Ασκήσεις 5& 6. Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR. Σύγκριση & Ανάλυση Δομών Βιομορίων

Transcript

1 Ασκήσεις 5& 6 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR Σύγκριση & Ανάλυση Δομών Βιομορίων

2 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR Κρυσταλλογραφία Ακτίνων-Χ & Φασματοσκοπία ΝΜR Πλεονεκτήματα - Μόρια, Μοριακά Σύμπλοκα ΜΒ>>100kDa!!! - Δεν απαιτείται κρυστάλλωση -Tαχύτητα όταν υπάρχουν κρύσταλλοι - Διαλύματα. Υδατικά ή μη - Εξέλιξη τεχνικής - Μεγάλη κλίμακα πειραματικών συνθηκών (θερμοκρασία, ph, ιονική ισχύς κ.λπ.) - Δυναμική συμπεριφορά βιομορίων (κινητικότητα, χημική ισορροπία, unfolding) - Σύγκριση μεταξύ δομών NMR και X-ray Δομικές διαφορές σε Στερεά Κατάσταση & Διάλυμα Μειονεκτήματα - Υψηλή συγκέντρωση αλάτων - Μέγεθος μορίων Τώρα : 35-50kDa - Κρυστάλλωση Βιομορίου *** Μέλλον : kDa - Εμπλουτισμός Βιομορίου σε 13 C, 15 N & 2 Η (για βιομόρια > kda)

3 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR Iστορία & Mεθοδολογία Αποτίμηση Δομικές Πληροφορίες Υπολογισμοί Δομής Βελτιστοποίηση Από 2D NMR φάσματα σε...3d δομές σε διάλυμα Complete Sequence-Specific Resonance assignments σε βιομόρια (K. Wüthrich In NMR of Proteins and Nucleic Acids, 1986) Prof Richard Ernst ETH, Zűrich Prof Kurt Wűthrich ETH, Zűrich & Scripps, California Nobel Prize 1991 Nobel Prize 2002

4 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR Το πρώτο στάδιο μετά την καταγραφή των 2D NMR φασμάτων είναι η ταυτοποίηση ενδο-αμινοξικών συζεύξεων με την χρήση φασμάτων COSY/TOCSY, (spin pattern). Στη συνέχεια τα δεδομένα των φασμάτων COSY/TOCSY μεταφέρονται στα φάσματα NOESY, όπου οι συζεύξεις προκύπτουν από την αλληλεπίδραση πρωτονίων μέσω του χώρου όταν οι πυρήνες βρίσκονται σε απόσταση < Å. Το δεύτερο στάδιο είναι η εξαγωγή γεωμετρικών πληροφοριών μέσω: ακολουθιακών συζεύξεων (ΝΗ, Ηα, πρωτεϊνικός σκελετός), συζεύξεις μεταξύ πρωτονίων πλευρικών ομάδων, συζεύξεις μέσης απόστασης και μακρινής απόστασης. σταθερές σύζευξης, αντιπροσωπευτικές για δίεδρες γωνίες του σκελετού της πρωτεΐνης, φ & ψ και χαρακτηριστικές για την 2ταγή δομή της. Το τρίτο στάδιο είναι η μετατροπή της έντασης του σήματος ΝΟΕ σε περιοριστικούς όρους απόστασης (υπό μορφή ανώτατων ορίων διατομικών αποστάσεων) και η εισαγωγή των γεωμετρικών δεδομένων σε προγράμματα υπολογισμού της δομής. Το τέταρτο στάδιο είναι ο υπολογισμός της δομής με όλα τα NMR πειραματικά δεδομένα που εξήχθησαν, (αποστάσεις, J-συζεύξεις, δίεδρες γωνίες, κλπ.) μέσω υπολογιστικών προγραμμάτων (μοριακή δυναμική, προσομοίωση ανόπτησης κ.λ.π.). Υπολογίζονται τα τα πιθανά διαμορφομερή που ικανοποιούν τις συγκεκριμένες γεωμετρικές παραμέτρους. Το πέμπτο και τελικό στάδιο περιλαμβάνει τη βελτιστοποίηση των υπολογισμένων δομών μέσω Μοριακής Μηχανικής ή/και Δυναμικής (λογισμικό AMBER) και την ποιοτική τους αξιολόγηση (λογισμικό Procheck).

5 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR TOCSY Αλληλεπίδρασης μέσω δεσμών (σε απόσταση έως 4/5 δεσμών) Αναγνώριση Χαρακτηριστικών ομάδων σημάτων, π.χ. Αμινοξέα Ταυτοποίηση αμινοξέων Χαρακτηριστικές ομάδες σημάτων για κάποια αμινοξέα Μεταφορά δεδομένων στα NOESY Φάσματα

6 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR NOESY Αναγνώριση NMR σημάτων που οφείλονται σε Η-Η «ακολουθιακές συζεύξεις», π.χ. ΝΗ ΝΗi+1 & Hα ΝΗi+1 i Αναγνώριση σημάτων που οφείλονται σε Η-Η συζεύξεις που βρίσκονται σε κοντινή μέση και μακρινή απόσταση (μέχρι 5.5 Å)... ανάμεσα σε πρωτόνια του ίδιου ή διαφορετικών αμινοξέων NOEij ~1/r 6 ij Μέτρηση της έντασης των σημάτων Ολοκλήρωση Έντασης Βαθμονόμηση Εξαγωγή Γεωμετρικών αποστάσεων (ανώτατα όρια αποστάσεων)

