Σχετικός προσανατολισμός των ηλεκτρικών διπολικών ροπών πρωτεϊνών σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΝΑΝΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ & ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της φοιτήτριας Μαραδίδου Στυλιανής με θέμα: Σχετικός προσανατολισμός των ηλεκτρικών διπολικών ροπών πρωτεϊνών σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Επιβλέπων: Παπαδόπουλος Γεώργιος Συνεπιβλέπων: Λογοθετίδης Στέργιος Συνεπιβλέπουσα: Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 4 ABSTRACT 5 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Εισαγωγή στα σύμπλοκα πρωτεϊνών Εισαγωγή Δομή πρωτεϊνών Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών τεταρτοταγής δομή Ομοδιμερή και ετεροδιμερή πρωτεϊνικά σύμπλοκα Προσδιορισμός πρωτεϊνικών συμπλόκων 12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Μέθοδος Docking Μοντελοποίηση πρωτεϊνικών συμπλόκων Πρόβλεψη των πρωτεϊνικών συμπλόκων Scoring Function 23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ηλεκτρική διπολική ροπή πρωτεϊνών Ηλεκτρική διπολική ροπή Ηλεκτρική διπολική ροπή των πρωτεϊνών Παράγοντες που επηρεάζουν τη διπολική ροπή 30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Επιλογή και προετοιμασία του συστήματος μελέτης Επιλογή των πρωτεϊνικών συμπλόκων Προετοιμασία των πρωτεϊνικών συμπλόκων Έλεγχος της ακεραιότητας της δομής Προσθήκη υδρογόνων Περιγραφή των scripts προετοιμασίας των δομών Ανάλυση πρωτεϊνικών συμπλόκων Γωνία διπόλων Ηλεκτροστατική ενέργεια Διεπιφάνεια συμπλόκων Παράμετρος interface_ area /

3 3 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Αποτελέσματα και συζήτηση Ομοδιμερή σύμπλοκα Ετεροδιμερή σύμπλοκα 56 ΕΠΙΛΟΓΟΣ 66 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 68 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α 74 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β 80 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Γ 84

4 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στις περισσότερες βιολογικές διεργασίες υπάρχει η ανάγκη συνεργασίας πρωτεϊνών, οι οποίες δρουν σε συνδυασμό. Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα μπορούν να σχηματιστούν με τη δράση μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων, συμπεριλαμβανομένων των δεσμών υδρογόνου, Van-der Waals και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Στα πλαίσια της κατανόησης της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών έχουν αναπτυχθεί πειραματικές τεχνικές υψηλής απόδοσης για την ανίχνευση του σχετικού προσανατολισμού των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν. Την αδυναμία των πειραματικών τεχνικών να ορίσουν το πώς οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν έρχονται να καλύψουν οι επιστήμονες με την ανάπτυξη υπολογιστικών μεθόδων ικανών να προβλέψουν με αυτόματο τρόπο την τριδιάστατη δομή των πρωτεϊνικών συμπλόκων, όπως το docking πρωτεϊνών. Στόχος μας ήταν να μελετηθεί ο σχετικός προσανατολισμός των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των πρωτεϊνών σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Μια παράμετρος που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στο docking πρωτεϊνών για να αναδείξει τις περισσότερο πιθανές αλληλεπιδράσεις. Στο πλαίσιο αυτής της μελέτης προέκυψαν κατανομές πιθανοτήτων των γωνιών που σχηματίζουν οι ηλεκτρικές διπολικές ροπές των πρωτεϊνών στα σύμπλοκα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την βελτίωση των αποτελεσμάτων που παίρνουμε από το docking πρωτεϊνών.

5 5 ABSTRACT In most biological processes there is a need for cooperation of proteins, which act in tandem. Protein complexes can be formed by a variety of non -covalent interactions, including hydrogen bonds, Van-der Waals and electrostatic interactions. In order to understand the interaction of proteins experimental techniques of high efficiency have been developed for the detection of interacting proteins. Scientists trying to surpass the inability of the experimental techniques to define the relative orientation of interacting proteins develop computational methods capable to provide automatically the three-dimensional structure of protein complexes, such as protein docking. Our goal was to study the relative orientation of the electric dipole moments of proteins in protein complexes. This is a parameter that could be used in protein docking to identify the probable protein orientations. The result of this study is to obtain probability distributions of the angle between the electric dipole moments of proteins in the complexes. These probability distributions can be then used to improve the results obtained from protein docking.

6 6 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα σύμπλοκα πρωτεϊνών 1.1 Εισαγωγή Οι μοριακές αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, ενζύμου-υποστρώματος, πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος, φαρμάκου-πρωτεΐνης, και φαρμάκου-νουκλεϊκού οξέος παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές βασικές βιολογικές διαδικασίες, όπως η μεταγωγή σήματος, η κυτταρική ρύθμιση, ο έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων, η αναστολή των ενζύμων, η αναγνώριση αντισώματος-αντιγόνου, και η συγκρότηση των πρωτεϊνών. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις πολύ συχνά οδηγούν στον σχηματισμό σταθερών συμπλόκων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή πρωτεΐνης-προσδέτη που είναι απαραίτητα για την εκτέλεση των βιολογικών λειτουργιών. Η τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για την κατανόηση της λειτουργίας και της συγγένειας πρόσδεσης μεταξύ των αλληλεπιδρώντων μορίων. Ωστόσο, είναι συχνά δύσκολο και δαπανηρό να ληφθούν πολύπλοκες δομές με πειραματικές μεθόδους, όπως η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ ή το NMR. Έτσι, η υπολογιστική μέθοδος του docking θεωρείται μια σημαντική προσέγγιση για την κατανόηση της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή πρωτεΐνης-προσδέτη. 1.2 Δομή πρωτεϊνών Οι πρωτεΐνες είναι τα πιο πολυδύναμα μακρομόρια στους ζώντες οργανισμούς και εξυπηρετούν βασικές λειτουργίες σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες. Λειτουργούν ως καταλύτες, μεταφορείς και αποθηκευτές άλλων μορίων όπως το οξυγόνο, παρέχουν μηχανική στήριξη και ανοσοπροστασία, δημιουργούν κίνηση, διαβιβάζουν νευρικές ώσεις και ρυθμίζουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση. Οι πρωτεΐνες είναι βιολογικά μακρομόρια που αποτελούνται από αλληλουχίες

7 7 αμινοξέων και η λειτουργία τους σχετίζεται άμεσα με τη διαμόρφωσή τους στον χώρο. Η αναδίπλωση της πεπτιδικής αλυσίδας προσδίδει στην πρωτεΐνη συγκεκριμένο σχήμα στον χώρο. Η τελική αρχιτεκτονική, η μορφή, του κάθε πρωτεϊνικού μορίου δομείται σε τέσσερα μερικώς ανεξάρτητα επίπεδα, από το απλούστερο, την πρωτοταγή δομή ως το πιο σύνθετο την τεταρτοταγή [2]. Τα τέσσερα επίπεδα οργάνωσης των πρωτεϊνών (Εικόνα 1) είναι τα εξής: Πρωτοταγής δομή: είναι η αλληλουχία των αμινοξέων της πρωτεΐνης και αποτελεί την ταυτότητα της πρωτεΐνης αφού ουσιαστικά είναι αυτή που καθορίζει και τις υπόλοιπες δομές. Η ίδια η πρωτοταγής δομή καθορίζεται απευθείας από την αλληλουχία των βάσεων του DNA, μετά τις τροποποιήσεις που υφίσταται σε επίπεδο μεταγραφής σε RNA και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Δευτεροταγής δομή: αναφέρεται στη διάταξη στο χώρο των ατόμων που απαρτίζουν τη ραχοκοκαλιά της πεπτιδικής αλυσίδας και σταθεροποιείται από δεσμούς υδρογόνου. Οι δεσμοί αυτοί αναπτύσσονται κυρίως ανάμεσα σε άτομα υδρογόνου και οξυγόνου διαφορετικών πεπτιδικών δεσμών της αλυσίδας. Ουσιαστικά, περιγράφει τον τρόπο που αναδιπλώνεται η πεπτιδική αλυσίδα προκειμένου να διαμορφώσει τη διάταξή της στον χώρο. Οι δυο βασικές περιοδικές διαμορφώσεις των πρωτεϊνών η α-έλικα και η β-επιφάνεια ανακαλύφθηκαν το 1951 από τους Pauling και Corey. Εικόνα 1. Τα τέσσερα επίπεδα οργάνωσης της αιμοσφαιρίνης.

8 8 Τριτοταγής δομή: Η τριτοταγής δομή περιγράφει την τοποθέτηση στο χώρο όλων των ατόμων μιας πεπτιδικής αλυσίδας. Σημαντικό ρόλο σε αυτήν την περίπτωση παίζουν οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις πλευρικές ομάδες των αμινοξέων και στη σταθερότητα της δομής συμβάλουν οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις των υδρόφοβων αμινοξέων. Η εγγύτητα των μορίων επιτρέπει ακόμη στενότερη αλληλεπίδραση μεταξύ τους με δυνάμεις van der Waals. Τα υδρόφιλα αμινοξέα συνήθως διατάσσονται προς την εξωτερική επιφάνεια των πρωτεϊνών καθιστώντας τες υδατοδιαλυτές. Όταν βρίσκονται στο εσωτερικό των πρωτεϊνών αλληλεπιδρούν μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου, ηλεκτροστατικές δυνάμεις και αλληλεπιδράσεις διπόλων με ιόντα και διπόλου διπόλου. Ορισμένοι συμπαράγοντες, όπως μεταλλικά ιόντα, σταθεροποιούν την αναδίπλωση ορισμένων πρωτεϊνών καθώς αλληλεπιδρούν με ιοντισμένα ή πολικά αμινοξέα και σε κάποιες περιπτώσεις συμμετέχουν στην πρωτεϊνική λειτουργία και δράση. Τεταρτοταγής δομή: πολλές πρωτεΐνες και ένζυμα αποτελούνται από περισσότερες από μια πεπτιδικές αλυσίδες που μπορεί να είναι ίδιες ή διαφορετικές. Ο τρόπος με τον οποίο διατάσσονται στον χώρο οι πεπτιδικές υπομονάδες περιγράφεται στην τεταρτοταγή δομή. Στη διαμόρφωση αυτή συμμετέχουν κατά κανόνα δευτερεύοντες δεσμοί, δηλαδή δεσμοί υδρογόνου και ιοντικές, πολικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Μονομερείς πρωτεΐνες, που αποτελούνται δηλαδή από ένα μόνο πρωτεϊνικό μόριο, δε διαθέτουν τεταρτοταγή δομή. 1.3 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών τεταρτοταγής δομή Πολλές βιολογικές λειτουργίες περιλαμβάνουν τον σχηματισμό συμπλόκων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Για τη δημιουργία των υπερπρωτεϊνικών αυτών συμπλόκων ισχύουν οι ίδιοι κανόνες με αυτούς που ισχύουν για την αλληλεπίδραση των δομικών αυτοτελών περιοχών για την δημιουργία της τριτοταγούς δομής. Ωστόσο, διαφορετικοί τύποι συμπλόκων παρατηρούνται σε συγκεκριμένες λειτουργίες όπως στην περίπτωση των ριβοσωμάτων, που είναι πρωτεϊνικά σύμπλοκα υψηλής σταθερότητας σε αντίθεση με τα σύμπλοκα που σχηματίζονται στα σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία σημαντικό ρόλο παίζουν οι παροδικές αλληλεπιδράσεις (transient interaction). Οι αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών μπορούν να ταξινομηθούν με

9 9 βάση τη σύνθεση τους σε ομο- και ετερο- ολιγομερή σύμπλοκα, με βάση τη συγγένεια σε non-obligate και obligate σύμπλοκα, με βάση τον χρόνο ζωής τους σε παροδικά και μόνιμα σύμπλοκα και τέλος με βάση την ειδίκευση σε εξειδικευμένες και μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις [5]. Τα σύμπλοκα στα οποία οι αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν μεταξύ πανομοιότυπων αλυσίδων ονομάζονται ομο-ολιγομερή σύμπλοκα. Ενώ στη περίπτωση που οι αλληλεπιδράσεις συμβαίνουν μεταξύ μη πανομοιότυπων αλυσίδων σχηματίζονται τα ετερο-ολιγομερή σύμπλοκα. Τα ομο-ολιγομερή σύμπλοκα είναι συμμετρικά και παρέχουν ένα καλό ικρίωμα για τον σχηματισμό σταθερών μακρομορίων [52]. Στην περίπτωση όμως των ετερο-ολιγομερών συμπλόκων η σταθερότητά τους ποικίλει και έτσι μπορούν να συγκεντρωθούν διαφορετικές πρωτεΐνες ώστε να συνεργαστούν σε ένα ενιαίο μακρομόριο. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι ο σχηματισμός των σταθερών διμερών α/β σωληνίνης τα οποία σχηματίζουν μακριά πρωτονημάτια που είναι συστατικά των μικροσωληνίσκων [53]. Η διαφοροποίηση μεταξύ των obligate και των non-obligate συμπλόκων όπως αναφέρθηκε βασίζεται στη συγγένεια (συνάφεια affinity). Αν οι αλυσίδες (μονομερή) ενός συμπλόκου είναι ασταθείς από μόνες τους in vivo, τότε εμφανίζουν obligate αλληλεπίδραση. Αντίθετα τα σύμπλοκα που αποτελούνται από αλυσίδες οι οποίες συγκροτούν σταθερή τριτοταγή από μόνες τους (ανεξάρτητα μονομερή) εμφανίζουν non-obligate αλληλεπιδράσεις [8]. Η διάκριση μεταξύ των παροδικών και των μόνιμων συμπλόκων στηρίζεται στη σταθερότητα (ή διάρκεια ζωής) τους [10]. Έτσι, στα μόνιμα (σταθερά) σύμπλοκα οι αλληλεπιδράσεις είναι πολύ σταθερές και μη αναστρέψιμες. Ενώ τα μονομερή στα παροδικά σύμπλοκα συνδέονται και αποσυνδέονται προσωρινά invivo. Τα παροδικά σύμπλοκα, ανάλογα με τον λειτουργικό τους ρόλο στο κύτταρο, έχουν ένα ευρύ φάσμα συγγένειας και διάρκειας ζωής και ως εκ τούτου, μπορούν να ταξινομηθούν περαιτέρω ως ισχυρά και ασθενή [5, 9]. Οι ισχυρές παροδικές αλληλεπιδράσεις (π.χ. ετεροτριμερείς πρωτεΐνης G) μετατοπίζουν την ισορροπία της σύνδεσης/αποσύνδεσης κάτω από ορισμένες συνθήκες. Δομικά και λειτουργικά οι obligate αλληλεπιδράσεις είναι συνήθως μόνιμες ενώ οι non-obligate αλληλεπιδράσεις είναι είτε παροδικές είτε μόνιμες.

