες (Klaenhammer, 2001). Η επιλογή των κατάλληλων κάθε φορά στελεχών 7

23 έχει ιδιαίτερη σηµασία τόσο για την συµπεριφορά της καλλιέργειας όσο και για την εκδήλωση των προβιοτικών ιδιοτήτων της (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Κριτήρια επιλογής µικροοργανισµών µε προβιοτικές ιδιότητες (Ouwehand et al., 1999; Klenhammer, 2001). Καταλληλότητα Ασφάλεια, µη τοξικότητα, µη παθογένεια, γενικά αναγνωρισµένο ως ασφαλές (GRAS) Προέλευση από τη φυσιολογική µικροχλωρίδα του οργανισµού Τεχνολογική καταλληλότητα Επαρκής ανάπτυξη Επιβίωση πληθυσµού (10 7 έως 10 9 cfu/g) Συντήρηση των επιθυµητών χαρακτηριστικών κατά την προετοιµασία και τη συντήρηση της καλλιέργειας Επιθυµητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στα τρόφιµα ιατήρηση φαινοτυπικών ιδιοτήτων Αντοχή Ικανότητα επιβίωσης, ανάπτυξης και µεταβολικής δραστικότητας σε συνθήκες in vivo Αντοχή στα χολικά άλατα Αντοχή σε χαµηλό ph και σε συνθήκες στοµαχιού (γαστρικό υγρό) Ικανότητα ανταγωνισµού µε τη φυσιολογική µικροχλωρίδα, ανθεκτικότητα στις βακτηριοσίνες καθώς και στις αντιµικροβιακές ουσίες που παράγονται από τη µικροχλωρίδα του εντέρου Ακινητοποίηση στο επιθήλιο του εντέρου Αντοχή στα αντιβιοτικά Επίδραση στην υγεία Ικανότητα έκφρασης µίας ή περισσότερων κλινικά αποδεδειγµένων ευεργετικών για την υγεία ιδιοτήτων Ανταγωνισµός στους παθογόνους µικροοργανισµούς Παραγωγή αντιµικροβιακών ουσιών Αντικαρκινικές-αντιφλεγµονώδεις ιδιότητες ιέγερση του ανοσοποιητικού συστήµατος και παραγωγή βιοενεργών ενώσεων 8

24 Παρά την αναφορά σε µεγάλο αριθµό κριτηρίων επιλογής στη βιβλιογραφία, υπάρχει ταύτιση απόψεων για τη διάκριση των σηµαντικότερων κριτηρίων στην επιλογή των προβιοτικών µικροοργανισµών. Αυτά είναι (i) η ανθρώπινη προέλευση των στελεχών, (ii) η ανθεκτικότητά τους σε οξύ και χολικά άλατα, (iii) η σταθερότητά τους στις τεχνολογικές επεξεργασίες του τροφίµου, (iv) η διατήρηση της ζωτικότητάς τους κατά τη συντήρηση του τροφίµου καθώς και (v) η ύπαρξη αποδεδειγµένων ευεργετικών στην υγεία αποτελεσµάτων (Shortt, 1999). Σύµφωνα µε τους οργανισµούς FAO/WHO (2002), οι σηµαντικότερες in vitro δοκιµές για την επιλογή προβιοτικών µικροοργανισµών είναι (α) η αντοχή στην οξύτητα του στοµάχου και στα χολικά άλατα, (β) η ακινητοποίηση στα επιθηλιακά κύτταρα, (γ) η αντιµικροβιακή δραστηριότητα έναντι δυνητικά παθογόνων µικροοργανισµών, (δ) η ικανότητα περιορισµού της ακινητοποίησης των παθογόνων µικροοργανισµών, (ε) η δραστικότητα στην υδρόλυση των χολικών αλάτων καθώς και (στ) η αντοχή στις φαρµακευτικές ουσίες στην περίπτωση που η χορήγηση των προβιοτικών µικροοργανισµών πραγµατοποιηθεί ενδοκολπικά (FAO/WHO, 2002). Ιδιαίτερα σηµαντικό για την αποτελεσµατικότητα του προβιοτικού µικροοργανισµού είναι το πέρασµά του από τον γαστρεντερικό σωλήνα. Κι αυτό επειδή το περιβάλλον του στοµάχου, µε την παρουσία του γαστρικού υγρού σαν άµυνα του οργανισµού στους µικροοργανισµούς, είναι πιθανόν να αποκλείσει τη µεταφορά των ζωντανών κυττάρων στο έντερο. Η προστασία και η επιβίωση της καλλιέργειας επιτυγχάνεται ως ένα βαθµό µε την προσθήκη τους σε γαλακτοκοµικά προϊόντα και µε την προσθήκη παραγόντων που εµποδίζουν τη µείωση του ph. Οι τεχνολογικές ιδιότητες των βακτηρίων παίζουν εξίσου σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή των προβιοτικών τροφίµων (Saarela et al., 2000). Στα πλαίσια αυτά πρέπει να προσδίδουν τα επιθυµητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στο προϊόν, ικανοποιητικούς ρυθµούς ζύµωσης, υψηλή βιωσιµότητα, τόσο κατά τις µεθόδους ξήρανσής τους, όπως είναι η λυοφιλίωση, όσο και κατά την παραγωγή των τροφίµων. Επίσης πρέπει να παρουσιάζουν σταθερότητα στη µακρόχρονη αποθήκευσή τους (Grajek et al., 2005). Τα κριτήρια επιλογής που εξετάζουν την αντοχή των µικροοργανισµών, την ακινητοποίησή τους στο έντερο, τις αντικαρκινικές ιδιότητες και τη διέγερση του ανοσοποιητικού συστήµατος, είναι ιδιαίτερα σύνθετα επειδή οι µηχανισµοί µε τους οποίους οι µικροοργανισµοί εκφράζουν τις συγκεκριµένες ιδιότητες δεν έχουν µελετηθεί επαρκώς. Έτσι, είναι δύσκολο τη συγκεκριµένη χρονική στιγµή να οριστούν οι χαρακτήρες των προβιοτικών µικροοργανισµών που 9

25 συνδέονται µε τα παραπάνω κριτήρια. Η µελέτη των µηχανισµών που συνδέουν τα χαρακτηριστικά των µικροοργανισµών σε συνθήκες in vitro µε την λειτουργικότητά τους σε συνθήκες in vivo, αποτελεί τον κύριο µελλοντικό τοµέα έρευνας για τους προβιοτικούς µικροοργανισµούς (Mattila-Sandholm et al., 2002; Olejnik et al., 2003; Lewandowska et al., 2005) Θετικές επιδράσεις των προβιοτικών µικροοργανισµών Ο ρόλος της εντερικής µικροχλωρίδας στην υγεία και την αντοχή στις ασθένειες είναι ιδιαίτερα σηµαντικός. Κλινικές µελέτες µε καλλιέργειες που έχουν εξεταστεί κατ επανάληψη, έδωσαν αποτελέσµατα που στηρίζουν την άποψη ότι οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί έχουν θετική επίδραση στη χλωρίδα του εντέρου, καθώς και ότι προσφέρουν προστασία έναντι των γαστρεντερικών λοιµώξεων και των φλεγµονών του εντέρου. Όµως, οι ευεργετικές επιδράσεις των προβιοτικών συχνά αµφισβητούνται, αν και ένα πλήθος κλινικών µελετών µε τη χρήση συγκεκριµένων προβιοτικών µικροοργανισµών, αποδεικνύει αρκετές από αυτές (Shahani and Chandan, 1979; Oksanen et al., 1990; Siitonen et al., 1990; Isolauri et al., 1991; Nanji et al, 1994; Majamaa and Isolauri, 1997; Dunne et al., 1999; Lee et al., 2008). Για την εµφάνιση του ευεργετικού αποτελέσµατος απαιτείται συγκεκριµένος αριθµός κυττάρων του προβιοτικού µικροοργανισµού. Σύµφωνα µε την βιβλιογραφία, για την καθηµερινή κατανάλωση προβιοτικών µικροοργανισµών ο προτεινόµενος αριθµός είναι 10 8 έως 10 9 κύτταρα/ml ή και 10 9 έως κύτταρα/ml όταν αναµένονται σηµαντικές απώλειες ύστερα από την παραµονή στο περιβάλλον του στοµάχου (Sanders and Huis in t Veld, 1999). Οι καλλιέργειες που περιέχουν προβιοτικούς µικροοργανισµούς επιδρούν τόσο στη µικροχλωρίδα όσο και στις µεταβολικές και ενζυµικές δραστηριότητες των παθογόνων µικροοργανισµών. Οι αλλαγές στη µικροχλωρίδα έχουν σχέση µε τη µείωση της παραγωγής των προκαρκινικών ενζύµων καθώς και των καρκινογόνων ουσιών από τους µικροοργανισµούς του γαστρεντερικού σωλήνα. Επιπρόσθετα, οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί µε την ακινητοποίηση στο επιθήλιο του εντέρου, τα κυτταρικά τους συστατικά και την επίδραση στη µικροχλωρίδα του εντέρου, βελτιώνουν τη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήµατος στο γαστρεντερικό σωλήνα. Οι θετικές επιδράσεις των προβιοτικών µικροοργανισµών καθώς και οι πιθανοί µηχανισµοί τους δίνονται στον πίνακα 4. 10

26 Πίνακας 4. Πιθανές θετικές επιδράσεις των προβιοτικών και οι µηχανισµοί τους (Ouwehand et al., 1999; Zubillaga et al., 2001; Klaenhammer, 2001; Holzapfel and Schillinger, 2002). Πιθανή θετική επίδραση Μηχανισµοί Αντιµετώπιση δυσανεξίας στη λακτόζη ράση των ενζύµων λακτασών των µικροοργανισµών Απελευθέρωση των ενζύµων λακτασών των µικροοργανισµών στο έντερο Αντίσταση στους παθογόνους µικροοργανισµούς του εντέρου Αντικαρκινικές ιδιότητες Ενίσχυση ανοσοποιητικού συστήµατος Καρδιαγγειακά νοσήµατα Περιορισµός της δράσης του Helicobacter pylori Περιορισµός λοιµώξεων του ουροποιητικού και του γεννητικού συστήµατος Ανταγωνισµός στην αποίκηση ηµιουργία αντίξοων συνθηκών για τους παθογόνους µικροοργανισµούς όπως είναι το χαµηλό ph και η παραγωγή αντιµικροβιακών ουσιών Αντιµεταλλαξιογόνος δράση Περιορισµός της δράσης προκαρκινικών ενζύµων Ενδυνάµωση της άµυνας του ανθρώπινου οργανισµού έναντι των λοιµώξεων Μείωση της χοληστερόλης Παραγωγή αντιµικροβιακών ουσιών Ανταγωνισµός µε τους παθογόνους µικροοργανισµούς Επικόλληση στα επιθηλιακά κύτταρα Παραγωγή αντιµικροβιακών ουσιών Το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (Helicobacter pylori) εγκαθίσταται στο επιθήλιο του στοµάχου και προκαλεί γαστρικές διαταραχές όπως γαστρίτιδα, έλκος και σε ορισµένες περιπτώσεις καρκινώµατα (Gibson, 1998). Συγκεκριµένοι προβιοτικοί µικροοργανισµοί περιορίζουν τη δράση του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού µε την παραγωγή αντιµικροβιακών ουσιών. Αυτό συµβαίνει µε τον 11

