ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ. Μικροβιακή Γενετική. Βακτηριακός μετασχηματισμός

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Μικροβιακή Γενετική Βακτηριακός μετασχηματισμός Διδάσκουσα: Επίκουρη Καθηγήτρια Αμαλία-Σοφία Αφένδρα

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 Βακτηριακός μετασχηματισμός

4 Βακτήρια Τα βακτήρια μεταφέρουν γενετικό υλικό από ένακύτταροσεέναάλλομετρείς διαφορετικούςμηχανισμούς: σύζευξη, μετασχηματισμόκαιμεταγωγή. Kαι στους τρεις μηχανισμούς, το γενετικό υλικό που μεταφέρεται διατίθεται από ένα κύτταρο που ονομάζεται δότης. Τοκύτταροπουλαμβάνειτογενετικόαυτό υλικό ονομάζεται δέκτης.

5 Βακτήρια Μετασχηματισμός Το πρώτο σύστημα μεταφοράς γονιδίων που ανακαλύφθηκε Αποτελεί το καταλληλότερο τρόπο μεταφοράς DNA από πολλές απόψεις

6 Μετασχηματισμός Ενα βακτηριακό κύτταρο αποκτά DNA από το περιβάλλον και το ενσωματώνει στο δικό τουγενετικόυλικό. Δότης Ελεύθερο DNA Δέκτης

7 Frederick Griffith, 1928 Μίγμα: νεκρωμένοι παθογόνοι πνευμονιόκοκκοι (Streptococcus pneumonia) + ζωντανοί μη παθογόνοι Ενεση σε ποντίκια Θάνατος από σηψαιμία Στο αίμα των νεκρών ποντικιών απομονώθηκαν παθογόνα κύτταρα πνευμονιοκόκκων. Tα νεκρωμένα κύτταρα μετέτρεψαν μέσω κάποιου παράγοντα τα ζωντανά σε παθογόνα.

8 ΒΑΚΤΗΡΙΑ Ζωντανά, λείες αποικίες, μολυσματικά Πείραμα Griffith Ζωντανά, τραχιές αποικίες, μη μολυσματικά Νεκρά, λείες αποικίες Ζωντανά τραχιά& νεκρά λεία

9 Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty, 1944 H ουσίαπουμεταφέρθηκεαπότα νεκρωμένα παθογόνα κύτταρα πνευμονιοκόκκων στα ζωντανά μη παθογόνα ήταν DNA.

10 Πείραμα Avery, MacLeod & McCarty: ΤομετασχηματίζονστοιχείοείναιDNA IIIS IIIS filtrate IIR + IIIS filtrate Οενεργός παράγων ήταν DNA

11 Επιδεκτικότητα Η ικανότητα των βακτηρίων να προσλαμβάνουν ξένο DNA. Βακτήρια με φυσική επιδεκτικότητα Παραγωγή εξειδικευμένων πρωτεϊνών υπεύθυνων για την είσοδοκαιτηναντιγραφήτουdnaστονέοξενιστή(bacillus subtilis, Streptococcus, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, κ.ά.) Βακτήρια με τεχνητή επιδεκτικότητα Επίδραση του κυτταρικού περιβλήματος από εξωγενείς παράγοντες, όπωςδισθενήκατιόντα(κυρίωςca2+ καιmg2+), πολυαιθυλενική γλυκόλη, σχηματισμό πρωτοπλαστών (αφαίρεση του κυτταρικού τοιχώματος), κ.ά.

12 Αντιπροσωπευτικά βακτήρια με φυσική επιδεκτικότητα Gram+ Bacillus subtilis: εδαφοβακτήριο Streptococcus pneumonia: παθογόνο(λοιμώξεις στο λαιμό) Gram- Haemophilus influenzae:(μηνιγγίτιδα) Neisseria gonorrhoeae: παθογόνο(γονόρροια) Helicobacter pylori: παθογόνο Acinetobacter calcoaceticus Κυανοβακτήρια Synechococcus

13 Πορείαμετασχηματισμού Πρόσδεση του DNA στο εξωτερικό περίβλημα του κυττάρου. Μεταφορά του DNA στο εσωτερικό του κυττάρου διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. Αυτόνομη αναπαραγωγή(πλασμίδιο), ή ενσωμάτωση με ανασυνδυασμό στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή(χρωμοσωμικό τμήμα του κυττάρου-δότη). Έκφραση της γενετικής πληροφορίας που φέρει το DNA.

14 ΕπιδεκτικότητασεBacillus subtilis (αντιπροσωπευτικόβακτήριοgram+) com: γονίδια που κωδικεύουν την παραγωγή εξειδικευμένων πρωτεϊνών υπεύθυνων για την είσοδοκαιτηναντιγραφήτουdnaστονέο ξενιστή Ταγονίδιααυτάείναιοργανωμένασεοπερόνια. Οπερόνια come, comf& comg: κωδικοποιούν δομικές πρωτεΐνες για την πρόσληψη του DNA

15 ΕπιδεκτικότητασεBacillus subtilis (αντιπροσωπευτικόβακτήριοgram+) ComEA: πρωτεΐνη πρόσδεσης του εξωκυτταρικού δίκλωνου DNA comf: κωδικοποιείπρωτεΐνεςπουμετατοπίζουντοdna στο εσωτερικό του κυττάρου comg: κωδικοποιεί πρωτεΐνες που παρέχουν δομή αντίστοιχη ενός πόρου ή καναλιού, επιτρέποντας στο DNAναδιαπεράσειολόκληροτοκυτταρικόπερίβλημα. Επίσης επιτρέπουν στην ComEA να έχει πρόσβαση στο εξωτερικό του κυττάρου.