7 Διαμόρφωση Βιομορίων μέσω Φασματοσκοπίας NMR Οικογένεια 40 NMR δομών του κυτοχρώματος c Μέση δομή του κυτοχρώματος c 1 Rmsd = Σ( r - r ) N N i i 2 i=1

8 Σύγκριση & Ανάλυση Ποιότητας Δομών Παραδείγματα πρωτεϊνικών δομών στην βάση PDB τα οποία εμφανίζουν σημαντικά λάθη και οι σωστές δομές τους. Εσφαλμένη (α; 1phy) και ορθή δομή (β; 2phy) της photoavctive yellow protein Ολοκληρωτικά λάθος δομή, Εσφαλμένη αναδίπλωση, και υπολογισμός 2ταγούς Δομής. και εσφαλμένη (γ; 1pte) και ορθή δομή (δ; 3pte) της D-alanyl-D-alanine peptidase. Ορθός υπολογισμός 2ταγούς δομής Λάθος υπολογισμός αναδίπλωσης. ΑΝΑΖΗΤΗΣΤΕ ΤΙΣ ΔΟΜΕΣ ME PDB ID & 1phy 1pte Στο διαδικτυακό τόπο

9 Σύγκριση & Ανάλυση Ποιότητας Δομών The Triumph of Galatea 1511 Fresco, 295 x 225 cm Villa Farnesina, Rome RAFFAELLO Sanzio (b. 1483, Urbino, d. 1520, Roma) Ακρίβεια ΟΧΙ Ακρίβεια ΝΑΙ Ακρίβεια ΝΑΙ Επαναληψιμότητα ΟΧΙ Επαναληψιμότητα ΝΑΙ Επαναληψιμότητα ΝΑΙ Ορθότητα ΟΧΙ Ορθότητα ΟΧΙ Ορθότητα ΝΑΙ Πως εξασφαλίζεται υψηλή ακρίβεια και ορθότητα???

10 Κριτήρια Ποιότητας Δομών Οι πρωτεϊνικές δομές υψηλής ανάλυσης και ποιότητας πρέπει να εμφανίζουν: 1) θερμοδυναμικά προτιμητέες διαμορφώσεις του πεπτιδικού σκελετού. Δηλ. κατάλληλο συνδυασμό των τιμών των δίεδρων γωνιών φ και ψ...βλέπε Διάγραμμα Ramachandran!!! Τυχόν μη επιτρεπτές τιμών των φ/ψ δεν πρέπει να ξεπερνούν το 2-5% των αμινοξέων 2) μέγιστο δυνατό αριθμό δεσμών-η 3) ελάχιστο δυνατό αριθμό αμινοξέων εκτεθειμένων στο διαλύτη (πρωτεΐνες) αναδίπλωση 4) μέγιστο δυνατό αριθμό πολικών ή φορτισμένων αμινοξέων εκτεθειμένων στο διαλύτη από τα αμινοξέα που βρίσκονται στην επιφάνεια του μορίου 5) ελάχιστο αριθμό διάκενων, κοιλοτήτων και εσφαλμένης στοίβαξης των αμινοξέων στο εσωτερικό της δομής 6) ελάχιστο δυνατό αριθμό μη δεσμικά συνδεδεμένων ατόμων σε απόσταση <2,6 Å (όριο απόστασης στο οποίο εμφανίζονται στερεοχημικές και van der Waals αλληλεπιδράσεις) 7) ελαχιστοποίηση της τυπικής απόκλισης της ενέργειας των δεσμών-η 8) χαμηλό R-factor (<0.20) για κρυσταλλικές δομές Ακτίνων-Χ ή χαμηλές τιμές της μέσης τυπικής απόκλισης (rmsd) για την οικογένεια των NMR μοντέλων (10, 20, 30 ή 40 δομών) < Å για τα άτομα του πεπτιδικού σκελετού, <2.0 για τα άτομα των πλευρικών αλυσίδων

11 Διάγραμμα Ramachandran Ισχυρά προτιμητέες τιμές φ & ψ Επιτρεπόμενες τιμές φ & ψ Οριακά Επιτρεπόμενες τιμές φ & ψ Μη Επιτρεπόμενες τιμές φ & ψ

12 Ανάλυση Ποιότητας Δομών ( ADIT : a web-based AutoDeposit Input Tool (Westbrook, Feng, & Berman, 1998)

13 Ανάλυση Ποιότητας Δομών ( PDB Validate

14 Ανάλυση Ποιότητας Δομών ( PROCHECK

15 Ανάλυση Ποιότητας Δομών ( Αναζητήστε στην PDB την δομή με τον κωδικό 1qq3 1p6t & PDB και μεταφορτώστε τα αρχεία *.pdb στην στο ADIT και ξεκινήστε την διαδικασία ελέγχου. Validate Να αναλυθεί το Διάγραμμα Ramachandran και να αποτιμηθούν τα στοιχεία της 2ταγούς δομής