27 ανταγωνισµό µε το ελικοβακτηρίδιο και την ακινητοποίησή τους στο επιθήλιο του στοµάχου. Σύµφωνα µε τους Oh et al. (2002), συµβιωτική καλλιέργεια λακτοβακίλλων και ζυµών είχε θανατηφόρο αποτέλεσµα έναντι του H. pylori, όταν η καλλιέργεια εµβολιάστηκε σε αγελαδινό γάλα και σε άλλα υποστρώµατα. Σύµφωνα µε τους Salminen et al. (1998), οι θετικές επιδράσεις των προβιοτικών µικροοργανισµών, η ακρίβεια των οποίων στηρίζεται σε τουλάχιστον δύο επιστηµονικές εργασίες που έγιναν µε αντικείµενο τον άνθρωπο, είναι η ανακούφιση των συµπτωµάτων της δυσανεξίας στη λακτόζη, ο περιορισµός της ενζυµικής δραστηριότητας των µη ωφέλιµων µικροοργανισµών του γαστρεντερικού σωλήνα και η ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήµατος. Οι δοκιµές in vitro είναι ιδιαίτερα χρήσιµες για τη µελέτη των υποψήφιων µικροοργανισµών για προβιοτική χρήση καθώς και για την κατανόηση των µηχανισµών των προβιοτικών δράσεων. Όµως, οι δοκιµές αυτές δεν επαρκούν για να γίνει πρόβλεψη της λειτουργικότητας του µικροοργανισµού στον ανθρώπινο οργανισµό (FAO/WHO, 2002). Ιδιαίτερα σηµαντική είναι η επίδραση των προβιοτικών µικροοργανισµών στον έλεγχο των λοιµώξεων του ουροποιητικού και του γεννητικού συστήµατος από παθογόνους µικροοργανισµούς όπως Candida, Trichomonas, Mycoplasma, Chlamhydia και E. coli. Ένα επιπλέον πλεονέκτηµα για τη χρήση των προβιοτικών µικροοργανισµών στην πρόληψη αυτού του είδους των λοιµώξεων, είναι η απουσία εµφάνισης παρενεργειών από τη χορήγηση, καθώς και η πιθανή χρήση των µικροοργανισµών ως πρόσθετο σε συγκεκριµένα τρόφιµα (Rowland, 1999). Επιπλέον, προβιοτικοί µικροοργανισµοί επιδρούν προληπτικά και θεραπευτικά στη διάρροια (Rowland, 1999). Η δράση των προβιοτικών µικροοργανισµών έναντι της διάρροιας αποτελεί την πιο µελετηµένη επίδραση στην υγεία που έγινε µε κλινικές δοκιµές σε ανθρώπους. Προβιοτικοί µικροοργανισµοί όπως ο L. rhamnosus και ο S. boulardii δρουν τόσο στην κοινή διάρροια, που προέρχεται από τη χρήση αντιβιοτικών και η οποία προκαλείται από διατάραξη της ισορροπίας της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου, όσο και έναντι της διάρροιας που προκαλείται όταν το άτοµο έχει µολυνθεί από παθογόνους µικροοργανισµούς (Elmer, 2001). Επίσης, η χρήση των προβιοτικών βοηθά στην πρόληψη της διάρροιας που εµφανίζεται σε παιδιά των αναπτυσσόµενων χωρών που δεν τρέφονται επαρκώς, αλλά και στην οξεία διάρροια προκαλώντας µείωση του χρόνου των διαρροϊκών επεισοδίων (Oberhelman et al., 1999). 12

28 Προβιοτικοί µικροοργανισµοί χρησιµοποιήθηκαν στη διατροφή των ζώων ως ενισχυτές ανάπτυξης, αντικαθιστώντας έτσι τις αντιβιοτικές ουσίες στο σιτηρέσιο των ζώων (Fuller, 1989). Η προσθήκη µικροοργανισµών στην τροφή των ζώων, όπως είναι τα στελέχη του γένους Lactobacillus, είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση της ηµερήσιας απόκτησης βάρους καθώς και τη βελτίωση του µεταβολισµού των συστατικών της τροφής (Baird, 1977). Στη διατροφή των ζώων, εκτός των στελεχών του είδους Lactobacillus, χρησιµοποιήθηκαν και στελέχη των ειδών Saccharomyces καθώς και Clostridium ως συµπληρώµατα µε προβιοτικές ιδιότητες. Τα βακτηριακά προβιοτικά πρόσθετα διατροφής είναι αποτελεσµατικά σε πουλερικά, χοίρους και νεαρά βοοειδή, ενώ τα προβιοτικά πρόσθετα διατροφής που περιέχουν µύκητες έχουν καλύτερα αποτελέσµατα σε ενήλικα µηρυκαστικά. Η έρευνα στον τοµέα των προβιοτικών µικροοργανισµών συνεχίζεται και σύµφωνα µε πρόσφατη µελέτη (Owehand et al., 2003) διερευνάται η χρήση των προβιοτικών µικροοργανισµών στο δέρµα για την ανταγωνιστική αποµάκρυνση διάφορων παθογόνων µικροοργανισµών που προσβάλλουν το δέρµα όπως είναι ο S. aureus, η C. albicans και ο Malassezia furfur Μικροοργανισµοί των προϊόντων γάλακτος Λακτοβάκιλλοι (Lactobacillus spp.) Το γένος Lactobacillus έχει περίπου 50 είδη, τα οποία µπορούν να αναπτυχθούν σε γαλακτοκοµικά προϊόντα, σε προϊόντα δηµητριακών, σε προϊόντα κρέατος και ψαριών, στη µπύρα, στο κρασί, στα φρούτα και στους χυµούς, στα τουρσιά λαχανικών και µπορούν να βρεθούν επίσης στο φρέσκο χορτάρι, στη µαγιά και στο νερό. Αποτελούν τµήµα της φυσιολογικής µικροχλωρίδας της στοµατικής κοιλότητας, του εντερικού σωλήνα (στον ειλεό και στο παχύ έντερο) και του κόλπου του ανθρώπου αλλά και των ζώων (Stiles and Holzapfel, 1997). Τα ίδια συνήθως δεν είναι παθογόνα και προστατεύουν, µερικώς τουλάχιστον, τον οργανισµό από µολύνσεις (Αγγελής, 2007). Μορφολογικά, τα κύτταρα των λακτοβακίλλων ποικίλουν από επιµήκεις, λεπτοί και ενίοτε µε κλίση βάκιλλοι µέχρι κοκκοβάκιλλοι, ανάλογα µε την ηλικία της καλλιέργειας, τη σύσταση του θρεπτικού µέσου και την επίδραση του οξυγόνου. Οι λακτοβάκιλλοι απαντώνται συχνά και µε τη µορφή αλυσίδων. Μερικά ετεροζυµωτικά είδη όπως τα L. fermentum και L. brevis 13

29 εµφανίζονται ως µίγµατα βακίλλων µεγάλου και µικρού µήκους. Οι λακτοβάκιλλοι δεν σχηµατίζουν ενδοσπόρια και η αυτόνοµη κίνηση των κυττάρων τους δεν αποτελεί σύνηθες χαρακτηριστικό. Τα κύτταρα παρουσιάζονται θετικά κατά Gram, µε πιθανότητα εµφάνισης εσωτερικών κοκκοειδών σχηµατισµών, και αρνητικά στη δοκιµασία της καταλάσης. Το κυτταρικό τοίχωµά τους είναι χαρακτηριστικό των Gram θετικών βακτηρίων µε κύριο συστατικό την πεπτιδογλυκάνη µουρεΐνη (Kandler and Weiss, 1986; Αγγελής, 2007) Χρήση των λακτοβακίλλων στα τρόφιµα Οι λακτοβάκιλλοι έχουν χρησιµοποιηθεί ευρέως ως αρχικές καλλιέργειες για την παραγωγή γαλακτοκοµικών προϊόντων και άλλων τροφίµων που υφίστανται ζύµωση. Η χρήση των λακτοβακίλλων συµβάλλει στην αύξηση του χρόνου συντήρησης των τροφίµων, κυρίως λόγω της παραγωγής του γαλακτικού οξέος. Επιπλέον, οι λακτοβάκιλλοι ενισχύουν τη γεύση, το άρωµα και την υφή των τροφίµων (Gilliland, 1985; Dugas et al., 1999). Αρκετά είδη λακτοβακίλλων, όπως οι L. lactis, L. bulgaricus, L. fermentum, L. acidophilus και L. reuteri, έχουν χρησιµοποιηθεί ως προβιοτικά σε ζωοτροφές (Muralidhara et al., 1977; Barrow et al., 1980; Gilliland et al., 1980; Ratcliffe et al., 1986; Thanaruttikannont, 1996). Οι παραπάνω εργασίες αναφέρουν τα αποτελέσµατα της προβιοτικής δράσης που έχουν σε σχέση µε τη µείωση του πληθυσµού E. coli στα κόπρανα, το έντερο και το στοµάχι χοίρων καθώς και µε την εξουδετέρωση τοξίνης από E. coli σε µοσχάρια. Επίσης, αναφέρεται η θετική επίδραση των λακτοβακίλλων στο µεταβολισµό των ζώων επειδή µειώνουν τη χοληστερόλη (Gilliland et al., 1985) και την αµινοουρία (Hill et al., 1970) σε χοίρους και παράγουν υδρολυτικά ένζυµα που βοηθούν την πέψη σε ποντίκια (Garvie et al., 1984), κοτόπουλα (Fuller et al., 1981; Barrow et al., 1988) και χοίρους (Jonsson and Henningsson, 1991). Λίγες εργασίες αναφέρονται στη χρήση αντίστοιχων προβιοτικών ζωοτροφών σε θαλάσσιους οργανισµούς όπως είναι οι γαρίδες (Rengpipat et al., 1998). Σηµαντική είναι η επίδραση των λακτοβακίλλων σε ζυµωµένο γάλα. Από τα 400 περίπου ονόµατα των προϊόντων αυτής της κατηγορίας, τα πιο διαδεδοµένα είναι το ξινόγαλα, το κεφίρ, το κουµίς, το Dahi και το Leben (Sellars, 1981; Batish et al., 1999; Khurana και Kanawjia, 2007). Για την οξίνιση των προϊόντων αυτών τις περισσότερες φορές χρησιµοποιείται ο L. bulgaricus σε συνδυασµό µε τους L. 14