10 10 Τέλος, σε πολλές κυτταρικές διεργασίες οι πρωτεΐνες αναγνωρίζουν ειδικούς στόχους και δεσμεύονται. Η εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων καθορίζεται από τις δομικές και φυσικοχημικές ιδιότητες των δυο πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει την ύπαρξη ενός βαθμού συντήρησης των μοτίβων μέσω των οποίων αλληλεπιδρούν οι όμοιες πρωτεΐνες [6]. Η εξειδίκευση της αλληλεπίδρασης παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σημάτων, που εξασφαλίζεται μέσω της αλληλουχίας των αμινοξέων των επικρατειών που αλληλεπιδρούν και στη συνάθροιση των πρωτεϊνών για τη δημιουργία συμπλόκων [54]. Η σωστή λειτουργία των πρωτεϊνών δεν απαιτεί μόνο την σύνδεση με τις ειδικές επικράτειες αλλά και την αποφυγή δημιουργίας μη λειτουργικών αλληλεπιδράσεων και μη εξειδικευμένης συσσωμάτωσης [55]. Η ειδίκευση στην δημιουργία των συσσωματωμάτων προκύπτει από μια ποικιλία χαρακτηριστικών όπως η γεωμετρία, η έκταση των υδρόφοβων περιοχών και η ύπαρξη δομικών υπομονάδων [56]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι πολλές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών δεν εμπίπτουν σε ένα συγκεκριμένο είδος. Αντίθετα, υπάρχει μια συνέχεια μεταξύ των non obligate και των obligate αλληλεπιδράσεων, και η σταθερότητα όλων των συμπλόκων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις φυσιολογικές συνθήκες και το περιβάλλον. Μια αλληλεπίδραση μπορεί να είναι κυρίως παροδική in vivo, αλλά να γίνει μόνιμη υπό ορισμένες κυτταρικές συνθήκες. Δεδομένα αναδίπλωσης, καθώς και στοιχεία σχετικά με τη δυναμική του συμπλόκου σε διάφορες φυσιολογικές συνθήκες ή περιβάλλοντα, συχνά δεν είναι διαθέσιμα. Ωστόσο, η θέση των υπομονάδων στο κύτταρο και η λειτουργία της πρωτεΐνης συχνά υποδεικνύουν τον τύπο της αλληλεπίδρασης. Για παράδειγμα, οι αλληλεπιδράσεις στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση αναμένεται να είναι παροδικές, δεδομένου ότι η λειτουργία τους απαιτεί σύνδεση και απομάκρυνση. 1.4 Ομοδιμερή και ετεροδιμερή πρωτεϊνικά σύμπλοκα Προκειμένου να μελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών ξεκίνησαν να μελετούνται τα μικρότερα συστήματα, τα διμερή, που αποτελούνται από δυο αλυσίδες. Από φυσικοχημική άποψη, δυο οποιεσδήποτε πρωτεΐνες μπορούν να αλληλεπιδράσουν. Το ερώτημα όμως που τίθεται είναι κάτω από ποιες συνθήκες και πόσο ισχυρή μπορεί να είναι αυτή η αλληλεπίδραση. Οι δεσμοί υδρογόνου και οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις διαδραματίζουν καίριο ρόλο, και οι ομοιοπολικοί δεσμοί είναι επίσης σημαντικοί. Πολλές από τις αλληλεπιδράσεις που

11 11 παρατηρήθηκαν in vitro είναι το αποτέλεσμα των πειραμάτων υπερέκφρασης ή το αποτέλεσμα κρυστάλλωσης, γεγονός που περιπλέκει την πρόβλεψη των λειτουργικών αλληλεπιδράσεων [1]. Για να είναι δυνατή η πρόβλεψη του τρόπου αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών, υπάρχει η ανάγκη να καταλάβουμε τις χημικές πτυχές των ενώσεών τους. Αυτές περιλαμβάνουν από τη συμπληρωματικότητα του σχήματος και την υδροφοβικότητα μέχρι τη σταθερότητά τους [14]. Οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν μέσω των διεπιφανειών τους [1]. Οι διεπιφάνειες αποτελούνται από αλληλεπιδρώντα κατάλοιπα που ανήκουν σε δύο διαφορετικές αλυσίδες, μαζί με κατάλοιπα που βρίσκονται σε χωρική γειτνίαση με αυτά. Έτσι, οι διεπιφάνειες αποτελούνται από θραύσματα της καθεμίας αλυσίδας και κάποια μεμονωμένα κατάλοιπα. Κατά συνέπεια, το ενδιαφέρον συνήθως επικεντρώνεται στην επιφάνεια των πρωτεϊνών. Για τον προσδιορισμό των καταλοίπων και των ομάδων ατόμων που καλύπτουν τις επιφάνειες, είναι απαραίτητο να είναι γνωστή η τριδιάστατη δομή των πρωτεϊνών. Ο προσδιορισμός των καταλοίπων και των ατόμων που είναι στην επιφάνεια συνήθως διεξάγεται μέσω υπολογισμού του εμβαδού της επιφανείας που είναι προσβάσιμη στον διαλύτη. Εάν το μόριο αλληλεπιδρά με ένα άλλο μόριο πρωτεΐνης, τα άτομα της επιφανείας του ενός μορίου θα αλληλεπιδρούν με τα άτομα στην επιφάνειας της άλλης πρωτεΐνης. Για την κατανόηση της φύσης των διαμοριακών αλληλεπιδράσεων εξετάζονται διάφορες ιδιότητες της διεπιφάνειας πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, για παράδειγμα, το εμβαδόν της επιφανείας που καλύπτεται από τα αλληλεπιδρώντα μόρια και ποιο κλάσμα του είναι μη πολικό, οι δεσμοί υδρογόνου σε ολόκληρη τη διεπιφάνεια, τα κρυμμένα μόρια νερού, η σύνθεση της διεπιφάνειας, τα συντηρημένα κατάλοιπα, τα κατάλοιπα που συμβάλλουν σημαντικά στην ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης, το σχήμα της διεπιφάνειας σύνδεσης και τα είδη της δευτεροταγούς δομής. Καμιά μεμονωμένη φυσικοχημική ιδιότητα δε διακρίνει επαρκώς τις διεπιφάνειες από την υπόλοιπη επιφάνεια. Από την άλλη πλευρά, η υδροφοβικότητα, η ενέργεια διαλυτοποίησης, η προσβάσιμη περιοχή από διαλύτη και η σύσταση των καταλοίπων δείχνουν τάσεις που διαφέρουν στις διεπιφάνειες έναντι της υπόλοιπης επιφάνειας της πρωτεΐνης. Τα ομοδιμερή, τα οποία είναι συνήθως μόνιμα σύμπλοκα, ως επί το πλείστον αναλύονται ξεχωριστά από τα ετεροδιμερή [3]. Οι διεπιφάνειες των ομοδιμερών μοιάζουν με τον πυρήνα των πρωτεϊνών. Είναι συνήθως μεγάλες, υδρόφοβες καθώς σε αυτές βρίσκονται μη πολικές περιοχές, και δείχνουν καλή συμπληρωματικότητα

12 12 μεταξύ των δύο αλυσίδων [4]. Αυτές οι διεπιφάνειες μπορούν να διακριθούν από την υπόλοιπη επιφάνεια των πρωτεϊνών. Στην περίπτωση όμως των ετεροδιμερών, που οι αλυσίδες διαφέρουν μεταξύ τους, δεν μπορούν να διακριθούν με βάση την έκταση της υδροφοβικότητας τους. 1.5 Προσδιορισμός πρωτεϊνικών συμπλόκων Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών μπορούν να πάρουν πολλές μορφές, πολλές πρωτεΐνες λειτουργούν μόνο σε σύμπλοκα και άλλες μέσω της επαφής με άλλες πρωτεΐνες. Οι αλληλεπιδράσεις είναι πολύ εξειδικευμένες και συχνά μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη είναι σε θέση να αναγνωρίζει την πρωτεΐνη με την οποία αλληλεπιδρά ανάμεσα σε εκατοντάδες χιλιάδες υποψήφιες πρωτεΐνες [7]. Για την ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης έχουν αναπτυχθεί τόσο πειραματικές όσο και μέθοδοι που συνδυάζουν τη Βιοπληροφορική και τη δομική βιολογία [11]. Η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης είναι σημαντική για τη διερεύνηση των μονοπατιών ενδοκυττάριας σηματοδότησης, τη μοντελοποίηση των πρωτεϊνικών πολύπλοκων δομών και για την κατανόηση διαφόρων βιοχημικών διεργασιών. Μια ποικιλία πειραματικών τεχνικών είναι διαθέσιμες για την ανίχνευση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων [6]. Οι αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών μπορούν να αναλυθούν με διαφορετικές γενετικές, βιοχημικές και φυσικές μεθόδους, οι οποίες παρατίθενται στον Πίνακα 1. Μερικές τεχνικές που επιτρέπουν τον έλεγχο ενός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών ενός κυττάρου είναι η τεχνική δύο-υβριδίων (yeast twohybrid, Y2H) [15], tandem affinity purification (TAP) [16], η φασματοσκοπία μάζας (MS) [12], οι μικροσυστοιχίες DNA και πρωτεϊνών και η συνθετική θνησιμότητα (synthetic lethality) [8] (Εικόνα 2). Άλλες μέθοδοι εστιάζουν στην παρακολούθηση και χαρακτηρίζουν συγκεκριμένες βιοχημικές και φυσικοχημικές ιδιότητες ενός συμπλόκου πρωτεϊνών.

13 13 Πίνακας 1. Σύγκριση των πειραματικών μεθόδων για την ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνηςπρωτεΐνης [8]. Οι πιο λεπτομερής πληροφορίες σχετικά με την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών σε ατομικό επίπεδο παρέχονται από την κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ και τη Φασματοσκοπία NMR, αλλά ο αριθμός των λυμένων πρωτεϊνικών συμπλόκων παραμένει σε χαμηλά επίπεδα. Την ίδια στιγμή, η ανίχνευση αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών σε πραγματικό χρόνο in vivo μπορεί να επιτευχθεί με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές. Μία τέτοια ισχυρή τεχνική είναι η fluorescence resonance energy transfer (FRET) [13]. Μια άλλη αποτελεσματική μέθοδος, η surface plasmon resonance (SPR), μπορεί να ανιχνεύσει αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαλυτών προσδετών και ακινητοποιημένων υποδοχέων, ενώ η τεχνική θερμιδομετρίας ισόθερμης τιτλοδότησης (isothermal titration calorimetry - ITC ) επιτρέπει την άμεση μέτρηση της ενθαλπίας σύνδεσης. Πρόσφατα, νέες μέθοδοι έχουν αναπτύχθηκαν για την ανάλυση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων σε επίπεδο ενός μορίου. Για παράδειγμα, η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (atomic force microscopy, AFM) μπορεί με ακρίβεια να μετρήσει τις δυνάμεις των αλληλεπιδράσεων, ενώ τεχνικές φθορισμού μπορούν να χαρακτηρίσουν τις αλλαγές στη διαμόρφωση των πρωτεϊνών κατά τη σύνδεση.

14 14 Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση των κύριων πειραματικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων: (Α) Y2H, ανιχνεύει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών Χ και Υ, όπου το Χ συνδέεται στην περιοχή BD που προσδένεται στην ανάντη αλληλουχία ενεργοποίησης (UAS) ενός προαγωγέα. (Β) MS, προσδιορίζει την αλληλουχία πολυπεπτιδίου. (C) TAP, καθαρίζει τα σύμπλοκα των πρωτεϊνών και απομακρύνει τα μόρια των προσμείξεων. (D) Γονιδιακή ανάλυση συνέκφρασης, παράγει την μήτρα συσχέτισης, όπου οι σκοτεινές περιοχές δείχνουν υψηλή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων. (Ε) Μικροσυστοιχίες πρωτεΐνης (protein chips) μπορούν να ανιχνεύσουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών: οι πρωτεΐνες-στόχος ακινητοποιούνται και ανιχνεύονται τα πρωτεϊνικά ζεύγη με

15 15 επισημασμένες φθορίζουσες πρωτεΐνες. (F) Μέθοδος σύνθετης θνησιμότητας, περιγράφει τη γενετική αλληλεπίδραση όταν δύο μεμονωμένες, μη-θανατηφόρες μεταλλάξεις έχουν ως αποτέλεσμα τη θνησιμότητα όταν χορηγούνται μαζί (α - β - )[6]. Η πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης είναι ένα πεδίο που απασχολεί την Βιοπληροφορική και την δομική Βιολογία, σε μια προσπάθεια να εντοπιστούν και να καταγραφούν οι φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ ζευγών ή ομάδων πρωτεϊνών. Η υπολογιστική πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνηςπρωτεΐνης αποτελείται από δύο κύριους τομείς. Ο πρώτος αφορά τη χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, δηλαδή, το να διερευνηθεί αν οι δύο πρωτεΐνες είναι πιθανόν να αλληλεπιδρούν. Και ο δεύτερος την κατανόηση του μηχανισμού της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και τη ταυτοποίηση των καταλοίπων σε πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις. Στην πρώτη επιτυχημένη υπολογιστική ανάλυση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνηςπρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκε το δομικό πλαίσιο των πρωτεϊνών, προκειμένου να αναλυθούν γνωστές διεπιφάνειες αλληλεπίδρασης και να προσδιοριστούν οι φυσικοί κανόνες που καθορίζουν την εξειδίκευση της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Σε αντίθεση με άλλες υπολογιστικές μεθόδους που χρησιμοποιούν το εξελικτικό ή γονιδιωματικό πλαίσιο για την πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης, οι μέθοδοι που στηρίζονται στη δομή τείνουν να έχουν περισσότερους περιορισμούς, δεδομένου ότι μόνο ένα μικρό ποσοστό πρωτεϊνικών αλληλουχιών έχουν ακριβείς τριδιάστατες δομές που έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων PDB. Ωστόσο, αυτές επιτρέπουν μια πιο λεπτομερή ανάλυση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων από τις μεθόδους που στηρίζονται στο γονιδίωμα. Οι δομικές προσεγγίσεις μπορούν να εξετάσουν όχι μόνο αν οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν, αλλά επίσης να προσδιορίσουν και τα φυσικά χαρακτηριστικά της αλληλεπίδρασης, και τα κατάλοιπα στη διεπιφάνεια των πρωτεϊνών τα οποία διαμεσολαβούν στην αλληλεπίδραση. Οι βάσεις δεδομένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων γίνονται όλο και πιο σημαντικά στοιχεία για την πρόβλεψη της δομής των συμπλόκων πρωτεΐνης [5]. Αν και δεν είναι επίσημα μια βάση δεδομένων, η Protein-Protein Docking Benchmark[ 26], είναι μια συλλογή από σύμπλοκα πρωτεϊνών για τα οποία τόσο η δεσμευμένη όσο και οι μη δεσμευμένες δομές είναι διαθέσιμες, παρέχει μια πολύτιμη πηγή για τη δοκιμή νέων αλγόριθμων σύνδεσης. Αρκετές επιπλέον βάσεις δεδομένων αλληλεπιδράσεων

16 16 πρωτεΐνης-πρωτεΐνης έχουν συνταχθεί, π.χ. PQS, DIP, BIND, DIMER, BID, 3DID, PIBASE, ipfam, INTERDOM, Interpare, 3DComplex, Dockground, I2I, SCOPPI, και PROTCOM. Οι περισσότερες από αυτές τις βάσεις δεδομένων παρέχουν τουλάχιστον την ταυτότητα των καταλοίπων της περιοχής αλληλεπίδρασης, μαζί με στατιστικές που αφορούν την περιοχή αλληλεπίδρασης, όπως η τάση των καταλοίπων και οι κρυμμένες περιοχές.