16 Gram+ (Bacillus subtilis) Κυτταρικό περίβλημα των Gram+

17 Ρύθμιση της επιδεκτικότητας στο B. subtilis Ρυθμιστικό σύστημα δύο συστατικών ComP: πρωτεΐνη αισθητήρας Εκκρίνεται, όταν: 1) Τα θρεπτικά συστατικά του κυττάρου αρχίζουν να τελειώνουν 2) Ο πληθυσμός φθάνει σε ένα μέγιστο που αντιστοιχεί σε μεγάλη κυτταρική πυκνότητα. ComP: φωσφορυλιώνεται ΜεταφέρειτονΡστηνπρωτεΐνηComA. Η φωσφορυλιωμένη ComA αποτελεί έναν μεταγραφικό ενεργοποιητή που επάγει το σύστημα της επιδεκτικότητας.

18 Μικρά πεπτίδια Φερομόνες επιδεκτικότητας Εκκρίνονται κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού των βακτηρίων Απαιτείται μεγάλη συγκέντρωση φερομονών για την πρόκληση της επιδεκτικότητας Μία από τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες της φερομόνης προκαλεί την φωσφορυλίωση του ComP.

19 (Επιδεκτικότητα σε B. subtilis) ComK: μεταγραφικός παράγοντας από τον οποίο εξαρτάται ό μεταγραφικόςέλεγχοςτωνοπερονίωνcome, comf& comg. ComA: ρυθμίζει τον παράγοντα ComK Επιπλέονκαιάλλεςπρωτεΐνεςεμπλέκονταιστομετασχηματισμό, όπως τα προϊόντα των γονιδίων nuca, οι πρωτεΐνες SSB, RecA Μήκος DNA που ενσωματώνεται στο χρωμοσωμικό DNA του δέκτη: 8,5 12 kbπερίπου. ΕΝΔΟΣΠOΡΙΩΣΗ ΣΤΟ Bacillus subtilis Ενδοσπορίωση: Τέλος εκθετικής αρχή στατικής φάσης ανάπτυξης(όμοιαμεεπιδεκτικότητα) Κάποια από τα ρυθμιστικά γονίδια που απαιτούνται για την ενδοσπορίωση, απαιτούνται επίσης και για την ανάπτυξη της επιδεκτικότητας.

20 Επιδεκτικότητα σε βακτήρια Gram- PSTC: Pilus formation Secretion Twitching motility Competence IV (Helicobacter pilori) (Agrobacterium tumefaciens)

21 Gram-(Neisseria gonorrhoeae) Κυτταρικό περίβλημα των Gram-

22 Gram- Gram+

23 Πρόσληψη του DNA Ο μηχανισμός πρόσληψης του DNA από επιδεκτικά κύτταρα βακτηρίων Gram- έχει μελετηθεί καλά στο Streptococcus pneumonia. Το βακτήριο αυτό παρουσιάζει μεγάλη συχνότητα μετασχηματισμού. Επομένως η μελέτη σ αυτό παρουσίασε μεγάλη αποτελεσματικότητα.

24 Πρωτεΐνη δέσμευσης του DNA Νουκλεάση: κόβει και κατακερματίζει τη μία αλυσίδατουdna Εξειδικευμένη πρωτεΐνη επιδεκτικότητας Πρόσληψη DNA στο Streptococcus pneumoniae

25 Εξειδίκευση ΑλληλουχίεςπουπρέπειναπεριέχονταιστοDNA, προκειμένου να προσληφθεί από κύτταρα: H. influenzae: 5 -AAGTGCGGTCA-3 N. gonorrhoeae: 5 -GCCGTCTCAA-3

26 Haemophilus influenzae Transformasomes φυσαλίδες κυτταροπλασματικής μεμβράνης που περιέχουν πρωτεΐνες για την πρόσδεση και την κατεύθυνση του DNA στο εσωτερικό του κυττάρου. Πρόκειται για υποκυτταρικά διαμερίσματα που έχουν την δυνατότητα εγκλεισμού DNA μεγέθους kb

27 Τα κύτταρα με φυσική επιδεκτικότητα: Σπάνια μετασχηματίζονται από πλασμιδιακό ή φαγικό DNA. Τα DNA αυτά πρέπει να επανακυκλοποιηθούν, για να αποτελέσουν ώριμα μόρια DNA. Tα DNA αυτά σπάνια διαθέτουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στα άκρα τους. Η μόνη περίπτωση μετασχηματισμού από πλασμιδιακό ή φαγικό DNA είναι από διμερή μορφή τους(αποδιάταξη διμερούς, βλ. πλασμιδιακό καταμερισμό).