30 acidophilus και L. rhamnosus. Το τρόφιµο µπορεί να αποκτήσει βελτιωµένη υφή ενώ οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί βιωσιµότητα (Sodini et al., 2002). Αρκετές έρευνες προτείνουν τη χρήση του L. helveticus στην παραγωγή ζυµωµένου γάλακτος λόγω της ευεργετικής του δράσης στην υγεία του ανθρώπου. Συγκεκριµένα, έχει αναφερθεί η θετική συµβολή του στις διαταραχές του ύπνου (Yamamura et al., 2009), το µεταβολισµό του ασβεστίου µετά την εµµηνόπαυση (Narva et al., 2004) και την υψηλή αρτηριακή πίεση (Nakamura, 2004; Aihara et al., 2005; Jauhiainen et al., 2005). Ζυµωµένα προϊόντα γάλακτος µε την προσθήκη του L. acidophilus µπορούν να βοηθήσουν στη µείωση της χοληστερόλης (Schaafsma et al., 1998; Anderson and Gilliland, 1999; Andrade and Borges, 2009) ενώ σε συνδυασµό µε L. casei ανακόπτουν τη διάρροια (Beausoleil et al., 2007). Επίσης η χρήση του L. casei σε ζυµωµένο γάλα, σε συνδυασµό µε τη χρήση ολιγοσακχαριτών ως πριβιοτικών, είχε ως αποτέλεσµα την εξυγίανση της µικροχλωρίδας του εντέρου των καταναλωτών και τη βελτίωση της συχνότητας των εκκενώσεων (Shioiri et al., 2006). Οι Kourkoutas et al. (2005) ακινητοποίησαν τον L. casei σε κοµµάτια φρούτου µε αποτέλεσµα τη µείωση του χρόνου παραγωγής του ζυµωµένου γάλακτος και την ενίσχυση της γεύσης του. Γενικά το γάλα αποτελεί ιδανικό µέσο ανάπτυξης των λακτοβακίλλων λόγω της σύστασής του η οποία είναι περισσότερο από 87% νερό, περίπου 4,7% λακτόζη, 3,8% λίπος, 3,3% πρωτεΐνη, 0,2% κιτρικό οξύ και 0,6% ιχνοστοιχεία (Heller, 2001). Ο πληθυσµός των λακτοβακίλλων συνήθως φτάνει µέχρι και 10 8 ή 10 9 CFU/mL γάλακτος (Prajapati, 1987). Η παράλληλη χρήση ουσιών ως πρόσθετων µπορεί να ενισχύσει την ανάπτυξη των λακτοβακίλλων στο γάλα. Κάποιες από τις πρόσθετες ουσίες που έχουν µελετηθεί είναι ο χυµός τοµάτας (Miller and Puhan, 1981; Babu et al., 1982), η πεπτόνη της καζεΐνης (Miller and Puhan, 1981), οι πρωτεΐνες του τυρογάλακτος (Marshall et al., 1982), η σακχαρόζη (Argawal et al., 1986) και τα ιόντα µαγνησίου και µαγγανίου (Ahmed et al., 1990). Σε µελέτη των Saxena et al. (1994), η συνδυασµένη προσθήκη κασιτόνης µε φρουκτόζη διπλασίασε τα ζωντανά κύτταρα του L. acidophilus σε γάλα κατά τη διάρκεια αποθήκευσής του για 21 ηµέρες. Σε άλλη έρευνα, η προσθήκη 0,5% εκχυλίσµατος ζύµης και 1,0% γλυκόζης, είχε ως αποτέλεσµα τη βέλτιστη ανάπτυξη του L. acidophilus σε άπαχο γάλα. Επιπλέον, η ρύθµιση του ph στο 6,5 κάθε 8 ώρες οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση του µικροβιακού πληθυσµού (Rana et al., 2000). 15

31 Για την παραγωγή προβιοτικού γιαουρτιού χρησιµοποιείται αρχική καλλιέργεια γιαουρτιού, που αποτελείται από S. thermophilus και L. delbrueckii subsp. bulgaricus, σε συνδυασµό µε πρόσθετες καλλιέργειες προβιοτικών λακτοβακίλλων όπως L. acidophilus και L. casei µε σκοπό την επιτάχυνση της ζύµωσης του γάλακτος (Dave and Shah, 1998; Leroy and De Vuyst, 2004). Η προσθήκη αρχικών καλλιεργειών βοηθάει την ανάπτυξη και τη βιωσιµότητα των προβιοτικών µικροοργανισµών µέσω της παραγωγής κατάλληλων ενώσεων ή µέσω της µείωσης του περιεχόµενου οξυγόνου στο γάλα (Dave and Shah, 1997; Shah, 2000; Vinderola et al., 2002). Τα προβιοτικά βακτήρια προστίθενται είτε πριν τη ζύµωση µαζί µε την αρχική καλλιέργεια του γιαουρτιού, είτε µετά τη ζύµωση και πριν τη συσκευασία του προϊόντος. Στα ροφήµατα γιαουρτιού εφαρµόζεται η δεύτερη µέθοδος (Heller, 2001). Η παραγωγή προβιοτικού τυριού προϋποθέτει τη βιωσιµότητα των προβιοτικών µικροοργανισµών κατά τη διάρκεια της ωρίµανσής του, η οποία σε κάποιες ποικιλίες τυριών ξεπερνά τους 6 µήνες. Επίσης η βιωσιµότητα οφείλει να συνεχιστεί και κατά τη διάρκεια του συνολικού χρόνου συντήρησής για να έχουµε τα οφέλη στην υγεία του καταναλωτή. Κατά τη διάρκεια της παραγωγής και της ωρίµανσης του τυριού οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί δεν πρέπει να παράγουν µεταβολίτες που προκαλούν ελαττώµατα ή µειώνουν τη δραστικότητα άλλων χρήσιµων µικροοργανισµών στο τυρί (Kearney et al., 2008). Προβιοτικό τυρί µε L. paracasei έχει παρασκευαστεί µε επιτυχία χωρίς να µεταβάλλεται η σύστασή του (Gardiner et al., 1998; Stanton et al., 1998). Ο πληθυσµός του L. paracasei NFBC 338 και NFBC 364 έφτασε 2,9x10 8 CFU/g ωριµανθέντος τυριού για 3 µήνες και διατηρήθηκε σε αυτά τα επίπεδα έως και 200 ηµέρες. Οι Vinderola et al. (2000) µελέτησαν την παραγωγή τυριού χρησιµοποιώντας L. casei, L. acidophilus και Bifidobacterium. Αρκετές µελέτες αναφέρουν τη χρήση των λακτοβακίλλων σε κατεψυγµένα γαλακτοκοµικά προϊόντα καθώς έχει αποδειχτεί η αυξηµένη αντοχή ορισµένων ειδών σε θερµοκρασίες κατάψυξης. Συγκεκριµένα, ο πληθυσµός L. acidophilus βρίσκεται µεταξύ των τιµών 10 6 και 10 8 CFU/g παγωτού (Hekmat and McMahon, 1992; Hagen and Narvhus, 1999) ή κατεψυγµένου γιαουρτιού (Holocomb et al, 1991; Davidson et al., 1999). Κατά την αποθήκευση των παραπάνω προϊόντων έως και 52 εβδοµάδες στους -20 C, η βιωσιµότητα των λακτοβακίλλων συνεχίζει να είναι σε υψηλά επίπεδα των 10 6 CFU/g. 16

32 Εκτός από τα γαλακτοκοµικά προϊόντα, οι λακτοβάκιλλοι έχουν χρησιµοποιηθεί ως προβιοτικά και σε άλλα τρόφιµα. Ο L. plantarum έχει χρησιµοποιηθεί σε προβιοτικό ποτό από καρπό τριανταφυλλιάς και βρώµη (Johansson et al., 1998) καθώς και σε προβιοτικό ποτό φρούτων (Molin, 2001). Επίσης, έχουν µελετηθεί χυµοί φρούτων που περιέχουν L. rhamnosus GG, L. casei imunitass και L. paracasei NFBC 43338, οι οποίοι παρουσιάζουν ικανοποιητικό χρόνο συντήρησης και καλά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά µετά από 7 ηµέρες αποθήκευσης (Luckow et al., 2005) Ζύµες Ως ζύµες ορίζονται εκείνοι οι βασιδιοµύκητες ή ασκοµύκητες οι οποίοι έχουν µονοκυττάρια βλαστική µορφή και πολλαπλασιάζονται µε εκβλάστηση ή διχοτόµηση ενώ δεν σχηµατίζουν πάντα σπόρια. Υπάρχουν στο φυσικό περιβάλλον και ποικίλουν σε µέγεθος, σχήµα και χρώµα ανάλογα µε το γένος ή το είδος. Το µήκος των κυττάρων διαφέρει πολύ, µπορεί να είναι µόνο 2-3 µm ή ακόµη και µm σε µερικά είδη. Το πλάτος τους κυµαίνεται µεταξύ 1-10 µm. Το σχήµα των κυττάρων είναι στενά συνδεδεµένο µε τη λειτουργία τους και έχει τη δυνατότητα να µεταβάλλεται µε την επίδραση της επιφανειακής τάσης και της σύστασης του θρεπτικού µέσου (Walker, 1998). Τα κύτταρα των ζυµών περιέχουν πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, λιπίδια και νουκλεϊκά οξέα, οι συγκεντρώσεις των οποίων ποικίλουν σύµφωνα µε τις συνθήκες ανάπτυξης και το είδος (Walker, 1998) Χρήση των ζυµών στα τρόφιµα Οι ζύµες αποτελούν σηµαντικό τµήµα της µικροχλωρίδας αρκετών γαλακτοκοµικών προϊόντων καθώς και άλλων τροφίµων και ποτών (Jakobsen and Narvhus, 1996). Αν και η χρήση τους για τον άνθρωπο ως προβιοτικοί µικροοργανισµοί είναι σχετικά περιορισµένη, οι ζύµες χρησιµοποιούνται εδώ και πολλά χρόνια ως προβιοτικά στις ζωοτροφές (Burnett and Neil, 1977). Για τη συγκεκριµένη εφαρµογή αξιοποιείται η βιοµάζα ζύµης που περισσεύει από τις βιοµηχανίες της ζυθοποιίας. Η προσθήκη ζυµών στην τροφή των ζώων έχει ως αποτέλεσµα την καλύτερη απόδοση και βελτιωµένη ποιότητα του τελικού πρoϊόντος. Οι ζύµες προστίθενται συνήθως στις τροφές των βοοειδών, των χοίρων καθώς και 17