17 17 Κεφάλαιο 2 Μέθοδος Docking 2.1 Μοντελοποίηση πρωτεϊνικών συμπλόκων Η εξέλιξη των πειραματικών τεχνικών ανίχνευσης πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων όπως η αυτοματοποίηση σε μεγάλη κλίμακα της τεχνικής δυο υβριδίων καθιστά δυνατή την αναγνώριση όλων των πιθανών πρωτεϊνικών ζευγών, και η φασματοσκοπία μάζας (ΜS, mass spectrometry) έχει γίνει ένα ισχυρό εργαλείο για τον εντοπισμό των πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Ο πειραματικός προσδιορισμός συναντά δυσκολίες στην περίπτωση των παροδικών ή ασθενών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πρωτεϊνών. Όλες αυτές οι τεχνικές παρόλο που δίνουν στους ερευνητές πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με το ποιές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν σε έναν οργανισμό, ωστόσο, δεν μπορούν να ορίσουν ακριβώς το πως οι πρωτεΐνες αυτές αλληλεπιδρούν. Η πληροφορία αυτή είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση της κυτταρικής λειτουργίας και των διαδικασιών που σχετίζονται με διάφορα νοσήματα. Η πλήρης κατανόηση αυτών των κυτταρικών διαδικασιών και ο σχεδιασμός μορίων για τη ρύθμισή τους, ιδίως για θεραπευτικούς σκοπούς, απαιτεί γνώση των ατομικών αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε αυτές. Μέσω της φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-χ έχουν λυθεί οι δομές χιλιάδων πρωτεϊνών του ανθρώπινου γονιδιώματος και άλλων γονιδιωμάτων. Ωστόσο, μόνο ένας μικρός αριθμός από αυτές τις δομές αφορά σύμπλοκα πρωτεϊνών. Η πρόβλεψη της δομής του συμπλόκου πρωτεΐνης πρωτεΐνης είναι μεγάλης σπουδαιότητας για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών διαδικασιών αναγνώρισης. Το ενδιαφέρον, λοιπόν, των επιστημόνων στράφηκε στην ανάπτυξη υπολογιστικών μεθόδων ικανών να προβλέψουν με αυτόματο τρόπο την τριδιάστατη δομή των πρωτεϊνικών συμπλόκων, όπως το docking πρωτεϊνών [18].

18 18 Το docking πρωτεϊνών είναι μια υπολογιστική μέθοδος προσομοίωσης για την πρόβλεψη της τριδιάστατης διαμόρφωσης ενός συμπλόκου υποδοχέα-προσδέτη όπου ο υποδοχέας είναι συνήθως μια πρωτεΐνη ή ένα μόριο νουκλεϊκού οξέος και ο προσδέτης είναι είτε ένα μικρό μόριο ή μια άλλη πρωτεΐνη [21]. Σε αντίθεση λοιπόν με τις πειραματικές τεχνικές που αναφέρθηκαν, που καθορίζουν ή προβλέπουν ποιες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν, το docking έχει ως στόχο να προβλέψει πώς αλληλεπιδρούν οι πρωτεΐνες. Λόγω των πρακτικών δυσκολιών, φαίνεται απίθανο να καταστεί δυνατή η λύση των δομών των πρωτεϊνικών συμπλόκων με τη χρήση τεχνικών δομικής γονιδιωματικής (structural genomics techniques). Ως εκ τούτου, οι υπολογιστικές τεχνικές όπως το docking πρωτεϊνών θα αποτελέσουν το σημαντικότερο εργαλείο για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών των βιολογικών συστημάτων [30]. Το 1978, οι Wodak και Janin [17] περιέγραψαν τον πρώτο αυτοματοποιημένο αλγόριθμο docking για την πρόβλεψη της 3D αλληλεπίδρασης μεταξύ της παγκρεατικής θρυψίνης βοός και του φυσικού αναστολέα της. Από τότε, το docking πρωτεϊνών έχει εξελιχθεί σε μια ξεχωριστή υπολογιστική διαδικασία που συγκεντρώνει τεχνικές και γνώσεις από ένα ευρύ φάσμα επιστημών συμπεριλαμβανομένων της φυσικής, της χημείας, της βιολογίας, των μαθηματικών, και της πληροφορικής με στόχο τη μοντελοποίηση in silico της συμπεριφοράς των μακρομορίων όπως οι πρωτεΐνες. Οι αλγόριθμοι docking χρησιμοποιούν μια σειρά από αποτελεσματικές στρατηγικές αναζήτησης και βαθμολόγησης, συμπεριλαμβανομένων του μετασχηματισμού Fourier (Fast Fourier Transform, FFT) συσχετίσεων, το γεωμετρικό hashing, και των τεχνικών Monte Carlo (MC). Αυτές οι προσεγγίσεις παράγουν, κατά κανόνα, μια σχετικά μικρή λίστα με μερικές χιλιάδες υποθετικούς προσανατολισμούς σύνδεσης, μεταξύ των οποίων παρατηρείται και κάποια που προσεγγίζει τον φυσικό τρόπο σύνδεσης. Ωστόσο, παρά τη χρήση βελτιωμένων συναρτήσεων βαθμολόγησης που περιλαμβάνουν την διαλυτότητα (desolvation), την υδροφοβικότητα, και τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, εξακολουθεί να υπάρχει δυσκολία στον προσδιορισμό της βέλτιστης λύσης μέσα από έναν κατάλογο ψευδώς θετικών λύσεων. Ως εκ τούτου, πολλοί αλγόριθμοι docking χρησιμοποιούν πλέον μια διαδικασία δυο σταδίων αναζήτησης και βαθμολόγησης, στην οποίο τεχνικές χρησιμοποιούνται ab initio για να δημιουργηθεί ένας αρχικός κατάλογος πιθανών τρόπων σύνδεσης που στη συνέχεια βαθμολογούνται εκ νέου

19 19 χρησιμοποιώντας τις διαθέσιμες βιοφυσικές πληροφορίες (data-driven docking) και τις πληροφορίες που προέρχονται από την μελέτη των υφιστάμενων διεπιφανειών πρωτεΐνης-πρωτεΐνης [24]. Σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στον τομέα του docking για να βελτιωθεί η υπολογιστική ταχύτητα και η ακρίβεια, ωστόσο κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών έχουν γίνει σημαντικά βήματα και πέρα από αυτό το τομέα. Ο αποτελεσματικός χειρισμός της ευκαμψίας (flexibility) των πρωτεϊνών θεωρείται σήμερα μια από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στον τομέα του docking. Η θέση της περιοχής πρόσδεσης και ο προσανατολισμός κατά την πρόσδεση μπορεί να επηρεαστεί σημαντικά από την ευκαμψία των πρωτεϊνών. Υπάρχουν πολλοί ενδιαφέροντες αλγόριθμοι docking που έχουν δείξει σημαντική πρόοδο στην πρόβλεψη της εγγενούς θέσης δέσμευσης κάνοντας χρήση των βιοφυσικών και βιοχημικών πληροφοριών με τη συμβολή της Βιοπληροφορικής. 2.2 Πρόβλεψη των πρωτεϊνικών συμπλόκων Το μοντέλο «κλειδί-κλειδαριά», όπως διατυπώθηκε από τον Emil Fischer (1894) προκειμένου να περιγράψει τον τρόπο δράσης των ενζύμων, τόνισε τη σημασία των στερεοχημικών φαινομένων στην αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών στη περιοχή δέσμευσης για την επίτευξη της πρόσδεσης. Στο μοντέλο αυτό, η δομή μιας πρωτεΐνης παρέχει ένα θύλακα που επιτρέπει στην συμπληρωματική δομή μιας άλλης πρωτεΐνης να ταιριάξει μέσα σε αυτόν. Αυτό το μοντέλο θα ήταν ιδανικό για την εφαρμογή του στο πρωτεϊνικό docking. Στην περίπτωση αυτή, τα προγράμματα θα μπορούσαν να κινήσουν μια δομή με τέτοιο τρόπο ώστε οι δυο πρωτεΐνες να αλληλεπιδρούν μέσω μιας διεπιφάνειας που θα εμφανίζει φυσικοχημική και γεωμετρική συμπληρωματικό [27]. Στην πραγματικότητα, η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών δεν συμβαίνει μεταξύ δυο άκαμπτων δομών. Η σύνδεση μπορεί και συχνά είναι αποτέλεσμα μεταβολών της δομής των αλληλεπιδρώντων μορίων, και η ειδικότητα επιτυγχάνεται όταν τα δύο μόρια προσαρμόζουν τη δομή τους κατά την δέσμευση. Το γεγονός αυτό περιπλέκει την διαδικασία σύνδεσης, μιας και οι δομικές αλλαγές πρέπει να εισάγονται στα αλληλεπιδρώντα μακρομόρια προκειμένου να παραχθεί μια ακριβής δομή.

20 20 Στο αυτοματοποιημένο docking πρωτεϊνών διακρίνονται δυο γενικές κατηγορίες προσεγγίσεων. Στην πρώτη, το rigid-body docking, και οι δύο πρωτεΐνες θεωρείται ότι είναι εντελώς άκαμπτες, μειώνοντας έτσι τα προβλήματα του docking σε μια αναζήτηση έξι βαθμών ελευθερίας για το βέλτιστο προσανατολισμό. Οι rigid-body docking προσεγγίσεις συνήθως προσανατολίζονται προς τη βελτιστοποίηση του γεωμετρικού ή/και χημικού ταιριάσματος των δύο πρωτεϊνών. Στην περίπτωση που μελετάμε συστήματα ενζύμου αναστολέα και με την δεδομένη υπολογιστή ισχύ ο τυπικός χρόνος εκτέλεσης του πειράματoς είναι της τάξης των λεπτών. Αυτή η υπολογιστική απόδοση επιτρέπει την αυτόματη επιλογή μέσα από βάσεις δεδομένων των πρωτεϊνών με αμοιβαία αλληλεπίδραση. Από την άλλη πλευρά, η αναδιάταξη της δομής των πρωτεϊνών και η διεπιφανειακή διαλυτοποίηση δεν αντιμετωπίζονται σε καμία από τις rigid-body docking προσεγγίσεις. Στη δεύτερη προσέγγιση, το εύκαμπτο docking (flexible docking), οι πρωτεΐνες αντιμετωπίζονται ως εύκαμπτες. Ο βαθμός της ευκαμψίας των πρωτεϊνών που επιτρέπουν οι διάφοροι αλγόριθμοι ποικίλλει. Μερικές προσεγγίσεις λαμβάνουν υπόψη τις σχετικές κινήσεις των πρωτεϊνικών επικρατειών, άλλες την περιστροφή των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων, και άλλες όλους τους βαθμούς ελευθερίας των ατόμων. Αυτές οι προσεγγίσεις βασίζονται στην ελαχιστοποίηση της ενέργειας ή στη βελτιστοποίηση των κριτηρίων με βάση το σχήμα, ή στην εκτέλεση προσομοιώσεων που επιτρέπουν την χρονική περιγραφή της διαδικασίας δέσμευσης. Φυσικά, οι ταχύτητες εκτέλεσης κυμαίνονται από ώρες έως ημέρες για ένα docking. Λόγω του μεγάλου υπολογιστικού κόστους η εξέταση μιας βάσης δεδομένων με χιλιάδες υποτιθέμενες αλληλεπιδράσεις είναι αδύνατο να επιτευχθεί με τα μέσα που υπάρχουν. Πολλά από τα προγράμματα docking που έχουν αναπτυχθεί έως τώρα μοιράζονται κοινά υπολογιστικά βήματα (Εικόνα 2.1). Ακολουθώντας αυτά τα βήματα τα προγράμματα έχουν στόχο να δημιουργήσουν μοντέλα αλληλεπιδράσεων τα οποία βελτιώνονται μέχρι να παράξουν μοντέλα κοντά στα εγγενή. Το πρώτο βήμα είναι η αναζήτηση ενός άκαμπτου μορίου που σαρώνει τις πρωτεΐνες για μια πιθανή θέση αλληλεπίδρασης. Το δεύτερο βήμα περιλαμβάνει την επιλογή μια περιοχής, από τις διαμορφώσεις που παρήχθησαν από το πρώτο βήμα και είναι κοντά σε μια μητρική δομή. Στο τρίτο βήμα γίνεται η βελτιστοποίηση της δομής για να αυξηθεί η πιστότητα της δομής και στο τελευταίο βήμα επιλέγονται τα ακριβέστερα μοντέλα [28, 29].

21 21 Εικόνα 2.1 Τα βήματα του Docking, αναγράφεται ο αριθμός των μοντέλων που συνήθως λαμβάνονται σε κάθε βήμα [29]. Μερικοί από τους αλγορίθμους docking που χρησιμοποιούνται ευρέως για την πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης δύο πρωτεϊνών είναι οι ZDOCK, PIPER, ClusPro, HADDOCK, RosettaDOCK και PatchDock (Πίνακας 2). Αυτοί μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: τις μεθόδους που χρησιμοποιούν τον μετασχηματισμό Fourier (FFT) για να αναζητήσουν την καλύτερη διαμόρφωση της αλληλεπίδρασης κατά τη διάρκεια περιστροφών/μεταθέσεων των άκαμπτων πρωτεϊνών, και τις μεθόδους που χρησιμοποιούν πειραματικά στοιχεία, όπως είναι τα κατάλοιπα που συναντώνται περισσότερο στην διεπιφάνεια και δεδομένα που προέρχονται από ΝΜR [25]. Λόγω της ύπαρξης μιας πληθώρας αλγόριθμων docking το 2000 ξεκίνησε ένα μεγάλο πείραμα, η κριτική αξιολόγηση των προβλεπόμενων αλληλεπιδράσεων (CAPRI: Critical Assessment of PRedicted Interactions), που πραγματοποιείται κάθε δύο χρόνια, με στόχο να κρίνει την απόδοση των υφιστάμενων μεθόδων [22, 23]. Επίσης, μεθοδολογίες που βασίζονται στην ομολογία χρησιμοποιούνται ευρέως, ιδιαίτερα για μελέτες μεγάλης κλίμακας, καθώς οι μέθοδοι docking απαιτούν περισσότερο χρόνο. Μία εναλλακτική προσέγγιση για μια αξιόπιστη πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης είναι να

22 22 χρησιμοποιηθεί η πληροφορία για την διεπιφάνεια πρόσδεσης από μια ομόλογη πρωτεΐνη. Οι προσεγγίσεις που βασίζονται στη διεπαφάνεια ενισχύονται από την παρατήρηση ότι οι περιοχές με τις οποίες αλληλεπιδρούν οι πρωτεΐνες είναι περισσότερο συντηρημένες σε σχέση με την υπόλοιπη επιφάνεια τους. Πίνακας 2. Μια σύντομη περιγραφή των εργαλείων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης από τις δομές των πρωτεϊνών [25].