28 Ο ρόλος του φυσικού μετασχηματισμού Γιατίταβακτήριαέχουναναπτύξειαυτότομηχανισμό; Σε τι τους χρησιμεύει; Λαμβάνοντας υπ όψιν ότι τα βακτήρια προσλαμβάνουν μόνον ομοειδές DNA, υποτίθεταιότιηπρόσληψητουdna έχειωςσκοπό: 1) Τη διατροφή(πηγή άνθρακα, αζώτου) από το κατακερματισμένο DNA. 2) ΤηνεπιδιόρθωσητουαντίστοιχουDNAπουέχειτυχόνυποστείβλάβη(π.χ. κύτταρα που έχουν εκτεθεί σε ακτινοβολία υπεριώδους). ΗυπόθεσηαυτήενισχύεταιαπότογεγονόςότιτογονίδιοrecAεπάγεταισε απόκριση προς το μετασχηματισμό. 3) Τον ανασυνδυασμό, με σκοπό το συνδυασμό γονιδίων προς χάριν της ποικιλότηταςκαιεπομένωςτηςεξέλιξης.

29 Αντιγονική διαφοροποίηση στο Neisseria gonorrhoeae Παθογόνα βακτήρια Αποφυγή του ανοσοποιητικού συστήματος του προσβαλλόμενου οργανισμού με μεταβολή των αντιγόνων στην κυτταρική επιφάνεια. Χαρακτηριστικό παράδειγμα το Neisseria gonorrhoeae. Ινίδια(pili) του N. gonorrhoeae: αγκυροβόληση των βακτηρίων πάνω στα επιθηλιακά κύτταρα. Άμεση τροποποίηση των ινιδίων μεταβολή της εξειδίκευσης της πρόσδεσης πρόκληση σύγχυσης στο ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Γονίδιο pile: σχηματισμός πιλίνης Άλλα σιωπηλά γονίδια σχηματισμού πιλίνης(pils) παρόντα Ανασυνδυασμός μεταξύ pile& pils διαφοροποιημένη πιλίνη Μετασχηματισμός μεταξύ N. gonorrhoeae: ανταλλαγή γονιδίων pil Ακόμη περισσότεροι συνδυασμοί διαφορετικών πιλινών

30 Βακτήρια με τεχνητή επιδεκτικότητα Δεν υπάρχει καμμία σχέση μεταξύ φυσικής και τεχνητής επιδεκτικότητας. Επίδραση του κυτταρικού περιβλήματος από εξωγενείς παράγοντες, όπως δισθενή κατιόντα(κυρίως Ca2+ και Mg2+), πολυαιθυλενική γλυκόλη, σχηματισμό πρωτοπλαστών(αφαίρεση του κυτταρικού τοιχώματος), κ.ά.

31 Μετασχηματισμός με ηλεκτροώσμωση (electroporation) Εφαρμογή υψηλής τάσης στο βακτηριακό εναιώρημα Σχηματισμός προσωρινών οπών στο κυτταρικό περίβλημα ΕίσοδοςτουDNAαπότιςοπές Αποκατάσταση των οπών κατά την ανάρρωση των κυττάρων Εφαρμογήσεπολλάβακτήρια, κυρίωςσεαυτάπου δεν μετασχηματίζονται με τις παραπάνω μεθόδους

32 Εφαρμογές Φυσικός μετασχηματισμός: Χαρτογράφηση γονιδίων

33 DNA δότης Βακτηριακός ξενιστής Απομόνωση& πέψη DNA δότη Δημιουργία τμημάτων διαφόρων μεγεθών Κύτταραδέκτες: ανασυνδυασμός με τοdna τουδότη Σημείο γενετικού ανασυνδυασμού Μετασχηματισμός βακτηρίου μεγονότυποa - b - c - Γονότυποι μετασχηματισμένων κυττάρων - μετασχηματισμός μετασχηματισμός μετασχηματισμός συμμετασχηματισμός συμμετασχηματισμός

34 Εφαρμογές Τεχνητός μετασχηματισμός: Εισαγωγή ετερόλογων γονιδίων σε προκαρυωτικούς (βακτήρια) και ευκαρυωτικούς οργανισμούς (ζυμομύκητες, φυτά) με σκοπό τη γενετική βελτίωση.

35 Χρωμοσωμικό DNA Κύτταρα E. coli Amp s Amp r Μετασχηματισμός μεπλασμίδιοamp r Κύτταρα E. coli Amp r + πλασμίδιο

36 Αριθμός μετασχηματισμένων κυττάρων Συγκέντρωση DNA (mg/ml) Γραφική παράσταση της απόδοσης μετασχηματισμού συναρτήσει της συγκέντρωσης του DNA.

37 Τέλος Ενότητας

38 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

39 Σημειώματα

40 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

41 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκουσα: Επίκουρη Καθηγήτρια Αμαλία-Σοφία Αφένδρα. «Μικροβιακή Γενετική. Βακτηριακός μετασχηματισμός». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

42 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]