33 των πουλερικών (Lyons et al., 1993). Η ζύµη που έχει µελετηθεί περισσότερο για τις προβιοτικές της ιδιότητες είναι ο S. boulardii. Ο S. boulardii είναι µη παθογόνος ζύµη που αποµονώθηκε από το φρούτο Lychee στην Ινδοκίνα τη δεκαετία του 1950 και από τότε χρησιµοποιείται τόσο για την πρόληψη όσο και για τη θεραπεία της διάρροιας (Kollaritsch et al., 1993; Mc Farland and Bernasconi, 1993; Saint-Marc et al., 1995) και της ψευδοµεµβρανώδους κολίτιδας (Klein et al., 1993). Άλλες ζύµες που χρησιµοποιούνται στις ζωοτροφές ως προβιοτικά είναι οι C. pintolopesii, C. saitoana και S. cerevisiae (Bovill et al., 2001; Leuschner et al., 2004). Ο S. cerevisiae είναι η µαγιά που καλλιεργείται περισσότερο από κάθε άλλη και αποτελεί εδώ και χιλιάδες χρόνια βασικό πρόσθετο στην αρτοποίηση. Η µαγιά κυκλοφορεί στο εµπόριο ως πιεστή µαγιά ή σε ξηρή µορφή. Στην Ευρώπη, για την παραγωγή της µαγιάς χρησιµοποιείται µελάσα και πραγµατοποιείται αερόβια ζύµωση του S. cerevisiae. Η µαγιά µετατρέπει τα σάκχαρα σε νερό και διοξείδιο του άνθρακα το οποίο παγιδεύεται στη µάζα του ψωµιού µε αποτέλεσµα τη διόγκωσή του (Olsson and Nielsen, 2000; Gül et al., 2005; Bekatorou et al., 2006). Επιπλέον, η ζύµη συµβάλλει στην παραγωγή αρωµατικών συστατικών, κυρίως καρβονυλικών ενώσεων λόγω του καταβολισµού των αµινοξέων, και αποτελεί πλούσια πηγή πρωτεϊνών και βιταµινών (Jahan et al., 2007). Άλλες ζύµες που έχουν χρησιµοποιηθεί στην παραγωγή ψωµιού µε σκοπό τη βελτίωση των οργανοληπτικών του χαρακτηριστικών είναι οι Kluyveromyces marxianus (Plessas et al, 2008; Dimitrellou et al., 2009), C. lusitaniae (Williams and Luksas, 1981), K. lactis και K. fragilis (Kusachi, 1981). Η χρήση διαφορετικών ζυµών µπορεί επίσης να επιταχύνει την αρτοποίηση (Fernandes et al., 1985). Οι ζύµες χρησιµοποιούνται σε µεγάλη έκταση στην παραγωγή αλκοολούχων ποτών, όπως είναι ο οίνος, η µπύρα και τα αποστάγµατα. Τα είδη που συνήθως χρησιµοποιούνται για την παραγωγή µπύρας είναι ο S. uvarum και ο S. cerevisiae. Οι ζύµες ζυθοποιίας αποτελούν πηγή βιταµίνών Β, Ca, P, K, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn και Cr (Bekatorou et al., 2006). Κλινικές µελέτες αναφέρουν τη χρήση των ζυµών για τη θεραπεία του διαβήτη, της ανορεξίας, της χρόνιας ακµής και της διάρροιας (Sinai et al., 1974; Mc Carty, 1984; Bahijiri et al., 2000). Για την παραγωγή του οίνου έχει χρησιµοποιηθεί ποικιλία ζυµών του γένους Saccharomyces όπως S. cerevisiae, S. bayanus, S. uvarum, S. oviformis, S. carlsbergensis, S. chevalieri, S. diastaticus, S. fructuum, S. pasteurianus, S. sake και S. vini (Mateo and Di Stefano, 1997; Teramoto et al., 2005; Bekatorou et al., 2006). Η επιλογή της κατάλληλης ζύµης εξαρτάται από 18

34 τη γεωγραφική περιοχή, το κλίµα, την ποικιλία του σταφυλιού, και τα επιθυµητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος. Για την παραγωγή αλκοολούχων ποτών από απόσταξη, οι ζύµες που χρησιµοποιούνται πρέπει να ζυµώνουν µεγάλο εύρος υποστρωµάτων από καλαµπόκι, κριθάρι, σιτάρι, πατάτα, κτλ. Επίσης πρέπει να είναι ανθεκτικές στη σχετικά υψηλή θερµοκρασία, την οσµωτική πίεση και τη συγκέντρωση αλκοόλης. Οι ζύµες που έχουν µελετηθεί για την παραγωγή αλκοολούχων αποσταγµάτων ανήκουν στα γένη Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, και Schizosaccharomyces (Laube et al., 1987; Ibragimova et al., 1995). Επίσης, σηµαντική είναι η επίδραση των ζυµών στην παραγωγή ζυµωµένων γαλακτοκοµικών προϊόντων όπως το τυρί, το γιαούρτι, το κεφίρ και το κουµίς. Στην περίπτωση αυτή οι ζύµες ενισχύουν τη δράση της καλλιέργειας, αναστέλλουν την ανάπτυξη ανεπιθύµητων µικροοργανισµών που προκαλούν αλλοιώσεις στο τρόφιµο και συµβάλλουν στην παραγωγή συστατικών του αρώµατος (Jakobsen and Narvhus, 1996; Wyder and Puhan, 1999; Viljoen, 2001). Οι De Freitas et al. (2008) χρησιµοποίησαν K. lactis και Pichia fermentans για την παραγωγή γαλλικού σκληρού τυριού και επηρέασαν τη γεύση του. Αργότερα, στο ίδιο τυρί χρησιµοποιήθηκε µίγµα καλλιέργειας K. lactis, Yarrowia lipolytica και P. fermentans. Η προσθήκη των ζυµών αυτών δεν επηρέασε τη συγκέντρωση των ελεύθερων αµινοξέων αλλά αύξησε το ρυθµό της λιπόλυσης και τη συγκέντρωση των πτητικών ενώσεων (De Freitas et al., 2009). Επίσης, οι Kesenkaş and Akbulut (2008) πρόσθεσαν Y. lipolytica, Debaryomyces hansenii και K. marxianus σε λευκό τυρί άλµης µε αποτέλεσµα τη βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του. Άλλοι ερευνητές έχουν προτείνει την προσθήκη των ζυµών D. hansenii και Y. lipolytica σε τυρί cheddar µε σκοπό την επιτάχυνση της ωρίµανσής του (Ferreira and Viljoen, 2003). Όσον αφορά το γιαούρτι, έχει βρεθεί ότι η χρήση του S. boulardii προάγει την ανάπτυξη των υπόλοιπων προβιοτικών µικροοργανισµών και εξασφαλίζει τη βιωσιµότητά τους (Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001). Επίσης, µίγµα καλλιέργειας K. marxianus, S. cerevisiae, C. albicans και D. hansenii έχει χρησιµοποιηθεί για την παραγωγή παραδοσιακού ρευστού προϊόντος γάλακτος (Kebede et al., 2007). 19

35 1.5. Αλληλεπιδράσεις ζυµών-βακτηρίων στα τρόφιµα Το ενδιαφέρον για τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ ζυµών, βακτηρίων και µυκήτων είναι ιδιαίτερα αυξηµένο από τη στιγµή που ξεκίνησε η εφαρµογή των ζυµώσεων στη βιοµηχανία των τροφίµων. Ορισµένες φορές η ζύµωση των γαλακτοκοµικών προϊόντων γίνεται µε την αλληλεπίδραση διαφόρων µικροοργανισµών που επιφέρουν επιθυµητές αλλαγές στα χαρακτηριστικά και την ποιότητα του τροφίµου και παράλληλα σταθεροποιούν τον µικροβιακό πληθυσµό του τροφίµου (Jakobsen and Narvhus, 1996). Η αλληλεπίδραση δεν έχει µόνο θετικά ή αρνητικά αποτελέσµατα στη ζύµωση. Αυτή οδηγεί στην ανταγωνιστική δράση των ζυµών έναντι άλλων µικροοργανισµών εξαιτίας της παραγωγής αντιµικροβιακών ουσιών και της εξουδετέρωσης των παθογόνων µικροοργανισµών. Οι ουσίες που προκαλούν το θάνατο των µικροοργανισµών είναι κυρίως πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες που εκκρίνονται από το κύτταρο της ζύµης. Επίσης κάποια στελέχη ζυµών παράγουν µεταβολίτες, όπως λιπαρά οξέα µικρής αλυσίδας, που έχουν τοξική επίδραση σε µικροοργανισµούς οι οποίοι είναι ανεπιθύµητοι στον γαστρεντερικό σωλήνα (Gedek, 1991). Η µικροβιακή χλωρίδα και ο συνδυασµός των φυσιολογικών λειτουργιών, των αλληλεπιδράσεων και των ενζυµικών δραστηριοτήτων ευθύνονται για τις σηµαντικές βιοχηµικές αλλαγές αλλά και τη διαφοροποίηση στη θρεπτική αξία του τροφίµου. Οι αντιµικροβιακές δράσεις των ζυµωµένων γαλακτοκοµικών προϊόντων αποδίδονται κυρίως σε οργανικά οξέα, αντιµικροβιακές ουσίες, πτητικά οξέα και στο υπεροξείδιο του υδρογόνου. Οι συγκεκριµένες αντιµικροβιακές δράσεις είναι αποτέλεσµα της παρουσίας διαφόρων ειδών µικροοργανισµών, όπως είναι οι ζύµες και τα βακτήρια, που συµµετέχουν στη ζύµωση και την αλλοίωση των προϊόντων (Bull and Slater, 1982). Έτσι οι ζύµες παρέχουν απαραίτητες οργανικές ουσίες για την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων όπως είναι διάφορα προϊόντα µεταβολισµού, αµινοξέα και βιταµίνες. Επιπλέον, αποµακρύνουν τα τοξικά προϊόντα του µεταβολισµού και αναστέλλουν την ανάπτυξη των ανεπιθύµητων µικροοργανισµών µε την παραγωγή αλκοόλης, CO 2 και οξέων καθώς και µε την πτώση του ph που προκαλούν (Fleet, 1990). Ορισµένες από τις σηµαντικότερες ζυµώσεις που πραγµατοποιούνται µε την αλληλεπίδραση ζυµών και βακτηρίων είναι η διόγκωση της αρτοµάζας και η παραγωγή του κεφίρ (Wood and Hodge, 1985; Plessas et al., 2008). Οι ζύµες 20