23 Scoring Function Έχει προταθεί ότι μόνο η συμπληρωματικότητα του σχήματος δεν μπορεί να επιτύχει εξαιρετικά ακριβείς προβλέψεις σύνδεσης, αλλά θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με φυσικοχημικούς παράγοντες, όπως οι δυνάμεις Coulomb, οι δυνάμεις van der Waals, η υδροφοβικότητα, κλπ. Οι μέθοδοι docking πρωτεϊνών γενικά αποτελούνται από τρία στοιχεία: α) τη μοριακή αναπαράσταση της επιφάνειας, β) τη αναζήτηση της διάταξης στον χώρο και γ) τη βαθμολόγηση των πιθανών λύσεων. Τυπικά μια πρόβλεψη σύνδεσης για ένα ζεύγος πρωτεϊνών παράγει μερικές χιλιάδες διαμορφώσεις σύνδεσης (docking decoys), οι οποίες υπόκεινται σε κατάταξη χρησιμοποιώντας μια συνάρτηση βαθμολόγησης. Προκειμένου να αξιολογηθεί η εφικτότητα της κάθε θέσης έχουν δημιουργηθεί αρκετές συναρτήσεις βαθμολόγησης [20] που βασίζονται είτε στη γεωμετρική συμπληρωματικότητα ή σε άλλους μηγεωμετρικούς παράγοντες, όπως η διαλυτοποίηση, η υδροφοβικότητα, και η ηλεκτροστατική ενέργεια (Shape & Chemical Complementary Scores, Empirical Scoring, Force Field Scoring, Knowledge-based Scoring, Consensus Scoring). Ο τελικός στόχος στο docking πρωτεϊνών είναι να είναι σε θέση να μπορεί να συμπεριλάβει στη συνάρτηση βαθμολόγησης μία θερμοδυναμική περιγραφή του συστήματος που θα επιτρέπει την ακριβή περιγραφή της συγγένειας ή τις μεταβολές της ελεύθερης ενέργειας Gibbs του συμπλόκου κατά τη δέσμευση των μονομερών. Η συνάρτηση αυτή θα επιτρέψει τη πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων (interactoms) και την κατανόησή τους, προσθέτοντας την κινητική/θερμοδυναμική διάσταση του υπό μελέτη συστήματος. Θα ανοίξει το δρόμο για τον σχεδιασμό των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με βάση τη δομή και την εξειδίκευσή τους, και θα είναι χρήσιμη για τον σχεδιασμό αναστολέων αυτών των αλληλεπιδράσεων. Ιδανικά, μια συνάρτηση βαθμολόγησης που μπορεί να προβλέψει με επιτυχία την συγγένεια κάθε δεδομένου συμπλόκου πρωτεΐνης-πρωτεΐνης πρέπει να πληροί τα ακόλουθα κριτήρια [19]: Η συνάρτηση βαθμολόγησης θα πρέπει να βασίζεται στις φυσικοχημικές ιδιότητες του συστήματος που παίζουν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση. Αυτές οι φυσικοχημικές ιδιότητες θα πρέπει να συνδυάζονται σε ένα απλό και γρήγορο μοντέλο, προκειμένου να αναπαραχθεί με ακρίβεια, εντός του

24 24 πειραματικού σφάλματος, ένας μεγάλος αριθμός πειραματικών δεδομένων της συγγένειας πρόσδεσης. Ο αλγόριθμος θα πρέπει να λειτουργεί ικανοποιητικά με τη χρήση διαφορετικών πειραματικών δεδομένων. Ο αλγόριθμος θα πρέπει να κατατάσσει στην κορυφή της βαθμολογίας τις εγγενείς θέσεις docking. Δεδομένου ενός συνόλου πρωτεϊνών που είναι άγνωστο αν αλληλεπιδρούν, ο αλγόριθμος θα πρέπει να είναι σε θέση να διακρίνει αυτές που σχηματίζουν σύμπλοκα από αυτές που δεν σχηματίζουν, βαθμολογώντας υψηλότερα την συγγένεια των πρωτεϊνών που δεσμεύονται πράγματι. Εάν μπορούν να πληρούνται όλες οι προαναφερθείσες προϋποθέσεις, ένα πρόγραμμα που θα προβλέπει με ακρίβεια τη συνάφεια δέσμευσης θα πρέπει να βελτιώνει σημαντικά την κατάταξη των παραγόμενων πιθανών δεσμεύσεων και να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη θερμοδυναμική των μακρομορίων. Ωστόσο, μέχρι τώρα, περιορισμένες προσπάθειες έχουν γίνει προς την επίτευξη αυτού του στόχου, βασικά, λόγω της απουσίας ενός μεγάλου συνόλου πειραματικών δεδομένων αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Οι περισσότεροι από τους αλγόριθμους που παρέχουν μια εκτίμηση της συγγένειας δέσμευσης έχουν παραμετροποιηθεί με βάση ένα μικρό σύνολο πειραματικών δεδομένων. Άλλοι λόγοι που μπορούν να εξηγήσουν την αδυναμία αυτή των συναρτήσεων βαθμολόγησης είναι η ποιότητα των πειραματικών δεδομένων, οι αλλαγές της διαμόρφωσης που λαμβάνουν χώρα κατά τη σύνδεση, οι συμπαράγοντες που ενδέχεται να χρειαστούν για την πρόσδεση, η αλλοστερική ρύθμιση, η επίδραση του διαλύτη, κ.λ.π. Μια νέα μέθοδος που αναπτύχθηκε από τους Axenopoulos et al [57] βελτιώνει τα αποτελέσματα του docking πρωτεϊνών συγκρινόμενη με τις υπάρχουσες μεθόδους. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται τόσο στη γεωμετρική όσο και στη φυσικοχημική συμπληρωματικότητα που χαρακτηρίζει δύο πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν. Ο αλγόριθμος που εξετάζει την συμπληρωματικότητα του σχήματος αντιστοιχεί ζεύγη τμημάτων επιφάνειας από την πρωτεΐνη-υποδοχέα με ζεύγη τμημάτων επιφανείας από την πρωτεΐνη-προσδέτη. Ακόμα λαμβάνεται υπόψη το γεγονός ότι οι επιφάνειες παρουσιάζουν συμπληρωματικότητα «κατά προσέγγιση» και όχι «ακριβή». Τέλος,

25 25 στην συνάρτηση βαθμολόγησης εκτός από την γεωμετρική συμπληρωματικότητα συμπεριλαμβάνονται και φυσικοχημικοί παράγοντες όπως η ενέργεια αποδιαλύτωσης, η ηλεκτροστατική συμπληρωματικότητα, η υδροφοβικότητα, οι δυνάμεις Coulomb και το δυναμικό Lennard - Jones βελτιώνοντας την τελική κατάταξη των συμπλόκων που προκύπτουν.

26 26 Κεφάλαιο 3 Ηλεκτρική διπολική ροπή πρωτεϊνών Η ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ δυο πρωτεϊνών είναι πολύ σημαντική για την σταθερότητα ενός συμπλόκου. Ε = Ε qq + E qd + E dd +. E qq : αλληλεπίδραση Coulomb των καθαρών πρωτεϊνικών φορτίων E qd : αλληλεπίδραση καθαρού φορτίου της μια πρωτεΐνης με το δίπολο της άλλης E dd : αλληλεπίδραση των ηλεκτρικών πρωτεϊνικών διπόλων Στο πλαίσιο αυτής της εργασίας επικεντρωθήκαμε στον όρο Ε dd καθώς είναι ο μόνος που εξαρτάται από τον σχετικό προσανατολισμό των πρωτεϊνών. 3.1 Ηλεκτρική διπολική ροπή Η ηλεκτρική διπολική ροπή είναι ένα μέτρο της τάσης του διπόλου να περιστραφεί κάτω από την επίδραση εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου. Στην περίπτωση ενός συστήματος που αποτελείται από δυο διαχωρισμένα φορτία με αντίθετο πρόσημο, το μέτρο της δίνεται από τη σχέση: r (1) όπου δ είναι το στοιχειώδες φορτίο και r είναι το διάνυσμα που συνδέει τα δύο φορτία. Στα πολυατομικά μόρια η πολύπλοκη κατανομή ηλεκτρικών φορτίων τα οδηγεί στο να συμπεριφέρονται ως δίπολα. Σε αυτές τις περιπτώσεις μπορούμε να βρούμε την ηλεκτρική διπολική μιας κατανομής Ν διακριτών φορτίων από τη σχέση [34]:

27 27 N i r i (2) i όπου το κάθε r i είναι το διάνυσμα θέσης του φορτίου δ i ως προς κάποιο σταθερό σύστημα αναφοράς. Η διπολική ροπή μετράται σε Coulob meter (C m). Δεδομένου ότι αυτές οι μονάδες οδηγούν σε πολύ μικρούς αριθμούς, χρησιμοποιείται η μονάδα Debye (1D = 3, C m). Η διπολική ροπή ενός µορίου εξαρτάται από την πόλωση των δεσµών καθώς και τη γεωµετρία του µορίου στα πολυατοµικά µόρια. Η πόλωση ενός δεσµού εξαρτάται από τη διαφορά ηλεκτραρνητικότητας των ατόµων του. Η τάση του κάθε ατόμου να τραβήξει ηλεκτρόνια μακριά από άλλα άτομα χαρακτηρίζεται από μια ποσότητα που ονομάζεται ηλεκτραρνητικότητα. Σε ένα μόριο που αποτελείται από άτομα με διαφορετική ηλεκτραρνητικότητα, τα άτομα με μικρότερη ηλεκτραρνητικότητα κατέχουν μερικό θετικό φορτίο και τα άτομα με τις μεγαλύτερες ηλεκτραρνητικότητες κατέχουν μερικό αρνητικό φορτίο. Αυτό το φαινόμενο του διαχωρισμού φορτίων ονομάζεται πολικότητα. Όσο μεγαλύτερη η διαφορά ηλεκτραρνητικότητας των ατόμων που συμμετέχουν στον δεσμό τόσο μεγαλύτερη η πολικότητα του μορίου και κατά συνέπεια η διπολική ροπή. Με βάση τη διπολική ροπή μπορούμε να διακρίνουμε τα πολικά και τα µη πολικά µόρια. Πολικά ονοµάζονται τα µόρια που έχουν πολωµένους οµοιοπολικούς δεσµούς και η συνισταµένη διπολική ροπή είναι διαφορετική από το μηδέν (µ 0). Σε αυτά ανήκουν διατοµικά µόρια που αποτελούνται από διαφορετικά άτοµα (Α - Β) αλλά και πολυατοµικά µόρια µε πολωµένους δεσµούς και κατάλληλη γεωµετρία. Μη πολικά µόρια ονοµάζονται τα µόρια τα οποία δεν εµφανίζουν διπολική ροπή (µ=0). Τέτοια είναι διατοµικά µόρια που αποτελούνται από όµοια άτοµα καθώς και πολυατοµικά µόρια µε πολωµένους δεσµούς στα οποία η γεωµετρία είναι τέτοια ώστε η συνισταµένη διπολική ροπή να είναι μηδέν. 3.2 Ηλεκτρική διπολική ροπή των πρωτεϊνών Οι πρωτεΐνες είναι εξαιρετικά πολύπλοκα μόρια. Πρόκειται για ετεροπολυμερή αμινοξέων, που περιέχουν ένα μίγμα ουδέτερων, πολικών και φορτισμένων πλευρικών αλυσίδων. Τα βασικά δομικά στοιχεία των πρωτεϊνών, τα αμινοξέα,

28 28 περιέχουν μια καρβοξυλική ομάδα (-COOH) και μια αμινομάδα (-NH 2 ). Η αμινομάδα είναι η πιο διαδεδομένη πολική ομάδα σε οποιαδήποτε πρωτεΐνη, και αυτό παίζει αρκετά καθοριστικό ρόλο στον προσδιορισμό της πρωτεϊνικής δομής και λειτουργίας. Η κάθε πεπτιδική ομάδα έχει διπολική ροπή που οφείλεται στη διαφορετική πολικότητα των ομάδων NH και C=O. Στα βιολογικά συστήματα, το οξυγόνο είναι γενικά το πιο ηλεκτραρνητικό άτομο. Στον Πίνακα 3 φαίνεται η ηλεκτραρνητικότητα των ατόμων που συναντάμε στα βιολογικά συστήματα και το μερικό φορτίο των ατόμων στα αμινοξέα. Πίνακας 3. Ηλεκτραρνητικότητα και φορτίο των ατόμων στα βιολογικά συστήματα. Άτομο Ηλεκτραρνητικότητα Άτομο Φορτίο (e - ) Η 2.1 C 2.6 N 3.0 O 3.5 P 2.2 S 2.5 N -0,42 HN +0,27 Cα +0,12 C +0,60 O -0,57 Ο προσανατολισμός της διπολικής ροπής ενός πεπτιδίου είναι περίπου παράλληλος προς τον δεσμό Ν-Η και σε μέγεθος είναι περίπου 3,7 Debye, όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.1. Η μεγάλη διπολική ροπή του πεπτιδικού δεσμού μας δείχνει πόσο σημαντικές αναμένεται να είναι οι διπολικές αλληλεπιδράσεις στην διαμόρφωση της δομής των πρωτεϊνών και στις αλληλεπιδράσεις. Το μεγάλο δίπολο ενός πεπτιδικού δεσμού μπορεί να αποδοθεί εν μέρει στον συντονισμό Εικόνα 3.2. Ωστόσο, αυτές οι απλές δομές συντονισμού παρουσιάζουν μια υπεραπλουστευμένη άποψη της ηλεκτρονικής δομής ενός πεπτιδίου [35].

29 29 Εικόνα 3.1 Ο προσανατολισμός της διπολικής ροπής του πεπτιδίου. Εικόνα 3.2 Δύο από τις δομές συντονισμού ενός πεπτιδίου. Η πραγματική δομή είναι ένα υβρίδιο των δομών συντονισμού. Ο πεπτιδικός δεσμός είναι μερικός διπλός δεσμός, και δεν μπορεί να περιστραφεί ελεύθερα. Ένα δίπολο μπορεί να αλληλεπιδράσει με ένα σημειακό φορτίο και τότε έχουμε την αλληλεπίδραση που ονομάζεται φορτίου-διπόλου, με άλλα δίπολα που ονομάζεται αλληλεπίδραση δίπολου-δίπολου, και μπορεί να προκαλέσει κατανομή του φορτίου σε γειτονικά μόρια (που ονομάζεται αλληλεπίδραση δίπολου - επαγόμενου δίπολου). Οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις πιστεύεται ότι παίζουν έναν σημαντικό ρόλο παρέχοντας τον σωστό προσανατολισμό των πρωτεϊνών καθώς και τη σταθεροποίηση

30 30 των συμπλόκων που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών. Σε αυτό το πλαίσιο, οι διεπιφάνειες μεταξύ των πρωτεϊνών συχνά εμφανίζουν συμπληρωματικά ηλεκτροστατικά χαρακτηριστικά και, επιπλέον, εντοπισμένες αλληλεπιδράσεις, όπως δεσμούς-η και γέφυρες άλατος που εμφανίζονται μεταξύ των πολικών και φορτισμένων αμινοξέων που καταλαμβάνουν τις διεπιφάνειες των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Αν και η ανάλυση του ηλεκτροστατικού δυναμικού των διεπιφανειών που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών συχνά διεξάγεται στη μελέτη των συμπλόκων, η συνεισφορά των φορτισμένων καταλοίπων που βρίσκονται μακριά από την ενδιάμεση περιοχή δεν αναγνωρίζεται από τις αναλύσεις αυτές. Η συνεισφορά αυτή, ωστόσο, μπορεί να συμπεριληφθεί ποσοτικώς όταν λάβει κανείς υπόψη την αλληλεπίδραση μεταξύ των ηλεκτρικών διπολικών ροπών κάθε πρωτεΐνης στο σύμπλοκο. Τα πρωτεϊνικά δίπολα μπορούν να μετρηθούν πειραματικά με ηλεκτροοπτικές μετρήσεις [39] ή με την τεχνική της διηλεκτρικής σταθεράς, καθώς και χρησιμοποιώντας διαφορετικές υπολογιστικές προσεγγίσεις [33]. Διαδεδομένες παράμετροι όπως το μοριακό βάρος, το ισοηλεκτρικό σημείο, και το συνολικό φορτίο, δεν είναι ενδεικτικές της κατανομής του φορτίου μιας πρωτεΐνης όπως είναι η ηλεκτρική διπολική ροπή [37]. Η διπολική ροπή έχει χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών δέσμευσης DNA [41], για τον χαρακτηρισμό της αλληλεπίδρασης σε σύμπλοκα πρωτεΐνης-πρωτεΐνης [42], και για να προβλέψει τα επίπεδα συσσωμάτωσης πρωτεϊνών [43]. 3.4 Παράγοντες που επηρεάζουν τη διπολική ροπή Όπως έχει αναφερθεί η ηλεκτρική διπολική ροπή είναι ένα διανυσματικό μέγεθος και επομένως επηρεάζεται από τη δομή του μορίου και από την κατανομή των φορτίων σε αυτό. Στην περίπτωση των πρωτεϊνών, λάθη που αφορούν στη δομή των πρωτεϊνών και τα φορτία των ατόμων που τις αποτελούν μπορεί να επηρεάσουν σημαντικά τον υπολογισμό της ηλεκτρικής διπολικής ροπής. Ο ρόλος της κατάστασης πρωτονίωσης των επιμέρους ομάδων των αμινοξέων (-COOH, -NH 2, -R) είναι προφανής. Σε πιο όξινες τιμές ph η καρβοξυλική ομάδα ιοντίζεται σύμφωνα με τη σταθερά διάστασής της όπως και η αμινο-ομάδα ιοντίζεται σε πιο αλκαλικές τιμές ph σύμφωνα με τη δική της σταθερά ιοντισμού. Αν οι πλευρικές ομάδες φέρουν και

31 31 αυτές ιοντισμένες ομάδες, τότε και αυτές ακολουθούν το δικό τους ανεξάρτητο ιοντισμό σύμφωνα με τη δική τους σταθερά ιοντισμού. Οι θεωρητικές προσεγγίσεις για τον υπολογισμό της ηλεκτρικής διπολικής ροπής των πρωτεϊνών βασίζονται στις τιμές των pk [37]. Οι τιμές των pk των καταλοίπων μιας πρωτεΐνης επηρεάζονται από τη δομή της πρωτεΐνης, τη σύνθεση και το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται, και επομένως αντιπροσωπεύουν ένα σύνθετο καθοριστικό παράγοντα, της λειτουργίας και της σταθερότητας, ο οποίος αντικατοπτρίζεται στην κατανομή του φορτίου της πρωτεΐνης [36]. Πίνακας 4. Τιμές pkα των αμινοξέων [31]. Η τιμή pka είναι ένα μέτρο της ικανότητας μιας ομάδας να εισέλθει σε μια πρωτονιωμένη κατάσταση. Οι ομάδες αυτές μπορούν να χωριστούν σε βασικές ομάδες, οι οποίες είναι φορτισμένες θετικά στην πρωτονιωμένη κατάσταση, και στις όξινες ομάδες, οι οποίες είναι ουδέτερες στην πρωτονιωμένη κατάσταση.

32 32 Υποθέτοντας ότι η καμπύλη τιτλοδότησης είναι της μορφής Henderson Hasselbalch (Σχέση 3), το pκ της ομάδας περιγράφει την κατάσταση πρωτονίωσης σε ένα δεδομένο pη. Προκύπτει ότι το σύνολο των τιμών pk των ομάδων μιας πρωτεΐνης προσδιορίζει την κατάσταση πρωτονίωσής της σε ένα δεδομένο pη, και σε συνδυασμό με την τριδιάστατη δομή, την χωρική κατανομή του φορτίου. Ένα μεγάλο μέρος της έρευνας έχει επενδυθεί από βιοφυσικούς στην πρόβλεψη των τιμών pκ των πρωτεϊνών, με έμφαση στη γρήγορη και ακριβή πρόβλεψή τους με βάση τη δομή [44, 45]. Η εξίσωση Henderson-Hasselbalch συνδέει την τιμή ph με τις σχετικές συγκεντρώσεις των συζυγών οξέων και βάσεων και την τιμή pk a : ph = pk a +log([βάση]/[οξύ]) (3) όπου pk a η σταθερά ιοντισμού του οξέως. Εμπειρικές προσεγγίσεις για την πρόβλεψη των pκ πρωτεΐνης, όπως το πρόγραμμα PROPKA [46], έχουν κερδίσει έδαφος, λόγω της μεγάλης ταχύτητας υπολογισμού. Το πρόγραμμα PROPKA, που αναπτύχθηκε από τον Jensen και τους συνεργάτες του, προβλέπει τις τιμές pk ως συνδυασμό των αποτελεσμάτων αποδιαλυτοποίησης και των αλληλεπιδράσεων στο εσωτερικό των πρωτεϊνών στη θέση μιας ιοντιζόμενης ομάδας. Αυτή η μέθοδος λειτουργεί με την παραδοχή ότι ιοντιζόμενα κατάλοιπα με παρόμοια περιβάλλοντα έχουν παρόμοιες pk [37].

33 33 Κεφάλαιο 4 Επιλογή και προετοιμασία του συστήματος μελέτης Σκοπός αυτής της εργασίας είναι ο προσδιορισμός του σχετικού προσανατολισμού των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των πρωτεϊνών σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Για τον υπολογισμό της ηλεκτρικής διπολικής ροπής των πρωτεϊνών πρέπει να είναι γνωστά η τριτοταγής τους δομή και τα φορτία των ατόμων. Μεγάλο βάρος δόθηκε στην εύρεση των πρωτεϊνικών συμπλόκων και την προετοιμασία της δομής τους. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε μπορεί να χωριστεί σε τρία βήματα, την επιλογή και προετοιμασία των συμπλόκων, τη διεξαγωγή των υπολογισμών και την ανάλυση των αποτελεσμάτων. Σε αυτό το κεφάλαιο θα γίνει αναφορά στην επιλογή και προετοιμασία των πρωτεϊνικών συμπλόκων. 4.1 Επιλογή των πρωτεϊνικών συμπλόκων Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα χωρίστηκαν σε δυο κατηγορίες με βάση τη σύνθεση τους, στα ομοδιμερή και στα ετεροδιμερή. Η αναζήτηση της τριδιάστατης δομής των συμπλόκων έγινε με τον προηγμένο αλγόριθμο αναζήτησης της Protein Data Bank (PDB, με τη χρήση των κατάλληλων φίλτρων. Πρώτο κριτήριο επιλογής είναι ότι η τεταρτοταγής δομή των πρωτεϊνών θα πρέπει να είναι η λειτουργική μορφή του μορίου (biological assembly). Η λειτουργική μορφή του μορίου προσδιορίζεται είτε πειραματικά ή με τη χρήση λογισμικών όπως το PQS (Probable Quaternary Structure Server) που εξετάζει τις επαφές μεταξύ των αλυσίδων μέσα στους κρυστάλλους των πρωτεϊνών και κάνει εκτίμηση για το ποια επαφή αντιπροσωπεύει ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών και το ποιες είναι αποτέλεσμα της κρυστάλλωσης. Από το 2010 το PQS αντικαταστάθηκε από το PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies Server) που χρησιμοποιεί βελτιωμένες μεθόδους για την πρόβλεψη της βιολογικής μονάδας, σε σύγκριση με τον προκάτοχό

34 34 του PQS. Το PISA εξετάζει τις επαφές που εμφανίζονται στους μακρομοριακούς κρυστάλλους που χρησιμοποιούνται στην κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ. Προσπαθεί να κάνει διάκριση μεταξύ των κρυσταλλικών επαφών και των επαφών μεταξύ των αλυσίδων που έχουν εξελιχθεί από κοινού για τη διατήρηση των ειδικών ολιγομερών δεσμεύσεων. Δεύτερο κριτήριο είναι ότι τα βιολογικά αυτά σύμπλοκα θα πρέπει να αποτελούνται από δυο πρωτεϊνικές αλυσίδες και πιο συγκεκριμένα στην περίπτωση των ομοδιμερών από δύο όμοιες αλυσίδες ενώ στην περίπτωση των ετεροδιμερών από δύο διαφορετικές αλυσίδες. Τρίτο κριτήριο, τα σύμπλοκα δεν πρέπει να περιέχουν άλλο τύπο μακρομορίων όπως DNA, RNA. Τέλος, επιλέχτηκαν τα σύμπλοκα με ομολογία < 40%. Από αυτή την αναζήτηση προέκυψαν 6357 ομοδιμερή και 695 ετεροδιμερή σύμπλοκα. Εικόνα 4.1 Αναζήτηση στη βάση δεδομένων PDB

35 Προετοιμασία των πρωτεϊνικών συμπλόκων Έλεγχος της ακεραιότητας της δομής Οι δομές των συμπλόκων που προέκυψαν από την διαλογή είναι αποτέλεσμα κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ παρόλο που μπορεί να παρέχει λεπτομερείς πληροφορίες σε ατομικό επίπεδο για τη δομή των πρωτεϊνών. Ωστόσο υπάρχουν αρχεία PDB από τα οποία λείπουν οι συντεταγμένες των εύκαμπτων περιοχών, των υδρογόνων ακόμα και ολόκληρων τμημάτων των πρωτεϊνών. Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ είναι μια εξαιρετική μέθοδος για τον προσδιορισμό των δομών των άκαμπτων πρωτεϊνών που σχηματίζουν ωραία διατεταγμένους κρυστάλλους. Οι εύκαμπτες πρωτεΐνες, από την άλλη πλευρά, είναι πολύ πιο δύσκολο να μελετηθούν με τη μέθοδο αυτή, διότι η κρυσταλλογραφία στηρίζεται στο ότι πολλά μόρια ευθυγραμμίζονται ακριβώς με τον ίδιο προσανατολισμό, όπως ένα επαναλαμβανόμενο μοτίβο. Τα εύκαμπτα τμήματα των πρωτεϊνών θα είναι επομένως αόρατα στους κρυσταλλογραφικούς χάρτες ηλεκτρονιακής πυκνότητας. Συνήθως αυτές οι ελλείψεις βρίσκονται στην αρχή ή στο τέλος την αλυσίδας. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να είναι σημαντικό, δεδομένου ότι οι εύκαμπτοι βρόχοι συχνά εμπλέκονται στο ενεργό κέντρο ή στη θέση δέσμευσης της πρωτεΐνης. Στην περίπτωση που από τα αρχεία PDB λείπουν μεγάλα τμήματα των πρωτεϊνών αυτό συμβαίνει γιατί οι μεγάλες πρωτεΐνες με αρκετά κινητά μέρη είναι αδύνατο να κρυσταλλωθούν ως σύνολο. Ένα ακόμα μειονέκτημα των κρυσταλλογραφικών πειραμάτων είναι η αδυναμία τους να προσδιορίσουν τα άτομα του υδρογόνου, δεδομένου ότι το μέγεθος τους είναι πολύ μικρό για να αλληλεπιδρούν με την ακτινοβολία, δεδομένου ότι περιέχουν μόνο ένα ηλεκτρόνιο. Η καλύτερη διακριτική ικανότητα της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ που διατίθεται σήμερα είναι περίπου 0,9Å. Έτσι τα περισσότερα αρχεία συντεταγμένων περιλαμβάνουν μόνο τις θέσεις για τα άτομα εκτός του υδρογόνου. Για όλους αυτούς τους λόγους τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα ελέγχθηκαν ως προς την ακεραιότητα της δομής τους καθώς οι ελλείψεις αυτές δημιουργούν προβλήματα στον υπολογισμό της ηλεκτρικής διπολικής ροπής. Για παράδειγμα, η έλλειψη του αμινοτελικού ή καρβοξυτελικού άκρου, που είναι από τις πιο πολικές ομάδες των πρωτεϊνών, θα επηρεάσει τη διπολική ροπή της πρωτεΐνης.