36 απαντώνται πολύ συχνά στα γαλακτοκοµικά προϊόντα και συνεισφέρουν στην ποιότητά τους (Fleet and Mian, 1987; Fleet, 1990). Στα προϊόντα αυτά συνυπάρχουν τα βακτήρια, ειδικά τα ψυχρότροφα, που προκαλούν αλλοιώσεις καθώς και οι βακτηριακές καλλιέργειες εκκίνησης που συµβάλλουν στην ποιότητα του τελικού προϊόντος επιδρώντας στην ανάπτυξη του αρώµατος και της γεύσης (Cousin, 1982; Santos et al., 1996). Επίσης, το ζυµωµένο γάλα ευνοείται από την ανάπτυξη των ζυµών και των βακτηρίων µε αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση της συνολικής µικροχλωρίδας. Αυτό αποτελεί ένδειξη του γεγονότος ότι οι ζύµες επιβιώνουν και ανταγωνίζονται στο οικοσύστηµα των τροφίµων κάτω από αντίξοες για τους µικροοργανισµούς συνθήκες που δηµιουργούνται από την υψηλή συγκέντρωση αλατιού, τη χαµηλή τιµή ph καθώς και τη µειωµένη ενεργότητα νερού (α w ). Ένα τέτοιο παράδειγµα ανταγωνισµού αποτελεί η παραγωγή του acidophilus-yeast milk που βασίζεται στην αλληλεπίδραση του γαλακτικού βακτηρίου L. acidophilus και της ζύµης K. fragilis, η οποία έχει την ικανότητα να ζυµώνει τη λακτόζη. Η γαλακτική ζύµωση στην περίπτωση αυτή γίνεται µόνο από τον L. acidophilus ή από τον L. acidophilus και άλλα γαλακτικά βακτήρια. Η έντονη ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση των ζωντανών κυττάρων του L. acidophilus µε συνέπεια τη µείωση της θετικής επίδρασης του L. acidophilus ως προβιοτικού µικροοργανισµού. Η συνκαλλιέργειά του µε τη ζύµη, η οποία έχει την ικανότητα να ζυµώνει τη λακτόζη και να µειώνει το χρόνο πήξης του γάλακτος, αυξάνει τον αριθµό των ζωντανών γαλακτικών βακτηρίων εξαιτίας της ευνοϊκής επίδρασης των ζυµών και αναστέλλει έτσι την ανάπτυξη των παθογόνων µικροοργανισµών E. coli και του B. cereus (Koroleva, 1991). Στην περίπτωση του ποτού κεφίρ, οι ζύµες παρέχουν αµινοξέα, βιταµίνες και άλλα συστατικά για την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων µε αποτέλεσµα την αυξηµένη παραγωγή γαλακτικού οξέος. Τα τελικά προϊόντα του µεταβολισµού των βακτηρίων χρησιµοποιούνται από τις ζύµες ως πηγή ενέργειας. Το φαινόµενο αυτό παρέχει σταθερότητα στο προϊόν. Παρόλα αυτά, µπορεί να παρατηρηθεί µείωση της παραγωγής αλκοόλης από τις ζύµες που οφείλεται κυρίως στη µεγάλη παραγωγή γαλακτικού και οξικού οξέος από τα ωσµώφιλα γαλακτικά βακτήρια, τον ανταγωνισµό για το διοξείδιο του άνθρακα ή µπορεί να συµβεί η λύση του κυτταρικού τοιχώµατος των ζυµών από βακτηριακά ένζυµα (Wood and Hodge, 1985). 21

37 1.6. Κεφίρ Το κεφίρ είναι ένα ζυµωµένο παραδοσιακό προϊόν γάλακτος που παράγεται εδώ και αιώνες στις χώρες του Καυκάσου. Παράγεται χωρίς πήγµα και µε την προσθήκη των χαρακτηριστικών κόκκων κεφίρ σε κατσικίσιο, αγελαδινό ή πρόβειο γάλα ή σε µίγµα τους (Wood and Hodge, 1985; Koroleva, 1991). Το τελικό προϊόν περιέχει περίπου 0,8% γαλακτικό οξύ, 1% αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Ιδιαίτερα σηµαντικές είναι οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ ζυµών και βακτηρίων στο κεφίρ. Η συµβίωση των µικροοργανισµών δίνει τη δυνατότητα στους κόκκους του κεφίρ να διατηρούν την οµοιοµορφία τους µε αποτέλεσµα η µικροβιολογική τους σύσταση να παραµένει σταθερή µε το πέρασµα του χρόνου, παρά τις µεταβολές στην ποιότητα του γάλακτος και την πιθανή παρουσία αντιβιοτικών ή άλλων ανασταλτικών παραγόντων. Οι ζύµες βρίσκονται συνήθως στο εσωτερικό των κόκκων ενώ οι λακτόκοκκοι στην επιφάνεια. Έτσι, ο αριθµός των ζυµών στο τελικό προϊόν του κεφίρ είναι χαµηλότερος σε σχέση µε τον αριθµό των κυττάρων των ζυµών στους κόκκους (Farnworth and Mainville, 2008). Οι κόκκοι του κεφίρ (Εικόνα 1) αποτελούνται από κόκκους πηκτής, στους οποίους είναι προσκολληµένοι οι µικροοργανισµοί της µικροχλωρίδας του. Το σχήµα των κόκκων είναι ακανόνιστο ενώ το µέγεθός τους ποικίλλει. Το χρώµα τους είναι υποκίτρινο ή λευκό και η διάµετρος κυµαίνεται από 1-6 mm µε συνηθέστερο µήκος στα 2-3 mm. Το µέγεθος των κόκκων εξαρτάται από την ένταση της ανάδευσης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των µικροοργανισµών. Εντονότερη ανάδευση έχει ως αποτέλεσµα κόκκους κεφίρ µικρού µεγέθους µε µεγαλύτερη επιφάνεια επαφής µε το γάλα και µεγαλύτερη δραστικότητα της µικροχλωρίδας. Εικόνα 1. Κόκκοι κεφίρ (Farnworth and Mainville, 2008). 22

38 Όταν οι οµάδες µικροοργανισµών της µικροχλωρίδας του κεφίρ διαχωριστούν σε καθαρές καλλιέργειες υπάρχει πιθανότητα να µην αναπτύσσονται στο γάλα όπως για παράδειγµα τα βακτήρια που παράγουν οξικό οξύ και οι ζύµες που δεν ζυµώνουν τη λακτόζη. Επίσης, σε µερικές περιπτώσεις, όπως των ετεροζυµωτικών στρεπτόκοκκων και λακτοβακίλλων, η βιοχηµική τους δραστικότητα περιορίζεται σηµαντικά (Koroleva, 1991). Μέχρι πρόσφατα η ταυτοποίηση των µικροοργανισµών του κεφίρ βασιζόταν στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους τα οποία συχνά δεν επαρκούν για την κατάταξή τους στα διάφορα είδη (Rohm et al., 1992; Pintado et al., 1996). Προς τούτο οι τελευταίες εργασίες χρησιµοποιούν µοριακές τεχνικές (Wyder and Puhan, 1997; Mainville et al., 2006). Η σταθερή αναλογία των µικροοργανισµών του κεφίρ από την παραγωγή έως την κατανάλωση του προϊόντος είναι σηµαντική για τους καταναλωτές οι οποίοι το χρησιµοποιούν για τα οφέλη που παρέχει στην υγεία. Η αλληλεπίδραση µεταξύ των ζυµών και των γαλακτικών βακτηρίων στο κεφίρ, έχει χαρακτηριστεί απόλυτα αρµονική (La Riviere et al., 1967; Marshall et al., 1984). Ο πίνακας 5 δίνει τη σύσταση της µικροχλωρίδας του κεφίρ. Πίνακας 5. Σύσταση της µικροχλωρίδας του κεφίρ. Μικροοργανισµοί Λειτουργικός ρόλος Μεσόφιλοι και οµοζυµωτικοί Προκαλούν γρήγορη αύξηση της οξύτητας στεπτόκοκκοι τις πρώτες ώρες της ζύµωσης Ετεροζυµωτικοί λακτοβάκιλλοι Ο πληθυσµός τους αυξάνεται µε την αύξηση της θερµοκρασίας Μεσόφιλοι και ετεροζυµωτικοί Σχηµατισµός γεύσης και αρώµατος στρεπτόκοκκοι ηµιουργούν αέρια Ζύµες Ενισχύουν την ανάπτυξη των µικροοργανισµών του κεφίρ Βακτήρια που παράγουν οξικό οξύ Ενισχύουν την ανάπτυξη των µικροοργανισµών του κεφίρ Αυξάνουν το ιξώδες Οι εργασίες για τη σύσταση της µικροχλωρίδας του κεφίρ δείχνουν ότι αυτή αποτελείται από γαλακτικά βακτήρια, ζύµες αλλά και βακτήρια που παράγουν οξικό οξύ. Οι ζύµες που συµµετέχουν στη µικροχλωρίδα του κεφίρ ανήκουν στα είδη 23

39 Kluyveromyces, Saccharomyces, Candida και Pichia spp. Τα γαλακτικά βακτήρια είναι κυρίως Lactobacillus, Lactococcus και Leuconostoc spp. (Wood and Hodge, 1985; Koroleva, 1991; Luis et al., 1993; Garrote et al., 1997; Witthuhn et al., 2005). Η παρουσία οµοζυµωτικών στρεπτόκοκκων, ζυµών και βακτηρίων που παράγουν οξικό οξύ στη µικροχλωρίδα του κεφίρ, προσδίδει σηµαντική αντιµικροβιακή δράση έναντι παθογόνων µικροοργανισµών του εντέρου. Ειδικότερα, σύµφωνα µε τους Silva et al. (2009), ζύµες του γένους Torulaspora που αποµονώθηκαν από το κεφίρ καθώς και στελέχη που ζυµώνουν τη λακτόζη, εµφάνισαν ισχυρή αντιµικροβιακή δράση έναντι των κολοβακτηρίων, ενώ δε συνέβη το ίδιο σε στελέχη ζυµών που δε ζύµωναν τη λακτόζη. Σύµφωνα µε την Ivanova (1975) την ισχυρότερη αντιµικροβιακή δράση παρουσιάζουν τα βακτήρια που παράγουν οξικό οξύ και οι οµοζυµωτικοί στρεπτόκοκκοι, κυρίως οι S. lactis και S. cremoris. Η αντιµικροβιακή δράση του κεφίρ ασκείται έναντι µεγάλου εύρους βακτηρίων και µυκήτων όπως είναι το E. coli (Ota, 1999), το H. pylori (Bohmler, 1996), ο B. cereus (Kakisu et al., 2007) και ο S. aureus (Rodriguez et al., 2005a). Τα ερευνητικά αποτελέσµατα που αφορούν την παραγωγή βακτηριοσινών από τον κεφίρ δείχνουν ότι υπάρχουν διάφορες κατηγορίες των αντιµικροβιακών αυτών ενώσεων. Το µεγαλύτερο εύρος δραστικότητας παρουσιάζει η λακτισίνη 3147 η οποία βρέθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των καλλιεργειών Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, S. thermophilus και S. aureus. Η δράση αυτή µελετήθηκε στην παραγωγή τυριού cheddar (Ryan et al., 1996). Οι Morgan et al. (2000), απέδειξαν ότι η αντιµικροβιακή δράση του κεφίρ φθάνει µέχρι και εναντίον των παθογόνων της Listeria innocua, λόγω της παραγωγής βακτηριοσινών, αλλά και του E. coli, λόγω της παραγωγής οξέος και υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η παρουσία των ζυµών και των ετεροζυµωτικών στρεπτόκοκκων έχουν ως αποτέλεσµα τη βελτίωση της πέψης στον άνθρωπο που τρέφεται µε κεφίρ, ενώ η παρουσία του διοξειδίου του άνθρακα και της αλκοόλης αυξάνει την όρεξη. Επίσης το κεφίρ παράγει γαλακτικό οξύ της µορφής L (+) η οποία γίνεται εύκολα ανεκτή από τον ανθρώπινο οργανισµό (Hertzler and Clancy, 2003). Οι πολυσακχαρίτες της µικλοχλωρίδας του κεφίρ δεσµεύουν τις τοξικές ουσίες και ταυτόχρονα παρουσιάζουν αντιφλεγµονώδη δράση (Rodriguez et al. 2005b). Άλλες εργασίες αναφέρουν τη δράση των συγκεκριµένων συστατικών του κεφίρ στη µείωση των λιπιδίων, της χοληστερόλης, της αρτηριακής πίεσης και της γλυκόζης του αίµατος (Maeda et al., 2004; Liu et al., 2006; Sarkar, 2007). Επίσης, έχει µελετηθεί η αντικαρκινική δράση του κεφίρ (Liu et al., 2002; de 24