36 36 Αρχικά εντοπίστηκαν τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα με ασυνέχεια στη δομή τους. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της αλληλουχίας των αμινοξέων των συμπλόκων που δεν εμφανίζουν σφάλματα στη δομή τους για τυχόν έλλειψη του αμινοτελικού και καρβοξυτελικού άκρου. Επίσης, αφαιρέθηκαν οι δομές που περιέχουν μη φυσιολογικά αμινοξέα. Τα ομοδιμερή σύμπλοκα που προέκυψαν μετά από αυτή την διαδικασία ήταν 135, μόλις το 2,1% συμπλόκων που προέκυψαν αρχικά από την αναζήτηση στη βάση δεδομένων, και τα ετεροδιμερή σύμπλοκα 24, που αποτελούν το 3,5% των αρχικών ετεροδιμερών συμπλόκων Προσθήκη υδρογόνων Για τον υπολογισμό της ηλεκτρικής διπολικής ροπής των πρωτεϊνών εκτός από το ότι οι πρωτεΐνες πρέπει να έχουν πλήρη δομή, χωρίς κενά, πρέπει να είναι γνωστό και το ph του διαλύματος στο οποίο πραγματοποιήθηκε η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών καθώς αυτό επηρεάζει το φορτίο της πρωτεΐνης. Όπως αναφέρθηκε και προηγούμενος τα αρχεία PDB που περιγράφουν τη τριδιάστατη δομή των συμπλόκων που προσδιορίστηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ δεν περιέχουν πληροφορίες για τη θέση των υδρογόνων. Η θέση των υδρογόνων στην περίπτωση των ιοντισμένων ομάδων εξαρτάται από την τιμή της pk της κάθε ομάδας και την τιμή ph του διαλύματος κατά την κρυστάλλωση. Οι συνθήκες κρυστάλλωσης επηρεάζουν την πρωτονίωση και αποπρωτονίωση των ιοντισμένων ομάδων και κατά συνέπεια τη θέση των υδρογόνων στην πρωτεΐνη. Για την προσθήκη των υδρογόνων στις δομές των συμπλόκων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα PDB2PQR (Version 1.8) [47] μέσω του webserver: ucsd.edu/pdb2pqr_1.8/. Το πρόγραμμα αυτό αυτοματοποιεί πολλές από τις εργασίες που πρέπει να γίνουν για την προετοιμασία των πρωτεϊνικών δομών που προέρχονται από κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Αυτές είναι η προσθήκη βαρέων ατόμων που λείπουν από τα αρχεία συντεταγμένων, η εκτίμηση της κατάστασης πρωτονίωσης των βιομορίων και η τοποθέτηση πρωτονίων, η απόδοση του ηλεκτρικού φορτίου και της ακτίνας με τη χρήση μιας ποικιλίας force fields. Πιο συγκεκριμένα, το πρόγραμμα PDB2PQR προσδιορίζει την κατάσταση πρωτονίωσης των καταλοίπων ιστιδίνης (HIS), ασπαραγινικού (ASP) και γλουταμινικού (GLU) με βάση τον βέλτιστο δεσμό υδρογόνου και τις τιμές pka. Στα

37 37 προστιθέμενα άτομα υδρογόνου ελέγχεται και η στερεοδιάταξή τους στις πρωτεΐνες. Για τον υπολογισμό των τιμών pka των ιοντισμένων ομάδων στις πρωτεΐνες το PDB2PQR χρησιμοποιεί το πρόγραμμα PROPKA [40, 46, 48, 49] ( Το PROPKA είναι ένα πρόγραμμα FORTRAN που υπολογίζει τις τιμές pka όλων των ιοντιζόμενων ομάδων από ένα αρχείο PDB. Για λόγους απλότητας, μόνο δύο καταστάσεις ιοντισμού θεωρούνται για κάθε ιοντιζόμενη ομάδα για ph > pka και ph < pka, δίνοντας αποδεκτά αποτελέσματα. Το PROPKA [40] υπολογίζει τις τιμές pka αφού πρώτα εντοπίσει τις ιοντισμένες ομάδες παραβλέποντας τα υδρογόνα, τα μόρια του νερού και τα ιόντα που υπάρχουν στα αρχεία των συντεταγμένων. Έπειτα υπολογίζει τις προσωρινές τιμές pka για τις ιοντιζόμενες ομάδες χρησιμοποιώντας τις καταστάσεις πρωτονίωσης των άλλων ιοντιζόμενων υπολειμμάτων που μπορούν να προσδιοριστούν εύκολα. Για την προετοιμασία των πρωτεϊνικών συμπλόκων με την χρήση του προγράμματος PDB2PQR έγινε η εισαγωγή των αρχείων PDB, επιλέχθηκε το CHARMM force field, επιλέχτηκε να γίνει χρήση του προγράμματος PROPKA για τον προσδιορισμό της κατάστασης πρωτονίωσης των ιοντισμένων ομάδων των πρωτεϊνών και στη θέση της τιμής ph ορίστηκε η τιμή του ph στην οποία έγινε η κρυστάλλωση, πληροφορία που είναι καταχωρημένη στα αρχεία PDB (Εικόνα 4.2). Ο συνολικός χρόνος επεξεργασίας των δεδομένων για την εξαγωγή των αποτελέσματα είναι γύρω στα 30 δευτερόλεπτα και εξαρτάται από το μέγεθος των πρωτεϊνών. Το αρχείο PQR που προκύπτει είναι ένα αρχείο PDB με τη στήλη της θερμοκρασίας και της πληρότητας (occupancy) να αντικαθίστανται από τις στήλες που περιέχουν το φορτίο ανά άτομο (Q) και την ακτίνα (R). Για τον εντοπισμό των υδρογόνων που προστέθηκαν στις δομές των πρωτεϊνών τα αρχεία αυτά συγκρίθηκαν με τα αρχεία PDB.

38 38 Εικόνα 4.2 Πρόγραμμα PDB2PQR Περιγραφή των scripts προετοιμασίας των δομών Η προετοιμασία των πρωτεϊνικών συμπλόκων έγινε με τη χρήση τoυ προγράμματος VMD (Version 1.9.1), ενός προγράμματος μοριακής απεικόνισης και ανάλυσης. Τα scripts, που χρησιμοποιήθηκαν τόσο για την προετοιμασία των δόμων όσο και για την πραγματοποίηση των υπολογισμών, είναι γραμμένα σε Tcl (Tool Command Language). Η Tcl είναι μια γλώσσα προγραμματισμού που δημιουργήθηκε από τον John Ousterhout και υποστηρίζεται από το VMD, όπου μπορεί να εκτελέσει βασικές εντολές αλλά και διάφορες ειδικές προεκτάσεις του VMD. Στην ενότητα αυτή περιγράφονται τα βήματα που έγιναν για την τελειοποίηση των δομών των

39 39 πρωτεϊνικών συμπλοκών ώστε να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν αργότερα για την εκτέλεση των υπολογισμών. Διαχωρισμός αλυσίδων Αρχικά, απομακρύνθηκαν τα μόρια νερού και τα ετεροάτομα (π.χ. ιόντα) από τη δομή των συμπλόκων επιλέγοντας την κάθε αλυσίδα του συμπλόκου χωριστά (script Παράρτημα Β1). Οι απομάκρυνση αυτών των ατόμων δε προκαλεί αλλαγή στη δομή των πρωτεϊνών για τις οποίες δημιουργούνται δυο νέα αρχεία pdb με τις συντεταγμένες τις κάθε μιας. Τελειοποίηση της δομής Το πρόγραμμα που απαιτείται για την ολοκλήρωση της δομής των συμπλόκων είναι το PSFGEN. Το πρόγραμμα αυτό είναι ενσωματωμένο στο VMD και λειτουργεί σε περιβάλλον Tcl. Με το PSFEGEN μπορούμε να φτιάξουμε τη δομή των πρωτεϊνών αφού έχει τη δυνατότητα να τροποποιήσει αμινοξέα, να μαντέψει συντεταγμένες ατόμων που λείπουν και να τοποθετήσει τα υδρογόνα. Για να τα πραγματοποιήσει όλα αυτά το PSFGEN χρειάζεται ένα αρχείο με την τοπολογία (συνδεσμολογία) που περιέχει πληροφορίες σχετικά με τους ατομικούς τύπους, τα φορτία και τον τρόπο σύνδεσης των ατόμων στο μόριο. Τα αρχεία αυτά μπορούν να καθορίζουν δεσμούς (σύνδεση δυο ατόμων), γωνίες (3 άτομα), τις δίεδρες γωνιές (4 άτομα) και τις καταχρηστικές γωνίες που χρησιμοποιούνται για να κρατήσουν τον πεπτιδικό δεσμό επίπεδο. Λαμβάνοντας υπόψη μια πλήρη λίστα των ατόμων και του συνόλου των δεσμών, το PSFGEN είναι σε θέση να κατασκευάσει τη σωστή τοπολογία για το μόριο. Στην περίπτωση μας χρησιμοποιήθηκε το αρχείο top_all27_prot_na.inp. Σύμφωνα λοιπόν με τα αποτελέσματα που πήραμε από το πρόγραμμα PDB2PQR, έγιναν οι τροποποιήσεις των αμινοξέων στο PSFGEN. Εικόνα 4.3 Διαφορετικές καταστάσεις πρωτονίωσης ιστιδίνης.

40 40 Στην περίπτωση των καταλοίπων ιστιδίνης που έχει τιμή pka ~ 6 συναντάται σε διαφορετικές καταστάσεις πρωτονίωσης (Εικόνα 4.3). Οι δυνατές καταστάσεις της ιστιδίνης είναι τρεις, αυτή στην οποία το υδρογόνο βρίσκεται στη θέση του αζώτου δ και το κατάλοιπο αναφέρεται με το όνομα HSD, αυτή στην οποία το υδρογόνο βρίσκεται στο άζωτο ε και ονομάζεται HSE και αυτή στην οποία και τα δύο άζωτα είναι πρωτονιωμένα και ονομάζεται HSP. Στον Πίνακα 5 φαίνεται η ονοματολογία των καταλοίπων ανάλογα με την κατάσταση πρωτονίωσης. Πίνακας 5. Ονοματολογία των καταλοίπων ανάλογα με την κατάσταση πρωτονίωσης Αμινοξέα PQR file CHARMM, topology file Ιστιδίνη (ΗΙS) HIE neutral (hydrogen in HSE, neutral (proton on NE2) HE2) HID neutral (hydrogen in HSD neutral (proton on ND1) HD1) HIP positive HIS HSP protonated (1.00) Ασπαρτικό (ΑSP) ASH neutral APS ASPP patch protonated (0.00) Γλουταμινικό (GLU) GLH neutral GLU GLUP patch protonated (0.00) Με τον ίδιο τρόπο έγινε και ο καθορισμός της σωστής κατάστασης πρωτονίωσης των αμινοξέων ασπαραγινικό και γλουταμινικό ώστε να προκύψουν τελικά ένα αρχείο psf και ένα αρχείο pdb με την πλήρη δομή του συμπλόκου. Στο παράρτημα Β υπάρχει ένα παράδειγμα προετοιμασίας ενός συμπλόκου. 4.3 Ανάλυση πρωτεϊνικών συμπλόκων Από την στιγμή που έχουμε συγκεντρώσει τα σύμπλοκα ακολουθεί το στάδιο της ανάλυσης. Προκειμένου να εξάγουμε συμπεράσματα σχετικά με τον σχετικό προσανατολισμό των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των πρωτεϊνών στα πρωτεϊνικά σύμπλοκα μελετήθηκε μια σειρά παραγόντων, πέρα από τη γωνία που σχηματίζουν τα διανύσματα των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των δυο αλυσίδων στα σύμπλοκα, όπως περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω.

41 Γωνία διπόλων Η πιο χρήσιμη παράμετρος ενδεικτική του σχετικού προσανατολισμού των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των πρωτεϊνών στα πρωτεϊνικά σύμπλοκα είναι η γωνία που σχηματίζουν τα διανύσματά τους. Στην Εικόνα 4.4 φαίνεται η γωνία που σχηματίζουν τα διανύσματα των ηλεκτρικών διπολικών ροπών σε ένα ομοδιμερές σύμπλοκο. θ Εικόνα 4.4 Προσανατολισμός ηλεκτρικών διπολικών ροπών σε ένα ομοδιμερές σύμπλοκο (PDB_ID: 1AI9). Το script που δημιουργήθηκε για να υπολογιστεί η γωνία που σχηματίζουν τα πρωτεϊνικά δίπολα στα ομοδιμερή και ετεροδιμερή σύμπλοκα περιλαμβάνει την ανάγνωση των συντεταγμένων και του φορτίου του κάθε ατόμου των δυο πρωτεϊνικών αλυσίδων από τα αρχεία psf και pdb. Στην συνέχεια απομονώνεται η κάθε αλυσίδα του συμπλόκου και υπολογίζεται η ηλεκτρική διπολική ροπή με σημείο αναφοράς το γεωμετρικό κέντρο. Τέλος, υπολογίζεται διανυσματικά μέσω του εσωτερικού γινομένου το συνημίτονο της γωνίας που σχηματίζουν τα δυο διανύσματα ηλεκτρικών ροπών που προκύπτουν και μετατρέπεται σε μοίρες. Στο Παράρτημα Β βρίσκονται τμήματα των scripts που χρησιμοποιήθηκαν.

42 42 Διανυσματικός υπολογισμός του συνημίτονου της γωνίας δυο διανυσμάτων: cos cos (4) 1 2 Έστω ότι οι συντεταγμένες των διανυσμάτων των ηλεκτρικών διπολικών ροπών κάθε x, y, x, y,. Το συνημίτονο της γωνίας που αλυσίδας είναι και z z2 σχηματίζουν τα διανύσματα αυτά με αντικατάσταση στην παραπάνω σχέση είναι: (5) Ηλεκτροστατική ενέργεια Ας θεωρήσουμε δύο ηλεκτρικά δίπολα με διπολικές ροπές 1 και 2 τα κέντρα των οποίων απέχουν μεταξύ τους απόσταση r πολύ μεγαλύτερη από το μήκος των επιμέρους διπόλων. Η ενέργεια αλληλεπίδρασης των διπόλων θα είναι ουσιαστικά η δυναμική ενέργεια του ενός διπόλου στο ηλεκτρικό πεδίο του άλλου διπόλου. Η δυναμική ενέργεια δίνεται από τη σχέση: U r r pr r Όπου 1, 2 είναι τα διανύσματα των διπολικών ροπών και r είναι το διάνυσμα θέσης της 2 σε σχέση με την 1, και r ταυτίζεται με την απόσταση των κέντρων των δυο διπόλων. Όταν η απόσταση μεταξύ των δύο δίπολων είναι μικρότερη του μήκους των επιμέρους διπόλων, κυρίαρχο ρόλο παίζει η αλληλεπίδραση των μεμονωμένων φορτίων. Ως εκ τούτου, η ηλεκτροστατική δυναμική ενέργεια του συστήματος των φορτίων στην περίπτωση που έχουμε πρωτεϊνικά δίπολα υπολογίζεται από τη σχέση: 2 (6) (7) Όπου r ij είναι η απόσταση μεταξύ των φορτίων q i και q j, ε ο είναι η διηλεκτρική σταθερά του κενού και ε p είναι η διηλεκτρική σταθερά του μέσου δηλαδή της πρωτεΐνης [38].

43 43 Στην περίπτωση που τα δυο δίπολα έλκονται η ηλεκτροστατική ενέργεια αναμένεται να είναι αρνητική ενώ στην περίπτωση που τα δίπολα απωθούνται θετική. Γενικά το προφίλ της ηλεκτροστατικής ενέργειας μεταξύ δύο διπόλων που προσανατολίζονται με διαφορετικές γωνίες (θ) δείχνει ότι όταν ένα ζεύγος διπόλων είναι σε παράλληλη θέση (θ=0 ), η ενέργεια είναι μέγιστη, όταν είναι κάθετα (θ=90 ), η ενέργεια είναι μηδέν και όταν είναι σε αντιπαράλληλο προσανατολισμό (θ=180 ), η ενέργεια είναι ελάχιστη και έχουν την μεγαλύτερη σταθερότητα. Η κύρια διαφορά μεταξύ έτερο-και ομο-συμπλόκων είναι ότι τα ετερο-σύμπλοκα είναι από διαφορετικές πρωτεΐνες, οι οποίες μπορεί να φέρουν αντίθετο φορτίο, ενώ τα ομο-σύμπλοκα που αποτελούνται από δύο όμοιες μονάδες δεν μπορούν. Εξαιτίας αυτού, ο ρόλος της ηλεκτροστατικής ενέργειας στον προσανατολισμό των μονομερών ως προς το άλλο είναι εμφανώς διαφορετικός για τα έτερο-και ομο-σύμπλοκα. Δεδομένου ότι στις περισσότερες των περιπτώσεων τα μονομερή που σχηματίζουν ένα ετερο-σύμπλοκο φέρουν αντίθετο καθαρό φορτίο [50], η ηλεκτροστατική ενέργεια θα προκαλέσει μια έλξη, ενώ θα είναι ακριβώς το αντίθετο για τα ομοσύμπλοκα. Ωστόσο, φέρνοντας δύο πρωτεΐνες σε στενή γειτνίαση, η έλξη αυτή δεν είναι απαραίτητο να βοηθήσει στη δέσμευση, δεδομένου ότι η διεπιφάνεια πρόσδεσης μπορεί να μην έχει τοποθετηθεί σωστά. Έτσι, σε μικρές αποστάσεις, ο ρόλος της ηλεκτροστατικής ενέργειας θα εξαρτηθεί από την κατανομή φορτίου, και όχι του συνολικού φορτίο των μονομερών [51]. Για να διαπιστώσουμε αν η ηλεκτροστατική ενέργεια επηρεάζει τον προσανατολισμό των διπόλων στα σύμπλοκα υπολογίστηκε η ηλεκτροστατική ενέργεια μεταξύ των δυο αλυσίδων. Για αυτό τον υπολογισμό χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα NAMD Energy 1.4 που βρίσκεται ενσωματωμένο στο VMD Διεπιφάνεια συμπλόκων Οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν μέσω της επιφάνειάς τους. Εάν μια πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με μια άλλη πρωτεΐνη, τα άτομα της επιφάνειας του ενός μορίου θα αλληλεπιδρούν με τα άτομα στην επιφάνειας της άλλης πρωτεΐνης. Για να κατανοηθεί η φύση των διαμοριακών αλληλεπιδράσεων, εξετάζονται διάφορες ιδιότητες της διεπιφάνειας πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, όπως το εμβαδόν της διεπιφάνειας και τί ποσοστό της αποτελείται από μη πολικά αμινοξέα, οι δεσμοί υδρογόνου σε ολόκληρη τη

44 44 διεπιφάνεια και οι γέφυρες άλατος, τα θαμμένα μόρια νερού, η σύνθεση της διεπιφάνειας, τα διατηρημένα κατάλοιπα, το σχήμα της διεπιφάνειας σύνδεσης κλπ. Σε αυτή την ενότητα θα αναφερθούμε στο πώς επιλέγουμε την περιοχή που αποτελεί την διεπιφάνεια σε ένα σύμπλοκο δυο πρωτεϊνών καθώς και στον υπολογισμό του ποσοστού της υδρόφοβης επιφανείας σε αυτή την περιοχή. Δυο αμινοξέα θεωρούνται ότι έρχονται σε επαφή, εάν η απόσταση μεταξύ των πλησιέστερων ατόμων τους είναι 6Å (Εικόνα 4.5). Άλλοι τρόποι για να απομονώσουμε τα αμινοξέα της διεπιφάνειας ενός συμπλόκου γνωστής δομής είναι να επιλέξουμε τα αμινοξέα των δυο αλυσίδων που τα Ca άτομα απέχουν απόσταση μικρότερη από 12Å ή να επιλέξουμε αυτά που η ελεύθερή τους επιφάνεια είναι μεγαλύτερη από 1Å 2. Επομένως, στην περίπτωση μας που χρησιμοποιήσαμε το πρώτο κριτήριο, ένα αμινοξύ θεωρείται ότι ανήκει στην διεπιφάνεια εάν έχει ένα τουλάχιστον άτομο σε επαφή με ένα άτομο της άλλης αλυσίδας, αλλιώς θεωρείται ως ένα μη διεπιφανειακό κατάλοιπο. Εικόνα 4.5 Επιλογή διεπιφανειακών αμινοξέων, η απόσταση μεταξύ των πλησιέστερων ατόμων τους είναι 6Å. Το εμβαδόν της διεπιφάνειας μεταξύ των δυο αλυσίδων δίνεται από τη σχέση: 1 Interface _ Area SASA SASA SASA 2 A B AB Όπου SASA A, SASA B είναι τα εμβαδά των επιφανειών των δυο αλυσίδων αντίστοιχα που μπορούν να αλληλεπιδρούν με το νερό και SASA AB το εμβαδόν της επιφάνειας του συμπλόκου που αλληλεπιδρά με το νερό.

45 45 Η τιμή SASA (Solvent Accessible Surface Area) είναι ένας ποσοτικός τρόπος για να δείξουμε το εμβαδόν της επιφάνειας ενός μορίου που είναι δυνητικά διαθέσιμη για δέσμευση. Στο VMD είναι διαθέσιμος ο αλγόριθμος Shrake-Rupley με τον οποίο μπορεί να υπολογιστεί εύκολα η διαθέσιμη επιφάνεια αν είναι γνωστή η πλήρης δομή ενός μορίου (Εικόνα 4.6). Η ιδέα αυτού του αλγόριθμου είναι ότι μπορούμε να πάρουμε ένα μόριο διερευνητή (μόριο νερού) και να το μετακινήσουμε γύρω από το μόριο που θέλουμε και έτσι να υπολογίσουμε την επιφάνεια που είναι διαθέσιμη για αλληλεπίδραση με το νερό. Η ακτίνα του μορίου διερευνητή που χρησιμοποιείται είναι 1.4 angstroms που είναι η ακτίνα του μορίου του νερού. Εικόνα 4.6 Η διεπιφάνεια μεταξύ δυο αλυσίδων. Μια άλλη παράμετρος ενδεικτική της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών είναι η υδροφοβικότητα. Η ικανότητα των πρωτεϊνών να δεσμεύονται η μία στην άλλη με ένα εξαιρετικά ειδικό τρόπο είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της ποικιλίας των βιολογικών διεργασιών. Πολύ σημαντική είναι η παρουσία φορτισμένων και πολικών αμινοξέων στις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι επιφάνειες των πρωτεϊνών είναι αρκετά πολικές, ίσως δεν αποτελεί έκπληξη το ότι και οι διεπιφάνειες των συμπλόκων μπορεί να είναι πολικές. Με βάση αυτό θα αναμέναμε ότι οι πολικές ομάδες που βρίσκονται θαμμένες στην διεπιφάνεια

46 46 των συμπλόκων θα αντιτίθενται στον σχηματισμό του συμπλόκου, εάν δεν υπάρχει ηλεκτροστατική συμπληρωματικότητα. Για να υπολογιστεί το ποσοστό της διεπιφάνειας που αντιστοιχεί στα υδρόφοβα κατάλοιπα, πρώτα υπολογίζεται το εμβαδόν της επιφάνειας στην περιοχή δέσμευσης και εν συνεχεία υπολογίζεται το εμβαδόν της υδρόφοβης επιφάνειας που αντιστοιχεί στην περιοχή δέσμευσης για κάθε αλυσίδα του συμπλόκου. Το ποσοστό της υδρόφοβης επιφάνειας στην περιοχή δέσμευσης υπολογίζεται από τον τύπο: (8) Όπου: hydrophobic_sasa A : είναι το εμβαδόν της επιφάνειας που καταλαμβάνουν τα υδρόφοβα κατάλοιπα της διεπιφάνειας της αλυσίδας Α, hydrophobic_sasa Β : είναι το εμβαδόν της επιφάνειας που καταλαμβάνουν τα υδρόφοβα κατάλοιπα της διεπιφάνειας της αλυσίδας Β, Interface_area: το εμβαδόν της διεπιφάνειας Παράμετρος interface_ area 1 2 / Στην προσπάθεια να βγάλουμε κάποια συμπεράσματα για τον τρόπο με τον οποίο αλληλεπιδρούν οι αλυσίδες μέσω της επιφάνειας τους υπολογίζεται το γινόμενο των μέτρων των διπολικών ροπών στην διεπιφάνεια που κανονικοποιείται διαιρώντας με το εμβαδόν της περιοχής αλληλεπίδρασης. interface_area (9) 1 2 / Όπου: 1 το μέτρο της διπολικής ροπής της αλυσίδας Α στην περιοχή πρόσδεσης σε Debye, 2 το μέτρο της διπολικής ροπής της αλυσίδας B στην περιοχή πρόσδεσης σε Debye και interface_area το εμβαδόν της διεπιφάνειας μεταξύ των δυο αλυσίδων.

47 47 Κεφάλαιο 5 Αποτελέσματα και συζήτηση Ο στόχος αυτή της εργασίας είναι να μελετηθεί ο σχετικός προσανατολισμός των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των πρωτεϊνών στα πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Για τον σκοπό αυτό τα σύμπλοκα διαχωρίστηκαν σε ομοδιμερή και ετεροδιμερή και μελετήθηκαν ξεχωριστά. Ο σχετικός προσανατολισμός των ηλεκτρικών διπολικών ροπών προσδιορίστηκε σε ολόκληρα τα σύμπλοκα αλλά και στην περιοχή μέσω της οποίας οι δυο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν για τον σχηματισμό των συμπλόκων. Οι αναλύσεις που ακολουθούν έγιναν με το πρόγραμμα VMD και τη χρήση scripts στη γλώσσα προγραμματισμού Tcl. Τα script που χρησιμοποιήθηκαν βρίσκονται στο Παράρτημα Β. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τα προγράμματα Minitab 16 και το Easyfit Ομοδιμερή σύμπλοκα Στην Εικόνα 5.1 φαίνεται η κατανομή των γωνιών των διανυσμάτων των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των αλυσίδων στα ομοδιμερή σύμπλοκα. Εάν η μόνη φυσική αλληλεπίδραση ήταν η διπολική θα περιμέναμε οι αλυσίδες να προσανατολίζονται αντιπαράλληλα έτσι ώστε να έλκονται μεταξύ τους. Ωστόσο, παρατηρούμε να μην εμφανίζουν μια ξεκάθαρη προτίμηση στο να προσανατολίζονται με μια συγκεκριμένη γωνία, αφού υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που καθορίζουν τον προσανατολισμό τους.

48 48 Πίνακας 6. Αποτελέσματα για τα ομοδιμερή σύμπλοκα. ΟΜΟΔΙΜΕΡΗ (PDBID) ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΙΚΩΝ ΡΟΠΩΝ ΗΕΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΓΩΝΙΑ ΣΤΗΝ ΠΟΣΟΣΤΟ ΥΔΡΟΦΟΒΗΣ p ΜΕΤΑΞΥ ΑΛΥΣΙΔΩΝ (μοίρες) (kcal/mol) ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑ (μοίρες) ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ % 1 p 2 /interface_area ΗΕΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑ (kcal/mol) 1A8U 12,04-11,02 35,39 29,04 1,81-15,49 1ADW 168,04-177,99 109,50 23,56 2,41-172,37 1AI9 133,55-71,02 159,41 29,28 6,63-59,06 1AQ0 55,07-47,60 150,41 24,87 2,94-40,49 1AUO 168,88 43,30 51,52 37,11 8,31 60,84 1AZW 138,86 33,75 140,75 35,41 34,20 32,25 1BDY 100,02-304,72 102,42 17,47 12,30-292,37 1BKZ 108,71-659,52 124,96 27,60 8,67-684,77 1C6O 105,25 40,29 116,69 28,58 6,87 45,37 1C9O 105,14-110,52 113,41 26,29 4,77-108,29 1CBK 155,03-271,15 92,16 17,16 13,85-284,56 1CKU 69,94-1,93 37,73 43,92 2,24 14,43 1CP2 161,98-158,05 51,62 30,50 0,54-159,20 1D2C 115,64-807,18 165,57 31,70 11,83-798,43 1D4A 140,10-373,58 71,74 42,70 3,67-798,43 1D7F 134,86-147,41 158,73 27,73 14,78-145,58 1DJN 59, ,57 146,90 28,51 38, ,65 1DQE 109,10-96,24 137,96 26,65 1,69-87,83 1DQN 111,18-323,48 108,71 20,08 19,63-304,43 1DXG 79,58-64,03 162,63 30,81 6,55-60,13 1EE8 56,54-136,27 142,47 17,76 1,49-133,14 1EEJ 69,45-72,68 171,05 43,36 5,74-76,86 1ET1 95,69 86,88 64,23 50,63 2,46 87,33 1F2D 66,61-92,12 160,33 39,87 18,52-88,44 1F5V 135,01-830,60 154,41 40,16 9,86-851,68 1FN9 137,95-238,01 162,57 29,75 31,14-216,62 1G29 157,22-99,19 148,97 27,24 42,77-109,02 1GE7 159,08-103,12 57,25 27,78 0,23-89,69 1GPE 111,39-232,77 58,72 30,01 18,33-203,36 1GQA 102,14 100,53 46,95 34,27 0,94 84,13 1ITU 76,17-590,61 170,06 21,17 8,23-605,28 1ITV 101,55-116,33 28,10 25,88 23,71-133,52 1J0H 114,99-705,54 27,96 26,10 10,60-686,15 1J32 168,80-785,82 140,63 35,43 5,97-774,34 1JFL 67,21-322,50 76,94 38,07 5,81-291,44 1JKE 86,21-15,89 138,99 32,38 4,08 2,21 1K2W 128,84-202,05 79,26 37,35 13,71-179,18 1K66 66,97-306,11 154,92 27,94 3,68-322,83 1KEW 164,49-105,47 42,18 36,84 1,11-100,49 1KQP 155,41-520,86 116,84 30,35 6,52-501,16 1L5W 101,14-453,12 76,96 29,65 12,39-421,87 1L8S 62,35 190,61 59,31 37,19 5,65 172,80 1MOE 117,16-274,91 133,49 30,97 8,62-267,85 1MV8 147, ,70 122,71 31,33 7, ,60 1NVT 163,34-179,80 124,30 44,17 8,26-180,63 1OCK 116,83-85,53 72,18 31,69 11,84-85,53 1OKE 151,08-273,93 164,90 27,01 93,69-253,72 1PGJ 138, ,44 127,60 33,35 6, ,51 1PIW 82,32-246,96 178,24 30,35 13,10-184,94 1PSR 54,68-333,36 101,20 23,65 8,66-309,33 1QH3 174,98-189,03 104,76 6,83 5,47-156,16 1RGE 72,37 25,20 49,03 20,27 4,34 23,49 1T06 166,54-306,24 128,88 25,73 16,73-271,47 1T6F 19,56-272,49 9,28 30,11 8,25-272,77 1T6S 115,83-19,74 148,65 51,42 20,59-6,56 1TO6 104,38-148,30 66,30 44,90 13,31-169,43 1UC3 155,74-141,47 75,27 18,52 7,31-159,79 1UFB 139,23-326,18 128,14 38,03 1,08-349,86 1VC1 158,93 89,79 110,78 32,24 2,92 115,14 1VS3 63,99-671,78 134,67 33,85 26,84-710,92 1WMZ 103,20-174,29 85,86 18,42 4,78-171,64 1WN1 69,91-181,69 129,64 27,50 4,76-208,33 1X8D 176,06-297,74 142,93 38,79 4,65-330,28 1XX1 74,72-169,76 161,67 39,85 0,75-178,20 1XXU 41,89-32,17 91,72 16,76 2,05-24,08 1Y9W 160,97-886,60 172,18 31,04 30,44-880,05