40 LeBlank et al., 2006; Chen et al., 2007). Οι παραπάνω εργασίες έδειξαν ότι το κεφίρ περιέχει ενεργά συστατικά που αναστέλλουν µε εξειδικευµένη δράση την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του µαστού σε ποσοστό έως και 56%. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήµατος και τη µείωση κάποιων κυτοσινών οι οποίες παράγονται από τον όγκο. Η ελαφρά όξινη γεύση του ποτού κεφίρ και η µικροχλωρίδα του ενισχύουν την έκκριση σιέλου καθώς και την έκκριση των ενζύµων του στοµάχου και του παγκρέατος. Επιπλέον, ευνοούνται και οι περισταλτικές κινήσεις του εντέρου. Η κατανάλωση του κεφίρ συµβάλλει στην οµαλή κίνηση της τροφής στο γαστρεντερικό σωλήνα, ενώ η παρουσία του γαλακτικού οξέος και των αντιµικροβιακών ουσιών αναστέλλουν τη σήψη στο περιβάλλον του λεπτού εντέρου. Το κεφίρ µε χαµηλή οξύτητα µπορεί να χορηγηθεί ως καθαρτικό ενώ το κεφίρ µε υψηλή οξύτητα προκαλεί δυσκοιλιότητα. Το κεφίρ που παράγεται σε βιοµηχανική κλίµακα έχει την κατάλληλη οξύτητα ώστε να επιφέρει ισορροπία στη σύσταση της µικροχλωρίδας του εντέρου (Koroleva, 1991). Άλλες εργασίες ασχολούνται µε τη χρήση του κεφίρ για τη µείωση της χοληστερόλης τόσο στα τρόφιµα όσο και στο αίµα των καταναλωτών. Σε γάλα, στο οποίο προστέθηκαν κόκκοι κεφίρ, η περιεκτικότητα της χοληστερόλης µειώθηκε έως και 63% µετά από 24 ώρες επώασης ενώ σε 48 ώρες είχε µειωθεί έως και 84% (Vujicic et al., 1992). Επίσης, µείωση της χοληστερόλης παρατηρήθηκε και στο αίµα ποντικιών λόγω της διατροφής τους µε γάλα κεφίρ (Liu et al., 2006). Παρόµοια αποτελέσµατα δηµοσιεύτηκαν από τους Maeda et al. (2004) οι οποίοι κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η κατανάλωση του κεφίρ επηρεάζει το µηχανισµό του µεταβολισµού των λιπιδίων. Οι ερευνητές Shiomi et al. (1982) έδειξαν ότι οι διαλυτοί πολυσακχαρίτες των κόκκων του κεφίρ περιορίζουν την ανάπτυξη µορφών καρκίνου όπως το σάρκωµα Elrich σε ποντίκια. Σε πιο πρόσφατη µελέτη βρέθηκε ότι τα οξυγαλακτικά βακτήρια του κεφίρ ενισχύουν τη δράση των µακροφάγων και το ανοσοποιητικό σύστηµα προφυλάσσοντας έτσι τον άνθρωπο από τις λοιµώξεις (Hong et al., 2009) Ακινητοποίηση κυττάρων Η ακινητοποίηση είναι ένας γενικός όρος που χρησιµοποιείται για να περιγράψει την καθήλωση ενός βιοκαταλύτη µέσα ή πάνω σε στερεό φορέα. Οι ακινητοποιηµένοι βιοκαταλύτες αποτελούνται από το φορέα ακινητοποίησης και τους 25

41 βιοκαταλύτες. Ο όρος του βιοκαταλύτη έχει σχέση µε βιολογικές δοµές που εµφανίζουν ενζυµική δραστικότητα. Μπορεί να είναι ένα απλό ένζυµο έως ένα ζωντανό κύτταρο µε το σύνολο των ενζύµων του. Ο ακινητοποιηµένος βιοκαταλύτης έχει τα φυσικά χαρακτηριστικά του υποστρώµατος, ενώ διατηρεί τη βασική βιοχηµική δραστικότητα του ελεύθερου καταλύτη και βελτιώνει την αποδοτικότητά του (Chibata, 1978). Αρκετές βιοτεχνολογικές διεργασίες βελτιώνονται από την τεχνολογία των ακινητοποιηµένων βιοκαταλυτών και συνεπώς κατά καιρούς έχουν προταθεί διάφορες τεχνικές και διάφορα υποστρώµατα. Οι τεχνικές ακινητοποίησης που έχουν χρησιµοποιηθεί µέχρι σήµερα, µπορούν να ταξινοµηθούν σε τέσσερις γενικές κατηγορίες και περιλαµβάνουν, (α) προσκόλληση ή προσρόφηση σε επιφάνεια στερεού φορέα, (β) εγκλωβισµό σε πορώδες υλικό, (γ) συσσωµάτωση µε κροκίδωση και (δ) µηχανική συγκράτηση βιοκαταλυτών σε έναν φορέα (Pilkington et al., 1998; Kourkoutas et al., 2004; Doleyres and Lacroix, 2005). Η ακινητοποίηση κυττάρων σε στερεό φορέα γίνεται µε φυσική προσκόλληση µέσω ηλεκτροστατικών δυνάµεων ή οµοιοπολικών δεσµών µεταξύ της κυτταρικής µεµβράνης και του υποστρώµατος. Το πάχος του κυτταρικού στρώµατος ποικίλει από µια στρώση κυττάρων µέχρι 1 mm ή περισσότερο. Συστήµατα µε ακινητοποιηµένα κύτταρα σε µια επιφάνεια χρησιµοποιούνται συνήθως λόγω της σχετικής ευκολίας της µεθόδου ακινητοποίησης. Η δύναµη µε την οποία τα κύτταρα συνδέονται µε το φορέα ποικίλει και δεν µπορεί να προσδιοριστεί εύκολα. Επειδή δεν υπάρχουν εµπόδια µεταξύ των κυττάρων και του διαλύµατος, είναι πιθανό τα κύτταρα συνεχώς να αποσπώνται και να ακινητοποιούνται, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία µιας κατάστασης ισορροπίας µεταξύ των προσροφηµένων και των ελεύθερων κυττάρων. Παραδείγµατα στερεών φορέων που χρησιµοποιούνται για αυτόν τον τύπο ακινητοποίησης είναι τα κυτταρινικά υλικά όπως το ξύλο και το πριονίδι καθώς και ανόργανα υλικά όπως η πορώδης πορσελάνη, το πορώδες γυαλί, η κίσσηρη, ο περλίτης και η γ-αλουµίνα. Η ικανότητα προσρόφησης των στερεών φορέων, όπως το γυαλί ή η κυτταρίνη µπορεί να ενισχυθεί, ύστερα από την επεξεργασία τους µε χιτοζάνη ή άλλα υλικά επικάλυψης (Navarro and Durand, 1977; Norton and D Amore, 1994). Κατά τον εγκλωβισµό των κυττάρων σε πορώδες υλικό τα κύτταρα, είτε αφήνονται να διεισδύσουν στο πορώδες υλικό έως ότου η κινητικότητά τους εµποδιστεί, είτε το πήκτωµα σχηµατίζεται in situ σε µια καλλιέργεια κυττάρων. Και οι δύο µέθοδοι βασίζονται στον εγκλωβισµό των κυττάρων σε ένα άκαµπτο δίκτυο έτσι ώστε να µη διαχέονται στο περιβάλλον ενώ παράλληλα επιτρέπεται η συνεχής 26

42 µεταφορά θρεπτικών ουσιών και µεταβολιτών. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα αυτού του τύπου της ακινητοποίησης είναι η παγίδευση µέσα σε πηκτώµατα πολυσακχαριτών όπως αλγινικών, κ-καραγεννάνης, άγαρ, χιτοζάνης, πολυγαλακτουρονικού οξέος ή σε άλλα πολυµερή υλικά όπως η ζελατίνη και το κολλαγόνο (Norton et al., 1994; Park and Chang, 2000). Η ανάπτυξη των κυττάρων στο υλικό αυτό εξαρτάται από τους περιορισµούς της διάχυσης που καθορίζονται από το πορώδες του υλικού και από την επίδραση της συσσωρευµένης βιοµάζας. Για παράδειγµα, το εύρος διείσδυσης του οξυγόνου έχει υπολογιστεί πως είναι 0,08 έως 0,10 mm σε σφαιρίδια καραγεννάνης (Huang et al., 1990) και 0,10 έως 0,15 mm σε σφαιρίδια αλγινικού (Ogbonna et al., 1991). Αναπτύσσεται έτσι ένας ανοµοιογενώς κατανεµηµένος κυτταρικός πληθυσµός και πιθανόν εκείνα τα κύτταρα που βρίσκονται κοντά στην επιφάνεια συµπεριφέρονται διαφορετικά σε σύγκριση µε τα ελλιπώς τροφοδοτούµενα κύτταρα του εσωτερικού. Ένα από τα προβλήµατα του εγκλωβισµού σε πολυµερές πορώδες υλικό, όπως σε πηκτή πολυσακχαριτών, είναι η ικανότητα των κυττάρων, που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια του στρώµατος, να πολλαπλασιάζονται και να απελευθερώνονται. Για να αποφευχθεί το πρόβληµα αυτό έχουν δηµιουργηθεί σφαιρίδια µε δύο στρώσεις, µια εσωτερική η οποία περιέχει τα κύτταρα, και µια εξωτερική που τα συγκρατεί (Tanaka et al., 1989; Taillandier et al., 1994; Ramon-Portugal et al., 2003). Κροκίδωση των κυττάρων (cell flocculation) ονοµάζεται η συσσώρευση των κυττάρων ώστε να σχηµατίσουν ένα µεγαλύτερο σωµατίδιο ή η ιδιότητα που έχουν τα κύτταρα να σχηµατίζουν θρόµβους και να καθιζάνουν γρήγορα. Η κροκίδωση µπορεί να θεωρηθεί τεχνική ακινητοποίησης αφού το µεγάλο µέγεθος των συσσωµατωµάτων τα καθιστά ικανά να χρησιµοποιηθούν σε βιοαντιδραστήρες και να εγκλωβιστούν σε αυτούς ακόµη και σε συστήµατα συνεχούς λειτουργίας. Η ικανότητα σχηµατισµού των συσσωµατωµάτων παρατηρείται κυρίως σε ζυµοµύκητες. Ωστόσο σε κυτταρικές καλλιέργειες που δεν γίνεται κροκίδωση, µπορούν να χρησιµοποιηθούν τεχνητοί παράγοντες κροκίδωσης ώστε να προκληθεί η θρόµβωση. Η κροκίδωση ζυµών είναι σηµαντική για τη βιοµηχανία παρασκευής µπύρας αφού επηρεάζει την παραγωγικότητα της ζύµωσης και την ποιότητα του προϊόντος. Επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες όπως η σύσταση του κυτταρικού τοιχώµατος, το ph, το διαλυµένο οξυγόνο και η σύσταση του θρεπτικού µέσου (Jin and Speers, 1998). Τέλος, η µηχανική συγκράτηση των βιοκαταλυτών µπορεί να επιτευχθεί µε (α) τη χρήση φίλτρων από µεµβράνες µε µικρούς πόρους, (β) εγκλωβισµό των κυττάρων σε 27

43 µικροκάψουλες και (γ) ακινητοποίηση των βιοκαταλυτών σε µια επιφάνεια αλληλεπίδρασης δύο µη αναµειγνυόµενων υγρών. Αυτός ο τύπος ακινητοποίησης είναι ιδανικός όταν απαιτείται προϊόν ελεύθερο κυττάρων (Park and Chang, 2000). Στην αγορά υπάρχουν µεµβράνες στις οποίες έχουν εγκλωβιστεί επιλεγµένα στελέχη ζυµών και µπορούν να χρησιµοποιηθούν στην οινοποίηση (Lebeau et al., 1998; Gryta, 2002) Υποστρώµατα ακινητοποίησης κυττάρων Τα υλικά των υποστρωµάτων µπορούν να διακριθούν σε (α) οργανικά όπως τα άλατα του αλγινικού οξέος (Colagrande et al., 1994; Ciani and Ferraro, 1996; Suzzi et al., 1996; Ferraro et al., 2000; Champagne and Gardner, 2001), η κυτταρίνη (Lommi and Advenainen, 1990), η κ-καραγεννάνη (Adhikari et al., 2000; Adhikari et al., 2002; Adhikari et al., 2003) και η χιτοζάνη (Spagna et al., 2001). (β) Τα ανόργανα υποστρώµατα όπως η κίσσηρη (Bakoyianis et al., 1992; Bakoyianis et al., 1993; Argiriou et al., 1996), η γ-αλουµίνα (Loukatos et al., 2000) και το γυαλί (Ogbonna et al., 1989). (γ) Τα φυσικά προϊόντα όπως η γλουτένη (Bardi et al., 1996; Bardi et al., 1997; Bekatorou et al., 2001), τα απολιγνινοποιηµένα κυτταρινούχα υλικά (Bardi and Koutinas, 1994; Iconomopoulou et al., 2000; Iconomopoulou et al., 2002; Iconomopoulou et al., 2003), το µήλο (Kourkoutas et al., 2001), το κυδώνι (Kourkoutas et al., 2003), το αχλάδι (Mallios et al., 2004), το καρπούζι (Reddy et al., 2008), οι σταφίδες (Tsakiris et al., 2004a; Tsakiris et al., 2004b, Tsakiris et al., 2006) και οι φλοιοί των πορτοκαλιών (Plessas et al., 2007). (δ) Επίσης µπορούν να χρησιµοποιηθούν συστήµατα µεµβρανών (Takaya et al., 2002) Τα ακινητοποιηµένα κύτταρα στα γαλακτοκοµικά προϊόντα Η χρήση της ακινητοποίησης στην παραγωγή γαλακτοκοµικών προϊόντων έχει µελετηθεί αρκετά και έχει ως κύριους στόχους τη βελτίωση της βιωσιµότητας των ακινητοποιηµένων µικροοργανισµών, τη µείωση του χρόνου ζύµωσης καθώς και τη βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των προϊόντων του γάλακτος. Έτσι, για τη συνεχή ζύµωση του γάλακτος και του τυρογάλακτος έχει προταθεί η ακινητοποίηση των γαλακτικών βακτηρίων σε κ-καραγενάνη σε συνδυασµό µε κόµµι χαρουπιού. Το παραπάνω σύστηµα παρέµεινε σταθερό περισσότερο από επτά 28

44 εβδοµάδες (Sodini et al., 1997; Lamboley et al., 1999; Lamboley et al., 2001). Επίσης, η ακινητοποίηση του B. longum και η χρήση του βιοκαταλύτη στο γάλα, βελτίωσε τη βιωσιµότητά του κατά τη διάρκεια κατάψυξης του προϊόντος. Η συντήρηση της βιωσιµότητας των µικροοργανισµών από την προσθήκη της καλλιέργειας στο τρόφιµο µέχρι την κατανάλωσή του, ακόµη και για την περίπτωση της κατάψυξης ως µεθόδου συντήρησης, είναι απαραίτητη προϋπόθεση στην περίπτωση των προβιοτικών βακτηρίων (Truelstrup-Hansen et al., 2002). Σε άλλη µελέτη, η ακινητοποίηση κυττάρων D. hansenii UFV-1 σε αλγινικό ασβέστιο οδήγησε σε σηµαντική αύξηση του ρυθµού υδρόλυσης των ολιγοσακχαριτών γάλακτος σόγιας και βελτίωσε τη θρεπτική αξία του προϊόντος. Παράλληλα, βελτίωσε την πέψη του από τον ανθρώπινο οργανισµό (de Souza Júnior et al., 2009). Σε κατεψυγµένο γαλακτοκοµικό επιδόρπιο, η ακινητοποίηση του L. acidophilus και των Bifidobacterium spp. σε αλγινικό ασβέστιο βελτίωσε τη βιωσιµότητα των παραπάνω βακτηρίων (Shah and Ravula, 2000). Σε κρέµα γάλακτος, η ακινητοποίηση µεικτής καλλιέργειας λακτόκοκκων στον ίδιο φορέα είχε ως αποτέλεσµα τη µείωση του χρόνου ζύµωσης κατά 60% (Prévost and Diviès, 1992). Οι Sheu και Marshall (1993) αναφέρουν ότι η βιωσιµότητα των λακτοβακίλλων σε παγωτό αυξήθηκε κατά 40% µε την ακινητοποίησή τους σε αλγινικό ασβέστιο. Από τους πρώτους που µελέτησαν τη συνεχή ζύµωση του γάλακτος για την παραγωγή γιαουρτιού ήταν οι Prévost και Diviès (1988a, 1988b). Η ακινητοποίηση των L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus σε κάψουλες αλγινικού ασβεστίου, µείωσε σηµαντικά το χρόνο ζύµωσης του προϊόντος. Σε µετέπειτα έρευνα, ο εγκλωβισµός των B. longum B6 και B. longum ATCC σε κ-καραγενάνη, προστάτευσε τα προβιοτικά βακτήρια αυξάνοντας τη βιωσιµότητά τους σε γιαούρτι κατά τη διάρκεια της αποθήκευσής του σε συνθήκες κατάψυξης. Στην ίδια εργασία, ο εγκλωβισµός των Bifidobacteria σε κ-καραγενάνη βελτίωσε τη βιωσιµότητά τους και σε συνθήκες ψύξης του γιαουρτιού για 30 ηµέρες (Adhikari et al., 2000). Οι Picot και Lacroix (2004) ακινητοποίησαν κύτταρα σε πρωτεΐνες τυρογάλακτος µε τη µέθοδο εγκλωβισµού των κυττάρων. Ως αποτέλεσµα αυτού ήταν η βιωσιµότητα των µικροοργανισµών να αυξηθεί σε σχέση µε τα ελεύθερα κύτταρα κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης γιαουρτιού στους 4 C. Στο τυρί έχουν προτείνει την ακινητοποίηση ενζύµων, όπως είναι η ρεννίνη, µε σκοπό τη δυνατότητα επαναχρησιµοποίησής τους και τη µείωση των απωλειών κατά τη διάρκεια της παραγωγικής διαδικασίας (Carlson, 1984; Anprung et al., 1989). Σε πρόσφατη έρευνα σχεδιάστηκε 29

45 αντιδραστήρας για τη συνεχή παραγωγή τυριού χρησιµοποιώντας για την πήξη του γάλακτος πρωτεάση που είχε ακινητοποιηθεί σε ακρυλικό πολυµερές. Το σύστηµα λειτούργησε για δύο µήνες χωρίς να επηρεάσει αρνητικά την ποσότητα και την ποιότητα του τυριού (Channe and Shewale, 1998a). Έχει βρεθεί ότι η παραπάνω ακινητοποιηµένη πρωτεάση µπορεί να διατηρήσει την δραστικότητά της έως και 100 ηµέρες (Channe and Shewale, 1998b). Οι Prévost και Diviès (1987) ακινητοποίησαν κύτταρα S. lactis subsp. diacetylactis και S. cremoris σε αλγινικό ασβέστιο και βελτίωσαν τους χρόνους ζύµωσης και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του φρέσκου τυριού. Παρόµοια αποτελέσµατα παρουσιάζονται και από τους Sodini et al. (1997) και Sodini-Gallot et al. (1995) µε την ακινητοποίηση µεικτής καλλιέργειας οξυγαλακτικών βακτηρίων σε κ-καραγενάνη. Η ακινητοποίηση κυττάρων L. casei σε κοµµάτια φρούτων έχει βρεθεί ότι αυξάνει τη βιωσιµότητα της αρχικής καλλιέργειας κατά την παραγωγή και την ωρίµανση τυριού τύπου φέτας, ενώ παράλληλα βελτιώνει τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος (Kourkoutas et al., 2006a) Ξήρανση µικροοργανισµών Λυοφιλίωση Η λυοφιλίωση χρησιµοποιείται ως µέθοδος ξήρανσης στη συντήρηση τροφίµων και την παρασκευή φαρµάκων. Το προς ξήρανση δείγµα καταψύχεται και στη συνέχεια τοποθετείται µέσα σε θάλαµο υψηλού κενού. Το παγωµένο νερό εξαχνώνεται αφού προηγουµένως έχει γίνει υψηλό κενό µε τη βοήθεια αντλίας κενού. Αναλυτικότερα, όταν η θερµοκρασία είναι χαµηλότερη από 0 C, σχηµατίζεται καθαρός πάγος στο εσωτερικό του προς ξήρανση δείγµατος, ο οποίος µπορεί να εξαχνωθεί µε την εφαρµογή του κενού. Η εξάχνωση αρχικά πραγµατοποιείται στην επιφάνεια του προϊόντος και βαθµιαία προχωρά προς το εσωτερικό του. Αφού η διαδικασία της κατάψυξης είναι γρήγορη, σχηµατίζονται µόνο µικροί κρύσταλλοι πάγου. Η αργή ψύξη θα σχηµάτιζε πολύ µεγαλύτερους κρυστάλλους πάγου και θα µπορούσε να καταστρέψει τη δοµή του δείγµατος, µε την είσοδο κρυστάλλων στα κυτταρικά τοιχώµατα. Στο στάδιο της εφαρµογής κενού, η χαµηλή πίεση προστατεύει τα παγωµένα δείγµατα από το να λιώσουν και επιταχύνει το επόµενο στάδιο της διαδικασίας που είναι το πρωταρχικό στάδιο της ξήρανσης. Η εξάχνωση του πάγου διασφαλίζει ότι η δοµή του δείγµατος παραµένει ανέπαφη. Κατά τη 30