49 49 Πίνακας 6. (Συνέχεια) ΟΜΟΔΙΜΕΡΗ (PDBID) ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΙΚΩΝ ΡΟΠΩΝ ΗΕΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΓΩΝΙΑ ΣΤΗΝ ΠΟΣΟΣΤΟ ΥΔΡΟΦΟΒΗΣ p ΜΕΤΑΞΥ ΑΛΥΣΙΔΩΝ (μοίρες) (kcal/mol) ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑ (μοίρες) ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ % 1 p 2 /interface_area ΗΕΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑ (kcal/mol) 1YYA 162,74-328,91 82,46 28,97 2,39-328,24 1ZHS 107,56-110,63 68,73 51,34 1,21-75,58 1ZZG 164, ,04 157,57 35,07 87, ,06 2AGV 137,21-131,76 123,29 42,81 4,16-128,76 2AIB 163,95-8,78 44,40 33,72 3,52-0,23 2AS8 145,79-128,52 114,03 10,93 8,85-183,96 2AXW 115,52-430,35 92,45 27,13 0,66-428,02 2CMG 135,89-95,29 159,46 36,95 3,41-105,55 2CUK 160,93-406,60 175,88 49,74 5,81-381,49 2CUY 122,11-107,39 166,27 30,31 8,37-124,82 2CVI 126,17-128,55 86,37 35,82 12,72-135,86 2D0I 166,15-553,24 149,63 32,31 3,36-574,43 2DFI 126,65-103,90 34,83 24,83 5,23-93,93 2DQL 35,49 43,11 60,32 44,17 7,25 43,89 2DSJ 154,97-158,90 162,41 41,90 7,60-160,69 2E5Y 74,21-182,14 143,49 29,52 5,41-229,52 2EH6 157,09-893,33 122,00 32,92 44,11-916,37 2EI5 117,18-213,62 93,04 47,63 10,67-219,63 2EUL 97,70 143,95 173,56 31,32 22,31 111,21 2HP4 57,38-42,04 117,18 41,20 2,48-44,83 2J96 100,58-82,12 50,62 36,07 0,65-73,02 2NQL 165,24-679,13 162,50 39,87 4,49-699,00 2OQQ 103,10-354,62 169,55 29,14 3,39-357,15 2OR2 169,25 1,59 59,83 23,15 4,03 11,28 2OWY 107,70-189,46 98,10 24,07 75,33-178,80 2OX1 167,85-329,38 129,80 21,20 18,55-350,96 2P53 139,32-325,76 159,21 28,58 3,88-329,83 2P5U 102,84-42,75 50,46 38,33 5,25-51,43 2P62 119,78-359,46 133,92 14,07 8,46-400,95 2QUL 72,18-639,96 120,09 29,38 6,70-636,26 2V9B 89,50-7,37 45,70 21,05 4,36-8,61 2YQU 167,56-849,73 61,91 37,65 8,11-852,90 2YR1 147,90-42,66 81,52 40,29 4,63-45,76 2YVS 144,66-30,72 86,61 46,12 2,41-64,87 2Z0J 133,22-286,45 59,92 38,82 1,91-274,92 2ZGY 61,04 61,38 26,48 16,38 13,08 31,21 2ZSK 146,67-359,73 83,10 31,89 1,64-333,33 2ZX2 166,58-515,75 128,59 31,73 5,14-510,29 3A6R 20,71-24,44 25,25 31,30 7,21-34,92 3BXU 150,11 16,18 142,08 20,13 2,63 23,02 3C2X 126,68-284,91 98,02 46,43 5,77-286,83 3CCD 139,41-34,12 111,79 9,13 5,89-34,95 3CZZ 59,62 11,83 88,40 18,86 2,81 13,37 3D1G 142,43-892,35 176,06 20,34 326,48-914,13 3EIP 146,23 24,40 130,52 16,97 6,37 11,10 3HGM 172,87 14,09 31,67 55,20 1,71 10,55 3HJ2 69,54-55,28 149,29 25,92 0,57-54,13 3HOA 122,21-627,80 146,63 31,09 28,30-619,79 3HZB 86,50-26,46 121,53 2,99 0,48-28,85 3I17 91,12-157,69 118,80 34,02 2,16-156,08 3I5W 108,21 2,17 52,24 39,58 4,05-5,48 3K9U 83,60 58,70 83,54 37,00 5,38 66,56 3LQS 75,46-273,79 108,97 29,75 12,33-271,71 3MEX 100,71-131,47 129,87 43,65 3,34-130,27 3NVU 108,77-86,40 163,94 45,46 11,96-85,48 3P8T 137,96-198,33 113,13 45,05 13,69-216,08 3PPE 142,62-172,75 141,01 36,19 4,95-162,40 3Q9B 134, ,27 167,32 27,97 14, ,72 3TAK 82,00-72,29 88,46 27,46 2,95-52,61 3VAY 140,69-380,09 169,40 41,12 5,23-399,13 3VTS 98,37 216,24 134,30 50,37 7,82 214,03 3W0E 168,34-43,88 140,89 39,22 0,75-48,58 4DYH 105,40-36,07 80,43 59,87 0,19-40,24 4HIA 133,14 90,76 53,07 21,31 12,37 94,97 4I4O 110,59-330,93 118,75 34,03 7,53-337,63 4IJ5 147,54-566,02 156,04 26,17 14,86-534,13

50 50 Προκειμένου να κατανοήσουμε αυτή τη συμπεριφορά των πρωτεϊνών στα σύμπλοκα το επόμενο βήμα ήταν να εξετάσουμε τη συμπεριφορά τους με βάση την ηλεκτροστατική ενέργεια μεταξύ των αλυσίδων. Στην Εικόνα 5.2α φαίνεται η κατανομή της ηλεκτροστατικής ενέργειας αλληλεπίδρασης των ομοδιμερών συμπλόκων. Στην περίπτωση αυτή περιμένουμε στα σύμπλοκα με μικρή ηλεκτροστατική ενέργεια τα δίπολα των αλυσίδων τους να προσανατολίζονται σε γωνίες κοντά στις 180 ο. Τα σύμπλοκα χωρίστηκαν σε δυο ομάδες. Η μια ομάδα περιλαμβάνει τα σύμπλοκα με την μικρότερη ηλεκτροστατική ενέργεια (μικρότερη από τη διάμεσο των τιμών της ηλεκτροστατικής ενέργειας) και η δεύτερη αυτά με τη μεγαλύτερη. Στην Εικόνα 5.2β-γ παρατηρούμε ότι οι κατανομές των γωνιών των διπόλων δεν έχουν πλέον την εικόνα της κατανομής πριν το διαχωρισμό αυτό. Στην περίπτωση των συμπλόκων με τη μικρότερη ηλεκτροστατική ενέργεια τα δίπολα δείχνουν μια προτίμηση προς το σχηματισμό γωνιών μεγαλύτερων από 140 ο. Σε αντίθεση με τα σύμπλοκα της άλλης ομάδας που εμφανίζουν μια κορυφή γύρω από τις 90 ο. Για να διαπιστώσουμε αν τα δεδομένα αυτά προέρχονται από έναν πληθυσμό με συγκεκριμένη κατανομή χρησιμοποιήθηκαν οι έλεγχοι Anderson-Darling και Kolmogorov-Smirnov και ως επίπεδο σημαντικότητας χρησιμοποιήθηκε το α=0,05. Και οι δυο κατανομές περιγράφονται από τον τύπο της κατανομής Johnson SB. Οι κατανομές αυτές συνοδεύονται από τα διαγράμματα Q-Q που παρέχουν μια εκτίμηση της «καλής προσαρμογής» των πειραματικών δεδομένων με το θεωρητικό μοντέλο. Τα σημεία θα πρέπει να πέφτουν περίπου πάνω στην γραμμή αναφοράς. Τα στοιχεία των κατανομών βρίσκονται στο Παράρτημα Γ1 και Γ2 αντίστοιχα. Με αυτόν τον διαχωρισμό πετύχαμε να αποσαφηνίσουμε λίγο την κατάσταση σχετικά με την προτίμηση των διπόλων να προσανατολίζονται προς συγκεκριμένη κατεύθυνση ανάλογα με το αν σε αυτά παίζουν σημαντικό ή λιγότερο σημαντικό ρόλο οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Για παράδειγμα, τα σύμπλοκα με μικρότερη ηλεκτροστατική ενέργεια έχουν πιθανότητα περίπου 0,3 να σχηματίζουν γωνίες διπόλων μεταξύ 150 ο 180 ο, ενώ τα σύμπλοκα με μεγαλύτερη ηλεκτροστατική ενέργεια έχουν πιθανότητα περίπου 0,15.

51 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ (μοίρες) Εικόνα 5.1 Ιστόγραμμα συχνοτήτων γωνιών που σχηματίζουν τα πρωτεϊνικά δίπολα στα ομοδιμερή σύμπλοκα. Όπως έχει αναφερθεί και στα προηγούμενα κεφάλαια οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν μέσω της επιφάνειάς τους. Είναι λοιπόν σημαντικό να μελετήσουμε και τον προσανατολισμό των διπόλων των επιφανειών των αλυσίδων που συμμετέχουν στον σχηματισμό της διεπιφάνειας κατά την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών. Στην Εικόνα 5.3α φαίνεται η κατανομή των γωνιών των διανυσμάτων των ηλεκτρικών διπολικών ροπών των περιοχών των αλυσίδων που βρίσκονται στη διεπιφάνεια των συμπλόκων. Παρατηρούμε ότι και στην περίπτωση της διεπιφάνειας η κατανομή των γωνιών των διπόλων εμφανίζει παρόμοια συμπεριφορά με την κατανομή των γωνιών στην περίπτωση που μελετήσαμε ολόκληρο το σύμπλοκο. Προσπαθώντας να ομαδοποιήσουμε τα σύμπλοκα χρησιμοποιήθηκαν κάποιες παράμετροι όπως η παράμετρος interface_ area, η ηλεκτροστατική ενέργεια 1 2 / και το ποσοστό υδρόφοβης επιφάνειας στην περιοχή της διεπιφάνειας. Από την ομαδοποίηση με βάση τη τιμή interface_ area προέκυψαν δυο ομάδες 1 2 / συμπλόκων και οι κατανομές των γωνιών των διπόλων της διεπιφάνειας τους φαίνονται στην Εικόνα 5.3β-γ. Η ομάδα των συμπλόκων που η τιμή αυτή είναι μεγαλύτερη από τη διάμεσο ( 6) εμφανίζουν μια κορυφή γύρω από τις 160 ο ενώ τα υπόλοιπα σύμπλοκα δεν δείχνουν κάποια προτίμηση.

52 52 Όπως στην περίπτωση που ως δίπολο θεωρήθηκαν ολόκληρες οι αλυσίδες έτσι και στην περίπτωση που απομονώθηκε η περιοχή της διεπιφάνειας, η ηλεκτροστατική ενέργεια δείχνει να επηρεάζει την κατανομή των γωνιών των διπόλων. Διαπιστώθηκε ότι στις διεπιφάνειες με ηλεκτροστατική ενέργεια αλληλεπίδρασης μικρότερη από τον μέσο όρο του συνόλου των ενεργειών που υπολογίστηκαν οι γωνίες των διπόλων της διεπιφάνειας συγκεντρώνονται στις μεγαλύτερες γωνίες (Εικόνα 5.4). Η τελευταία παράμετρος που μελετήθηκε ήταν η υδροφοβικότητα. Στα σύμπλοκα με μεγάλο ποσοστό υδρόφοβης επιφάνειας στη περιοχή αλληλεπιδράσεις παίζουν μεγαλύτερο ρόλο οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και όχι οι ηλεκτροστατικές. Επιλέχθηκαν λοιπόν τα σύμπλοκα που εμφανίζουν μικρότερο ποσοστό υδρόφοβης επιφάνειας μιας και σε αυτά περιμένουμε να συμβάλλουν περισσότερο οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις και επομένως να πάρουμε μια καλύτερη κατανομή. Στην Εικόνα 5.5 φαίνεται η κατανομή των γωνιών των διπόλων στην περιοχή της διεπιφάνειας των συμπλόκων με τις πιο υδρόφιλες διεπιφάνειες.

53 f(x) f(x) Expected Value Expected Value 53 (α) Q-Q Plot distr. Johnson SB Q-Q Plot distr. Johnson SB Observed Value Observed Value Johnson SB Johnson SB Probability Density Function 0,18 Probability Density Function 0,18 0,16 0,14 0,12 0,16 0,14 0,12 0,1 0,1 0,08 0,08 0,06 0,06 0,04 0,04 0,02 0, ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ Histogram Johnson SB Histogram Johnson SB (β) (γ) Εικόνα 5.2 (α) Ιστόγραμμα συχνοτήτων της ηλεκτροστατικής ενέργειας στα ομοδιμερή σύμπλοκα. Οι κατανομές των γωνιών των διπόλων και τα Q-Q plot για τα σύμπλοκα που έχουν μικρότερη ηλεκτροστατική ενέργεια (β) και αυτά με την μεγαλύτερη ηλεκτροστατική ενέργεια (γ).

54 f(x) f(x) Expected Value Expected Value 54 ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ (μοίρες) Q-Q Plot dist. Gen Extreme Value (α) Q-Q Plot distr. Unidorm Observed Value Observed Value 150 Gen. Extreme Value Uniform 0,18 Probability Density Function 0,14 Probability Density Function 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0, ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ ΓΩΝΙΑ ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ ΔΙΠΟΛΩΝ (μοίρες) Histogram Gen. Extreme Value ,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0, ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ ΓΩΝΙΑ ΔΙΠΟΛΩΝ ΔΙΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ (μοίρες) Histogram Uniform 150 (β) (γ) Εικόνα 5.3 (α) Ιστόγραμα συχνοτήτων της γωνίας των διπόλων στη διεπιφάνεια των ομοδιμερών συμπλόκων. Οι κατανομές των γωνιών των διπόλων και τα Q-Q plot για τα ομοδιμερή σύμπλοκα που έχουν τιμή interface_ area μεγαλύτερη από τη διάμεσο των συνολικών τιμών (β) και 1 2 / αυτά με τιμή μικρότερη (γ).