46 διάρκεια του πρώτου σταδίου της ξήρανσης, περίπου το 95% του νερού αποµακρύνεται από το προϊόν. Τα κυριότερα µέρη των εργαστηριακών συσκευών λυοφιλίωσης είναι ο θάλαµος κατάψυξης, ο ψυχόµενος συµπυκνωτής, από τον οποίο διέρχονται οι υδρατµοί ενώ παράλληλα παρέχει τη δυνατότητα αποµάκρυνσης του σχηµατιζόµενου πάγου χωρίς να διακόπτεται το κενό στους θαλάµους, και η αντλία κενού που διατηρεί την πίεση µέσα στο θάλαµο κάτω των 4 mm Hg (Ζουµπούλης και συν., 2009). Η ιστορία της λυοφιλίωσης ξεκινάει από τους Ίνκας και τους Ινδιάνους που χρησιµοποιούσαν την τεχνική αυτή για να συντηρούν τις πατάτες. Συγκεκριµένα, έφτιαχναν έναν πολτό τον οποίο αφυδάτωναν, εκθέτοντάς τον στο ψύχος και την ελαττωµένη ατµοσφαιρική πίεση που επικρατεί στο µεγάλο υψόµετρο του Περού. Έτσι παρασκεύαζαν µια σκόνη που µπορούσε να συντηρηθεί έως και τέσσερα χρόνια. Στην Ευρώπη, το 1890, ο Altman τοποθέτησε βιολογικούς ιστούς, παγωµένους στους -15 C, σε ξηραντήρα και στη συνέχεια εφάρµοσε κενό (Couriel, 1980). Η µεγάλη ζήτηση για ευαίσθητα αντιβιοτικά και πλάσµα αίµατος τις πρώτες δεκαετίες του 20 ου αιώνα, οδήγησε στην εκτεταµένη µελέτη της λυοφιλίωσης και την ανάπτυξή της σε βιοµηχανική κλίµακα (Adams, 2007). Τα πλεονεκτήµατα της λυοφιλίωσης είναι τα εξής (Ratti, 2001; Adams, 2007): ιατήρηση των µορφολογικών, βιοχηµικών και γενετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων. υνατότητα ξήρανσης µεγάλων ποσοτήτων. Συντήρηση της βιωσιµότητας των µικροοργανισµών και της δραστικότητας των πρωτεϊνών, των πεπτιδίων και των φαρµακευτικών ενεργών ουσιών. Ηπιότερες συνθήκες ξήρανσης σε σχέση µε άλλες µεθόδους. Μικρές πιθανότητες µόλυνσης του δείγµατος λόγω της αποµάκρυνσης έως και 98% της υγρασίας. υνατότητα γρήγορης και τέλειας επανυδάτωσης του δείγµατος. Εκτός από τα παραπάνω πλεονεκτήµατα η µέθοδος της λυοφιλίωσης παρουσιάζει και µειονεκτήµατα. Το υψηλό κόστος εγκατάστασης και εξοπλισµού, η κατανάλωση µεγάλων ποσών ενέργειας, η πολυπλοκότητα και ο σχετικά µεγάλος χρόνος της διεργασίας περιορίζουν πολλές φορές την εφαρµογή της µεθόδου (Mille et al., 2004). Η βιωσιµότητα των λυοφιλιωµένων κυττάρων µπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι η χρήση προστατευτικών 31

47 µέσων, το είδος του µικροοργανισµού, η ηλικία της καλλιέργειας, η υγρασία και η θερµοκρασία κατά την αποθήκευση, η διάρκεια της ξήρανσης, η τελική θερµοκρασία ψύξης, το µέσο και η θερµοκρασία επανυδάτωσης των λυοφιλιωµένων κυττάρων, η θερµοκρασία και το µέσο ανάπτυξης των κυττάρων (Gehrke et al., 1992; Jennings et al., 1993; Palmfeldt et al., 2003; Carvalho et al., 2004). Έχει βρεθεί ότι η αποθήκευση των λυοφιλιωµένων κυττάρων σε θερµοκρασίες ψύξης σε συνδυασµό µε τη χαµηλή υγρασία και την απουσία οξυγόνου συντελεί σε υψηλά ποσοστά βιωσιµότητας (Gehrke et al., 1992). Η χρήση κρυοπροστατευτικών µέσων µπορεί να βελτιώσει τη βιωσιµότητα των κυττάρων κατά τη λυοφιλίωση εµποδίζοντας το σχηµατισµό πάγου ενδοκυτταρικά. Κάποια από τα κρυοπροστατευτικά µέσα που έχουν µελετηθεί είναι η γλυκερόλη (Nei, 1961; Gehrke et al., 1992), διαλύµατα σακχάρων (Berny and Hennebert, 1991; Abadias et al., 2001), η τρεαλόζη (Crowe and Crowe, 1984; Jennings, 1993; Conrad et al., 2000; Zayed and Roos, 2004), το αποβουτυρωµένο γάλα (Da Silva et al., 1992; Gehrke et al., 1992; Champagne et al., 1996; Iconomopoulou et al., 2000), οι µαλτοδεξτρίνες (Champagne et al., 1996; Lodato et al., 1999), η ζελατίνη (Champagne et al., 1996), η πηκτίνη (Capela et al., 2006), οι πρωτεΐνες και τα αµινοξέα (Berny and Hennebert, 1991). Ορισµένες εργασίες αναφέρουν µεγαλύτερη βιωσιµότητα των µικροοργανισµών όταν ψύχονται χωρίς την παρουσία προστατευτικού µέσου (Jennings, 1993; Parthuisot et al., 2003) Βιοµηχανική λυοφιλίωση Η ξήρανση µε τη µέθοδο της λυοφιλίωσης εφαρµόστηκε σε βιοµηχανική κλίµακα για πρώτη φορά το 1940 µε σκοπό να εξυπηρετήσει τις ανάγκες του πληθυσµού για ξηρό πλάσµα αίµατος. Έπειτα η λυοφιλίωση χρησιµοποιήθηκε στη βιοµηχανία παραγωγής αντιβιοτικών και άλλων βιολογικών υλικών καθώς και τροφίµων. Τα λυοφιλιωµένα προϊόντα που έχουν αποθηκευτεί κατάλληλα, µπορούν να συντηρηθούν για µεγάλο χρονικό διάστηµα διατηρώντας τις φυσικές, χηµικές, βιολογικές και οργανοληπτικές ιδιότητες των αντίστοιχων φρέσκων προϊόντων. Συγκεκριµένα, η αποθήκευση των προϊόντων σε συσκευασίες που δεν επιτρέπουν την επαφή µε το οξυγόνο, αποτρέπει την οξείδωση του λίπους τους που οφείλεται στη χαµηλή υγρασία (Ibarz and Barbosa-Cánovas, 2003). 32

48 Εικόνα 2. Λυοφιλιωτής βιοµηχανικής κλίµακας (Walsh, 2003). Στη βιοµηχανία, η λυοφιλίωση εφαρµόζεται είτε σε υγρά τρόφιµα όπως ο καφές, το τσάι, οι σούπες και οι χυµοί, είτε σε στερεά προϊόντα όπως τα φρούτα, τα λαχανικά και το κρέας. Τα τρόφιµα αυτά απλώνονται σε επίπεδα, µεταλλικά ράφια τα οποία εισάγονται ανά 20 ή 30 µε κατακόρυφη τοποθέτηση στο θάλαµο κατάψυξης µε θερµοκρασία 40 C. Σε µερικές περιπτώσεις, όπως στον καφέ, το τρόφιµο πρέπει αµέσως να τεµαχιστεί σε µικρότερα κοµµάτια ή να µετατραπεί σε σκόνη. Ακολουθεί η µεταφορά των τροφίµων στο θάλαµο ξήρανσης (Εικόνα 2) όπου πραγµατοποιείται η εξάχνωση του προιόντος µε την εφαρµογή του κενού. Μετά την εξαγωγή των λυοφιλιωµένων δειγµάτων, ο θάλαµος ξήρανσης κλείνει ξανά και αποστειρώνεται µε θέρµανση. Η αύξηση της θερµοκρασίας προκαλείται µε ακτινοβολία από λάµπες θερµότητας ή µε τη χρήση θερµαινόµενων ραφιών (Walsh, 2003). Σχέδιο ενός συστήµατος λυοφιλίωσης σε βιοµηχανική κλίµακα παρουσιάζεται στο σχήµα 1. Η άµεση συσκευασία του τροφίµου είναι απαραίτητη ώστε να αποτραπεί η επαφή του µε το οξυγόνο και την υγρασία της ατµόσφαιρας (Ratti, 2001). Οι ερευνητικές εργασίες που αφορούν τη λυοφιλίωση σε βιοµηχανική κλίµακα είναι ελάχιστες λόγω του υψηλού οικονοµικού κόστους της µεθόδου. Ο Sagara (2001) παρουσίασε την εγκατάσταση ενός βελτιωµένου συστήµατος λυοφιλίωσης σε βιοµηχανία παραγωγής αφυδατωµένης σούπας. Ο έλεγχος της θερµοκρασίας στην επιφάνεια του τροφίµου κατά τη λυοφιλίωση και η διατήρησή της σε σταθερό επίπεδο κατά τη θέρµανσή του, µπορεί να µειώσει το χρόνο της ξήρανσης περισσότερο από 4 ώρες. Έτσι, απαιτείται λιγότερη ενέργεια και το οικονοµικό ώφελος για τη βιοµηχανία είναι σηµαντικό. 33

49 Σχήµα 1. Σχέδιο βιοµηχανικής εγκατάστασης λυοφιλίωσης. (1) Θάλαµος ξήρανσης, (2) ψυχόµενο ή θερµαινόµενο ράφι, (3) συµπυκνωτής υδρατµών σε κατάσταση πάγου, (4) αντλία κενού, (5) κυκλική αντλία κενού, (6) µονάδα ψύξης, (7) µονάδα θέρµανσης, (8) δοχείο συλλογής πάγου, (9) κυκλοφορητής και (10) φίλτρο αέρα (Pakowsi and Mujumdar, 2007) Θερµική ξήρανση Ξήρανση θεωρείται το φαινόµενο της αποµάκρυνσης ενός υγρού, συνήθως νερού, που περιέχεται εντός στερεού σώµατος δια της θερµικής εξάτµισης. Το φαινόµενο συντελείται δια της ταυτόχρονης µεταφοράς θερµότητας και µάζας. Η θερµότητα παρέχεται συνήθως στο στερεό από το θερµό αέρα της ξήρανσης, που µεταφέρει µαζί του και την αφαιρούµενη από το στερεό υγρασία. Έτσι στο προϊόν ή/και στο µικροοργανισµό µε την περιεχόµενη υγρασία που υπόκεινται σε θερµική ξήρανση, λαµβάνουν χώρα δύο διεργασίες οι οποίες γίνονται ταυτόχρονα. Η µία αφορά τη µεταφορά ενέργειας υπό µορφή θερµότητας, από το περιβάλλον προς το σώµα. Η άλλη διεργασία αφορά τη µεταφορά της υγρασίας, από το εσωτερικό προς την επιφάνεια του µικροοργανισµού και από τη διεπιφάνεια στερεού-αερίου προς το µέσο ξήρανσης (θερµός αέρας). ηλαδή η υγρασία διαχέεται εντός του δείγµατος από το εσωτερικό προς την επιφάνεια και από εκεί απάγεται από το ρεύµα του θερµού αέρα. Από το ρυθµό µε τον οποίον εξελίσσονται αυτά τα φαινόµενα εξαρτάται και ο συνολικός ρυθµός της ξήρανσης (Bruin and Luyben, 1980). 34